ES2224099T3 - Inmunotoxinas dirigidas contra antigenos de superficies relacionados con c-erbb-2 (her-2/neu). - Google Patents
Inmunotoxinas dirigidas contra antigenos de superficies relacionados con c-erbb-2 (her-2/neu).Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN NUEVAS INMUNOTOXINAS Y METODOS DE TRATAR ENFERMEDADES NEOPLASICAS. MAS ESPECIFICAMENTE, SE PROPORCIONAN INMUNOTOXINAS QUE COMPRENDEN CONJUGACION DE UNA FRACCION DE DESTINO C-ERBB-2 Y UN MODULADOR DE CRECIMIENTO CELULAR. ESTAS INMUNOTOXINAS ESPECIFICAMENTE Y SELECTIVAMENTE MATAN CELULAS TUMORALES QUE SUPER-EXPRESAN LA PROTEINA C-ERBB-2. LAS NUEVAS INMUNOTOXINAS PODRIAN SER USADAS EN TRATAMIENTO DE CARCINOMAS MAMARIOS HUMANOS, CARCINOMAS OVARIOS HUMANOS, CARCINOMAS PULMONARES, TUMORES GASTRICOS, ADENOCARCINOMAS DE GLANDULAS SALIVARES, Y ADENOCARCINOMAS DE COLON.
Description
Inmunotoxinas dirigidas contra antígenos de
superficie relacionados con c-erbB-2
(HER-2/neu).
La presente invención se refiere generalmente al
campo del tratamiento de la enfermedad neoplásica. Más
específicamente, la presente invención se refiere a nuevos
inmunoconjugados y a su uso en el tratamiento de la enfermedad
neoplásica.
La enfermedad neoplásica es una de las
principales causas de mortalidad y morbidez en el mundo occidental.
Los estados neoplásicos, por ejemplo enfermedades o "cánceres",
comparten al menos una característica, es decir, la implicación de
defectos en el proceso regulador del crecimiento celular.
El proceso por el que las células normales se
transforman en células malignas ha sido objeto de estudio intenso
durante décadas. Más recientemente, el estudio se ha enfocado al
papel de los oncogenes en el proceso del cáncer. Los oncogenes son
genes que tienen la capacidad de transformar células eucarióticas de
modo que crecen de una manera análoga a las células tumorales.
Un oncogén se crea cuando un gen normal o
proto-oncogén se muta, se transpone o se amplifica.
Uno de tales oncogenes es el proto-oncogén
c-erbB-2(HER-2/neu).
En lo sucesivo este oncogén se denominará
c-erbB-2. Este gen codifica una
proteína similar al receptor del factor de crecimiento epidérmico.
La amplificación de este proto-oncogén puede dar
como resultado una cascada de sucesos celulares que conducen a un
crecimiento celular no
regulado.
regulado.
Los anticuerpos son proteínas producidas por el
sistema inmunitario de un animal, normalmente en respuesta a
antígenos o determinantes antigénicos extraños. Los anticuerpos se
unen al antígeno específico al que se dirigen. El desarrollo de
anticuerpos monoclonales específicos ha proporcionado a los
investigadores posibles medios para orientar selectivamente agentes
terapéuticos a células que sobreexpresan antígenos definidos.
Tecce y otros (Anti-Cancer
Research 1990, Vol. 10(5A) página 1454) han producido
inmunotoxinas para el producto HER-2 que emplean dos
anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos sobre
gp185 que se han conjugado a la saporina de toxina de plantas. Sivam
y otros (Cancer Research 47, 3169-3175, 15 de Junio
de 1987) han conectado covalentemente gelonina a anticuerpo
monoclonal 9.2.27, dirigido a una glicoproteína/un proteoglicano
asociados con melanoma humano.
Se ha postulado la sobreexpresión del
proto-oncogén
c-erbB-2 en la transformación
neoplásica. Varios tipos de cánceres humanos incluyendo algunos
carcinomas mamarios y algunos carcinomas ováricos tienen un gen
c-erbB-2 amplificado. Por otra
parte, la amplificación y la sobreexpresión subsiguiente del gen
c-erbB-2 se han correlacionado con
una escasa prognosis de la enfermedad. Así, existe una gran
necesidad y un deseo en esta especialidad de un método para orientar
selectivamente un agente quimioterapéutico a una célula que exhiba
la sobreexpresión del oncogén
c-erbB-2 para modular el crecimiento
de células que sobreexpresan la proteína. La presente invención
proporciona medios para realizar esto.
La presente invención proporciona una nueva
composición que comprende un conjugado de un resto de orientación a
proteínas, por ejemplo una región que se une antígeno, que exhibe
especificidad de unión para un dominio antigénico para la proteína
c-erbB-2 y una toxina derivada de
planta, donde dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en
gelonina y gelonina recombinante de longitud completa. Tal
composición puede actuar como una inmunotoxina para orientar
específicamente un modulador del crecimiento celular a células
tumorales que sobreexpresan la proteína
c-erbB-2.
Así, en una realización de la presente invención,
se proporciona una nueva composición de interés que comprende un
conjugado y un resto de orientación a proteínas con especificidad de
unión para la proteína c-erbB-2, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal TAb 250, un segmento V_{H} de un
anticuerpo, cadena pesada de inmunoglobulina intacta, un segmento
V_{L} de un anticuerpo, cadena ligera de inmunoglobulina intacta,
cadena pesada de inmunoglobulina intacta o anticuerpo monocatenario,
y un resto tóxico. El resto tóxico puede ser un modificador de la
respuesta biológica. En una realización particular, el resto tóxico
es una toxina derivada de planta que tiene un efecto celular muy
inferior cuando no está conjugada al resto de orientación. Esta
toxina puede seleccionarse del grupo que consiste en toxina natural
o toxina recombinante. En una realización adicional, el resto tóxico
es gelonina.
Otra realización de la presente invención
proporciona una composición farmacéutica para tratar un estado
neoplásico, por ejemplo una enfermedad, que se caracteriza por la
amplificación o la sobreexpresión del oncogén
c-erbB-2 en células, que comprende
administrar una dosis citocidamente eficaz de una inmunotoxina de la
presente invención a un individuo que necesite tal tratamiento.
Otra realización proporciona una composición que
comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otra realización proporciona un método para
destruir células tumorales in vitro, seguido típicamente por
la reintroducción en un paciente. Por ejemplo, al tratar un estado
neoplásico de la médula ósea, la médula ósea se retira de un
individuo que tiene la enfermedad neoplásica y se trata con una
composición de la presente invención.
Otra realización proporciona una composición para
usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la
sobreexpresión de la proteína
c-erbB-2 o células neoplásicas, por
ejemplo, células de carcinoma mamario, células de carcinoma ovárico,
células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de las glándulas
salivares, células de tumor gástrico, células de adenocarcinoma de
colon y células de leucemia de la médula ósea.
Otra realización proporciona un método in
vitro para el tratamiento de una célula neoplásica,
comprendiendo el método administrar una dosis eficaz de la
composición a las células.
En otra realización de la presente invención, se
proporciona un método para prevenir la recurrencia de una enfermedad
neoplásica. La recurrencia se evita mediante la administración de un
tratamiento citocidamente eficaz de la toxina orientada, por ejemplo
una inmunoglobulina tal como anticuerpo TAb
250-gelonina.
En otra realización más de la presente invención,
se proporcionan nuevas composiciones de interés que comprenden
construcciones de fusión de restos de orientación con afinidad de
unión para proteína c-erbB-2, y un
resto tóxico. Preferiblemente, el resto de orientación es un
anticuerpo que reconoce un epítopo extracelular de
c-erbB-2, por ejemplo, TAb 250, y el
resto tóxico es relativamente inerte cuando se aplica separadamente
del resto de orientación, por ejemplo, gelonina. En otras
realizaciones de la presente invención, se proporcionan métodos para
prolongar el tiempo de supervivencia de un mamífero que tiene un
tumor mediante la administración de toxinas orientadas de la
presente invención a este mamífero y también un método para retardar
la velocidad de crecimiento de tumores al administrar toxinas
orientadas de la presente invención. Típicamente, las toxinas
orientadas estarán orientadas por una región de unión inmunológica,
por ejemplo un segmento que se une a anticuerpo. Adicionalmente, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende una
inmunotoxina que consiste en un resto tóxico conjugado a un
anticuerpo monoclonal. Lo más preferiblemente, el anticuerpo es TAb
250 y el resto tóxico es gelonina.
La Figura 1 demuestra los efectos de anticuerpo
ZME, anticuerpo TAb 250 o inmunoconjugados de TAb 250 y gelonina
sobre células SKOV-3 según se mide mediante
ELISA.
La Figura 2 demuestra la citotoxicidad de la
construcción de TAb 250-gelonina sobre células
SKOV-3.
La Figura 3 demuestra la competición de
anticuerpo relevante frente a irrelevante con el conjugado sobre
células SKOV-3.
La Figura 4 demuestra la relación
dosis-respuesta y los efectos del conjugado de TAb
250-gelonina sobre células
SKOV-3.
La Figura 5 demuestra la citotoxicidad de TAb 250
y el conjugado de TAb 250-gelonina sobre células
SKOV-3.
La Figura 6 demuestra la capacidad del anticuerpo
TAb 250 para internalizarse en diversas líneas celulares.
La Figura 7 demuestra la citotoxicidad del
inmunoconjugado de TAb 250-gelonina en el ensayo de
MTT.
Según se usa aquí, un resto de orientación
celular es capaz de unirse selectivamente a una proteína
c-erbB-2 que se expresa sobre una
célula, típicamente sobre su superficie. Esto incluye una proteína
que exhibe unión específicamente para un dominio antigénico para la
proteína c-erbB-2, por ejemplo,
anticuerpos intactos o sus fragmentos que se unen a epítopos. Esto
abarca moléculas de anticuerpo clásicas, versiones quiméricas, una
cadena simple y fragmentos de anticuerpo modificados que retienen
especificidad y afinidad de unión a epítopos.
Según se usa aquí, el término
"inmunoglobulina" o "péptido o péptidos de anticuerpo" se
refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo entero o cualquier
fragmento de unión funcional de una molécula de inmunoglobulina.
Ejemplos de tales péptidos incluyen moléculas de anticuerpo
completas, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab,
F(ab')_{2}, CDRs, V_{L}, V_{H} y cualquier otra porción
de un anticuerpo, particularmente las que exhiben especificidad o
afinidad de unión a antígeno. Por ejemplo, una molécula de
anticuerpo de IgG está compuesta por dos cadenas ligeras, cada una
conectada por enlaces disulfuro a dos cadenas pesadas. Las dos
cadenas pesadas están, a su vez, conectadas entre sí por enlaces
disulfuro en un área conocida como la región de bisagra de un
anticuerpo. Una molécula de IgG simple tiene típicamente un peso
molecular de aproximadamente 150-160 kD y contiene
dos sitios de unión a antígeno. Los fragmentos de estas moléculas,
por ejemplo, cadenas pesadas o ligeras solas, a veces pueden unirse
al antígeno. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y las
cadenas individuales pueden ser funcionalmente equivalentes a las
inmunoglobulinas.
