ES2472690T3 - Anticuerpo contra CD22 para el tratamiento de tumores de origen hematopoy�tico - Google Patents

Abstract

Anticuerpo aislado que se une a un polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51, con o sin su péptido señal asociado, en el que dicho anticuerpo está conjugado a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citotóxico y está internalizado por una célula de linfoma difuso de célula grande, una célula de linfoma folicular o una célula de linfoma de células del manto que expresan dicho polipéptido, e inhibe el crecimiento de las mismas, para utilizar en un método de tratamiento del linfoma difuso de célula grande, linfoma folicular o linfoma de células del manto en un sujeto.

Description

Anticuerpo contra CD22 para el tratamiento de tumores de origen hematopoy�tico

5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a composiciones de materia para utilizar en el tratamiento de tumores hematopoy�ticos en mamíferos y a procedimientos de utilización de estas composiciones de materia para los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los tumores malignos (cáncer) son la segunda causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades del corazón (Boring et al., CA Cancer J Clin., 43:7 [(1993]). El cáncer se caracteriza por el incremento

15 en el número de células anormales, o neopl�sicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neopl�sicas, y la generación de células malignas que finalmente se extienden a través de la sangre o el sistema linfático hasta nódulos linfáticos regionales y hasta puntos distantes a través de un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que no crecerían células normales. El cáncer se manifiesta en una gran variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasión y agresividad.

[0003] Los c�nceres que implican células generadas durante la hematopoyesis, un proceso mediante el cual se generan elementos celulares de la sangre, tales como linfocitos, leucocitos, plaquetas, eritrocitos y células asesinas (“killers”) naturales, se refieren como c�nceres hematopoy�ticos. Los linfocitos que se pueden encontrar en la sangre

25 y el tejido linfático y que son críticos para la respuesta inmune se clasifican en dos clases principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T), que median en la inmunidad humoral y medida por células, respectivamente.

[0004] Las células B maduran en la médula ósea y dejan que la médula exprese un anticuerpo de unión a ant�geno en su superficie celular. Cuando una célula B intacta encuentra primero el ant�geno para el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie a diferenciarse en células B de memoria y células efectoras denominadas “células plasm�ticas”. Las células B de memoria tienen una esperanza de vida más larga y continúan expresando el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula parenteral original. Las células plasm�ticas no producen el anticuerpo unido a membrana, pero en cambio producen

35 el anticuerpo en una forma que se puede secretar. Los anticuerpos secretados son la molécula efectora principal de la inmunidad humoral.

[0005] Las células T maduran en el timo que proporciona un ambiente para la proliferaci�n y diferenciación de células T inmaduras. Durante la maduración de células T, las células T realizan el reajuste de genes que producen el receptor de células T y la selección positiva y negativa que ayuda a determinar el fenotipo de la superficie celular de la célula T madura. Los marcadores característicos de la superficie celular de células T maduras son el complejo CD3:receptor de célula T y uno de sus correceptores, CD4 o CD8.

[0006] En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para la terapia contra el cáncer, los investigadores han

45 buscado identificar polip�ptidos transmembrana u otros polip�ptidos asociados a membranas que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polip�ptidos asociados a membrana se expresan de manera más abundante en la superficie de las células cancerosas en comparación con la superficie de las células no cancerosas. La identificación de polip�ptidos ant�genos de la superficie celular asociados a tumores ha proporcionado la capacidad de reconocer específicamente células cancerosas para la destrucción a través de terapias basadas en anticuerpos. En este aspecto, cabe indicar que la terapia basada en anticuerpos se ha demostrado muy eficaz en el tratamiento de ciertos tumores. Por ejemplo, HERCEPTIN� y RITUXAN� (ambas de Genentech Inc, South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado satisfactoriamente para tratar el cáncer de mama y el linfoma de no Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN� es un

55 anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del protooncog�n del receptor 2 del factor de crecimiento epid�rmico humano (HER2). Se observa la sobreexpresi�n de la proteína HER2 en el 25-30% de c�nceres de mama primarios. RITUXAN� es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico modificado genéticamente dirigido contra el ant�geno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales u malignos. Estos anticuerpos se producen recombinantemente en células CHO.

[0007] En otros intentos por descubrir dianas celulares eficaces para la terapia contra el cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polip�ptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación a por uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas, (2) polip�ptidos que son producidos por células cancerosas en un nivel de expresión que es 65 significativamente más elevado que el de una o más células normales no cancerosas, o (3) polip�ptidos cuya expresión est� limitada específicamente a sólo un tipo de tejido (o a un número muy limitado de diferentes tejidos)

tanto en estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de pr�stata normal y de tumor de pr�stata). Dichos polip�ptidos pueden permanecer localizadas intracelularmente o se puede secretar por la célula cancerosa. Además, dichos polip�ptidos pueden expresarse no por la propia célula cancerosa, sino por células que producen y/o secretan polip�ptidos que tienen un efecto potenciador o un efecto de aumento del crecimiento en células

5 cancerosas. Dichos polip�ptidos secretados son a menudo proteínas que proporcionan células cancerosas con una ventaja de crecimiento sobre las células normales e incluyen cosas, tales como factores angiog�nicos, factores de adhesión celular, factores de crecimiento, y similares. Se esperaría que la identificación de antagonistas de dichos polip�ptidos no asociados a membrana sirviera como agentes terapéuticos eficaces para el tratamiento de dichos c�nceres. Además, la identificación del patrón de expresión de dichos polip�ptidos sería útil para el diagnóstico de c�nceres particulares en mamíferos.

[0008] A pesar de los avances identificados anteriormente en la terapia contra el cáncer en mamíferos, existe una gran necesidad de agentes terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumores en un mamífero y para inhibir de manera eficaz el crecimiento de células neopl�sicas, respectivamente. Por consiguiente, un objetivo

15 de la presente solicitud es identificar polip�ptidos, polip�ptidos asociados a membrana, secretados o intracelulares, cuya expresión est� limitada específicamente a un único tipo de tejido (o un número muy limitado de diferentes tipos de tejido), tejidos hematopoy�ticos, tanto en estado canceroso o no canceroso, y utilizar estos polip�ptidos, y sus ácidos nucleicos codificantes, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico para la detección de cáncer hematopoy�tico en mamíferos.

DESCRIPCI�N RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

A. Realizaciones

25 [0009] En la presente memoria, los solicitantes describen por primera vez la identificación de varios polip�ptidos celulares (y sus ácidos codificantes o fragmentos de los mismos) que son expresados específicamente tanto por células tumorales como normales de un tipo de célula específico, por ejemplo, células generadas durante la hematopoyesis, es decir, linfocitos, leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Todos los polip�ptidos anteriores se refieren aquí como polip�ptidos Ant�genos tumorales de Origen Hematopoy�tico (polip�ptidos “TAHO”) y se espera que sirvan como dianas eficaces para la terapia contra el cáncer en mamíferos.

[0010] Por consiguiente, el presente documento describe una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido ant�geno tumoral de origen hematopoy�tico (un polip�ptido “TAHO”) o un fragmento del mismo.

35 [0011] En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% � 100% de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica un polip�ptido TAHO de longitud completa que tiene una secuencia de amino�cidos tal como se describe aquí, una secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO que carece del p�ptido señal tal como se ha descrito aquí, un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO transmembrana, con o sin el p�ptido señal, tal como se ha descrito aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de amino�cidos de polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de

45 (a).

[0012] En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menso aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% � 100% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, con (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc del polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí, la secuencia codificante de un polip�ptido TAHO que carece del p�ptido señal tal como se describe aquí, la secuencia codificante de un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO transmembrana, con o sin el p�ptido señal, tal como se describe aquí o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento específicamente definido de la

55 secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

[0013] En aspectos adicionales, el presente documento describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% � 100% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polip�ptido maduro codificado por la región codificante de longitud completa de cualquiera de los ADNcs de proteína humana depositados con la ATCC tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

65 [0014] Otro aspecto del presente documento describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido TAHO que presenta el dominio transmembrana eliminado o inactivado, o es complementaria a dicha secuencia codificante, donde el dominio o dominios transmembrana de dicho polip�ptido o polip�ptidos se describen aquí. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polip�ptidos TAHO descritos aquí.

5 [0015] En otros aspectos, la presente solicitud describe moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido TAHO que tiene una secuencia de amino�cidos de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO que carece del p�ptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO transmembrana, con o sin el p�ptido señal, tal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí, o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a). En este aspecto, los fragmentos de una secuencia codificante del polip�ptido TAHO de longitud completa, o el complemento de la misma, tal como se describe aquí, pueden ser útiles como, por ejemplo, sondas de hibridación útiles como, por ejemplo, sondas de detección, sondas de oligonucle�tidos no

15 codificante, o para codificar fragmentos de un polip�ptido TAHO de longitud completa que pueden codificar opcionalmente un polip�ptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-polip�ptido TAHO, un oligop�ptido de unión TAHO u otra molécula orgánica pequeña que se une a un polip�ptido TAHO. Dichos fragmentos de ácidos nucleicos tienen normalmente por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 83, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, �

25 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término “aproximadamente” significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos un 10% de la longitud referenciada. Cabe indicar que se pueden determinar fragmentos novedosos de una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido TAHO de manera rutinaria mediante la alineación de la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido TAHO con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un conjunto de programas de alineación de secuencias bien conocidos y determinando qué fragmento o fragmentos de la secuencia de nucleótidos que codifican el polip�ptido TAHO son nuevos. Se contemplan en la presente invención todos estos fragmentos nuevos de secuencias de nucleótidos que codifican el polip�ptido TAHO. También se contemplan los fragmentos de polip�ptido TAHO codificados por estos fragmentos de moléculas nucleótidos, preferiblemente aquellos fragmentos de polip�ptido TAHO que comprenden un sitio de unión por un anticuerpo anti-TAHO, un oligop�ptido de unión a

35 TAHO u otra molécula orgánica pequeña que se une a un polip�ptido TAHO.

[0016] También se describen en el presente documento polip�ptidos TAHO aislados codificados por cualquier de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas identificadas anteriormente aquí.

[0017] En un cierto aspecto, el presente documento describe un polip�ptido TAHO aislado, que comprende una secuencia de amino�cidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de amino�cidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% � 100% de identidad en la secuencia de amino�cidos, con un polip�ptido TAHO que tiene una secuencia de amino�cidos de longitud completa tal como se describe aquí,

45 una secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO que carece del p�ptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de una proteína polip�ptido TAHO transmembrana, con o sin el p�ptido señal, tal como se describe aquí, una secuencia de amino�cidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas aquí o cualquier otro fragmento de específicamente definido de una secuencia de amino�cidos del polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí.

[0018] En un aspecto adicional, , el presente documento describe un polip�ptido TAHO aislado que comprende una secuencia de amino�cidos que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de amino�cidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, � 99% de identidad en la secuencia de amino�cidos, con

55 una secuencia de amino�cidos codificada por cualquiera de los ADNcs de proteína humana depositados con la ATCC tal como se describe aquí.

[0019] En un aspecto específico, el presente documento describe un polip�ptido TAHO aislado sin la secuencia señal N-terminal y/o sin la metionina de iniciación y est� codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de amino�cidos descrita anteriormente en la presente invención. Los procesos para producir el mismo también se describen en la presente invención, donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del polip�ptido TAHO y recuperar el polip�ptido TAHO del cultivo celular.

65 [0020] También se describe un polip�ptido TAHO aislado que presenta el dominio transmembrana eliminado o inactivado. Los procesos para producir el mismo también se describen aquí, donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del polip�ptido TAHO y recuperar el polip�ptido TAHO del cultivo celular.

5 [0021] También se describen vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polip�ptidos descritos aquí. También se describen las células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Se describe también un proceso para producir cualquiera de los polip�ptidos descritos aquí y comprende cultivar las células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polip�ptido deseado y recuperar el polip�ptido deseado del cultivo celular.

[0022] También se describen polip�ptidos quiméricos aislados que comprende cualquiera de los polip�ptidos TAHO descritos aquí fusionados a un polip�ptido heter�logo (no TAHO). Ejemplos de dichas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polip�ptidos TAHO descritos aquí fusionados a un polip�ptido heter�logo, tal como,

15 por ejemplo, una secuencia ep�topo etiqueta o una región Fc de una inmunoglobulina.

[0023] La presente invención proporciona un anticuerpo que se une, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido que tiene la secuencia de amino�cidos de SEQ ID NO: 51, con o sin su secuencia señal asociada, para su uso según las reivindicaciones. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena única o un anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo anti-polip�ptido TAHO a su ep�topo antig�nico respectivo. Los anticuerpos para utilizar de la presente invención se conjugan a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citot�xico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o caliquemicina, un anticuerpo, un isótopo radioactivo, una enzima nucleol�tica, o similar. Los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden producir

25 opcionalmente en células CHO o células bacterianas y preferiblemente inducen la muerte de una célula a la que se unen. Para el objetivo de la detección, los anticuerpos se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido o similar.

[0024] También se describen vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos aquí. También se comprende la célula huésped que comprende cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. También se proporciona un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos aquí y comprende cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular.

35 [0025] También se describen oligop�ptidos (“oligop�ptidos de unión a TAHO”) que se unen, preferiblemente específicamente, a cualquiera de los polip�ptidos TAHO descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o un agente citot�xico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleol�tica, o similar. Los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden producir opcionalmente en células CHO o células bacterianas e inducen preferiblemente la muerte de una célula a la que se unen. Para el objetivo de la detección, los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar.

45 [0026] También se describen vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los oligop�ptidos de unión a TAHO descritos aquí. También se comprende la célula huésped que comprende cualquiera de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. También se proporciona un proceso para producir cualquiera de los oligop�ptidos de unión a TAHO descritos aquí y comprende cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del oligop�ptido deseado y recuperar el oligop�ptido deseado del cultivo celular.

[0027] También se describen moléculas orgánicas pequeñas (“moléculas orgánicas de unión a TAHO”) que se unen, preferiblemente específicamente, a cualquiera de los polip�ptidos TAHO descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, las moléculas orgánicas de unión a TAHO se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento

55 o un agente citot�xico, tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o una caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleol�tica, o similar. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO inducen preferiblemente la muerte de una célula a la que se unen. Para el objetivo de la detección, las moléculas orgánicas de unión a TAHO se pueden marcar para su detección, unirse a un soporte sólido, o similar.

[0028] También se describe una composición de material que comprende un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí, un polip�ptido TAHO quimérico tal como se describe aquí, un anticuerpo anti-TAHO tal como se describe aquí, un oligop�ptido de unión a TAHO tal como se describe aquí, o una molécula orgánica de unión a TAHO tal como se describe aquí, en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador farmac�uticamente aceptable.

65 [0029] También se describe un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición de materia contenida en el recipiente, donde la composición de materia puede comprender un polip�ptido TAHO quimérico tal como se describe aquí, un anticuerpo anti-TAHO tal como se describe aquí, un oligop�ptido de unión a TAHO tal como se describe aquí, o una molécula orgánica de unión a TAHO tal como se describe aquí. El artículo puede comprender opcionalmente un marcador fijado al recipiente, o un prospecto incluido en el recipiente, que se refiere

5 al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico.

[0030] Una realización de la presente invención se dirige al uso de un anticuerpo anti-polip�ptido TAHO para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que es sensible al anticuerpo antipolip�ptido TAHO, tal como se define en las reivindicaciones.

10 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0031] La figura 50 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 50) de un ADNc de TAHO26 (PRO2177), en la que

15 la SEC ID NO: 50 es un clon designado en el presente documento como "DNA88116" (también referido aquí como "CD22"). La figura 51 muestra la secuencia de amino�cidos (SEC ID NO: 51) derivada de la secuencia codificante de SEC ID NO. 50 mostrada en la figura 50.

20 [0032] Las figuras 91A-91D muestran datos de microarrays que muestran la expresión de TAHO26 en muestras normales y en muestras enfermas, tales como la expresión significativa en células B normales. Las abreviaturas utilizadas en las figuras se designan de la siguiente manera: Linfoma no de Hodgkin (NHL), linfoma folicular (FL), nódulo de linfoma normal (NLN), células B normales (NB), células de mieloma múltiple (MM), intestino delgado (intestino d.), hígado fetal (hígado f.), músculo liso (músculo l.), cerebro fetal (cerebro f.), células asesinas (“killer”)

25 naturales (NK), neutr�filos (N’phil), dendrocitos (DC), células B de memoria (mem B), células plasm�ticas (PC), células plasm�tica de médula ósea (BM PC).

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

30 I. Definiciones

[0033] Los términos “polip�ptido TAHO” y “TAHO” tal como se utilizan aquí y cuando va seguida inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polip�ptidos, en los que la designación completa (es decir, TAHO/número) se refiere a secuencias de polip�ptidos específicas tal como se describen aquí. Los términos 35 “polip�ptido TAHO/número” y “TAHO/número” donde el término “número” se proporciona como una designación numérica real tal como se utiliza aquí, comprenden polip�ptidos de secuencia nativa, variantes de polip�ptidos y fragmentos de polip�ptidos de secuencia nativa y variantes de polip�ptidos (que se definen posteriormente aquí). Los polip�ptidos TAHO descritos en la presente invención se pueden aislar de un conjunto de fuentes, tales como de tipos de tejido humano y de otras fuentes, o se pueden preparar mediante procedimientos recombinantes o 40 sintéticos. El término “polip�ptido TAHO” se refiere a cada polip�ptido TAHO/número individual descrito aquí. Todas las descripciones en esta memoria que se refieren al “polip�ptido TAHO” se refieren a cada uno de los polip�ptidos individualmente, as� como de manera conjunta. Por ejemplo, las descripciones de la preparación, purificación, derivación, formación de anticuerpos a o contra, la formación de oligop�ptidos de unión a TAHO a o contra, la formación de moléculas orgánicas de unión a TAHO a o contra, la administración de composiciones que contienen,

45 el tratamiento de una enfermedad con, etc., se refieren a cada polip�ptido de la invención individualmente. El término “polip�ptido TAHO” también incluye variantes de polip�ptidos TAHO/número descritos aquí.

[0034] "TAHO1" también se refiere aquí como "RP105", "CD180" o "LY64". "TAHO2" también se refiere aquí como "CD20" o "MS4A1". "TAHO3" también se refiere aquí como "FcRH2" o "SPAP1". "TAHO4" también se refiere aquí 50 como "CD79A". "TAHO5" también se refiere aquí como "CD79B". "TAHO6" también se refiere aquí como "CR2" o "CD21". "TAH07" también se refiere aquí como "CCR6". "TAHO8" también se refiere aquí como "CD72". "TAHO9" también se refiere aquí como "P2RX5" o "UNQ2170". "TAHO10" también se refiere aquí como "HLA-DOB". "TAHO11" también se refiere aquí como "CXCR5" o "BLR1". "TAHO12" también se refiere aquí como "FCER2" o "CD23". "TAHO13" también se refiere como "GPR2" o "UNQ12100". "TAHO14" también se refiere como "BTig". 55 "TAHO15" también se refiere como "NAG14" o "LRRC4". "TAHO16" también se refiere como "SLGC16270". "TAHO17" también se refiere como "FcRH1" o "IRTA5". "TAHO18" también se refiere como "IRTA2" o "FcRH5". "TAHO19" también se refiere como "ATWD578". "TAHO20" también se refiere como "FcRH3" o "IRTA3". "TAHO21" también se refiere como "IRTA1" o "FcRH4". "TAHO22" también se refiere como "FcRH6" o "FAIL". "TAHO23" también se refiere como "BCMA". "TAHO24" también se refiere como "239287_at". "TAHO25" también se refiere 60 como "CD19". "TAHO26" también se refiere como "CD22". "TAHO27" también se refiere como "CXCR3" o "UNQ8371". "TAHO28" también se refiere como "SILV" o "UNQ1747". "TAHO29" también se refiere como "KCNK4"

o "UNQ11492". "TAHO30" también se refiere como "CXorf1 " o "UNQ9197". "TAH031" también se refiere como "LRRN5" o "UNQ256". "TAHO32" también se refiere como "UNQ9308". L "TAH033" también se refiere como "IGSF4B" o "UNQ225". "TAHO34" también se refiere como "BC021 178" o "UNQ13267". "TAHO35" también se

65 refiere como "FLJ12681" o "UNQ6034". "TAHO36" también se refiere como "I_928646" o "UNQ12376".

[0035] Un “polip�ptido TAHO de secuencia nativa” comprende un polip�ptido que tiene la misma secuencia de amino�cidos que el correspondiente polip�ptido TAHO derivado de la naturaleza. Dichos polip�ptidos TAHO de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término “polip�ptido TAHO de secuencia nativa” abarca específicamente las formas truncadas o secretadas 5 naturales del polip�ptido TAHO específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas cortadas y empalmadas (“spliced”) alternativamente) y variantes al�licas naturales del polip�ptido. En varias realizaciones de la solicitud, los polip�ptidos TAHO de secuencia nativa descritos aquí son polip�ptidos de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprenden las secuencias de amino�cidos de longitud completa que se muestran en las figuras acompañantes. Los codones de inicio y parada (si se indican) se muestran en negrita y subrayados en las figuras. Los residuos de ácidos nucleicos indicados como una “N” en las figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, mientras que el polip�ptido TAHO descrito en las figuras acompañantes se inicia con los residuos de metionina denominados aquí como amino�cido en la posición 1 en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina localizados cadena arriba o cadena abajo de la posición 1 de amino�cidos en las figuras puedan utilizarse como el residuo de amino�cido de

15 partida de los polip�ptidos TAHO.

[0036] El “dominio extracelular” o “ECD” del polip�ptido TAHO se refiere a una forma del polip�ptido TAHO que est� libre esencialmente de los dominios transmembrana y citoplasmático. Generalmente, un ECD del polip�ptido TAHO tendr� menos del 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmático y preferiblemente, tendr� menos del 0,5% de dichos dominios. Se entender� que cualquier dominio transmembrana identificado para los polip�ptidos TAHO de la presente invención se identifican siguiendo los criterios utilizados habitualmente en la técnica para la identificación de ese tipo de dominio hidrof�bico. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero más probablemente, en no más de aproximadamente 5 amino�cidos en cualquier extremo del dominio tal como inicialmente se identificó aquí. Opcionalmente, por tanto, se contemplan un dominio extracelular de un polip�ptido

25 TAHO que puede contener desde aproximadamente 5 o menos amino�cidos en cualquier extremo de los límites del dominio transmembrana/dominio extracelular tal como se identifica en los Ejemplos o la memoria y dichos polip�ptidos, con o sin el p�ptido señal asociado, y el ácido nucleico que los codifica.

[0037] La localización aproximada de los “p�ptidos señal” de los diversos polip�ptidos TAHO descritos aquí se puede mostrar en la presente memoria y/o las figuras acompañantes. Se ha de remarcar, sin embargo, que el límite C-terminal de un p�ptido señal puede variar, pero más probablemente, en no más de aproximadamente 5 amino�cidos en cualquiera de los extremos del límite C-terminal del p�ptido señal tal como se identificó inicialmente aquí, donde el límite C-terminal del p�ptido señal puede identificarse según el criterio utilizado de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de elemento de secuencia de amino�cidos (por ejemplo, Nielsen y et al., Prot Eng,

35 10:1-6 (1997) y von Heinje y et al., Nucl Acids Res, 14:4683-4690 (1986)). Además, también se ha reconocido, que, en algunos casos, la división de una secuencia señal de un polip�ptido secretado no es totalmente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polip�ptidos maduros, cuando su p�ptido señal se corta en no más de aproximadamente 5 amino�cidos por cualquier extremo del límite C-terminal del p�ptido señal identificado aquí, y los polinucle�tidos que los codifican, est�n contemplados por la presente invención.

[0038] “Variante de polip�ptido TAHO” significa un polip�ptido TAHO, preferiblemente un polip�ptido TAHO activo, tal como se define aquí que tiene por lo menos aproximadamente el 80% de identidad en la secuencia con una secuencia de polip�ptido TAHO de secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de polip�ptido TAHO que carece del p�ptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un 45 polip�ptido TAHO, con o sin el p�ptido señal, tal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí (tales como las codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una parte de la secuencia codificante completa para un polip�ptido TAHO de longitud completa). Dichas variantes de polip�ptido TAHO incluyen, por ejemplo, los polip�ptidos TAHO en donde uno o más residuos de amino�cido se añaden, o eliminan, en el extremo N- o C-terminal de la secuencia de amino�cidos nativa de longitud completa. Generalmente, una variante de polip�ptido TAHO tendr� por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de amino�cidos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, � 99% de identidad en la secuencia de amino�cidos con una secuencia de un polip�ptido TAHO de secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí, una secuencia de polip�ptido TAHO que carece

55 del p�ptido señal tal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO, con o sin el p�ptido señal, tal como se describe aquí o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de polip�ptido TAHO de longitud completa tal como se describe aquí. Generalmente, los polip�ptidos variantes de TAHO tienen una longitud de por lo menos aproximadamente 10 amino�cidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 1170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 amino�cidos de longitud, o más. Opcionalmente, los polip�ptidos variantes de TAHO tendr� no más de una sustitución de amino�cido conservativo en comparación con la secuencia de polip�ptido TAHO nativa, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, � 10 sustituciones de amino�cido conservativo en comparación con la secuencia de polip�ptido TAHO nativa.

[0039] El “porcentaje (%) de identidad en la secuencia de amino�cidos” con respecto a las secuencias del

polip�ptido TAHO identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de amino�cidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de amino�cidos en la secuencia de polip�ptido TAHO específica, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa 5 como parte de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de amino�cidos se puede conseguir de varias maneras que est�n dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software inform�tico disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de amino�cidos se generan utilizando el programa inform�tico de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla

1. El programa inform�tico de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office,

15 Washington D.C. 20559, donde est� registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 est� disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.

[0040] En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para la secuencia de amino�cidos, el % de identidad en la secuencia de amino�cidos de una secuencia de amino�cidos determinada A a, con, o contra una secuencia de amino�cidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de amino�cidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de amino�cidos a, con, o contra una

25 secuencia de amino�cidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación: 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de residuos de amino�cidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de amino�cidos en B. Se comprender� que cuando la longitud de la secuencia de amino�cidos A no es igual a la longitud de la secuencia de amino�cidos B, el % de identidad en la secuencia de amino�cidos de A a B no ser� igual al % de identidad en la secuencia de amino�cidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de amino�cidos utilizando este procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de amino�cidos de la secuencia de amino�cidos denominada “Proteína de comparación” a la secuencia de amino�cidos denominada “TAHO”, donde “TAHO” representa la secuencia de

35 amino�cidos de un polip�ptido contra el que el polip�ptido “TAHO” de interés que se compara, y “X”, “Y” y “Z” cada uno representa residuos de amino�cidos hipotéticos diferentes. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad en la secuencia de amino�cidos utilizados aquí se obtienen tal como se describe en párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa inform�tico ALIGN-2.

[0041] El “polinucle�tido variante de TAHO” o “secuencia de ácidos nucleicos variante de TAHO” significa una molécula de ácido nucleico que codifica una polip�ptido TAHO, preferiblemente un polip�ptido TAHO activo, tal y como se define a continuación y que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polip�ptido TAHO de secuencia nativa de longitud completa tal y como se describe en la presente invención, una secuencia de polip�ptido 45 TAHO de secuencia nativa y de longitud completa que carece del p�ptido señal tal y como se describe en la presente invención, un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO, con o sin el p�ptido señal, tal y como se describe en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polip�ptido TAHO de longitud completa tal y como se describe en la presente invención (tales como las codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una parte de la secuencia codificante completa para un polip�ptido TAHO de longitud completa). Habitualmente, un polinucle�tido variante de TAHO tendr� por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente por lo menos aproximadamente un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% � 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polip�ptido TAHO de secuencia nativa de longitud completa tal y como se describe en la presente invención, una secuencia de polip�ptido

55 TAHO de secuencia nativa y longitud completa que carece del p�ptido señal tal y como se describe en la presente invención, un dominio extracelular de un polip�ptido TAHO, con o sin el p�ptido señal, tal y como se describe en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polip�ptido TAHO de longitud completa tal y como se describe en la presente invención. Las variantes no comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.

[0042] Habitualmente, los polinucle�tidos variantes de TAHO tienen por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65,70,75,80, 85, 90, 95, 100,105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 65 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980,

990, � 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término “aproximadamente” significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos un 10% de esa longitud referenciada.

[0043] El “porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos” con respecto a las secuencias de ácidos

5 nucleicos que codifican el TAHO identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica TAHO de interés, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que est�n dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software inform�tico disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se generan utilizando el programa inform�tico de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El programa inform�tico de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y

15 el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde est� registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 est� disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.

[0044] En las situaciones en as que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencia de ácidos nucleicos, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir alternativamente como una

25 secuencia de ácidos nucleicos determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación: 100 veces la fracción W/Z donde W es el número de nucleótidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en

D. Se comprender� que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de C a D no ser� igual al % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de D a C. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizando este procedimiento, las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de

35 identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada “ADN de comparación” a la secuencia de ácidos nucleicos denominada “TAHO-DNA”, donde “TAHO-DNA” representa una secuencia de ácidos nucleicos hipotética que codifica TAHO de interés, “ADN de comparación”, representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la que se compara la molécula de ácido nucleico “TAHO-DNA” de interés, y “N”, “L” y “V” cada uno representa nucleótidos hipotéticos. A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos utilizados aquí se obtienen tal como se describe en párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa inform�tico ALIGN-2.

[0045] En otras realizaciones, los polinucle�tidos variantes de TAHO son moléculas de ácido nucleico que codifican un polip�ptido TAHO y que son capaces de hibridarse, preferiblemente bajo condiciones de hibridación y lavado

45 astringentes, a secuencias de nucleótidos que codifican un polip�ptido TAHO de longitud completa mostrado tal como se describe aquí. Los polip�ptidos variantes de TAHO pueden ser aquéllos codificados por un polinucle�tido variante de TAHO.

[0046] El término “región codificante de longitud completa” cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico que codifica un polip�ptido TAHO se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido TAHO de longitud completa de la solicitud (que se muestra a menudo entre los codones de inicio y parada, incluyendo ambos, en las figuras que se acompañan). El término “región codificante de longitud completa” cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico depositado en ATCC se refiere a la parte del ADNc que codifica el polip�ptido TAHO que se inserta en el vector depositado con la ATCC (que se muestra a menudo entre los codones de inicio y parada, incluyendo 55 ambos, en las figuras que se acompañan (codones de inicio y parada est�n en negrita y subrayados en las figuras)).

[0047] El término “aislado”, cuando se utiliza para describir los diversos polip�ptidos TAHO descritos en la presente invención, significa polip�ptidos que se han identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos terapéuticos para el polip�ptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos protein�ceos o no protein�ceos. En realizaciones preferidas, se purificar� el polip�ptido (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de amino�cidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polip�ptido aislado incluye el 65 polip�ptido in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del polip�ptido TAHO no estar� presente. Normalmente, sin embargo, el polip�ptido aislado se preparar� mediante por

lo menos una etapa de purificación.

[0048] Un ácido nucleico “aislada” que codifica un polip�ptido TAHO o un ácido nucleico que codifica otro polip�ptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico

5 contaminante con la que est� asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico que codifica el polip�ptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polip�ptido aislada es una forma o composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polip�ptido se diferencian de la molécula de ácido nucleico que codifica un polip�ptido tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polip�ptido incluye moléculas de ácido nucleico que codifican el polip�ptido contenidas en células que normalmente expresan el polip�ptido cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico est� en una localización cromos�mica diferente de la de las células naturales.

[0049] El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una

15 secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilaci�n y potenciadores.

[0050] Un ácido nucleico est� “unido operativamente” cuando est� situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora est� unido operativamente a ADN para un polip�ptido si se expresa como una preprote�na que participa en la secreción del polip�ptido; un promotor o potenciador est� unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma est� unido operativamente a una secuencia codificante

25 si est� situado para facilitar la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen est�n contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucle�tidos sintéticos según la práctica convencional.

[0051] La “astringencia” de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende

35 generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias est�n presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas inferiores no tanto. Para detalles adicionales y explicaciones de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

[0052] “Condiciones astringentes” o “condiciones de astringencia elevada”, tal y como se definen en la presente invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para

45 el lavado, por ejemplo, cloruro sádico 0,015 M/citrato sádico 0,0015 M/dodecil sulfato sádico al 0,1% a 50oC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sádico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sádico 750 mM, citrato sádico 75 mM a 42oC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sádico 0,075 M), fosfato sádico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sádico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 μg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42oC, con un lavado de 10 min a 42oC en 0,2 x SSC (cloruro sádico/citrato sádico) seguido de un lavado de astringencia elevada de 10 min que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55oC.

[0053] Las “condiciones moderadamente astringentes” se pueden identificar tal y como se describen en Sambrook y

55 otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubaci�n durante toda la noche a 37oC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sádico 15 mM), fosfato sádico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50oC. El experto en la materia sabr� como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. necesarias para acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y similares.

[0054] El término “ep�topo etiquetado”, cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un polip�ptido

65 quimérico que comprende un polip�ptido TAHO o un anticuerpo anti-TAHO fusionado a un “polip�ptido etiqueta”. El polip�ptido etiqueta tiene residuos suficientes para proporcionar un ep�topo contra el que se puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera que no interfiere en la actividad del polip�ptido al que se fusiona. El polip�ptido etiqueta es también preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de forma cruzada con otros ep�topos. Los polip�ptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de amino�cidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos

5 de amino�cidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de amino�cidos).

[0055] “Activo” o “actividad” para los objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas de un polip�ptido TAHO que retiene una actividad biológica y/o inmunol�gica de un polip�ptido TAHO nativo o natural, donde la actividad “biológica” se refiere a una función (inhibidora o estimuladora) provocada por un polip�ptido TAHO nativo o natural que es diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un ep�topo antig�nico que se encuentra en un polip�ptido TAHO nativo o natural y una actividad “inmunol�gica” se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un ep�topo antig�nico que se encuentra en un polip�ptido TAHO nativo o natural.

15 [0056] El término “antagonista” se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe

o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un polip�ptido nativo TAHO descrito aquí. De manera similar, el término “agonista” se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una actividad biológica de un polip�ptido TAHO nativo descrito aquí. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes en la secuencia de amino�cidos de polip�ptidos TAHO nativos, p�ptidos, oligonucle�tidos no codificante, moléculas orgánicas pequeñas, etc., agonistas o antagonistas. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polip�ptido TAHO pueden comprender poner en contacto un polip�ptido TAHO con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polip�ptido TAHO.

25 [0057] “Tratar” o “tratamiento” o “alivio” se refieren a tanto un tratamiento terapéutico como con medidas profilácticas

o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico reconocido. Los necesitados del tratamiento incluyen aquéllos que ya padecen el trastorno, as� como aquéllos propensos a padecer el trastorno o aquéllos a los que debe prevenirse el trastorno. Un sujeto o mamífero es “tratado” satisfactoriamente para una cáncer que expresa el polip�ptido TAHO si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO según los procedimientos descritos en el presente documento, el paciente muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células cancerosas o ausencia de células cancerosas; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentizaci�n en cierto grado y preferiblemente

35 detención) de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos incluyendo la extensión del cáncer a tejido blando y hueso; inhibición (es decir, ralentizaci�n en cierto grado y preferiblemente detención) de la metástasis tumoral; inhibición, en cierto grado, del crecimiento tumoral; y/o alivio, en cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducidas, y mejora en cuestiones de calidad de vida. Siempre que el anticuerpo anti-TAHO o el oligop�ptido de unión a TAHO puedan prevenir el crecimiento y/o la cit�lisis de células cancerosas existentes, pueden ser citost�ticos o citot�xicos. La reducción de estos signos o síntomas también puede ser sentida por el paciente.

