CN110475779A - 标记含醛靶分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使衍生自N‑(2‑氨基乙基)吡咯的化合物与包含醛的靶分子结合的方法，所述化合物还包含关注部分，通过该方法获得的包含靶分子和关注部分二者的化合物(缀合物)，以及衍生自N‑(2‑氨基乙基)吡咯的新物质。式I：式II：

Description

标记含醛靶分子的方法
本发明涉及一种使衍生自N-(2-氨基乙基)吡咯的化合物与包含醛的靶分子结合的方法，所述化合物还包含关注部分，通过该方法获得的包含靶分子和关注部分二者的化合物(缀合物)，以及衍生自N-(2-氨基乙基)吡咯的新物质。
发明背景
蛋白质的位点特异性修饰是一个具有挑战性的问题，尤其是对于用于诊断或治疗应用的抗体。经济且可应用(在工业规模上)的用于位点特异性多肽修饰的可靠方法非常重要。
蛋白质功能化的早期方法通过使蛋白质分别与过量的硫醇或胺反应性试剂(例如马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应来利用半胱氨酸或赖氨酸残基的反应性。这些氨基酸丰富、分布广泛并且易于修饰(由于适当的偶联化学的可获得性)。
但是，当“赖氨酸标记”策略例如用于标记抗体或其抗原结合片段时有几个缺点：a)它经常导致显著降低的抗原结合活性(在或接近抗原结合位点的赖氨酸)；b)即使在相同的1:1化学计量下，单标记的缀合物也由混合物组成，该混合物包含通过多肽中的不同赖氨酸连接的标记物，和c)所需1:1产物的产率相当低。
用于位点特异性蛋白质标记的最重要的近期方法之一是通过酶促反应将生物正交官能团结合到蛋白质的特定位点中。有关“蛋白质的酶促标记”的最新评论参见M.Rashidian等人，Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294。该综述中涵盖的用于位点特异性缀合的酶包括甲酰甘氨酸生成酶、唾液酸转移酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、O-GlcNAc翻译后修饰、分拣标记、转谷氨酰胺酶、法尼基转移酶、生物素连接酶、硫辛酸连接酶和N-肉豆蔻酰基转移酶。
已经开发了多种化学、酶促和遗传方法以将醛和酮位点特异性地引入蛋白质。这些包括N末端丝氨酸或苏氨酸残基的高碘酸盐氧化(Geoghegan, K.F. & Stroh, J.G.,Bioconjugate Chem. (1992), 3(2):138-146)；磷酸吡哆醛介导的N-末端氨基转移以产生α-酮酰胺或乙醛酰胺(glyoxamide)(Gilmore, J.M.等人, Angew. Chem. Int. Ed.(2006),45(32):5307-5311; Scheck, R.A.等人, J. Am. Chem. Soc.(2008), 130(35):11762-11770; Witus, L.S.等人,J. Am. Chem. Soc. (2010), 132(47):16812-16817)；将含酮的小分子添加到通过表达蛋白连接产生的蛋白质C末端硫酯中(Esser-Kahn, A.P.& Francis, M.B. Angew. Chem. Int. Ed. (2008), 47(20):3751-3754)；经由琥珀终止密码子抑制遗传编码掺入含有酮的非天然氨基酸(Wang, L.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (2003), 100(1):56-61; Hutchins, B.M., et al,. Chem. Biol. (2011),18(3):299-303; Kim, C.H.,等人, J. Am. Chem. Soc. (2012), 134(24):9918-9921)；指导带有醛或酮的小分子的酶促连接的肽标签的遗传编码(Rashidian, M.,等人, J Am. Chem. Soc. (2012), 134(20):8455-8467; Chen, I.,等人, Nat. Methods (2005) 2(2):99-104)；和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)修饰位点的遗传编码，即由Carrico和Bertozzi开发的“醛标签”方法(Carrico, I.S.,等人, Nat. Chem. Biol. 3(6):321-322; Wu, P.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009), 106:3000-3005; Hudak, J.E.,等人, J Am. Chem. Soc. (2011),133(40):16127-16135; Hudak, J.E.,等人(2012), Chem. Int. Ed. (2012),51(17):4161-4165; Rabuka, D.等人, Nat. Protoc. (2012),7(6):1052-1067)。
与将反应性羰基引入蛋白质的方法的多样性形成对比的是，已广泛适用于其化学修饰的反应数量有限。由于其生物正交性、操作简便性(即不需要辅助试剂)以及良好产率(在温和水性条件下)，因此绝大多数报告使用上面提到的腙和肟形成反应。不幸地是，所得的C=N键易于水解(Mueller, B.M.,等人, Bioconjugate Chem. (1990), 1(5):325-330)，导致不稳定。但是，许多常规应用都需要长期的稳定性。
T. Sasaki等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. (2008), 18:4550-4553已经描述了在β位取代的吲哚化合物。在WO 2009/150865中，公开了一种通过使用Pictet-Spengler反应生产修饰的蛋白质的方法。描述了在其β-C位取代的杂环吲哚衍生物，并且在实施例中仅使用并显示了在其β-C位取代的吲哚衍生物。Bertozzi小组描述了在Pictet-Spengler型反应中的吲哚氨基氧基或肼官能团增加反应性(P. Agarwal,等人, PNAS (2013), 110(1), 46-51; P. Agarwal,等人, Bioconjugate Chem. (2013), 24 (6), 846-851; WO2014/078733)。
现已令人惊讶地发现，基于N-(2-氨基乙基)吡咯的化合物可用于Pictet-Spengler型反应并且具有很大的优势，例如在反应动力学和产率方面，其中氨基-乙基经由吡咯环的氮连接并且所述化合物进一步包含所需的关注部分。另外，公开了通过该方法获得的缀合物(化合物)以及某些N-(2-氨基乙基)吡咯物质。
发明概述
本发明公开了一种使衍生自N-(2-氨基乙基)吡咯的化合物与包含醛的靶分子结合的方法，所述化合物还包含关注部分。更具体地，本发明涉及一种制备根据式II的化合物的方法，所述方法包括：使式I的化合物与包含醛基的靶标T反应，如下面所给出的
式I:
由此得到根据式II的化合物(=缀合物)，
式II:
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接以形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中L不存在或是连接基，其中M是关注部分，且其中T是靶分子，条件是R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是-LM。
还公开了通过本文公开的方法获得的缀合物，其包含靶分子T和关注部分M二者，例如根据式II的化合物，
式II:
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和T如上所定义的。
进一步公开了根据式III的物质，
式III:
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6和R7独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，
其中R8是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接以形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中M是选自核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和马来酰亚胺的关注部分，
其中连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑，
条件是R4、R5、R6或R7中的至少一个是-LM。
发明详述
本发明公开了一种用于使衍生自N-(2-氨基乙基)吡咯的化合物与包含醛的靶分子结合的通用方法，所述化合物还包含关注部分。
在一个实施方案中，本公开涉及一种制备根据式II的化合物的方法，所述方法包括：使式I的化合物与包含醛基的靶标T反应，如下面所给出的
式I:
由此得到根据式II的化合物，
式II:
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接以形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中L不存在或是连接基，其中M是关注部分，且其中T是靶分子，条件是R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是-LM。
词语“包含(comprise)”以及变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。
如本文包括所附权利要求所用的取代基具有技术人员通常已知的含义。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，意指具有指定碳原子数(即，C1-C20意指1-20个碳)的直链或支链或环状烃基或其组合。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，例如正戊基、正己基的同系物和异构体，等。在某些实施方案中，烷基是具有1-20个碳原子长度，或具有1-10个碳原子长度或具有1-6个碳原子长度的直链或支链烷基。在一个实施方案中，烷基是甲基或乙基。