Una cadena pesada o ligera de anticuerpo normal
tiene una región variable (V) N-terminal (NH_{2})
y una región constante (C) C-terminal (-COOH). La
región variable de la cadena pesada se denomina V_{H} (incluyendo,
por ejemplo, V_{\gamma}) y la región variable de la cadena ligera
se denomina V_{L} (incluyendo V_{\kappa} o V_{\lambda}). La
región variable es la parte de la molécula que se une al antígeno
cognado del anticuerpo, mientras que la región Fc (los dominios
segundo y tercero de la región C) determina la función efectora del
anticuerpo (por ejemplo, fijación del complemento, opsonización). La
inmunoglobulina de longitud completa o las "cadenas ligeras"
del anticuerpo (generalmente aproximadamente 25 Kd, aproximadamente
214 aminoácidos) son codificadas por un gen de la región variable en
el extremo N (generalmente aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen
de la región constante \kappa (kappa) o \lambda (lambda) en el
extremo COOH. la inmunoglobulina de longitud completa o las
"cadenas pesadas" del anticuerpo (generalmente aproximadamente
50 Kd, aproximadamente 446 aminoácidos) son codificadas de forma
similar por un gen de la región variable (que codifica generalmente
aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los genes de la región
constante, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330
aminoácidos). Típicamente, la "V_{L}" incluirá la porción de
la cadena ligera codificada por los segmentos génicos V_{L} y/o
J_{L} (J o región de ligazón), y la "V_{H}" incluirá la
porción de la cadena pesada codificada por los segmentos génicos
V_{H} y/o D_{H} (D o región de diversidad) o J_{H}. Véanse
generalmente Roitt y otros, Immunology, Capítulo 6, (2ª ed.
1989) y Paul; Fundamental. Immunology, Raven Press (2ª ed.
1989).
Una región variable de la cadena ligera o pesada
de inmunoglobulina consiste en una región de "armazón"
interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas
regiones que determinan la complementariedad o CDRs. La extensión de
la región de armazón y las CDRs se ha definido (véase, "Sequences
of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat y otros, U.S.
Department of Health and Human Services, (1987).
Las secuencias de las regiones de armazón de
diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente
dentro de una especie. Las regiones de armazón de un anticuerpo,
esto es, las regiones de armazón combinadas de las cadenas ligeras y
pesadas integrantes, sirven para situar y alinear las CDRs en el
espacio tridimensional. Las CDRs son principalmente responsables de
la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDRs se denominan
típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando
desde el extremo N.
Los dos tipos de cadenas ligeras, \kappa y
\lambda, se denominan isotipos. Los determinantes isotípicos
residen típicamente en la región constante de la cadena ligera,
también denominada la C_{L} en general y C_{\kappa} o C
_{\lambda} en particular. La región constante de la molécula de la
cadena pesada, también denominada C_{H}, determina el isotipo del
anticuerpo. Los anticuerpos se clasifican como IgM, IgD, IgG, IgA e
IgE, dependiendo del isotipo de la cadena pesada. Los isotipos se
codifican en los segmentos mu (\mu), Delta (\Delta), gamma
(\gamma), alfa (\alpha) y épsilon (\in) de la región constante
de la cadena pesada, respectivamente. Además, hay un número de
subtipos \gamma.
El isotipo de la cadena pesada determina
diferentes funciones efectoras del anticuerpo, tales como
opsonización o fijación del complemento. Además, el isotipo de la
cadena pesada determina la forma secretada del anticuerpo. Los
isotipos IgG, IgD e IgE secretados se encuentran típicamente en
forma unitaria simple o monómera. El isotipo IgM secretado se
encuentra en forma pentámera; IgA secretada puede encontrarse en
forma tanto monómera como dímera.
El fragmento F(ab')_{2} carece de la
porción C-terminal de la región constante de la
cadena pesada, y habitualmente tiene un peso molecular de
aproximadamente 110 Kd. Retiene dos sitios de unión a antígeno y los
enlaces disulfuro intercatenarios en la región de bisagra, pero no
tiene las funciones efectoras de una molécula de IgG intacta. Un
fragmento F(ab')_{2} puede obtenerse a partir de una
molécula de IgG mediante digestión proteolítica con pepsina a pH
3,0-3,5 usando métodos estándar tales como los
descritos en Harlow y Lane, posteriormente.
Un fragmento "Fab" comprende una cadena
ligera y la porción N-terminal de la cadena pesada
que están conectadas entre sí mediante enlaces disulfuro.
Típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 50 Kd y
contiene un solo sitio de unión a antígeno. Los fragmentos Fab
pueden obtenerse a partir de fragmentos F(ab')_{2} mediante
reducción limitada, o a partir del anticuerpo entero mediante
digestión con papaína en presencia de agentes reductores. (Véase
Harlow y Lane, posteriormente). En ciertos casos, la concentración
de agente reductor necesaria para mantener la actividad de papaína
en presencia de oxígeno atmosférico es suficiente para reducir
completamente los enlaces disulfuro intercatenarios con el
anticuerpo. Esto puede dar como resultado una pérdida de
reconocimiento de antígeno. Para evitar este problema, la papaína
puede activarse y a continuación intercambiarse en tampón que
contiene una concentración de agente reductor compatible con
mantener la actividad de unión a antígeno. La digestión del
anticuerpo se lleva a cabo típicamente bajo una atmósfera inerte
para prevenir la desactivación de la papaína.
El siguiente sistema es un ejemplo de este
procedimiento:
A) Activación de papaína: La papaína,
suministrada como 10 mg/ml de suspensión de NH_{4}SO_{4}, se
disuelve en EDTA 10 mM, cisteína 20 mM, pH = 8,0, hasta una
concentración final de 2 mg/ml. La solución se desgasifica y se deja
incubar 2 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno.
B) La papaína activada se intercambia en
NaPO_{4} 20 mM, pH = 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, DTT 30
\muM.
C) Digestión de anticuerpo: Se añade 1 mg de
papaína activada para cada 100 \mug de anticuerpo y la solución se
dializa contra un gran exceso de NaPO_{4} 20 mM, pH = 7,0, NaCl
150 mM, EDTA 10 mM, DTT 30 \muM, con rociadura continua de helio.
La diálisis se usa para mantener un exceso molar de agente reductor
durante el transcurso de la digestión.
D) Después de 2-4 horas a
temperatura ambiente, la digestión se termina mediante la adición de
yodoacetamida.
E) Los fragmentos Fab se separan del anticuerpo
no digerido o parcialmente digerido usando métodos cromatográficos
estándar.
Según se usan aquí, los términos "Fab", o
cualesquiera otros fragmentos de anticuerpo, tienen clasificaciones
similares cuando se aplican a la presente invención que los términos
generales "anticuerpos" o "imunoglobulinas". Así, proteína
de Fab de "mamífero", "Fab quimérico" y similares se usan
análogamente a las definiciones correspondientes en el uso general,
y según se indica en los párrafos subsiguientes.
Según se usa aquí, el término "anticuerpos
quiméricos" o "péptidos quiméricos" se refiere a los
anticuerpos o péptidos de anticuerpo en los que una porción del
péptido tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de, o es
homóloga a, una secuencia correspondiente en un anticuerpo o péptido
derivado de una primera fuente génica, mientras que el segmento
restante de la cadena o las cadenas es homólogo a secuencias
correspondientes de otra fuente génica. Por ejemplo, un péptido de
anticuerpo de la cadena pesada quimérico puede comprender una región
variable murina y una región constante humana. Las dos fuentes
génicas serán típicamente dos especies separadas, pero
ocasionalmente implicarán una especie.
Los anticuerpos o péptidos quiméricos se producen
típicamente usando técnicas moleculares y/o celulares recombinantes.
En muchos casos, los anticuerpos quiméricos tienen regiones
variables de las cadenas tanto ligeras como pesadas que imitan las
regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de
mamífero, mientras que las porciones constantes y/o de armazón son
homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de una segunda
especie de mamífero diferente.
Según se usa aquí, la definición de anticuerpo
quimérico, sin embargo, no está limitada a este ejemplo. Un
anticuerpo quimérico es cualquier anticuerpo en el que cualquiera o
ambas de las cadenas pesadas o ligeras están compuestas por
combinaciones de secuencias que imitan las secuencias en anticuerpos
de fuentes diferentes, ya sean estas fuentes clases diferentes,
respuestas antigénicas diferentes o especies de origen diferentes, y
esté o no el punto de fusión en el límite variable/constante. Por
ejemplo, los anticuerpos quiméricos pueden incluir anticuerpos en
los que el armazón y las CDRs son de fuentes diferentes. Por
ejemplo, CDRs no humanas se integran en regiones de armazón humanas
conectadas a una región constante humana para formar "anticuerpos
humanizados". Véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud
PCT Nº WO 87/02671; la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; la Solicitud
de Patente EP 0173494; Jones y otros, Nature,
321:522-525 (1986); y Verhoeyen y otros,
Science, 239:1534-1536 (1988).
Según se usa aquí, el término "región de
armazón similar a humana" es una región de armazón para cada
cadena de anticuerpo, y habitualmente comprende al menos
aproximadamente 70 residuos de aminoácido, típicamente de 75 a 85 o
más residuos. Los residuos de aminoácido de la región de armazón
similar a humana son al menos aproximadamente 80%, preferiblemente
aproximadamente 80-85% y lo más preferiblemente más
de 85% homólogos con los de una inmunoglobulina humana. Esta
característica compartida con otros anticuerpos endógenos es útil
para generar un resto de orientación que introduce sólo una reacción
inmune secundaria, por ejemplo un mecanismo que minimiza la
respuesta a "auto"-marcadores.
Según se usa aquí, el término inmunoglobulina
"humanizada" o "similar a humana" se refiere a una
inmunoglobulina que comprende una región de armazón similar a humana
y una región constante que es sustancialmente homóloga a una región
constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, que tiene al menos
aproximadamente 80% o más, preferiblemente aproximadamente
85-90% o más y lo más preferiblemente
aproximadamente 95% o más de homología. De ahí que la mayoría de las
partes de una inmunoglobulina similar a humana, excepto posiblemente
las CDRs, sean sustancialmente homólogas a partes correspondientes
de una o más secuencias de inmunoglobulina humana natural.
