NO318173B1 - Immunotoksiner rettet mot c-erbB-2 (HER-2/neu) beslektede overflateantigener - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunotoksiner som er rettet mot c-erbB-2-(HER-2/neu)-relaterteoverflateantigener.

Mer spesielt angår oppfinnelsen nye immunokonjugater og anvendelsen av disse immunokonjugater for fremstilling av medikamenter for behandling av neoplastiske sykdommer.

Neoplastisk sykdom er en av de ledende årsaker til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden. Neoplastiske tilstander, for eksempel sykdommer eller "cancere", deler minst et karaktertrekk, det vil si involvering av defekter i den cellulære vekst-regulatoriske prosessen.

Den prosess ved hvilken som normale celler blir overført til ondartede celler, har vært utsatt for intens studie over tiår. I det siste har studier vært fokusert på rollen til onkogener i cancerprosessen. Onkogener er gener som har evne til å transformere eukaryotiske celler slik at de vokser på en måte som er analoge med tumorceller.

Et onkogen blir skapt når et normalt gen eller proto-onkogen blir mutert, rearrangert eller amplifisert. Et slikt onkogen er c-erbB-2(HER-2/neu) proto-onkogen. Herefter vil dette onkogenet angis som c-erbB-2. Dette genet koder for et protein som tilsvarer en epidermisk vekstfaktorreseptor. Amplifisering av dette proto-onkogenet kan resultere i en kaskade av cellulære hendelser som fører til uregulert cellevekst.

Antistoffer er proteiner fremstilt av immunsystemet i et dyr, normalt som respons på fremmede antigener eller antigene determinanter. Antistoffer binder til det spesifikke antigenet som de er rettet mot. Utvikling av spesifikke monoklonale har for forskerne tilveiebragt en mulig måte for selektivt å målrette terapeutiske midler til celler som overuttrykker definerte antigener.

For eksempel beskriver R. Tecce, (Elena Cancer Institute, Roma, Italia) konjugater mellom c-erbB-2-spesifikke antistoffer og toksinet saporin-6.

En artikkel av McKenzie, et al. i "Onkogen", 1989, angår anti-c-erbB-2-antistoffer uten å nevne plantetoksiner.

Vitetta et al. beskriver i "Science", 1987, immunotoksinkonjugater av antistoffer og plantetoksiner, men beskriver ikke den spesielle konjugering av et anti-c-erbB-2-antistoff med noen variant av gelonin.

Langton et al. beskriver i "Cancer Resarch", 1991, bruken av c-erbB-2-spesifikke antistoffer for å detektere et museantigen, men beskriver ikke noen konjugering av slike antistoffer med et plantetoksin.

Til slutt beskriver NO 303122 immunokonjugater av et antistoff mot 15A8 antigene konjugert til gelonin.

Overekspresjon av c-erbB-2 proto-onkogenet i neoplastisk transformasjon har vært postulert. Flere typer humane cancere som inkluderer noen brystcarcinomaer og noen ovariecarcinomaer har et amplifisert c-erbB-2-gen. Amplifisering og efterfølgende overekspresjon av c-erbB-2-genet er videre korrelert med dårlig sykdomsprognose. Det eksisterer således et stort behov og ønske innenfor fagområdet for en mulighet for selektivt å målrette et kjemoterapeutisk middel mot en celle som oppviser overekspresjon av c-erbB-2-onkogenet for å modulere vekst av celler som overuttrykker proteinet. Foreliggende oppfinnelse skaffer til veie en mulighet for å gjennomføre dette.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å forbedre den kjente teknikk og angår således en sammensetning som karakteriseres ved at den omfatter et konjugat. En slik sammensetning kan virke som et immuntoksin for spesifikt å målrette en cellevekstmodulator mot tumorceller som overuttrykker c-erbB-2-proteinet.

I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt en sammensetning av stoff som omfatter et konjugat av en målrettet del med bindingsspesifisitet for c-erbB-2-protein, for eksempel TAb 250 monoklonalt antistoff, og en cytotoksisk del. Den cytotoksiske delen kan være et toksin, et cytocidisk medikament, et cytostatisk medikament eller en biologisk responsmodifiserer. I en spesiell utførelsesform er den cytotoksiske delen gelonin.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen angår anvendelsen av en sammensetning som beskrevet for å fremstille et farmasøytisk preparat for behandling av en neoplastisk tilstand, for eksempel en sykdom som kjennetegnes ved amplifisering eller overekspresjon av c-erb-B-2-onkogenet.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen anvendelsen av en sammensetning som beskrevet for å fremstille et farmasøytisk preparat for å drepe tumorceller in vitro, typisk etterfulgt av gjeninnføring i en vert. Ved for eksempel behandling av en benmargsneoplastisk tilstand, blir benmargen fjernet fra et individ som har den neoplastiske sykdommen og behandlet med en sammensetning av foreliggende oppfinnelse.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen angår den anvendelsen av en sammensetning som beskrevet for å fremstille et farmasøytisk preparat for å hindre gjenopptreden av en neoplastisk sykdom.

I en ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse angår den nye sammensetninger av stoff som omfatter fusjonskonstmksjoner av måldeler med bindingsaffinitet for c-erbB-2-protein og en cytotoksisk del. Den målrettede delen er fortrinnsvis et antistoff som gjenkjenner en ekstracellulær epitope av c-erbB-2, for eksempel TAb 250, og den cytotoksiske delen er relativt inert når den blir påført separat fra den målrettede delen, for eksempel gelonin.

I andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse angår den anvendelse av sammensetninger som beskrevet ovenfor der cellen er valgt fra gruppen som består av en brystcarcinomacelle, en ovariecarcinomacelle, en lungecarcinomacelle, en spyttkjertelcarcinomacelle, en gastrisk tumorcelle, en kolonadenocarcinomacelle og en benmargleukemicelle.

Videre angår oppfinnelsen sammensetninger for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å forlenge overlevelsestiden hos et tumorbærende pattedyr og for å forsinke veksthastigheten for tumorer. Målrettede toksiner vil typisk bli rettet ved en immunologisk bindingsregion, for eksempel et antistoffbindende segment.

Det blir i tillegg tilveiebrakt et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at det inneholder sammensetningen som beskrevet ovenfor.

Fig. 1 viser effektene av ZME-antistoff, TAb 250-antistoff eller immunokonjugater av

TAb 250 og gelonin på SKOV-3-celler målt ved ELISA.

Fig. 2 viser cytotoksisitet av TAb 250 geloninkonstruksjon på SKOV-3-celler.

Fig. 3 viser konkurrering av relevant versus irrelevant antistoff med konjugat på

SKOV-3-celler.

Fig. 4 viser doseresponsforhold og effekter av TAb 250-geloninkonjugat på SKOV-3- celler-Fig. 5 viser cytotoksisitet av TAb 250 og TAb 250-geloninkonjugat på KOV-3-celler.

Fig. 6 viser evne til TAb 250 antistoff å internalisere i forskjellige cellelinjer.

Fig. 7 viser cytotoksisitet av TAb 250-geloninimmunokonjugat i MTT-analyse.

Slik det er brukt her, har en cellulær målrettet del evnen til selektiv binding til et c-erbB-2-protein som uttrykkes på en celle, typisk på overflaten. Dette innbefatter både en ligand som er spesifikk for binding til c-erbB-2 -proteinet og antigenbindende region, for eksempel intaktantistoffer eller epitope bindende fragmenter derav. Dette innbefatter både klassiske antistoffmolekyler, chimeriske versjoner, enkelkjeder og modifiserte antistoff-fragmenter som beholder epitope bindende spesifisitet og affinitet.

Slik det brukes her, betyr begrepet "immunoglobulin" eller "antistoffpeptidfer)" et helt immunoglobulin eller antistoff eller et hvilket som helst funksjonelt bindingsfragment av et immunoglobulinmolekyl. Eksempler på slike peptider innbefatter komplette antistoffmolekyler, antistoff-fragmenter som Fab (F(ab')2, CDR, Vl, Vfj, og en hvilken som helst annen del av et antistoff, særlig de som utviser antigenbindende spesifisitet eller affinitet. For eksempel består et IgG-antistoffmolekyl av to lette kjeder, hver bundet ved disulfidbindinger til to tunge kjeder. De to tunge kjedene er i sin tur bundet til hverandre via disulfidbindinger i et område som er kjent som hengselregionen av antistoffet. Et enkelt IgG-molekyl har typisk en molekylvekt på tilnærmet 150-160 kD og inneholder to antigenbindende seter. Fragmenter av disse molekylene, for eksempel tunge eller lette kjeder alene, kan noen ganger binde antigen. Antistoffer, fragmenter av antistoffer og individuelle kjeder kan være funksjonelt ekvivalente til immunoglobuliner.

En normal tung eller lett antistoff-kjede har en N-terminal (NH2) variabel (V) region, og en C-terminal (—COOH) konstant (C) region. Den tunge kjedens variable region blir angitt som Vjj (inkludert for eksempel Vy), og den lette kjedede variable regionen blir angitt som Vj^ (inkludert V^ eller VjJ. Den variable regionen er delen av molekylet som binder til antistoffets kognatantigen, mens Fc-regionen (andre og tredje domener av C-regionen) bestemmer antistoffets effektorfunksjon (for eksempel komplementfiksering, opsonisering). Full-lengde immunoglobulin eller antistoff "lette kjeder" (generelt ca. 25 Kd, ca. 214 aminosyrer) blir kodet av et variabel region-gen ved N-terminal (generelt ca. 110 aminosyrer) og et k (kappa)- eller X (lambda) konstant region-gen ved COOH-terminal. Full-lengde immunoglobulin eller antistoff "tunge kjeder" (generelt ca. 50 Kd, ca. 446 aminosyrer), blir på tilsvarende måte kodet av et variabel-region-gen (som generelt koder ca. 116 aminosyrer) og en av konstantregion-genene, for eksempel y (som koder for ca. 330 aminosyrer). Typisk vil "Vl inkludere den delen av den lette kjeden som er kodet av Vl og/eller Jl (J eller sammenknyttende region) gensegmenter, og "Vh" vil inkludere den delen av den tunge kjeden som er kodet av Vjj, og/eller Dh (D eller diversitetsregion) og Jjj-gensegmenter, se generelt Roitt, et al., "Immunology", kap. 6 (2. utgave, 1989) og Paul, "Fundamental Immunology", Raven Press (2. utgave, 1989).