除非另有说明，否则术语“芳基”和“杂芳基”本身或作为另一取代基的一部分意指也可以与另外的芳族环系统(优选 1至4个环)稠合的芳族环系统(即5或6元环)。“杂芳基”环系统包含选自O、S和N的1-4个杂原子。“芳基”的实例包括但不限于基团如苯基和萘基。“杂芳基”的实例包括但不限于衍生自呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、三唑和吲哚的基团。
如技术人员所理解的，化学实体如烷基或芳基(仅提及两个非限制性实例)可以被“取代”，即，一个或多个氢可以被替换/替代。在一个实施方案中，氢被选自以下的基团替代：卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OR'、=O、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)OR'、-C(O)NR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)OR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRS(O)2R'、-CN、卤素和-NO2、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，其中R'、R"和R"'优选独立地选自氢和取代或未取代的烷基。优选的取代基是烷基如甲基或乙基，芳基如苯基或苄基，甲氧基或乙氧基，胺如二甲基氨基，羧酸衍生物如羧酸、酯或酰胺，以及硝基，氰基，叠氮化物和卤素。
术语“杂烷基”本身或与另一术语组合意指稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，由上面“烷基”下所述的一定数量的碳原子和至少一个选自O、N、P和S的杂原子组成。杂原子可位于杂烷基的任何内部位置或末端位置，即与杂烷基通过其连接至分子其余部分的位置相对。杂原子也可以位于N-(2-氨基乙基)吡咯核心结构的吡咯环与(杂)烷基或(杂)芳基取代基之间。优选地，在内部位置为链或环的成员的每个杂原子的两侧是碳原子。内部位置的杂原子可以是未取代的，例如，带有氢原子，或可具有选自烷基和O的至少一个取代基。杂烷基的实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3、-NH-CH3、-NH-CH2-CH3、-N(CH3)2、-N(CH2-CH3)2和聚(环氧烷)，尤其是聚乙二醇(PEG)衍生物。
术语“烯基”描述了化学基团，除了存在至少一个双键外，在其他方面如在上面烷基下所定义的。
术语“杂烯基”描述了化学基团，除了存在至少一个双键外，在其他方面如在上面杂烷基下所定义的。
在一个实施方案中，R1、R2和R3独立地是H或甲基。
在一个实施方案中，R1、R2和R3均是H。
如本领域技术人员将理解的，“连接基”是提供两个部分之间具有任何期望距离的连接的任何合适的结构。因此，两个部分不是直接彼此结合而是通过这样的连接结构或连接基结合。
在一个实施方案中，分别包含在式I或II中的连接基L可以由其骨架长度定义，并且在一个实施方案中，具有1至100个原子的骨架长度。在一个实施方案中，L具有1至50个原子的骨架长度。在一个实施方案中，L为直链或支链的饱和、不饱和、未取代或取代的C1-C50烷基链，或具有由碳原子和一个或多个选自O、N和S的杂原子组成的骨架的1至50个原子链，或包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基(其中例如亚苯基环占四个原子的长度)的具有由碳原子和一个或多个选自O、N和S的杂原子组成的骨架的1至50个原子链。在一个实施方案中，根据本发明的化合物中的连接基L是饱和的C1-C20烷基链，或具有由碳原子和一个或多个选自O、N和S的杂原子组成的骨架的1至20个原子链，或包含至少一个芳基、杂芳基、取代的芳基或取代的杂芳基(其中例如亚苯基环占四个原子的长度)的具有由碳原子和一个或多个选自O、N和S的杂原子组成的骨架的1至20个原子链。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的连接基L不存在或选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑或由酰胺键、酯键、烯烃或三唑组成。在一个实施方案中，L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑或可以由酰胺键、酯键、烯烃或三唑组成。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物的定义中的连接基L不存在。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑或可以由酰胺键、酯键、烯烃或三唑组成。在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、酰胺键和寡肽。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的L选自取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基。
在一个实施方案中，L中可包含的肽是寡肽并由2至20个氨基酸组成。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的L通过酯、醚、硫醚、胺、酰胺、二硫化物、碳酸酯、氨基甲酸酯、烯烃、三唑、二氢哒嗪或磷酸二酯键与关注部分M连接。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中并用于本文公开的方法中的“关注部分”(M)选自核苷酸、寡核苷酸、肽即寡肽或多肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和官能团。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M具有低分子量，即，其具有小于20000道尔顿的分子量。在进一步的实施方案中，关注部分的分子量为100至15000、100至10000、100至5000、以及100至2000道尔顿。
在一个实施方案中，可以代表在本文公开的方法中使用的关注部分M的肽由1至100个氨基酸组成。
在一个实施方案中，连接基L或关注部分M中的仅一个分别是寡肽或肽。
在一个实施方案中，可以代表在本文公开的方法中使用的关注部分M的寡核苷酸由2至100个核苷酸组成。
在一个实施方案中，关注部分M包含核苷酸。
分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M之一是标记物。可以使用可共价连接至连接基(L)的任何标记物。标记物可以起作用从而：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如以进行FRET(荧光共振能量转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞渗透性，或(iv)提供捕获部分，例如以调节离子络合。
可获得许多标记物(也称为染料)，所述标记物通常可以分为以下类别：
(a) 荧光染料
荧光染料例如描述于Briggs等人"Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyesand Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1(1997) 1051-1058。
荧光标记物或荧光团包括稀土元素螯合物(铕螯合物)；荧光素型标记物，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型标记物，包括TAMRA、丽丝胺、德克萨斯红；丹酰；花青；藻红蛋白；及其类似物。可以使用本文公开的技术使荧光标记物与靶分子中包含的醛基缀合。荧光染料和荧光标记试剂包括可商购获得的那些，例如，可从Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA)、ThermoFisher Scientific (Waltham,Massachusetts, USA)和Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.)商购获得。
(b) 发光染料
发光染料或标记物可以进一步细分为化学发光和电化学发光染料。
化学发光标记物的不同类别包括鲁米诺、吖啶鎓化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸及其衍生物的体系。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶鎓的标记物(详细综述在Dodeigne C.等人, Talanta 51 (2000) 415-439中给出)。
用作电化学发光标记物的主要相关标记物分别是基于钌和铱的电化学发光络合物。证实电化学发光(ECL)作为高度灵敏的和选择性的方法在分析应用中非常有用。它将化学发光分析的分析优势(无背景光信号)与通过施加电极电势而易于控制反应相结合。通常，在液相或液-固界面用TPA(三丙胺)再生的钌络合物，尤其是[Ru (Bpy)3]2+(在约620nm处释放光子)，被用作ECL标记物。最近，也已经描述了基于铱的ECL标记物(WO2012107419(A1))。
(c) 放射性标记物利用放射性同位素(放射性核素)，例如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