Según se usa aquí, el término "anticuerpo
híbrido" se refiere a un anticuerpo en el que cada cadena es
homóloga separadamente con referencia a una cadena de anticuerpo de
mamífero, pero la combinación representa un nuevo ensamblaje de modo
que dos antígenos diferentes son reconocidos por el anticuerpo. En
anticuerpos híbridos, un par de cadena pesada y ligera es homólogo
al encontrado en un anticuerpo producido contra una secuencia
característica de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, un
epítopo, mientras que el otro par de cadena pesada y ligera es
homólogo a un par encontrado en un anticuerpo producido contra otro
epítopo. Esto da como resultado la propiedad de la valencia
multifuncional, es decir, la capacidad para unirse a al menos dos
epítopos diferentes simultáneamente. Por supuesto, tales híbridos
también pueden formarse usando cadenas quiméricas.
Según se usa aquí, el término "anticuerpo
monoclonal" significa una composición de anticuerpo que reconoce
un determinante antigénico discreto. No pretende estar limitado en
cuanto a la fuente del anticuerpo o la manera en la que se
elabora.
Usando métodos estándar que son bien conocidos en
la especialidad, las regiones variables y las CDRs pueden derivarse
de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que es
específico para c-erbB-2. Las
secuencias de ácido nucleico de la presente invención capaces de
expresar finalmente los anticuerpos quiméricos deseados pueden
formarse a partir de una variedad de diferentes secuencias
nucleotídicas (genómicas o cDNA, RNA, oligonucleótidos sintéticos,
etc.) y componentes (por ejemplo, regiones V, J, D y C), así como
mediante una variedad de técnicas diferentes. Ligar secuencias
genómicas apropiadas es actualmente un método de producción común,
pero también pueden utilizarse secuencias de cDNA (véanse la
Publicación de Patente Europea Nº 0239400 y Reichmann, L. y otros,
Nature, 332:323-327 (1988).
Las secuencias de DNA de la región constante
humana se aislan preferiblemente de células B inmortalizadas, véase,
por ejemplo, Heiter y otros, Cell, 22:197-207
(1980), incorporado aquí mediante referencia, pero pueden aislarse o
sintetizarse a partir de una variedad de otras fuentes. La secuencia
nucleotídica de un gen de inmunoglobulina C_{\gamma 1} humana se
describe en Ellison y otros, Nucl. Acid. Res. 10:4071 (1982);
Beidler y otros, J. Immunol., 141:4053 (1988); Liu y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439 (1987).
Las CDRs para producir las imunoglobulinas de la
presente invención se derivan preferiblemente de anticuerpos
monoclonales capaces de unirse al antígeno deseado, proteína
c-erbB-2, y se producen en cualquier
fuente de mamífero conveniente, incluyendo ratones, ratas, conejos,
hámsteres u otras células huésped de vertebrado capaces de producir
anticuerpos mediante métodos bien conocidos. Células originarias
adecuadas para las secuencias de DNA y células huésped para la
expresión y secreción de inmunoglobulinas pueden obtenerse a partir
de un número de fuentes, tales como ("ATCC") ("Catalogue of
Cell Lines and Hybridomas", Quinta edición (1985) Rockville,
Maryland,
U.S.A.
U.S.A.
Además de los péptidos de anticuerpo quiméricos
descritos específicamente aquí, otras inmunoglobulinas modificadas
(sustancialmente homólogas) pueden diseñarse y fabricarse fácilmente
utilizando diversas técnicas de DNA recombinante conocidas por los
expertos en la especialidad. Las modificaciones de los genes pueden
efectuarse fácilmente mediante una variedad de técnicas bien
conocidas, tales como mutagénesis dirigida al sitio (véase Gillman y
Smith, Gene, 8: 81-97 (1979) y Roberts, S. y
otros, Nature, 328:731-734 (1987).
Estas modificaciones pueden incluir adiciones,
supresiones, sustituciones, preferiblemente conservativas, de
aminoácidos y otros cambios en la secuencia del polipéptido mientras
se retenga la propiedad o actividad biológica apropiada.
Alternativamente, pueden producirse fragmentos de polipéptido que
comprenden sólo una porción de la estructura de anticuerpo primario
y que poseen actividades de unión y/o efectoras. Además, debido a
que, como muchos genes, los genes relacionados con imunoglobulinas
contienen regiones funcionales separadas, teniendo cada una una o
más actividades biológicas distintas, los genes pueden fusionarse a
regiones funcionales de otros genes para producir proteínas de
fusión (por ejemplo, inmunotoxinas) que tienen nuevas propiedades o
nuevas combinaciones de propiedades.
La variable clonada y las regiones constantes
pueden aislarse de plásmidos y ligarse entre sí en un vector de
expresión de mamífero, por ejemplo pSV2-neo o
pRSV-gpt, para formar una unidad de transcripción
funcional. Estos vectores de expresión pueden transferirse a
continuación a células huésped. Las células de mieloma de ratón,
tales como células SP 2/O o P3X, son un huésped preferido debido a
que no secretan proteína de inmunoglobulina endógena y que tienen
todos los componentes usados en la expresión de inmunoglobulinas.
Las células de mieloma pueden transfectarse usando técnicas
apropiadas como las descritas anteriormente.
Otros tipos de promotores y estimuladores
específicos para otras células huésped son conocidos en la
especialidad. Véase, Kameyoma, K. y otros, anteriormente. Por
ejemplo, la secuencia de DNA que codifica la secuencia de
aminoácidos del anticuerpo quimérico puede conectarse a promotores y
estimuladores de levadura y transfectarse en levadura mediante
métodos bien conocidos en la especialidad. Véase Kriegler,
anteriormente.
Este mismo sistema puede tomarse para aislar las
CDRs específicas de c-erbB-2 de una
fuente tal como una especie de mamífero y las regiones de armazón de
otra fuente, tal como una especie de mamífero diferente. Las CDRs
pueden ligarse a continuación a las regiones de armazón y las
regiones constantes para formar un anticuerpo quimérico. Véanse los
documentos PCT Nº GB88/00731 (1989) y U.S.S.N. 07/808.462,
presentado el 12 de Diciembre de 1991.
Las CDRs pueden clonarse en un vector de
expresión que comprende, por ejemplo, regiones de armazón y
constantes humanas.
Otro ejemplo es una secuencia de DNA recombinante
que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de
una especie, tal como el ratón, y la región de armazón de la cadena
pesada humana para codificar un anticuerpo específico para
c-erbB-2. Otras posibilidades
incluyen usar CDRs específicas para
c-erbB-2; usar parte de la región
variable que abarca CDR1 y CDR2 de una especie de mamífero y a
continuación ligar esta secuencia a otra que codifica las porciones
de armazón de una especie de mamífero a la CDR3 de la primera; o
transfectar una línea de células huésped con una secuencia de DNA
recombinante que codifica CDRs de la cadena pesada específicas de
c-erbB-2 derivadas de una primera
especie de mamífero, intercaladas dentro del armazón de una segunda
especie de mamífero con una cadena ligera que contiene una secuencia
de DNA de la región variable derivada de la primera especie y la
región constante derivada de la segunda especie.
Vectores de expresión de DNA recombinante que
comprenden secuencias de anticuerpo pueden transfectarse mediante
electroporación en células huésped. Se usan procedimientos de
selección estándar para aislar clones que producen el anticuerpo
quimérico específico para
c-erbB-2.
Los anticuerpos pueden expresarse en una forma
plegada apropiada, incluyendo anticuerpos monocatenarios, a partir
de bacterias tales como E. coli. Véanse, Pluckthum,
Biotechnology, 9:545 (1991); Huse y otros, Science,
246:1275 (1989) y Ward y otros, Nature, 341:544 (1989).
Las secuencias peptídicas de anticuerpo pueden
amplificarse para clonación mediante el uso de la reacción en cadena
de la polimerasa, o PCR, una técnica usada para amplificar una
secuencia de DNA de interés usando una DNA polimerasa termoestable,
tal como polimerasa de Taq, y polimerasa y cebadores
oligonucleotídicos, todo según se describe en PCR Protocols,
ed. Innis y otros, Academic Press, Inc. (1990). Véanse además
Orlandi, anteriormente, y Larrick y otros, Biotechnology,
7:934 (1989).
La proteína
c-erbB-2 (también denominada aquí
simplemente c-erbB-2) es una
glicoproteína de membrana de 185 Kd (kilodaltons) que tiene
actividad de tirosina quinasa y está relacionada con, pero es
distinta de, el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR). Como la proteína del EGFR, la proteína
c-erbB-2 tiene un dominio
extracelular que incluye dos aglomerados repetidos ricos en
cisteína, un dominio de transmembrana y un dominio de quinasa
intracelular. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína
c-erbB-2, así como la secuencia
nucleotídica, ha sido descrita por Coussens y otros, Science,
230:1132 (1985).
La proteína
c-erbB-2 está codificada por el
oncogén c-erbB-2 descrito en 1985
por tres grupos de investigación diferentes: Semba y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497 (que denominan al gen
c-erbB-2); Coussens y otros,
anteriormente (que denominan al gen HER-2) y King y
otros, Science, 229:1132 (que denominan al gen relacionado
con v-erbB). Así, la secuencia génica de
c-erbB-2 y su secuencia proteínica
correspondiente son bien conocidas y se describen en la
especialidad. La proteína c-erbB-2
tiene un diseño intracelular definido, una región de transmembrana y
una región extracelular. Típicamente, los restos de orientación de
la presente invención se unirán a la región extracelular, que debe
exponerse al exterior de la célula neoplásica. El resto de
orientación reconocerá generalmente una secuencia característica o
secuencias características encontradas allí, incluyendo sitios de
reconocimiento del antígeno, por ejemplo epítopos. Los epítopos a
menudo se dirigirán a epítopos polipeptídicos puros, determinantes
de la secuencia peptídica lineal o determinantes de la conformación,
pero también pueden dirigirse a epítopos que tienen componentes de
carbohidrato. Los epítopos pueden así incluir componentes de
proteína/carbohidrato combinados o componentes de carbohidrato
solos. Además, otras modificaciones para la proteína, normales o
anormales, presentarán determinantes epitópicos importantes.
La detección de la proteína
c-erbB-2 puede efectuarse mediante
inmunoensayos bien conocidos que emplean anticuerpos específicos
para la proteína c-erbB-2, tales
como los descritos aquí. Tales anticuerpos están disponibles
comercialmente, por ejemplo de Chemicon International, Inc.,
Temecula, CA, o pueden prepararse mediante procedimientos
inmunológicos estándar. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Publications, N.Y. (1988).