En immunoglobulin lett- eller tungkjedet variabel region består av en "rammeverk"-region avbrutt av tre hypervariable regioner, også kalt komplementaritets-bestemmende regioner eller CDR. Graden av rammeverkregion og CDR er definert, se "Sequences of Proteins of Immunological Inter est," E. Kabat, et. al., U.S. Department of Health and Human Services, (1987). Sekvensene av rammeverksregionene av forskjellige lette eller tunge kjeder er relativt konservert i en art. Rammeverksregionen til et antistoff, det er de kombinerte rammeverksregionene av de bestående lette og tunge kjeder, tjener til å posisjonere og tilegne CDR i det tredimensjonale rommet. CDR er primært ansvarlig for binding til en epitope av et antigen. CDR angis typisk som CDR1, CDR2 og CDR3, og nummereres sekvensielt ved å starte fra N-terminal.

To typer av lette kjeder, k og X, blir referert til isotyper. Isotypiske determinanter hviler typisk i den konstante regionen av den lette kjeden, også angitt som Cl generelt, og særlig Ck eller C^. Den konstante regionen av det tungkjedede molekylet, også kjent som Cjf, bestemmer isotype av antistoffet. Antistoffer blir klassifisert som IgM, IgD, IgG, IgA og IgE avhengig av den tungkjedede isotypen. Isotypene blir kodet i mu-(ji), delta-(A), gamma-(y), alfa-(a) og epsilon-(e)-segmenter av den tungkjedede konstante regionen, henholdsvis. I tillegg er det et antall av y-undertyper.

Den tungkjedede isotypen bestemmer forskjellige effektorfunksjoner i antistoffet, slik som opsonisering eller komplementfiksering. I tillegg bestemmer den tunge kjedens isotype den sekrerte formen av antistoff. Sekreterte IgG, IgD og IgE isotyper blir typisk funnet i enkelenhet- eller monomerisk form. Sekretert IgM-isotype finnes i pentamer form; sekrert IgA kan finnes både i monomer og dimer form.

Et F(ab')2-fragment mangler C-terminaldel av den tungkjedede konstante regionen, og har vanligvis en molekylvekt på tilnærmet 110 kD. Den beholder to antigenbindings-seter og interkjedet disulfidbindinger i hengselregionen, men den har ikke effektorfunk-sjonene til et intakt IgG-molekyl. Et F(ab")2-fragment kan oppnås fra et IgG-molekyl ved proteolytisk spalting med pepsin ved pH 3,0-3,5 ved å anvende standardmetoder slik som de som er beskrevet i Harlow og Lane, nedenfor.

Et "Fab"-fragment omfatter en lett kjede og N-terminaldel av den tunge kjeden som er bundet sammen av disulfidbindinger. Den har typisk en molekylvekt på tilnærmet 50 kD og inneholder et enkelt antigenbindingssete. Fab-fragmenter kan oppnås fra F(ab')2-fragmenter ved begrenset reduksjon, eller fra hel antistoff ved spalting med papain i nærvær av reduseringsmidler (Se Harlow og Lane, nedenfor.) I visse tilfeller et konsentrasjon av reduksjonsmiddel nødvendig for å opprettholde aktiviteten av papain i nærvær av atmosfærisk oksygen tilstrekkelig til fullstendig å redusere inter-kjededisulfidbindinger til antistoffet. Dette kan resultere i tap av antigengjenkjenning. For å omgå dette problemet, kan papain aktiveres og deretter byttes ut i buffer inneholdende en konsentrasjon av reduksjonsmiddel som er kompatibel med opprettholdelse av antigenbindingsaktivitet. Antistoffspaltingen ble typisk gjennomført under en inert atmosfære for å hindre deaktivering av papain.

Følgende protokoll er et eksempel på denne prosessen:

A) Aktivering av papain: Papain, tilført som 10 mg/ml MfySO^suspensjon, oppløst i 10 mM EDTA, 20 mM cystein, pH=8,0, til en sluttkonsentrasjon på 2 mg/ml. Oppløsningen blir avgasset og far anledning til å inkubere i 2 timer ved romtemperatur under nitrogen. B) Aktivert papain blir byttet ut i 20 mM NaP04, pH=7,0,150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 30 uM DTT. C) Spalting av antistoff: 1 mg aktivert papain ble tilsatt for hver 100 mg antistoff, og oppløsningen ble dialysert mot et stort overskudd av 20 mM NaP04, pH=7,0,150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 30 uM DTT, med kontinuerlig heliumskylling. Dialyse anvendes for å opprettholde et molart overskudd av reduksjonsmiddel i løpet av spaltingen. D) Etter 2-4 timer ved romtemperatur ble spaltingen avsluttet ved tilsetning av jodacetamid. E) Fab-fragmenter ble separert fra uspaltet eller delvis spaltet antistoff ved å anvende standard kromatografimetoder.

Slik de brukes her, angir begrepene "Fab" eller hvilke som helst andre antistoff-fragmenter, tilsvarende klassifikasjoner når de anvendes i foreliggende oppfinnelse som de generelle begrepene "antistoffer" eller "immunoglobuliner". "Pattedyr" Fab-protein, "chimerisk Fab" og lignende, anvendes således analogt med tilsvarende definisjoner som brukes generelt, og som er angitt i etterfølgende avsnitt.

Slik de brukes her, betyr begrepet "chimeriske antistoffer" eller "chimeriske peptider" antistoffer eller anhstoffpeptider der en del av peptidet har en aminosyresekvens som er avledet fra, eller er homolog til, en tilsvarende sekvens i et antistoff eller peptid avledet fra en første genkilde, mens det gjenværende segmentet av kjeden(e) er homolog med tilsvarende sekvenser fra annen genkilde. Et chimerisk tungkjedeantistoffpeptid kan for eksempel omfatte en murinvariabel region og en human konstant region. De to kildene vil typisk være to separate arter, men vil leilighetsvis involvere en art.

Chimeriske antistoffer eller peptider blir typisk produsert ved å anvende rekombinant molekylære og/eller cellulære teknikker. I mange tilfeller har chimeriske antistoffer variable regioner av både lette og tunge kjeder som etterligner variable regioner av antistoffer avledet fra en pattedyrart, mens den konstante og/eller rammeverkdelene er homologe med sekvenser i antistoffer avledet fra en annen, ulik pattedyrkilde.

Slik det blir brukt her, er definisjonen av chimerisk antistoff imidlertid ikke begrenset til dette eksempel. Et chimerisk antistoff er et hvilket som helst antistoff der enten den ene eller begge av tunge eller lette kjeder består av kombinasjoner av sekvenser som etterligner sekvensene i antistoffene av forskjellige kilder, uavhengig om disse kildene atskiller seg i forskjellige klasser, atskiller seg i antigenresponser eller atskiller seg i opprinnelsesart, og av om fusjonspunktet er den variable/konstante grensen. Chimeriske antistoffer kan for eksempel innbefatte antistoffer der rammeverket og CDR er fra forskjellige kilder. Dcke-human CDR blir for eksempel integrert i humane rammeverkregioner bundet til en human konstant region for å lage "humaniserte antistoffer", se for eksempel WO 87/02671; US 4.816.567; EP-søknad 0173494; Jones, et al., "Nature", 321:522-525 (1986); og Verhoeyen, et al., "Science", 239:1534-1536

(1988).

Slik det brukes her, er begrepet "human-lignende rammeverkregion" en rammeverkregion for hver antistoffkjede, og omfatter vanligvis minst ca. 70 aminosyreresidier, typisk 75-85 eller flere residier. Aminosyreresidiene av human-lignende rammeverkregion er minst ca. 80%, fortrinnsvis ca. 80-85%, og mest å foretrekke mer enn 85% homologene med de i et humant immunoglobulin. Dette felles-trekket med andre endogene antistoffer er nyttig i å generere en målrettet del som bare introduserer en mindre immunreaksjon, for eksempel en mekanisme som minimaliserer respons til "selv"-markører.

Slik det her brukes, betyr begrepet "humanisert" eller "human-lignende immunoglobulin" et immunoglobulin som omfatter en humanlignende rammeverkregion og en konstant region som hovedsakelig er homolog til en human immunoglobulinkonstantregion, som for eksempel har minst ca. 80% eller mer, fortrinnsvis ca. 85-90% eller mer og mest å foretrekke ca. 95% eller mer homologi. De fleste deler av et humanlignende immunoglobulin, mulig unntakelse for CDR, er således hovedsakelig homologe med tilsvarende deler av en eller flere native humane immunoglobulinsekvenser.

Slik det her anvendes, angir begrepet "hybrid antistoff11 et antistoff der hver kjede er separat homolog med referanse til en pattedyr-antistoffkjede, men kombinasjonen representerer en ny samling slik at to forskjellige antigener blir gjenkjent av antistoffet. I et hybridantistoff er et tungt og lettkjedet par homologe til det som man finner i et antistoff som er reist mot et antigengjenkjennende trekk, for eksempel epitop, mens det andre tunge og lette kjedeparet er homologt til et par man finner i et antistoff reist mot en annen epitop. Dette resulterer i egenskaper med mange-funksjonell valens, det vil si evnen til å binde ved minst to forskjellige epitoper samtidig. Slike hybrider kan naturligvis også dannes ved å anvende chimeriske kjeder.

Slik det brukes her, betyr begrepet "monoklonalt antistoff' en antistoffsammensetning som gjenkjenner en bestemt antigendeterminant. Den har ikke til hensikt å være begrensende når det gjelder kilden for antistoff eller på måten den er laget.

Ved å anvende standard metoder som er velkjent innenfor fagområdet, kan de variable regionene og CDR avledes fra et hybridoma som produserer et monoklonalt antistoff som er spesifikk for c-erbB-2. Nukleinsyresekvensen i foreliggende oppfinnelse som har evnen til til slutt å uttrykke de ønskede chimeriske antistoffene, kan dannes fira en lang rekke forskjellige nukleotidsekvenser (genomisk eller cDNA, RNA, syntetiske oligonukleotider, etc.) og komponenter (for eksempel V-, J-, D- og C-regioner), så vel som ved en lang rekke forskjellige teknikker. Sammenknytting av passende genomiske sekvenser er for tiden er vanlig metode ved fremstilling, men cDNA-sekvenser kan også bli utnyttet, se europeiske patentpublikasjon nr. EP-publikasjon 0239400 og Reichmann, L., et a., "Nature", 332:323-327 (1988).

Humane konstantregion DNA-sekvenser blir fortrinnsvis isolert fra udødeliggjorte B-celler, se for eksempel Heiter, et al., "Cell", 22:197-207 (1980), men kan isoleres eller syntetiseres fra en rekke andre kilder. Nukleotidsekvensen av et human immunoglobulin C i-gen er beskrevet av Ellison et al. i "Nucl. Acid. Res.", 10:4071 (1982); Beidler et al. "J. Immunol.", 141:4053 (1988); Liu et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei", USA, 84:3439

(1987).