(d) 适合用作用于成像和治疗目的的标记物的金属螯合物络合物在本领域中是众所周知的(US 2010/0111856；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157；Meares等人,Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78；Mirzadeh等人, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65；Meares等人, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26；Izard等人, BioconjugateChem. 3 (1992) 346-350；Nikula等人, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90；Camera等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62；Kukis等人, J. Nucl. Med. 39 (1998)2105-2110；Verel等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670；Camera等人, J. Nucl.Med. 21 (1994) 640-646；Ruegg等人, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226；Verel等人,J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670；Lee等人, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482；Mitchell,等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112；Kobayashi等人 BioconjugateChem. 10 (1999) 103-111；Miederer等人, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137；DeNardo等人, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90；Blend等人, Cancer Biotherapy& Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363；Nikula等人 J. Nucl. Med. 40 (1999)166-76；Kobayashi等人, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36；Mardirossian等人, Nucl.Med. Biol. 20 (1993) 65-74；Roselli等人, Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20)。
分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M之一是细胞毒性剂。在一个实施方案中，关注部分是选自以下的细胞毒性剂：(i)化学治疗剂，其可以用作微管抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂；(ii)可能以酶促方式起作用的蛋白质毒素；和(iii)治疗性放射性同位素。在一个实施方案中，关注部分是化学治疗剂。
示例性的化学治疗剂包括但不限于美登醇、奥利斯他汀、尾海兔素、单端孢霉烯、CC1065、卡奇霉素和其他烯二炔抗生素、紫杉烷、蒽环霉素及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
蛋白毒素包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链(Vitetta等人 (1987) Science, 238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲素A链 、α-八叠球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAP1、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端抱菌素(trichothecenes) (WO 93/21232)。
治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb和Lu的放射性同位素。
可以以已知的方式掺入放射性同位素(Fraker等人 (1978) Biochem. Biophys.Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal,CRC Press 1989)。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至络合物的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
如上所述，分别包含在式I或式II的化合物中的可能的关注部分M之一是结合对的配偶体。
如本文所用的结合对由以高亲和力(即以一纳摩尔亲和力或更好的亲和力)彼此结合的两个配偶体组成。如技术人员将容易理解的，分别包含在式I或式II的化合物中的M代表两个可能的配偶体元素之一，例如，半抗原/抗半抗原结合对的半抗原。结合对的实施方案是例如由受体和配体组成的结合对、半抗原和抗半抗原抗体组成的结合对，以及基于天然存在的高亲和力结合对的结合对。在某些实施方案中，结合对的配偶体是配体或半抗原，或它是天然存在的高亲和力结合对的一个配偶体。
受体-配体结合对的一个实例是由类固醇激素受体和相应的类固醇激素组成的对。在一个实施方案中，配体是类固醇激素。
在一个实施方案中，结合对的配偶体是半抗原，或它是天然存在的高亲和力结合对的一个配偶体。
代表本发明一个实施方案的基于天然存在的高亲和力结合对的结合对的实例是生物素或生物素类似物，例如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和亲和素或链霉亲和素，以及FimG和DsF结合对。生物素-(链霉)亲和素结合对是本领域众所周知的。FimG-DsF结合对的基本原理例如描述于WO2012/028697。
本发明的另一种类型的结合对和实施方案是半抗原和抗半抗原抗体结合对。半抗原是分子量为100至2000道尔顿的有机分子。在一个实施方案中，半抗原的分子量为100至1000道尔顿。通常，这种分子量的有机分子不具有免疫原性或具有较低的免疫原性。通过将半抗原与载体分子偶联，可以使半抗原具有免疫原性，并且可以根据标准程序生成抗半抗原抗体。在一个实施方案中，半抗原可以选自包括以下的组：固醇、胆汁酸、性激素、皮质类固醇、强心苷、强心苷-糖苷、蟾蜍二烯羟酸内酯、类固醇-皂角苷元和类固醇生物碱、强心苷和强心苷-糖苷。这些物质类别的代表是异羟基洋地黄毒苷、洋地黄毒苷元、羟基洋地黄毒苷元、毒毛旋花子甙元、地高辛、洋地黄毒苷、ditoxin、毒毛旋花甙。另外的合适的半抗原是例如荧光素。
对于本领域技术人员显而易见的是，某些物质例如生物素或其类似物都是天然存在的结合对的配偶体，或半抗原，即它们可用于产生与其结合的抗体。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M是选自羧酸、羧酸酯、环氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、肼、羟基、巯基、马来酰亚胺基、烯基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚磷酰胺、反式环辛烯和四嗪的官能团。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M是选自羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、氨基、卤素、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和亚磷酰胺的官能团。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M是结合对的配偶体。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M选自核苷酸、寡核苷酸、荧光或发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物和马来酰亚胺。
优选的地高辛类似物是异羟基洋地黄毒苷。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M选自半抗原，生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素，FimG，配体和寡核苷酸。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M选自半抗原和生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M是生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M是生物素。
生物素类似物是氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
如技术人员所理解的，核苷酸是由连接到嘌呤或嘧啶碱基和磷酸酯基团上的核糖或脱氧核糖组成的化合物，其例如是核酸(例如RNA和DNA)的基本结构单元。核苷酸可在糖、碱基或磷酸酯部分被修饰，例如，它们可在嘧啶碱基的C5位被修饰。优选的实例是2’-脱氧腺苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧胞苷和2’-脱氧胸苷的5’-磷酸酯或多磷酸酯。其他核苷酸类似物或衍生物在下文关于寡核苷酸(核酸)的详细描述中进一步描述。
寡核苷酸由通过磷酸酯键连接的多个核苷酸组成，并且还可以包含非核苷酸的结构单元，例如间隔物分子，如二醇、1,3-丙二醇、来自Glen Research或Chemgenes的dSpacer®，或甚至是芳香族结构单元如取代的苯，只要它们可以掺入寡核苷酸。这种寡核苷酸中包含的一些核苷酸可以被其他官能团如标记部分(例如生物素、荧光素)取代。
在一个实施方案中，代表关注部分M的寡核苷酸由2至50个选自核苷酸和非核苷酸结构单元的亚单元组成。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中并用于本文所公开的方法中的关注部分M具有小于20000道尔顿的分子量，并且是官能团、结合对的配偶体、细胞毒性剂或标记物。