Se pretende aquí que la definición de la proteína
c-erbB-2 también incluya las
proteínas desarrolladas a partir de otros sistemas hospedantes, por
ejemplo proteínas que están inmunológicamente relacionadas con la
proteína c-erbB-2 humana. Por
ejemplo, un gen de rata relacionado (denominado neu) se ha
presentado en Schecter y otros, Science, 229:976 (1985).
Epítopos útiles para los que pueden producirse
fácilmente anticuerpos incluyen epítopos extracelulares encontrados
sobre células diana. Estos epítopos generalmente serán epítopos
proteínicos, por ejemplo epítopos lineales o de conformación de la
proteína como los encontrados en células neoplásicas. Otros epítopos
útiles incluirán componentes no proteínicos incluyendo carbohidrato
u otras modificaciones, habitualmente
post-traduccionales, encontrados en la proteína
c-erbB-2. Los anticuerpos y otras
regiones de unión que exhiben especificidad de unión para
c-erbB-2 sobreexpresada pueden
producirse contra fragmentos de la proteína.
Se han elaborado anticuerpos monoclonales de
ratón contra la porción extracelular de
c-erbB-2. Un ejemplo de tal
anticuerpo es TAb 250, que está depositado en the American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC), teniendo el Nº de
Registro HB10646.
Alternativamente, un resto que se orienta a
proteínas puede derivarse de cualquier otro método de orientación
que exhiba afinidad y especificidad para una célula que expresa
c-erbB. Por ejemplo, un ligando que es reconocido y
unido mediante la proteína c-erbB-2
sería un resto de orientación útil. Véanse, por ejemplo, Ciccodicola
y otros, (1989) Embo J. 8:1987-1991;
Ciardiello y otros (1991) Cancer Research
51:1051-1054 y Ciardiello y otros (1991) P.N.A.S.
USA 88:7793-7796, que describen CRIPTO, una
molécula que parece servir como un ligando para el receptor de EGF,
y probablemente también se unirá con especificidad a la proteína
c-erbB-2.
En el caso de las secuencias descritas aquí, debe
entenderse que también se incluyen variantes de estas secuencias,
tales como mutaciones de sustitución, adición y/o supresión, o
cualquier otra secuencia que posea actividad de unión
sustancialmente similar a las secuencias de las que se derivan o a
las que son similares de otra manera.
Para esta invención, un anticuerpo u otro péptido
es específico para una proteína
c-erbB-2 si el anticuerpo o el
péptido se une o es capaz de unirse a proteína
c-erbB-2, por ejemplo según se mide
mediante ensayos de anticuerpo-antígeno o
ligando-receptor estándar, por ejemplo ensayos
competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos estándar tales
como ELISA o RIA. Esta definición de especificidad se aplica a
cadenas pesadas y/o ligeras simples, CDRs, proteínas de fusión o
fragmentos de cadenas pesadas y/o ligeras, que también son
específicos para proteínas c-erbB-2
si se unen a proteína c-erbB-2
solos o si, cuando se incorporan apropiadamente en la conformación
de inmunoglobulina con regiones variables y regiones constantes
complementarias según sea apropiado, son capaces entonces de unirse
a proteína c-erbB-2 con
especificidad.
En ensayos de competición la capacidad de un
anticuerpo o un fragmento peptídico para unirse a un antígeno puede
determinarse al detectar la capacidad del péptido para competir con
la unión de un compuesto que se sabe que se une al antígeno.
Numerosos tipos de ensayos competitivos son conocidos y se analizan
aquí. Alternativamente, también pueden usarse ensayos que miden la
unión de un compuesto de prueba en ausencia de un inhibidor. Por
ejemplo, la capacidad de una molécula u otro compuesto para unirse a
la proteína c-erbB-2 puede
detectarse al marcar la molécula de interés directamente o puede
estar no marcada y detectarse indirectamente usando diversos
formatos de ensayo tipo sándwich. Se conocen numerosos tipos de
ensayos de unión tales como ensayos de unión competitiva (véanse,
por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 3.376.110, 4.016.043, Harlow
y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Publications, N.Y. (1988) y Coligan y otros (eds), Current
Protocol in Immunology, Wiley and Sons, N.Y.
También están disponibles ensayos para medir la
unión de un compuesto de prueba a un componente solo en lugar de
usar un ensayo de competición. Por ejemplo, las inmunoglobulinas
pueden usarse para identificar la presencia de la proteína
c-erbB-2. Pueden usarse
procedimientos estándar para ensayos de anticuerpos monoclonales,
tales como ELISA (véase Harlow y Lane, anteriormente). Para una
revisión de diversos sistemas que producen señales que pueden
usarse, véase la Patente de EE.UU. Nº 4.391.904.
Además, la especificidad de los restos de unión a
c-erbB-2 puede determinarse mediante
su afinidad. Tal especificidad existe si la constante de disociación
(K_{D} = 1/K, donde K es la constante de afinidad) del resto es
< 1 \muM, preferiblemente < 100 nM, y lo más preferiblemente
< 1 nM. Las moléculas de anticuerpo tendrán típicamente una
K_{D} en los intervalos inferiores. K_{D} =
[R-L]/[R][L] donde [R], [L] y [R-L]
son las concentraciones en el equilibrio del receptor o
c-erbB-2 (R), el ligando, el
anticuerpo o el péptido (L) y el complejo
receptor-ligando (R-L),
respectivamente. Típicamente, las interacciones de unión entre el
ligando o el péptido y el receptor o el antígeno incluyen
asociaciones no covalentes reversibles tales como atracción
electrostática, fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrógeno.
hidrógeno.
Otros formatos de ensayo pueden implicar la
detección de la presencia o ausencia de diversos cambios
fisiológicos o químicos que resultan de la interacción, tales como
modulación a la baja, internalización o un incremento en la
fosforilación, según se describe en la Solicitud de Patente de
Estados Unidos Nº 07/644.361, presentada el 1/18/91.
Véase además, Receptor-Efector
Coupling - A Practical Approach, ed. Hulme, IRL Press, Oxford
(1990).
Un péptido preferido específico para la proteína
c-erbB-2 induce un incremento en la
fosforilación de la proteína
c-erbB-2 cuando se pone en contacto
con células tumorales que expresan la proteína
c-erbB-2. Una molécula que "induce
un incremento en la fosforilación de proteína
c-erbB-2" es una que provoca un
incremento detectable en la incorporación de fosfato en la proteína
sobre la que se produce en ausencia de la molécula. Típicamente,
este incremento detectable será un incremento de dos veces o más en
la fosforilación, preferiblemente un incremento de más de tres veces
sobre los controles. La fosforilación puede medirse mediante los
métodos conocidos en la especialidad para detectar la fosforilación
de receptores. Véanse, por ejemplo, Cooper y otros, Methods in
Enzymology, 99:387-402 (1983); Antoniades y
Pantazis, Methods in Enzymology, 147:36-40
(1987) y Lesniak y otros, Methods in Enzymology,
150:717-723 (1987).
Típicamente, la fosforilación puede medirse
mediante fosforilación in vivo de células intactas (Lesniak,
previamente) o mediante una reacción de autofosforilación in
vitro (Antonaides, anteriormente). Para medir la fosforilación
in vivo, por ejemplo, pueden efectuarse ensayos en los que
células que tienen la proteína
c-erbB-2 se ponen en contacto con
fosfato marcado radiactivo. Para detectar la fosforilación del
receptor de proteína c-erbB-2 en el
ensayo in vivo, es ventajoso incubar las células de prueba
durante aproximadamente 12 a aproximadamente 18 horas, con el
fosfato marcado. Las células se dividen en dos o más partidas, en
las que algunas se exponen a la molécula que se espera que
incremente la fosforilación del receptor y algunas se separan como
controles. Las partes alícuotas se inmunoprecipitan
subsiguientemente, el receptor se reconoce, por ejemplo, mediante
gel de poliacrilamida en SDS o métodos autorradiográficos y un
incremento en la fosforilación se considera estadísticamente
significativo cuando hay un incremento de dos veces o más en el
fondo de la parte alícuota expuesta a la molécula de prueba sobre
las partes alícuotas de control.
Para medir la autofosforilación in vitro,
por ejemplo, células o extractos celulares pueden incubarse en
presencia o ausencia del péptido específico para
c-erbB-2. Después de la
inmunoprecipitación con un anticuerpo
anti-c-erbB-2, el
complejo inmune puede incubarse con
\gamma^{32}P-ATP y analizarse mediante
autorradiografía en SDS-PAGE.
Otro péptido preferido específico para proteína
c-erbB-2 es uno que provoca la
modulación a la baja de la proteína
c-erbB-2. La "modulación a la
baja de la proteína c-erbB-2" se
determina mediante una disminución detectable en presencia sobre las
células tumorales del receptor de
c-erbB-2. Tal modulación a la baja
se detecta mediante una disminución en la capacidad de los
anticuerpos u otras moléculas de unión específica para unirse a o
reconocer la proteína receptora de
c-erbB-2 sobre las células
tumorales. Por ejemplo, la modulación a la baja puede determinarse
al incubar células tumorales que tienen el receptor de proteína
c-erbB-2 con el péptido de interés,
lavar las células y a continuación poner en contacto las células con
anticuerpos marcados (preferiblemente radiomarcados) específicos
para la proteína c-erbB-2. La
extensión de la unión de los anticuerpos
anti-c-erbB-2
marcados a las células expuestas al péptido específico para proteína
c-erbB-2 se compara con la
extensión de unión de los anticuerpos a células de control (es
decir, no expuestas al péptido específico para
c-erbB-2). Preferiblemente, para
estos ensayos, las células se someten directamente a los anticuerpos
anti-c-erbB-2
marcados después de lavar.
La modulación a la baja observada es típicamente
dependiente de la dosis, es decir, la extensión de la modulación a
la baja se incrementa con la cantidad de péptido específico para
proteína c-erbB-2 expuesto a la
proteína c-erbB-2. Se prefiere un
péptido que provoca una disminución en 90% o más de la unión de las
células no tratadas frente a las células de control para anticuerpos
anti-c-erbB-2.
Otro péptido específico preferido para proteína
c-erbB-2 es uno que se une a células
tumorales que expresan proteína
c-erbB-2 y se internaliza cuando se
pone en contacto con tales células tumorales. La
"internalización" se produce cuando el péptido queda
secuestrado en el citoplasma de las células. Una vez internalizado,
el receptor y/o el péptido puede degradarse en los lisosomas
celulares o puede reciclarse a la superficie celular. Un método para
determinar la internalización de un complejo de
ligando-receptor también se describe en Haigler y
otros, J. Biol. Chem., 255:1239-1241
(1980).
Un modulador del crecimiento celular es una
molécula que afecta al crecimiento de una célula a la que se
orienta. Típicamente, el modulador debe internalizarse en la célula
diana, pero esta función es habitualmente proporcionada por la
internalización que resulta del resto de orientación.