CDR for fremstilling av immunoglobuliner ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis avledet fra monoklonale antistoffer som har evnen til binding til det ønskede antigenet, c-erbB-2-protein og som er fremstilt i en hvilken som helst hensiktsmessig pattedyrkilde, inkludert mus, rotter, kaniner, hamstre eller andre vertebrat-vertsceller som har evnen til å produsere antistoffer i velkjente metoder. Egnede cellekilder for DNA-sekvenser og vertsceller for immunoglobulinekspresjon og sekresjon kan oppnås fra et antall kilder som "American Type Culture Collection"

("ATCC") ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," (1985) Rockville, Maryland,

USA).

I tillegg til chimeriske antistoffpeptider som spesifikt er beskrevet her, kan andre "hovedsakelig homologe" modifiserte immunoglobuliner raskt utformet og fremstilles ved å utnytte forskjellige rekombinante DNA-teknikker som er kjent innenfor fagområdet. Modifikasjoner av genene kan raskt gjennomføres ved en lang rekke velkjente teknikker, som sete-rette mutagenese (se Gillman og Smith, "Gene", 8:81-97

(1979) og Roberts, S. et al., "Nature", 328:731-734 (1987). Disse modifikasjonene kan innbefatte aminosyreaddisjoner, delesjoner, substitusjoner, fortrinnsvis konservative og andre endringer i sekvensen av polypeptidet mens man beholder den riktige egenskapen eller den biologiske aktivitet. Alternativt kan polypeptidfragmenter som bare omfatter en del av den primære antistoffstruktur og innehar bindings- og/eller effektoraktiviteter, fremstilles. Også fordi, som mange gener, immunoglobulinbeslektede gener inneholder separate funksjonelle regioner, hver med en eller flere distinkte biologiske aktiviteter, kan genene kan sammensmeltes til funksjonelle regioner fra andre gener for å fremstille fusjonsproteiner (for eksempel immunotoksiner) som har nye egenskaper eller nye kombinasjoner av egenskaper.

Klonede variable og konstante regioner kan bli isolert fra plasmider og ligert sammen i en pattedyrekspresjonsvektor, for eksempel pSV2-neo eller pRSV-gpt, for å danne en funksjonell transkripsjonsenhet. Disse ekspresjonsvektorene kan derefter transfekteres i vertceller. Musemyelomaceller som SP 2/0- eller P3X-celler er en foretrukket vert fordi de ikke skiller ut endogent immunoglobulinprotein og inneholder alle komponentene som blir anvendt i en immunoglobulinekspresjon. Myelomaceller kan transfekteres ved å anvende relevante teknikker som beskrevet over.

Andre typer promotere og forøkere som er spesifikk for hver vertscelle er kjent innenfor fagområdet, Kameyoma, K. et al., over. DNA-sekvens som koder for den chimeriske antistoffaminosyresekvensen kan for eksempel bindes til gjærpromotere og forøkere og transfekteres inn i gjær ved metoder som er velkjent innenfor fagområdet, se Kriegler, over.

Den samme tilnærmelsen kan foretas for å isolere c-erbB-2-spesifikk CDR fra en kilde, for eksempel en pattedyrart, og rammeverkregionene av en annen kilde, for eksempel en annen pattedyrart. CDR kan derefter ligeres til rammeverkregionene og konstante regioner for å danne et chimerisk antistoff, se PCT nr. GB88/00731 (1989) og U.S.S.N. 07/808.462, inngitt 12. desember 1991. CDR kan så klones inn i en ekspresjonsvektor som omfatter for eksempel humane rammeverk og konstante regioner.

Et annet eksempel er en rekombinant DNA-sekvens som omfatter en tung og/eller lettkjedet CDR1, CDR2 og CDR3 og en art, slik som mus, og rammeverkregionene av human tung kjede for å kode for et antistoff som er spesifikk for c-erbB-2. Andre muligheter innbefatter anvendelse av CDR som er spesifikk for c-erbB-2; anvendelse av en del av den variable regionen som omfatter CDR1 og CDR2 fra en pattedyrart, og derefter ligere denne sekvensen til en annen som koder for rammeverkdelene av en annen pattedyrart til CDR3 av den første; eller transfektere en vertcellelinje med en rekombinant DNA-sekvens som koder for en c-erbB-2 spesifikk tungkjedet CDR avledet fra en første pattedyrart, anbrakt innimellom rammeverket til en annen pattedyrart med en lett kjede som inneholder en variabel region DNA-sekvens avledet fra den første arten og den konstante regionen avledet fra den andre arten.

Rekombinante DNA-ekspresjonsvektorer som omfatter antistoffsekvenser, kan transfekteres ved elektroporering inn i vertscellene. Standard seleksjonsprosedyrer blir anvendes for å isolere kloner som produserer c-erbB-2-spesifikt chimerisk antistoff.

Antistoffer kan uttrykkes i en egnet foldet form, inkludert enkelkjedede antistoffer, fra bakterier som E. coli, se Pluckthun, "Biotechnology", 9:545 (1991); Huse et al., "Science", 246:1275 (1989); og Ward, et al., "Nature", 341:544 (1989).

Antistoffpeptidsekvenser kan amplifiseres for kloning ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon eller PCR, en teknikk som anvendes for å forsterke en DNA-sekvens som er aktuell ved å anvende en termostabil DNA-polymerase, som Taq-polymerase og polymerase og oligonukleotidprimere, alle som beskrevet i PCR-protokoller, ed. Innis et al., "Academic Press, Inc." (1990), se også Orlandi, supra og Larrick et al., "Biotechnology", 7:934 (1989). c-erbB-2-protein (også her for enkelhets skyld kalt c-erbB-2) er et 185 Kd (Kilodalton) membranglykoprotein som har tyrosinkinaseaktivitet og som er beslektet med, men forskjellig fra, epidermisk vekstfaktorreseptor (EGFR). Som EGFR-proteinet har c-erbB-2-proteinet et ekstracellulært domene som inkluderer to cysteinrike gjentagende clustere, et transmembrandomene og et intracellulært kinasedomene. I tillegg er aminosyresekvensen av c-erbB-2-proteinet, så vel som nukleotidsekvensen, beskrevet av Coussens et al. i "Science", 230:1132 (1985). c-erbB-2-proteinet blir kodet av c-erbB-2-onkogenet som beskrevet i 1985 av tre forskjellige forskningsgrupper: Semba et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 82:6497 (betegner genet som c-erbB-2); Coussens, et al., supra (betegner genet som HER-2); og King, et al., "Science", 229:1132 (betegner genet som v-erbB-beslektet). c-erbB-2-gensekvensen og dens tilsvarende proteinsekvens er velkjent og beskrevet innenfor fagområdet. c-erbB-2-proteinet har en definert intracellulær utforming, en transmembranregion og en ekstracellulær region. De målrettede delene av foreliggende oppfinnelse vil typisk binde til den ekstracellulære regionen, som bør eksponeres til det ytre av den neoplastiske cellen. Den målrettede delen vil normalt gjenkjenne et trekk eller trekk som der finnes, inkludert en ligandbindende region, eller antigengjen-kj enningsseter, for eksempel epitoper. Epitopene vil ofte være rettet mot rene polypeptidepitoper, enten lineære peptidsekvensdeterminanter eller konformasjonsdeterminanter, men kan også være rettet mot epitoper som har karbohydratkomponenter. Epitopene kan således inkludere kombinert protein/karbohydratkomponenter, eller karbohydratkomponenter alene. Andre modifikasjoner av proteinet, normale eller unormale, vil innebære viktige epitopiske determinanter også.

Påvisning av c-erbB-2-proteinet kan gjennomføres ved velkjente immunoanalyser som benytter antistoffer spesifikt til c-erbB-2-proteinet, for eksempel de som her er beskrevet. Slike antistoffer er kommersielt tilgjengelig, for eksempel fra Chemicon International, Inc., Temecula, CA eller kan fremstilles ved standard immunologiske prosedyrer, se Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988).

Det er her ment at c-erbB-2-proteindefinisjonen også vil innbefatte de proteinene som er utviklet fra andre vertssystemer, for eksempel proteiner som er immunologisk beslektet med human c-erbB-2-protein. Et beslektet rottegen (betegnet neu) er for eksempel blitt rapportert av Schecter et al., "Science", 229:976 (1985).

Nyttige epitoper til hvilke antistoffer lett kan tilveiebringes, innbefatter ekstracellulære epitoper som man finner på målceller. Disse epitopene vil generelt være proteinepitoper, for eksempel lineære eller konformasjonsepitoper av proteinet slik man finner på neoplastiske celler. Andre nyttige epitoper vil inkludere ikke-proteinholdige komponenter inkludert karbohydrat eller andre modifikasjoner, vanligvis post-trans-lasjonale, som man finner på c-erbB-2-proteinet. Antistoffer og andre bindingsregioner som utviser bindingspesifisitet for overuttrykt c-erbB-2 kan tilveiebringes mot fragmenter av proteinet.

Det har vært laget musmonoklonale antistoffer mot den ekstracellulære delen av c-erbB-2. Et eksempel på et slikt antistoff er TAb 250, som er deponert med "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland (ATCC) og bærer nummer HB 10646.

Alternativt kan en målrettet del avledes fra en hvilken som helst annen målrettet metode som oppviser affinitet og spesifisitet for en c-erbB-2-ekspresjonscelle. En ligand som er gjenkjent og bundet ved c-erbB-2-proteinet, vil for eksempel være en nyttig måldel, se for eksempel Ciccodicola et al., (1989) "Embo J." 8:1987-1991; Ciardiello et al., (1991) "Cancer Research" 51:1054; og Ciardiello et al., (1991) P.N.A.S. USA 88:7792-7796, som beskriver CRIPTO, et molekyl som synes å tjene som en ligand for EGF-reseptoren, og som sannsynligvis også vil binde med spesifisitet til c-erbB-2-proteinet.

Når det gjelder de sekvensene som er beskrevet her, er det underforstått at varianter av disse sekvensene også er innbefattet, slik som substitusjons-, addisjons- og/eller delesjonsmutasjoner, eller andre sekvenser som innehar hovedsakelig tilsvarende bindingsaktivitet til sekvensene fra hvilke de er avledet fra eller på annen måte ligner. For oppfinnelsen er et antistoff eller annet peptid spesifikk for et c-erbB-2-protein hvis antistoff eller peptidet binder eller har evne til binding av c-erbB-2, for eksempel protein som målt eller bestemt ved standard antistoff-antigen eller ligand-reseptoranalyser, for eksempel konkurrerende analyser, metningsanalyser eller standard immunoanalyser som ELISA eller RIA. Denne definisjonen av spesifisitet anvendes på enkle tunge og/eller lette kjeder, CDR, fusjonsproteiner eller fragmenter av tunge og/eller lette kjeder, som også er spesifikk for c-erbB-2-protein hvis de binder c-erbB-2-protein alene, eller hvis, når de er inkorporert i immunoglobulinkonformasjonen med komplementære variable regioner og konstante regioner som passer, har dermed evne til binding av c-erbB-2-protein med spesifisitet.