[0058] Los parámetros anteriores para evaluar una tratamiento satisfactorio y una mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares para el m�dico. Para la terapia contra el cáncer, se

45 puede medir la eficacia, por ejemplo, mediante la valoración del tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación de la velocidad de respuesta (RR). La metástasis se puede determinar mediante tests de estadificaci�n y media escaneo óseo y tests de los niveles de calcio y otras enzimas para determinar la expansión hacia los huesos. Los escaneos CT también se pueden realizar para buscar la expansión hacia la pelvis y los nódulos linfáticos en el área. Los rayos X del pecho y la medición de los niveles de enzimas hepáticas mediante procedimientos conocidos se utilizan para buscar metástasis hacia pulmones e hígado, respectivamente. Otros procedimientos de rutina para monitorizar la enfermedad incluyen ultrasonograf�a transrectal (TRUS) y biopsia con aguja transrectal (TRNB).

[0059] Para el cáncer de vejiga, que es un cáncer más localizado, los procedimientos para determinar el progreso de

55 la enfermedad incluyen la evaluación citol�gica urinaria mediante citoscop�a, monitorización de la presencia de sangre en la orina, visualización del tracto urotelial mediante monografía o un pielograma intravenoso, tomografía computerizada (CT) e imagen por resonancia magnética (MRI). La presencia de metástasis distantes se puede evaluar mediante CT del abdomen, rayos X del pecho u obtención de imágenes por radionucleidos del esqueleto.

[0060] Administración “crónica” se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial durante un periodo de tiempo largo. Administración “intermitente” es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es cíclico por naturaleza.

65 [0061] El término “mamífero” con el propósito de tratamiento, o alivio de los síntomas del cáncer, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre, animales domésticos y de granja, y animales del zoo, deportivos o de compa��a, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos etc. Preferiblemente, el mamífero es el hombre.

[0062] La administración “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración 5 simultánea (a la vez) y la administración consecutiva en cualquier orden.

[0063] “Portadores”, tal como se utiliza aquí, incluyen los potadores, excipientes o estabilizantes farmac�uticamente aceptables, que no son tóxicos a la célula o al mamífero que se expone a los mismos en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH. Ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, y otros ácido orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido asc�rbico; polip�ptidos de bajo peso molecular (inferiores a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina s�rica, gelatina o inmunoglobulinas; pol�meros hidrof�licos, tales como polivinilpirrolidona; amino�cidos, tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina

o la lisina; monosac�ridos, disac�ridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas;

15 agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEENTM, polietilenglicol (PEG) y PLURONICSTM.

[0064] Por "fase sólida" o “soporte sólido” se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir o unir un anticuerpo, un oligonucle�tido de unión a TAHO o una molécula orgánica de unión a TAHO de la presente solicitud. Ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente invención incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), de polisac�ridos (por ejemplo, agarosa), de poliacrilamidas, de poliestireno, de polivinil alcohol y de siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatograf�a por afinidad). Este término también incluye una fase sólida

25 discontinua de partículas discretas, tal como las descritas en la patente de Estados Unidos no. 4.275.149.

[0065] Un “liposoma” es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfol�pidos y/o tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un polip�ptido TAHO o anticuerpo para el mismo o un oligop�ptido de unión a TAHO) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.

[0066] Una molécula “pequeña” o molécula orgánica “pequeña” se define en la presente invención por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.

35 [0067] Una “cantidad eficaz” de un polip�ptido, anticuerpo, oligop�ptido de unión a TAHO, molécula orgánica de unión a TAHO o un agonista o antagonista de los mismos tal como se describe aquí, es una cantidad suficiente para llevar a cabo un objetivo específicamente indicado. Una “cantidad eficaz” puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria, en relación al objetivo indicado.

[0068] El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polip�ptido, oligop�ptido de unión a TAHO, molécula orgánica de unión a TAHO u otro fármaco eficaz para “tratar” una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir, ralentizaci�n en cierto grado y preferiblemente detención) de la infiltración de células cancerosas en órganos

45 periféricos; inhibición (es decir, ralentizaci�n en cierto grado y preferiblemente detención) de la metástasis tumoral; inhibición, en cierto grado, del crecimiento tumoral; y/o alivio, en cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición de “tratamiento” en la presente invención. Siempre que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o la cit�lisis de células cancerosas existentes, puede ser citost�tico o citot�xico.

[0069] Una “cantidad inhibidora del crecimiento” de un anticuerpo anti-TAHO, polip�ptido TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo, las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo. Una “cantidad inhibidora del crecimiento” de un anticuerpo anti-TAHO, polip�ptido TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO con el propósito de inhibir el crecimiento de células neopl�sicas se puede determinar empíricamente y

55 de una manera rutinaria.

[0070] Una “cantidad citot�xica” de un anticuerpo anti-TAHO, polip�ptido TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo. Una “cantidad citot�xica” de un anticuerpo anti-TAHO, polip�ptido TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO con el propósito de inhibir el crecimiento de células neopl�sicas se puede determinar empíricamente y de una manera rutinaria.

[0071] El término “anticuerpo” se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TAHO individuales (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes), 65 composiciones de anticuerpos anti-TAHO con especificidad poliepit�pica, anticuerpos policlonales, anticuerpos anti-TAHO de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-TAHO (ver a continuación), siempre y cuando muestren la

actividad biológica o inmunol�gica deseadas. El término “inmunoglobulina” (Ig) se utiliza indistintamente con el anticuerpo de la presente invención.

[0072] Un “anticuerpo aislado” es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su

5 medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos protein�ceos o no protein�ceos. En realizaciones preferidas, se purificar� el anticuerpo (1) en más de un 95% en peso del anticuerpo determinado por el procedimiento de Lowry, y aún más preferiblemente en más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de amino�cidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estar� presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparar� mediante por lo menos una etapa de purificación.

15 [0073] La unidad básica del anticuerpo de 4 cadenas es una glicoprote�na heterotetram�rica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de la unidad heterotetram�rica básica junto con un polip�ptido adicional denominado cadena J y, por tanto, contiene 10 sitios de unión a ant�geno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de 150.00 daltons. Cada cadena L est� unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H est�n unidas entre s� mediante uno o más enlaces disulfuro que dependen del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también est� regularmente presenta puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada cadena H tiene en el extremo N-terminal un

25 dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a y γ y cuatro dominios CH para los isotipos μ y ε. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL est� alineado con el VH y el CL est� alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Se cree que los residuos de amino�cidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de un VH y un VL juntos forma un único sitio de unión a ant�geno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8� Edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristam

G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.

[0074] La cadena L de cualquier especie vertebrada se puede asignar a uno de los dos tipos claramente distintos,

35 denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de amino�cidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de amino�cidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen las cadenas pesadas designadas a, 5, E, y, y 1, respectivamente. Las clases y y a se dividen además en subclases en base a diferencias relativamente menores en la secuencia y la función de CH, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

[0075] El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos. El dominio V media en la unión a ant�geno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su ant�geno particular. Sin embargo, la variabilidad no est� distribuida uniformemente a lo 45 largo del tramo de 110 amino�cidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones armazón (“framework”) (FRs) de 15-30 amino�cidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas “regiones hipervariables” que tienen cada una de 9 a 12 amino�cidos de longitud. Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de lámina beta, conectadas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas de manera próxima mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a ant�geno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no est�n implicados directamente en la unión de un

55 anticuerpo a un ant�geno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

[0076] El término “región hipervariable” cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos de amino�cidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a ant�geno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de amino�cidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (por ejemplo, aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL y aproximadamente 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el VL y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH;

65 Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).

[0077] El término “anticuerpo monoclonal” tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio 5 antig�nico único. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (ep�topos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el ant�geno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se pueden sintetizar sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” no debe interpretarse como que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención tal como se definen en las reivindicaciones, se pueden fabricar mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante en células bacterianas, animales o vegetales eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas

15 en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

[0078] Entre los anticuerpos monoclonales de la presente invención se incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, as� como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (véase, Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias

25 de unión a ant�geno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del viejo Mundo, Simio, etc) y secuencias de la región constante humana.

[0079] Un anticuerpo “intacto” es aquel que comprende un sitio de unión a ant�geno, as� como un CL y por lo menos dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes en la secuencia de amino�cidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

[0080] Los “fragmentos de anticuerpos” comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a ant�geno o variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen los fragmentos

35 Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diabodies; anticuerpos lineales (véase la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespec�ficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

[0081] La digestión con papa�na de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a ant�geno idénticos, llamados fragmentos “Fab” y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). Cada fragmento de Fab es monovalente con respecto a la unión a ant�geno, es decir, presenta un único sitio de unión a ant�geno. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 grande único que corresponde aproximadamente a dos fragmentos de Fab unidos por puentes

45 disulfuro que tienen una actividad de unión a ant�geno divalente y aún es capaz de reticular con el ant�geno. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 que incluyen una o más ciste�nas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en la presente invención para Fab’ en el que el residuo o residuos de ciste�na de los dominios constantes transportan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab’)2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab’ que tienen ciste�nas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0082] El fragmento Fc comprende las partes carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias en la región

55 Fc, cuya región es también la parte reconocida por receptores Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de células.

[0083] “Fv” es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de ant�geno. Este fragmento consiste en un d�mero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no covalente. A partir del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de las cadenas H y L) que contribuyen con los residuos de amino�cidos para la unión a ant�geno y que confieren especificidad de unión a ant�geno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs específicas de ant�geno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a ant�geno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

65 [0084] “Fv de cadena única”, también abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo conectados en una única cadena de polip�ptido. Preferiblemente, el polip�ptido sFv comprende además un polip�ptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a ant�geno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

5 [0085] El término “diabodies” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL, de manera que se consigue el emparejamiento de los dominios V entre cadenas, pero no intracadenas, dando lugar a un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a ant�geno. Los diabodies biespec�ficos son heterod�meros de dos fragmentos de sFv “ de entrecruce”, donde los fragmentos VH y VL de los dos anticuerpos est�n presentes en diferentes cadenas polipept�dicas. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 64446448 (1993).

15 [0086] Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón (“framework”) (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprender� sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles

25 hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprender� opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0087] Un “anticuerpo dependiente de especie”, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgE humana de mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte por un ant�geno de una primera especie mamífera que la que tiene un homólogo de ese ant�geno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie “se une específicamente” a un ant�geno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no

35 más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 y lo más preferible no más de aproximadamente 1 x 10-9 M), pero presenta una afinidad de unión por un homólogo del ant�geno de una segunda especie de mamífero no humano que es por lo menos aproximadamente 50 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o por lo menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el ant�geno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano.

[0088] Un "polip�ptido de unión a TAHO” es un oligop�ptido que se une, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí. Los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden sintetizar químicamente utilizando una metodología de síntesis de oligop�ptidos conocida o se pueden preparar y purificar utilizando 45 tecnología recombinante. Los oligop�ptidos de unión a TAHO tienen habitualmente por lo menos aproximadamente 5 amino�cidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, � 100 amino�cidos de longitud o más, donde dichos oligop�ptidos son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí. Los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de oligop�ptidos para oligop�ptidos que son capaces de unirse específicamente a un polip�ptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 55 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,1.43; Publicación PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth.,

102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991). J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668).

[0089] Una "molécula orgánica de unión a TAHO” es una molécula orgánica diferente de un oligop�ptido o anticuerpo tal como se define aquí, que se une, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se 65 describe aquí. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO se pueden identificar y sintetizar químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas

org�nicas de unión a TAHO tienen habitualmente menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 � 200 daltons de tamaño, donde dichas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí, se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este

5 aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de unirse específicamente a un polip�ptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585).

[0090] Un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica “que se une” a un ant�geno de interés, por ejemplo, un polip�ptido ant�geno diana asociado a un tumor, es aquel que se une al ant�geno con suficiente afinidad, de manera que el anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica es útil como agente terapéutico en el reconocimiento de una célula o tejido que expresan el ant�geno, y no reacciona significativamente de forma cruzada con otras proteínas. En dichas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica a una proteína “no diana” ser� inferior a aproximadamente un 10% de la unión del anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica a 15 su proteína diana particular tal como se determina mediante un análisis mediante separador celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitaci�n (RIA). Con respecto a la unión de un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica a una molécula diana, el término “unión específica” o “que se une específicamente a” o es “específico para” un polip�ptido particular o un ep�topo en un polip�ptido diana particular significa una unión que es diferente de forma medible de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar mediante la competición con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda es inhibida competitivamente por un exceso de diana no marcada. El término “unión específica” o “que se une

25 específicamente a” o es “específico para” un polip�ptido particular o un ep�topo en un polip�ptido diana particular tal como se utiliza aquí se pueden mostrar, por ejemplo, mediante una molécula que tiene una Kd para la diana de por lo menos aproximadamente 10-4 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-5 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-6 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-7 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-8 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-10 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-11 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-12 M, o superior. En una realización, el término “unión específica” se refiere a la unión en la que una molécula se une a un polip�ptido particular o un ep�topo en un polip�ptido particular sin unirse específicamente a cualquier otro polip�ptido o ep�topo en polip�ptido.

35 [0091] Un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica que”inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polip�ptido TAHO” o un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica “inhibidora del crecimiento” son aquellos que dan lugar a una inhibición de crecimiento medible de las células cancerosas que expresan o sobreexpresan el polip�ptido TAHO apropiado. El polip�ptido TAHO puede ser un polip�ptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polip�ptido que es producido o secretado por una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos o moléculas orgánicas inhibidoras del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células tumorales que expresan TAHO en más de un 20%, preferiblemente de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 50% e incluso, más preferiblemente, en más de un 50%, por ejemplo, de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 100%), en comparación con el control apropiado, siendo habitualmente el control células tumorales no tratadas con el anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula

45 orgánica a analizar. En una realización, la inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,1 a 30 μg/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varias maneras, tales como las descritas en la sección de Ejemplos Experimentales siguiente. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAHO a aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da lugar a la reducción en el tamaño tumoral o proliferaci�n de células tumorales en aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferiblemente en aproximadamente 5 a 30 días.

[0092] Un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica que “induce apoptosis” es aquel que induce la muerte

55 celular programada determinada mediante la unión de annexina V, la fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplasm�tico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apopt�ticos). La célula es normalmente aquella que sobreexpresa un polip�ptido TAHO. Preferiblemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula hematopoy�tica, tal como una célula B, célula T, bas�filo, eosin�filo, neutr�filo, monocito, plaqueta o eritrocito. Existen varios procedimientos disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocaci�n de la fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante la unión a annexina; la fragmentación de ADN se puede evaluar a través del “laddering” del ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN se pueden evaluar mediante cualquier aumento en células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo, el oligop�ptido u otra molécula orgánica que induce la apoptosis es aquel que da lugar a de aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente de

65 aproximadamente 5 a 50 veces, y aún más preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de unión a annexina en relación a célula no tratada en un ensayo de unión a annexina.

[0093] Las “funciones efectoras” de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de amino�cidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión a

5 C1q y la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; subregulaci�n de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B(); y la activación de células B.

[0094] “Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refieren a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores de Fc (FcRs) presentes en ciertas células citot�xicas (por ejemplo, células asesinas (“killer”) naturales (NK), neutr�filos, y macr�fagos) permite que estas células efectoras citot�xicas se unan específicamente a una célula diana que porta el ant�geno y, posteriormente, destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” las células citot�xicas y son absolutamente necesarias para dicha destrucción. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII solo, mientras que los

15 monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoy�ticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 � 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

[0095] Los términos “receptor Fc” y “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es aquella que 25 se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo variantes al�licas y formas alternativamente empalmadas (“spliced”) de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor de activación”) y FcyRIIB (un “receptor de inhibición”), que tienen secuencias de amino�cidos similares que difieren principalmente en sus dominios citopl�smicos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citopl�smico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citopl�smico (revisado en Da�ron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, est�n comprendidos por el término “FcR” aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable 35 de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol.,

24:249 (1994)).

[0096] “Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citot�xicas y neutr�filos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.

[0097] “Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refieren a la lisis de una célula diana en presencia

45 del complemento. La activación del mecanismo de del complemento clásico se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que est�n unidos a su ant�geno af�n. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0098] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no se limitan a, c�nceres hematopoy�ticos o c�nceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma o tumores linfoides, pero también c�nceres del bazo y c�nceres de los nódulos linfáticos. Ejemplos más particulares de dichos c�nceres asociados a células B incluyen, por ejemplo, linfomas de grado alto, intermedio y 55 bajo (incluyendo linfomas de células B tales como, por ejemplo, linfoma de células B de tejido linfoide asociado a mucosa y linfoma que no es de Hodgkin, linfoma de células de manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfoc�tico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células grandes difusas, linfoma folicular y linfoma de Hodgkin y linfomas de células T) y leucemias (incluyendo leucemia secundario, leucemia linfoc�tica crónica, tal como leucemia de células B (linfocitos B CD5+), leucemia de mieloma, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia de mieloma crónica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfobl�stico agudo y mielodisplasia), mieloma múltiple, tal como tumores de células plasm�ticas y otros c�nceres hematol�gicos y/o asociados a células B o células T. También se incluyen c�nceres de células hematopoy�ticas adicionales, incluyendo leucocitos polimorfonucleares, tales como bas�filos, eosin�filos, neutr�filos y monocitos, células dendr�ticas, plaquetas, eritrocitos y células asesinas naturales. Los orígenes de los c�nceres de células B son los siguientes: el linfoma de células B de zona marginal se origina en 65 células B de memoria en la zona marginal, el linfoma folicular y el linfoma de células B grandes difusas se origina en centrocitos en la zona clara de los centros germinales, el mieloma múltiple se origina en las células plasm�ticas, la

leucemia linfoc�tica crónica y la leucemia linfoc�tica pequeña se originan en células B1 (CD5+), el linfoma de células de manto se origina en células B intactas en la zona del manto y el linfoma de Burkitt se origina en centroblastos en la zona oscura de los centros germinales. Los tejidos que incluyen células hematopoy�ticas referidos en la presente invención como “tejidos de células hematopoy�ticas” incluyen el timo y la médula ósea y tejidos linfoides periféricos,

5 tales como el bazo, nódulos linfáticos, tejidos linfoides asociados con mucosa, tales como los tejidos linfoides asociados a intestino, amígdalas, parches de Peyer y apéndice y tejidos linfoides asociados con otra mucosa, por ejemplo, los recubrimientos bronquiales.

[0099] Los términos “trastorno proliferativo celular” y “trastorno proliferativo” se refieren a trastornos que est�n asociados con cierto grado de proliferaci�n de células anormales. En una realización, el trastorno proliferativo celular es el cáncer.

[0100] “Tumor”, tal como se utiliza aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferaci�n de células neopl�sicas, tanto malignas como benignas y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

15 [0101] Un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica que “induce la muerte celular” es aquel que provoca que una célula viable se convierta en no viable. La célula es aquella que expresa un polip�ptido TAHO y es de un tipo celular que específicamente expresa o sobreexpresa un polip�ptido TAHO. La célula puede ser una célula cancerosa o normal del tipo de célula particular. El polip�ptido TAHO puede ser un polip�ptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polip�ptido que es producido y secretado por una célula cancerosa. La célula puede ser una célula cancerosa, por ejemplo, una célula B o una célula T. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y de células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). De este modo, el ensayo por la muerte celular se puede realizar utilizando

25 suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo, oligop�ptido, u otra molécula orgánica es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de la integridad de membrana evaluada mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase Moore et al. Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) o 7AAD se puede evaluar en relación con las células no tratadas. Los anticuerpos, oligop�ptidos u otras moléculas orgánicas que inducen la muerte celular preferidas son aquellos que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en células BT474.

[0102] Una "célula que expresa TAHO" es una célula que expresa un polip�ptido TAHo end�geno o transfectado en la superficie celular o en una forma secretada. Un “cáncer que expresa TAHO” es un cáncer que comprende células que tienen un polip�ptido TAHO presente en la superficie celular o que producen y secretan un polip�ptido TAHO. 35 Un “cáncer que expresa TAHO” produce opcionalmente niveles suficientes de polip�ptido TAHO en la superficie de células del mismo, de manera que un anticuerpo anti-TAHO, un oligop�ptido u otra molécula orgánica se pueden unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra realización, un “cáncer que expresa TAHO” produce y secreta opcionalmente niveles suficientes de polip�ptido TAHO, de manera que un anticuerpo anti-TAHO, un oligop�ptido u otra molécula orgánica antagonistas se pueden unir al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a esto último, el antagonista puede ser un oligonucle�tido no codificante que reduce, inhibe o evita la producción y la secreción del polip�ptido TAHO secretado mediante células tumorales. Un cáncer que “sobreexpresa” un polip�ptido TAHO es aquel que tiene niveles significativamente más elevados de polip�ptido TAHO en la superficie celular del mismo, o produce y secreta, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresi�n puede estar causada por la amplificación g�nica o 45 mediante el aumento de la transcripción o la traducción. La sobreexpresi�n de polip�ptido TAHO se puede determinar en un ensayo de detección o pronóstico mediante la evaluación de niveles incrementados de la proteína TAHO presente en la superficie de una célula, o secretada por la célula, (por ejemplo, mediante un ensayo de inmunohistoqu�mica utilizando anticuerpos anti-TAHO preparados contra un polip�ptido TAHO aislado que se puede preparar utilizando tecnología de ADN recombinante a partir de un ácido nucleico aislado que codifica el polip�ptido TAHo; análisis FACS, etc.). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucleico que codifica el polip�ptido TAHO o ARNm en la célula, por ejemplo, a través de hibridación in situ fluorescente utilizando una sonda basada en ácidos nucleicos correspondiente a un ácido nucleico que codifica TAHO o el complemento del mismo; (FISH; véase WO98/45479 publicada en octubre 1998), técnicas de transferencia Southern, transferencia Northern o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR).

55 También se puede estudiar la sobreexpresi�n del polip�ptido TAHO midiendo el ant�geno escindido en un fluido biológico, tal como suero, por ejemplo, utilizando ensayos basados en anticuerpos (véase, también por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4,933,294 concedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; la Patente de estados unidos 5,401,638 concedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). A parte de los ensayos anteriores, existen varios ensayos in vivo para el técnico experto. Por ejemplo, se pueden exponer células en el cuerpo del paciente a un anticuerpo que es opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a células en el paciente, por ejemplo, mediante rastreo externo para la radioactividad o mediante en análisis de una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.

65 [0103] Tal como se utiliza aquí, el término "inmunoadhesina", designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heter�loga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas se componen de la fusión de una secuencia de amino�cidos con la especificidad de unión deseada y que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a ant�geno de un anticuerpo (es decir es "heter�loga"), y de una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia contigua

5 de amino�cidos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor a un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluidos IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.

[0104] La palabra "marcador", cuando se usa aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica para generar anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica "marcados". El marcador puede ser detectable por s� mismo (por ejemplo marcadores radioisot�picos o marcadores fluorescentes) o, en el caso del marcador enzim�tico, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato detectables.

15 [0105] El término “agente citot�xico” tal como se utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por

I125

ejemplo, At211, I131, , Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterap�uticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca, alcaloides (vincristina, vinblastina, etop�sido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina, u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleol�ticos, antibióticos, y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzim�ticamente activas de origen bacteriano, f�ngico, vegetal animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancer�genos descritos a continuación. A continuación, se describen otros agentes citot�xicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de células tumorales.

25 [0106] Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa TAHO, in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan TAHO en la fase S. Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etop�sido, y bleomicina. Los agentes que interrumpen G1 también afectan a la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina,

35 mecloroetamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancer�genos derivados del tejo. El docetaxel (TAXOTERE�, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo es un análogo semisint�tico del paclitaxel (TAXOL�, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel promueven el ensamblaje de microt�bulos a partir de d�meros de tubulina y estabilizan los microt�bulos mediante la prevención de la despolimerizaci�n, lo que da lugar a la inhibición de la mitosis en células.

[0107] “Doxorrubicina” es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)

45 10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi5,12-naftacenodiona.

[0108] El término “citoquina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Algunos ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipept�dicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas del crecimiento, tales como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidal; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoprote�nas, tales como hormona estimulante del fol�culo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y hormona lute�nica (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lact�geno

55 placentario; factor α y β de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; p�ptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-β; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-α y TGF-β, factor de crecimiento I y II de tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones, tales como interfer�n-α, β, y γ; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como macr�fago-CSF (M-CSF); granulocito-macr�fago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (ILs), tales como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-α o TNF-β, y otros factores de polip�ptidos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal y como se utiliza en la presente invención, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biol�gicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

65 [0109] El término “prospecto” se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de los productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, utilización, dosis, administración, contraindicaciones y/o avisos con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

Tabla 1

TAHO XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 amino�cidos)

Prote�na de comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 amino�cidos) % de identidad en la secuencia de amino�cidos = (el número de residuos de amino�cidos que se emparejan de forma idéntica entre las dos secuencias de polip�ptidos según se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos de amino�cidos del polip�ptido TAHO) =

25 5 dividido por 15 = 33,3%

Tabla 3 TAHO XXXXXXXXXX (Longitud = 10 amino�cidos) Proteína de comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 amino�cidos)

% de identidad en la secuencia de amino�cidos = (el número de residuos de amino�cidos que se emparejan de forma idéntica entre las dos secuencias de polip�ptidos según se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos de amino�cidos del polip�ptido TAHO) = 5 dividido por 10 = 50%

Tabla 4 TAHO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos)

% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos que se emparejan de forma idéntica entre las dos secuencias de ácidos nucleicos según

35 se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de TAHO-DNA) = 6 dividido por 14 = 42,9%

Tabla 5 TAHO-DNA NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de comparación NNNNLLLVV (Longitud = 9 nucleótidos)

% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos que se emparejan de forma idéntica entre las dos secuencias de ácidos nucleicos según se determina mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de TAHO-ADN) = 4 dividido por 12 = 33,3%

45 II.Composiciones y procedimientos de la invención

A. Anticuerpos anti-TAHO

[0110] En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAHO para utilizar como agentes terapéuticos, tal como se establece en las reivindicaciones. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespec�ficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

55 [0111] Los anticuerpos policlonales se desarrollan preferiblemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del ant�geno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el ant�geno pertinente (especialmente cuando se utilizan p�ptidos sintéticos) a una proteína que es inmunog�nica en la especie a inmunizar. Por ejemplo, el ant�geno se puede conjugar a la hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de ciste�na), Nhidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldeh�do, anh�drido succ�nico, SOCl2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

5 [0112] Los animales se inmunizan contra el ant�geno, conjugados inmunog�nicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección intrad�rmica de la solución en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de p�ptido o conjugado en

10 adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días más tarde los animales sangran y el suero se ensaya para el título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de agregación, tales como el alumbre, se utilizan de forma adecuada para potenciar la respuesta inmune.

2. Anticuerpos monoclonales

[0113] Los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o se pueden producir mediante procedimientos de ADN

20 recombinante (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567).

[0114] En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un h�mster, se inmunizan como se ha descrito anteriormente para conseguir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunizaci�n. Alternativamente, los

25 linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunizaci�n, los linfocitos se aislan y se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press. 1986)).

[0115] Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo

30 adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también referidas como compañero de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirán habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

35 [0116] Las células de mieloma de compañero de fusión preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, contribuyen a una producción estable a un nivel elevado de anticuerpo por las células seleccionadas productoras de los anticuerpos, y son sensibles a un medio que se selecciona contra las células parentales no fusionadas. Entre las líneas de células de mieloma preferidas est�n las líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores

40 de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 y derivadas, por ejemplo X63-Ag8-653, disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol.

133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 45 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

[0117] Se ensaya el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el ant�geno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitaci�n o mediante un ensayo de unión

50 in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

[0118] La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

55 [0119] Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59103 (Academia Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores

60 ascéticos en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en los ratones.

[0120] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascético, o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como, por ejemplo, cromatograf�a de afinidad (por ejemplo, proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatograf�a de

65 intercambio iónico, cromatograf�a de hidroxilapatita, electroforesis en gel, di�lisis, etc.

[0121] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucle�tidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de

5 expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simios, células de ovario de h�mster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún otro modo producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pl�ckthun, Immunol Revs., 130:151-188 (1992).

[0122] En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las

15 posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), as� como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

[0123] El ADN que codifica el anticuerpo se puede modificar para producir polip�ptidos anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, mediante la sustitución de las secuencias de los dominios constantes de cadena pesada y ligera (CH y CL) humanos por las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567;

25 Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la fusión de la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polip�ptido que no es inmunoglobulina (polip�ptido heter�logo). Las secuencias de polip�ptidos que no son inmunoglobulinas se pueden sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a ant�geno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación a ant�geno que tiene especificidad por un ant�geno y otro sitio de combinación a ant�geno que tiene especificidad por un ant�geno diferente.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

35 [0124] Los anticuerpos anti-TAHO para utilizar según la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de unión a ant�geno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón (“framework”) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no

45 se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En general, el anticuerpo humanizado comprender� sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprender� por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

[0125] Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. En general, un

55 anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de amino�cidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de amino�cidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos “importados”, que habitualmente se obtienen de un dominio variable “importado”. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias de CDRs o CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se

65 sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

[0126] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo antirat�n de humano) cuando el anticuerpo pretende utilizarse para uso terapéutico humano. Según el procedimiento denominado “mejor-ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la 5 biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Se identifica el dominio V humano de la secuencia humana que est� más próxima a la del roedor y se acepta la región de armazón (FR) humana en el mismo para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una región de armazón particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de armazón se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,

89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).

[0127] Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el ant�geno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferido, los 15 anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas est�n disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas inform�ticos que muestran y visualizan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su ant�geno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias receptoras e importadas, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el ant�geno o ant�genos diana. En general, los residuos de la región hipervariable

25 est�n directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al ant�geno.

[0128] Se contemplan varias formas de un anticuerpo anti-TAHO humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que est� conjugado opcionalmente con uno o más agentes citot�xicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.

[0129] Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transg�nicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunizaci�n, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina end�gena. Por ejemplo, se ha 35 descrito que la eliminación homocig�tica del gen la región de unión (JH) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y en la línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpos end�genos. La transferencia del grupo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes en la línea germinal dar� lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la estimulaci�n con ant�genos. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y las Patentes de Estados Unidos 5.545.806,

5.569.825 y 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.547.807; y WO 97/17852.

[0130] Alternativamente, la tecnología de expresión de fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de 45 genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en el marco en un gen de proteína de recubrimiento principal o secundario de un bacteri�fago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. De este modo, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos de anti-oxazolona a

55 partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para un conjunto diverso de ant�genos (incluyendo auto-ant�genos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). Véase también las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

[0131] Tal como se ha descrito anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos mediante células B activadas in vivo (véase las Patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).

4. Fragmentos de anticuerpos

65 [0132] En ciertas circunstancias, existen ventajas al utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una depuración rápida y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos.

[0133] Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos

5 fragmentos se derivaban mediante la digestión proteol�tica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden todos expresar en y secretarse de E. coli, permitiendo as� la producción simple de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab’-SH se pueden recuperar directamente de E coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otra estrategia, los fragmentos F(Ab’)2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab’)2 con una mayor vida media in vivo que comprenden residuos de ep�topo de unión a receptor salvaje se describen en la Patente de Estados

15 Unidos No. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos ser�n evidentes para el técnico de la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véase WO 93/16185; Patente de Estados Unidos No. 5.571.894; y Patente de Estados Unidos No.

5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intacta carentes de regiones constantes; de este modo, son adecuadas para una unión específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión con sFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un sFv. Véase, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un “anticuerpo lineal”, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespec�ficos o biespec�ficos.

25 5. Anticuerpos biespec�ficos

[0134] Los anticuerpos biespec�ficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos ep�topos diferentes. Los anticuerpos biespec�ficos de ejemplo se pueden unir a dos ep�topos diferentes de la proteína TAHO. Otros de dichos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a TAHO con un sitio de unión por otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-TAHO puede combinarse con un brazo que se une a una molécula inductora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD3) o receptores Fc para IgG (FCγR), tales como FCγRI (CD64), FCγRII (CD32) y FCγRIII (CD16) con el fin de centrar y localizar los mecanismos de defensa celulares en la célula que expresa TAHO. Los anticuerpos biespec�ficos también se pueden utilizar para localizar agentes citot�xicos en células que expresan TAHO. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a TAHO y

35 un brazo que se une al agente citot�xico (por ejemplo, saporina, anti-interfer�n-α, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno con isótopo radioactivo). Los anticuerpos biespec�ficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespec�ficos F(ab’)2).

[0135] WO 96/16673 describe un anticuerpo biespec�fico anti-ErbB2/anti-FcγRIII y la Patente de Estados Unidos

5.837.234 describe un anticuerpo biespec�fico anti-ErbB2/anti-FcγRI. En WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespec�fico anti-ErbB2/Fcα. La Patente de Estados Unidos No. 5.821.337 describe un anticuerpo biespec�fico antiErbB2/anti-CD3.

[0136] Los procedimientos para realizar anticuerpos biespec�ficos son conocidos en la técnica. La producción

45 habitual de anticuerpos específicos de longitud completa se basa en la coexpresi�n de dos pares de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespec�fica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatograf�a de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. En WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procesos similares.

[0137] Según una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-ant�geno) se fusionan a secuencias del dominio constante de 55 inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con una dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polip�ptido en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polip�ptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimientos óptimo del anticuerpo biespec�fico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas de polip�ptido en un único vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polip�ptido en proporciones iguales da 65 lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen un efecto significativo en el rendimiento de la

combinaci�n de cadena deseadas.

[0138] En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespec�ficos est�n compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de

5 cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observ� que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespec�fico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespec�fica proporciona una manera sencilla de separación. Esta estrategia se describe en WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespec�ficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

[0139] Según otra estrategia descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.731.168, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterod�meros que se recuperan de cultivos de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3. En

15 este procedimiento, una o más cadenas laterales de amino�cidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o tript�fano). Se crean las “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales de amino�cidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterod�mero sobre otros productos finales no deseados, tales como homod�meros.

[0140] Entre los anticuerpos biespec�ficos se incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados

25 Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980 junto con un grupo de técnicas de reticulación.

[0141] Las técnicas para generar anticuerpos biespec�ficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespec�ficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se descomponen proteol�ticamente para generar fragmentos F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sádico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro

35 intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab’ generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab’-TNB se reconvierte a continuación en Fab’-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespec�fico. Los anticuerpos biespec�ficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

[0142] El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab’-SH de E. coli., que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespec�ficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespec�fico F(ab’)2 completamente humanizada. Cada fragmento de Fab’ se secret� por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para 45 formar el anticuerpo biespec�fico. El anticuerpo biespec�fico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, as� como de desencadenar la actividad l�tica de linfocitos citot�xicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos. Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespec�ficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespec�ficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los p�ptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión g�nica. Los homod�meros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar mon�meros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterod�meros de anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homod�meros de anticuerpos. La tecnología de “diabody” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 55 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespec�ficos. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando as� dos sitios de unión a ant�geno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespec�ficos mediante la utilización de d�meros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

[0143] Se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespec�ficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

65 6. Anticuerpos heteroconjugados

[0144] Los anticuerpos heteroconjugados tal como se definen en las reivindicaciones también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados est�n compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 5 91/00360: WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tio�ter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.

4.676.980.

7. Anticuerpos multivalentes

[0145] Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por

15 una célula que expresa un ant�geno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención tal como se definen en las reivindicaciones pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de a los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a ant�geno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipept�dicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerizaci�n y tres o más sitios de unión a ant�geno. El dominio de dimerizaci�n preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprender� una región Fc y tres o más sitios de unión a ant�geno amino terminales a la región fc. El anticuerpo multivalente preferido de la presente invención comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de unión a ant�geno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena polipept�dica (y preferiblemente dos cadenas polipept�dicas), donde la cadena

25 o cadenas polipept�dicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipept�dicas pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipept�dica de una región Fc, X1 y X2 representan un amino�cido o un polip�ptido, y n es 0 � 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipept�dicas pueden comprender: VH-CH1enlazador flexible-VH-CH1-cadena de región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente de la presente invención comprende preferiblemente además por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polip�ptidos del dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente invención puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polip�ptidos del dominio variable de cadena ligera. Los polip�ptidos del dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, además, comprenden un dominio CL.