在一个实施方案中，分别包含在式I或式II的化合物中的关注部分M具有100至20000道尔顿的分子量，并且选自结合对的配偶体和标记物。
如上所述，本文公开的方法在将任何种类的包含醛基的靶分子T与式I的化合物结合中具有大用途。
在一个实施方案中，靶分子T选自固相、多肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸和核酸。
“固相”、“固体载体”或“固体表面”通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。如本领域技术人员将理解的，固相或者就其性质而言可以包含醛官能团或者可以被化学修饰以引入醛基。进一步明显的是，固相可以被多肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸和核酸中的任何一种包被，其出于本发明的目的包含醛基。固体载体可以是管、珠或微孔板的盘的形式。在一个实施方案中，固相是基于玻璃或任何上述聚合物的顺磁珠。
在一个实施方案中，靶分子T选自多肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸和核酸。
“碳水化合物”是由碳(C)、氢(H)和氧(O)原子组成的生物分子，氢氧原子比通常为2：1(如在水中)；换句话说，具有经验式Cm(H2O)n(其中m通常与n相同)。存在一些例外(m与n不同)；例如，脱氧核糖(DNA的糖成分)具有经验式C5H10O4。碳水化合物在技术上是碳的水合物；在结构上将它们视为多羟基醛和酮更为准确。
术语碳水化合物是生物化学中最常见的一组包括糖、淀粉和纤维素的分子，它是“糖类”的同义词。在一个实施方案中，碳水化合物选自糖、淀粉和纤维素。
在一个实施方案中，靶分子T选自多肽、蛋白质和核酸。
在一个实施方案中，靶分子T选自蛋白质和核酸。
在一个实施方案中，靶分子T是多肽或蛋白质。
术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”是本领域技术人员已知的并且在下文中进一步定义。
通常，术语“肽”是指包含两个或更多个氨基酸(=氨基酸残基)的聚合物，其中氨基酸的单体通过酰胺键连接在一起。氨基酸可以是其D-异构体或L-异构体，并且多肽可以由氨基酸的D-异构体或L-异构体组成。在一个实施方案中，肽由氨基酸的L-异构体组成。术语肽包括寡肽和多肽。
术语“寡肽”用于包含至少2个且至多20个氨基酸的肽。
术语“多肽”用于包含至少21个氨基酸的肽。天然存在的多肽由天然存在的氨基酸组成。另外，可以合成包含非天然氨基酸如β-丙氨酸、苯甘氨酸或/和高精氨酸的多肽。多肽可能会经历所谓的二级修饰，例如磷酸化或糖基化。这种修饰的多肽也是根据本发明的多肽。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的多肽具有21至1000个氨基酸残基。
在本发明的不同方面的上下文中，术语“蛋白质”是指包含一个或多个恢复二级和三级结构的肽链的分子，并且另外是指由数个肽链(即数个亚基)组成以形成四级结构的蛋白质。蛋白质有时会连接有非肽基团，所述基团可以称为辅基或辅因子。蛋白质也可以包含二级修饰，例如磷酸化、糖基化等。
在一个实施方案中，在包含醛基的靶分子T中，通过甲酰生成酶(FGE)方法引入醛基。简而言之，甲酰甘氨酸生成酶识别五肽共有序列CxPxR，并且它特异性地将该序列中的半胱氨酸氧化成甲酰甘氨酸。FGE识别序列或醛标签可以插入在原核或真核表达系统中产生的异源重组蛋白中(参见例如Rabuka等人，Nature Protocols 2012, 7, 1052-1067)。在另一个实施方案中，可以通过氨基转移反应将N-末端甘氨酸转化为醛(参见例如Gilmore等人, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 5307)。在其他实施方案中，例如，N-末端丝氨酸或苏氨酸可以被氧化成醛，并且糖修饰的蛋白质的糖结构可以被高碘酸盐氧化以产生醛基。
在一个实施方案中，靶分子T是选自结合对的多肽配偶体和抗体的多肽或蛋白质。
结合对的多肽配偶体例如是受体配体结合对中的受体，生物素亲和素或链霉亲和素结合对的亲和素或链霉亲和素，或FimG/DsF结合对的FimG。
在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的靶分子T是选自FimG、亲和素、链霉亲和素和抗体的多肽或蛋白质。
在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的靶分子T是选自亲和素、链霉亲和素和抗体的多肽或蛋白质。
本文中术语“抗体”以最广义使用，并且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。其天然环境中的污染物组分是会干扰抗体研究、诊断或治疗用途的材料，并且可能包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化(1)至例如通过Lowry方法所测定的大于95重量%的抗体，并且在一些实施方案中，至大于99重量%的抗体；(2)至足以通过使用例如经转杯式测序仪获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)至在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝或银染通过SDS-PAGE确定的均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不会存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最具可变性的部分，并含有抗原结合位点。
术语“可变的”是指以下事实：在抗体之间，可变结构域的某些部分在序列方面差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，可变性并非在抗体的整个可变结构域中均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR区，其主要采用β-折叠构型，通过三个HVR连接，形成连接β-折叠结构(并在某些情况下形成β-折叠结构的一部分)的环。每条链中的HVR通过FR区紧密结合在一起，并与另一条链中的HVR促使形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第五版, National Institute of Health,Bethesda, MD (1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应物功能，例如参与抗体依赖性细胞毒性中的抗体。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配为两种明显不同的类型之一，称为κ(κ)和λ(λ)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配为不同类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并在例如Abbas等人, Cellular and Mol. Immunology, 4thed., W.B. Saunders, Co. (2000)中进行了一般描述。抗体可以是较大融合分子的一部分，该较大融合分子是通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指基本上为其完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。该术语特别是指具有含有Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点，以及残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv物种由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链和一个轻链可变域可以通过柔性肽连接基共价连接，使得轻链和重链可以结合成类似于双链Fv物种的“二聚”结构。在这种构型中每个可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个HVR共同向抗体赋予抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
Fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对Fab'的指定，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初产生为Fab'片段对，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽连接基，使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。对于scFv的综述，参见例如Plueckthun, In: The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315。
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一条链上两个结构域之间配对的连接基，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体可以是二价或双特异性的。双链抗体在例如EP 0404097; WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134；和Holliger,P.等人, PNAS USA 90 (1993) 6444-6448中有更充分的描述。三链抗体和四链抗体也描述在Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134中。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的方法获得靶标结合多肽序列。例如，选择方法可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变选择的靶标结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的产生，降低其在体内的免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优势在于它们通常不受其他免疫球蛋白的污染。