I konkurrerende analyser kan evnen til et antistoff eller et peptidfragment å binde et antigen bestemmes ved å påvise evnen hos peptidet til å konkurrere med binding av en forbindelse som er kjent fir å binde antigenet. En lang rekke typer av konkurrerende analyser er kjent og skal her diskuteres. Analyser som måler binding av en testforbindelse i fravær av en hemmer kan alternativt også anvendes. For eksempel kan evnen hos et molekyl eller annen forbindelse til å binde c-erbB-2-proteinet detekteres ved å merke det aktuelle molekylet direkte eller det kan være utmerket og påvises indirekte ved å anvende forskjellige sandwich-analyseformater. Tallrike typer av bindingsanalyser er kjent, for eksempel konkurrerende bindingsanalyser, (se for eksempel US 3.376.110,4.016.043, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988), og Coligan et al., (eds), "Current Protocol in Immunology", Wiley and Sons, N.Y. Analyser for måling av binding av en testforbindelse til en komponent alene isteden for anvendelse av en konkurrerende analyse, er også tilgjengelig. Immunoglobulinene kan for eksempel anvendes for å identifisere nærværet av c-erbB-2-proteinet. Standard prosedyrer for monoklonale antistoffanalyser, slik som ELISA, kan anvendes (se Harlow and Lane, supra). For en oversikt for forskjellige signalproduserende systemer som kan anvendes, vises det til US 4.391.904.

Spesifisiteten av bindingsdelene til c-erbB-2 kan videre bestemmes ved deres affinitet. Slik spesifisitet eksisterer hvis dissosiasjonskonstanten (Krj = l/K, der K er affinitets-konstanten) av delen er < 1 uM, fortrinnsvis < 100 nM, og mest å foretrekke < 1 nM. Antistoffmolekyler vil typisk ha en Krj) i de lavere områder. Kp = [R-L]/[R][L] der [R], [L] og [R—L] er konsentrasjonene ved likevekt av henholdsvis reseptor eller c-erbB-2 (R), ligand, antistoff eller peptid (L) og reseptor-ligandkompleks (R-L). Bindingsinteraksjoner mellom ligand eller peptid og reseptor eller antigen inkluderer reversible, ikke-kovalente assosiasjoner som elektrostatisk tiltrekning, Van der Waalske krefter og hydrogenbindinger.

Andre analyseformater kan innbefatte deteksjon av nærvær eller fravær av forskjellige fysiologiske eller kjemiske endringer som resultat av interaksjon, for eksempel nedmodulering, internalisering eller en økning i fosforylering, som beskrevet i US-søknad 07/644,361, se også "Receptor-Effector Coupling - A Practical Approach", utg. Hulme, ERL Press, Oxford (1990).

Et foretrukket peptid som er spesifikt for c-erbB-2-proteinet induserer en økning i fosforylering av c-erbB-2-proteinet når det blir brakt i kontakt med tumorceller som uttrykker c-erbB-2-proteinet. Et molekyl som "induserer en økning i fosforylering av c-erbB-2-protein" er et som sørger for en påvisbar økning i inkorporering av fosfat i proteinet over det som forekommer i fravær av molekylet. Denne typiske påvisbare økningen vil være en to-ganger eller høyere økning i fosforylering, fortrinnsvis mer enn en tre-ganger økning over kontroller. Fosforylering kan måles ved de metodene som kjent innenfor fagområdet for påvisning av fosforylering av reseptorer, se for eksempel Cooper et al., "Methods in Enzymology", 99:387-402 (1983); "Antoniades and Pantazis, Methods in Enzymology", 147:36-40 (1987); og Lesniak et al., "Methods in Enzymology", 150:717-723 (1987).

Fosforylering kan typisk måles ved in vivo-fosforylering av intakte celler (Lesniak, supra) eller ved in vitro autofosforyleringsreaksjon (Antonaides, supra). For å måle in vivo-fosforylering, kan for eksempel analyser gjennomføres der celler som bærer c-erbB-2-proteinet bringes i kontakt med radioaktivt merket fosfat. For å påvise fosforylering av c-erbB-2-proteinreseptoren i in vivo-analysen, er det fordelaktig å inkubere testcellene i ca. 12 til 18 timer, med merket fosfat. Cellene er oppdelt i to eller flere satser, der noen er eksponert til molekylet som forventes å øke fosforylering av respetoren og noen blir separert ut som kontroller. Prøver blir derefter immunoutfelt, reseptoren blir gjenkjent, for eksempel ved SDS-polyakrylamidgel eller autoradiografimetoder, og en økning i fosforylering blir betraktet å være statistisk signifikant der det er en to-ganger eller høyere økning i bakgrunn av prøven eksponert til testmolekylet i forhold til kontrollprøver.

For å måle in vitro-autofosforylering, kan for eksempel celler eller celleekstrakter inkluderes i nærvær eller fråvær av peptidet som er spesifikt for c-erbB-2. Efter immunoutfelling med anti-c-erbB-2-antistoff, kan immunkomplekset inkuberes med

Y<32->P-ATP og analysert ved SDS-PAGE-autoradiografi.

Et annet foretrukket peptid som er spesifikt for c-erbB-2-protein er et som forårsaker nedmodulering av c-erbB-2-proteinet. "Nedmodulering av c-erbB-2-proteinet" blir bestemt ved en påvisbar nedgang i nærvær av tumorceller av c-erbB-2-reseptoren. Slik nedmodulering blir påvist ved nedgang i evnen hos antistoffene eller andre spesifikke bindingsdeler til å binde til eller gjenkjenne c-erbB-2-reseptorproteinet på tumorceller. Nedmodulering kan for eksempel bestemmes ved å inkubere tumorceller som bærer c-erbB-2-proteinreseptoren med peptidet som er aktuelt, vasking av cellene, derefter å bringe cellene i kontakt med merkede antistoffer (fortrinnsvis radiomerket) som er spesifikk for c-erbB-2-proteinet. Grad av binding av merkede anti-c-erbB-2-antistoffer til cellene eksponert til peptidet som er spesifikt for c-erbB-2-protein blir sammenlignet med grad av binding av antistoffer til kontrollceller (det vil si ikke eksponert til c-erbB-2-spesifikk peptid). Det er fordelaktig for disse analysene at cellene direkte blir utsatt for merkede anti-c-erbB-2-antistoffer efter vasking.

Nedmoduleringen som blir observert er typisk doseavhengig, det vil si grad av nedmodulering øker med mengde av peptid som er spesifikk for c-erbB-2-protein eksponert til c-erbB-2-proteinet. Et peptid som forårsaker en nedgang med 90% eller mer av binding av de behandlede cellene versus kontrollceller til anti-c-erbB-2-antistoffer, er foretrukket.

Et annet foretrukket peptid som er spesifikt for c-erbB-2-protein er et som binder tumorceller som uttrykker c-erbB-2-protein og blir internalisert når det blir anbrakt i kontakt med slike tumorceller. "Internalisering" forekommer når peptider blir sekvestrert i cytoplasma av cellene. Med en gang det er internalisert, kan reseptor og/eller peptid nedbrytes i cellelysosomene eller de kan resirkuleres til celleoverflaten. En metode for å bestemme internalisering av et ligand-reseptorkompleks er også beskrevet av Haigler et al. i "J. Biol. Chem.", 255:1239-1241 (1980).

En cellevekstmodulator er et molekyl som påvirker veksten av en celle som den er rettet mot. Modulatoren må typisk være internalisert i målcellen, men denne funksjonen blir vanligvis tilveiebrakt ved internalisering som et resultat av den målrettede delen.

Moduleringen vil typisk medføre en nedgang i metabolisme eller veksthastighet, fortrinnsvis ved en cytotoksisk effekt, men en signifikant økning i metabolisme eller veksthastighet vil også være nyttig. Når en signifikant økning i metabolisme eller veksthastighet blir påvirket, kan en kortidsgift anvendes i kombinasjon for å bare drepe de cellene der slikt vises.

For modulatorer som minsker metabolisme eller veksthastighet, er det foretrukket at modulatoren er meget potent, det vil si har en meget høy aktivitet. Toksinet kan innbefatte uorganiske eller enkle organiske molekyler, men biologiske molekyler vil vanligvis være mer potente. Selv om virale og fungale toksiner eksisterer, har spesielt bakterie- eller plantetoksiner blant de høyest spesifikke aktivitetene som er kjent. Vekststopp kan forekomme ved hindring av en hvilken som helst av et antall essensielle cellulære funksjoner inkludert nukleinsyresyntetiske, proteinsyntese og cellulær metabolisme, generell eller spesifikk. Pseudomonas exotosin og difteria toksin fungerer for eksempel ved irreversibel stopping av proteinsyntese i eukaryotiske celler. Begge eksempler inaktiverer enzymatisk elongeringsfaktor 2, som er en vesentlig komponent i proteinsyntese. Andre forlengelsesfaktorer kan være målrettede for andre toksiner. Ricin, i motsetning, er et plantetoksin som virker direkte på ribosomet, virker på 285 rRNA.

Vekstmodulatorer vil fortrinnsvis ha enzymatiske aktiviteter med høyere turnover-tall slik at internalisering av meget få molekyler kan drepe målcellen, se Pastain, et al., "Science" 254:1173-1177.

Gelonin er et glykoprotein (M.W. tilnærmet 29-30000 Kd) renset fra frø av Gelonium multiforum og tilhører en klasse potente ribosomal-inaktiverende plantetoksiner. Andre medlemmer fra denne klassen innbefatter kjeder av abrin, ricin og modeccin. Gelonin, som abrin og ricin, hemmer proteinsyntese ved å skade 60S-subenheten av pattedyrribo-somer. Gelonin synes å være stabil overfor kjemisk og fysikalsk behandling. Gelonin selv binder videre ikke til celler og er normalt ikke-toksisk (med unntakelse for høye konsentrasjoner) når de blir administrert alene, og er sikker å manipulere i laboratoriet. Inaktivering av ribosomer er irreversibel, og synes ikke å involvere ko-faktorer, og forekommer med en effektivitet som antyder at gelonin virker enzymatisk.