8. Diseño de la función efectora

[0146] Se puede desear modificar el anticuerpo de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones con respecto a la función efectora, por ejemplo, con el fin de aumentar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de ant�geno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir mediante la introducción de una o más sustituciones de amino�cidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo o residuos de ciste�nas se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodim�rico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de internalizaci�n y/o incrementar la cit�lisis 45 mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodim�ricos con una actividad anti-tumoral aumentada también se pueden preparar utilizando entrecruzadores heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989). Para aumentar la vida media del suero del anticuerpo, se puede incorporar un ep�topo de unión al receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,739,277, por ejemplo. Tal como se utiliza aquí, el término “ep�topo de unión al receptor salvaje” se refiere a un ep�topo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que son responsables del

55 incremento de la vida media en suero in vivo de la molécula IgG.

9. Inmunoconjugados

[0147] La presente invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citot�xico, tal como un agente quimioterap�utico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzim�ticamente activa de origen bacteriano, f�ngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

[0148] Anteriormente se han descrito agentes quimioterap�uticos útiles para la generación de dichos

65 inmunoconjugados. Entre las toxinas enzim�ticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionucleidos disponibles para la producción de

5 anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citot�xico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imido�steres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldeh�dos (tales como glutaraldeh�do), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitella et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilen triaminopentaac�tico (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucle�tidos al anticuerpo. Véase WO94/11026.

15 [0149] También se contemplan en la presente invención conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, p�ptidos de auristatina, tales como monometil auristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina), maitansinoides, tales como DM1, un tricoteno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tiene actividad de toxina.

Maitansina y maitansinoides

[0150] En una realización preferida, se conjuga un anticuerpo anti-TAHO (longitud completa o fragmentos) a una o más moléculas maitansinoides.

25 [0151] Los maitansinoides, tales como DM1, son inhibidores mitot�ticos que actúan inhibiendo la polimerizaci�n detubulina. La maitansina se aisl� por primera vez del arbusto Maytenus serrata del áfrica del este (Patente de Estados Unidos No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (Patente de Estados Unidos No. (4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; and 4,371,533.

35 Conjugados maitansinoide-anticuerpo

[0152] En un intento por mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado a anticuerpos que se unen específicamente a ant�genos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal humano. Se observ� que el conjugado era altamente citot�xico hacia las células del cáncer de colon cultivadas y mostr� actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en lkos que se

45 conjugó un maitansinoide a través de un enlace disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un ant�geno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncog�n HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado Ta.1-maitansinoide se ensay� in vitro en la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 ant�genos de la superficie de HER-2 por célula. El fármaco conjugado consiguió un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, que se podía incrementar mediante el incremento del número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostr� una citotoxicidad sist�mica baja en ratones.

Conjugados anticuerpo anti-polip�ptido TAHO-maitansinoide

55 [0153] Los conjugados anticuerpo anti-TAHO-maitansinoide se preparan mediante la unión química de un anticuerpo anti-TAHO a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo han mostrado una eficacia en el aumento de la citotoxicidad de células diana sin afectar significativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se describen maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 y en las otras publicaciones de patente y no patente referidas anteriormente aquí. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de

65 maitansinol.

[0154] Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para fabricar conjugados anticuerpomaitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro,

5 grupos tio�ter, grupos l�biles ácidos, grupos fotol�biles, o grupos l�biles peptidasa o grupos l�biles esterasa, tal como se describe en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tio�ter.

[0155] Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden fabricar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imido�steres (tales como, dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldeh�dos (tales como glutaraldeh�do), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente

15 preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]), sulfosuccinimidil maleimidometil ciclohexano carboxilato (SMCC) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. Otros enlazadores disulfuro incluyen cys-MC-vc-PAB (un reactivo enlazador dip�ptido valina-citrulina (vc) que tiene un componente maleimida y un componente auto-inmolador paraaminobencilcarbamo�lo (PAB).

[0156] El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede estar formado por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede tener lugar en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada don hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20

25 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.

Caliqueamicina

[0157] Otro inmunoconjugado de particular interés comprende un anticuerpo anti-TAHO conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,773,001; y 5,877,296 (todas de la American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se

35 pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, γ11, α21, α31, N-acetil-γ11, PSAG, y θ11 (Hinman et al, CancerRes 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cancerres 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral preferido al que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasm�tica. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalizaci�n mediada por anticuerpos aumenta ampliamente sus efectos citot�xicos.

Otros agentes citot�xicos

[0158] Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los anticuerpos anti-TAHO de la presente invención

45 incluyen BCNU, estrepzoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,053,394, 5,770,710, as� como esperamicinas (patente de Estados Unidos 5,877,296).

[0159] Entre las toxinas enzim�ticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.

55 [0160] La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleol�tica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desorribonucleasa; ADNasa).

[0161] Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Existe un conjunto de isótopos radioactivos disponibles para la producción de anticuerpos anti-TAHO radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el conjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellogr�ficos, por ejemplo tc99m o I123, o un marcador de spin para la obtención de imágenes por resonancia

65 magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

[0162] Los radiomarcadores u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado de varias maneras conocidas. Por ejemplo, el p�ptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar mediante la síntesis química de amino�cidos utilizando precursores de amino�cidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de

5 hidrógeno. Los marcadores, tales como, tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 se pueden unir mediante un residuo de ciste�na en el p�ptido. El ytrio-90 se puede unir mediante un residuo de lisina. El procedimiento de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. “Monoclonal antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) describe otros procedimientos en detalle.

[0163] Los conjugados del anticuerpo y el agente citot�xico se pueden fabricar utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imido�steres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldeh�dos (tales como glutaraldeh�do), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p

15 diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaac�tico (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucle�tidos al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador separable” que facilita la liberación del fármaco citot�xico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador l�bil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotol�bil, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 [1992]; Patente de Estados Unidos No. 5,208,020).

[0164] Alternativamente, se puede fabricar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAHO y agente

25 citot�xico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de p�ptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado ya sea adyacentes entre s� o separadas por una región que codifica un p�ptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

10. Inmunoliposomas

[0165] Los anticuerpos anti-TAHO descritos en la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Un “liposoma” es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfol�pidos y/o tensoactivo que es útil para la liberación de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma est�n

35 dispuesto habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Pat. De Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545; y WO97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.

[0166] Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir

45 liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente solicitud se pueden conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. En el liposoma est� contenido opcionalmente un agente quimioterap�utico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).

B. Oligop�ptidos de unión a TAHO

[0167] Los oligop�ptidos de unión a TAHO son oligop�ptidos que se unen, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí. Los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden sintetizar químicamente utilizando la metodología de síntesis de oligop�ptidos conocida o se pueden preparar y purificar utilizando tecnología 55 recombinante. Los oligop�ptidos de unión a TAHO tiene habitualmente por lo menos aproximadamente 5 amino�cidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, � 100 amino�cidos de longitud o más, donde dichos oligop�ptidos que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí. Los oligop�ptidos de unión a TAHO se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de oligop�ptidos para oligop�ptidos que son capaces de unirse específicamente a un polip�ptido diana son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 65 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicación PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985);

Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, y Smith, G. P.

5 (1991) Current Opin, Biotechnol., 2: 668).

[0168] En este aspecto, la expresión en bacteri�fagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite cribar bibliotecas grandes de oligop�ptidos para identificar el miembro o miembros de estas bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a un polip�ptido diana. La expresión en fago es una técnica por la cual se expresan variantes de polip�ptidos como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento en la superficie de partículas de bacteri�fagos (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad de la expresión en fagos radica en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas seleccionadas al azar (o ADNcs clonados al azar) se pueden separar rápida y eficazmente para las secuencias que se unen a una molécula diana con gran afinidad. La expresión de bibliotecas de p�ptido (Cwirla, S. E. et al. (1990Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378) o proteína 15 (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363) en fagos se ha utilizado para cribar millones de polip�ptidos u oligop�ptidos para aquellos con propiedades de unión específicas (Smith, G.

P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668). La separación de la bibliotecas en fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad utilizando el receptor diana, y un medio de evaluación de los resultados de enriquecimientos de unión. Patentes de Estados Unidos nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.

[0169] Aunque la mayoría de procedimientos de expresión en fago han utilizado sistemas de expresión en fago filamentoso, también son conocidos los sistemas de expresión en fago lamboide (WO 95/34683; U.S. 5,627,024),

25 sistema de expresión fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58 (15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2): 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de expresión en fago T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905) .

[0170] Actualmente se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto básico de expresión en fagos. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de expresión para cribar bibliotecas de p�ptidos para unirse a moléculas diana seleccionadas y para expresar proteínas funcionales con el potencial de cribar estas proteínas por las propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para las reacciones de expresión en fagos (WO 98/14277) y se han utilizado bibliotecas de expresión en fagos para analizar 35 y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de p�ptidos helicoidales obligados (WO 98/20036). WO 97/35196 describe un procedimiento para aislar un ligando de afinidad en el que se pone en contacto una biblioteca de expresión en fagos con una solución en la que el ligando se unir� a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se unir� a la molécula diana, para aislar selectivamente los ligandos de unión. WO 97/46251 describe un procedimiento para la bioadsorci�n de una biblioteca de expresión en fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y a continuación el aislamiento del fago de unión, seguido de un proceso de microadsorci�n utilizando pocillos de microplacas para aislar el fago de unión con afinidad elevada. También se ha descrito el uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como etiqueta de afinidad (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9: 187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir las especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una

45 biblioteca de expresión en fagos. En WO 97/094446 se describe un procedimiento para seleccionar enzimas adecuadas para su uso en detergentes utilizando la expresión en fagos. Procedimientos adicionales de selección de proteínas de unión específica se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,498,538,5,432,018, y WO 98/15833.

[0171] Los procedimientos de generación de bibliotecas de p�ptidos y cribado de estas bibliotecas también se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.

C. Moléculas orgánicas de unión a TAHO

55 [0172] Las moléculas orgánicas de unión a TAHO son moléculas orgánicas diferentes de oligop�ptidos o anticuerpos tal como se definen aquí que se unen, preferiblemente específicamente, a un polip�ptido TAHO tal como se describe aquí. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO se pueden identificar y sintetizar químicamente utilizando metodología conocida (véase, por ejemplo, Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas orgánicas de unión a TAHO tienen habitualmente menos de aproximadamente 200 daltons de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 � 200 daltons de tamaño, donde dichas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente a un polip�ptido tal como se describe aquí, se pueden identificar sin una gran experimentación utilizando técnicas conocidas. En este aspecto, cabe indicar que las técnicas para cribar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de

65 unirse a un polip�ptido diana son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas de orgánicas de unión a TAHO pueden ser, por ejemplo, aldeh�dos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, �teres, tioles, tio�teres, disulfuros, ácidos carbox�licos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heteroc�clicos, anilinas,

5 alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, ep�xidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o similares.

D. Cribado de anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos de unión a TAHO y moléculas orgánicas de unión a TAHO con las propiedades deseadas.

[0173] Las técnicas para generar anticuerpos, oligop�ptidos y moléculas orgánicas que se unen a polip�ptidos TAHO se han descrito anteriormente. Se pueden seleccionar además anticuerpos, oligop�ptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee.

15 [0174] Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido u otra molécula orgánica de la solicitud se pueden valorar mediante los procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando células que expresan un polip�ptido TAHO end�genamente o tras la transfecci�n con el gen de TAHO. Por ejemplo, las líneas de células tumorales y las células transfectadas con TAHO apropiadas se pueden tratar con un anticuerpo monoclonal anti-TAHO, oligop�ptido u otra molécula orgánica de la solicitud a varias concentraciones durante unos días (por ejemplo, 2-7 días) y se pueden teñir con violeta cristal o MTT o analizarse mediante algún otro ensayo colorim�trico. Otro procedimiento de medición de la proliferaci�n sería mediante la comparación de la captación de3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO de la solicitud. Después del tratamiento, las células se recogen y se

25 cuantifica la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibidor el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varias maneras conocidas en la técnica. La célula tumoral puede ser la que sobreexpresa un polip�ptido TAHO. El anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO inhibirán la proliferaci�n celular de una célula tumoral que expresa TAHO in vitro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con la célula tumoral no tratada, más preferiblemente, en aproximadamente 30-100%, e incluso más preferiblemente en aproximadamente 50-100% � 70-100%, en una realización, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 μg/ml. La inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 μg/ml o aproximadamente 0,5 nM a

35 200 nM en cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAHO de aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da lugar a la reducción del tamaño tumoral o la reducción de la proliferaci�n del tumor dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferiblemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días.

[0175] Para seleccionar un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO que induce la muerte celular, se puede valorar la pérdida de integridad de la membrana indicada mediante, por ejemplo, la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD en relación al control. Se puede realizar un ensayo de captación de PI en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células tumorales que

45 expresan el polip�ptido TAHO se incuban con medio solo o medio que contiene anticuerpo anti-TAHO (por ejemplo, a aproximadamente 10 μg/ml), un oligop�ptido de unión a TAHO o una molécula orgánica de unión a TAHO. Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Tras cada tratamiento, las células se lavan y se fraccionan en tubos 12x 75 de tapón colador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de grupos de células. A continuación, los tubos reciben PI (10 μg/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando un cit�metro de flujo PACSCAN� y el software FACSCONVERT� CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos de unión a TAHO o moléculas de unión a TAHO que inducen estad�siticamente niveles significativos de la muerte celular determinada mediante la captación de PI se pueden seleccionar como anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos de unión a TAHO o moléculas orgánicas de unión a TAHO inductoras de la muerte celular.

55 [0176] Para cribar anticuerpos, oligop�ptidos u otras moléculas orgánicas que se unen a un ep�topo en un polip�ptido TAHO unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensayo se puede utilizar para determinar si un anticuerpo, oligop�ptido u otra molécula orgánica de prueba se une al mismo sitio o ep�topo que un anticuerpo anti-TAHO conocido. Alternativa o adicionalmente, la localización del ep�topo se realiza mediante procedimientos conocidos en el sector. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo se puede mutagenizar mediante, por ejemplo, rastreo de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se analiza inicialmente por su unión con anticuerpo policlonal para asegurar el pliegue correcto. En un procedimiento diferente, se pueden utilizar p�ptidos correspondientes a diferentes regiones de un polip�ptido TAHO en ensayos de competición con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con

65 un ep�topo caracterizado o conocido.

E. Terapia de prof�rmaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpo (ADEPT)

[0177] Los anticuerpos también se pueden utilizar en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima

5 activadora de prof�rmaco que convierte un prof�rmaco (por ejemplo, un agente quimioterap�utico peptidilo, véase WO 81/01145) en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente de Estados Unidos No. 4.975.278.

[0178] El componente enzim�tico del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un prof�rmaco de manera que lo convierte en su forma citot�xica más activa.

[0179] Entre las enzimas que son útiles en el procedimiento se incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir prof�rmacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir prof�rmacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco 15 anticanceroso, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir prof�rmacos que contienen p�ptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prof�rmacos que contienen sustituyentes de Damino�cidos; enzimas que que dividen los carbohidratos, tales como β-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prof�rmacos glicosilados en fármacos libres; β-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con βlactamas en fármacos libres; y penicilin amidasas, tales como penicilin V amidasa o penicilin G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitr�genos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzim�tica, también conocidos en la técnica como “abzimas” se pueden utilizar para convertir los prof�rmacos de la solicitud en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima se pueden preparar tal y

25 como se ha descrito en la presente invención para la liberación de la abzima a una población de células tumorales.

[0180] Las enzimas de la presente invención se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-TAHO mediante técnicas bien conocidas en el sector, tal como la utilización de los reactivos de reticulación heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión a ant�geno de un anticuerpo de la presente solicitud unida a por lo menos una parte funcionalmente activa de una enzima de la solicitud se pueden construir utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el sector (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

F. Polip�ptidos TAHO de longitud completa

35 [0181] La presente solicitud también describe secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican polip�ptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como polip�ptidos TAHO. En particular,

se han identificado y aislado los ADNc (parciales y de longitud completa) que codifican varios polip�ptidos TAHO, tal y como se describe con mayor detalle en los posteriores ejemplos.

[0182] Tal y como se describe en los Ejemplos posteriores, se han depositado clones de ADNc con el ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de los clones se pueden determinar fácilmente por un experto en la materia mediante la secuenciaci�n del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios en la técnica. Las secuencias de amino�cidos previstas se pueden determinar a partir de las secuencias de nucleótidos utilizando la técnica rutinaria.

45 Para los polip�ptidos TAHO y los ácidos nucleicos codificantes descritos en la presente invención, en algunos casos, los solicitantes han identificado lo que se cree que son los mejores marcos de lectura identificables con la información de la secuencia disponible en el momento.

G. Variantes de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO

[0183] Además de los anticuerpos anti-TAHO y los polip�ptidos TAHO de secuencia nativa y de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que se pueden preparar variantes de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO. Las variantes de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante y/o mediante la síntesis del polip�ptido o anticuerpo

55 deseados. Los expertos en la materia entenderán que los cambios de amino�cidos pueden alterar los procesos posttraduccionales del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilaci�n o la alteración de las características de anclamiento a la membrana.

[0184] Las variaciones en los anticuerpos anti-TAHO y polip�ptidos TAHO descritos en la presente invención, se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o el polip�ptido que dan lugar a un cambio en la secuencia de amino�cidos en comparación con el anticuerpo o polip�ptido de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de por lo menos un amino�cido por 65 cualquier otro amino�cido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO. Al determinar qué residuo de amino�cido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de forma adversa la actividad

deseada, se puede encontrar una guía mediante la comparación de la secuencia del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO con la de las moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de amino�cidos realizados en regiones con elevada homología. Las sustituciones de amino�cidos pueden ser el resultado de la sustitución de un amino�cido por otro amino�cido que tiene una estructura y/o

5 propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservativas de amino�cidos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 amino�cidos. La variación permitida se puede determinar realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de amino�cidos en la secuencia y probando en las variantes resultantes la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o madura.

10 [0185] En la presente invención se proporcionan fragmentos de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO. Dichos fragmentos pueden estar truncados en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo o proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de amino�cidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo

15 anti-TAHO o polip�ptido TAHO.

[0186] Los fragmentos del anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO se pueden preparar mediante cualquiera de un conjunto de técnicas convencionales. Los fragmentos de p�ptidos deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la generación de fragmentos de anticuerpo o polip�ptido mediante digestión enzim�tica, 20 por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por residuos de amino�cidos concretos o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polip�ptido deseado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucle�tidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores de los

25 extremos 5’ y 3’ en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunol�gica con el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO nativos descritos aquí.

[0187] En realizaciones particulares, las sustituciones conservativas de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el

30 encabezamiento de “sustituciones preferidas”. Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales denominados “ejemplos de sustituciones” en la Tabla 6 o, tal como se describe posteriormente en referencia a clases de amino�cidos, y se criban los productos. Tabla 1

Residuo

Ejemplos de sustituciones Sustituciones

original

preferidas

Ala (A)

val; leu; ile val

Arg (R)

lys; gln; asn lys

Asn (N)

gln; his; lys; arg gln

Asp (U)

glu; glu

Cys(C)

ser; ser

Gln(Q)

asn; asn

Glu(E)

asp asp

Gly(G)

pro; ala ala

His(H)

asn; gln; lys; arg arg

Ile(I)

leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu(L)

Norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys(K)

arg; gln; asn arg

Met(M)

leu; phe; ile leu

Phe(F)

leu; val; ile; ala; tyr leu

Pro(P)

ala ala

Ser(S)

thr thr

Thr(T)

ser ser

Trp(W)

tyr; phe tyr

Tyr(Y)

trp; phe; thr; ser phe

Val(V)

ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

35

[0188] Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunol�gica del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO se realizan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polip�ptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hélice o lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la

40 cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrof�bico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrof�lico neutro: cys, ser, thr;

(3)

�cido: asp, glu;

(4)

b�sico: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

arom�ticos: trp, tyr, phe.

[0189] Las sustituciones no conservativas comprenderán el intercambio de un miembro de una de estas clases por 5 otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados)

[0190] Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutag�nesis mediada por oligonucle�tidos (dirigida de sitio), el rastreo de alanina, y mutag�nesis por PCR. Para fabricar el ADN variante del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutag�nesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutag�nesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutag�nesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

15 [0191] El análisis de amino�cido por rastreo también se puede realizar para identificar uno o más amino�cidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los amino�cidos de rastreo preferidos est�n los amino�cidos relativamente pequeños y neutros. Entre dichos amino�cidos se incluyen alanina, glicina, serina y ciste�na. La alanina es habitualmente un amino�cido de rastreo preferido de este grupo ya que elimina la cadena lateral más all� del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también habitualmente preferida ya que es el amino�cido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un amino�cido isot�rico.

25 [0192] También se puede sustituir, generalmente por serina, cualquier residuo de ciste�na no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. En cambio, se pueden añadir el enlace o enlaces de ciste�na al anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

[0193] Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por 35 sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetados en cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede aplicar la mutag�nesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a ant�geno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo ant�geno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el polip�ptido TAHO humano. Dichos residuos de contacto y residuos próximos son

45 candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente invención. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo posterior.

[0194] Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de amino�cidos del anticuerpo anti-TAHO se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de amino�cidos naturales) o la preparación por mutag�nesis mediada por oligonucle�tidos (o dirigida de sitio), la mutag�nesis de PCR y la mutag�nesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-TAHO.

H. Modificaciones de anticuerpos anti-TAHO y polip�ptidos TAHO

[0195] Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-TAHO est�n incluidas en la presente solicitud. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de amino�cidos marcados de un anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO. La derivatizaci�n con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-TAHO, y viceversa. Entre los agentes de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)65 2-feniletano, glutaraldeh�do, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imido�steres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimid�licos, tales como 3,3’

ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

[0196] Otras modificaciones incluyen la desamidaci�n de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes 5 residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilaci�n de prolina y lisina, fosforilaci�n de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilaci�n de los grupos α-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina

[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], acetilaci�n de la amina N-terminal, y la amidaci�n de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0197] Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAHO incluido en la presente solicitud comprende la alteración del patrón de glicosilaci�n nativo del anticuerpo o polip�ptido. Por “alteración del patrón de glicosilaci�n nativo” para los objetivos de la presente invención se pretende indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de glicosilaci�n subyacente o mediante la eliminación de la glicosilaci�n por medios químicos y/o

15 enzim�ticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilaci�n que no est�n presentes en el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO de secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glicosilaci�n de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos de carbohidrato presentes.

[0198] La glicosilaci�n de anticuerpos y otros polip�ptidos es habitualmente por unión a N o unión a O. La unión a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias trip�ptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier amino�cido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzim�tica del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias trip�ptido en un polip�ptido crea un potencial sitio de

25 glicosilaci�n. La glicosilaci�n por unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0199] La adición de sitios de glicosilaci�n al anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se puede realizar convenientemente alterando la secuencia de amino�cidos, de manera que contiene una o más de las secuencias trip�ptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilaci�n unidos a N). La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO original (para sitios de glicosilaci�n unidos a O). La secuencia de amino�cidos del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a

35 nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO en bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan se traducirán en los amino�cidos deseados.

[0200] Otros medios para aumentar el número de grupos carbohidrato en el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO es mediante acoplamiento químico o enzim�tico de glic�sidos al polip�ptido. Dichos procedimientos est�n descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).

[0201] La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se puede

45 realizar química o enzim�ticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos de amino�cidos que actúan como dianas para la glicosilaci�n. Las técnicas de desglicosilaci�n química son conocidas en la técnica y est�n descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzim�tica de grupos carbohidrato en los polip�ptidos se puede conseguir mediante la utilización de un conjunto de endo- y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

[0202] Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO comprende la unión del anticuerpo o polip�ptido a uno del conjunto de pol�meros no protein�ceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835;

55 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 � 4.179.337. El anticuerpo o polip�ptido pueden también encapsularse en microc�psulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervaci�n o por polimerizaci�n interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microc�psulas de gelatina y microc�psulas de poli-(metilmetacilato) respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopart�culas y nanoc�psulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980).

[0203] El anticuerpo anti-TAHO de la presente solicitud también se puede modificar de una manera que forme moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo anti-TAHO fusionado a otro polip�ptido o secuencia de amino�cidos heter�logo.

[0204] Dicha molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO con un

polip�ptido etiqueta que proporciona un ep�topo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El ep�topo-etiqueta se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO. La presencia de dichas formas ep�topo etiquetadas del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polip�ptido etiqueta. Además, la disposición del ep�topo 5 etiqueta permite que el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une al ep�topo etiqueta. En la técnica se conocen varios polip�ptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polip�ptido etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de gliprote�na D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Entre otros polip�ptidos etiqueta se incluyen el p�ptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el p�ptido ep�topo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un p�ptido ep�topo de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el p�ptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10 [Lutz

15 Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

[0205] Alternativamente, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como “inmunoadhesina”), dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO en lugar de por lo menos una región variable de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.428.130

25 concedida el 27 de junio de 1995.

I. Preparación de anticuerpos anti-TAHO y polip�ptidos TAHO

[0206] La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAHO y polip�ptidos TAHO mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico codifica anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO. Naturalmente, se prev� que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se conocen bien en la técnica, para preparar los anticuerpos anti-TAHO y polip�ptidos TAHO. Por ejemplo, la secuencia de amino�cidos apropiada, o partes de la misma, se pueden producir mediante síntesis directa de p�ptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis,

35 W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente por separado varias partes del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzim�ticos para producir el anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO deseado.

1. Aislamiento del ADN que codifica un anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO

[0207] El ADN que codifica el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se puede obtener a partir de una biblioteca

45 de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO y lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO humano se puede obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO también se puede obtener a partir de una biblioteca gen�mica o mediante procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).

[0208] Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como oligonucle�tidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc

o biblioteca gen�mica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se

55 describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

[0209] Los siguientes Ejemplos describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucle�tidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inequívoca que se minimizan los falsos positivos. El oligonucle�tido est� preferiblemente marcado de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con 32P, biotinilaci�n o marcaje enzim�tico.

65 Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

[0210] Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras bases de datos privadas de secuencias. La identidad de secuencia (a nivel de amino�cido o

5 nucleótido) en las regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y como se describen en la presente invención.

[0211] El ácido nucleico que tiene la secuencia de codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado del ADNc seleccionado o las bibliotecas gen�micas utilizando la secuencia de amino�cidos deducida descrita en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesando intermedios de ARNm que no se han transcrito de forma inversa en ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

15 [0212] Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonaci�n descritos en la presente invención para la producción del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por un experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

25 [0213] Los procedimientos de transfecci�n de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediados por liposomas y electroporaci�n. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al., supra,

o la electroporaci�n se utilizan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped de mamíferos. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo habitualmente según el

35 procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyecci�n nuclear, electroporaci�n, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et al., Nature, 336. 348-352 (1988).

[0214] Entre las células huésped adecuadas para la clonaci�n o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, levadura, o eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli est�n disponibles públicamente, tales como la cepa de 45 E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y cepa de

E. coli K5772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, as� como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La Cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferible ya que es una cepa de huésped habitual para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteol�ticos. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas end�genas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo la cepa de E.

55 coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argFlac) 169 degP ompT kon’; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argFlac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan’; la cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa peripl�smica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonaci�n in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico polimerasa.

[0215] El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilaci�n y la función efectora de Fc, tal como 65 cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citot�xico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por s� mismo muestra eficacia en la destrucción de la célula tumoral. Los anticuerpos de longitud completa presentan

una vida media mayor en la circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polip�ptidos en bacterias, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5,648,237 (Carter et. al.), la Patente de Estados Unidos 5,789,199 (Joly et al.), y la Patente de Estados Unidos 5,840,523 (Simmons et al.) que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la

5 expresión y secreción, estas patentes se incorporan en la presente por referencia. Después de la expresión, se aisla el anticuerpo de la pasta celular de E: coli en un fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado en, por ejemplo, células CHO.

[0216] Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonaci�n o expresión adecuados para vectores que codifican que codifican el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucari�tico inferior utilizado habitualmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP

139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529;

15 Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al. J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como

A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. Niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475

25 479 [1985]). Las levaduras metilotr�picas son adecuadas en la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol seleccionada del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

[0217] Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, as� como células vegetales, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Se han modificado numerosas cepas baculov�ricas y variantes y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda

35 (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Droshophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una serie de cepas v�ricas para la transfecci�n est�n públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar como el virus del presente documento según la presente invención, particularmente para la transfecci�n de células de Spodoptera frugiperda.

[0218] Sin embargo, el mayor interés ha estado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles est�n la línea CV1 de ri��n de mono transformada por SV40 (COS7, ATCC CRL 1651); línea de ri��n de embrión humano (células 293 � 293 subclonadas para el crecimiento en

45 cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ri��n de h�mster beb� (BHK, ATCC CCL 10; células de ovario de h�mster chino/-DHFR (CHO. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de ri��n de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de ri��n de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de ri��n canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

[0219] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonaci�n descritos anteriormente para

55 la producción del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO y se cultivan en un medio con nutrientes habituales modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

3. Selección e utilización de un vector replicable

[0220] El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN gen�mico), que codifica el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se puede insertar en un vector replicable para la clonaci�n (amplificación del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de pl�smido, c�smido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante 65 una serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente,

pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicaci�n, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por un experto en la materia.

5 [0221] El polip�ptido TAHO se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polip�ptido de fusión con un polip�ptido heter�logo, que puede ser una secuencia señal u otro polip�ptido que tiene un sitio de división específico en el extremo N-terminal de la proteína o polip�ptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el anticuerpo anti-TAHO o

10 polip�ptido TAHO que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de secuencias líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa (incluyendo las secuencias líder del factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia

15 líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990)

o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polip�ptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, as� como secuencias líderes secretoras virales.

20 [0222] Ambos vectores de expresión y clonaci�n contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicaci�n del vector en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levadura, y virus. El origen de la replicaci�n del pl�smido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el origen del pl�smido 2μ es adecuado para la levadura, y orígenes virales

25 varios (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonaci�n en células de mamíferos.

[0223] Los vectores de clonaci�n y expresión contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las

30 deficiencias auxotr�ficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

[0224] Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAHO o el 35 polip�ptido TAHO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1 presente en el pl�smido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador

40 de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en tript�fano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

[0225] Los vectores de clonaci�n y expresión contienen habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO para dirigir la síntesis de 45 ARNm. Son conocidos promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de βlactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de tript�fano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los

50 promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo anti-TAHo o polip�ptido TAHO.

[0226] Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas

55 glucol�ticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

60 [0227] Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotione�na, gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se

65 describen en detalle en EP 73.657.

[0228] La transcripción del anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO a partir de vectores en células huésped de mamíferos est� controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (Patente UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la

5 hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heter�logos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

[0229] Se puede incrementar la transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO por eucariotas superiores mediante la inserción de una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, α-fetoprote�na e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizar� un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía

15 del origen de replicaci�n (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicaci�n, y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar (“splice”) en el vector en una posición 5’ � 3’ con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5’ con respecto al promotor.

[0230] Los vectores de expresión utilizados en células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilizaci�n del ARNm. Dichas secuencias est�n disponibles habitualmente desde las regiones no traducidas 5’ y, ocasionalmente 3’, de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte

25 no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO.

[0231] En Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP

117.058 se describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis del anticuerpo anti-TAHO o el polip�ptido TAHO en cultivos de células de vertebrados recombinantes.

4. cultivo de células huésped

[0232] Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se pueden cultivar

35 en un conjunto de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patente de Estados Unidos Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de Estados Unidos Re. 30,985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina

o factor de crecimiento epid�rmico), sales (tales como cloruro sádico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMICINATM), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a

45 concentraciones finales en el rango micromolar) y la glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario en las concentraciones apropiadas que serían conocidas por un experto en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y ser� evidente para el experto en la materia.

5. Detección de la amplificación/expresión de los genes

[0233] La amplificación y/o expresión de los genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o

55 hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dobles cadenas específicas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN, dobles cadenas híbridas de ADN-ARN o dobles cadenas de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la doble cadena est� unida a una superficie, de manera que tras la formación de la doble cadena en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos a la doble cadena.

[0234] La expresión g�nica, alternativamente, se puede medir mediante procedimientos inmunol�gicos, tales como tinción inmunohistoqu�mica de células o secciones de tejido y el ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto g�nico. Los anticuerpos útiles para la tinción 65 inmunohistoqu�mica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polip�ptido TAHO

de secuencia nativa o contra un p�ptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia ex�gena fusionada a ADN de TAHO que codifica un ep�topo de anticuerpo específico.

5 6. Purificación de anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO

[0235] Las formas de anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de células huésped. Si est� unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o mediante división enzim�tica. Las células utilizadas en la expresión del anticuerpo anti-TAHO y polip�ptido TAHO se pueden romper mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicaci�n, destrucción mecánica, o agentes para lisar células.

[0236] Se puede desear purificar el anticuerpo anti-TAHO y el polip�ptido TAHO a partir de proteínas o polip�ptidos

15 de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatograf�a sobre sílice o una resina de intercambio cati�nico, tal como DEAE; “cromatofocusing”; SDS-PAGE; precipitación con sulfato am�nico; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con ep�topo del anticuerpo anti-TAHO y el polip�ptido TAHO. Se pueden utilizar varios procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el anticuerpo anti-TAHO o polip�ptido TAHO concreto producido.

25 [0237] Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio peripl�smico, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, se elimina el debris particulado, ya sean células huésped o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugaci�n o ultrafiltraci�n. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio peripl�smico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato sádico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonil (PSMF) durante aproximadamente 30 minutos. La debris celular se puede eliminar mediante centrifugaci�n. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran en primer lugar utilizando un filtrador de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltraci�n Amicon o

35 Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa, tal como PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la prote�lisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes extraños.

[0238] La composición de anticuerpos preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatograf�a de hidroxiapatita, electroforesis en gel, di�lisis, y cromatograf�a de afinidad, siendo la cromatograf�a de afinidad la técnica de purificación preferida. La adeq�idad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier región Fc de inmunoglobulina que est� presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas γ1, γ2 o γ4 humanas (Lindmark et al., J, Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1565-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente

45 agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más elevadas y tiempos de procesado más cortos que los conseguidos con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTm (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatograf�a en sílice, cromatograf�a en heparina SEPHAROSETM, cromatograf�a en una resina de intercambio ani�nica o cati�nica (tal como una columna de ácido poliasp�rtico), cromatoenfoque (“chromatofocusing”), SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también est�n disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

[0239] Tras la etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y

55 contaminantes se puede someter a una cromatograf�a de interacción hidrof�bica de pH bajo utilizando un tampón de eluci�n a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente se realiza a concentraciones bajas de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

J. Formulaciones farmacéuticas

[0240] Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos de unión a TAHO, moléculas orgánicas de unión a TAHO y/o polip�ptidos TAHO utilizados según el presente documento se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del anticuerpo, polip�ptido, oligop�ptido o molécula orgánica que tienen el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmac�uticamente aceptables 65 (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a Edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido asc�rbico y metionina; conservantes (tales como, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol but�lico o benc�lico; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y 5 m-cresol); polip�ptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; pol�meros hidrof�licos, tales como polivinilpirrolidona; amino�cidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosac�ridos, disac�ridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; tonificantes, tales como terhalosa y cloruro sádico; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensoactivos, tales

10 como polisorbato; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEENTM, PLURONICSTM o polietilenglicol (PEG). El anticuerpo comprende preferiblemente el anticuerpo a una concentración entre 5 y 200 mg/ml, preferiblemente entre 10 y 100 mg/ml.