La modulación será típicamente una disminución en
el metabolismo o la velocidad de crecimiento, preferiblemente un
efecto tóxico, pero también será útil un incremento significativo en
el metabolismo o la velocidad de crecimiento. Cuando se efectúa un
incremento significativo en el metabolismo o la velocidad de
crecimiento, podría usarse un veneno a corto plazo en combinación
para destruir sólo las células que exhiben esto.
Para moduladores que disminuyen el metabolismo o
la velocidad de crecimiento, se prefiere que el modulador sea
altamente potente, por ejemplo tenga una actividad muy alta.
Aunque existen toxinas virales y fúngicas,
toxinas bacterianas o de plantas particulares tienen las actividades
específicas más altas conocidas. La detención del crecimiento puede
producirse al evitar cualquiera de un número de funciones celulares
esenciales incluyendo la síntesis de ácidos nucleicos, la síntesis
de proteínas y el metabolismo celular, general o específico. Por
ejemplo, la exotoxina de pseudomonas y la toxina de la difteria
funcionan deteniendo irreversiblemente la síntesis de proteínas en
células eucarióticas. Ambos ejemplos inactivan enzimáticamente el
factor de elongación 2, que es un componente esencial de la síntesis
de proteínas. Otros factores de elongación pueden ser dianas para
otras toxinas. La ricina, en contraste, es una toxina de planta que
actúa directamente sobre el ribosoma, actuando sobre el rRNA
285.
Preferiblemente, los moduladores del crecimiento
tendrán actividades enzimáticas con números de renovación altos de
modo que la internalización de muy pocas moléculas puede destruir la
célula diana. Véase Pastain y otros, Science
254:1173-1177.
La gelonina es una glicoproteína (P.M.
aproximadamente 29-30.000 Kd) purificada a partir
de las semillas de Gelonium multiflorum y pertenece a una
clase de potentes toxinas de planta inactivadoras de ribosomas.
Otros miembros de esta clase incluyen cadenas de abrina, ricina y
modecina. La gelonina, como la abrina y la ricina, inhibe la
síntesis de proteínas al dañar la subunidad 60S de ribosomas de
mamífero. La gelonina parece ser estable al tratamiento químico y
físico. Por otra parte, la propia gelonina no se une a células y
normalmente es atóxica (excepto en altas concentraciones) cuando se
administra sola, y es segura para manipular en el laboratorio. La
inactivación de los ribosomas es irreversible, no parece implicar
cofactores y se produce con una eficacia que sugiere que la gelonina
actúa enzimáticamente.
La gelonina y la ricina inhiben la síntesis de
proteínas y están entre las toxinas más activas sobre una base en
peso de la proteína. La gelonina es 10 a 1.000 veces más activa para
inhibir la síntesis de proteínas que la cadena de ricina A. Péptidos
como la ricina y la abrina están compuestos por dos cadenas, una
cadena A que es la unidad tóxica y una cadena B que actúa al unirse
a las células. A diferencia de la ricina y la abrina, la gelonina
está compuesta por una sola cadena y, debido a su falta de una
cadena B para unirse a células, es ella misma relativamente inerte o
atóxica para células intactas. Esta característica de tener un
efecto celular muy inferior cuando no se conjuga a un resto de unión
u orientación es una característica importante de diversas
realizaciones de la presente invención. Esta toxicidad diferencial
es importante en la alta especificidad para células que expresan
c-erbB-2.
Las células de mamífero carecen aparentemente de
la capacidad de unirse a y/o internalizar la molécula de gelonina
natural. Los conjugados de gelonina con un reaccionante que se
orienta a tumores, tal como el anticuerpo monoclonal TAb 250
dirigido a un antígeno asociado con tumor presente sobre ciertas
células tumorales, proporcionan tanto un método específico para unir
la gelonina a la célula como una ruta para la internalización del
complejo gelonina-anticuerpo.
El resto tóxico de la inmunotoxina puede ser un
fármaco tóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen de
planta, o un fragmento enzimáticamente activo ("cadena A") de
tal toxina.
Las toxinas activas pueden funcionar mediante
cualquiera de un número de mecanismos, cada uno de los cuales afecta
a la fisiología y el crecimiento celulares. Las toxinas pueden ser
inhibidores o venenos metabólicos, inhibidores de la síntesis de
ácidos nucleicos, inhibidores de la síntesis de proteínas o
cualesquiera otros mediadores de funciones anormales o
perjudiciales. Lo más preferido es la conjugación con gelonina.
Fragmentos y derivados activos incluyen
cualesquiera compuestos que tengan la misma estructura nuclear que
la estructura de longitud completa de la gelonina pero carezcan de
la secuencia primaria completa. Estos fragmentos o derivados tendrán
la misma actividad biológica o tóxica mejorada que la gelonina. La
toxicidad de los fragmentos o derivados de gelonina puede ser
determinada habitualmente por los expertos en la especialidad usando
el ensayo del lisado de reticulocitos de conejo.
El resto de orientación y el modulador del
crecimiento celular pueden conjugarse usando una variedad de agentes
de acoplamiento de proteínas bifuncionales. Ejemplos de tales
reaccionantes son 3-(2-piridilditio)(propionato) de
N-succinimidilo (SPDP), 2-IT,
4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil-\alpha(2-piridilditio)tolueno
(SMPT), derivados bifuncionales de imidoésteres tales como
adipimidato de dimetilo, HCl, ésteres activos tales como suberato de
disuccinimidilo, aldehídos tales como glutaraldehído,
bis-azido-compuestos tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina,
derivados de bis-diazonio tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina,
diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de
tolileno, y compuestos de bis-fluoro activo tales
como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.
Antes de usar en estos estudios, las células
Sp2/0-Ag14 se harán crecer inicialmente en presencia
de 0,1 \mug/ml de gelonina natural. Durante varios meses, la
concentración de gelonina se incrementará gradualmente hasta que las
células puedan mantenerse en hasta 10 mg/ml. Las células se clonarán
a continuación mediante dilución limitativa en presencia de 10 mg/ml
de gelonina y las colonias resultantes resistentes a gelonina se
expandirán. La gelonina se retirará a continuación del medio de
cultivo durante dos pasadas y las células se estimularán de nuevo
con exposición a gelonina para confirmar el desarrollo de clones
establemente resistentes. Después de pruebas para confirmar la
producción y la actividad de TAb-250 quimérico, se
harán crecer células SP2/0 resistentes a gelonina que producen
anticuerpo y el cDNA para el anticuerpo TAb 250 se retirará del DNA
total mediante incubación con endonucleasa de restricción. En
paralelo, el cDNA de E. coli JM105 que expresa gelonina
optimizada se retirará, se purificará y el DNA que codifica gelonina
se liberará después de la digestión con HindIII y Eco RI. El gen de
gelonina se ligará en el fragmento de la cadena pesada y el inserto
se recolocará en células SP2/0 resistentes a gelonina. Las células
se subclonarán a continuación mediante dilución limitativa y los
clones se rastrearán con respecto tanto a la producción de
anticuerpos quiméricos como al contenido de gelonina. Finalmente,
los clones positivos se expandirán y la proteína de fusión
recombinante se purificará y se probará tanto en ensayos de
citotoxicidad in vitro como en distribución de tejidos in
vivo, farmacocinética, terapéutica y experimentos de toxicidad.
Una comparación de las propiedades de la proteína de fusión
TAb-250-gelonina con las
características de las construcciones de TAb
250-gelonina descritos previamente se realizará para
determinar las ventajas y los inconvenientes de cada uno. Basándose
en estos estudios, puede realizarse un estudio clínico de Fase I de
proteína de fusión de TAb 250 quimérico-gelonina en
pacientes con cáncer de mama avanzado.
La administración de las inmunotoxinas de la
presente invención a un individuo al que se le ha diagnosticado que
tiene células neoplásicas, por ejemplo un tumor con un nivel no
deseable de expresión del oncogén
c-erbB-2, permitirá la orientación y
la concentración del agente citotóxico en el sitio en el que se
necesita destruirlas. Orientando así los agentes tóxicos, la
toxicidad no específica para otros órganos, tejidos y células se
eliminará, se minimizará o al menos disminuirá.
Cuando se usan in vivo para terapia, las
inmunotoxinas de la presente invención se administran a los
pacientes o a un animal en cantidades terapéuticamente eficaces, es
decir cantidades que eliminan o reducen la carga del tumor.
Normalmente se administrarán parenteralmente, preferiblemente
intravenosamente, pero se usarán otras rutas de administración según
sea apropiado. La dosis y el régimen de dosificación dependerán de
la naturaleza del cáncer (primario o metastático) y su población,
las características de la inmunotoxina particular, por ejemplo su
índice terapéutico, el paciente, la historia del paciente y otros
factores. La cantidad de inmunotoxina administrada estará
típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente
10 mg/kg de peso del paciente. El programa se continuará para
optimizar la eficacia mientras se equilibra contra efectos negativos
del tratamiento. Véanse Remington's Pharmaceutical Science, 17ª Ed.
(1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; y Goodman and
Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8ª Ed (1990)
Pergamon Press.
Para la administración parenteral, las
imunotoxinas se formularán lo más típicamente en una forma
inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión)
en asociación con un vehículo parenteral aceptable. Tales vehículos
son preferiblemente atóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales
vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de
dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden usarse
vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo.
Pueden usarse liposomas como portadores. El vehículo puede contener
cantidades secundarias de aditivos tales como sustancias que mejoran
la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo tampones y
conservantes. La inmunotoxina se formulará típicamente en tales
vehículos en concentraciones de aproximadamente 0,1 mg/ml a 10
mg/ml.
Las inmunotoxinas de la presente invención
también pueden usarse en un método in vitro. Por ejemplo, el
método puede usarse para destruir células tumorales de la médula
ósea. En este método, la médula ósea se retira en primer lugar de un
individuo que tiene una enfermedad neoplásica. Subsiguientemente, la
médula ósea se trata con una dosis citocidamente eficaz de una
inmunotoxina de la presente invención para eliminar las células
tumorales residuales. Las células de la médula ósea tratadas pueden
readministrarse al paciente para restablecer un sistema inmunitario
después de recibir quimioterapia y/o radioterapia intensivas para
eliminar todas las células hematotóxicas neoplásicas endógenas.