如上所述，在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的靶分子T选自固相、寡肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸和核酸。
在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的靶分子T是核酸。
如本文所用的术语“寡核苷酸”或“核酸”通常是指包含至少2个核苷酸和至多约1000个核苷酸的短的、通常为单链的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸将具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸将具有不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。在一个实施方案中，寡核苷酸包含天然核苷2'-脱氧腺苷(dA)、2'-脱氧鸟苷(dG)、2'-脱氧胞苷(dC)、2'-脱氧胸苷(dT)、腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷以及 2'-脱氧尿苷(dU)。在另一个实施方案中，核酸可以是双链的。
术语寡核苷酸或核酸应被广义地理解，并且包括DNA和RNA以及其类似物和变体。核酸类似物可以例如含有在标准碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶上带有取代基的取代的核苷酸。这种包含取代核碱基的核苷的实例为：5-取代的嘧啶，如5-甲基dC、氨基烯丙基dU或dC、5-(氨基乙基-3-丙烯酰亚胺基)-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5卤代-dU或-dC；N取代的嘧啶，如N4-乙基-dC；N取代的嘌呤，如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8-取代的嘌呤，如8-[(6-氨基-己-1-基)-氨基]-dG或-dA、8卤代dA或dG、8-烷基dG或dA；和2-取代的dA，如2-氨基dA。
核酸类似物可包含核苷酸或核苷类似物。即，天然存在的核碱基可通过使用核碱基类似物进行交换，如5-硝基吲哚d核糖苷；3硝基吡咯d核糖苷、脱氧肌苷(dI)、脱氧黄嘌呤核苷(dX)；7-去氮杂-dG、-dA、-dI或-dX；7-去氮杂-8-氮杂-dG、-dA、-dI或-dX；8-氮杂-dA、-dG、-dI或-dX；d间型霉素；伪dU；伪异dC；4硫代dT；6硫代dG；2硫代dT；异dG；5-甲基-异-dC；N8-连接的8-氮杂-7-去氮杂-dA；5,6-二氢-5-氮杂-dC；和亚乙烯基-dA或吡咯-dC。对于技术人员显而易见的是，必须以使得双链体形成是特异性的方式选择互补链中的核碱基。例如，如果在一条链(例如(a))中使用5-甲基-异-dC，则异dG必须位于互补链(例如(a'))中。
在核酸类似物中，寡核苷酸骨架可以被修饰以含有取代的糖残基、糖类似物、核苷间磷酸酯部分的修饰和/或是PNA。
寡核苷酸可例如含有具有取代的脱氧核糖的核苷酸，如2'-甲氧基、2'-氟、2'-甲基硒基、2'-烯丙氧基、4'-甲基dN(其中N是核碱基，例如A、G、C、T或U)。
糖类似物是例如木糖；2',4'桥接核糖，如(2'-O，4'-C亚甲基)桥接核糖(低聚物，称为LNA)或(2'-O，4'-C亚乙基)桥接核糖(低聚物，称为ENA)；L-核糖、L-d-核糖、己糖醇(低聚物，称为HNA)；环己烯基(低聚物，称为CeNA)；阿卓糖醇(低聚物，称为ANA)；三环核糖类似物，其中C3'和C5'原子通过与环丙烷环稠合的亚乙基桥连接(低聚物，称为三环DNA)；甘油(低聚物，称为GNA)；吡喃葡萄糖(低聚物，称为同源DNA)；carbaribose(用环戊烷代替四氢呋喃亚基)；羟甲基吗啉(低聚物，称为吗啉代DNA)。
还已知包含修饰的核苷间磷酸酯部分的大量修饰不干扰杂交性质，并且这种骨架修饰也可以与取代的核苷酸或核苷酸类似物组合。实例是寡核苷酸硫代磷酸酯、寡核苷酸二硫代磷酸酯、寡核苷酸氨基磷酸酯和寡核苷酸甲基膦酸酯。
PNA(具有不含磷酸酯和d-核糖的骨架)也可以用作DNA类似物。上述修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及寡核苷酸骨架修饰可根据需要在本发明意义上的寡核苷酸中组合。
在将核酸或寡核苷酸用作靶分子T的情况下，在某些实施方案中，可以通过化学或酶促方法掺入醛修饰。通过化学方法，甲酰基改性的亚磷酰胺(例如，甲酰基吲哚亚磷酰胺，Glen Research)可用于引入醛基，也可应用NHS酯化学。醛修饰的三磷酸核苷可用于酶促掺入醛基。
在根据本公开的方法中，可以结合以上针对式I的化合物中包含的关注部分M以及靶部分T给出的各种实施方案。例如，在一个实施方案中，式I的化合物中包含的关注部分M选自核苷酸、寡核苷酸、荧光或发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物、和马来酰亚胺，并且靶分子T是多肽或蛋白质，例如抗体。在另一个实例中，式I的化合物中包含的关注部分M是核苷酸，并且靶分子T是核酸。
在一个实施方案中，包含在式I的化合物中的关注部分M是寡核苷酸，并且靶分子T是核苷酸。在一个实施方案中，包含在式I的化合物中的关注部分M是寡核苷酸，并且靶分子T是寡核苷酸。
在一个实施方案中，靶分子T包含多个，即2至50个醛基。结果，当实施本文公开的方法时，多个关注部分M与靶分子T连接。
本文还公开了通过本发明描述和公开的方法获得的缀合物，其包含靶分子T和关注部分M二者。
在一个实施方案中，本公开涉及根据式II的化合物(或缀合物)，
式II:
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和T均如上文在式I下所定义。即 R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是-LM，其中L和M如上所定义。如技术人员所理解的，式II的化合物是实施本文公开的方法时获得的产物。在式II的化合物中，靶分子T通过式II的核心结构1,2,3,4-四氢吡咯并[1,2-a]吡嗪与关注部分M结合或如本领域技术人员同样指出的那样缀合。
在根据本公开的方法中，根据需要可以将一方面靶分子T的各种实施方案和另一方面各种关注部分M组合。这些组合的选择产生了各种各样的缀合物，在各种应用领域中都具有显著的实用性。
在一个实施方案中，产生了式II的化合物(缀合物)，其包含作为靶分子的抗体，和作为关注部分的荧光标记物或发光标记物、或生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物。在一个实施方案中，这种化合物用于免疫学检测方法。
在一个实施方案中，产生了式II的化合物(缀合物)，其包含作为靶分子的抗体和作为关注部分的细胞毒性剂。在一个实施方案中，这种化合物用于治疗目的，例如用于抗癌治疗。
在一个实施方案中，产生了式II的化合物(缀合物)，其包含作为靶分子的核苷酸和作为关注部分的寡核苷酸。在一个实施方案中，这种化合物用于下一代测序方法，例如用于纳米孔测序。
进一步公开了根据式III的物质，
式III
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，其中R4、R5、R6和R7独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，
其中R8是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中M是选自核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和马来酰亚胺的关注部分，
其中连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑，
条件是R4、R5、R6或R7中的至少一个是-LM。
分别地，式I的化合物和式III的物质之间的一个重要区别是式III的R8不是-LM的事实。
在一个实施方案中，式III的物质中的R1、R2和R3独立地是H或甲基。
在一个实施方案中，式III的物质中的R1、R2和R3均是H。
如上所述，包含在式III的物质中的连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑。除这些限制外，包含在根据式Ⅲ的物质中的连接基L满足上面分别对包含在式Ⅰ和式Ⅱ的化合物中的连接基Ｌ所述的定义。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的L选自取代或未取代的烷基，以及取代或未取代的杂烷基，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑或由酰胺键、酯键、烯烃或三唑组成。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和寡肽。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的L选自取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基。
式III中包含的连接基L可以进一步由其骨架长度定义，并且在一个实施方案中，其骨架长度为1至100个原子。
包含在式III的物质中的“关注部分”(M)选自核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和官能团。除这些限制外，包含在根据式Ⅲ的物质中的关注部分M满足上面分别对包含在式Ⅰ和式Ⅱ化合物中的关注部分M所述的定义。