15 [0241] La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre s�. Por ejemplo, además del anticuerpo anti-TAHO puede ser deseable incluir en la formulación un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAHO que se une a un ep�topo diferente en el polip�ptido TAHO, o un anticuerpo para alguna otra diana, tal como un factor de crecimiento que

20 afecta al crecimiento del cáncer concreto. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterap�utico, un agente citot�xico, una citoquina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente anti-hormonal, y/o un cardioprotector. Dichas moléculas est�n presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.

25 [0242] Los principios activos también pueden estar contenidos en microc�psulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervaci�n o mediante polimerizaci�n entre fases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microc�psulas de gelatina y microc�psulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopart�culas y nanoc�psulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a Edición, Osol, A.

30 Ed. (1980).

[0243] Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de pol�meros hidrof�bicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices est�n en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microc�psulas. Entre

35 los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poli�steres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polil�ctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copol�meros de ácido Lglut�mico y γ-etil-L-glutamato, copol�meros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copol�meros de ácido l�ctico�cido glic�lico degradables, tales como el LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copol�mero de ácido l�ctico-ácido glic�lico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibut�rico.

40 [0244] Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

K. Tratamiento con anticuerpos Anti-TAHO, oligop�ptidos de unión a TAHO y moléculas orgánicas de unión a TAHO

45 [0245] Para determinar la expresión de TAHO en el cáncer, est�n disponibles varios ensayos de detección. En una realización, la sobreexpresi�n del polip�ptido TAHO puede analizarse mediante immunohistoqu�mica (IHC). Las secciones de tejido bañadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo IHC y acordarse unos criterios de intensidad de tinción de la proteína TAHO tal y como se indica a continuación:

50 Valoración 0 – no se observa tinción o tinción de membrana en menos del 10% de células tumorales. Valoración 1+ - se detecta una tinción de membrana débil/apenas perceptible en más del 10% de las células tumorales. Las células sólo se tiñen en parte de sus membranas. Valoración 2+ - se observa una tinción de membrana completa de débil a moderada en más del 10% de las células tumorales.

55 Valoración 3+ - se observa una tinción de membrana completa de moderada a fuerte en más del 10% de las células tumorales.

[0246] Los tumores con una valoración 0 � 1+ para la expresión de polip�ptido TAHO pueden caracterizarse como que no sobreexpresan TAHO, mientras que los tumores con resultados 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que

60 sobreexpresan TAHO.

[0247] Alternativamente, o adicionalmente, pueden realizarse ensayos FISH tal como el INFORM� (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION� (Vysis, Illinois) en tejido tumoral fijado a formalina y bañado en parafina para determinar el grado (si la hay) de sobreexpresi�n de TAHO en el tumor.

65 [0248] Puede evaluarse la amplificación o la sobreexpresi�n de TAHO utilizando un ensayo de detección in vivo, por ejemplo, mediante la administración de una molécula (como un anticuerpo, un oligop�ptido o una molécula orgánica) que une a la molécula a detectar y que est� marcado con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o una marca fluorescente) y escaneando externamente el paciente para la localización de la marca.

5 [0249] Tal y como se describe anteriormente, los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos y moléculas orgánicas tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos y moléculas orgánicas pueden ser útiles para destacar los c�nceres que expresan los polip�ptidos TAHO (por ejemplo, en radioimagen). Los anticuerpos, oligop�ptidos y moléculas orgánicas también son útiles para la purificación o la inmunoprecipitaci�n de polip�ptido TAHO a partir de células, para la detección y la cuantificación de polip�ptido TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western, para matar o eliminar células que expresan TAHO de una población de células mezcladas como una etapa en la purificación de las otras células.

[0250] Actualmente, dependiendo del estadio del cáncer, el tratamiento del cáncer implica una o una combinación

15 de las siguientes terapias: cirugía para eliminar el tejido canceroso, radioterapia, y quimioterapia. La terapia con anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica puede ser deseable especialmente en pacientes ancianos que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedad metast�sica donde la radioterapia tiene una utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos y moléculas orgánicas que reconocen el tumor son útiles para paliar los c�nceres que expresan TAHO tras su diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAHO puede utilizarse solo, o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiogenes, o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo anti-TAHO puede administrarse conjuntamente con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre- o post-convencional. Se utilizan fármacos quimioterap�uticos como TAXOTERE� (docetaxel), TAXOL� (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona en

25 el tratamiento del cáncer, en concreto, en pacientes con riesgo. En los medicamentos actuales de la aplicación para tratar o paliar el cáncer, a los pacientes de cáncer se les puede administrar anticuerpo anti-TAHO conjuntamente con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterap�uticos anteriores. En concreto, se contempla la terapia de combinación con paclictaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517). Se administrar� el anticuerpo anti-TAHO con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterap�utico. En otra realización, se administra el anticuerpo anti-TAHO conjuntamente con quimioterapia para potenciar la actividad y la eficacia del agente quimioterap�utico, por ejemplo, paclitaxel. La Physicians’ Desk Reference (PDR) describe dosis de estos agentes que han sido utilizados en el tratamiento de varios c�nceres. La pauta de dosificación y las dosis de estos fármacos quimioterap�uticos anteriormente mencionados que son efectivas terapéuticamente dependerán del cáncer concreto que se trata, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares para los m�dicos con experiencia y pueden

35 ser determinados por el m�dico.

[0251] En una ejemplo particular, se administra al paciente un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica conjugado con un agente citot�xico. Preferiblemente, el inmunoconjugado unido a la proteína TAHO es internalizado por la célula, dando lugar a una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la eliminación de la célula cancerosa a la que se une. En un ejemplo preferido, el agente citot�xico reconoce o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Anteriormente se han descrito ejemplos de dichos agentes citot�xicos y se incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.

[0252] Se administran a un paciente humano anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos, moléculas orgánicas o

45 conjugados con toxinas de los mismos, según los procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, típica, o inhalaci�n. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica.

[0253] Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden, donde preferiblemente hay un periodo de tiempo a la vez que ambos (o todos) los agentes activos simultáneamente ejercen sus actividades biológicas. Preferiblemente dicha terapia combinada da lugar a un efecto terapéutico sin�rgico.

55 [0254] También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos o moléculas orgánicas, con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro ant�geno de tumor asociado con el cáncer concreto.

[0255] En otro ejemplo, los métodos de tratamiento terapéutico implican la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) anti-TAHO, oligop�ptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterap�uticos

o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministraci�n de cócteles de diferentes agentes quimioterap�uticos. Entre los agentes quimioterap�uticos se incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalano, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y

65 doxitaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y pautas de dosificación para dichos agentes quimioterap�uticos se pueden utilizar según las instrucciones de los fabricantes o tal como se determina empíricamente por el técnico en la materia. La preparación y pautas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & wilkins, Baltimore, MD (1992).

[0256] El anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica se puede combinar con un compuesto anti-hormonal, por

5 ejemplo, un compuesto anti-estr�geno, tal como tamoxifeno; una anti-progesterona, tal como onapristona (véase, EP 616 812); o un anti-andr�geno, tal como flutamida, en dosis conocidas para dichas moléculas. Cuando el cáncer a tratar es un cáncer independiente de andr�geno, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia antiandr�geno y, después de que el cáncer se convierta en independiente de andr�geno, se puede administrar al paciente el anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica (y opcionalmente otros agentes tal como se describen en el presente documento).

[0257] A veces, puede ser beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para evitar o reducir la disfunción mioc�rdica asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter a una extracción quirúrgica de células cancerosas y/o terapia de radiación,

15 antes, simultáneamente o posteriormente a la terapia con anticuerpos, oligop�ptidos o moléculas org�ncias. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son aquellas utilizadas actualmente y pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica.

[0258] Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis y el modo de administración ser�n elegidos por el m�dico según criterios conocidos. La dosis apropiada de anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica depender� del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con objetivos de prevención o terapéuticos, terapia previa, el historial cl�nico del paciente y la respuesta al anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica, y el criterio del m�dico 25 responsable. El anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Preferiblemente, el anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica se administra mediante perfusi�n intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 μg/kg hasta 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, mediante, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una pauta de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAHO. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. Una dosis diaria habitual podría variar desde, aproximadamente, 1 μg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o

35 más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar la desaparición deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia se puede monitorizar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales y en base a criterios conocidos para el m�dico u otras personas expertas.

[0259] A parte de la administración de la proteína anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia g�nica. Dicha administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo esta comprendida por la expresión “administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo”. Véase, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996 que se refiere al uso de la terapia g�nica para generar anticuerpos intracelulares.

45 [0260] Existen dos estrategias principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la liberación in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en el punto donde se necesita el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y se administran las células modificadas al paciente, ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.892.538 y 5.283.187). Existen una serie de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporaci�n, microinyecci�n, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de

55 precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado normalmente para la liberación ex vivo del gen es un retrovirus.

[0261] Entre las técnicas actuales de transferencia de ácido nucleico in vivo preferidas se incluyen la transfecci�n con vectores virales (tales como adenovirus, virus del herpes simplex I, o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol). Para una revisión de los protocolos de marcaje g�nico y terapia g�nica actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.

[0262] Los anticuerpos anti-TAHO útiles en la presente invención pueden estar en las diferentes formas

65 comprendidas por la definición de “anticuerpo” del presente documento. De este modo, los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpo o amino�cidos de secuencia nativa, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusión, se fusiona una secuencia de anticuerpo a una secuencia de polip�ptido heter�logo. Los anticuerpos se pueden modificar en la región Fc para proporcionar las funciones efectoras deseadas. Tal como se describe en detalle en las secciones del presente documento, con las regiones Fc

5 apropiadas, el anticuerpo desnudo unido en la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o mediante el reclutamiento de complemento en citotoxicidad dependiente de complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, se pueden utilizar algunas otras regiones Fc cuando es deseable eliminar o reducir la función efectora para minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas.

[0263] En una realización, el anticuerpo compite por la unión o por unirse sustancialmente al mismo ep�topo que los anticuerpos útiles en la presente invención. También se contemplan los anticuerpos que tienen características biológicas de los presentes anticuerpos anti-TAHO útiles en la presente invención, específicamente incluyendo el reconocimiento de tumores in vivo y cualquier inhibición de proliferaci�n celular o car�cter�sticas citot�xicas.

15 [0264] Los procedimientos para producer los anticuerpos anteriores se describen en detalle aquí.

[0265] Los presentes anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos y moléculas orgánicas son útiles para tratar cáncer que expresa TAHO o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Dicho cáncer incluye, pero sin limitación, c�nceres hematopoy�ticos o c�nceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma o tumores linfoides, pero también c�nceres del bazo y c�nceres de los nódulos linfáticos. Ejemplos más particulares de dichos c�nceres asociados a células B incluyen, por ejemplo, linfomas de grado alto, medio y bajo (incluyendo linfomas de células B, tales como, por ejemplo, linfoma de células B de tejido linfoide asociado a la mucosa y linfoma no de Hodgkin, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfoc�tico pequeño, linfoma de la zona marginal, 25 linfoma difuso de célula grande, linfoma folicular, y linfoma de Hodgkin y linfomas de células T), y leucemias (incluyendo leucemia secundaria, leucemia linfoc�tica crónica, tal como leucemia de células B (linfocitos B CD5+), leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide agudo, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfobl�stica aguda y mielodisplasia), mieloma múltiple, tal como tumores de células plasm�ticas, y otros c�nceres hematol�gicos y/o asociados con células B o células T. Los c�nceres comprenden c�nceres metast�ticos de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica es capaz de unirse a por lo menos una parte de las células cancerosas que expresan el polip�ptido TAHO en el mamífero. En un ejemplo preferido, el anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica es eficaz para destruir o matar células tumorales que expresan TAHO o para inhibir el crecimiento de dichas células tumorales, in vitro o in vivo, tras la unión al polip�ptido TAHO en la célula. Dicho anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAHO desnudo (no conjugado a ningún agente). Los anticuerpos

35 desnudos que tienen propiedades citot�xicas o de inhibición del crecimiento se pueden emplear con un agente citot�xico para hacerlos incluso más potentes en la destrucción de células tumorales. Las propiedades citot�xicas se pueden conferir a un anticuerpo anti-TAHO mediante, por ejemplo, la conjugación del anticuerpo con un agente citot�xico, para formar un inmunoconjugado tal como se describe en el presente documento. El agente citot�xico o el agente inhibidor del crecimiento es preferiblemente una molécula pequeña. Son preferibles las toxinas, tales como caliqueamicina o un maitansinoide y análogos o derivados de los mismos.

[0266] También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica y un portador, y un portador. Para los objetivos del tratamiento del cáncer, las composiciones se pueden administrar al paciente con necesidad de dicho tratamiento, en el que la composición

45 puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAHO presentes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una ejemplo adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligop�ptidos o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como agentes citot�xicos o inhibidores del crecimiento, incluyendo agentes quimioterap�uticos. También se describen en el presente documento formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica de la invención y un portador. En un ejemplo, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmac�uticamente aceptable.

[0267] También se describen en el presente documento ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-TAHO. Se comprenden ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L y especialmente los residuos de la región

55 hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa, as� como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo.

[0268] También se describen procedimientos útiles para tratar un cáncer que expresa el polip�ptido TAHO o que alivia uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica se pueden administrar a corto plazo (agudo) o crónico, o intermitente según indique el m�dico. Además, se proporcionan procedimientos de inhibición del crecimiento y cit�lisis de una célula que expresa el polip�ptido TAHO.

65 [0269] También se describen kits y artículos de fabricación que comprenden por lo menos un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica. Los kits que contienen anticuerpos anti-TAHO, oligop�ptidos o moléculas orgánicas son útiles, por ejemplo, para ensayos de cit�lisis de células TAHO, para la purificación o inmunoprecipitaci�n de polip�ptido TAHO a partir de las células. Por ejemplo, para el aislamiento y purificación de TAHO, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica acoplados a esferas (por ejemplo, esferas de sefarosa). Los kits se pueden disponer conteniendo anticuerpos, oligop�ptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo, oligop�ptido o molécula orgánica útil para la detección se pueden disponer con un marcador, tal como un fluorescente o radiomarcador.

L. Artículos de fabricación y kits

[0270] También se describe un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento del cáncer que expresa anti-TAHO. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento del cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica de la solicitud. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento del cáncer. La etiqueta o prospecto comprenderán además instrucciones para administrar una composición con el anticuerpo, el oligop�ptido o la molécula orgánica al paciente con cáncer. Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmac�uticamente aceptable, tal como agua bacteriost�tica para inyección (BWFI), una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

[0271] También se proporcionan kits que son útiles para varios objetivos, por ejemplo, para ensayos para matar células que expresan TAHO, para la purificación o inmunoprecipitaci�n de polip�ptido TAHO a partir de células. Para el aislamiento y purificación de polip�ptido TAHO, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica acoplada a esferas (por ejemplo, esferas de sefarosa). Los kits se pueden disponer conteniendo los anticuerpos, oligop�ptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de polip�ptido TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociados con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-TAHO, oligop�ptido o molécula orgánica de la solicitud. Se pueden incluir recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes, tampones y anticuerpos de control. La etiqueta

o prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición, as� como instrucciones para el uso in vitro pretendido o de uso.

M.

Usos de polip�ptidos TAHO y ácidos nucleicos que codifican polip�ptidos TAHO

[0272] Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican los polip�ptidos TAHO tienen diferentes aplicaciones en el campo de biología molecular, incluyendo usos tales como sondas de hibridación, en la localización en cromosomas y genes y en la generación de sondas de ARN y ADN no codificante. El ácido nucleico que codifica TAHO también ser� útil para la preparación de los polip�ptidos TAHO mediante técnicas recombinantes descritas aquí, donde estos polip�ptidos TAHO pueden ser útiles, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos anti-TAHO tal como se describen aquí.

[0273] Se puede usar el gen de TAHO de secuencia nativa y longitud completa, o partes del mismo, como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de TAHO de longitud completa o para aislar otros ADNcs (por ejemplo, aquellos que codifican variantes naturales de TAHO o TAHO de otras especias) que tienen una identidad de secuencia deseada con la secuencia de TAHO nativa descrita aquí. Opcionalmente, la longitud de las sondas ser� de aproximadamente entre 20 y aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivar de regiones por lo menos parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud nativa, donde estas regiones pueden determinarse sin una experimentación excesiva o partir de las secuencias gen�micas incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones de la secuencia nativa de TAHO. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprender� aislar la región codificante del gen de TAHO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Se puede marcar las sondas de hibridación con una variedad de marcadores, incluyendo radionucle�tidos tales como 32P o 35S o marcadores enzim�ticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidita/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de TAHO de la presente solicitud se pueden usar para cribar las bibliotecas de ADNc humano, ADN gen�mico o ANRm para determinar a qué miembros de estas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen detalladamente en los Ejemplos más abajo. De manera similar se puede emplear como sonda cualquiera de las secuencias EST descritas en la presente solicitud usando los procedimientos descritos aquí.

[0274] Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican TAHO incluyen oligonucle�tidos codificantes o no codificantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico (o ARN o ADN) de cadena única capaz de unirse a las secuencias diana de ARNm de TAHO (codificante) o de ADN de TAHO (no codificante). Los oligonucle�tidos no codificantes o codificantes, según la presente solicitud, comprenden un fragmento de la región codificante del ADN de TAHO. Dicho fragmento generalmente comprende por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente entre 14 y 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucle�tido codificante o no codificante, en base a una secuencia de ADNc que codifica una proteína determinada se describe, por ejemplo, en Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y Van der Krol et al. (Bio Techniques 6:958, 1988).

[0275] La unión de oligonucle�tidos codificantes o no codificantes a las secuencias de ácido nucleico diana da lugar a la formación de cadenas dobles que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno de una serie de medios, incluyendo la mayor degradación de las cadenas dobles, la terminación prematura de la trascripción o la traducción, o mediante otros medios. Dichos procedimientos se describen en la presente solicitud. Los oligonucle�tidos no codificantes se pueden usar por tanto para bloquear la expresión de proteínas TAHO, donde dichas proteínas TAHO pueden jugar un papel en la inducción del cáncer en mamíferos. Los oligonucle�tidos codificantes o no codificantes comprenden además oligonucle�tidos que tienen esqueletos de azúcar-fosfodi�ster modificados (u otras uniones a azúcares, tales como las descritos en WO 91/06629) y donde dichas uniones a azúcares son resistentes a nucleasas end�genas. Dichos oligonucle�tidos con uniones a azúcares resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzim�tica), pero retienen la especificidad de secuencia para poder unirse a las secuencias de nucleótidos diana.

[0276] Las zonas intrag�nicas preferidas para la unión no codificante incluyen la región que incorpora el cod�n de inicio/comienzo de la traducción (5’-AUG, 5’-ATG) o el cod�n de terminación/parada (5’-UAA, 5’-UAG y 5-UAG/5’-TAA, 5’-TAG y 5’-TGA) del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una parte del ANRm

o gen que abarca aproximadamente entre 25 y aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) desde un cod�n de inicio o terminación de la traducción. Otras regiones preferidas para la unión no codificante incluyen: intrones; exones; uniones intr�n-ex�n; el marco de lectura abierto (ORF) o “región codificante”, que es la zona entre el cod�n de inicio de la traducción y el cod�n de terminación de la traducción; la caperuza (“cap”) en 5’ de un ARNm que comprende un residuo de guanosina de metilado en N7 unido al residuo 5’ del ANRm a través de una unión de trifosfato 5’-5’ e incluye la propia estructura de caperuza en 5’, as� como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la caperuza; la región 5’ no traducida (5’UTC); la parte de un ANRm en la dirección 5’ desde el cod�n de inicio de la traducción, y de este modo incluyendo nucleótidos entre el sitio de la caperuza en 5’ y el cod�n de inicio de la traducción de un ANRm o los nucleótidos correspondientes en el gen; y la región 3’ no traducida (3’UTR), la parte de un ANRm en la dirección 3’ desde el cod�n de terminación de la traducción, y de este modo incluyendo los nucleótidos entre el cod�n de terminación de la traducción y el extremo 3’ de un ANRm o los nucleótidos correspondientes en el gen.

[0277] Entre los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de proteínas TAHO se incluyen oligonucle�tidos que contienen esqueletos modificados o uniones entre nucle�sidos no naturales. Los oligonucle�tidos que presentan esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los objetivos de esta memoria, y tal como se hace referencia a veces en la técnica, los oligonucle�tidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto entre nucle�sidos también pueden considerarse como oligonucle�sidos. Entre los esqueletos de oligonucle�tidos modificados preferidos se incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotri�steres, aminoalquilfosfotri�steres, fosofnatos de metilo y otros alquilos, incluyendo 3’-alquileno fosfonatos, 5’-alquileno fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3’-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotri�steres, selenofosfatos y borano-fosfatos que tienen uniones normales 3’-5’, análogos de estos unidos por 2’-5’, y los que tienen una polaridad invertida, donde una o más uniones entre nucleótidos son una unión 3’ a 3’, 5’ a 5’ o 2’ a 2’. Los oligonucle�tidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden una única unión 3’ a 3’en la unión entre nucleótidos en 3’, es decir un residuo de nucle�diso invertido único que puede ser ab�sico (falta la nucleobaseo tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas ácidas libres. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de uniones que contienen fósforo incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050.

[0278] Los esqueletos de oligonucle�tidos preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos presentan esqueletos que est�n formados por uniones ente nucle�sidos con alquilos de cadena corta o cicloalquilo, hetero�tomos mezclados y uniones entre nucle�sidos con alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones entre nucle�sidos heteroat�micas o heteroc�clicas de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen uniones morfolino (formadas en parte a partir de la parte de azúcar de un nucle�sido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulf�xido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes con componentes N, O, S y CH2 mezclados. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos oligonucle�tidos incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,5 62; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439.

[0279] En otros oligonucle�tidos no codificantes preferidos, la unión de tanto del azúcar como ente nucle�sidos, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleótidos se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades de las bases se mantienen para la hibridación con un compuesto de ácidos nucleicos diana apropiado. A uno de dichos compuestos oligom�ricos, un oligonucl�otido mimético que se ha observado que tiene propiedades de hibridación excelentes, se hace referencia como ácido nucleico de p�ptido (PNA). En los compuestos PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucle�tido se sustituye por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases se mantienen y est�n unidas directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte amida del esqueleto. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos PNa incluyen, pero sin limitación, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Más sobre los compuestos PNA se puede encontrar en Nielsen et al, Science, 1991, 254, 1497-1500.

[0280] Los oligonucle�tidos no codificantes preferidos incorporan esqueletos de fosforotioato y/o esqueletos de hetero�tomos, y en particular, -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocido como esqueleto metilen (metilimino)

o MMI], -CHO-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH)-CH2-CH2- [donde el esuqeleto de fosfodi�ster nativo est� representado como -O-P-O-CH2-] descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,489,677 indicada anteriormente, y los esqueletos de amida de la Patente de Estados Unidos No. 5,602,240 indicada anteriormente. También se prefieren oligonucle�tidos no codificantes que tienen estructuras de esqueeto de morfolino de la Patente de Estados Unidos No. 5,034,506 indicada anteriormente.

[0281] los oligonucle�tidos modificados también pueden contener uno o más grupos azúcar sustituidos. Los oligonucle�tidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: OH; F; O-alquil, S-alquil, o N-alquil; O-alquenil, S-alquenil, o N-alquenil; O-alquinil, S-alquinil o N-alquinil; o O-alquil-O-alquil, donde el alquil, alquenil y alquinil pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Particularmente preferidos son O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucle�tidos no codificantes preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo divisor de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocin�ticas de un oligonucle�tido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodin�micas de un oligonucle�tido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2’-metoxietoxi (2’-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2’-O-(2-metoxietilo) o 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486504) es decir, un grupo alcoxialcoxi group. Una modificación adicional incluye 2’-dimetilaminooxietoxi, es decir un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2’-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos siguientes, y 2’dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2’-O-dimetilaminoetoxietilo o 2’-DMAEOE), es decir, 2’O-CH2-O-CH2-N(CH2).

[0282] Una modificación preferida adicional incluye ácidos Nucleicos Cerrados (LNAs) en los que el grupo 2’hidroxilo se une al átomo de carbono 3’ � 4’ del anillo de azúcar formando as� un grupo de azúcares bic�clicos. La unión es preferiblemente un grupo metileno (-CH2-)n que une el átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4’, donde n es 1 � 2. Los LNAs y la preparación de los mismos se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226.

[0283] Otras modificaicones preferidas incluyen 2’-metoxi (2’-O-CH3), 2’-aminopropoxi (2’-OCH2CH2CH2 NH2), 2’-alil (2’-CH2-CH=CH2), 2’-O-alil (2’-O-CH2-CH=CH2) y 2’-fluoro (2’-F). La modificación en 2’ puede ser en la posición arabino (arriba) o la posición ribo (abajo). Una modificación 2’-arabino preferida es 2’-F. También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucle�tido, particularmente en la posición 3’ del azúcar en el nucleótidos 3’ terminal o en oligonucle�tidos unidos 2’-5’ y la posición 5’ del nucleótido terminal 5’. Los oligonucle�tidos también pueden tener miméticos de azúcares, tales como grupos ciclobutilo en lugar de azúcares pentofuranosilo. Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcares modificados incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920.

[0284] Los oligonucle�tidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo referidos en la técnica simplemente como “bases”). Tal como se utiliza aquí, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases pur�nicas adenina (A) y guanina (G) y las bases primid�nicas timina (T), citosina (C) y uracil (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5- halouracil y citosina, 5-propinil (-C≡C-CH3 o -CH2-C≡CH) uracil y cytosine y otros derivados alquinilo de bases pirimid�nicas, 6-azo uracil, citosina y timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustitutidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uraciles y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tric�clicas, tales como fenoxazin citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)ona), fenotiazin citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G, tales como una fenoxazin citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido [5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2Hpirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3’,2’:4,5]pirrol[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base pur�nica o pirimid�nica se sustituye por otros heterociclos, por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Más nucleobases incluyen las descritas en la patente de Estados Unidos No. 3,687,808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligom�ricos de la solicitud. Enter éstas se incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2aminopropiladenina, 5-propiniluracil y 5-propinilcitosina. Se ha observado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de las dobles cadenas de ácido nucleico en 0,6-1,2 grados C. (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones de bases preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de los �zucares 2’-O-metoxietil. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero sin limitación, Patente de Estados Unidos No. 3,687,808, as� como las Patentes de estados Unidos No.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,583; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692.

[0285] Otra modificación de oligonucle�tidos no codificantes que se unen químicamente a uno o más grupos del oligonucle�tido o conjugados que aumentan la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucle�tido. Los compuestos de la solicitud pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales, tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la solicitud incluyen intercaladotes, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poli�teres, grupos que aumentan las propiedades farmacodin�micas de olig�meros y grupos que aumentan las propiedades farmacocin�ticas de los olig�meros. Los grupos conjugados t�picos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos cati�nicos, fosfol�pidos, fosfol�pidos cati�nicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresce�nas, rodaminas, coumarinas y colorantes. Los grupos que aumentan las propiedades farmacod�n�micas, en este contexto de la solicitud, incluye grupos que mejoran la captación del olig�mero, aumentan la resistencia del olig�mero a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con ARN. Los grupos que aumentan las propiedades farmacocin�ticas, en este contexto de la solicitud, incluyen grupos que mejoran la capataci�n, distribución, metabolismo o excreci�n de olig�mero. Los grupos conjugados incluyen, pero sin limitación, grupos lip�dicos, tales como un grupo colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tio�ter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alif�tica, por ejemplo, dodecandiol

o residuos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfol�pido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 36513654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un grupo palmitil (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229237), o un grupo octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucle�tidos de la solicitud también se pueden conjugar a sustancias farmacol�gica activas, por ejemplo, aspirina, warfarin, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufen�mico, ácido fol�nico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiab�tico, un antibacteriano o un antibiótico. Los cojugados oligonucle�tidof�rmaco y su preparación se describen en la solicitud de Patente de Estados Unidos Ser. No. 09/334,130 (presentada el 15 Junio de 1999) y las patentes de Estados Unidos Nos.: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,243,022; 5,254,469; 3,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 3,292,873; 5,317,098; 3,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941.

[0286] No es necesario que todas las posiciones de un compuesto determinado se modifiquen uniformemente, y de hecho, se pueden incorporar más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un único compuesto

o incluso en un único nucle�sido en un oligonucle�tido. La presente solicitud también describe compuestos no codificantes que con compuestos quiméricos. Los compuestos no codificantes “quiméricos” o “quimeras”, en el contexto de esta solicitud, son compuestos no codificantes, particularmente oligonucle�tidos, que contiene dos o más regiones químicamente distintas, cada una formada por por lo menos una unidad monom�rica, es decir, un

nucle�tidos en el caso de un compuesto oligonucle�tido. Estos oligonucle�tidos contienen habitualmente por lo menos una región en la que se modifica el oligonucle�tido para conferir al oligonucle�tido una mayor resistencia a la degradación por nucleasa, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucle�tido puede servir como sustrato para enzimas capaces de dividir los híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARnasa H es una endonucleasa celular que divide la cadena de ARN de la cadena doble ARN:ADN. La activación de ARNasa H, por tanto, da lugar a la división del ARN diana, aumentando ampliamente as� la eficacia de la inhibición de oligonucle�tidos de la expresión g�nica. Consecuentemente, se pueden obtener a menudo resultados comparables con oligonucle�tidos más cortos cuando se utilizan oligonucle�tidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucle�tidos fosforotioato que se hibridan a la misma región diana. Los compuestos no codificantes quiméricos se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucle�tidos, oligonucle�tidos modificados, miméticos de oligonucle�sidos y/o oligonucle�tidos tal como se han descrito anteriormente. Los oligonucle�tidos no codificantes quiméricos preferidos incorporan por lo menos una azúcar modificado en 2’ (preferiblemente 2’-O-(CH2)2-O-CH3) en el extremo 3’ terminal para conferir resistencia a la nucleasa y una región con por lo menos 4 azúcares 2’-H contiguas para conferir la actividad de ARNasa H. Dichos compuestos también se refieren en la técnica como híbridos o espaci�meros (“gapmers”). Los “gapmers” preferidos tienen una región de azúcares modificados en 2’ (2’-O-(CH2)2-O-CH3) en el extremo 3’ terminal y el extremo 5’ terminal separados por por lo menos una región que tiene por lo menos 4 azúcares 2’-H contiguos y preferiblemente incorporan uniones de la estructura de fosforotioato. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero sin limitación, las patentes de Estados Unidos Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,978; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; S, 652,355; 5,652,356; y 5,700,922.

[0287] Los compuestos no codificantes se pueden fabricar convenientemente y rutinariamente a través de la técnica conocida de la síntesis de fase sólida. El equipo para dicha síntesis es comercializado por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Se puede utilizar, adicional o alternativamente, cualquier otro medio para dicha síntesis conocida en la técnica. Se conoce que se utilizan técnicas similares para preparar oligonucle�tidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos también se pueden mezclar, encapsular, conjugar o en cualquier caso asociarse con otras moléculas, estructurales moleculares o mezclas de compuestos, tales como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, típicas u otras, para ayudar e la captación, distribución, y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas formulaciones auxiliares de captación, distribución y/o absorción incluyen, pero sin limitación, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,321,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020;5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; S,S 1Z,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756.

[0288] Otros ejemplos de oligonucle�tidos codificante o no codificantes incluyen aquellos oligonucle�tidos que est�n unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del oligonucle�tido por una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Además, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos met�licos, se pueden unir a oligonucle�tidos codificantes o no codificantes para modificar las especificidades de unión del oligonucle�tido codificante o no codificante por la secuencia de nucleótidos diana.

[0289] Los oligonucle�tido no codificantes o codificante se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia g�nica, incluyendo, por ejemplo, la electroporaci�n de transfecci�n de ADN mediada por CaPO4, o mediante la utilización de vectores de transferencia g�nica, tales como el virus Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, se inserta un oligonucle�tido no codificante o codificante en un vector retroviral adecuado. Se pone en contacto una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana con el vector retroviral recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovirales adecuados se incluyen, pero sin limitación, los derivados de los retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de la doble copia designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641).

[0290] Los oligonucle�tidos codificante o no codificantes también se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero sin limitación, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando de unirse a su molécula o receptor correspondiente, o de bloquear la entrada del oligonucle�tido codificante o no codificante o su conjugado en la célula.

[0291] Alternativamente, un oligonucle�tido codificante o no codificante se puede introducir en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucle�tido-lípido, tal como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucle�tido codificante o no codificante-lípido se disocia preferiblemente en la célula mediante una lipasa end�gena.

[0292] Las moléculas ARN o AND no codificante o codificantes tienen generalmente por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165,170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, � 1000 nucleótidos de longitud, donde en este contexto el término “aproximadamente” significa la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia más o menos 10% de esa longitud de referencia.

[0293] Las sondas se pueden emplear en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para identificar secuencias codificantes de TAHO estrechamente relacionadas.

[0294] Las secuencias de nucleótidos que codifican TAHO se pueden usar además para construir sondas de hibridación para la localización del gen que codifica este polip�ptido TAHO y para el análisis genético de individuos con alteraciones genéticas. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención se pueden usar para la localización de un cromosoma y regiones específicas del cromosoma usando técnicas conocidas como la hibridación in situ, análisis de unión frente marcadores cromos�micos conocidos y cribado de genotecas por hibridación.

[0295] Cuando las secuencias codificantes para TAHO codifican una proteína que se une a otra proteína (ejemplo, cuando el TAHO es un receptor), los TAHO se pueden usar en análisis para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones de unión se pueden usar además para cribar p�ptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la interacción de unión. Además, el receptor TAHO se puede utilizar para aislar el ligando o ligandos correlativos. Se pueden diseñar ensayos de cribado para encontrar compuestos guía que mimeticen la actividad biológica del polip�ptido TAHO nativo o un receptor para TAHO. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles para un cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para identificar candidatos farmacol�gicos de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en varios formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos celulares, caracterizados en la técnica.

[0296] Los ácidos nucleicos que codifican un polip�ptido TAHO o sus formas modificadas se pueden usar además para generar animales transg�nicos o animales "knock out" (sin un determinado gen) que a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transg�nico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transg�n, el cual fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transg�n es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir del cual se desarrolla un animal. En una realización, el ADNc que codifica un polip�ptido TAHO se puede utilizar para clonar ADN gen�mico que codifique el polip�ptido TAHO según las técnicas establecidas y las secuencias gen�micas usadas para generar los animales transg�nicos que contienen las células que expresan el ADN que codifica el polip�ptido TAHO. Los procedimientos para generar animales transg�nicos, particularmente animales como ratones

o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos No 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, las células particulares ser�n las dianas para la incorporación de un transg�n del polip�ptido TAHO con potenciadores específicos de tejido. Los animales transg�nicos que incluyen una copia de un transg�n que codifica un polip�ptido TAHO introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria se pueden usar para examinar el efecto de la expresión aumentada del ADN que codifica el polip�ptido TAHO. Dichos animales se pueden usar como animales de prueba para reactivos que se cree que confieren protección frente, por ejemplo, a estados patológicos asociados con su sobreexpresi�n. Se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida del estado patológico en comparación con los animales sin tratar que lleven el transg�n, indicaría una intervención terapéutica potencial para el estado patológico.