Las inmunotoxinas de la presente invención
también pueden usarse para prolongar el tiempo de supervivencia de
animales que tienen tumores y para retardar la velocidad de
crecimiento de tumores comprendidos por células cancerígenas
soportados por un mamífero. Por ejemplo, ratones desnudos que tienen
xenoinjertos de tumores humanos que crecen subcutáneamente o
intraperitonealmente pueden tratarse con dosis de inmunotoxina,
anticuerpo solo, toxina sola o solución salina a una dosis entre 25
y 100 mg/kg. La inhibición del crecimiento de tumores puede medirse
mediante el cambio en el tamaño físico de los tumores subcutáneos o
mediante la prolongación de la supervivencia en ratones que tienen
tumores intraperitonealmente, tales como células
SKOV-3. Tales estudios pueden ser útiles o
indicativos de metodologías y podrían ser aplicables a otros
mamíferos, incluyendo primates.
Los siguientes ejemplos proporcionan una
descripción detallada de la preparación, la caracterización y el uso
de las inmunotoxinas de esta invención. Estos ejemplos no pretenden
limitar la invención de ningún modo.
Un procedimiento para el aislamiento de gelonina
está disponible en Stirpe y otros, I. Biol. Chem., 255,
6947-53 (1980). Semillas de Gelonium
multiflorum se descascararon y las nueces se trituraron en un
homogeneizador con ocho volúmenes de NaCl 0,14 M que contenían un
fosfato sódico 5 mM (pH 7,4). El homogenado se dejó durante la noche
a 4ºC con agitación continua, se enfrió sobre hielo y se centrifugó
a 35.000 veces g durante 20 minutos a 0ºC. El sobrenadante se
retiró, se dializó contra fosfato sódico 5 mM (pH 6,5) y se
concentró usando un filtro pm10. La muestra se estratificó sobre una
columna de intercambio iónico CM-52 (20 x 1,5 cm)
equilibrada con fosfato sódico 5 mM (pH 6,5). El material que se
unía a la resina de intercambio iónico se eluyó con 400 ml de un
gradiente de NaCl lineal de 0 a 0,3 M a una velocidad de 25 ml por
hora a 4ºC. Se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones se
controlaron a 280 nm en un espectrofotómetro. La gelonina se eluyó
en aproximadamente las fracciones 55-70 y era el
último pico de elución principal. Las fracciones
55-70 se reunieron, se dializaron frente a agua
doblemente destilada y se concentraron mediante liofilización. La
pureza y el peso molecular de cada preparación se verificó en
cromatografía líquida a alta presión usando una columna de
penetración en gel TSK 3000 con tampón de fosfato sódico 50 mM, pH
7,4, y electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sódico (SDS-page) al 15%. La gelonina
migraba como una banda simple con un peso molecular aproximado de
29-30.000 daltons.
La actividad de gelonina se controló en un ensayo
de inhibición de la síntesis de proteínas libre de células. El
ensayo de inhibición de la síntesis de proteínas libre de células se
realizó al añadir secuencialmente a 50 \mul de lisado de
reticulocitos de conejo, mezclando después de cada adición, los
siguientes componentes: 0,5 ml de Tris-HCl 0,2 M (pH
7,8), 8,9 ml de etilenglicol y 0,25 ml de HCl 1M).
Veinte microlitros de una mezcla energética de
sales-aminoácidos (SAEM) que consiste en: KCl 0,375
M, Mg(CH_{3}CO_{2})_{2} 10 mM, glucosa 15 mM,
aminoácidos (excluyendo leucina) 0,25-10 mM, ATP 5
mM, GTP 1 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), 10 \mul de
fosfato de creatinina-creatinina fosfoquinasa, 12
\mul de [^{3}H]-leucina (Amersham, 74
mCi/milimol) y añadir 1,5 \mul de soluciones que contienen
concentraciones variables de la mezcla de gelonina. La mezcla se
incubó durante 60 minutos a 30ºC. La incorporación de
[^{3}H]-leucina se controló en una parte alícuota
de la mezcla al precipitar proteína sintetizada sobre filtro de
fibra de vidrio, lavar en TCA al 10% y acetona y controlar la
radiactividad en un contador Beta usando fluido de centelleo
Aquasol. Se usó gelonina con una actividad específica no inferior
que 4 x 10^{9} U/mg para la conjugación con los anticuerpos. Una
unidad de actividad de gelonina es la cantidad de proteína de
gelonina que provoca 50% de inhibición de la incorporación de
[^{14}C]-leucina en proteína en el ensayo libre de
células.
La gelonina en solución salina tamponada con
fosfato se concentró hasta aproximadamente 10 mg/ml en un
concentrador Centriprep 10. Se añadieron hidrocloruro de
trietanolamina (TEA/HCl), pH 8,0, y EDTA hasta una concentración
final de TEA/HCl 60 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0. Una solución de reserva
de 2-iminotiolano (500 mM en tampón de TEA/HCl 60 mM
que contenía EDTA 1 mM, pH 8,0) se añadió hasta una concentración
final de 1 mM y la muestra se incubó durante 90 min a 4ºC bajo una
corriente de nitrógeno gaseoso con agitación. El iminotiolano en
exceso se retiró mediante filtración en gel sobre una columna de
Sephadex G-25 (1 x 24 cm) preequilibrada con tampón
de fosfato-EDTA, pH 7,5, que contenía
Na_{2}HPO_{4} 0,01 M, KH_{2}PO_{4} 0,0018 M, KCl 0,0034 M,
EDTA 0,001 M y NaCl 0,17 M. Las fracciones se analizaron con
respecto al contenido de proteínas en placas de microvaloración
usando el ensayo Bio-Rad. La gelonina se eluía en el
volumen de huecos (aproximadamente fracciones
21-23). Estas fracciones se reunieron y se
almacenaron a 4ºC.
Ratones BALB/c fueron imunizados
intraperitonealmente (i.p.) y subcutáneamente (s.c.) con 2 x
10^{6}-1 x 10^{7} células NIH3T3_{\tau}
(células NIH373 transfectadas con
c-erbB-2) emulsificadas 1:1 en
adyuvante completo de Freund. Se les administraron a los animales
dosis de refuerzo cada 2 a 4 semanas. Cuando se detectaban
valoraciones positivas en un ELISA (descrito más adelante), se
administró una dosis de refuerzo i.p. o intravenosa (i.v.) final 4
días antes de la fusión. Las células de bazo se fusionaron con
células de mieloma P3-X63Ag8.653 mantenidas en RPMI
1640, FBS al 10% y L-glutamina 2 mM. Los
sobrenadantes de hibridoma se probaron con respecto a la reactividad
positiva en un ELISA (véase posteriormente), y la reactividad de los
dominios extracelulares se determinó mediante inmunofluorescencia
indirecta usando células NIH3T3 y NIH3T3_{\tau} no fijadas a 4ºC
seguido por análisis citométrico de flujo. El anticuerpo monoclonal
TAb 250 puede obtenerse de cualquier fuente. Lo más preferiblemente,
el anticuerpo
anti-c-erbB-2 usado
en la presente invención es un anticuerpo humano o un anticuerpo
murino.
Células de hibridoma que producen TAb 250 se
hacen crecer en un biorreactor de perfusión continuo de 2 l. El
sobrenadante celular del biorreactor se filtra y a continuación se
hace pasar a través de un sistema Protein-G Trio
seguido por cromatografía de intercambio iónico. El material se
concentra a continuación y se filtra estérilmente. La prueba del
producto final incluye pruebas para DNA total, pureza de proteínas,
pH, (IEF), proteína total, endotoxina, potencia, identidad y
antígeno de proteína G.
La presente invención, entre otras cosas, utiliza
un anticuerpo quimérico, incluyendo un anticuerpo híbrido o un
anticuerpo humanizado o similar a humano. En una realización
preferida, la secuencia variable se origina a partir de y es
sustancialmente idéntica a una secuencia del anticuerpo TAb 250
murino. Tal anticuerpo quimérico es BACh-250.
Placas de 96 pocillos estériles se pretrataron
durante 2 horas a 37ºC con colágeno bovino a 1 mg/ml en PBS estéril.
Células NIH3T3_{\tau} (células NIH353 transformadas con el vector)
se hicieron crecer hasta 80% de la confluencia y se recogieron con
Versene de Puck (0,02% de EDTA en PBS) caliente, se lavaron y se
cultivaron en placas a 0,5-1 x 10^{6} células/ml
en pocillos tratados durante la noche a 37ºC. Las placas se lavaron
suavemente y se trataron con formalina tamponada neutra al 10%
seguido por una etapa de bloqueo con albúmina de suero bovino BSA al
1%/PBS. Los sobrenadantes de muestra o las diluciones de anticuerpo
se añadieron a continuación a las placas y se incubaron durante 2
horas a 37ºC seguido por la incubación con un anticuerpo secundario
específico de Fc anti-(IgG de ratón) caprino conjugado a fosfatasa
alcalina y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron
con PBS, se añadieron fosfato de para-nitrofenilo y
sustrato de dietanolamina y se incubaron durante 15 minutos a
temperatura ambiente y se midió la A_{405}. Los sobrenadantes o
los anticuerpos que reaccionaban con las células transfectadas a una
absorbancia de 0,1-1,0 mayor que la absorbancia para
un anticuerpo de control negativo se consideraban
positivos.
positivos.
Se radiomarcó TAb 250 usando Iodobeads (Pierce)
de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Na^{125}I (400
\muCi de IMS 30, Amersham) libre de portador se hizo reaccionar
con 25 \mug de TAb 250 en tampón de fosfato Na 100 mM (200 \mul,
pH 7,4) en presencia de 3 Iodobeads. Esto daba como resultado una
relación aproximada de un átomo de yodo por molécula de IgG. Se dejó
que la incorporación avanzara a temperatura ambiente durante 7,5
minutos con mezcladura intermitente. La mezcla de reacción se retiró
de las cuentas y, después de 5 minutos, el volumen se ajustó hasta
0,5 ml con tampón de fosfato Na y se tomaron 2 \mul para estimular
la actividad específica (véase más adelante). El volumen restante se
desaló mediante filtración en gel usando una columna
NAP-5 (Pharmacia) equilibrada con PBS que contenía
BSA al 0,1% y azida al 0,02%. El anticuerpo radiomarcado se eluyó en
1 ml de tampón de columna y se almacenó a 4ºC durante hasta seis
semanas sin pérdida aparente de actividad de unión. El material
desalado estaba esencialmente libre de yodo no incorporado ya que
>95% era precipitable con TCA.
La actividad específica del anticuerpo
radiomarcado se estimó mediante precipitación con TCA del material
antes de la etapa de desalado. Así, 2 \mul de la mezcla de
reacción se diluyeron 500 veces en tampón de columna y partes
alícuotas duplicadas se mezclaron con un volumen igual de TCA al 20%
enfriado con hielo. Después de 25 minutos sobre hielo el material
precipitado se recogió mediante centrifugación (10 minutos, 3000 x
g). Los sobrenadantes y los pelets se contaron separadamente y la
incorporación se expresó como el porcentaje de conteos precipitables
con TCA. La incorporación obtenido en yodaciones separadas variaba
de 27% a 45%, dando estimaciones de la actividad específica de 3,9 a
7,2 \muCi/\mug. Antes de cada experimento de unión, una cantidad
apropiada de ^{125}I-TAb 250 se desaló mediante
filtración en gel usando una columna NAP-5
equilibrada en tampón de unión. Este procedimiento retiraba la azida
y daba material que era habitualmente >98% precipitable con
TCA.