如果包含在式III的物质中的关注部分M为核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体或官能团，则所有这些部分均如上所定义。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的关注部分选自核苷酸、寡核苷酸、荧光或发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物和马来酰亚胺。
作为关注部分M包含在式III的物质中的核苷酸、寡核苷酸、荧光标记物、发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物均如上所定义。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的关注部分选自发光标记物、细胞毒性剂和生物素或生物素类似物。
在一个实施方案中，包含在式III的物质中的关注部分是核苷酸或寡核苷酸。
如在实施例部分中证明的，分别在式I和式III中公开的在其N位被取代的吡咯化合物显示出比C-取代的吡咯化合物更高的反应性。另外，通过使包含醛的靶分子与根据本公开的吡咯化合物(其在吡咯环的N位被取代)反应而获得的缀合产物(根据式II的物质)也显示出更高的稳定性。
附图描述
图1：α-，β-和N-(2-氨基乙基)吡咯分别与含甲酰甘氨酸的肽(11)(SEQ ID NO:1)反应。在(A)中，反应被示意性地描绘。从(B)可以明显看出，N-(2-氨基乙基)吡咯(图1B中的N)的转化分别显著比α-以及ß-(2-氨基乙基)吡咯(图1B中的α，ß)的转化更快和更有效。
图2：此图示意性地显示了用吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)对C末端醛标记的小鼠单克隆抗TSH抗体进行位点特异性标记。
图3：用吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)对C末端(醛)标记的小鼠单克隆抗TSH抗体进行位点特异性标记。显示了通过TSK GFC300 SA-FLUO分析获得的缀合物的结果，该缀合物是用以下获得的：具有C末端突变标签(LATPSRAALLTGR = SEQ ID NO:4)(不含甲酰甘氨酸)的小鼠抗TSH抗体(A) (未形成缀合物)，以及分别在(B)和(C)中的含有C末端醛标签(L*甲酰基Gly*TPSRAALLTGR = SEQ ID NO:3)的小鼠抗TSH抗体(高效标记)。
图4：缀合物在TSH-Elecsys测定和稳定性测试中的性能。已经测试了通过用吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)对C末端醛标记的针对TSH的小鼠单克隆抗体进行位点特异性标记而获得的缀合物。从左到右的列是：t = 0时的原始缀合物(标记为“ori”；通过经典NHS化学获得)；在35℃下7天后的原始缀合物；在t ＝ 0时的新缀合物(标记为“5”)；和在35℃下7天后的新缀合物。
图5：用N-和α-取代的吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素[分别为化合物(5)和(7)]对C末端醛标记的针对TSH抗体的小鼠单克隆抗体进行位点特异性标记。显示了分别与(A) N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)和(B) α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(7)缀合的含有SEQID NO:3 (L*甲酰基Gly*TPSRAALLTGR)的C末端醛标签的针对TSH抗体的小鼠单克隆抗体的TSK GFC300 SA-FLUO分析。图5 C分别显示了针对TSH的小鼠单克隆抗体的IgG-生物素缀合物在t = 0或在35℃下3周后的性能/稳定性，所述缀合物是通过经典NHS化学(ori)或通过醛标签标记物N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)或α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(7)位点特异性获得的。
提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中列出。应该理解的是，可以在不背离本发明精神的情况下对列出的程序进行修改。
实施例1
合成(1): Boc-N-吡咯基-丙氨酸 (2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(1H-吡咯-1-基)丙酸)
根据来自Chemical Science, 6(4), 2219-2223; 2015的程序进行合成。
实施例2
合成(2): Fmoc-N-吡咯基-丙氨酸-OH
将Boc-N-吡咯基-丙氨酸(1)(150 mg，0.591 mmol)溶于CH2Cl2/TFA(3 mL，1：1)中，并在室温下搅拌1 h。此时间之后，减压除去溶剂，将残余物重新溶解于1,4-二噁烷/H2O (5mL，1：1)中，并将溶液冷却至0℃。加入NaHCO3(150 mg，1.77 mmol)和Fmoc-OSu(220 mg，0.650 mmol)，并将反应在室温搅拌过夜。减压除去1,4-二噁烷，将水性残余物用己烷洗涤，然后用HCl(1M水溶液)酸化，并用EtOAc萃取。SiO2柱色谱得到为无色固体的所需产物。
MS (ESI): 实测值377.1[M + H]+, 计算值377.1 [M + H]+。
实施例3
合成(3): Boc-N-吡咯基-丙氨酸-五氟苯酯
将Boc-N-吡咯基-丙氨酸(1)(100 mg，0.39 mmol)在DMF(1 mL)和三乙胺(83 μL，0.59mmol)中的溶液冷却至0℃。加入三氟乙酸五氟苯酯(100 μL，0.59 mmol)，并将反应在室温搅拌1 h。将己烷加入溶液中，冷却2 h，收集白色结晶沉淀并用于下一步而不进行进一步纯化。
实施例4
合成(4): Fmoc-N-吡咯基-丙氨酸-五氟苯酯
将Fmoc-N-吡咯基-丙氨酸(2)(100 mg，0.267 mmol)在DMF(2 mL)和二异丙基乙胺(DIPEA)(93 μL，0.534 mmol)中的溶液冷却至0℃。加入三氟乙酸五氟苯酯(50 μL，0.292mmol)，并将反应在室温搅拌1 h。加入饱和NaCl水溶液(15 mL)，并用EtOAc(3×30 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，并通过SiO2柱色谱(己烷/EtOAc ＝ 4:1)纯化，得到为无色固体的所需产物(58 mg，40%)。
MS (ESI): 实测值543.1 [M + H]+, 计算值543.13 [M + H]+。
实施例5
合成(5): N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素
用经典的HATU/DIPEA化学在注射器中使Boc-N-吡咯基-丙氨酸-OH(1)在Fmoc-PEG 生物素 NovaTag™树脂(0.31 mmol/g；购自Merck)上偶联，并用TFA与树脂裂解。
MS (ESI): 实测值583.4 [M + H]+, 292.3 [M/2 + H]+, 计算值583.8 [M + H]+。
实施例6
合成(6): N-吡咯基-丙氨酸-(PEG10)2- PEG2-生物素
用经典的固相肽合成条件在注射器中使N-Fmoc-PEG10-CH2CH2COOH(两次)和Boc-N-吡咯基-丙氨酸-OH(一次)依次在Fmoc-PEG生物素NovaTag™树脂(0.31 mmol/g；购自Merck)上偶联，其中HATU/DIPEA用作偶联反应的试剂，哌啶(20%，在DMF中)用于Fmoc脱保护步骤。通过用TFA处理获得与树脂的裂解。HPLC纯化得到所需产物。
MS (ESI): 实测值536.1 [M/3 + H]+, 803.7 [M/2 + H]+, 计算值1606.9 [M +H]+。
实施例7
合成(7):α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素
将Fmoc-α-PyrAla(250 mg，0.664 mmol)在DMF(3 mL)和DIPEA(231 µL，1.33 mmol)中的溶液冷却至0℃。加入三氟乙酸五氟苯酯(100 μL，0.59 mmol)，并将反应在室温搅拌2 h。将600 µL的该溶液添加到生物素-PEG2-NH2(50 mg，0.133 mmol)和DIPEA(46 µL，0.266mmol)的DMF(1 mL)溶液中。在室温下搅拌2 h后，将二乙胺(400 μL)加入溶液中并再搅拌20分钟。将反应混合物加入到75 mL冷却的二异丙醚中，并且可以以高纯度分离出为沉淀的所需产物(22 mg，33%)。
MS (ESI): 实测值511.2 [M + H]+, 计算值511.6 [M + H]+。
实施例8
合成(8): Boc-N-吡咯基-丙氨酸-PEG7-NH2
向NH2-PEG7-NH2(50 mg，0.121 mmol)和DIPEA(21 µL，0.121 mmol)的DMF(1 mL)溶液中加入Boc-N-吡咯基-丙氨酸-五氟苯酯(3)(11 mg，0.025 mmol)。将反应在室温搅拌1h，然后减压除去溶剂。制备型HPLC色谱(20%MeCN - 60%MeCN/H2O + 0.1%TFA)得到为无色树脂的所需产物(13 mg，86%)。
MS (ESI): 605.5[M + H]+。
实施例9
合成(9): N-吡咯基-丙氨酸-PEG7-NH-CO(CH2)5-马来酰亚胺
1)向Boc-N-吡咯基-丙氨酸-PEG7-NH2(8)(16 mg，0.022 mmol)的CH2Cl2(1 mL)溶液中加入DIPEA(15 µL，0.88 mmol)和6-马来酰亚胺基-己酸NHS酯(14 mg，0.044 mmol)。将反应搅拌16 h，然后除去溶剂。制备型HPLC(20%MeCN - 60%MeCN/H2O + 0.1%TFA)得到为无色树脂的所需产物(9 mg，50%)。
MS (ESI): 实测值798.5[M + H]+, 计算值798.9[M + H]+。
2)将获得的物质溶于CH2Cl2(1 mL)和TFA(500 μL)中，并在室温下搅拌30 min。减压除去溶剂，得到为无色树脂的所需产物(8 mg，定量)。