[0297] Alternativamente, se pueden usar homólogos no humanos de los polip�ptidos TAHO para construir un animal "knock out" para el polip�ptido TAHO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el polip�ptido TAHO como resultado de una recombinación homóloga entre el gen end�geno que codifica el polip�ptido TAHO y un ADN gen�mico alterado que codifica el polip�ptido TAHO introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, se puede utilizar ADNc que codifica un polip�ptido TAHO para clonar ADN gen�mico que codifica el polip�ptido TAHO según las técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una porción del ADN gen�mico que codifica un polip�ptido TAHO por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que se usa para controlar la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias quilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5' como en el 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea celular madre embrionaria (por ejemplo por electroporaci�n) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado hom�logamente con el ADN end�geno [ver por ejemplo, Li y col., Cell, 69: 915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal (por ejemplo, ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embrionyc Stem Cells: A Practical Approach", (Teratocarcinomas y células troncales embrionarias: Un enfoque práctico), E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), p�gs 113-125]. Un embrión quimérico se puede después implantar en un animal de crianza hembra pseudopre�ada adecuada y el embrión nace para crear un animal "knock out". La progenie que porta el ADN recombinado hom�logamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas habituales y se puede usar para criar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado hom�logamente. Los animales "knock out" se pueden caracterizar por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polip�ptido TAHO.

[0298] EL ácido nucleico que codifica los polip�ptidos TAHO también se pueden utilizar en terapia g�nica. En las aplicaciones de terapia g�nica, se introducen los genes en células con el fin de conseguir la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. “Terapia g�nica” incluye tanto la terapia g�nica convencionales en la que se consigue un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos g�nicos, lo cual implica la administración de una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Se pueden utilizar ARNs o ADNs no codificantes como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Se ha observado que se pueden importar oligonucle�tidos no codificantes cortos en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus concentraciones intracelulares bajas causadas por su captación limitada por la membrana celular. (Zamenick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83; 4143-4146 [1986]). Los oligonucle�tidos se pueden modificar para aumentar su captación, por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodi�ster cargados negativamente por grupos no cargados.

[0299] Existen una serie de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporaci�n, microinyecci�n, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, etc. Entre las técnicas actuales de transferencia de genes in vivo preferidas se incluyen la transfecci�n con vectores virales (habitualmente retrovirales) y transfecci�n mediada por liposomas recubiertos de proteína viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que reconoce las células diana, tales como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para el reconocimiento y/o facilitar la captación de, por ejemplo, proteínas c�pside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan la internalizaci�n en el ciclado, y proteínas que dirigen la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biool. Chem. 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 34103414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcaje g�nico y terapia g�nica, véase Anderson et al., Science

256: 808-813 (1992).

[0300] Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polip�ptidos TAHO o fragmentos de los mismos descritos en la presente invención son útiles para la identificación de cromosomas. En este aspecto, existe una necesidad actual para identificar nuevos marcadores cromos�micos, ya que, en base a los datos de secuencias reales, existen actualmente relativamente pocos reactivos marcadores cromos�micos. Cada molécula de ácido nucleico de TAHO de la presente invención se puede utilizar como marcador cromos�mico.

[0301] Los polip�ptidos TAHO y las moléculas de ácido nucleico de la presente solicitud también se pueden utilizar para el diagnóstico de la tipificaci�n del tejido, donde los polip�ptidos TAHO de la presente solicitud se pueden expresar diferencialmente en un tejido en comparación con otro, preferiblemente en un tejido enfermo en comparación con tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico de TAHO ser�n útiles para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western.

[0302] Esta solicitud describe procedimientos de cribado de compuestos para identificar aquellos compuestos que mimetizan el polip�ptido TAHO (agonistas) o prevenir el efecto del polip�ptido TAHO (antagonistas). Los ensayos de cribado de fármacos candidatos antagonistas est�n diseñados para identificar compuestos que se unen o forman complejos con los polip�ptidos TAHO codificados por los genes identificados aquí, o de otro modo interfieren con la interacción de los polip�ptidos codificados con otras proteínas celulares, incluyendo, por ejemplo, la inhibición de la expresión de polip�ptido TAHO a partir de células. Dichos ensayos de cribado incluirán ensayos susceptibles de cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para la identificación de pequeñas moléculas como fármacos candidatos.

[0303] Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de prote�naprote�na, ensayos de cribado bioquímicos, inmunoensayos y ensayos basados en células, que est�n bien caracterizados en la técnica.

[0304] Todos los ensayos tienen en común que requieren el contacto del fármaco candidato con un polip�ptido TAHO codificado por un ácido nucleico aquí identificado en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen.

[0305] En ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polip�ptido TAHO codificado por el gen identificado aquí o el fármaco candidato se inmovilizan sobre una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtitulaci�n, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se realiza mediante el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polip�ptido TAHO y dejándolo secar. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polip�ptido TAHO a ser inmovilizado para fijarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente fijado. Cuando la reacción se ha completado, se eliminan los componentes que no han reaccionado, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos fijados en la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado transporta un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que el complejo se ha formado. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no transporta un marcador, se puede detectar la formación del complejo, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.

[0306] Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a un polip�ptido TAHO particular codificado por un gen identificado aquí, su interacción con este polip�ptido puede ser analizada mediante procedimientos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen estrategias tradicionales, tales como el entrecruzamiento, la coinmunoprecipitaci�n, y la copurificaci�n a través de gradientes o en columnas cromatogr�ficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden controlarse utilizando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores [Fields and Song, Nature, 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)] como se describe en Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]. Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión a ADN, mientras que el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión en levaduras descrito en las publicaciones antes mencionadas (generalmente denominados como “sistema del doble híbrido”) aprovecha esta propiedad, y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana se fusiona al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1/lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4, depende de la reconstitución de la actividad GAL4 a través de la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polip�ptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromog�nico para la β-galactosidasa. Existe un kit completo (MATCHMAKERTM) disponible comercialmente por Clontech para la identificación de interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica del doble híbrido. Este sistema también puede extenderse para localizar dominios proteicos implicados en interacciones proteicas específicas, as� como para señalar los residuos de amino�cidos que son cruciales para estas interacciones.

[0307] Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polip�ptido TAHO identificado aquí y otros componentes intra o extracelulares pueden ser analizados tal como se indica a continuación: habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular en condiciones y durante un tiempo para permitir la interacción y la unión de los dos productos. Para analizar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto a analizar. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción para utilizarse como control positivo. La unión (formación del complejo) entre el compuesto a analizar y el componente intra o extracelular presente en la mezcla se controla tal como se describió anteriormente. La formación de un complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción, que contiene el compuesto a analizar indica que el compuesto a analizar interfiere con la interacción del compuesto a analizar y su pareja de reacción.

[0308] Para analizar antagonistas, el polip�ptido TAHO puede añadirse a una célula junto con el compuesto a cribar por una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polip�ptido TAHO indica que el compuesto es un antagonista del polip�ptido PRO. Alternativamente, se pueden detectar antagonistas mediante la combinación del polip�ptido TAHO y un potencial antagonista con receptores del polip�ptido TAHO unidos a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones adecuadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polip�ptido TAHO puede marcarse, mediante, por ejemplo, radioactividad, de manera que el número de moléculas del polip�ptido TAHO unidas al receptor pueden usarse para determinar la eficacia del potencial antagonista. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, “panning” de ligandos y separación por FACS. Coligan et al., Current Protocolos in Immun., 1(2): capítulo 5(1991). Preferiblemente, se emplea la clonaci�n de expresión donde se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula sensible al polip�ptido TAHO y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y se usa para transfectar células COS u otras células que no son sensibles al polip�ptido PRO. Las células transfectadas que crecen en portaobjetos de cristal se exponen al polip�ptido TAHO marcado. El polip�ptido TAHO puede marcarse mediante distintos medios incluyendo la yodaci�n o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica para un sitio. Tras la fijación e incubaci�n, los portaobjetos se someten a un análisis autorradiogr�fico. Los grupos positivos se identifican y se preparan subgrupos y se retransfectan usando un proceso interactivo de subagrupamiento y recribado, que finalmente producen un único clon que codifica el supuesto receptor.

[0309] Como estrategia alternativa para la identificación de un receptor, el polip�ptido TAHO marcado puede unirse por fotoafinidad con preparaciones de membrana o extractos celulares que expresan la molécula receptora. El material entrecruzado se resuelve por PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede cortarse, separarse en pequeños fragmentos y someterse a microsecuenciaci�n de proteínas. La secuencia de amino�cidos obtenida por microsecuenciaci�n se utilizaría para diseñar un conjunto de sondas de oligonucle�tidos degenerados para cribar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor putativo.

[0310] En otro ensayo para antagonistas, se incubar�an células de mamífero o una preparación de membrana que expresan el receptor con el polip�ptido TAHO marcado en presencia del compuesto candidato. A continuación, se podría medir la capacidad del compuesto de aumentar o bloquear esta interacción.

[0311] Ejemplos más específicos de potenciales antagonistas incluyen un oligonucle�tido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con el polip�ptido TAHO y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos antiidiot�picos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, as� como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un potencial antagonista puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polip�ptido TAHO que reconozca el receptor, pero que no ejerza ningún efecto, inhibiendo as� competitivamente la acción del polip�ptido TAHO.

[0312] Otro antagonista potencial del polip�ptido TAHO es una construcción de ARN o ADN no codificante preparada usando la tecnología no codificante, donde, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN no codificante actúa bloqueando directamente la traducción de ARNm mediante la hibridación con el ARNm diana y evitando la traducción de la proteína. La tecnología no codificante puede usarse para controlar la expresión g�nica a través de la formación de una triple hélice o del ADN o ARN no codificante, ambos procedimientos basados en la unión de un polinucle�tido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la región codificante 5’ de la secuencia de polinucle�tidos, que codifica el polip�ptido TAHO maduro de la presente invención se usa para diseñar un oligonucle�tido de ARN no codificante de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucle�tido de ADN que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice- véase, Lee et al., Nucl. Acids Res.,

6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988): Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)], evitando as� la transcripción y la producción del polip�ptido TAHO. El oligonucle�tido de ARN no codificante se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polip�ptido TAHO (no codificante-Okano, Neurochem.,

56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucle�tidos descritos anteriormente pueden también liberarse a células, de manera que el ARN o ADN no codificante puede ser expresado in vivo para inhibir la producción del polip�ptido TAHO. Cuando se usa un ADN no codificante, se prefieren oligodesoxirribonucle�tidos derivados del la región de inicio de la traducción, por ejemplo, entre las posiciones de aproximadamente -10 a +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.

[0313] Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polip�ptido TAHO, bloqueando de este modo la actividad biológica normal del polip�ptido TAHO. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas se incluyen, pero sin limitación, p�ptidos o moléculas de tipo p�ptido pequeñas, preferiblemente p�ptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no pept�dicos sintéticos.

[0314] Los ribozimas son moléculas de ARN enzim�tico capaces de catalizar la escisión específica del ARN. Las ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia con el ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleol�tica. Los sitios de escisión específicos de ribozimas en un ARN diana potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles, véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), y la publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre 1997).

[0315] Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de cadena sencilla y compuestas de desoxinucle�tidos. La composición de bases de estos oligonucle�tidos se diseña de manera que provoca la formación de una triple hélice a través de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, lo cual requiere generalmente tramos ajustables de purinas o pirimidinas en una cadena de una cadena doble. Para más detalles, véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 97/33551, supra.

[0316] estas moléculas pequeñas se pueden identificar mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos anteriormente y/o mediante cualquiera otra técnica de cribado conocida para los expertos en la materia.

[0317] El ácido nucleico codifica el polip�ptido TAHO se puede utilizar aquí para la producción recombinante de polip�ptido TAHO utilizando técnicas conocidas en el sector y tal como se describen aquí. A su vez, los polip�ptidos TAHO producidos se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-TAHO utilizando técnicas conocidas en el sector y tal como se describen aquí

[0318] Los anticuerpos que se unen específicamente a un polip�ptido TAHO identificados aquí, as� como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de cribado descritos anteriormente aquí, se pueden administrar para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo cáncer, en forma de composiciones farmacéuticas.

[0319] Si el polip�ptido TAHO es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren anticuerpos internalizantes. Sin embargo, también se pueden utilizar lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas pept�dicas que retienen la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Dichos p�ptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

[0320] La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre s�. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citot�xico, citoquina, agente quimioterap�utico, o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas se presentan de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el objetivo determinado.

[0321] Los siguientes ejemplos se ofrecen con sólo objetivos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

EJEMPLOS

[0322] Se utilizaron reactivos disponibles comercialmente en los ejemplos según las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos utilizados en los ejemplos son anticuerpos disponibles comercialmente e incluyen, pero sin limitación, anti-CD180 (eBioscience MRH73-11, BD Pharmingen G28-8) y Serotec MHR73), anti-CD20 (Ancell 2H7 y BD Pharmingen 2H7), anti-CD72 (BD Pharmingen J4-117), anti-CXCR5 (R&D Systems 51505), anti-CD22 (Ancell RFB4, DAKO To15, Diatec 157, Sigma HIB-22 y Monosan BL-BC34), anti-CD22 (Leinco RFB-4 y NeoMarkers 22C04), anti-CD21 (ATCC HB-135 y ATCC HB5), anti-HLA-DOB (BD Pharmingen DOB.L1), anti-CD79a (Caltag ZL7-4 y Serotec ZL7-4), anti-CD79b (BiomedaSN8 y BD Pharmingen CB3), anti-CD19 (Biomeda CB-19), anti-FCER2 (Ancell BU38 y Serotec D3.6 y BD Pharmingen M-L233). El origen de estas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, por los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

EJEMPLO 1: Análisis de datos por microarray de la expresión de TAHO

[0323] Los datos de microarray implican el análisis de la expresión de TAHO por la acción del análisis de microarray de ADN en una amplia variedad de muestras de ARN de tejidos y células cultivados. Las muestras incluyen tejido humano normal y canceroso y varios tipos de células inmunes purificadas ambas en reposo y posterior a la estimulaci�n externa. Estas muestras de ARN se pueden analizar según los protocolos de microarray regular en microarrays Agilent.

[0324] En este experimento, se aisl� ARN de células y se generaron sondas de ARNc marcadas con cianina-3 y cinaina-5 mediante transcripción in vitro utilizando el kit de amplificación lineal fluorescente de ARN de input bajo Agilent (Agilent). Se utilizó cianina-5 para marcar las muestras a analizar para la expresión del polip�ptido PRO, por ejemplo, el mieloma y las células plasm�ticas, y se utilizó cianina-3 para marcar la referencia universal (el grupo de líneas celulares de Stratagene) con la que se compar� la expresión de las muestras de prueba. Se hibridaron 0,1 μg0,2 mg la sonda de ARNc marcada con cianina-3 y cianina-5 con chips de grupos de oligonucle�tidos de 60 unidades Agilent utilizando el Kit de Hibridación in situ plus (Agilent). Estas sondas se hibridaron a microarrays. Para el análisis del mieloma múltiple, las sondas se hibridaron a microarrays de oligonucle�tidos de Genoma Humano Completo Agilent utilizando las condiciones y tampones estándar (Agilent) recomendados por Agilent.

[0325] Las sondas de ARNc se hibridaron a los microarrays a 60�C durante 17 horas en un centrifugador para hibridación fijado a 4 RPM. Después del lavado, se rastrearon con el escáner de microarrays Agilent que era capaz de excitar y detectar la fluorescencia de las moléculas fluorescentes de cianina-3 y cianina-5 (líneas láser a 532 y 633 nm). Los datos para cada gen en el grupo de oligonucle�tidos de 60 unidades se extrajeron de la imagen del microarray rastreado utilizando el software de extracción de características de Agilent que representa el reconocimiento de características, la sustracción del fondo y la normalización y los datos resultantes se cargaron en el paquete de software conocido como Rosetta Resolver Gene Expression Data Analysis System (Rosetta Inpharmatics, Inc.). Rosetta Resolver incluye una base de datos de relación y numerosas herramientas analíticas para guardar, extraer y analizar grandes cantidades de datos de intensidad o proporción de expresión de genes.

[0326] En este ejemplo, se obtuvieron células B y células T (control) para el análisis por microarray. Para el aislamiento de células B intactas y células B de memoria y célula plasm�ticas, se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cualquiera de los paquetes leucocitarios proporcionados por cuatro donantes masculinos sanos o de toda la sangre de varios donantes normales. Se aislaron células plasm�ticas CD138+ de PBMC utilizando el sistema de separación magnética de células MACS (Miltenyi Biotec) y esferas anti-CD138. Alternativamente, se seleccionaron las células B CD19+ totales con esferas anti-CD19 y separación MACS. Después del enriquecimiento de CD19+ (pureza del alrededor del 90%), se realizó una separación FACS (Moflo) para separar células b intactas y células B de memoria. Las células separadas se recogieron sometiendo las muestras a centrifugaci�n. Las células separadas se lisaron inmediatamente en tampón LTR y se homogeneizaron con una columna de centrifugaci�n QIAshredder (Qiagen), seguido por mini kit RNeasy para la purificación de ARN. El rendimiento de ARN fue variable de 0,4 a 10 μg y dependía del número de células.

[0327] Como control, se aislaron células T para análisis por microarray. Se aislaron células CD8 de sangre periférica de paquetes leucocitarios mediante selección negativa utilizando el kit de aislamiento de células CD8 de Stem Cell Technologies (Rosette Separation) y se purificó adicicionalmente mediante el sistema de separación magnética de células MACS utilizando el kit de aislamiento de células CD8 y se añadieron microesferas CD45RO para extraer las células CD45RO (Miltenyi Biotec). Las células T CD8 se dividieron en 3 muestras con cada muestra sometida a la estimulaci�n que se indica a continuación: (1) anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, más IL-12 y anti-IL4, (2) anti-CD3 y anti-CD29 sin añadir citoquinas o anticuerpos neutralizantes y (3) anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, más IL-4, anticuerpos anti-IL12 y anticuerpo anti-IFN-γ. 48 horas después de la estimulaci�n, se recogió el ARN. Después de 72 horas, las células se expandieron mediante la adición de una dilución de 8 veces con medio fresco. 7 días después de recoger el ARN, se recogieron las células Cd8, se lavaron y se estimularon por anti-CD3 y anti-CD28. 16 horas más tarde, se realizó una segunda recogida de ARN. 48 horas después de la reestipulaci�n, se realizó una tercera recogida de ARN. Se recogió el ARN utilizando preparaciones Qiagen Midi según las instrucciones del manual con la adición de una digestión con ADNsa en columna después de la primera etapa de lavado RW1. Se eluy� el ARN en agua libre de ARNsa y posteriormente se concentr� mediante precipitación con etanol. El ARN precipitado se tom� en agua libre de nucleasa hasta una concentración mínima final de 0,5 μg/μl.

[0328] Los microarrays de control adicionales se realizaron en ARN aislado de células T CD4+, células T auxiliares, células asesinas naturales (NK), neutr�filos (N’phil), monocitos CD14+, CD16+ y CD16- y células dendr�ticas (DC).

[0329] Se realizaron microarrays adicionales en ARN aislado de tejido canceroso, tal como Linfoma no de Hodgkin (NHL), linfoma folicular (FL) y mieloma múltiple (MM). Se realizaron microarrays adicionales en ARN aislado de células normales, tales como de nódulo linfático normal (NLN), células B normales, tales como Células B de centroblastos, centrocitos y manto folicular, células B de memoria, y células plasm�ticas normales (PC), que son del linaje de células B y son equivalentes normales de la célula de mieloma, tal como células plasm�ticas de amígdala, células plasm�ticas de médula ósea (BM PC), células plasm�ticas CD19+ (CD19+ PC), células plasm�ticas CD19(CD19- PC). Se realizaron microarrays adicionales en tejido normal, tal como cerebelo, corazón, pr�stata, glándula adrenal, vejiga, intestino delgado, colon, hígado fetal, útero, ri��n, placenta, pulmón, páncreas, músculo, cerebro, glándula salivar, médula ósea, sangre, timo, amígdala, bazo, testículos, y glándula mamaria.

[0330] Las moléculas indicadas a continuación se han identificado por expresarse de manera significativa en células B en comparación con células no B. Específicamente, las moléculas se expresan de manera diferencial en células B intactas, células B de memoria que son IgGA+ o IgM+ y células plasm�ticas de PBMC o médula ósea, en comparación con Células no B, por ejemplo células T. Por consiguiente, estas moléculas representan dianas excelentes para la terapia de tumores en mamíferos.

Mol�cula

Expresión específica en: en comparación con:

DNA88116 (TAH026)

Células B Células no B

Resumen

[0331] En la figura 91, la expresión de ARNm significativa se indicó en general como un valor de la proporción superior a 2 (eje vertical de la figura 91). En la figura 91, cualquier expresión aparente en células no B, tales como en pr�stata, bazo, etc. puede representar un artefacto, una infiltración de tejido normal mediante linfocitos o pérdida de la integridad de la muestra por el suministrador.

(19) TAHO26 (también referida en el presente documento como CD22) se expres� significativamente en células B normales (NB) (figura 91).

[0332] Como TAHO26 se ha identificado por expresarse significativamente en células B y en muestras de enfermedades asociadas a células B, tales como el linfoma no de Hodgkin, linfoma folicular y mieloma múltiple en comparación con las células no B detectado mediante análisis por microarray, la molécula es una excelente diana para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas, leucemias, mielomas y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

EJEMPLO 2: Análisis cuantitativa de la expresión de ARNm de TAHO

[0333] En este ensayo, se utilizaron un ensayo de 5’ nucleasa (por ejemplo, TaqMan�) y PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo, Mx3000P™ Real-Time PCR System (Stratagene, La Jolla, CA)), para encontrar genes que se sobreexpresan significativamente en un tipo de tejido específico, tal como células B, en comparación con un tipo de célula diferente, tal como otros tipos de glóbulos blancos primarios, y que además se pueden sobreexpresar en células cancerosas del tipo de tejido específico en comparación con células no cancerosas del tipo de tejido específico. La reacción del ensayo de 5’ nucleasa es una técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad de 5’ exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para controlar la expresión g�nica a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de oligonucle�tidos (cuyas secuencias se basan en el gen o la secuencia EST de interés) para generar un amplic�n t�pico de una reacción de PCR. Se diseña un tercer oligonucle�tidos, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extendible por la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente desactivador. Cualquier emisión inducida por láser del colorante informador es desactivado por el colorante desactivador cuando los dos colorantes se encuentran próximos al estar en la sonda. Durante la reacción de amplificación con PCR, la enzima Taq ADN polimerasa divide la sonda de una forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución y la señal del colorante informador liberado est� libre del efecto desactivador del segundo fluor�foro. Se libera una molécula del colorante informador para cada nueva molécula sintetizada y la detección del colorante informador no desactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

[0334] El procedimiento de 5’ nucleasa se desarrolla en un dispositivo de PCR cuantitativo a tiempo real, tal como el Mx3000™ Real-Time PCR System. El sistema consiste en un termociclador, una lámpara de cuarzo-tungsteno, un tubo fotomultiplicador (PMT) para la detección y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el PMT. El sistema incluye software para desarrollar el instrumento y para analizar los datos. El material de partida para el cribado fue ARNm (50 ng/pocillo desarrollado por duplicado) aislado de una variedad de diferentes tipos de glóbulos blancos (Neturophil (Neutr), células asesinas naturales (NK), Células dendr�ticas (Dend.), Monocitos (Mono), células T (subgrupos CD4+ y CD8+), células madre (CD34+), as� como 20 donantes de células B separados (donantes Ids 310, 330, 357, 362, 597, 635, 816, 1012, 1013, 1020, 1072, 1074, 1075, 1076, 1077, 1086, 1096, 1098, 1109, 1112) para analizar la viabilidad del donante. Todo el ARN se adquirió comercialmente (AllCells, LLC, Berkeley, CA) y la concentración de cada uno se midió con exactitud siguiendo instrucciones. El ARNm se cuantifica de manera exacta, por ejemplo, fluorim�tricamente.

[0335] Los datos del ensayo de la 5’ nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o ciclo umbral. éste se define como el ciclo en el que la señal informadora se acumula por encima del nivel base de fluorescencia. Los valores ΔCt se utilizan como medida cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico. Como una unidad Ct corresponde a 1 ciclo de PCR o aproximadamente a un incremento relativo de 2 veces en relación al normal. Dos unidades corresponde a un incremento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponde a un incremento relativo de 8 veces y as� sucesivamente, se puede medir cuantitativamente el incremento relativo de veces en la expresión de ARNm entre dos o más tejidos diferentes. Cuanto más bajo es el valor de ct en una muestra, mayor es el número de copias de partida de ese gen en concreto. Si se incluye una curva estándar en el ensayo, la cantidad relativa de cada diana se puede extrapolar y facilita la visión de los datos ya que un número elevado de copias también presenta cantidades relativas (en oposición a un número de copias elevadas que tiene valores Ct inferiores) y también corrige cualquier variación de la regla generalizada de que 1Ct es igual a un incremento de 2 veces. Utilizando esta técnica, se han identificado las moléculas indicadas a continuación por sobreexpresarse de manera significativa (es decir, por lo menos 2 veces) en un único (o número limitado) de tejidos específicos o tipos de células específicos en comparación con un tejido o tipo de células diferente (del mismo y diferentes donantes de tejido), identific�ndose también algunas por sobreexpresarse significativamente (es decir, por lo menos 2 veces) en células cancerosas cuando se compara con células normales del tejido o tipo de célula particular y, de este modo, representan polip�ptidos diana excelentes para la terapia contra el cáncer en mamíferos.

Mol�cula

expresión específica en: en comparación con:

DNA8816 (TAHO26)

Células B Células no B

Resumen

[0336] Los niveles de expresión de TAHO26 en ARN total aislado de células B purificadas o de células B de 20 donantes de células B (310-1112) (AllCell) y promedio (Avg. B) fue significativamente superior que los respectivos niveles de expresión de TAHO26 en ARN total aislado de varios tipos de glóbulos blancos, neutr�filos (Neutr), células asesinas naturales (NK) (un subgrupo de células T), células dendr�ticas (Dend), monocitos (Mono), células T CD4+, células T CD8+, células madre CD34+ (datos no mostrados).

[0337] Por consiguiente, como TAHO26 se expresa significativamente en células B en comparación con células no B según se detecta mediante análisis TaqMan, la molécula es una excelente diana para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

EJEMPLO 4: Utilización de TAHO como sonda de hibridación

[0338] El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAHO como sonda de hibridación para, por ejemplo, la detección de la presencia de TAHO en un mamífero.

[0339] El ADN que comprende la secuencia codificante del TAHO de longitud completa o maduro tal como se describe aquí, también se puede utilizar como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que codifican variantes naturales de TAHO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas gen�micas de tejido humano.

[0340] La hibridación y el lavado de filtros que contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las siguientes condiciones de elevada astringencia. La hibridación de la sonda derivada de TAHO radiomarcada a los filtros se realiza en una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42�C durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42�C.

[0341] A continuación, se pueden identificar los ADNs que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica TAHO de secuencia nativa y longitud completa utilizando las técnicas estándar conocidas en el sector.

EJEMPLO 5: Expresión de polip�ptido de TAHO en E.coli

[0342] Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TAHO mediante la expresión recombinante en E. coli.

[0343] La secuencia de ADN que codifica TAHO se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase Bolivar et.al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluir� secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia líder poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y sitio de división para la enteroquinasa), la región codificante de TAHO, el terminador transcripcional lambda, y un gen argU.

[0344] A continuación, la mezcla de unión se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et. al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plasm�dico se puede aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la secuenciaci�n del ADN.

[0345] Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión se activa.

[0346] Después de cultivar las células durante muchas más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugaci�n. El residuo de células obtenido mediante la centrifugaci�n se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína TAHO solubilizada se puede a continuación purificar utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

[0347] El TAHO se puede expresar en E. coli en una forma etiquetada con poli-His según el procedimiento siguiente. El ADN que codifica TAHO se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contienen sitios para enzimas de restricción que corresponden con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficiente y fiable, una purificación rápida en una columna quelante de metales y la eliminación proteol�tica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR se ligan a continuación en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se desarrollan en primer lugar en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30�C con agitaci�n hasta alcanzar una D.O. de 3-5 a 600 nm. Los cultivos se diluyen entonces 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato s�dico�2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, as� como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO4 7 mM) y se desarrollan durante aproximadamente 20-30 horas a 30�C con agitaci�n. Se toman muestras para verificar la expresión mediante análisis de SDS-PAGE, y se centrifuga todo el cultivo para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelan hasta la purificación y renaturalizaci�n.

[0348] La pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5-1 l (6-10 g de sedimentos) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, tampón pH 8. Se añaden sulfito sádico sólido y tetrationato sádico hasta concentraciones finales de 0,1 M y 0,02M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a 4�C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de ciste�na bloqueados por la sulfitolizaci�n. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentr�fuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante de metales (guanidina 6M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para purificar. El extracto purificado se carga en una columna quelante Qiagen de Ni2+-NTA de 5 ml equilibrada en el tampón de la columna quelante de metal. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y guardan a 4�C. La concentración de proteínas se estima por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de amino�cidos.

[0349] Las proteína se renaturalizan diluyendo la muestra lentamente en tampón de renaturalizaci�n preparado fresco que consiste en: Tris 20 mM, pH 8,6; NaCl 0,3 M; urea 2,5 M; ciste�na 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de renaturalizaci�n se eligen para que la concentración final se encuentre entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de renaturalizaci�n se agita suavemente a 4�C durante 12-36 horas. La reacción de renaturalizaci�n se desactiva mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína renaturalizada se cromatograf�a en una columna de fase inversa Poros R1/H con un tampón móvil de TFA al 0,1% con eluci�n con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Se analizan alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 en geles de poliacrilamida-SDS y se agrupan las fracciones que contienen la proteína renaturalizada homogénea. En general, las muestras renaturalizadas de manera adecuada de la mayoría de proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo, ya que estas muestras son las más compactas con sus interiores hidrof�bicos resguardados de la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de separar las formas mal plegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

[0350] Las fracciones que contienen el polip�ptido TAHO plegada deseada se agrupan y se elimina el acetonitrilo con una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mm, pH 6,8 con cloruro sádico 0,14 M y manitol al 4% mediante di�lisis o mediante filtración en gel utilizando resinas Superfine G25 (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas de forma estéril.

[0351] Algunos de los polip�ptidos TAHo descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta o estas técnicas.

EJEMPLO 6: Expresión de TAHO en células de mamíferos

[0352] Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de TAHO mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.

[0353] El vector pRK5 (véase, EP 307.247 publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcio4nalmente, el ADN de TAHO se liga en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de TAHO utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et. al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-TAHO.

[0354] En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 1g de ADN de pRK5-[TAHO] con aproximadamente 1 1g de ADN que codifica el gen de ARN VA [Thimmappaya et. al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 1l de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl2. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 1l de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO4, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25�C. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37�C. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

[0355] Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 1Ci/ml de 35S-ciste�na y 200 μCi/ml de 35S- metionina. Tras una incubaci�n de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de centrifugaci�n y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polip�ptido TAHO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubaci�n adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.

[0356] En una técnica alternativa, se puede introducir el ADN de TAHO en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981). Las células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un matraz giratorio y se añaden 700 1g de ADN de pRK5-TAHO. En primer lugar, las células se concentran a partir del matraz giratorio mediante centrifugaci�n y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano es incubado en el residuo celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 1g/ml de insulina bovina y 0,1 1g/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y restos celulares. La muestra que contiene el TAHO expresado se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la di�lisis y/o cromatograf�a en columna.

[0357] En otra realización, puede expresarse TAHO en células CHO. El vector pRK5-TAHO puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO4 o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio puede sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia del polip�ptido TAHO, el medio de cultivo puede sustituirse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio condicionado. A continuación, el medio que contiene el TAHO expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

[0358] El TAHO etiquetado con ep�topo puede expresarse también en células CHO huéspedes. El TAHO puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subcl�n puede someterse a PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta ep�topo seleccionada, tal como una etiqueta de poli-His en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de TAHO etiquetado con poli-His puede subclonarse a continuación en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje puede realizarse, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el TAHO etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatograf�a de afinidad de quelato con Ni2+.

[0359] TAHO se puede expresar en células CHO y/o COS mediante un procedimiento transitorio o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

[0360] La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, CH2 y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada de polihis.

[0361] Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector utilizado para la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas et. al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del pl�smido tras la transfecci�n.

[0362] Se introducen doce microgramos del ADN plasm�dico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfecci�n Superfect� (Quiagen), Dosper� o Fugene� (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se desarrollan tal y como se describe en Lucas et. al., supra. Se congelan aproximadamente 3 x 107 células en una ampolla para el crecimiento y producción posterior tal y como se describe a continuación.

[0363] Las ampollas que contienen el ADN plasm�dico se descongelan mediante la colocación en un baño de agua y se mezclan mediante agitaci�n. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 1m con suero bovino fetal al 5% dialfiltrado a 0,2 1m). A continuación, las células se fraccionan en un agitador de 100 mL que contiene 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un agitador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37�C. Después de otros 2-3 días, se siembran 3 x 105 células/mL en agitadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL. El medio celular se cambia por medio fresco mediante centrifugaci�n y resuspensi�n en el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se utiliza un medio de producción descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. En un agitador de producción de 3L se siembra a razón de 1,2 x 106 células/ml. En el día 0, se determina el número de células y el pH. En el día 1, se toman muestras del agitador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras del agitador, la temperatura se cambia a 33�C, y se añaden 30 mL de glucosa 500g/L y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugaci�n y se filtra a través de un flitro de 0,22 1m. El filtrado se guarda a 4�C o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.

[0364] Para las construcciones etiquetadas de poli-his, las proteínas se purifican utilizando una columna de Ni2+-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni2+-NTA equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4�C. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrio que contiene 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80�C.

[0365] Las construcciones de inmunoadhesina (que contiene Fc) se purifican a partir del medio condicionado tal y como se indica a continuación. El medio condicionado se bombea en una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sádico, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio antes de la eluci�n con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína elu�da se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 1L de tampón Tris 1M, pH

9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciaci�n de los amino�cidos N-terminales mediante degradación Edman.

[0366] Algunos de los polip�ptidos TAHO descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta o estas técnicas.

EJEMPLO 7: Expresión de TAHO en levadura

[0367] El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de TAHO en levadura.

[0368] En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de TAHO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica TAHO y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el pl�smido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAHO. Para la secreción, el ADN que codifica TAHO puede clonarse en el pl�smido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un p�ptido señal TAHO nativo u otro p�ptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una secuencia señal/líder secretora del factor alfa o invertasa de levadura, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de TAHO.

[0369] Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los pl�smidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroac�tico al 10% y una separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.

[0370] El TAHO recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación por centrifugaci�n y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene TAHO puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatograf�a en columna seleccionadas.

[0371] Algunos de los polip�ptidos TAHO descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta o estas técnicas.

EJEMPLO 8: Expresión de TAHO en células de insectos infectadas de Baculovirus

[0372] El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante en células de insectos infectadas de Baculovirus.

[0373] La secuencia que codifica para TAHO se fusiona en dirección 5’ de un ep�topo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas ep�topo etiquetas incluyen etiquetas de poli-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una variedad de pl�smidos, incluyendo pl�smidos derivados de los pl�smidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica TAHO o la parte deseada de la secuencia codificante de TAHO, tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

[0374] El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfecci�n del pl�smido anterior y el ADN del virus BaculoGoldTM (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubaci�n a 28�C, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como se describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

[0375] A continuación, TAHO etiquetado con poli-His expresados puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatograf�a de afinidad de Ni2+-quelato tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a partir de las células recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por Rupert et. al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicaci�n (25 ml de HEPES, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl2; 0,1 mM de EDTA; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se depuran por centrifugaci�n, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 �m. Se prepara una columna de agarosa Ni2+-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A280 con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato: 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína no unidas específicamente. Después de alcanzar la línea base a A280 de nuevo, la columna se desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni2+-NTA-conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el TAHO etiquetado con His10 elu�do, respectivamente, se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.

[0376] Alternativamente, la purificación del TAHO etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatograf�a conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatograf�a en columna con Proteína A o proteína G.

[0377] Algunos de los polip�ptidos TAHO descritos aquí se han expresado de manera satisfactoria y purificado utilizando esta o estas técnicas.

EJEMPLO 9:Preparación de anticuerpos que se unen a TAHO

[0378] Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a TAHO.