Se usaron las líneas celulares de adenocarcinoma
de mama humano SKBR-3,
MDA-MB-453 y
MDA-MB-231 y la línea celular de
adenocarcinoma ovárico humano SKOV-3. Las células
SKBR-3, MDA-MB-231
y MDA-MB-453 se mantuvieron en medio
esencial mínimo complementado con FBS al 10% y
L-glutamina 2 mM. El medio para las células
MDA-MB-453 también contenía 1% de
aminoácido no esencial y 1% de vitaminas. Las células
SKOV-3 se cultivaron en medio de Dulbecco modificado
de Iscove complementado con FBS al 10% y L-glutamina
2 mM. Todos los cultivos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5 ó 10%
según se requiriera.
La internalización de
^{125}I-TAb 250 se ensayó determinando la cantidad
de radiactividad en compartimentos sensibles e insensibles al ácido.
Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de unión
enfriado con hielo con ^{125}I-TAB 250 solo (de 6
ng/ml a 153 ng/ml) o con TAb 250 no marcado en exceso para
determinar la unión no específica. Después de que la unión en la
superficie celular del anticuerpo radiomarcado alcanzara el
equilibrio, las células se formaron como pelets a 200 x g durante 5
minutos a 4ºC y se lavaron 3 veces con tampón de unión enfriado con
hielo para retirar anticuerpo no unido. Los pelets celulares se
resuspendieron en medio de unión enfriado con hielo y se tomaron
partes alícuotas para determinar la cantidad de unión superficial de
^{125}I-TAb 250 inicial. Para iniciar la
internalización del anticuerpo radiomarcado, las células se
calentaron hasta 37ºC. En los momentos de 15 a 150 minutos, se
retiraron partes alícuotas y las células se recogieron mediante
centrifugación (1400 x g 4 minutos, 4ºC). Los sobrenadantes que
contenían anticuerpo disociado o reciclado se recogieron. Los pelets
se resuspendieron 2 veces en un lavado ácido (100 \mul/tubo de
PBS, glucosa al 1%, pH 1). Los sobrenadantes que contenían el
anticuerpo unido superficialmente se combinaron y se contaron. Los
extremos de los tubos que contenían la radiactividad asociada a
células restante se cortaron y se contaron.
La Figura 6 ilustra que el anticuerpo monoclonal
TAb 250 no se internaliza en células
MDA-MB-231 (cuadro B). En contraste,
las células SKBR-3 internalizaban el anticuerpo TAb
250 lo más eficazmente (cuadro A) mientras que la internalización
del anticuerpo en células SKOV-3 y células
MDA-MB-453 era intermedia (cuadros
C y D), respectivamente.
Se preparó
3-(2-piridilditio)(propionato) de
N-succinimidilo (SPDP) en dimetilformamida como una
solución de reserva de 3 mg/ml en dimetilformamida seca. Puesto que
el SPDP cristalino puede sufrir hidrólisis, la concentración real de
reticulador químicamente reactivo se determinó mediante métodos
espectrofotométricos al analizar la absorbancia a 260 nm en un
espectrofotómetro de doble haz. La concentración de reserva de SPDP
se calcula a partir de la siguiente ecuación
\frac{\text{Cambio en la
absorbancia (260 nm);0}}{\text{02 x 103 ml/milimol}} \ x \
\frac{301;0}{01} =
milimoles/ml/SPDP
Un miligramo de anticuerpo monoclonal TAb 250 en
1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadió a un
tubo de vidrio. Se añadió lentamente solución de reserva de SPDP en
aproximadamente un exceso molar de 5 veces al tubo (aproximadamente
10 \mul de solución de reserva), mezclando constantemente. La
mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente,
mezclando cada 5 minutos durante el período de incubación.
El SPDP sin reaccionar en exceso se retiró de la
muestra mediante cromatografía de filtración en gel sobre una
columna Sephadex G-25 (1 x 24 cm) preequilibrada con
tampón de fosfato sódico 100 mM, pH 7,0, que contenía EDTA 0,5 mM
(Tampón A). Las fracciones (0,5 ml) se recogieron y se analizaron
con respecto al contenido de proteína usando el ensayo de unión de
colorante de Bradford (Bradford, Anal. Biochem.
72:248-254 (1976)). La absorbancia (600 nm) se
controló en una placa de 96 pocillos usando un autolector de
microplaca Bio-TEK. El anticuerpo se eluía en el
volumen de huecos (fracciones 14-20) y estas
fracciones se reunieron y se mantuvieron a 4ºC. La proteína se
concentró en un microconcentrador Centricon-30. El
retenido del Centricon se lavó con tampón de fosfato sódico 100 mM,
pH 7,0, que contenía EDTA (0,5 mM). El anticuerpo se concentró hasta
un volumen final de aproximadamente 0,5-0,75 ml.
Se prepara TAb 250-gelonina
conectado con SMTP al acoplar gelonina modificada con
2-IT con anticuerpo monoclonal TAb 250 modificado
con SMPT. Brevemente, para modificar TAb 250 con SMTP, 10 mg de
anticuerpo en 1,0 ml de PBS se diluyen 1:1 con 2 x tampón de borato
(borato sódico 0,05 M, cloruro sódico al 1,7%, pH 9,0) y 52 \mul
de SMPT 4 mM en DMF seca se añaden lentamente a la solución de
anticuerpo. La reacción se incuba a temperatura ambiente durante 2 h
con agitación bajo N_{2}. El SMPT en exceso se retira al hacer
pasar la mezcla de reacción a través de una columna Sephadex
G-25 que contiene tampón de
fosfato-EDTA, pH 7,5, y las fracciones positivas al
anticuerpo se evalúan mediante el ensayo Bio-Rad.
Las fracciones se reúnen y se almacenan a 4ºC bajo N_{2}. La
reticulación con 2-IT se lleva a cabo a 27ºC bajo
N_{2} con agitación durante 96 h. El producto final se purifica
como se describe para SPDP en el Ejemplo 9.
Un miligramo de gelonina purificada (2 mg/ml en
PBS) preparada como se describe en el Ejemplo 1 se modificó con
iminotiolano según se describe en el Ejemplo 3. Anticuerpo
monoclonal TAb 250 modificado como se describe en el Ejemplo 9 se
mezcló con un peso igual de la gelonina modificada. Esta proporción
correspondía a un exceso molar de 5 veces de gelonina en comparación
con el anticuerpo. El pH de la mezcla se ajustó hasta 7,0 mediante
la adición de tampón de TEA/HCl 0,05 M, pH 8,0, y la mezcla se
incubó durante 20 horas a 4ºC bajo nitrógeno. Se añadió
yodoacetamida (0,1 M) hasta una concentración de 2 mM para bloquear
cualesquiera grupos sulfhidrilo libres restantes y la incubación se
continuó durante 1 hora adicional a aproximadamente 25ºC. La mezcla
de reacción se almacenó a 4ºC hasta la purificación mediante
filtración en gel.
La gelonina no conjugada y los productos de bajo
peso molecular se retiraron de las mezclas de reacción del Ejemplo
10 mediante filtración en gel sobre una columna Sephadex
S-300 (1,6 x 31 cm) preequilibrada con PBS.
Las mezclas de reacción del Ejemplo 10 se
concentraron hasta aproximadamente 1 ml con un microconcentrador
Centricon 30 antes de cargar en la columna Sephadex. La columna se
lavó con PBS. Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron
partes alícuotas de 50 \mul con respecto a la proteína mediante el
ensayo de Bradford.
El anticuerpo no conjugado se retiró del
anticuerpo conjugado con gelonina mediante cromatografía de
actividad sobre una columna (1 x 24 cm) de Blue Sepharose
CL-6B preequilibrada con tampón de fosfato 10 mM, pH
7,2, que contenía NaCl 0,1 M. Después de cargar la muestra de eluato
S-300, la columna se lavó con 30 ml del mismo
tampón para eluir completamente anticuerpo no conjugado.
El anticuerpo conjugado a gelonina se unió a la
columna y se eluyó con un gradiente salino lineal de NaCl 0,2 a 2 M
en tampón de fosfato 10 mM, pH 7,2. El complejo de
anticuerpo-gelonina se eluyó a aproximadamente NaCl
0,7 M. El contenido de proteína de las fracciones eluidas se
determinó mediante el ensayo de Bradford. Las fracciones que
contenían proteína se reunieron y el patrón de elución se confirmó
mediante electroforesis sobre un gradiente de 5 a 20% de gel de
poliacrilamida no reductor. El pico de flujo pasante (fracciones
14-20) contiene sólo anticuerpo libre mientras que
las fracciones 50-80, eluidas con alto contenido de
sal, contienen conjugado de TAb 250-gelonina libre
de gelonina o anticuerpo no conjugados. El producto final contenía
anticuerpo TAb 250 acoplado a 1, 2 y 3 moléculas de gelonina. El
contenido medio de gelonina era 1,5 moléculas por molécula de
anticuerpo. El reticulocito de conejo en el sistema de traducción
in vitro se utilizó para estimar la actividad de gelonina del
complejo de gelonina-anticuerpo TAb 250
esencialmente puro. Una unidad de actividad de este ensayo se
definió como la cantidad de proteína requerida para proporcionar 50%
de inhibición de la síntesis de proteína en comparación con
controles no tratados. Utilizando este ensayo, se determinó que la
actividad específica tanto de la gelonina natural como del conjugado
de TAb 250-gelonina era 2 x 10^{8} U/mg y 8,2 x
10^{5} U/mg, respectivamente. El complejo de
gelonina-anticuerpo TAb 250 esencialmente puro es
activo en el ensayo de lisado de reticulocitos. Una dilución 1:1000
de la muestra original provocaba aproximadamente una dilución de 50%
de la síntesis de proteína, es decir una reducción de 50% de la
incorporación de [^{14}C]-leucina en la proteína.
Así, la actividad de la preparación original era 1000 U/ml.