MS (ESI): 实测值698.5[M + H]+, 计算值698.8[M + H]+。
实施例10
合成(10): 磺基BiPyRu-PEG2-N-吡咯基-丙氨酸
向磺基BiPyRu-NHS酯(Roche Diagnostics)(15 mg，0.0127 mmol)的DMF(1 mL)溶液中加入DIPEA(22 µL，0.127 mmol)和2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(19 µL，0.127 mmol)。将反应在室温搅拌1h。反应完成后，除去溶剂，反相制备型HPLC色谱(0%MeCN - 25%MeCN/H2O +0.1%TFA)得到为橙色固体的所需产物(8 mg，0.0068 mmol，54%)。在室温下，向所得的磺基BiPyRu-PEG2-NH2(10a)(4.5 mg，0.0038 mmol)的DMF(250 µL)溶液中加入DIPEA(2 µL，0.115 mmol)和Fmoc-N-吡咯基-丙氨酸-五氟苯酯(6 mg，0.0115 mmol)。偶联反应完成后，将二乙胺(50 μL)加入反应中并再搅拌30分钟。减压除去溶剂，并且反相制备型HPLC(0 %MeCN - 35 % MeCN/0.1 M醋酸三乙胺缓冲液，pH = 7)得到为橙色固体的所需产物(10b)(2.5 mg，50%)。
MS (ESI): 实测值656.8[M/2 + H]+, 1310.8[M + H]+, 计算值1311.2 [M + H]+。
实施例11
合成(11): 含有甲酰甘氨酸的肽
根据Rush等人, Org. Lett., 2006, 8, 131 -134合成上述肽((11) = SEQ ID NO:1)。简而言之，通过经典的固相肽合成获得所述肽，其中二乙缩醛用作醛官能团的保护前体。
MS (ESI): 实测值774.3[M/2 + H]+, 517.0 [M/3 + H]+。
实施例12
合成(12): 5'-吡咯基-丙氨酸-氨基己醇-T10-3'
将5'-氨基己醇-T10-3'寡核苷酸(80 µL，2.15 mM，在H2O中，172 nmol；根据经典的寡核苷酸合成程序合成)添加到硼酸钠缓冲液(250 µL，pH = 8.5，0.1M)中。随后加入Fmoc-N-吡咯基-丙氨酸-五氟苯酯(4)(150 µL，10 mM，在MeCN中，1500 nmol)。在室温下摇动2 h后，向溶液中加入二乙胺(100 µL)，将其再摇动30分钟。注射器过滤和渗析得到所需产物(120nmol，70%)。
MS (ESI): 实测值1097.3 [(M- 3H)/3]-。
实施例13
合成(13): 4-甲酰基苯甲酸NHS酯
向4-甲酰基苯甲酸(1.00 g，6.66 mmol)的DMF(30 mL)溶液中加入EDC-HCl(1.40 g，7.33 mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(842 mg，7.33 mmol)。在室温搅拌16 h后，将混合物用EtOAc(150 mL)稀释，并用饱和NaCl水溶液(3 x 50 mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，除去溶剂，得到为无色固体的所需产物(1.40 g，5.66 mmol，85%)。
实施例14
合成(14): 4-甲酰基苯甲酰胺基-十一醇-六磷酸-胞苷
将NH2-十一醇-六磷酸-胞苷(根据Fuller等人，PNAS, 113, 5233合成)(714 µL，5.6mM，在H2O中，4 µmol)和4-甲酰基苯甲酸NHS酯(13)(800 µL，50 mM，在MeCN中，40 µmol)加入到硼酸钠缓冲液(500 µL，pH = 8.5，0.1M)中。在室温下摇动3 h后，将反应混合物通过反相色谱(0-35%MeCN/H2O，0.1M醋酸三乙胺)纯化，得到所需的产物(1.82 µmol，46%)。
MS (ESI): 实测值522.2 [(M- 2H)/2 + 38]-, 1045.3 2 [M-H + 38]-。
实施例15至21显示了吡咯基衍生物(根据式I的化合物)与含有醛基的模型化合物以及含有甲酰甘氨酸的肽和抗体的缀合实验。
实施例15
2-(1H-吡咯-1-基)乙-1-胺的模型Pictet Spengler反应
将2-(1H-吡咯-1-基)乙-1-胺(100 mg，0.908 mmol)和2-(苄氧基)乙醛(136 mg，0.908mmol)溶解在醋酸盐缓冲液(0.1M，pH = 5.4，5 mL)和MeCN(5 mL)中。24 h后，减压除去溶剂，并且SiO2柱色谱(EtOAc + 2%TEA)得到为无色固体的所需产物。NMR光谱证实了环化产物。
描述：使2-(1H-吡咯-1-基)乙-1-胺与醛在“蛋白质兼容”条件下反应。1H NMR证明在这些条件下发生Pictet Spengler反应(亚胺形成和随后的C-C闭环)，提供了稳定的双环产物(15)。
实施例16
比较分别与含甲氧甘氨酸的肽(11)反应时α-、ß-和N-(2-氨基乙基)吡咯的转化率：
在相同条件下，使α-、β-和N-(2-氨基乙基)吡咯与含甲酰甘氨酸的肽(11)(SEQ ID NO:1)反应。反应条件为：在37℃将10 µL肽(11)(SEQ ID NO:1)(10 mM水溶液)和20 µL胺(分别为α-、β-和N-(2-氨基乙基)吡咯，每种胺为50 mM水溶液的形式)加入到170 µL醋酸盐缓冲液(0.05 M，pH = 5.4)中。该反应在图1A中示意性地描绘。
比较了α-、β-和N-(2-氨基乙基)吡咯在相同条件下与含甲酰甘氨酸的肽(11)反应时的反应速度。已知吡咯在其α位更具反应性：据此，β-取代的吡咯(闭环发生在α)的反应比α-取代的吡咯的反应稍快。出人意料的是，N-(2-氨基乙基)吡咯的转化分别显著快于α-以及β-(2-氨基乙基)吡咯的转化。从图1B显而易见地是，N-(2-氨基乙基)吡咯的更快和更有效的转化。
实施例17
含甲酰甘氨酸的肽(11)与N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)的缀合
向醋酸盐缓冲液(0.1 M, pH = 5.4, 70 µL)中加入N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)(20 µL，50 mM，在水中)和*Ac-*L*甲酰基Gly*TPSRGSLFTGRK*-OH* (11) (cf. SEQ IDNO:1)(10 µL，10 mM，在H2O中)，并将混合物在37℃摇动6 h，得到底物向所需环化缀合物(16)的完全转化。
从该实验中可以明显看出，可以在温和(=蛋白质兼容)条件下，通过吡咯基PictetSpengler化学使根据式I的标记物(即化合物(5))与生物分子(化合物(11)中包含的肽)缀合。在6小时内，用适度过量的吡咯标记物(5)获得向所需产物的完全转化。
实施例18
4-甲酰基苯甲酰胺-十一醇-六磷酸-胞苷(14)与5'-吡咯基-丙氨酸-氨基己醇-T10-3'(12)的缀合
向醋酸盐缓冲液(0.1 M，pH = 5.4，50 µL)中加入5'-吡咯基-丙氨酸-氨基己醇-T10-3'(12)(30 µL，1.2 mM，在H2O中)和4-甲酰基苯甲酰胺-十一醇-六磷酸-胞苷(14)(10 µL，3.6 mM，在H2O中)，并将混合物在37℃摇动16 h，得到底物向所需环化缀合物(17)的几乎完全转化。
(17): MS (ESI): 实测值1439.7 [(M- 3H)/3]- +38。
在该实施例中，证明了吡咯Pictet Spengler反应用于寡核苷酸/核苷酸结构单元的缀合的可行性。在浓度为0.4 mM的化学计量1：1的反应中，LCMS显示底物在16小时内几乎定量转化为缀合产物。
实施例19
含甲酰甘氨酸的抗体与生物素-PEG3-N-PyrAla标记物的生物缀合
抗体表达与纯化
使用标准克隆技术，将针对TSH的小鼠单克隆抗体的重链和轻链克隆到在重链C末端包含13个氨基酸醛标签(LCTPSRAALLTGR； SEQ ID NO：2)的哺乳动物表达载体中。将编码重链的质粒和编码轻链的质粒和过表达SUMF1的质粒(pRECEIVER-SUMF1，购自GeneCopoeia)共转染到HEK293F细胞中。SUMF1将醛标签序列中包含的半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸，从而将LCTPSRAALLTGR (SEQ ID NO:2)转化为L*甲酰甘氨酸*TPSRAALLTGR (SEQ ID NO:3)。根据供应商的说明，通过一步蛋白A亲和纯化(HiTrap MabSelect SuRe, GE)从培养上清液中纯化IgG。
生物素化
在37℃使在每个重链C末端被L*甲酰甘氨酸*TPSRAALLTGR标记的针对TSH的小鼠单克隆抗体(200 µM)与5倍过量的吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)缀合24h，或与3倍过量的吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)缀合48h。通过Zeba旋转柱(40K)(购自ThermoScientific)纯化所有缀合物以除去酶和未缀合的标记物。
TSK GFC300 SA-FLUO-分析
通过与荧光素标记的链霉亲和素(SA-FLUO)形成络合物来评估IgG生物素化。通过分析型尺寸排阻色谱(TSK GFC300，TOSOH)分析SA-FLUO-IgG-生物素-SA-FLUO络合物。详细地，将等体积(50 µl)的生物素化IgG (c = 0,6 mg/ml)和SA-FLUO (c = 0,3 mg/ml)混合，并在室温下孵育5 min。加入20 µl的100 mM生物素。将25 µl各样品注射在TSK GFC300 SW7.8 x 150 mm柱上，并在280和494 nm处监测消光曲线。通过在280 nm和494 nm处具有消光曲线的SA-FLUO-IgG-生物素络合物的存在来监测成功的生物素化。
Elecsys TSH免疫测定