[0379] Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en el sector y est�n descritas, por ejemplo, en Coding, supra. Entre los inmun�genos que se pueden utilizar se incluyen TAHO purificado, proteínas de fusión que contienen TAHO y células que expresan TAHO recombinante en la superficie celular. La selección del inmun�geno puede realizarse según el técnico en la materia sin una gran experimentación.

[0380] Los ratones, tal como Balb/c, se inmunizan con el inmun�geno de TAHO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta subcut�neamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1–100 microgramos. Alternativamente, el inmun�geno se emulsiona en el adyuvante de MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se refuerzan 10 a 12 días después con inmun�geno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas semanas, los ratones también se pueden reforzar con inyecciones de inmunizaci�n adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-TAHO.

[0381] Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales “positivos” para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de TAHO. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferaci�n de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

[0382] Las células de hibridomas se cribar�n en un ELISA para la reactividad contra inmun�geno. La determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra inmun�geno est� dentro de la técnica.

[0383] Las células de hibridomas positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para producir fluidos ascéticos que contienen los anticuerpos monoclonales anti-inmun�geno. Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces o en botellas en rodillo de cultivos de tejidos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los fluidos ascéticos se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatograf�a de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatograf�a por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

[0384] Los anticuerpos dirigidos contra algunos de los polip�ptidos TAHO descritos en el presente documento se pueden producir satisfactoriamente utilizando esta técnica o técnicas. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales funcionales que son capaces de reconocer y unirse a la proteína TAHO (medido mediante ELISA estándar, análisis de clasificación FACS y/o análisis por inmunohistoqu�mica) se pueden generar satisfactoriamente contra las siguientes proteínas TAHO descritas en el presente documento: TAHO26 (DNA88116).

[0385] Además de la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polip�ptidos TAHO descritos en el presente documento, muchos de los anticuerpos monoclonales se pueden conjugar satisfactoriamente a una toxina celular para su uso en el direccionamiento de la toxina celular a una célula (o tejido) que expresa un polip�ptido TAHO de interés (tanto in vitro como in vivo). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales derivados de la toxina (por ejemplo, DM1) se pueden generar satisfactoriamente contra los siguientes polip�ptidos TAHO descritos en el presente documento: TAHO26 (DNA88116).

EJEMPLO 10: Purificación de polip�ptidos TAHO utilizando anticuerpos específicos

[0386] Los polip�ptidos TAHO nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en las técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polip�ptido pro-TAHO, el polip�ptido TAHO maduro, o el polip�ptido pre-TAHO mediante cromatograf�a de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polip�ptido TAHO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad est� construida por acoplamientos covalentes de anticuerpos anti-polip�ptido TAHO a una resina de cromatograf�a activada.

[0387] Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). As� mismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos ascéticos de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o cromatograf�a en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatogr�fica, tal como la SEPHAROSETM activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0388] Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polip�ptido TAHO mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen polip�ptido TAHO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilizaci�n de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugaci�n diferencial por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polip�ptido TAHO soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células crecen.

[0389] Una preparación que contiene polip�ptido TAHO soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polip�ptido TAHO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polip�ptido TAHO (por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de 2-3, o una alta concentración de ca�tropo, tal como urea o i�n tiocianato), y se recoge el polip�ptido TAHO.

EJEMPLO 11: Ensayo de cit�lisis de células tumorales in Vitro

[0390] Se pueden obtener células de mamífero que expresan el polip�ptido TAHO de interés utilizando el vector de expresión estándar y técnicas de clonaci�n. Alternativamente, muchas líneas celulares tumorales que expresan polip�ptidos TAHO de interés est�n públicamente disponibles, por ejemplo, a través de la ATCC y se pueden identificar de manera rutinaria utilizando un análisis ELISA o FACS estándar. A continuación, los anticuerpos monoclonales anti-polip�ptido TAHO (disponibles comercialmente y derivados conjugados a toxina de los mismos) se pueden emplear en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para matar las células in vitro que expresan el polip�ptido TAHO.

[0391] Por ejemplo, las células que expresan el polip�ptido TAHO de interés se obtienen tal como se ha descrito anteriormente y se emplacan en placas de 96 pocillos. En un análisis, el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) se incluye en la incubaci�n celular durante un periodo de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células se incuban durante 1 hora con el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y, a continuación, se lavaron e incubaron en ausencia del conjugado anticuerpo/toxina durante un periodo de 4 días. A continuación se mide la viabilidad celular utilizando el Ensayo de viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo de Promega (Cat# G7571). Las células no tratadas sirven como control negativo.

[0392] Las líneas de células B (ARH-77, BJAB, Daudi, DOHH-2, Su-DHL-4, Raji y Ramos) se prepararon a 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de base plana estériles separadas y tratadas con cultivo de tejido (Cellstar 650185). Las células se introdujeron en un medio de ensayo (RPMI 1460, 1% L-Glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS; de Hyclone) y 10 mM HEPES). Las células se colocaron inmediatamente en un incubador a 37oC durante toda la noche. Se diluyeron conjugados de fármacos de anticuerpos (utilizando anti-CD19, anti-CD20, anti-CD21, anti-CD79A, anti-CD79B disponibles comercialmente) a 2 x 10 μg/ml en medio de ensayo. Los conjugados se unieron con reticuladores SMCC o enlazador disulfuro SPP a la toxina DM1. Además, los conjugados se pueden unir con Vc-PAB a la toxina MMAE. Los conjugados basados en herceptina (SMCC-DM1 o SPP-DM1) se utilizaron como controles negativos. Se utilizó L-DM1 libre equivalente a la dosis de carga de conjugado como control positivo. Las muestras se centrifugaron para asegurar una mezcla homogénea antes de la dilución. Los conjugados de fármacos de anticuerpos se diluyeron adicionalmente en serie 1:3. Las líneas celulares se cargaron con 50 μl de cada muestra por fila utilizando un sistema de automatización Rapidplate� 96/384 Zymark. Cuando se cargó la placa completa, las placas se reincubaron durante 3 días para permitir que las toxinas tuvieran efecto. Las reacciones se detuvieron mediante la aplicación de 100 μl/pocillo de Cell Glo (Promega, Cat. #G7571/2/3) a todos los pocillos durante 10 minutos. Los 100 μl del pocillo inactivado se transfirieron a placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido blanco, base clara (Costar 3610) y se leyó la luminiscencia y se registr� como unidades de luz relativa (RLU). Los anticuerpos TAHO para este experimento incluían anticuerpos disponibles comercialmente, incluyendo antiTAHO26/CD22 (Leinco REB-4).

Resumen

[0393] (1) Anticuerpo anti-TAH026/CD22 conjugado a toxina DM1 (CD22-SPP-DM1 y CD22-SMCC-DM1) mostr� una cit�lisis de células tumorales significativa cuando se compar� con anticuerpo anti-TAHO26/CD22 solo o anti-HER2 conjugado a toxina DM1 de control negativo (anti-HER2-SMCC-DM1) en células RAJI o RAMOS. Además, se observ� una mayor cit�lisis de células tumorales con CD22-SPP-DM1 en comparación con CD22-SMCC-DM1.

[0394] Los anticuerpo monoclonales anti-polip�ptido TAHO son útiles para reducir el crecimiento tumoral in vitro de tumores, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, Linfoma no de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

EJEMPLO 13: Immunohistoqu�mica

[0395] Para determinar la expresión en tejido de polip�ptido TAHO y para confirmar los resultados de microarray del ejemplo 1, se examin� la detección inmunohistoqu�mica de la expresión del polip�ptido TAHO en tejidos linfoides congelados bruscamente y fijados en formalina e insertados en parafina (FFPE), incluyendo amígdalas palatina, bazo, nódulo linfático y parches de Peyer del Banco de Tejidos Humanos de Genentech.

[0396] La prevalencia de la expresión de TAHO diana se evalu� en microarrays de tejido de linfoma FFPE (Cybrdi) y un panel de 24 muestras de linfoma humano congelado. Las muestras de tejido se congelaron a 5 μm, se secaron al aire y se fijaron en acetona durante 5 minutos antes de la inmunotinci�n. Los tejidos insertados en parafina se seccionaron a 5 μm y se montaron en portamuestras de microscopio SuperFrost Plus (VWR).

[0397] Para las secciones congeladas, se colocaron los portamuestras en TBST, 1% BSA y 10% de suero de caballo normal que contenía azida sádica al 0,05% durante 30 minutos, a continuación se incubaron con reactivos de un kit de bloqueo Avidina/Biotina (Vector) antes de la adición de anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios monoclonales de ratón (disponibles comercialmente) se detectaron con IgG antirat�n de caballo biotinilado (Vector), seguido de la incubaci�n en el complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC Elite, Vector) y tetrahidrocloruro de diaminobencidina potenciado con metal (DAB, Pierce). Las secciones de control se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón irrelevante coincidente de isotipo (Pharmingen) a una concentración equivalente. Tras la aplicación del reactivo ABC-HRP, las secciones se incubaron con biotinil-tiramida (Perkin Elmer) en diluyente de amplificación durante 5-10 minutos, se lavaron y se incubaron de nuevo con reactivo ABC-HRP. La detección se realizó utilizando DAB tal como se ha descrito anteriormente.

[0398] Las secciones de tejido humano FFPE se desceraron en agua destilada, se trataron con solución de extracción diana (Dako) en un baño se agua hirviendo durante 20 minutos, seguido de un periodo de enfriamiento de 20 minutos. La actividad de peroxidada end�gena residual se bloque� utilizando 1X una solución de bloqueo (KPL) durante 4 minutos. Las secciones se incubaron con reactivos de bloqueo avidina/biotina y tampón de bloqueo que contenía suero de caballo normal al 10% antes de la adición de los anticuerpos monoclonales diluidos hasta 0,5-5,0 μg/ml en tampón de bloqueo. A continuación, las secciones se incubaron secuencialmente con anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado, seguido de ABC-HRP y detección cromog�nica con DAB. Se utilizó la amplificación de la señal de tiramida, descrita anteriormente, para aumentar la sensibilidad de tinción para un conjunto de TAHO dianas (CD21, CD22, HLA-DOB).

Resumen

[0399]

(1) TAHO26 (CD22) mostr� un marcaje intenso de las células B de la zona del manto y un marcaje más débil, pero significativo, de los centros germinales detectado con un clon de anticuerpo primario RFB-4 (Leinco) en tejido de amígdala humana congelada y el clon 22C04 (Neomarkers) en tejido de amígdala humano FFPE (datos no mostrados).

[0400] Por consiguiente, en vista del patrón de expresión de TAHO26 evaluado mediante inmunohistoqu�mica en muestras de amígdala, un órgano linfoide donde se desarrollan células B, la moléculas es una diana excelente para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, Linfoma no de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

EJEMPLO 14: Citometr�a de flujo

[0401] Para determinar la expresión de moléculas TAHO, se realizó un análisis FACS utilizando una variedad de células, incluyendo células normales y células enfermas, tales como células de leucemia linfoc�tica crónica (CLL)

A. Células normales: TAHO26 (CD22)

[0402] Para los subtipos de células B de amígdalas, las amígdalas frescas se trocearon en HBSS frío y se pasaron a través de un colador de células de 70 um. Las células se lavaron una vez y se contaron. Las células B CD19+ se enriquecieron utilizando el AutoMACS (Miltenyi). Brevemente, las células de amígdalas se bloquearon con IgG humana, se incubaron con microesferas anti-CD19, y se lavaron antes de la selección positiva sobre el AutoMACS. Se guard� una fracción de células B CD19+ para el análisis citom�trico de flujo de células plasm�ticas. Las células CD19+ restantes se tiñeron con FITC-CD77, PE-IgD, y APC-CD38 para clasificar subpoblaciones de células B. El enriquecimiento de CD19+ se analizó utilizando PE-Cy5-CD19, y la pureza variaba del 94 al 98% de CD19+. Las subpoblaciones B de amígdalas se clasificaron en el MoFlo por Michael Hamilton a la velocidad de flujo de 18.00020000 células/segundo. Las células del manto folicular se recogieron como la fracción IgD/CD38-, las células B de memoria fueron IgD-/CD38-, los centrocitos fueron IgD-/CD38+/CD77-, y los centroblastos fueron IgD/CD38+/CD77+. Las células se guardaron en suero al 50% durante toda la noche, o se tiñeron y fijaron con paraformaldeh�do al 2%. Para el análisis de células plasm�ticas, se tiñeron todas las células B de amígdalas con CD138-PE, CD20-FITC, y se detect� el anticuerpo biotinilado a la diana de interés con estreptavidina-PE-Cy5. Las subpoblaciones B de amígdalas se tiñeron con anticuerpo biotinilado para la diana de interés, y se detectaron con estreptavidina-PE-Cy5. El análisis de flujo se realizó en el BD FACSCaliber, y se analizaron los datos posteriormente utilizando software FlowJo v 4.5.2 (TreeStar). Los anticuerpos conjugados con biotina que estaban disponibles comercialmente, tales como TAHO26/CD22 (RFB4 de Ancell) se utilizaron en la citometr�a de flujo.

Resumen de TAHO26 (CD22) en células normales

[0403] El patrón de expresión en los subtipos B de amígdalas clasificados se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el polip�ptido TAHO de interés. TAHO26 (CD22) (utilizando anti-CD22, RFB4 de Ancell) mostr� una expresión significativa en células B de memoria, células del manto folicular, centroblastos y centrocitos (datos no mostrados).

[0404] El patrón de expresión en las células plasm�ticas de amígdalas se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el polip�ptido TAHO de interés. TAHO26 (CD22) (utilizando anti-CD22, RFB4 de Ancell) mostr� una expresión significativa en células plasm�ticas (datos no mostrados).

[0405] Por consiguiente, a la vista del patrón de expresión de TAHO26 en subtipos B de amígdalas evaluados mediante FACS, la molécula es una diana excelente para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, Linfoma no de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

B. Células CLL: TAHO26 (CD22)

[0406] Los siguientes mAbs purificados o conjugados a fluorocromo se utilizaron para la citometr�a de flujo de muestras de CLL: CD5-PE, CD 19-PerCP Cy5.5, CD20-FITC, CD20-APC (disponible comercialmente de BD Pharmingen). Además, los anticuerpos biotinilados disponibles comercialmente contra CD22 (RFB4 de Ancell) se utilizaron para la citometr�a de flujo. Los anticuerpos CD5, CD19 y D20 se utilizaron para canalizar células B y se realizó la tinción con PI para comprobar la viabilidad celular.

[0407] Las células (106 células en un volumen de 100 ml) se incubaron en primer lugar con 1 mg de cada uno de los anticuerpos CD5, CD19 y CD20 y 10 mg de cada globulina gamma de humano y ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) para bloquear la unión no específica, a continuación se incubaron con concentraciones óptimas de mAbs durante 30 minutos en la oscuridad a 4�C. Cuando se utilizaron anticuerpos biotinilados, se añadieron a continuación estreptavidina-PE o estreptavidina-APC (Jackson ImunoResearch Laboratories) según las instrucciones de fabricación. Se realizó una citometr�a de flujo en un FACS calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Se registraron las señales de dispersi�n frontal (FSC) y dispersi�n lateral (SSC) en un modo lineal, señales de fluorescencia en modo logarítmico. Las células muertas y los residuos celulares se canalizaron utilizando las propiedades de dispersi�n de las células. Los datos se analizaron utilizando software CellQuest Pro (BD Biosciences) y FlowJo (Tree Star Inc.).

Resumen de TAHO26 (CD22) en muestras de CLL

[0408] El patrón de expresión en las muestras de CLL se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el polip�ptido TAHO de interés. TAHO26 (CD22) mostr� una expresión significativa en muestras de CLL (datos no mostrados).

[0409] Por consiguiente, en vista del patrón de expresión de TAHO26 en muestras de leucemia linfoc�tica crónica (CLL) evaluadas mediante FACS, la molécula es una diana excelente para la terapia de tumores en mamíferos incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, Linfoma no de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

Ejemplo 15: Internalizaci�n de TAHO

[0410] La internalizaci�n de los anticuerpos TAHO en líneas de células B se evaluaron en células Raji, Ramos, Daudi y otras células B, incluyendo líneas celulares ARH77, SuDHL4, U698M, huB y BJAB.

[0411] Se utilizó una placa de 15 cm “ready-to-split” de células B (~50 x 106 células) con células para su uso en hasta 20 reacciones. Las células estaban por debajo del paso 25 (menos de 8 semanas de vida) y crecieron de forma sana sin ningún micoplasma.

[0412] En un tubo Falcon de 15 ml de tapón suelto se añadieron 1 μg/ml de anticuerpo anti-TAHO de ratón a 2,5 x 106 células en 2 ml de medio de crecimiento normal (por ejemplo, RPMI/10% FBS/1% glutamina) que contenía 1:10 de bloqueo de FcR (kit MACS, dializado para eliminar la azida), 1% pen/strep, 5 PM pepstatina A, 10 μg/ml leupeptina (inhibidores de proteasas lisosomales) y 25 μg/ml Alexa488-transferrina (que marcaron el mecanismo de reciclaje e indicaron qué células estaban vivas; alternativamente se puede utilizar un marcador en fase fluida de dextrano Ax488 para marcar todos los mecanismos) durante 24 horas en un incubador con CO2 al 5% a 37oC. Para los anticuerpos de internalizaci�n rápida, se tomaron puntos de tiempo cada 5 minutos. Para los puntos de tiempo tomados en menos de 1 hora, se utilizó 1 ml de medio libre de carbonato completo (Gibco 18045-088 + 10% FBS, 1 % glutamina, 1% pen/strep, 10 mM Hepes pH 7,4) y las reacciones se realizaron en baño de agua a 37oC en lugar del incubador con CO2.

[0413] Después de completar la evolución el tiempo, las células se recogieron mediante centrifugaci�n (1500 rpm a 4oC durante 5 minutos en G6-SR o 2500 rpm a 3 minutos en una centrífuga eppendorf tipo benchtop), se lavaron una vez en 1,5 ml de medio libre de carbonato (en Eppendorfs) o 10 ml de medio para tubos Falcon de 15 ml. Las células se sometieron a una segunda centrifugaci�n y se resuspendieron en 0,5 ml de paraformaldeh�do al 3% (EMS) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la fijación de las células.

[0414] Las siguientes etapas son realizadas por un conjunto de células a través de centrifugaci�n. Las células se lavaron en PBS y a continuación se inactivaron durante 10 minutos en 0,5 ml de NH4Cl 50 mM (sigma) en PBS y se permeabilizaron con 0,5 ml de Triton-X-100 al 0,1% en PBS durante 4 minutos durante una rotación de centrifugaci�n de 4 minutos. Las células se lavaron en PBS y se sometieron a centrifugaci�n. Se a�adi� 1 μg/ml Cy3-anticuerpo anti ratón (o anti-especie 1�) para detectar la captación del anticuerpo en 200 μl de medio libre de carbonato completo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces en medio libre de carbonato y se resuspendieron en 25 μl de medio libre de carbonato y las células se dejaron reposar como una gota en un pocillo de un portamuestras LabtekII de 8 pocillos recubiertos de polilisina durante por lo menos una hora (o durante toda la noche en un frigorífico). Se aspiraron las células no unidas y se montaron los portamuestras con una gota por pocillo de Vectashield que contenía DAPI bajo un cubremuestras de 50x24 mm. Las células se examinaron bajo un objetivo de 100x para la internalizaci�n de los anticuerpos.

Resumen

[0415]

(3) TAHO26/CD22 (detectado utilizando anticuerpo anti-CD22 Leinco RFB4) se internaliz� en 5 minutos en células Raji, en 5 minutos en células Ramos, en 5 minutos en células Daudi y en 5 minutos en células ARH77 y se liber� a los lisosomas en 1 hora. TAHO26/CD22 (detectado utilizando anticuerpos anti-CD22, DAKO To15, Diatec 157, Sigma HIB-22 o Monosan BL-BC34) se internaliz� en 5 minutos en células Raji y se liber� a los lisosomas en 1 hora.

[0416] Por consiguiente, en vista de la internalizaci�n de TAHO26 en líneas celulares B evaluada mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-TAHO respectivos, la molécula es una diana excelente para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo c�nceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma No de Hodgkin), leucemias (es decir, leucemia linfoc�tica crónica), mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros c�nceres de células hematopoy�ticas.

Listado de secuencias

<110> Genentech, Inc.

<120> Composiciones y procedimientos para el tratamiento de tumores de origen hematopoyetico

<130> RXT/FP6712392

<140> Desconocido, presentado con el mismo

<141> 2004-11-16

<150> 09004091.6

<141> 2014-11-16

<150> EP04811110.8

<151> 2004-11-16

<150> PCT/us2004/038262

<151> 2004-11-16

<150> us 60/520,842

<151> 2003-11-17

<150> us 60/532,426

<151> 2003-12-24

<160> 75

<210> 1

<211> 2037

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 agtgtgatgg atatctgcag aattcgccct tatggcgttt gacgtcagct 50 gcttcttttg ggtggtgctg ttttctgccg gctgtaaagt catcacctcc 100 tgggatcaga tgtgcattga gaaagaagcc aacaaaacat ataactgtga 150 aaatttaggt ctcagtgaaa tccctgacac tctaccaaac acaacagaat 200 ttttggaatt cagctttaat tttttgccta caattcacaa tagaaccttc 250 agcagactca tgaatcttac ctttttggat ttaactaggt gccagattaa 300 ctggatacat gaagacactt ttcaaagcca tcatcaatta agcacacttg 350 tgttaactgg aaatcccctg atattcatgg cagaaacatc gcttaatggg 400 cccaagtcac tgaagcatct tttcttaatc caaacgggaa tatccaatct 450 cgagtttatt ccagtgcaca atctggaaaa cttggaaagc ttgtatcttg 500 gaagcaacca tatttcctcc attaagttcc ccaaagactt cccagcacgg 550 aatctgaaag tactggattt tcagaataat gctatacact acatctctag 600 agaagacatg aggtctctgg agcaggccat caacctaagc ctgaacttca 650

atggcaataa tgttaaaggt attgagcttg gggcttttga ttcaacggtc 700 ttccaaagtt tgaactttgg aggaactcca aatttgtctg ttatattcaa 750 tggtctgcag aactctacta ctcagtctct ctggctggga acatttgagg 800 acattgatga cgaagatatt agttcagcca tgctcaaggg actctgtgaa 850 atgtctgttg agagcctcaa cctgcaggaa caccgcttct ctgacatctc 900 atccaccaca tttcagtgct tcacccaact ccaagaattg gatctgacag 950 caactcactt gaaagggtta ccctctggga tgaagggtct gaacttgctc 1000 aagaaattag ttctcagtgt aaatcatttc gatcaattgt gtcaaatcag 1050 tgctgccaat ttcccctccc ttacacacct ctacatcaga ggcaacgtga 1100 agaaacttca ccttggtgtt ggctgcttgg agaaactagg aaaccttcag 1150 acacttgatt taagccataa tgacatagag gcttctgact gctgcagtct 1200 gcaactcaaa aacctgtccc acttgcaaac cttaaacctg agccacaatg 1250 agcctcttgg tctccagagt caggcattca aagaatgtcc tcagctagaa 1300 ctcctcgatt tggcatttac ccgcttacac attaatgctc cacaaagtcc 1350 cttccaaaac ctccatttcc ttcaggttct gaatctcact tactgcttcc 1400 ttgataccag caatcagcat cttctagcag gcctaccagt tctccggcat 1450 ctcaacttaa aagggaatca ctttcaagat gggactatca cgaagaccaa 1500 cctacttcag accgtgggca gcttggaggt tctgattttg tcctcttgtg 1550 gtctcctctc tatagaccag caagcattcc acagcttggg aaaaatgagc 1600 catgtagact taagccacaa cagcctgaca tgcgacagca ttgattctct 1650 tagccatctt aagggaatct acctcaatct ggctgccaac agcattaaca 1700 tcatctcacc ccgtctcctc cctatcttgt cccagcagag caccattaat 1750 ttaagtcata accccctgga ctgcacttgc tcgaatattc atttcttaac 1800 atggtacaaa gaaaacctgc acaaacttga aggctcggag gagaccacgt 1850 gtgcaaaccc gccatctcta aggggagtta agctatctga tgtcaagctt 1900 tcctgtggga ttacagccat aggcattttc tttctcatag tatttctatt 1950 attgttggct attctgctat tttttgcagt taaatacctt ctcaggtgga 2000 aataccaaca catttagtgc tgaaggtttc cagagaa 2037

<210> 2

<211> 660

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2 �et Ala Phe Asp �al ser Cys Phe Phe Trp �al �al �eu Phe ser 1 5 10 15

Ala Gly Cys �ys �al Ile Thr ser Trp Asp Gln �et Cys Ile Glu 20 25 30

�ys Glu Ala Asn �ys Thr Tyr Asn Cys Glu Asn �eu Gly �eu ser 35 40 45

Glu Ile Pro Asp Thr �eu Pro Asn Thr Thr Glu Phe �eu Glu Phe 50 55 60

ser Phe Asn Phe �eu Pro Thr Ile His Asn Arg Thr Phe ser Arg 65 70 75

�eu �et Asn �eu Thr Phe �eu Asp �eu Thr Arg Cys Gln Ile Asn 80 85 90

Trp Ile His Glu Asp Thr Phe Gln ser His His Gln �eu ser Thr 95 100 105

�eu �al �eu Thr Gly Asn Pro �eu Ile Phe �et Ala Glu Thr ser 110 115 120

�eu Asn Gly Pro �ys ser �eu �ys His �eu Phe �eu Ile Gln Thr 125 130 135

Gly Ile ser Asn �eu Glu Phe Ile Pro �al His Asn �eu Glu Asn 140 145 150

�eu Glu ser �eu Tyr �eu Gly ser Asn His Ile ser ser Ile �ys 155 160 165

Phe Pro �ys Asp Phe Pro Ala Arg Asn �eu �ys �al �eu Asp Phe 170 175 180

Gln Asn Asn Ala Ile His Tyr Ile ser Arg Glu Asp �et Arg ser 185 190 195

�eu Glu Gln Ala Ile Asn �eu ser �eu Asn Phe Asn Gly Asn Asn 200 205 210

�al �ys Gly Ile Glu �eu Gly Ala Phe Asp ser Thr �al Phe Gln 215 220 225

ser �eu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn �eu ser �al Ile Phe Asn 230 235 240

Gly �eu Gln Asn ser Thr Thr Gln ser �eu Trp �eu Gly Thr Phe 245 250 255

Glu Asp Ile Asp Asp Glu Asp Ile ser ser Ala �et �eu �ys Gly 260 265 270

�eu Cys Glu �et ser �al Glu ser �eu Asn �eu Gln Glu His Arg 275 280 285

Phe ser Asp Ile ser ser Thr Thr Phe Gln Cys Phe Thr Gln �eu 290 295 300

Gln Glu �eu Asp �eu Thr Ala Thr His �eu �ys Gly �eu Pro ser 305 310 315

Gly �et �ys Gly �eu Asn �eu �eu �ys �ys �eu �al �eu ser �al 320 325 330

Asn His Phe Asp Gln �eu Cys Gln Ile ser Ala Ala Asn Phe Pro 335 340 345

ser �eu Thr His �eu Tyr Ile Arg Gly Asn �al �ys �ys �eu His 350 355 360

�eu Gly �al Gly Cys �eu Glu �ys �eu Gly Asn �eu Gln Thr �eu 365 370 375

Asp �eu ser His Asn Asp Ile Glu Ala ser Asp Cys Cys ser �eu 380 385 390

Gln �eu �ys Asn �eu ser His �eu Gln Thr �eu Asn �eu ser His 395 400 405

Asn Glu Pro �eu Gly �eu Gln ser Gln Ala Phe �ys Glu Cys Pro 410 415 420

Gln �eu Glu �eu �eu Asp �eu Ala Phe Thr Arg �eu His Ile Asn 425 430 435

Ala Pro Gln ser Pro Phe Gln Asn �eu His Phe �eu Gln �al �eu 440 445 450

Asn �eu Thr Tyr Cys Phe �eu Asp Thr ser Asn Gln His �eu �eu 455 460 465

Ala Gly �eu Pro �al �eu Arg His �eu Asn �eu �ys Gly Asn His 470 475 480

Phe Gln Asp Gly Thr Ile Thr �ys Thr Asn �eu �eu Gln Thr �al 485 490 495

Gly ser �eu Glu �al �eu Ile �eu ser ser Cys Gly �eu �eu ser 500 505 510

Ile Asp Gln Gln Ala Phe His ser �eu Gly �ys �et ser His �al 515 520 525

Asp �eu ser His Asn ser �eu Thr Cys Asp ser Ile Asp ser �eu 530 535 540

ser His �eu �ys Gly Ile Tyr �eu Asn �eu Ala Ala Asn ser Ile 545 550 555

Asn Ile Ile ser Pro Arg �eu �eu Pro Ile �eu ser Gln Gln ser 560 565 570

Thr Ile Asn �eu ser His Asn Pro �eu Asp Cys Thr Cys ser Asn 575 580 585

Ile His Phe �eu Thr Trp Tyr �ys Glu Asn �eu His �ys �eu Glu 590 595 600

Gly ser Glu Glu Thr Thr Cys Ala Asn Pro Pro ser �eu Arg Gly 605 610 615

�al �ys �eu ser Asp �al �ys �eu ser Cys Gly Ile Thr Ala Ile 620 625 630

Gly Ile Phe Phe �eu Ile �al Phe �eu �eu �eu �eu Ala Ile �eu 635 640 645

�eu Phe Phe Ala �al �ys Tyr �eu �eu Arg Trp �ys Tyr Gln His 650 655 660

<210> 3

<211> 2661

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3 cagcagtagg ccttgcctca gatccaaggt cactcggaag aggccatgtc 50

taccctcaat gacactcatg gaggaaatgc tgagagaagc attcagatgc 100

atgacacaag gtaagactgc caaaaatctt gttcttgctc tcctcatttt 150 gttatttgtt ttatttttag gagttttgag agcaaaatga caacacccag 200 aaattcagta aatgggactt tcccggcaga gccaatgaaa ggccctattg 250 ctatgcaatc tggtccaaaa ccactcttca ggaggatgtc ttcactggtg 300 ggccccacgc aaagcttctt catgagggaa tctaagactt tgggggctgt 350 ccagattatg aatgggctct tccacattgc cctggggggt cttctgatga 400 tcccagcagg gatctatgca cccatctgtg tgactgtgtg gtaccctctc 450 tggggaggca ttatgtatat tatttccgga tcactcctgg cagcaacgga 500 gaaaaactcc aggaagtgtt tggtcaaagg aaaaatgata atgaattcat 550 tgagcctctt tgctgccatt tctggaatga ttctttcaat catggacata 600 cttaatatta aaatttccca ttttttaaaa atggagagtc tgaattttat 650 tagagctcac acaccatata ttaacatata caactgtgaa ccagctaatc 700 cctctgagaa aaactcccca tctacccaat actgttacag catacaatct 750 ctgttcttgg gcattttgtc agtgatgctg atctttgcct tcttccagga 800 acttgtaata gctggcatcg ttgagaatga atggaaaaga acgtgctcca 850 gacccaaatc taacatagtt ctcctgtcag cagaagaaaa aaaagaacag 900 actattgaaa taaaagaaga agtggttggg ctaactgaaa catcttccca 950 accaaagaat gaagaagaca ttgaaattat tccaatccaa gaagaggaag 1000 aagaagaaac agagacgaac tttccagaac ctccccaaga tcaggaatcc 1050 tcaccaatag aaaatgacag ctctccttaa gtgatttctt ctgttttctg 1100 tttccttttt taaacattag tgttcatagc ttccaagaga catgctgact 1150 ttcatttctt gaggtactct gcacatacgc accacatctc tatctggcct 1200 ttgcatggag tgaccatagc tccttctctc ttacattgaa tgtagagaat 1250 gtagccattg tagcagcttg tgttgtcacg cttcttcttt tgagcaactt 1300 tcttacactg aagaaaggca gaatgagtgc ttcagaatgt gatttcctac 1350 taacctgttc cttggatagg ctttttagta tagtattttt ttttgtcatt 1400 ttctccatca acaaccaggg agactgcacc tgatggaaaa gatatatgac 1450 tgcttcatga cattcctaaa ctatcttttt tttattccac atctacgttt 1500 ttggtggagt cccttttgca tcattgtttt aaggatgata aaaaaaaata 1550 acaactaggg acaatacaga acccattcca tttatctttc tacagggctg 1600 acattgtggc acattcttag agttaccaca ccccatgagg gaagctctaa 1650 atagccaaca cccatctgtt ttttgtaaaa acagcatagc ttatacatgg 1700 acatgtctct gccttaactt ttcctaactc ccactctagg ctattgtttg 1750 catgtctacc tacttttagc cattatgcga gaaaagaaaa aaatgaccat 1800 agaaaatgcc accatgaggt gcccaaattt caaataataa ttaacattta 1850 gttatattta taatttccag atgacaaagt atttcatcaa ataacttcat 1900 ttgatgttcc atgatcaaga aagaatccct atctctattt tacaagtaat 1950 tcaaagaggc caaataactt gtaaacaaga aaaggtaact tgtcaacagt 2000 cataactagt aattatgaga gccttgtttc ataaccaggt cttcttactc 2050 aaatcctgtg atgtttgaaa taaccaaatt gtctctccaa tgtctgcata 2100 aactgtgaga gccaagtcaa cagcttttat caagaattta ctctctgacc 2150 agcaataaac aagcactgag agacacagag agccagattc agattttacc 2200 catggggata aaaagactca gactttcacc acatttggaa aactacttgc 2250 atcataaata tataataact ggtagtttat atgaagcaga cactaagtgc 2300 tatagacact ctcagaatat catacttgga aacaatgtaa ttaaaatgcc 2350 gaatctgagt caacagctgc cctacttttc aattcagata tactagtacc 2400 ttacctagaa ataatgttaa cctagggtga agtcactata atctgtagtc 2450 tattatttgg gcatttgcta catgatgagt gctgccagat tgtggcaggt 2500 aaagagacaa tgtaatttgc actccctatg atatttctac atttttagcg 2550 accactagtg gaagacattc cccaaaatta gaaaaaaagg agatagaaga 2600 tttctgtcta tgtaaagttc tcaaaatttg ttctaaatta ataaaactat 2650 ctttgtgttc a 2661

<210> 4

<211> 297

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4 �et Thr Thr Pro Arg Asn ser �al Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu 1 5 10 15

Pro �et �ys Gly Pro Ile Ala �et Gln ser Gly Pro �ys Pro �eu 20 25 30

Phe Arg Arg �et ser ser �eu �al Gly Pro Thr Gln ser Phe Phe 35 40 45

�et Arg Glu ser �ys Thr �eu Gly Ala �al Gln Ile �et Asn Gly 50 55 60

�eu Phe His Ile Ala �eu Gly Gly �eu �eu �et Ile Pro Ala Gly 65 70 75

Ile Tyr Ala Pro Ile Cys �al Thr �al Trp Tyr Pro �eu Trp Gly 80 85 90

Gly Ile �et Tyr Ile Ile ser Gly ser �eu �eu Ala Ala Thr Glu 95 100 105

�ys Asn ser Arg �ys Cys �eu �al �ys Gly �ys �et Ile �et Asn 110 115 120

ser �eu ser �eu Phe Ala Ala Ile ser Gly �et Ile �eu ser Ile 125 130 135

�et Asp Ile �eu Asn Ile �ys Ile ser His Phe �eu �ys �et Glu 140 145 150

ser �eu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr 155 160 165

Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro ser Glu �ys Asn ser Pro ser Thr 170 175 180

Gln Tyr Cys Tyr ser Ile Gln ser �eu Phe �eu Gly Ile �eu ser 185 190 195

�al �et �eu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu �eu �al Ile Ala Gly 200 205 210