Gelonin og ricin hemmer proteinsyntese og er blant de mest aktive toksinene på en proteinvektbasis. Gelonin er 10 til 1000 ganger mer aktiv ved hemming av proteinsyntese enn ricin A-kjeden. Peptider som ricin og abrin består av to kjeder, en A-kjede som er den toksiske enheten og en B-kjede som virker ved binding til celler. I motsetning til ricin og abrin, består gelonin av en enkel kjede, og fordi den mangler en B-kjede for binding til celler, er den selv relativt inert, eller ikke-toksisk til intakte celler. Dette trekket med å ha en mye lavere cellulær effekt når den ikke er konjugert til en binding eller målrettet del, er et viktig trekk ved forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen. Denne differensielle toksisiteten er viktig med høy spesifisitet for c-erbB-2-uttrykkende celler.

Pattedyrceller mangler tilsynelatende evnen til å binde og/eller internalisere det native geloninmolekylet. Konjugater av gelonin med et tumormålrettet reagens, slik som det monoklonale antistoffet TAb 250 rettet mot et tumorassosiert antigen som er tilstede på visse tumorceller, skaffer til veie både en spesifikk fremgangsmåte for binding av gelonin til cellen og en vei for internalisering av gelonin-antistoffkomplekset.

Cytotoksisitetsdelen av immunotoksinet kan være et cytotoksisk medikament eller et enzymatisk aktivt toksin av bakteriell eller planteopprinnere, eller et enzymatisk aktivt fragment ("A-kjede") av et slikt toksin. Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter av disse er foretrukkede og eksemplifiseres ved gelonin, difteria A-kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteriatoksin, eksotoksin A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa, ricin A-kjede, abrin A-kjede, modeccin A-kjede, a-sarcin, Aleurites fordii-proteiner. diantinproteiner, Phvtoiacca americana-<p>roteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-hemmer, curcin, crotin, saponaria officinalis-hemmer, mitogellin, restrictocin, fenomycin og enomycin. Aktive toksiner kan fungere ved en hvilken som helst av et antall mekanismer, hver av disse påvirker cellulær fysiologi og vekst. Toksinene kan være metabolske hemmere eller gifter, nukleinsyresyntesehemmere, proteinsyntese-hemmere eller andre mediatorer for unormale eller skadelige funksjoner. Mest foretrukket er konjugasjon med gelonin.

Aktive fragmenter og derivater innbefatter en hvilken som helst forbindelse som har samme kjernestruktur som fullengdestrukturen av gelonin, men som mangler hele den primære sekvensen. Disse fragmentene eller derivatene vil ha samme eller forbedret biologisk eller cytotoksisk aktivitet som gelonin. Cytotoksisiteten av geloninrfagmenter eller derivater kan rutinemessig bli bestemt av personer med kunnskap innenfor fagområdet ved å anvende kaninretikulocyttlysatanalyse.

Biologisk responsmodifiserere som kan bli koplet til TAb 250 antistoff anvendt i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, lymfokiner og cytokiner som IL-1, IL-2, interferoner (a, R eller y), TNF, LT, TGF-13 og IL-6. Disse biologiske responsmodifisererne har varierende effekter på tumorceller. Blant disse effektene er øket tumorcelledreping ved direkte virkning så vel som øket tumorcelledreping ved økte vertsforsvarmedierte prosesser. Konjugering av antistoff TAb 250 til disse biologiske responsmodiflsererne tillater selektiv lokalisering eller målretting til tumorer eller celler som er overuttrykker c-erbB-2, og således forbedret antiproliferative effekter. Dcke-spesifikke effekter som fører til toksisitet av ikke-målceller vil bli begrenset siden den valgte cellevekstmediatoren er ineffektivt fraværende en målrettet komponent.

Cytotoksiske medikamenter (og derivater av disse) som er nyttige i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til adriamycin, cis-platinkompleks, bleomycin og metotrexat. Disse cytotoksiske medikamentene er nyttige for klinisk styring av gjentagende tumorer, men deres anvendelse er komplisert ved alvorlige sideeffekter og skade forårsaket på ikke-målceller. TAb 250-antistoff kan tjene som en nyttig bærer av slike medikamenter som skaffer tilveie en effektiv måte for både avlevering til tumoren og øket inngang i tumorcellene selv. I tillegg vil den spesifikke antistoffavleveringen av cytotoksiske medikamenter til tumorer skaffe tilveie beskyttelse fra skadelig virkning av kjemoterapeutiske midler av sensitive seter som ikke overuttrykker c-erbB-2 slik som lever og benmarg. Anvendelse av medikamenter konjugert til TAb 250-antistoff som et avleveringssystem tillater lavere dosering av medikamentet selv, siden alle medikamentdeler er konjugert til antistoffer som konsentrerer på neoplastiske celler, og vil vanligvis være internalisert deri.

Den målrettede delen og cellevekstmodulatoren kan konjugeres ved å anvende en lang rekke bifunksjonelle proteinkoplingsmidler. Eksempler på slike reagenser er N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)(propionat)(SPDP), 2-IT,

4-succinimidyloksykarbonyl-_-metyl-_(2-pyridylditio)toluen(SMPT) bifunksjonelle derivater av imidoestere slik som dimetyladipimidat, HC1, aktive estere som disuccin-imidylsuberat, aldehyder som glutaraldehyd, bis-azidoforbindelser som bis(p-azido-benzoyl)heksandiamin, bis-diazoniumderivater som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin, diisocyanater som tolylen 2,6-diisocyanat og bis-aktive fluorforbindelser som en l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen.

Før anvendelse av disse studiene vil Sp2/0-Agl4 celler dyrkes initielt i nærvær av 0,1

ug/ml nativ gelonin. Over flere måneder vil konsentrasjon av gelonin gradvis øke inntil cellene kan holdes i opptil 10 mg/ml. Celler vil derefter klones ved begrenset fortynning i nærvær av 10 mg/ml gelonin som er og resulterende kolonier resistente mot gelonin vil ekspanderes. Gelonin vil derefter fjernes fra kulturmediet for to føringer og celler igjen utfordret med gelonin-eksponering for å bekrefte utvikling av stabil-resistente kloner. Eftér tester for å bekrefte produksjon og aktivitet av kimerisk TAb-250, vil

gelonin-resistent SP2/0-celleproduksjonantistoff dyrkes og cDNA for TAb 250 antistoff fjernet fra total DNA ved inkubasjon med restriksjonsendonuklease. Parallelt vil cDNA fra JM105 E—Coli uttrykt optimalisert gelonin fjernes, renses og DNA som koder for gelonin frigjøres efter spalting med Hindlll og Eco RI. Geloningenet vil ligeres inn i tung-kjederfagmentet og innskuddet erstattes i geloninresistente SP2/0 celler. Celler vil derefter sub-klones ved begrenset fortynning og kloner screenes for både kimerisk antistoffproduksjon og gelonininnhold. Til slutt vil positive kloner ekspanderes og rekombinant funsjonsprotein vil renses og testes både i in vitro-cytotoksisitetsanalyser og in vivo-vevsfordeling, farmakokinetikk, terapeutiske prøver og toksisitetsprøver. En sammenligning av TAb-250-gelorunfusjonsproteinegenskaper med karaktertrekkene til tidligere beskrevet TAb 250 geloninkonstruksjoner vil gjennomføres for å bestemme fordeler og ulemper ved hver. Basert på disse studier kan en Fase I klinisk studie av kimerisk TAb 250 geloninfusjonsprotein gjennomføres i pasienter med fremskreden brystcancer.

Administrering av immunotoksiner i foreliggende oppfinnelse til et individ som er diagnostisert til å ha neoplastiske celler, for eksempel en tumor med et uønsket nivå av ekspresjon av c-erB-2 enkogen, vil tillate målretting og konsentrasjon av det cytotoksiske middel der det er nødvendig for å drepe disse. Ved slik målretting av cytotoksiske midler, vil ikke-spesifikk toksisitet til andre organer, vev og celler bli eliminert, minimalisert eller minst redusert.

Når det blir anvendt in vivo for terapi, blir immunotoksiner i foreliggende oppfinnelse administrert til pasienten eller et dyr i terapeutisk effektive mengder, det vil si mengder som eliminerer eller reduserer tumorbelastningen. De vil normalt administreres parenteralt, fortrinnsvis intravenøst, men andre administreirngsveier vil anvendes dersom de passer. Dose og doseringssystem vil avhengig av cancertype (primær eller metastatisk) og dens populasjon, karaktertrekkene ved det spesielle immunotoksin, for eksempel den terapeutiske indeks, pasient, pasientens historie og andre faktorer. Mengden av immunotoksin som administreres vil typisk være i området fra ca. 0,1 til 10 mg/kg pasientvekt. Skjema vil fortsette for å optimalisere effektivitet mens det er balansert mot negative effekter av behandling. Se Remington's "Pharmaceutical Science", 17th Ed. (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; og Goodman og Gilman's: "The Pharmacological Basis of Therapeutics" 8. utgave (1990) Pergamon Press.

For parenteral administrering vil immunotoksinet typisk formuleres i en enhetsdose-injiserbar form (oppløsning, suspensjon, emulsjon) i forbindelse med en farmasøytisk aksepterbar parenteral bærer. Slike bærere er fortrinnsvis ikke-toksiske og ikke-terapeutiske. Eksempler på slike bærere er vann, saltvann, RingerVopptøsning, dekstroseoppløsning og 5% human serumalbumin. Ikke-vandige bærere som fikserte oljer og etyloleat fikserte oljer og etyloleat kan så anvendes. Liposomer kan anvendes som bærere. Bæreren kan inneholde mindre mengder additiver som substanser som øker isotonisitet og kjemisk stabilitet, for eksempel buffere og preservativer. Immunotoksin vil typisk formuleres i slike bærere ved konsentrasjoner på ca. 0,1 mg til 10 mg ml.

Immunotoksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i en in vitro-metode. Metoden kan for eksempel anvendes for å drepe tumorceller fra benmarg. I denne metoden blir benmargen først fjernet fra et individ som har en neoplastisk sykdom. Derefter blir benmargen behandlet med en cytosidisk effektiv dose av et immunotoksin i foreliggende oppfinnelse for å eliminere resterende tumorceller. Behandlede benmargceller kan administreres på nytt til pasienten for å gjenetablere et immunosystem efter at man har mottatt intensiv kjemoterapi og/eller radioterapi for å eliminere alle endogene neoplastiske hemotoksiske celler.

Immunotoksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å utvide overlevelsestiden av tumorbærende pattedyr og for å retardere veksthastigheten av tumorer som er omfattet av cancerceller båret av pattedyr. Nakne mus som bærer xenografter av humane tumorer som vokser subkutant eller interperitonelat kan for eksempel behandles med doser av immunotoksin, et antistoff alene, toksin alene eller saltvann ved en dose mellom 25 og 100 mg/kg. Tumorveksthemming kan måles ved endring i fysikalsk størrelse av subkutane tumorer eller ved forlengelse av overlevelse i mus-bærende interperitoneale tumorer som SKOV-3 celler. Slike studier kan være nyttig eller indikative for metodologier og som kan anvendes på andre pattedyr inkludert primater.

Følgende eksempler skaffer til veie en detaljert beskrivelse av fremstilling, karakterisering og anvendelse av immunotoksinene i oppfinnelsen.

Eksempel 1

Rensing av gelonin

En fremgangsmåte for isolering av gelonin er tilgjengelig i Stripe, et al., "I. Biol. Chem", 255,6947-53 (1980). Frø fra gelonium multiflorum fikk fjernet skallet og nøttene ble knust i en homogenisator med åtte volumer 0,14 M NaCl inneholdende en 5 mM natriumfosfat (pH 7,4). Homogenatet fikk stå over natten ved 4°C med kontinuerlig omrøring, ble avkjølt på is og sentrifugert ved 35.000 ganger g i 20 minutter ved 0°C.

Supernatanten ble fjernet, dialysert mot 5 mM natriumfosfat (pH 6,5) og konsentrert ved å anvende et pm 10 filter. Prøven ble lagt på en CM-52 ionebytterkolonne (20 cm x 1,5 cm) ekvilibrert med 5 mM natriumfosfat (pH 6,5). Materialet som bandt seg til ionebytterharpiksen ble eluert med 400 ml av en lineær NaCl gradient fra 0 til 0,3 M ved en hastighet på 25 ml pr. time ved 4°C. 5 ml fraksjoner ble samlet. Fraksjonene ble registrert ved 280 nm i et spektrofotometer. Gelonin eluerte i fraksjoner ca. 55-70 og var siste hovedelueringstopp. Fraksjoner 55-70 ble samlet, dialysert mot dobbelt destillert vann og konsentrert ved lyofilisering. Renheten og molekylvekt av hver fremstilling ble undersøkt i en høytrykkvæskekromatografi ved å anvende en TSK 3000 gel gjennomtrengningskolonne med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4 og 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-page). Gelonin beveget seg som et enkelt bånd med en tilnærmet molekylvekt på 29-30.000 dalton.

Eksempel 2

Analyse av geloninaktivitet

Geloninaktiviteten ble registrert i en cellefri proteinsyntesehemmingsanalyse. Den cellefrie proteinsyntesehemmingsanalysen ble gjennomført ved i rekkefølge å sette til 50 ul kaninretikulocyttlysat, blanding efter hver tilsetning, følgende komponenter: 0,5 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 7,8), 8,9 ml etylenglykol og 0,25 ml 1 M HC1). 20 mikroliter av en salt-aminosyre-energiblanding (SAEM) besto av: 0,375 M KC1,10 mM Mg(CH3C02)2.15 mM glukose, 0,25-10 mM aminosyrer (eksklusiv leucin), 5 mM ATP, 1 mM GTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 ul Creatinin fosfat-creatinin fosfokinase, 12 ul 3H leucin (Amersham, 74 mCi/mmol), og tilsetning av 1,5 ul av oppløsningene inneholdende varierende konsentrasjoner av geloninblandingen. Blandingen ble inkubert i 60 minutter ved 30°C. ^H-leucininkorporering ble registrert i en prøve av blandingen ved utfelling av syntetisert protein på glassfiberfilteret, vasking i 10% TCA av aceton, og registrering av radioaktivitet i en Ji-teller ved å anvende Aquasol scintillasjonsfluid. Gelonin med en spesifikk aktivitet som ikke var lavere enn 4 x 10^ U/mg ble anvendt for konjugasjon med antistoffene. En enhet av geloninaktivitet er mengden av geloninprotein som sørger for 50% hemming av inkorporering av [<l>^C] leucin i protein i den cellefrie analysen.

Eksempel 3

Konjugering av Tab 250 med geloninfremstilline av 2- IT modifisert <g>elonin

Gelonin i fosfatbufret saltvann ble konsentrert til tilnærmet 10 mg/ml i en centriprep 10 konsentrater. Trietanolaminhydroklorid (TEA/HC1), pH 8,0 og EDTA ble satt til en sluttkonsentrasjon på 60 mM TEA/HC1 og 1 mM EDTA, pH 8,0. 2-iminotiolanforrådoppløsning (500 mM i 60 mM TEA/HCl-buffer inneholdende 1 mM EDTA, pH 8,0) ble |satt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM EDTA og prøven ble inkubert i 90 min. ved 4°C under en strøm av nitrogengass med omrøring. Overskudd iminotiolan ble fjernet ved gelfiltrering på en kolonne av Sefadex G-25 (1 x 24 cm) for-ekvilibrert med fosfat-EDTA buffer, pH 7,5 inneholdende 0,01 M Na2HP04,0,0018 M KH2PO4,0,0034 M KC1, 0,001 M EDTA og 0,17 M NaCl. Fraksjonene ble analysert

for proteininnhold i mikrotiterplater ved anvendelse av Bio-Rad analyse. Gelonin eluert i det tomme volumet (ca. fraksjoner 21-23). Disse fraksjonene ble samlet og lagret ved 4

Eksempel 4

Fremstilling av monoklonale antistoffer

BALB/c mus ble immunisert intraperitonealt (i.p.) og subkutant (s.c.) med 2 x 10^-1 x IO<7> NIH3T3x (NIH373 celler transfektert med c-erbB-2) celler emulgert i 1:1 i komplett Freund's adjuvant. Dyr ble forsterket hver 2 til 4 uker. Når positive titere i en ELISA (beskrevet nedenfor) ble påvist, ble det gitt en endelig i.p. eller intravenøs (i.v.) forsterkning 4 dager før fusjon. Miltceller ble sammensmeltet med P3-X63Ag8.653 myeloma celler i RPMI1640,10% FBS og 2 mM L-glutamin. Hybridomasupernatanter ble undersøkt for positiv radioaktivitet i en ELISA (se under), og en ekstracellulær domenereaktivitet ble bestemt ved indirekte immunofluoressens ved å anvende ufiksert NIH3T3 og NIH3T3x celler ved 4 °C etterfulgt av strømcytometrisk analyse. Monoklonalt antistoff TAb 250 kan oppnås fra en hvilken som helst kilde. Det er å foretrekke at anti-c-erbB-2 antistoff som anvendes i foreliggende oppfinnelse er enten et humant antistoff eller et murint antistoff.

Hybridomaceller som produserer TAb 250 ble dyrket i en 2 1 kontinuerlig perrusjonsbioreaktor. Cellesupernatanten fra bioreaktoren ble filtrert og deretter ført gjennom et protein-G Trio system etterfulgt av ionebytterkromatografi. Materialene ble derefter konsentrert og sterilfiltrert. Testing av sluttproduktet inkluderer tester av total DNA, proteinrenhet, pH, (IEF), total protein, endotoksin, potens, identitet og protein-G-antigen.

Foreliggende oppfinnelse utnytter blant annet et kimerisk antistoff, inkluderer et hybridantistoff eller et humanisert eller human-lignende antistoff. I en foretrukket utførelsesform er den variable sekvensen som har opprinnelse i og som hovedsakelig er identisk med en sekvens av murin TAb 250 antistoff. Et slikt kimerisk antistoffer BACh-250.

Eksempel 5

ELISA- analvse

Sterile 96-brønners plater ble forbehandlet i 2 timer ved 37°C med bovin kollagen ved 1 mg/ml i steril PBS. NIH3T3x (NIH353 celler transformert med vektoren) ble dyrket til 80% konferens og høstet med varm Puck's Versen (0,02% EDTA i PBS), vasket og bragt på plate ved 0,5-1 x 10^ celler/ml i de behandlede brønnene over natten ved 37 °C. Platene ble vasket forsiktig og behandlet med 10% nøytralbufret formalin etterfulgt av et blokkeringstrinn med 1% bovint serumalbumin BSA/PBS. Prøvesupernatanter eller antistoffortynning ble derefter satt til platene og inkubert i 2 timer ved 37°C etterfulgt av inkubering med en alkalisk fosfat-konjugert geite-anti-mus IgG Fc-spesifikt sekundært antistoff og inkubert i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket med PBS, et para-nitrofenylfosfat og dietanolaminsubstrat ble tilsatt og inkubert i 15 min. ved romtemperatur, og A4Q5 ble målt. Supernatanter eller antistoffer som reagerte med transfekterte celler ved en absorbans på 0,2-1,0 høyere enn den absorbansen for et negativt kontrollantistoff ble betraktet som positiv.

Eksempel 6

Fremstilling og behandling av H ^ l - TAb 250

TAB 250 ble radiomerket ved å anvende Iodobeads (Pierce) i henhold til forhandlerens spesifikasjoner. Bærer-fri Nai 25I (400 uCi av IMS. 30, Amersham) ble omsatt med 25 ug TAb 250 i 100 mM Na-fosfatbuffer (200 ul, pH 7,4) i nærvær av 3 Iodobeads. Dette resulterte i et passende forhold av et jodatom pr. IgG-molekyl. Inkorporeringen fikk skje ved romtemperatur i 7,5 min. med periodisk tilbakevendende blanding. Reaksjonsblandingen ble fjernet fra perlene, og etter 5 min. ble volumet justert til 0,5 ml med Na-fosfatbuffer og 2 ul ble tatt for å estimere spesifikk aktivitet (se nedenfor). Gjenværende volum ble avsaltet ved gelflltrering ved å anvende NAP-5 kolonne

(Pharmacia) ekvilibrert med PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,02% azid. Radiomerket antistoffble eluert i 1 ml kolonnebuffer og ble lagret ved 4°C i opptil 6 uker uten noe tilsynelatende tap av bindingsaktivitet. Avsaltet materiale var hovedsakelig fritt for uinkorporert jod siden >95% var TCA-utfellbart.