Las composiciones de la presente invención pueden
incluir construcciones de fusión del anticuerpo monoclonal TAb 250 y
un resto citotóxico. Las construcciones de fusión de la imunotoxina
de la presente invención pueden prepararse, por ejemplo, mediante el
siguiente método. La secuencia nucleotídica de las regiones V de la
cadena tanto H como L de TAb 250 se determina fácilmente. Por
ejemplo, el RNA total se extrae de células que producen TAb 250 con
tiocianato de guanidinio. RNA de poli A+ puede aislarse mediante
cromatografía con oligo-(dT)-celulosa. Los genes
apropiados pueden aislarse usando técnicas estándar, incluyendo
técnicas de transcripción inversa y PCR. Una hebra de cDNA puede
sintetizarse a partir de mRNA aislado usando un cebador de
oligo-dT y transcriptasa inversa. Tal hebra de cDNA
puede amplificarse usando técnicas de PCR estándar con cebadores
apropiados. Un cebador cercano a la cola de poli-A
del mensajero puede basarse en la secuencia de
poli-A o en secuencias adyacentes comunes
encontradas en inmunoglobulinas de ratón. Véase Devereaux, Genetics
Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center y sus
bases de datos de secuencias asociadas. Un cebador en el otro
extremo del gen puede seleccionarse de secuencias comunes
encontradas en inmunoglobulinas de ratón. Véase Orlandi y otros
(1989) PNAS 86:3833-3837 y Larrick y otros
(1989) Bio/Technology 7:934-938. El gen de la
cadena pesada de TAb 250 tiene una secuencia aguas arriba 5' de
ATATAG CAGGAC CATATG y empieza codificando con ATGAA CTTGG GGCTC. El
gen de la cadena ligera de TAb 250 tiene una secuencia aguas arriba
5' TTTAC TTCCT TATTT y empieza codificando con ATGGG CATCA AGATG.
Estos cebadores pueden usarse para amplificar los genes mediante
tecnología de PCK y clonarse en vectores de expresión
plasmídicos.
Métodos de transfección estándar pueden aplicarse
a estos genes. Por ejemplo, puede introducirse DNA en células
Sp2/0-AG14 de hibridoma murino mediante
electroporación. Se lavan 1-2 x 10^{3} células
SP2/0-AG14 que crecen activamente y se resuspenden
en 1,0 ml de PBS estéril. Se añaden treinta microgramos de cada
plásmido quimérico, IgK e IgG1, a la suspensión celular. El DNA/las
células se transfieren a una cubeta de choque preenfriada, se
incuban sobre hielo al menos 5 minutos y a continuación se aporta un
electroimpulso de 0,5 kv/cm durante 10 ms (Transfector 300, BTX).
Después del choque, la mezcla de DNA/células se devuelve a hielo
durante 10 minutos, se diluye en 10 ml de DMEM que contiene
NCTC-109 al 5% y FCS al 10% y se incuba a
temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, las células se
transfieren a una incubadora a 37ºC con CO_{2} al 7% durante 48
horas antes de cultivar en placas en medio selectivo, que contiene 1
\mug/ml de xantina. Las células pueden cultivarse en placa en
placas de 96 pocillos a 3 x 10^{4} células/pocillo y los
sobrenadantes de cultivo ensayarse mediante ELISA con respecto al
anticuerpo unido a células diana positivas a antígeno TAb 250.
Se llevaron a cabo ensayos con bromuro de
3-(4,5-dimetil/tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) al retirar células de matraces de cultivo tisular con Versene
1:5000, centrifugar a 500 x g durante cinco minutos y resuspender
las células en medio en una concentración de 1 x 10^{5}
células/ml. Las células se cultivaron en placa a 100 \mul/pocillo
en placas de microvaloración de 96 pocillos y se incubaron en una
incubadora de CO_{2} humidificada a 37ºC durante 24 horas.
Al día siguiente, se añadió TAb 250 o
TAb-250-gelonina. Inmediatamente
después de la deposición de la concentración de anticuerpo más alta
en la primera columna de pocillos, se realizaron directamente
diluciones 1:1 de anticuerpo en las placas de microvaloración usando
una pipeta de varios canales. Las placas se incubaron a continuación
durante 3 días, seguido por la adición de 10 \mul/pocillo de MTT.
El MTT se preparó como una solución de 5 mg/ml de PBS, se filtró, se
esterilizó y se almacenó a 4ºC en la oscuridad. Las placas se
mantuvieron en la oscuridad y se incubaron durante 4 horas
adicionales a 37ºC. Los cristales de MTT se disolvieron al mezclar
los contenidos de los pocillos vigorosamente con 100 microlitros de
isopropanol que contenían HCl 0,04 N y dodecilsulfato sódico al 3%.
Las absorbancias a 570 nm se determinaron usando un lector para
ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA).
El ensayo de proliferación celular (CPA) mide el
crecimiento celular mediante la determinación del número y la
viabilidad de las células. El Día 0, células a
80-90% de confluencia se liberan de un matraz de
cultivo tisular, se forman como pelets a 200 x g a 20ºC durante 6
minutos y se resuspenden en MEM de Iscove que contiene glutamina 2
mM y suero bovino fetal al 10% hasta una concentración de 6000
células/ml. La suspensión de células se añade a placas de 24
pocillos a 1 ml por pocillo. Las placas se incuban a 37ºC, CO_{2}
al 5%, durante 24 horas. El día 1, las células de tres pocillos se
lavan con PBS y se liberan de la placa con 1 ml de tripsina al 0,05%
en PBS y se cuentan 500 \mul usando un contador Coulter. Se añaden
a los restantes pocillos 20 \mul de PBS, TAb 250 o TAb
250-gelonina, a las concentraciones indicadas en las
figuras. Las placas se devuelven a la incubadora. En los puntos
temporales indicados en las figuras, las células se liberan con
tripsina y se cuentan como el Día 1. Los restantes 500 \mul de
células se tiñen con yoduro de propidio de modo que la viabilidad
puede determinarse mediante citometría de flujo. Para cada punto de
la gráfica, se determina un número de células medio (n = 3) y se
multiplica por el porcentaje de células vivas para encontrar el
número de células viables. Este se divide por el número de células
vivas tratadas con PBS para el porcentaje de control sobre el eje
Y.
Como puede observarse en la Figura 1, el
anticuerpo ZME virtualmente no tenía efecto sobre células
SKOV-3. En contraste, el inmunoconjugado de TAb
250-gelonina era altamente activo.
La Figura 2 ilustra una citotoxicidad del
inmunoconjugado de TAb 250-gelonina sobre células
SKOV-3 en comparación con gelonina sola. A la misma
concentración, el inmunoconjugado de TAb
250-gelonina era aproximadamente 10.000 veces más
citotóxico que la gelonina sola.
La Figura 3 demuestra que un anticuerpo
irrelevante, anticuerpo monoclonal ZME 18, no tiene efecto
competitivo sobre la citotoxicidad del inmunoconjugado de TAb
250-gelonina. En contraste, incrementar la
concentración de anticuerpo monoclonal TAb 250 disminuye la
citotoxicidad del inmunoconjugado de un modo dependiente de la
dosis.
La Figura 4 ilustra una relación de
dosis-respuesta del inmunoconjugado de TAb
250-gelonina sobre células SKOV-3.
Como se observa en el ensayo CPA, una dosis por encima de 0,1
microgramos/ml producía 80% de inhibición en seis días.
La Figura 5 ilustra los efectos del anticuerpo
monoclonal TAb 250 solo o el conjugado de TAb 250 con gelonina sobre
células SKOV-3. Como puede observarse, existe una
inhibición dependiente de la dosis por el inmunoconjugado de TAb
250-gelonina en el ensayo CPA.
La Figura 7 representa los efectos del
inmunoconjugado de TAb 250-gelonina sobre cuatro
líneas celulares diferentes. Como podría esperarse, la mayor
cantidad de toxicidad se producía en la línea celular
SKOV-3. Una toxicidad intermedia se evidenciaba en
células SKOV-3 y
MDA-MB-453 mientras que virtualmente
no se observaba citotoxicidad en células
MDA-MB-231. Así, la citotoxicidad
del inmunoconjugado de TAb 250-gelonina se
correlaciona con el número de receptores de la superficie celular en
estas células.
Por lo tanto, en conclusión, se observa que la
presente invención y las realizaciones descritas aquí están bien
adaptadas para llevar a cabo los objetivos de obtener los fines
indicados al comienzo.
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Claims (25)
1. Una composición que comprende un conjugado de
una proteína que exhibe especificidad de unión para un dominio
antigénico para proteína c-erbB-2 y
una toxina derivada de planta, en la que dicha toxina se selecciona
del grupo que consiste en gelonina y gelonina recombinante de
longitud completa.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha especificidad de unión es para un
epítopo extracelular de
c-erbB-2.
3. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha proteína se
deriva de un segmento V_{H} de un anticuerpo.
4. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína comprende
una cadena pesada de inmunoglobulina intacta.
5. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína se
deriva de un segmento V_{L} de un anticuerpo.
6. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína
comprende una cadena ligera de inmunoglobulina intacta.
7. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína
comprende además una cadena pesada de inmunoglobulina intacta.
8. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que dicha proteína es de un
anticuerpo monocatenario.
9. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que dicha proteína es de TAb 250
(Nº de Registro del ATCC HB 10646) o BACh-250 (TAb
250 humanizado).
10. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que dicha toxina derivada de planta
tiene un efecto celular muy inferior cuando no está conjugada a
dicho resto de orientación.
11. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que dicha toxina se selecciona del
grupo que consiste en toxina natural y toxina recombinante.
12. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que dicho conjugado es una proteína
de fusión entre dicho resto de orientación y dicha toxina derivada
de planta.
13. Una composición de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que comprende además un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
14. Un producto farmacéutico que comprende una
composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
15. Uso de una composición de acuerdo con
cualquier reivindicación precedente, en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de una célula neoplásica.
16. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la sobreexpresión de proteína
c-erbB-2.
17. Uso de una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para el
tratamiento de células neoplásicas, en el que dicha célula se
selecciona del grupo que consiste en una célula de carcinoma
mamario, una célula de carcinoma ovárico, una célula de carcinoma
pulmonar, una célula de carcinoma de las glándulas salivares, una
célula de tumor gástrico, una célula de adenocarcinoma de colon y
una célula de leucemia de la médula ósea.
18. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para retardar la velocidad de crecimiento de células
neoplásicas.
19. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de células neoplásicas de ser humano
o animal.
20. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para la prevención de la recurrencia de un estado
neoplásico.
\newpage
21. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para prolongar el tiempo de supervivencia de un huésped
de dicha célula neoplásica.
22. Un método in vitro para tratar una
célula neoplásica, comprendiendo el método administrar a las células
una dosis eficaz de una composición de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
22, en el que dicha célula neoplásica es una célula de la médula
ósea.
24. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparación de un
medicamento para destruir células neoplásicas en la médula ósea.
25. Uso de una composición de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que las células de la médula ósea
sobreexpresan proteína c-erbB-2.
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