Ile �al Glu Asn Glu Trp �ys Arg Thr Cys ser Arg Pro �ys ser 215 220 225

Asn Ile �al �eu �eu ser Ala Glu Glu �ys �ys Glu Gln Thr Ile 230 235 240

Glu Ile �ys Glu Glu �al �al Gly �eu Thr Glu Thr ser ser Gln 245 250 255

Pro �ys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu 260 265 270

Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp 275 280 285

Gln Glu ser ser Pro Ile Glu Asn Asp ser ser Pro 290 295

<210> 5

<211> 1846

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5 gttggtgacc aagagtacat ctcttttcaa atagctggat taggtcctca 50 tgctgctgtg gtcattgctg gtcatctttg atgcagtcac tgaacaggca 100 gattcgctga cccttgtggc gccctcttct gtcttcgaag gagacagcat 150 cgttctgaaa tgccagggag aacagaactg gaaaattcag aagatggctt 200 accataagga taacaaagag ttatctgttt tcaaaaaatt ctcagatttc 250 cttatccaaa gtgcagtttt aagtgacagt ggtaactatt tctgtagtac 300 caaaggacaa ctctttctct gggataaaac ttcaaatata gtaaagataa 350 aagtccaaga gctctttcaa cgtcctgtgc tgactgccag ctccttccag 400 cccatcgaag ggggtccagt gagcctgaaa tgtgagaccc ggctctctcc 450 acagaggttg gatgttcaac tccagttctg cttcttcaga gaaaaccagg 500 tcctggggtc aggctggagc agctctccgg agctccagat ttctgccgtg 550 tggagtgaag acacagggtc ttactggtgc aaggcagaaa cggtgactca 600 caggatcaga aaacagagcc tccaatccca gattcacgtg cagagaatcc 650 ccatctctaa tgtaagcttg gagatccggg cccccggggg acaggtgact 700

gaaggacaaa aactgatcct gctctgctca gtggctgggg gtacaggaaa 750 tgtcacattc tcctggtaca gagaggccac aggaaccagt atgggaaaga 800 aaacccagcg ttccctgtca gcagagctgg agatcccagc tgtgaaagag 850 agtgatgccg gcaaatatta ctgtagagct gacaacggcc atgtgcctat 900 ccagagcaag gtggtgaata tccctgtgag aattccagtg tctcgccctg 950 tcctcaccct caggtctcct ggggcccagg ctgcagtggg ggacctgctg 1000 gagcttcact gtgaggccct gagaggctct cccccaatct tgtaccaatt 1050 ttatcatgag gatgtcaccc ttgggaacag ctcggccccc tctggaggag 1100 gggcctcctt caacctctct ttgactgcag aacattctgg aaactactcc 1150 tgtgaggcca acaacggcct gggggcccag tgcagtgagg cagtgccagt 1200 ctccatctca ggacctgatg gctatagaag agacctcatg acagctggag 1250 ttctctgggg actgtttggt gtccttggtt tcactggtgt tgctttgctg 1300 ttgtatgcct tgttccacaa gatatcagga gaaagttctg ccactaatga 1350 acccagaggg gcttccaggc caaatcctca agagttcacc tattcaagcc 1400 caaccccaga catggaggag ctgcagccag tgtatgtcaa tgtgggctct 1450 gtagatgtgg atgtggttta ttctcaggtc tggagcatgc agcagccaga 1500 aagctcagca aacatcagga cacttctgga gaacaaggac tcccaagtca 1550 tctactcttc tgtgaagaaa tcataacact tggaggaatc agaagggaag 1600 atcaacagca aggatggggc atcattaaga cttgctataa aaccttatga 1650 aaatgcttga ggcttatcac ctgccacagc cagaacgtgc ctcaggaggc 1700 acctcctgtc atttttgtcc tgatgatgtt tcttctccaa tatcttcttt 1750 tacctatcaa tattcattga actgctgcta catccagaca ctgtgcaaat 1800 aaattatttc tgctaccttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atgcag 1846

<210> 6

<211> 508

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 �et �eu �eu Trp ser �eu �eu �al Ile Phe Asp Ala �al Thr Glu 1 5 10 15

Gln Ala Asp ser �eu Thr �eu �al Ala Pro ser ser �al Phe Glu 20 25 30

Gly Asp ser Ile �al �eu �ys Cys Gln Gly Glu Gln Asn Trp �ys 35 40 45

Ile Gln �ys �et Ala Tyr His �ys Asp Asn �ys Glu �eu ser �al 50 55 60

Phe �ys �ys Phe ser Asp Phe �eu Ile Gln ser Ala �al �eu ser 65 70 75

Asp ser Gly Asn Tyr Phe Cys ser Thr �ys Gly Gln �eu Phe �eu 80 85 90

Trp Asp �ys Thr ser Asn Ile �al �ys Ile �ys �al Gln Glu �eu 95 100 105

Phe Gln Arg Pro �al �eu Thr Ala ser ser Phe Gln Pro Ile Glu 110 115 120

Gly Gly Pro �al ser �eu �ys Cys Glu Thr Arg �eu ser Pro Gln 125 130 135

Arg �eu Asp �al Gln �eu Gln Phe Cys Phe Phe Arg Glu Asn Gln 140 145 150

�al �eu Gly ser Gly Trp ser ser ser Pro Glu �eu Gln Ile ser 155 160 165

Ala �al Trp ser Glu Asp Thr Gly ser Tyr Trp Cys �ys Ala Glu 170 175 180

Thr �al Thr His Arg Ile Arg �ys Gln ser �eu Gln ser Gln Ile 185 190 195

His �al Gln Arg Ile Pro Ile ser Asn �al ser �eu Glu Ile Arg 200 205 210

Ala Pro Gly Gly Gln �al Thr Glu Gly Gln �ys �eu Ile �eu �eu 215 220 225

Cys ser �al Ala Gly Gly Thr Gly Asn �al Thr Phe ser Trp Tyr 230 235 240

Arg Glu Ala Thr Gly Thr ser �et Gly �ys �ys Thr Gln Arg ser 245 250 255

�eu ser Ala Glu �eu Glu Ile Pro Ala �al �ys Glu ser Asp Ala 260 265 270

Gly �ys Tyr Tyr Cys Arg Ala Asp Asn Gly His �al Pro Ile Gln 275 280 285

ser �ys �al �al Asn Ile Pro �al Arg Ile Pro �al ser Arg Pro 290 295 300

�al �eu Thr �eu Arg ser Pro Gly Ala Gln Ala Ala �al Gly Asp 305 310 315

�eu �eu Glu �eu His Cys Glu Ala �eu Arg Gly ser Pro Pro Ile 320 325 330

�eu Tyr Gln Phe Tyr His Glu Asp �al Thr �eu Gly Asn ser ser 335 340 345

Ala Pro ser Gly Gly Gly Ala ser Phe Asn �eu ser �eu Thr Ala 350 355 360

Glu His ser Gly Asn Tyr ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly �eu Gly 365 370 375

Ala Gln Cys ser Glu Ala �al Pro �al ser Ile ser Gly Pro Asp 380 385 390

Gly Tyr Arg Arg Asp �eu �et Thr Ala Gly �al �eu Trp Gly �eu 395 400 405

Phe Gly �al �eu Gly Phe Thr Gly �al Ala �eu �eu �eu Tyr Ala 410 415 420

�eu Phe His �ys Ile ser Gly Glu ser ser Ala Thr Asn Glu Pro 425 430 435

Arg Gly Ala ser Arg Pro Asn Pro Gln Glu Phe Thr Tyr ser ser 440 445 450

Pro Thr Pro Asp �et Glu Glu �eu Gln Pro �al Tyr �al Asn �al 455 460 465

Gly ser �al Asp �al Asp �al �al Tyr ser Gln �al Trp ser �et 470 475 480

Gln Gln Pro Glu ser ser Ala Asn Ile Arg Thr �eu �eu Glu Asn 485 490 495

�ys Asp ser Gln �al Ile Tyr ser ser �al �ys �ys ser 500 505

<210> 7

<211> 1107

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7 tgctgcaact caaactaacc aacccactgg gagaagatgc ctgggggtcc 50 aggagtcctc caagctctgc ctgccaccat cttcctcctc ttcctgctgt 100 ctgctgtcta cctgggccct gggtgccagg ccctgtggat gcacaaggtc 150 ccagcatcat tgatggtgag cctgggggaa gacgcccact tccaatgccc 200 gcacaatagc agcaacaacg ccaacgtcac ctggtggcgc gtcctccatg 250 gcaactacac gtggccccct gagttcttgg gcccgggcga ggaccccaat 300 ggtacgctga tcatccagaa tgtgaacaag agccatgggg gcatatacgt 350 gtgccgggtc caggagggca acgagtcata ccagcagtcc tgcggcacct 400 acctccgcgt gcgccagccg ccccccaggc ccttcctgga catgggggag 450 ggcaccaaga accgaatcat cacagccgag gggatcatcc tcctgttctg 500 cgcggtggtg cctgggacgc tgctgctgtt caggaaacga tggcagaacg 550 agaagctcgg gttggatgcc ggggatgaat atgaagatga aaacctttat 600 gaaggcctga acctggacga ctgctccatg tatgaggaca tctcccgggg 650 cctccagggc acctaccagg atgtgggcag cctcaacata ggagatgtcc 700 agctggagaa gccgtgacac ccctactcct gccaggctgc ccccgcctgc 750 tgtgcaccca gctccagtgt ctcagctcac ttccctggga cattctcctt 800 tcagcccttc tgggggcttc cttagtcata ttcccccagt ggggggtggg 850 agggtaacct cactcttctc caggccaggc ctccttggac tcccctgggg 900 gtgtcccact cttcttccct ctaaactgcc ccacctccta acctaatccc 950 cacgccccgc tgcctttccc aggctcccct cacccagcgg gtaatgagcc 1000 cttaatcgct gcctctaggg gagctgattg tagcagcctc gttagtgtca 1050 ccccctcctc cctgatctgt cagggccact tagtgataat aaattcttcc 1100 caactgc 1107

<210> 8

<211> 226

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

�et Pro Gly Gly Pro Gly �al �eu Gln Ala �eu Pro Ala Thr Ile 1 5 10 15

Phe �eu �eu Phe �eu �eu ser Ala �al Tyr �eu Gly Pro Gly Cys 20 25 30

Gln Ala �eu Trp �et His �ys �al Pro Ala ser �eu �et �al ser 35 40 45

�eu Gly Glu Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn ser ser Asn 50 55 60

Asn Ala Asn �al Thr Trp Trp Arg �al �eu His Gly Asn Tyr Thr 65 70 75

Trp Pro Pro Glu Phe �eu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr 80 85 90

�eu Ile Ile Gln Asn �al Asn �ys ser His Gly Gly Ile Tyr �al 95 100 105

Cys Arg �al Gln Glu Gly Asn Glu ser Tyr Gln Gln ser Cys Gly 110 115 120

Thr Tyr �eu Arg �al Arg Gln Pro Pro Pro Arg Pro Phe �eu Asp 125 130 135

�et Gly Glu Gly Thr �ys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 140 145 150

Ile �eu �eu Phe Cys Ala �al �al Pro Gly Thr �eu �eu �eu Phe 155 160 165

Arg �ys Arg Trp Gln Asn Glu �ys �eu Gly �eu Asp Ala Gly Asp 170 175 180

Glu Tyr Glu Asp Glu Asn �eu Tyr Glu Gly �eu Asn �eu Asp Asp 185 190 195

Cys ser �et Tyr Glu Asp Ile ser Arg Gly �eu Gln Gly Thr Tyr 200 205 210

Gln Asp �al Gly ser �eu Asn Ile Gly Asp �al Gln �eu Glu �ys 215 220 225

Pro

<210> 9

<211> 1270

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9 caggggacag gctgcagccg gtgcagttac acgttttcct ccaaggagcc 50

tcggacgttg tcacgggttt ggggtcgggg acagagcagt gaccatggcc 100

aggctggcgt tgtctcctgt gcccagccac tggatggtgg cgttgctgct 150

gctgctctca gctgagccag taccagcagc cagatcggag gaccggtacc 200 ggaatcccaa aggtagtgct tgttcgcgga tctggcagag cccacgtttc 250 atagccagga aacggggctt cacggtgaaa atgcactgct acatgaacag 300 cgcctccggc aatgtgagct ggctctggaa gcaggagatg gacgagaatc 350 cccagcagct gaagctggaa aagggccgca tggaagagtc ccagaacgaa 400 tctctcgcca ccctcaccat ccaaggcatc cggtttgagg acaatggcat 450 ctacttctgt cagcagaagt gcaacaacac ctcggaggtc taccagggct 500 gcggcacaga gctgcgagtc atgggattca gcaccttggc acagctgaag 550 cagaggaaca cgctgaagga tggtatcatc atgatccaga cgctgctgat 600 catcctcttc atcatcgtgc ctatcttcct gctgctggac aaggatgaca 650 gcaaggctgg catggaggaa gatcacacct acgagggcct ggacattgac 700 cagacagcca cctatgagga catagtgacg ctgcggacag gggaagtgaa 750 gtggtctgta ggtgagcacc caggccagga gtgagagcca ggtcgcccca 800 tgacctgggt gcaggctccc tggcctcagt gactgcttcg gagctgcctg 850 gctcatggcc caaccccttt cctggacccc ccagctggcc tctgaagctg 900 gcccaccaga gctgccattt gtctccagcc cctggtcccc agctcttgcc 950 aaagggcctg gagtagaagg acaacagggc agcaacttgg agggagttct 1000 ctggggatgg acgggaccca gccttctggg ggtgctatga ggtgatccgt 1050 ccccacacat gggatggggg aggcagagac tggtccagag cccgcaaatg 1100 gactcggagc cgagggcctc ccagcagagc ttgggaaggg ccatggaccc 1150 aactgggccc cagaagagcc acaggaacat cattcctctc ccgcaaccac 1200 tcccacccca gggaggccct ggcctccagt gccttccccc gtggaataaa 1250 cggtgtgtcc tgagaaacca 1270

<210> 10

<211> 229

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 �et Ala Arg �eu Ala �eu ser Pro �al Pro ser His Trp �et �al 1 5 10 15

Ala �eu �eu �eu �eu �eu ser Ala Glu Pro �al Pro Ala Ala Arg 20 25 30

ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro �ys Gly ser Ala Cys ser Arg 35 40 45

Ile Trp Gln ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg �ys Arg Gly Phe Thr 50 55 60

�al �ys �et His Cys Tyr �et Asn ser Ala ser Gly Asn �al ser 65 70 75

Trp �eu Trp �ys Gln Glu �et Asp Glu Asn Pro Gln Gln �eu �ys

80 85 90 �eu Glu �ys Gly Arg �et Glu Glu ser Gln Asn Glu ser �eu Ala 95 100 105 Thr �eu Thr Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr 110 115 120 Phe Cys Gln Gln �ys Cys Asn Asn Thr ser Glu �al Tyr Gln Gly 125 130 135 Cys Gly Thr Glu �eu Arg �al �et Gly Phe ser Thr �eu Ala Gln 140 145 150 �eu �ys Gln Arg Asn Thr �eu �ys Asp Gly Ile Ile �et Ile Gln 155 160 165 Thr �eu �eu Ile Ile �eu Phe Ile Ile �al Pro Ile Phe �eu �eu 170 175 180 �eu Asp �ys Asp Asp ser �ys Ala Gly �et Glu Glu Asp His Thr 185 190 195 Tyr Glu Gly �eu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile 200 205 210 �al Thr �eu Arg Thr Gly Glu �al �ys Trp ser �al Gly Glu His 215 220 225 Pro Gly Gln Glu

<210> 11

<211> 3934

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11 gccctcccag agctgccgga cgctcgcggg tctcggaacg catcccgccg 50 cgggggcttc ggccgtggca tgggcgccgc gggcctgctc ggggttttct 100 tggctctcgt cgcaccgggg gtcctcggga tttcttgtgg ctctcctccg 150 cctatcctaa atggccggat tagttattat tctaccccca ttgctgttgg 200 taccgtgata aggtacagtt gttcaggtac cttccgcctc attggagaaa 250 aaagtctatt atgcataact aaagacaaag tggatggaac ctgggataaa 300 cctgctccta aatgtgaata tttcaataaa tattcttctt gccctgagcc 350 catagtacca ggaggataca aaattagagg ctctacaccc tacagacatg 400 gtgattctgt gacatttgcc tgtaaaacca acttctccat gaacggaaac 450 aagtctgttt ggtgtcaagc aaataatatg tgggggccga cacgactacc 500 aacctgtgta agtgttttcc ctctcgagtg tccagcactt cctatgatcc 550 acaatggaca tcacacaagt gagaatgttg gctccattgc tccaggattg 600 tctgtgactt acagctgtga atctggttac ttgcttgttg gagaaaagat 650 cattaactgt ttgtcttcgg gaaaatggag tgctgtcccc cccacatgtg 700 aagaggcacg ctgtaaatct ctaggacgat ttcccaatgg gaaggtaaag 750

gagcctccaa ttctccgggt tggtgtaact gcaaactttt tctgtgatga 800 agggtatcga ctgcaaggcc caccttctag tcggtgtgta attgctggac 850 agggagttgc ttggaccaaa atgccagtat gtgaagaaat tttttgccca 900 tcacctcccc ctattctcaa tggaagacat ataggcaact cactagcaaa 950 tgtctcatat ggaagcatag tcacttacac ttgtgacccg gacccagagg 1000 aaggagtgaa cttcatcctt attggagaga gcactctccg ttgtacagtt 1050 gatagtcaga agactgggac ctggagtggc cctgccccac gctgtgaact 1100 ttctacttct gcggttcagt gtccacatcc ccagatccta agaggccgaa 1150 tggtatctgg gcagaaagat cgatatacct ataacgacac tgtgatattt 1200 gcttgcatgt ttggcttcac cttgaagggc agcaagcaaa tccgatgcaa 1250 tgcccaaggc acatgggagc catctgcacc agtctgtgaa aaggaatgcc 1300 aggcccctcc taacatcctc aatgggcaaa aggaagatag acacatggtc 1350 cgctttgacc ctggaacatc tataaaatat agctgtaacc ctggctatgt 1400 gctggtggga gaagaatcca tacagtgtac ctctgagggg gtgtggacac 1450 cccctgtacc ccaatgcaaa gtggcagcgt gtgaagctac aggaaggcaa 1500 ctcttgacaa aaccccagca ccaatttgtt agaccagatg tcaactcttc 1550 ttgtggtgaa gggtacaagt taagtgggag tgtttatcag gagtgtcaag 1600 gcacaattcc ttggtttatg gagattcgtc tttgtaaaga aatcacctgc 1650 ccaccacccc ctgttatcta caatggggca cacaccggga gttccttaga 1700 agattttcca tatggaacca cggtcactta cacatgtaac cctgggccag 1750 aaagaggagt ggaattcagc ctcattggag agagcaccat ccgttgtaca 1800 agcaatgatc aagaaagagg cacctggagt ggccctgctc ccctatgtaa 1850 actttccctc cttgctgtcc agtgctcaca tgtccatatt gcaaatggat 1900 acaagatatc tggcaaggaa gccccatatt tctacaatga cactgtgaca 1950 ttcaagtgtt atagtggatt tactttgaag ggcagtagtc agattcgttg 2000 caaagctgat aacacctggg atcctgaaat accagtttgt gaaaaagaaa 2050 catgccagca tgtgagacag agtcttcaag aacttccagc tggttcacgt 2100 gtggagctag ttaatacgtc ctgccaagat gggtaccagt tgactggaca 2150 tgcttatcag atgtgtcaag atgctgaaaa tggaatttgg ttcaaaaaga 2200 ttccactttg taaagttatt cactgtcacc ctccaccagt gattgtcaat 2250 gggaagcaca cagggatgat ggcagaaaac tttctatatg gaaatgaagt 2300 ctcttatgaa tgtgaccaag gattctatct cctgggagag aaaaaattgc 2350 agtgcagaag tgattctaaa ggacatggat cttggagcgg gccttcccca 2400 cagtgcttac gatctcctcc tgtgactcgc tgccctaatc cagaagtcaa 2450 acatgggtac aagctcaata aaacacattc tgcatattcc cacaatgaca 2500 tagtgtatgt tgactgcaat cctggcttca tcatgaatgg tagtcgcgtg 2550 attaggtgtc atactgataa cacatgggtg ccaggtgtgc caacttgtat 2600 gaaaaaagcc ttcatagggt gtccacctcc gcctaagacc cctaacggga 2650 accatactgg tggaaacata gctcgatttt ctcctggaat gtcaatcctg 2700 tacagctgtg accaaggcta cctgctggtg ggagaggcac tccttctttg 2750 cacacatgag ggaacctgga gccaacctgc ccctcattgt aaagaggtaa 2800 actgtagctc accagcagat atggatggaa tccagaaagg gctggaacca 2850 aggaaaatgt atcagtatgg agctgttgta actctggagt gtgaagatgg 2900 gtatatgctg gaaggcagtc cccagagcca gtgccaatcg gatcaccaat 2950 ggaaccctcc cctggcggtt tgcagatccc gttcacttgc tcctgtcctt 3000 tgtggtattg ctgcaggttt gatacttctt accttcttga ttgtcattac 3050 cttatacgtg atatcaaaac acagagaacg caattattat acagatacaa 3100 gccagaaaga agcttttcat ttagaagcac gagaagtata ttctgttgat 3150 ccatacaacc cagccagctg atcagaagac aaactggtgt gtgcctcatt 3200 gcttggaatt cagcggaata ttgattagaa agaaactgct ctaatatcag 3250 caagtctctt tatatggcct caagatcaat gaaatgatgt cataagcgat 3300 cacttcctat atgcacttat tctcaagaag aacatcttta tggtaaagat 3350 gggagcccag tttcactgcc atatactctt caaggacttt ctgaagcctc 3400 acttatgaga tgcctgaagc caggccatgg ctataaacaa ttacatggct 3450 ctaaaaagtt ttgccctttt taaggaaggc actaaaaaga gctgtcctgg 3500 tatctagacc catcttcttt ttgaaatcag catactcaat gttactatct 3550 gcttttggtt ataatgtgtt tttaattatc taaagtatga agcattttct 3600 ggggttatga tggccttacc tttattagga agtatggttt tattttgata 3650 gtagcttcct cctctggtgg tgttaatcat ttcattttta cccttactgt 3700 ttgagtttct ctcacattac tgtatatact ttgcctttcc ataatcactc 3750 agtgattgca atttgcacaa gtttttttaa attatgggaa tcaagattta 3800 atcctagaga tttggtgtac aattcaggct ttggatgttt ctttagcagt 3850 tttgtgataa gttctagttg cttgtaaaat ttcacttaat aatgtgtaca 3900 ttagtcattc aataaattgt aattgtaaag aaaa 3934

<210> 12

<211> 1033

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

�et Gly Ala Ala Gly �eu �eu Gly �al Phe �eu Ala �eu �al Ala 1 5 10 15

Pro Gly �al �eu Gly Ile ser Cys Gly ser Pro Pro Pro Ile �eu 20 25 30

Asn Gly Arg Ile ser Tyr Tyr ser Thr Pro Ile Ala �al Gly Thr 35 40 45

�al Ile Arg Tyr ser Cys ser Gly Thr Phe Arg �eu Ile Gly Glu 50 55 60

�ys ser �eu �eu Cys Ile Thr �ys Asp �ys �al Asp Gly Thr Trp 65 70 75

Asp �ys Pro Ala Pro �ys Cys Glu Tyr Phe Asn �ys Tyr ser ser 80 85 90

Cys Pro Glu Pro Ile �al Pro Gly Gly Tyr �ys Ile Arg Gly ser 95 100 105

Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp ser �al Thr Phe Ala Cys �ys Thr 110 115 120

Asn Phe ser �et Asn Gly Asn �ys ser �al Trp Cys Gln Ala Asn 125 130 135

Asn �et Trp Gly Pro Thr Arg �eu Pro Thr Cys �al ser �al Phe 140 145 150

Pro �eu Glu Cys Pro Ala �eu Pro �et Ile His Asn Gly His His 155 160 165

Thr ser Glu Asn �al Gly ser Ile Ala Pro Gly �eu ser �al Thr 170 175 180

Tyr ser Cys Glu ser Gly Tyr �eu �eu �al Gly Glu �ys Ile Ile 185 190 195

Asn Cys �eu ser ser Gly �ys Trp ser Ala �al Pro Pro Thr Cys 200 205 210

Glu Glu Ala Arg Cys �ys ser �eu Gly Arg Phe Pro Asn Gly �ys 215 220 225

�al �ys Glu Pro Pro Ile �eu Arg �al Gly �al Thr Ala Asn Phe 230 235 240

Phe Cys Asp Glu Gly Tyr Arg �eu Gln Gly Pro Pro ser ser Arg 245 250 255

Cys �al Ile Ala Gly Gln Gly �al Ala Trp Thr �ys �et Pro �al 260 265 270

Cys Glu Glu Ile Phe Cys Pro ser Pro Pro Pro Ile �eu Asn Gly 275 280 285

Arg His Ile Gly Asn ser �eu Ala Asn �al ser Tyr Gly ser Ile 290 295 300

�al Thr Tyr Thr Cys Asp Pro Asp Pro Glu Glu Gly �al Asn Phe 305 310 315

Ile �eu Ile Gly Glu ser Thr �eu Arg Cys Thr �al Asp ser Gln 320 325 330

�ys Thr Gly Thr Trp ser Gly Pro Ala Pro Arg Cys Glu �eu ser 335 340 345

Thr ser Ala �al Gln Cys Pro His Pro Gln Ile �eu Arg Gly Arg 350 355 360

�et �al ser Gly Gln �ys Asp Arg Tyr Thr Tyr Asn Asp Thr �al 365 370 375

Ile Phe Ala Cys �et Phe Gly Phe Thr �eu �ys Gly ser �ys Gln 380 385 390

Ile Arg Cys Asn Ala Gln Gly Thr Trp Glu Pro ser Ala Pro �al 395 400 405

Cys Glu �ys Glu Cys Gln Ala Pro Pro Asn Ile �eu Asn Gly Gln 410 415 420

�ys Glu Asp Arg His �et �al Arg Phe Asp Pro Gly Thr ser Ile 425 430 435

�ys Tyr ser Cys Asn Pro Gly Tyr �al �eu �al Gly Glu Glu ser 440 445 450

Ile Gln Cys Thr ser Glu Gly �al Trp Thr Pro Pro �al Pro Gln 455 460 465

Cys �ys �al Ala Ala Cys Glu Ala Thr Gly Arg Gln �eu �eu Thr 470 475 480

�ys Pro Gln His Gln Phe �al Arg Pro Asp �al Asn ser ser Cys 485 490 495

Gly Glu Gly Tyr �ys �eu ser Gly ser �al Tyr Gln Glu Cys Gln 500 505 510

Gly Thr Ile Pro Trp Phe �et Glu Ile Arg �eu Cys �ys Glu Ile 515 520 525

Thr Cys Pro Pro Pro Pro �al Ile Tyr Asn Gly Ala His Thr Gly 530 535 540

ser ser �eu Glu Asp Phe Pro Tyr Gly Thr Thr �al Thr Tyr Thr 545 550 555

Cys Asn Pro Gly Pro Glu Arg Gly �al Glu Phe ser �eu Ile Gly 560 565 570

Glu ser Thr Ile Arg Cys Thr ser Asn Asp Gln Glu Arg Gly Thr 575 580 585

Trp ser Gly Pro Ala Pro �eu Cys �ys �eu ser �eu �eu Ala �al 590 595 600

Gln Cys ser His �al His Ile Ala Asn Gly Tyr �ys Ile ser Gly 605 610 615

�ys Glu Ala Pro Tyr Phe Tyr Asn Asp Thr �al Thr Phe �ys Cys 620 625 630

Tyr ser Gly Phe Thr �eu �ys Gly ser ser Gln Ile Arg Cys �ys 635 640 645

Ala Asp Asn Thr Trp Asp Pro Glu Ile Pro �al Cys Glu �ys Glu 650 655 660

Thr Cys Gln His �al Arg Gln ser �eu Gln Glu �eu Pro Ala Gly 665 670 675

ser Arg �al Glu �eu �al Asn Thr ser Cys Gln Asp Gly Tyr Gln 680 685 690

�eu Thr Gly His Ala Tyr Gln �et Cys Gln Asp Ala Glu Asn Gly 695 700 705

Ile Trp Phe �ys �ys Ile Pro �eu Cys �ys �al Ile His Cys His 710 715 720

Pro Pro Pro �al Ile �al Asn Gly �ys His Thr Gly �et �et Ala 725 730 735

Glu Asn Phe �eu Tyr Gly Asn Glu �al ser Tyr Glu Cys Asp Gln 740 745 750

Gly Phe Tyr �eu �eu Gly Glu �ys �ys �eu Gln Cys Arg ser Asp 755 760 765

ser �ys Gly His Gly ser Trp ser Gly Pro ser Pro Gln Cys �eu 770 775 780

Arg ser Pro Pro �al Thr Arg Cys Pro Asn Pro Glu �al �ys His 785 790 795

Gly Tyr �ys �eu Asn �ys Thr His ser Ala Tyr ser His Asn Asp 800 805 810

Ile �al Tyr �al Asp Cys Asn Pro Gly Phe Ile �et Asn Gly ser 815 820 825

Arg �al Ile Arg Cys His Thr Asp Asn Thr Trp �al Pro Gly �al 830 835 840

Pro Thr Cys �et �ys �ys Ala Phe Ile Gly Cys Pro Pro Pro Pro 845 850 855

�ys Thr Pro Asn Gly Asn His Thr Gly Gly Asn Ile Ala Arg Phe 860 865 870

ser Pro Gly �et ser Ile �eu Tyr ser Cys Asp Gln Gly Tyr �eu 875 880 885

�eu �al Gly Glu Ala �eu �eu �eu Cys Thr His Glu Gly Thr Trp 890 895 900

ser Gln Pro Ala Pro His Cys �ys Glu �al Asn Cys ser ser Pro 905 910 915

Ala Asp �et Asp Gly Ile Gln �ys Gly �eu Glu Pro Arg �ys �et 920 925 930

Tyr Gln Tyr Gly Ala �al �al Thr �eu Glu Cys Glu Asp Gly Tyr 935 940 945

�et �eu Glu Gly ser Pro Gln ser Gln Cys Gln ser Asp His Gln 950 955 960

Trp Asn Pro Pro �eu Ala �al Cys Arg ser Arg ser �eu Ala Pro 965 970 975

�al �eu Cys Gly Ile Ala Ala Gly �eu Ile �eu �eu Thr Phe �eu 980 985 990

Ile �al Ile Thr �eu Tyr �al Ile ser �ys His Arg Glu Arg Asn 995 1000 1005

Tyr Tyr Thr Asp Thr ser Gln �ys Glu Ala Phe His �eu Glu Ala 1010 1015 1020

Arg Glu �al Tyr ser �al Asp Pro Tyr Asn Pro Ala ser 1025 1030

<210> 13

<211> 2978

<212> ADN

<213> Homo

<400> 13 caaacgttcc ggagataacc agctggagtc tcagagcact gagctgaagg tttttctgcc gactccagtg tgattctgag ggctatttgt gggaatattc tatgacagac ttcttactct ttcagcaatg taactgcggg ccattgtaca cgcacgaaaa cagctcaact tctgtgaacc ctgatgttgg catgatattt attctaaaag tttctggctt aaatttgggt atacgaaaac cctgtgctct gatcttgaag tctcctgtgc accgcagata gtctccctaa agtctatggc caagcctctcsapiens

caaatcttcc cagtcggctt gcagagactc cttgctccca 50 agaagctgca tcttattgac agatggtcat cacattggtg 100 atcagattgt ggggcccgga gtgaggctga agggagtgga 150 gcctgagagt cacctctact ttcctgctac cgctgcctgt 200 ggctgaacca tacactcctt tttctacaac cagcttgcat 250 cacaatgagc ggggaatcaa tgaatttcag cgatgttttc 300 aagattattt tgtgtcagtc aatacttcat attactcagt 350 atgttactgt gctccttgca ggaggtcagg cagttctcca 400 accgattgcc tactccttga tctgtgtctt tggcctcctg 450 tggtggtgat cacctttgct ttttataaga aggccaggtc 500 gtctatctct tgaacatggc cattgcagac atcctctttg 550 cccattctgg gcagtgagtc atgccactgg tgcgtgggtt 600 ccacgtgcaa gttgctaaaa ggcatctatg ccatcaactt 650 atgctgctcc tgacttgcat tagcatggac cggtacatcg 700 ggcgactaag tcattccggc tccgatccag aacactaccg 750 tcatctgcct tgttgtgtgg gggctgtcag tcatcatctc 800 tttgtcttca accaaaaata caacacccaa ggcagcgatg 850 caagtaccag actgtctcgg agcccatcag gtggaagctg 900 ggcttgagct actctttggt ttctttatcc ctttgatgtt 950 tgttacacgt tcattgtcaa aaccttggtg caagctcaga 1000 gcacaaagcc atccgtgtaa tcatagctgt ggtgcttgtg 1050 gtcagattcc tcataacatg gtcctgcttg tgacggctgc 1100 aaaatgaacc gatcctgcca gagcgaaaag ctaattggct 1150 tgtcacagaa gtcctggctt tcctgcactg ctgcctgaac 1200 acgcttttat tgggcagaag ttcagaaact actttctgaa 1250 gacctgtggt gtgtgagaag gaagtacaag tcctcaggct 1300 cgggaggtac tcagaaaaca tttctcggca gaccagtgag 1350 acgacaatgc gtcgtccttc actatgtgat agaaagctga 1400 ggcatgtgtg aaacatactc atagatgtta tgcaaaaaaa 1450 caggtatgca tggaaaatgt gggaattaag caaaatcaag 1500 tcctgcggga cttaacgtgc tcatgggctg tgtgatctct 1550 tcagggtggg gtggtctctg ataggtagca ttttccagca ctttgcaagg 1600 aatgttttgt agctctaggg tatatatccg cctggcattt cacaaaacag 1650 cctttgggaa atgctgaatt aaagtgaatt gttgacaaat gtaaacattt 1700 tcagaaatat tcatgaagcg gtcacagatc acagtgtctt ttggttacag 1750 cacaaaatga tggcagtggt ttgaaaaact aaaacagaaa aaaaaatgga 1800 agccaacaca tcactcattt taggcaaatg tttaaacatt tttatctatc 1850 agaatgttta ttgttgctgg ttataagcag caggattggc cggctagtgt 1900 ttcctctcat ttccctttga tacagtcaac aagcctgacc ctgtaaaatg 1950 gaggtggaaa gacaagctca agtgttcaca acctggaagt gcttcgggaa 2000 gaaggggaca atggcagaac aggtgttggt gacaattgtc accaattgga 2050 taaagcagct caggttgtag tgggccatta ggaaactgtc ggtttgcttt 2100 gatttccctg ggagctgttc tctgtcgtga gtgtctcttg tctaaacgtc 2150 cattaagctg agagtgctat gaagacagga tctagaataa tcttgctcac 2200 agctgtgctc tgagtgccta gcggagttcc agcaaacaaa atggactcaa 2250 gagagatttg attaatgaat cgtaatgaag ttggggttta ttgtacagtt 2300 taaaatgtta gatgttttta attttttaaa taaatggaat actttttttt 2350 tttttaaaga aagcaacttt actgagacaa tgtagaaaga agttttgttc 2400 cgtttcttta atgtggttga agagcaatgt gtggctgaag acttttgtta 2450 tgaggagctg cagattagct aggggacagc tggaattatg ctggcttctg 2500 ataattattt taaaggggtc tgaaatttgt gatggaatca gattttaaca 2550 gctctcttca atgacataga aagttcatgg aactcatgtt tttaaagggc 2600 tatgtaaata tatgaacatt agaaaaatag caacttgtgt tacaaaaata 2650 caaacacatg ttaggaaggt actgtcatgg gctaggcatg gtggctcaca 2700 cctgtaatcc cagcattttg ggaagctaag atgggtggat cacttgaggt 2750 caggagtttg agaccagcct ggccaacatg gcgaaacccc tctctactaa 2800 aaatacaaaa atttgccagg cgtggtggcg ggtgcctgta atcccagcta 2850 cttgggaggc tgaggcaaga gaatcgcttg aacccaggag gcagaggttg 2900 cagtgagccg agatcgtgcc attgcactcc agcctgggtg acagagcgag 2950 actccatctc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2978