在无生物素化抗TSH抗体的原始TSH缓冲液中以2.5 µg/ml的浓度使用如上所述获得的来自针对TSH的小鼠单克隆抗体的位点特异性标记的IgG-生物素缀合物，从而替代Elecsys®免疫测定rackpack (Roche Diagnostics)的R1隔室中的生物素化试剂。根据制造商(Roche Diagnostics)给出的标准测定方案，在Cobas®E170模块上在TSHElecsys®免疫测定(Roche Diagnostics)中分析两个校准物Cal1和Cal2，来自TSH CalSet (RocheDiagnostics)。
使含有甲酰甘氨酸的抗体和包含序列LATPSRAALLTGR (SEQ ID NO:4)的突变抗体分别与生物素-PEG3-N-PyrAla标记物进行生物缀合
(A) 于在其他方面适合醛标记的条件下，100倍过量的N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素标记物(5)不与包含SEQ ID NO:4的突变抗体发生非特异性反应，SEQ ID NO:4即不含甲酰甘氨酸的多肽序列(丙氨酸代替半胱氨酸；只有后者可以转化为甲酰甘氨酸)。
(B)和(C) 5倍或3倍过量的N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)分别与含有SEQ IDNO:3的C末端醛标签的抗体在24 h和48 h内定量缀合。(B)或(C)的缀合反应示意性地显示在图2中。
使用TSK GFC300 SA-FLUO分析，通过尺寸排阻色谱分析通过此方法获得的缀合物。TSK GFC300 SA-FLUO分析的结果显示在图3A至3C中。
实施例20
缀合物的稳定性测试
在Cobas® E170模块上在TSH Elecsys®免疫测定(Roche Diagnostics)中分析来自针对TSH的小鼠单克隆抗体的位点特异性标记的IgG-生物素缀合物(如实施例19中所述获得)。将新缀合物以及原始(ori)或标准生物素缀合物在相同缓冲液中稀释，浓度各自为2,5µg/ml。将两者都放入Elecsys®免疫测定rackpack (Roche Diagnostics)的R1隔室中，并根据针对该可商购获得的测定(Roche Diagnostics)给出的标准程序进行测定。为了进行稳定性评估，使用原始以及新缀合物二者在Cobas®E170模块上在TSH Elecsys®免疫测定(Roche Diagnostics)中分别于t = 0时和35℃ 7天后测量校准物之一Cal2，来自TSHCalSet (Roche Diagnostics)。
通过使含有C末端醛标签的抗体与N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素标记物(5)缀合而获得的IgG-生物素缀合物在35℃孵育7天后显示出良好的稳定性。
实施例21
比较使用N-吡咯基-丙氨酸或α-吡咯基-丙氨酸生成的缀合物的抗体缀合功效和性能
直接比较含有SEQ ID NO:3 (L*甲酰基Gly*TPSRAALLTGR)的C末端醛标签的抗体分别与N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(5)和α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素(7)的缀合功效显示，虽然N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素标记物将抗体几乎定量地转化为标记的缀合物(见图5A)，但在与α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素一起孵育后，检测到大量未缀合的抗体(见图5B)。基本上如实施例20中所述研究缀合物在3周后的TSH-Elecsys测定性能和稳定性。α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素抗体缀合物的稳定性低于N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素抗体缀合物，表明所用的活化的α-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素 (7)的反应性较低和/或与该偶联剂的不完全环化反应。相反，N-吡咯基-丙氨酸-PEG2-生物素抗体缀合物，即基于本文公开的化合物和方法的缀合物，可以高产率制备，并且在免疫测定中显示出良好的性能以及良好的储存稳定性。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 标记含醛靶分子的方法
<130> P34235-WO
<150> EP17166237
<151> 2017-04-12
<160> 4
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含甲酰甘氨酸的肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 2位的X代表甲酰甘氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 2位的Xaa代表甲酰甘氨酸
<400> 1
Leu Xaa Thr Pro Ser Arg Gly Ser Leu Phe Thr Gly Arg Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲酰甘氨酸形成之前的醛标签序列
<400> 2
Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甲酰甘氨酸形成之后的醛标签
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X代表甲酰甘氨酸
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> Xaa代表甲酰甘氨酸
<400> 3
Leu Xaa Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 类似于醛标签序列的序列
<400> 4
Leu Ala Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg
1 5 10

Claims (15)

1.一种制备根据式II的化合物的方法，所述方法包括：
使式I的化合物与包含醛基的靶标反应，如下面所给出的
式I:
由此得到根据式II的化合物，
式II:
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接以形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中L不存在或是连接基，
其中M是关注部分，和
其中T是靶分子，
条件是R4、R5、R6、R7或R8中的至少一个是-LM。
2.根据权利要求1的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的R1、R2和R3独立地是H或甲基。
3.根据权利要求1或2的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述关注部分M选自核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和官能团。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述关注部分M选自核苷酸、寡核苷酸、荧光或发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物以及马来酰亚胺。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述靶分子T选自固相、多肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸和核酸。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述靶分子T是多肽、蛋白质或核酸。
7.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述靶分子T是抗体。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述连接基L不存在或选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑或可以由酰胺键、酯键、烯烃或三唑组成。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中分别在式I或式II的化合物中的所述连接基L通过酯、醚、硫醚、胺、酰胺、二硫化物、碳酸酯、氨基甲酸酯、烯烃、三唑、二氢哒嗪或磷酸二酯键与所述关注部分M连接。
11.式II的化合物
式II
其中R1至R8和T如前述权利要求中所定义。
12.根据式III的物质，
式III
其中R1、R2和R3独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6和R7独立地是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或-LM，
其中R8是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，
其中R4、R5、R6、R7和R8中的两个任选地连接以形成取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
其中M是选自核苷酸、寡核苷酸、肽、标记物、细胞毒性剂、结合对的配偶体和马来酰亚胺的关注部分，
其中连接基L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基或寡肽，并且可以包含酰胺键、酯键、烯烃或三唑，
条件是R4、R5、R6或R7中的至少一个是-LM。
13.权利要求12的物质，
其中M选自核苷酸、寡核苷酸、荧光或发光标记物、细胞毒性剂、生物素或生物素类似物、地高辛或地高辛类似物和马来酰亚胺。
14.权利要求12或13中任一项的物质，
其中M选自发光标记物、细胞毒性剂和生物素或生物素类似物。
15.权利要求12或13中任一项的物质，
其中M是寡核苷酸或核苷酸。
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