Spesifikk aktivitet av radiomerket antistoffble estimert ved TCA-utfelling av materialet før avsaltingstrinnet. 2 ul av reaksjonsblandingen ble således fortynnet 500 ganger i kolonnebuffer og doble prøver blandet med et likt volum iskald 20% TCA. Efter 25 minutter på is ble det utfelte materialet samlet ved sentrifugering (10 min., 3000 xg). Supernatanter og pelleter ble tellet separat og inkorporering ble uttrykt som prosent av TCA-utfellbare tellinger. Inkorporeringen som ble oppnådd i separate joderinger var i området fra 27% til 45%, og dette gir spesifikk aktivitsestimater fra 3,9 til 7,2 uCi/ug. Før hvert bindingseksperiment ble en passende mengde <125>j_TAb 250 avsaltet ved gelfiltrering ved å anvende en NAP-5 kolonne ekvilibrert i bindingsbuffer. Denne prosedyren fjernet azidet og ga materialet som rutinemessig var >98% TCA-utfellbart.

Eksempel 7

Cellekultur

Human brystadenokarcinomacellelinjer, SKBR-3, MDA-MB-453 og MDA-MB453, og MDA-MB-231, og human ovarieadenokarcinomacellelinje SKOV-3 ble anvendt. SKBR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-453 celler ble holdt i minirnalt essensielt medium supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin. Medium for MDA-MB-453 celler inneholdt også 1% ikke-essensiell aminosyre og 1% vitaminer. SKOV-3 celler ble dyrket i Iscov's modifiserte Dulbecco's medium supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin. Alle kulturer ble inkubert ved 37°C i enten 5 eller 10% C02 efter behov.

Eksempel 8

Internalisering av 125r. TAb 250

Internalisering av ^ l- TAb 250 ble fastslått ved å bestemme mengde av radioaktivitet i syresensitive og insensitive kamre. Celler ble høstet og suspendert på nytt i iskald

bindingsbuffer med <125>j_TAb 250 alene (fra 6 ng/ml til 153 ng/ml) eller med overskudd umerket TAb 250 for å bestemme ikke-spesifikk binding. Efter at celleoverflatebinding av radiomerket antistoff oppnådde likevekt, ble cellene pelletert ved 200 x g i 5 minutter 4°C og vasket tre ganger med iskald bindingsbuffer for å fjerne ikke-bundet antistoff. Cellepelletene ble suspendert på nytt i iskald bindingsmedium og prøve ble tatt for å

bestemme mendge av initiell 125i_TAb 250 overflatebinding. For å initiere internalisering av radiomerket antistoff, ble cellene oppvarmet til 37°C. Ved tidspunkter fira 15 til 150 minutter ble prøver fjernet og cellene samlet ved sentrifugering (1400 x g i 5 minutter, 4°C). Supernatantene som inneholdt dissosiert eller resirkulert antistoffble

samlet. Pelleter ble suspendert to ganger i en syrevask (100 ul/rør PBS, 1% glukose, pH 1). Supernatanter inneholdende overflate-bundet antistoffble kombinert og talt. Slissene av rørene som inneholdt gjenværende celleassosiert radioaktivitet ble klippet og tellet.

Figur 6 illustrerer at monoklonalt antistoff TAb 250 ikke er internalisert i MDA-MB-231 celler (panel B). I motsetning internaliserte SKBR-3 celler TAb 250 antistoff mest effektivt (panel A) mens internalisering av antistoffet inn i SKOV-3 celler og MDA-MB-453 celler var i mellomposisjon (henholdsvis panel C og D).

Eksempel 9

Modifikasjon av monoklonalt antistoff TAb 250 med SPDP

N-succinimidyl 3-(2-pyirdylditio)(propionat)(SPDP) i dimetylformamid ble fremstilt som en forrådsoppløsning av 3 mg ml i tørr dimetylformamid. Siden krystallinsk SPDP kan gjennomgå hydrolyse, ble virkelig konsentrasjon av kjemisk reaktiv fornetter bestemt ved spektrofotometriske metoder ved analysering av absorbans ved 260 nm i en dobbelt-strålespektrofotometer. Konsentrasjon av SPDP forråd ble beregnet fra følgende ligning:

Endring i absorbans ( 260 nm) X ( 30n = mmol/ml/SPDP

0,02 x 103mlmmol 0,01 1 mg monoklonalt antistoff TAb 250 i 1,0 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ble satt til et glassrør. SPDP forrådsoppløsning ble langsomt, ved et ca. 5-gangers molart overskudd satt til røret (tilnærmet 10 ul av forrådsoppløsning), under konstant blanding. Blandingen ble inkubert i 30 min. ved romtemperatur, blanding hvert 5 min. under inkuberingsperioden.

Overskudd av ikke-omsatt SPDP ble fjernet fira prøven ved gelfiltreringskromatografi på en Sephadex G-25 kolonne (1 x 24 cm) for-ekvilibrert med 100 mM natriumfosfatbuffer pH 7,0 inneholdende 0,5 mM EDTA (Buffer A). Fraksjoner (0,5 ml) ble samlet og analysert for proteininnhold ved å anvende Bradford fargebindingsanalyse (Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976). Absorbans (600 nm) ble registrert i en 96-brønns plate ved å anvende en Bio-TEK Microplateautoleser. Antistoffet eluerte i tomvolumet (fraksjoner 14-20) og disse fraksjonene ble samlet og holdt ved 4°C. Proteinet ble konsentrert i en Centricon-30 mikrokonsentrator. Centricon retentatet ble vasket med 100 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0 inneholdende EDTA (0,5 mM). Antistoffet ble konsentrert til et sluttvolum på tilnærmet 0,5-0,75 ml.

Eksempel 10

Konjugering av SPDP- modifiset monoklonalt antistoff TAb 250 med iminotiolan-modifisert gelonin

Konjugerin<g> av 2- IT modifisert gelonin og TAb 250

TAb 250-gelonin bundet med SMPT ble fremstilt ved kopling av 2-IT-modifisert gelonin med SMPT-modifisert monoklonalt antistoff TAb 250. For å modifisere TAb 250 med SMPT, 10 ble i korthet 10 mg antistoff i 1,0 ml PBS fortynnet 1:1 med 2X boratbuffer (0,05 M natriumborat i 1,7% natriumklorid, pH 9,0) og 52 ul 4 mM SMPT i tørr DMF langsomt tilsatt antistoffoppløsning. Reaksjonen ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer med omrøring under N2. Overskudd SMPT ble fjernet ved å føre reaksjonsblandingene gjennom en Sephadex G-25 kolonne inneholdende fosfat-EDTA buffer, pH 7,5, og antistoff-positive fraksjoner ble evaluert ved Bio-Rad analyse. Fraksjonene ble samlet og lagret ved 4°C under N2. Fornetting med 2-IT ble gjennomført ved 27°C under N2 med omrøring i 96 timer. Sluttproduktet ble renset som beskrevet for SPDP i eksempel 9. 1 mg renset gelonin (2 mg/ml i PBS), fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble modifisert med iminotiolan som beskrevet i eksempel 3. Monoklonalt antistoff TAb 250, modifisert som beskrevet i eksempel 9, ble blandet med en lik vekt av gelonin. Denne andelen tilsvarer et 5-gangers molart overskudd av gelonin samlet med antistoff.

pH i blandingen ble justert til 7,0 ved tilsetning av 0,05 M TEA/HC1 buffer pH 8,0 og blandingen ble inkubert i 20 timer ved 4°C under nitrogen. Jodacetamid (0,1 M) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mM for å blokkere eventuelt gjenværende frie sulfhydrylgrupper og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere en time ved ca. 25°C. Reaksjonsblandingen ble lagret ved 4 °C inntil rensing ved gelfiltrering.

Eksempel 11

Rensing av gelonin- monoklonalt antistoff TAb 250 komplekser

Ikke-konjugert gelonin og lavmolekylvektsproduktet ble fjernet fra reaksjonsblandingene fra eksempel 10 ved gelfiltrering på en Sephadex S-300 kolonne (1,6 x 31 cm) for-ekvilibrert med PBS.

Reaksjonsblandinger fra eksempel 10 ble konsentrert til tilnærmet 1 ml med en Centricon 30 mikrokonsentrator før anbringelse på en Sephadex kolonne. Kolonnen ble vasket med PBS. 1 ml fraksjoner ble samlet og 50 ul-prøver ble analysert for protein ved Bradford-analysen.

Ikke-konjugert antistoffble fjernet fra geloninkonjugert antistoff ved affinitetskromatografi på en kolonne (1 x 24 cm) av Blue Sepharose CL-6B for-ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer, pH 7,2 innhold 0,1 M NaCl. Efter anbringelse av S-300 eluatprøven ble kolonnen vasket med 30 ml av samme buffer for fullstendig å eluere ikke-konjugert antistoff.

Gelonin-konjugert antistoff bandt seg til kolonnen og ble eluert med en lineær saltgradient fra 0,2 til 2 M NaCl i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,2. Antistoff-geloninkompleks eluerte ved tilnærmet 0,7 M NaCl. Proteininnhold av eluerte fraksjoner ble bestemt ved Bradford-analysen. Proteininnholdende fraksjoner ble samlet og elueringsmønstret bekreftet ved elektroforese på en 5 til 20% gradient ikke-reduserende polyakrylamidgel. Strøm gjennom toppen (fraksjoner 14-20) inneholder bare fritt antistoff, mens fraksjoner 50-80 eluert med høyt saltinnhold, inneholder TAb 250-geloninkonjugat fri for ikke-konjugert gelonin eller antistoff. Sluttproduktet inneholdt TAb 250 antistoff koplet til 1,2 og 3 geloninmolekyler. Gjennomsnittlig gelonininnhold var 1,5 molekyler pr. antistoffmolekyl. Kaninreticulocyt- in vitro-translasjonssystem ble utnyttet for å bestemme geloninaktivitet av hovedsakelig ren gelonin-TAB 250-antistoffkompleks. En aktivitetsenhet i denne analysen ble definert som mengden protein som var nødvendig for å skaffe tilveie 50% hemming av proteinsyntese sammenlignet med ikke-behandlede kontroller. Ved å utnytte denne analysen ble den spesifikke aktiviteten av både nativ gelonin og TAb 250-geloninkonjugat bestemt til å være henholdsvis. 2 x IO* U/mg og 8,2 x 10^ U/mg. Hovedsakelig ren gelonin-TAb 250-antistoff er aktivt i retikulocyttlysatanalysen. En 1:1000 fortynning av den opprinnelige prøve forårsaker tilnærmet en 50% hemming av proteinsyntese, det vil si en 50% reduksjon av inkorporering av <14>C-leucin i protein. Aktiviteten av det opprinnelige preparat var 1000 U/ml. ;Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan innbefatte fusjonskonstruksjoner av TAb 250 monoklonalt antistoff og en cytotoksisk del. Fusjonskonstruksjoner av immunotoksin i foreliggende oppfinnelse kan fremstilles for eksempel med følgende fremgangsmåte. Nukleotidsekvensen av både H og L-kjede V-regioner av TAb 250 blir enkelt bestemt. Total RNA blir for eksempel ekstrahert fra TAb 250-produserende celler med guanidintiocyanat. Poly A+ RNA kan isoleres ved oligo (dT) cellulosekromatografi. Passende gener kan isoleres ved å anvende standard teknikker, inkludert revers transkripsjon og PCR-teknikker. En cDNA tråd kan syntetiseres fra isolert mRNA ved å anvende oligo-dT primer og revers transkriptase. En slik cDNA tråd kan amplifiseres ved å anvende standard PCR-teknikker med passende primere. En primer nær poly-A halen av meldingen kan baseres enten på poly-A sekvensen, eller på vanlig tilgrensende sekvenser som man finner i musimmunoglobuliner, se Devereaux, "Genetics Computer Group", University of Wisconsin Biotechnology Center og dens assosierte sekvensdatabaser. En primer ved den andre enden av genet kan velges fra vanlige sekvenser som man finner i musimmunoglobulinet, se Orlandi et al. (1989) "PNAS" 86:3833-3837 og Larrick et al. ;(1989) "Bio/Technology" 7:934-938. TAb 250 tungkjedegenet har en 5' oppstrøms sekvens med AT AT AG CAGGAC CATATG og starter koding med ATGAA CTTGG GGCTC. TAb 250 lettkjedegenet har en 5' oppstrømssekvens TTTAC TTCCT TATTT og starter koding med ATGGG CATCA AGATG. Disse primere kan anvendes til å amplifisere genene ved PCK-teknologi og klones inn i plasmidekspresjonsvektorer. ;Transfektering av DNA inn i museceller ved elektroporerin<g>;Standard transfekteirngsmetoder kan anvendes på disse genene. For eksempel kan DNA innføres i murin hybridoma Sp2/0-AG14 celler ved elektroporering. 1-2 x IO<3> aktivt voksende SP2/0-AG14 celler ble vasket og suspendert på nytt i 1,0 ml steril PBS. 30 mg av hver kimerisk, IgK- og IgG 1-plasmid tilsettes cellesuspensjon. DNA/cellene overføres til en forhåndsavkjølt støtkuvette, inkubert på is ved minst 5 minutter og derefter en 0,5 kv/cm elektro-puls levert i 10 ms (Transfector 300, BTX). Efter støt blir DNA/celleblandingen returnert til is i 10 minutter, fortynnet i 10 ml DMEM inneholdende 5% NCTC-109 og 10% FCS, og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Til slutt blir cellene overført til en 37°C inkubator med 7% CO2 i 48 timer før pleftering i selektivt medium, inneholdende 1 ug/ml Xanthine. Celler pletteres i 96-brønners plater ved 3 x IO<4> celler/brønn og kultursupernatantene analyseres ved ELISA for antistoff bundet til TAb 250 antigen positive målceller. ;Eksempel 12 ;MTT- analvse ;3-(4,5-dimetyl/tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyser ble gjennomført ved å fjerne celler fra vevskulturflasker med Versen 1:5000, centrifugering ved 500 x g i 5 minutter, og resuspendering av cellene i medium ved en konsentrasjon på 1 x 10^ celle/ml. Celler ble pleftert ved 100 (il/brønn i 96-brønners mikrotiterplater og inkubert i en fuktig CO2 inkubator ved 37 °C i 24 timer. ;Neste dag ble TAb 250 eller TAb-250 gelonin tilsatt. Umiddelbart efter avsetting av høyeste antistoffkonsentrasjon i den første kolonnen av brønnene, ble 1:2 fortynninger av antistoff gjennomført direkte i mikrotiterplater ved å anvende en mangekanalpipette. Plater ble derefter inkubert i tre dager, etterfulgt av tilsetning av 10 ul/brønn MTT. MTT ble fremstilt som en 5 mg/ml oppløsning av PBS, filtrert sterilisert og lagret ved 4°C i mørke. Plater ble holdt i mørke og inkubert i 24 timer ved 37°C. MTT-krystaller ble oppløst ved blanding av innholdet i brønnene kraftig med 100 ul i isopropanol inneholdende 0,04 N HC1 og 3% natriumdodecylsulfat. Absorbanser ved 570 nm ble bestemt ved åanvende en enzymbundet immunosorbentanalyseavleser (ELISA). ;Eksempel 13 ;CPA ;Celleproliferasjonsanalyse (CPA) måler cellevekst ved bestemmelse av celltall og levedyktighet. På dag 0 ble celler ved 80-90% konferens frigjort fra en vevskulturflaske, pelletert ved 200 x g ved 20°C i 6 minutter, og suspendert på nytt i Iscove's MEM inneholdende 2 mM glutamin og 10% fetalt bovin serum til en konsentrasjon på 6000 celler/ml. Cellesuspensjonen ble tilsatt 24-brønners plater ved 1 ml pr. brønn. Platene ble inkubert ved 37°C, 5% CO2 i 4 timer. På dag 1 ble cellene i tre brønner vasket med PBS og frigjort fra platen med 1 ml 0,05% trypsin i PBS og 500 ul blir tellet ved åanvende en Coulter-teller. Til de gjenværende brønnene ble det satt 20 ul PBS, TAb 250, eller TAb 250-gelonin ved konsentrasjoner som angitt i figurene. Platene ble returnert til inkubatoren. Ved de angitte tidspunktene i figurene, blir celler frigjort med trypsin og talt som på dag 1. Gjenværende 500 ul av cellene ble farvet med propidium-jodid slik at levedyktigheten kunne bestemmes ved strømcytometri. For hvert punkt på grafen ble et gjennomsnittlig celletall (n=3) bestemt og multiplisert med prosent av levende celler for å finne antall levedyktige celler. Dette blir dividert med antall levende celler som var behandlet med PBS til prosent av kontroll på Y-aksen. ;Eksempel 14 ;Cytotoksisitet av gelonin og gelonin- TAb 250- antistoffkompleks ;Slik man kan se i figur 1 hadde ZME-antistoff i virkeligheten ingen effekt på SKOV-3-celler. I motsetning var TAb 250-geloninimmunokonjugat meget aktivt. Figur 2 illustrerer en cytotoksisitet av TAb 250-geloninimmunokonjugat på SKOV-3-celler sammenlignet med gelonin alene. Ved samme konsentrasjon var TAb 250-gelonin immunokonjugatet tilnærmet 10.000 x cytotoksisk som gelonin alene. Figur 3 vise at et irrelevant antistoff, ZME 18 monoklonalt antistoff ikke hadde noen konkurrerende effekt på cytotoksisiteten av TAb 250-geloninimmunokonjugat. I motsetning senker økende konsentrasjon av TAb 250-monoklonalt antistoff cytotoksisiteten av immunokonjugatet på en doseavhengig måte. Figur 4 illustrerer et doseresponsforhold av TAb 250-gelonin immunokonjugat på SKOV-3-celler. Slik man kan se i CPA-analyse, produserte en dose over 0,1 mikrogram/ml 80% hemming efter seks dager. Figur 5 illustrerer effektene av enten monoklonalt antistoff TAb 250 alene eller konjugatet av TAb 250 med gelonin på SKOV-3 celler. Slik man kan se er det en doseavhengig hemming ved TAb 250-geloninimmunokonjugat i CPA-analyse. Figur 7 viser effektene av TAB 250-geloninimmunokonjugat på fire forskjellige cellelinjer. Slik man kan forvente forekom den største mengden toksisitet i SKBR-3 cellelinjer. Mellomliggende toksisitet var åpenbar i SKOV-3 og MDA-MB-453 celler mens man i virkeligheten kunne se noe cytotoksisitet i MDA-MB-231 celler. Cytotoksisitet av TAb 250-geloninimmunokonjugat korrelerer med antall celleoverflatereseptorer i samme celler. ;Som konklusjon kan man derfor se at foreliggende oppfinnelse og utførelsesformene som her er beskrevet er veltilpasset for å gjennomføre målene og oppnå det som tidligere er angitt. *

Claims (26)

1. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et konjugat av et antistoff som viser bindingsspesifisitet for et antigendomene for c-erbB-2 protein og et planteav-ledet toksin, eller en cellevekstmodulator, der nevnte toksin er valgt fra gruppen bestående av gelonin, fullengde rekombinant gelonin, funksjonelle geloninfragmenter og funksjonelle geloninderivater med i det vesentlige samme biologiske aktivitet som gelonin.

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte bindingsspesifisitet er for en ekstracellulær epitope av c-erbB-2.

3. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff omfatter et Vjj-segment.

4. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff omfatter en inntakt immunoglobulintung kjede.

5. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff omfatter et VL-segment.

6. Sammensetning ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte antistoff videre omfatter et Vfj-segment.

7. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff omfatter en intakt immunoglobulin lettkjede.

8. Sammensetning ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte antistoff omfatter en intakt immunoglobulin tungkjede.

9. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff er fra et enkelkjedet antistoff.

10. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte antistoff er fra TAb 250 eller BACh-250.

11. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte planteavledede toksin har en liten cellulær effekt på intakte celler når det ikke er konjugert til nevnte måldel.

12. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte toksin blir valgt fra gruppen som består av nativt toksin og rekombinant toksin.

13. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte konjugat er et fusjonsprotein mellom nevnte målrettet del og nevnte cellevekstmodulator.

14. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter sammensetningen ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

15. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at det foreligger i en enkelt dose.

16. Anvendelse av en sammensetning ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en neoplastisk celle.

17. Anvendelse ifølge krav 16 hvor nevnte neoplastiske celle er kjennetegnet ved en overekspresjon av c-erbB-2 protein.

18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte celle blir valgt fra gruppen som består av en brystcarcinomacelle, en ovariecarcinomacelle, en lungecarcinomacelle, en spyttkjertelcarcinomacelle, en gastrisk tumorcelle, en kolonadenocarcinomacelle, og en benmargleukemicelle.

19. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte sammensetning retarderer veksthastighet av nevnte celle.

20. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte neoplastiske celle er i et menneske eller dyr.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte sammensetning forhindrer gjentagelse av en neoplastisk tilstand.

22. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte sammensetning utvider overlevelsestiden hos en vert av nevnte neoplastiske celle.

23. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte neoplastiske celle er in vitro.

24. Anvendelse ifølge krav 16, hvor nevnte neoplastiske celle er en benmargcelle.

25. Anvendelse av en sammensetning ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for dreping av neoplastiske celler i benmarg.

26. Anvendelse ifølge krav 25, hvor nevnte neoplastiske celler er kjennetegnet ved overekspresjon av c-erbB-2-protein.