<210> 14

<211> 374

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

�et ser Gly Glu ser �et Asn Phe ser Asp �al Phe Asp ser ser 1 5 10 15

Glu Asp Tyr Phe �al ser �al Asn Thr ser Tyr Tyr ser �al Asp 20 25 30

ser Glu �et �eu �eu Cys ser �eu Gln Glu �al Arg Gln Phe ser 35 40 45

Arg �eu Phe �al Pro Ile Ala Tyr ser �eu Ile Cys �al Phe Gly 50 55 60

�eu �eu Gly Asn Ile �eu �al �al Ile Thr Phe Ala Phe Tyr �ys 65 70 75

�ys Ala Arg ser �et Thr Asp �al Tyr �eu �eu Asn �et Ala Ile 80 85 90

Ala Asp Ile �eu Phe �al �eu Thr �eu Pro Phe Trp Ala �al ser 95 100 105

His Ala Thr Gly Ala Trp �al Phe ser Asn Ala Thr Cys �ys �eu 110 115 120

�eu �ys Gly Ile Tyr Ala Ile Asn Phe Asn Cys Gly �et �eu �eu 125 130 135

�eu Thr Cys Ile ser �et Asp Arg Tyr Ile Ala Ile �al Gln Ala 140 145 150

Thr �ys ser Phe Arg �eu Arg ser Arg Thr �eu Pro Arg Thr �ys 155 160 165

Ile Ile Cys �eu �al �al Trp Gly �eu ser �al Ile Ile ser ser 170 175 180

ser Thr Phe �al Phe Asn Gln �ys Tyr Asn Thr Gln Gly ser Asp 185 190 195

�al Cys Glu Pro �ys Tyr Gln Thr �al ser Glu Pro Ile Arg Trp 200 205 210

�ys �eu �eu �et �eu Gly �eu Glu �eu �eu Phe Gly Phe Phe Ile 215 220 225

Pro �eu �et Phe �et Ile Phe Cys Tyr Thr Phe Ile �al �ys Thr 230 235 240

�eu �al Gln Ala Gln Asn ser �ys Arg His �ys Ala Ile Arg �al 245 250 255

Ile Ile Ala �al �al �eu �al Phe �eu Ala Cys Gln Ile Pro His 260 265 270

Asn �et �al �eu �eu �al Thr Ala Ala Asn �eu Gly �ys �et Asn 275 280 285

Arg ser Cys Gln ser Glu �ys �eu Ile Gly Tyr Thr �ys Thr �al 290 295 300

Thr Glu �al �eu Ala Phe �eu His Cys Cys �eu Asn Pro �al �eu 305 310 315

Tyr Ala Phe Ile Gly Gln �ys Phe Arg Asn Tyr Phe �eu �ys Ile 320 325 330

�eu �ys Asp �eu Trp Cys �al Arg Arg �ys Tyr �ys ser ser Gly 335 340 345

Phe ser Cys Ala Gly Arg Tyr ser Glu Asn Ile ser Arg Gln Thr 350 355 360

ser Glu Thr Ala Asp Asn Asp Asn Ala ser ser Phe Thr �et

365 370

<210> 15

<211> 1531

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15 agtcacagag ggaacacaga gcctagttgt aaacggacag agacgagagg 50 ggcaagggag gacagtggat gacagggaag acgagtgggg gcagagctgc 100 tcaggaccat ggctgaggcc atcacctatg cagatctgag gtttgtgaag 150 gctcccctga agaagagcat ctccagccgg ttaggacagg acccaggggc 200 tgatgatgat ggggaaatca cctacgagaa tgttcaagtg cccgcagtcc 250 taggggtgcc ctcaagcttg gcttcttctg tactagggga caaagcagcg 300 gtcaagtcgg agcagccaac tgcgtcctgg agagccgtga cgtcaccagc 350 tgtcgggcgg attctcccct gccgcacaac ctgcctgcga tacctcctgc 400 tcggcctgct cctcacctgc ctgctgttag gagtgaccgc catctgcctg 450 ggagtgcgct atctgcaggt gtctcagcag ctccagcaga cgaacagggt 500 tctggaagtc actaacagca gcctgaggca gcagctccgc ctcaagataa 550 cgcagctggg acagagtgca gaggatctgc aggggtccag gagagagctg 600 gcgcagagtc aggaagcact acaggtggaa cagagggctc atcaggcggc 650 cgaagggcag ctacaggcct gccaggcaga cagacagaag acgaaggaga 700 ccttgcaaag tgaggagcaa cagaggaggg ccttggagca gaagctgagc 750 aacatggaga acagactgaa gcccttcttc acatgcggct cagcagacac 800 ctgctgtccg tcgggatgga taatgcatca gaaaagctgc ttttacatct 850 cacttacttc aaaaaattgg caggagagcc aaaaacaatg tgaaactctg 900 tcttccaagc tggccacatt cagtgaaatt tatccacaat cacactctta 950 ctacttctta aattcactgt tgccaaatgg tggttcaggg aattcatatt 1000 ggactggcct cagctctaac aaggattgga agttgactga tgatacacaa 1050 cgcactagga cttatgctca aagctcaaaa tgtaacaagg tacataaaac 1100 ttggtcatgg tggacactgg agtcagagtc atgtagaagt tctcttccct 1150 acatctgtga gatgacagct ttcaggtttc cagattagga cagtcctttg 1200 cactgagttg acactcatgc caacaagaac ctgtgcccct ccttcctaac 1250 ctgaggcctg gggttcctca gaccatctcc ttcattctgg gcagtgccag 1300 ccaccggctg acccacacct gacacttcca gccagtctgc tgcctgctcc 1350 ctcttcctga aactggactg ttcctgggaa aagggtgaag ccacctctag 1400 aagggacttt ggcctccccc caagaacttc ccatggtaga atggggtggg 1450

ggaggagggc gcacgggctg agcggatagg ggcggcccgg agccagccag 1500

gcagttttat tgaaatcttt ttaaataatt g 1531

<210> 16

<211> 359

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

�et Ala Glu Ala Ile Thr Tyr Ala Asp �eu Arg Phe �al �ys Ala 1 5 10 15

Pro �eu �ys �ys ser Ile ser ser Arg �eu Gly Gln Asp Pro Gly 20 25 30

Ala Asp Asp Asp Gly Glu Ile Thr Tyr Glu Asn �al Gln �al Pro 35 40 45

Ala �al �eu Gly �al Pro ser ser �eu Ala ser ser �al �eu Gly 50 55 60

Asp �ys Ala Ala �al �ys ser Glu Gln Pro Thr Ala ser Trp Arg 65 70 75

Ala �al Thr ser Pro Ala �al Gly Arg Ile �eu Pro Cys Arg Thr 80 85 90

Thr Cys �eu Arg Tyr �eu �eu �eu Gly �eu �eu �eu Thr Cys �eu 95 100 105

�eu �eu Gly �al Thr Ala Ile Cys �eu Gly �al Arg Tyr �eu Gln 110 115 120

�al ser Gln Gln �eu Gln Gln Thr Asn Arg �al �eu Glu �al Thr 125 130 135

Asn ser ser �eu Arg Gln Gln �eu Arg �eu �ys Ile Thr Gln �eu 140 145 150

Gly Gln ser Ala Glu Asp �eu Gln Gly ser Arg Arg Glu �eu Ala 155 160 165

Gln ser Gln Glu Ala �eu Gln �al Glu Gln Arg Ala His Gln Ala 170 175 180

Ala Glu Gly Gln �eu Gln Ala Cys Gln Ala Asp Arg Gln �ys Thr 185 190 195

�ys Glu Thr �eu Gln ser Glu Glu Gln Gln Arg Arg Ala �eu Glu 200 205 210

Gln �ys �eu ser Asn �et Glu Asn Arg �eu �ys Pro Phe Phe Thr 215 220 225

Cys Gly ser Ala Asp Thr Cys Cys Pro ser Gly Trp Ile �et His 230 235 240

Gln �ys ser Cys Phe Tyr Ile ser �eu Thr ser �ys Asn Trp Gln 245 250 255

Glu ser Gln �ys Gln Cys Glu Thr �eu ser ser �ys �eu Ala Thr 260 265 270

Phe ser Glu Ile Tyr Pro Gln ser His ser Tyr Tyr Phe �eu Asn 275 280 285

ser �eu �eu Pro Asn Gly Gly ser Gly Asn ser Tyr Trp Thr Gly

290 295 300

�eu ser ser Asn �ys Asp Trp �ys �eu Thr Asp Asp Thr Gln Arg 305 310 315

Thr Arg Thr Tyr Ala Gln ser ser �ys Cys Asn �ys �al His �ys 320 325 330

Thr Trp ser Trp Trp Thr �eu Glu ser Glu ser Cys Arg ser ser 335 340 345

�eu Pro Tyr Ile Cys Glu �et Thr Ala Phe Arg Phe Pro Asp 350 355

<210> 17

<211> 1978

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17 ggcacgaggg tccgcaagcc cggctgagag cgcgccatgg ggcaggcggg 50 ctgcaagggg ctctgcctgt cgctgttcga ctacaagacc gagaagtatg 100 tcatcgccaa gaacaagaag gtgggcctgc tgtaccggct gctgcaggcc 150 tccatcctgg cgtacctggt cgtatgggtg ttcctgataa agaagggtta 200 ccaagacgtc gacacctccc tgcagagtgc tgtcatcacc aaagtcaagg 250 gcgtggcctt caccaacacc tcggatcttg ggcagcggat ctgggatgtc 300 gccgactacg tcattccagc ccagggagag aacgtctttt ttgtggtcac 350 caacctgatt gtgaccccca accagcggca gaacgtctgt gctgagaatg 400 aaggcattcc tgatggcgcg tgctccaagg acagcgactg ccacgctggg 450 gaagcggtta cagctggaaa cggagtgaag accggccgct gcctgcggag 500 agggaacttg gccaggggca cctgtgagat ctttgcctgg tgcccgttgg 550 agacaagctc caggccggag gagccattcc tgaaggaggc cgaagacttc 600 accattttca taaagaacca catccgtttc cccaaattca acttctccaa 650 aaacaatgtg atggacgtca aggacagatc tttcctgaaa tcatgccact 700 ttggccccaa gaaccactac tgccccatct tccgactggg ctccatcgtc 750 cgctgggccg ggagcgactt ccaggatata gccctgcgag gtggcgtgat 800 aggaattaat attgaatgga actgtgatct tgataaagct gcctctgagt 850 gccaccctca ctattctttt agccgtctgg acaataaact ttcaaagtct 900 gtctcctccg ggtacaactt cagatttgcc agatattacc gagacgcagc 950 cggggtggag ttccgcaccc tgatgaaagc ctacgggatc cgctttgacg 1000 tgatggtgaa cggcaagggt gctttcttct gcgacctggt actcatctac 1050 ctcatcaaaa agagagagtt ttaccgtgac aagaagtacg aggaagtgag 1100 gggcctagaa gacagttccc aggaggccga ggacgaggca tcggggctgg 1150 ggctatctga gcagctcaca tctgggccag ggctgctggg gatgccggag 1200 cagcaggagc tgcaggagcc acccgaggcg aagcgtggaa gcagcagtca 1250 gaaggggaac ggatctgtgt gcccacagct cctggagccc cacaggagca 1300 cgtgaattgc ctctgcttac gttcaggccc tgtcctaaac ccagccgtct 1350 agcacccagt gatcccatgc ctttgggaat cccaggatgc tgcccaacgg 1400 gaaatttgta cattgggtgc tatcaatgcc acatcacagg gaccagccat 1450 cacagagcaa agtgacctcc acgtctgatg ctggggtcat caggacggac 1500 ccatcatggc tgtctttttg ccccaccccc tgccgtcagt tcttcctttc 1550 tccgtggctg gcttcccgca ctagggaacg ggttgtaaat ggggaacatg 1600 acttccttcc ggagtccttg agcacctcag ctaaggaccg cagtgccctg 1650 tagagttcct agattacctc actgggaata gcattgtgcg tgtccggaaa 1700 agggctccat ttggttccag cccactcccc tctgcaagtg ccacagcttc 1750 cctcagagca tactctccag tggatccaag tactctctct cctaaagaca 1800 ccaccttcct gccagctgtt tgcccttagg ccagtacaca gaattaaagt 1850 gggggagatg gcagacgctt tctgggacct gcccaagata tgtattctct 1900 gacactctta tttggtcata aaacaataaa tggtgtcaat ttcaaaaaaa 1950 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1978

<210> 18

<211> 422

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18 �et Gly Gln Ala Gly Cys �ys Gly �eu Cys �eu ser �eu Phe Asp 1 5 10 15

Tyr �ys Thr Glu �ys Tyr �al Ile Ala �ys Asn �ys �ys �al Gly 20 25 30

�eu �eu Tyr Arg �eu �eu Gln Ala ser Ile �eu Ala Tyr �eu �al 35 40 45

�al Trp �al Phe �eu Ile �ys �ys Gly Tyr Gln Asp �al Asp Thr 50 55 60

ser �eu Gln ser Ala �al Ile Thr �ys �al �ys Gly �al Ala Phe 65 70 75

Thr Asn Thr ser Asp �eu Gly Gln Arg Ile Trp Asp �al Ala Asp 80 85 90

Tyr �al Ile Pro Ala Gln Gly Glu Asn �al Phe Phe �al �al Thr 95 100 105

Asn �eu Ile �al Thr Pro Asn Gln Arg Gln Asn �al Cys Ala Glu 110 115 120

Asn Glu Gly Ile Pro Asp Gly Ala Cys ser �ys Asp ser Asp Cys 125 130 135

His Ala Gly Glu Ala �al Thr Ala Gly Asn Gly �al �ys Thr Gly 140 145 150

Arg Cys �eu Arg Arg Gly Asn �eu Ala Arg Gly Thr Cys Glu Ile 155 160 165

Phe Ala Trp Cys Pro �eu Glu Thr ser ser Arg Pro Glu Glu Pro 170 175 180

Phe �eu �ys Glu Ala Glu Asp Phe Thr Ile Phe Ile �ys Asn His 185 190 195

Ile Arg Phe Pro �ys Phe Asn Phe ser �ys Asn Asn �al �et Asp 200 205 210

�al �ys Asp Arg ser Phe �eu �ys ser Cys His Phe Gly Pro �ys 215 220 225

Asn His Tyr Cys Pro Ile Phe Arg �eu Gly ser Ile �al Arg Trp 230 235 240

Ala Gly ser Asp Phe Gln Asp Ile Ala �eu Arg Gly Gly �al Ile 245 250 255

Gly Ile Asn Ile Glu Trp Asn Cys Asp �eu Asp �ys Ala Ala ser 260 265 270

Glu Cys His Pro His Tyr ser Phe ser Arg �eu Asp Asn �ys �eu 275 280 285

ser �ys ser �al ser ser Gly Tyr Asn Phe Arg Phe Ala Arg Tyr 290 295 300

Tyr Arg Asp Ala Ala Gly �al Glu Phe Arg Thr �eu �et �ys Ala 305 310 315

Tyr Gly Ile Arg Phe Asp �al �et �al Asn Gly �ys Gly Ala Phe 320 325 330

Phe Cys Asp �eu �al �eu Ile Tyr �eu Ile �ys �ys Arg Glu Phe 335 340 345

Tyr Arg Asp �ys �ys Tyr Glu Glu �al Arg Gly �eu Glu Asp ser 350 355 360

ser Gln Glu Ala Glu Asp Glu Ala ser Gly �eu Gly �eu ser Glu 365 370 375

Gln �eu Thr ser Gly Pro Gly �eu �eu Gly �et Pro Glu Gln Gln 380 385 390

Glu �eu Gln Glu Pro Pro Glu Ala �ys Arg Gly ser ser ser Gln 395 400 405

�ys Gly Asn Gly ser �al Cys Pro Gln �eu �eu Glu Pro His Arg 410 415 420

ser Thr

<210> 19

<211> 1322

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19 aactcattct gaagaggctg acgattttac tgtctcattt ttttcctttc 50

tccagaatgg gttctgggtg ggtcccctgg gtggtggctc tgctagtgaa 100

tctgacccga ctggattcct ccatgactca aggcacagac tctccagaag 150

attttgtgat tcaggcaaag gctgactgtt acttcaccaa cgggacagaa 200 aaggtgcagt ttgtggtcag attcatcttt aacttggagg agtatgtacg 250 tttcgacagt gatgtgggga tgtttgtggc attgaccaag ctggggcagc 300 cagatgctga gcagtggaac agccggctgg atctcttgga gaggagcaga 350 caggccgtgg atggggtctg tagacacaac tacaggctgg gcgcaccctt 400 cactgtgggg agaaaagtgc aaccagaggt gacagtgtac ccagagagga 450 ccccactcct gcaccagcat aatctgctgc actgctctgt gacaggcttc 500 tatccagggg atatcaagat caagtggttc ctgaatgggc aggaggagag 550 agctggggtc atgtccactg gccctatcag gaatggagac tggacctttc 600 agactgtggt gatgctagaa atgactcctg aacttggaca tgtctacacc 650 tgccttgtcg atcactccag cctgctgagc cctgtttctg tggagtggag 700 agctcagtct gaatattctt ggagaaagat gctgagtggc attgcagcct 750 tcctacttgg gctaatcttc cttctggtgg gaatcgtcat ccagctaagg 800 gctcagaaag gatatgtgag gacgcagatg tctggtaatg aggtctcaag 850 agctgttctg ctccctcagt catgctaagg tcctcactaa gcttgctctc 900 tctggagcct gaagtagtga tgagtagtct gggccctggg tgaggtaaag 950 gacattcatg aggtcaatgt tctgggaata actctcttcc ctgatccttg 1000 gaggagcccg aactgattct ggagctctgt gttctgagat catgcatctc 1050 ccacccatct gcccttctcc cttctacgtg tacatcatta atccccattg 1100 ccaagggcat tgtccagaaa ctcccctgag accttactcc ttccagcccc 1150 aaatcattta cttttctgtg gtccagccct actcctataa gtcatgatct 1200 ccaaagcttt ctgtcttcca actgcagtct ccacagtctt cagaagacaa 1250 atgctcaggt agtcactgtt tccttttcac tgtttttaaa aaccttttat 1300 tgtcaaataa aatggagata ca 1322

<210> 20

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 �et Gly ser Gly Trp �al Pro Trp �al �al Ala �eu �eu �al Asn 1 5 10 15

�eu Thr Arg �eu Asp ser ser �et Thr Gln Gly Thr Asp ser Pro 20 25 30

Glu Asp Phe �al Ile Gln Ala �ys Ala Asp Cys Tyr Phe Thr Asn 35 40 45

Gly Thr Glu �ys �al Gln Phe �al �al Arg Phe Ile Phe Asn �eu 50 55 60

Glu Glu Tyr �al Arg Phe Asp ser Asp �al Gly �et Phe �al Ala

65 70 75

�eu Thr �ys �eu Gly Gln Pro Asp Ala Glu Gln Trp Asn ser Arg 80 85 90 �eu Asp �eu �eu Glu Arg ser Arg Gln Ala �al Asp Gly �al Cys

95 100 105

Arg His Asn Tyr Arg �eu Gly Ala Pro Phe Thr �al Gly Arg �ys 110 115 120 �al Gln Pro Glu �al Thr �al Tyr Pro Glu Arg Thr Pro �eu �eu

125 130 135

His Gln His Asn �eu �eu His Cys ser �al Thr Gly Phe Tyr Pro 140 145 150 Gly Asp Ile �ys Ile �ys Trp Phe �eu Asn Gly Gln Glu Glu Arg

155 160 165

Ala Gly �al �et ser Thr Gly Pro Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr 170 175 180 Phe Gln Thr �al �al �et �eu Glu �et Thr Pro Glu �eu Gly His

185 190 195

�al Tyr Thr Cys �eu �al Asp His ser ser �eu �eu ser Pro �al 200 205 210 ser �al Glu Trp Arg Ala Gln ser Glu Tyr ser Trp Arg �ys �et

215 220 225

�eu ser Gly Ile Ala Ala Phe �eu �eu Gly �eu Ile Phe �eu �eu 230 235 240 �al Gly Ile �al Ile Gln �eu Arg Ala Gln �ys Gly Tyr �al Arg

245 250 255 Thr Gln �et ser Gly Asn Glu �al ser Arg Ala �al �eu �eu Pro 260 265 270 Gln ser Cys

<210> 21

<211> 2818

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21 gctgccacct ctctagaggc acctggcggg gagcctctca acataagaca 50 gtgaccagtc tggtgactca cagccggcac agccatgaac tacccgctaa 100 cgctggaaat ggacctcgag aacctggagg acctgttctg ggaactggac 150 agattggaca actataacga cacctccctg gtggaaaatc atctctgccc 200 tgccacagag ggtcccctca tggcctcctt caaggccgtg ttcgtgcccg 250 tggcctacag cctcatcttc ctcctgggcg tgatcggcaa cgtcctggtg 300 ctggtgatcc tggagcggca ccggcagaca cgcagttcca cggagacctt 350

cctgttccac ctggccgtgg ccgacctcct gctggtcttc atcttgccct 400 ttgccgtggc cgagggctct gtgggctggg tcctggggac cttcctctgc 450 aaaactgtga ttgccctgca caaagtcaac ttctactgca gcagcctgct 500 cctggcctgc atcgccgtgg accgctacct ggccattgtc cacgccgtcc 550 atgcctaccg ccaccgccgc ctcctctcca tccacatcac ctgtgggacc 600 atctggctgg tgggcttcct ccttgccttg ccagagattc tcttcgccaa 650 agtcagccaa ggccatcaca acaactccct gccacgttgc accttctccc 700 aagagaacca agcagaaacg catgcctggt tcacctcccg attcctctac 750 catgtggcgg gattcctgct gcccatgctg gtgatgggct ggtgctacgt 800 gggggtagtg cacaggttgc gccaggccca gcggcgccct cagcggcaga 850 aggcagtcag ggtggccatc ctggtgacaa gcatcttctt cctctgctgg 900 tcaccctacc acatcgtcat cttcctggac accctggcga ggctgaaggc 950 cgtggacaat acctgcaagc tgaatggctc tctccccgtg gccatcacca 1000 tgtgtgagtt cctgggcctg gcccactgct gcctcaaccc catgctctac 1050 actttcgccg gcgtgaagtt ccgcagtgac ctgtcgcggc tcctgaccaa 1100 gctgggctgt accggccctg cctccctgtg ccagctcttc cctagctggc 1150 gcaggagcag tctctctgag tcagagaatg ccacctctct caccacgttc 1200 taggtcccag tgtccccttt tattgctgct tttccttggg gcaggcagtg 1250 atgctggatg ctccttccaa caggagctgg gatcctaagg gctcaccgtg 1300 gctaagagtg tcctaggagt atcctcattt ggggtagcta gaggaaccaa 1350 ccccatttct agaacatccc tgccagctct tctgccggcc ctggggctag 1400 gctggagccc agggagcgga aagcagctcg aaggcacagt gaaggctgtc 1450 cttacccatc tgcacccccc tgggctgaga gaacctcacg cacctcccat 1500 cctaatcatc caatgctcaa gaaacaactt ctacttctgc ccttgccaac 1550 ggagagcgcc tgcccctccc agaacacact ccatcagctt aggggctgct 1600 gacctccaca gcttcccctc tctcctcctg cccacctgtc aaacaaagcc 1650 agaagctgag caccagggga tgagtggagg ttaaggctga ggaaaggcca 1700 gctggcagca gagtgtggct tcggacaact cagtccctaa aaacacagac 1750 attctgccag gcccccaagc ctgcagtcat cttgaccaag caggaagctc 1800 agactggttg agttcaggta gctgcccctg gctctgaccg aaacagcgct 1850 gggtccaccc catgtcaccg gatcctgggt ggtctgcagg cagggctgac 1900 tctaggtgcc cttggaggcc agccagtgac ctgaggaagc gtgaaggccg 1950 agaagcaaga aagaaacccg acagagggaa gaaaagagct ttcttcccga 2000 accccaagga gggagatgga tcaatcaaac ccggctgtcc cctccgccca 2050 ggcgagatgg ggtgggggga gaactcctag ggtggctggg tccaggggat 2100 gggaggttgt gggcattgat ggggaaggag gctggcttgt cccctcctca 2150 ctcccttccc ataagctata gacccgagga aactcagagt cggaacggag 2200 aaaggtggac tggaaggggc ccgtgggagt catctcaacc atcccctccg 2250 ttggcatcac cttaggcagg gaagtgtaag aaacacactg aggcaggaac 2300 tcccaggccc aggaagccgt gccctgcccc cgtgaggatg tcactcagat 2350 ggaaccgcag gaagctgctc cgtgcttgtt tgctcacctg gggtgtggga 2400 ggcccgtccg gcagttctgg gtgctcccta ccacctcccc agcctttgat 2450 caggtgggga gtcagggacc cctgcccttg tcccactcaa gccaagcagc 2500 caagctcctt gggaggcccc actggggaaa taacagctgt ggctcacgtg 2550 agagtgtctt cacggcagga caacgagaaa gccctaagac gtcccttttt 2600 tctctgagta tctcctcgca agctgggtaa tcgatgggga gtctgaagca 2650 gatgcaaaga ggcagaggat ggattttgaa ttttcttttt aataaaaagg 2700 cacctataaa acaggtcaat acagtacagg cagcacagag acccccggaa 2750 caagcctaaa aattgtttca aaataaaaac caagaagatg tcttcaaaaa 2800 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2818

<210> 22

<211> 372

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22 �et Asn Tyr Pro �eu Thr �eu Glu �et Asp �eu Glu Asn �eu Glu 1 5 10 15

Asp �eu Phe Trp Glu �eu Asp Arg �eu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr 20 25 30

ser �eu �al Glu Asn His �eu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro �eu 35 40 45

�et Ala ser Phe �ys Ala �al Phe �al Pro �al Ala Tyr ser �eu 50 55 60

Ile Phe �eu �eu Gly �al Ile Gly Asn �al �eu �al �eu �al Ile 65 70 75

�eu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg ser ser Thr Glu Thr Phe �eu 80 85 90

Phe His �eu Ala �al Ala Asp �eu �eu �eu �al Phe Ile �eu Pro 95 100 105

Phe Ala �al Ala Glu Gly ser �al Gly Trp �al �eu Gly Thr Phe 110 115 120

�eu Cys �ys Thr �al Ile Ala �eu His �ys �al Asn Phe Tyr Cys 125 130 135

ser ser �eu �eu �eu Ala Cys Ile Ala �al Asp Arg Tyr �eu Ala 140 145 150

Ile �al His Ala �al His Ala Tyr Arg His Arg Arg �eu �eu ser 155 160 165

Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp �eu �al Gly Phe �eu �eu

170 175 180

Ala �eu Pro Glu Ile �eu Phe Ala �ys �al ser Gln Gly His His 185 190 195

Asn Asn ser �eu Pro Arg Cys Thr Phe ser Gln Glu Asn Gln Ala 200 205 210

Glu Thr His Ala Trp Phe Thr ser Arg Phe �eu Tyr His �al Ala 215 220 225

Gly Phe �eu �eu Pro �et �eu �al �et Gly Trp Cys Tyr �al Gly 230 235 240

�al �al His Arg �eu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln 245 250 255

�ys Ala �al Arg �al Ala Ile �eu �al Thr ser Ile Phe Phe �eu 260 265 270

Cys Trp ser Pro Tyr His Ile �al Ile Phe �eu Asp Thr �eu Ala 275 280 285

Arg �eu �ys Ala �al Asp Asn Thr Cys �ys �eu Asn Gly ser �eu 290 295 300

Pro �al Ala Ile Thr �et Cys Glu Phe �eu Gly �eu Ala His Cys 305 310 315

Cys �eu Asn Pro �et �eu Tyr Thr Phe Ala Gly �al �ys Phe Arg 320 325 330

ser Asp �eu ser Arg �eu �eu Thr �ys �eu Gly Cys Thr Gly Pro 335 340 345

Ala ser �eu Cys Gln �eu Phe Pro ser Trp Arg Arg ser ser �eu 350 355 360

ser Glu ser Glu Asn Ala Thr ser �eu Thr Thr Phe 365 370

<210> 23

<211> 1529

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23 agtggctcta ctttcagaag aaagtgtctc tcttcctgct taaacctctg 50 tctctgacgg tccctgccaa tcgctctggt cgaccccaac acactaggag 100 gacagacaca ggctccaaac tccactaacc agagctgtga ttgtgcccgc 150 tgagtggact gcgttgtcag ggagtgagtg ctccatcatc gggagaatcc 200 aagcaggacc gccatggagg aaggtcaata ttcagagatc gaggagcttc 250 ccaggaggcg gtgttgcagg cgtgggactc agatcgtgct gctggggctg 300 gtgaccgccg ctctgtgggc tgggctgctg actctgcttc tcctgtggca 350 ctgggacacc acacagagtc taaaacagct ggaagagagg gctgcccgga 400 acgtctctca agtttccaag aacttggaaa gccaccacgg tgaccagatg 450 gcgcagaaat cccagtccac gcagatttca caggaactgg aggaacttcg 500 agctgaacag cagagattga aatctcagga cttggagctg tcctggaacc 550

tgaacgggct tcaagcagat ctgagcagct tcaagtccca ggaattgaac 600 gagaggaacg aagcttcaga tttgctggaa agactccggg aggaggtgac 650 aaagctaagg atggagttgc aggtgtccag cggctttgtg tgcaacacgt 700 gccctgaaaa gtggatcaac ttccaacgga agtgctacta cttcggcaag 750 ggcaccaagc agtgggtcca cgcccggtat gcctgtgacg acatggaagg 800 gcagctggtc agcatccaca gcccggagga gcaggacttc ctgaccaagc 850 atgccagcca caccggctcc tggattggcc ttcggaactt ggacctgaag 900 ggagagttta tctgggtgga tgggagccat gtggactaca gcaactgggc 950 tccaggggag cccaccagcc ggagccaggg cgaggactgc gtgatgatgc 1000 ggggctccgg tcgctggacc gacgccttct gcgaccgtaa gctgggcgcc 1050 tgggtgtgcg accggctggc cacatgcacg ccgccagcca gcgaaggttc 1100 cgcggagtcc atgggacctg attcaagacc agaccctgac ggccgcctgc 1150 ccaccccctc tgcccctctc cactcttgag catggataca gccaggccca 1200 gagcaagacc ctgaagaccc ccaaccacgg cctaaaagcc tctttgtggc 1250 tgaaaggtcc ctgtgacatt ttctgccacc caaacggagg cagctgacac 1300 atctcccgct cctctatggc ccctgccttc ccaggagtac accccaacag 1350 caccctctcc agatgggagt gcccccaaca gcaccctctc cagatgagag 1400 ttacacccca acagcaccct ctccagatgc agccccatct cctcagcacc 1450 ccaggacctg agtatcccca gctcagggtg gtgagtcctc ctgtccagcc 1500 tgcatcaata aaatggggca gtgatggcc 1529

<210> 24

<211> 321

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24 �et Glu Glu Gly Gln Tyr ser Glu Ile Glu Glu �eu Pro Arg Arg 1 5 10 15

Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gln Ile �al �eu �eu Gly �eu �al 20 25 30

Thr Ala Ala �eu Trp Ala Gly �eu �eu Thr �eu �eu �eu �eu Trp 35 40 45

His Trp Asp Thr Thr Gln ser �eu �ys Gln �eu Glu Glu Arg Ala 50 55 60

Ala Arg Asn �al ser Gln �al ser �ys Asn �eu Glu ser His His 65 70 75

Gly Asp Gln �et Ala Gln �ys ser Gln ser Thr Gln Ile ser Gln 80 85 90

Glu �eu Glu Glu �eu Arg Ala Glu Gln Gln Arg �eu �ys ser Gln 95 100 105

Asp �eu Glu �eu ser Trp Asn �eu Asn Gly �eu Gln Ala Asp �eu 110 115 120

ser ser Phe �ys ser Gln Glu �eu Asn Glu Arg Asn Glu Ala ser 125 130 135

Asp �eu �eu Glu Arg �eu Arg Glu Glu �al Thr �ys �eu Arg �et 140 145 150

Glu �eu Gln �al ser ser Gly Phe �al Cys Asn Thr Cys Pro Glu 155 160 165

�ys Trp Ile Asn Phe Gln Arg �ys Cys Tyr Tyr Phe Gly �ys Gly 170 175 180

Thr �ys Gln Trp �al His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp �et Glu 185 190 195

Gly Gln �eu �al ser Ile His ser Pro Glu Glu Gln Asp Phe �eu 200 205 210

Thr �ys His Ala ser His Thr Gly ser Trp Ile Gly �eu Arg Asn 215 220 225

�eu Asp �eu �ys Gly Glu Phe Ile Trp �al Asp Gly ser His �al 230 235 240

Asp Tyr ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr ser Arg ser Gln 245 250 255

Gly Glu Asp Cys �al �et �et Arg Gly ser Gly Arg Trp Thr Asp 260 265 270

Ala Phe Cys Asp Arg �ys �eu Gly Ala Trp �al Cys Asp Arg �eu 275 280 285

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala ser Glu Gly ser Ala Glu ser �et 290 295 300

Gly Pro Asp ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg �eu Pro Thr Pro 305 310 315

ser Ala Pro �eu His ser 320

<210> 25

<211> 1244

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25 agagatgggg acggaggcca cagagcaggt ttcctggggc cattactctg 50 gggatgaaga ggacgcatac tcggctgagc cactgccgga gctttgctac 100 aaggccgatg tccaggcctt cagccgggcc ttccaaccca gtgtctccct 150 gaccgtggct gcgctgggtc tggccggcaa tggcctggtc ctggccaccc 200 acctggcagc ccgacgcgca gcgcgctcgc ccacctctgc ccacctgctc 250 cagctggccc tggccgacct cttgctggcc ctgactctgc ccttcgcggc 300 agcaggggct cttcagggct ggagtctggg aagtgccacc tgccgcacca 350

tctctggcct ctactcggcc tccttccacg ccggcttcct cttcctggcc 400 tgtatcagcg ccgaccgcta cgtggccatc gcgcgagcgc tcccagccgg 450 gccgcggccc tccactcccg gccgcgcaca cttggtctcc gtcatcgtgt 500 ggctgctgtc actgctcctg gcgctgcctg cgctgctctt cagccaggat 550 gggcagcggg aaggccaacg acgctgtcgc ctcatcttcc ccgagggcct 600 cacgcagacg gtgaaggggg cgagcgccgt ggcgcaggtg gccctgggct 650 tcgcgctgcc gctgggcgtc atggtagcct gctacgcgct tctgggccgc 700 acgctgctgg ccgccagggg gcccgagcgc cggcgtgcgc tgcgcgtcgt 750 ggtggctctg gtggcggcct tcgtggtgct gcagctgccc tacagcctcg 800 ccctgctgct ggatactgcc gatctactgg ctgcgcgcga gcggagctgc 850 cctgccagca aacgcaagga tgtcgcactg ctggtgacca gcggcttggc 900 cctcgcccgc tgtggcctca atcccgttct ctacgccttc ctgggcctgc 950 gcttccgcca ggacctgcgg aggctgctac ggggtgggag ctcgccctca 1000 gggcctcaac cccgccgcgg ctgcccccgc cggccccgcc tttcttcctg 1050 ctcagctccc acggagaccc acagtctctc ctgggacaac tagggctgcg 1100 aatctagagg agggggcagg ctgagggtcg tgggaaaggg gagtaggtgg 1150 gggaacactg agaaagaggc agggacctaa agggactacc tctgtgcctt 1200 gccacattaa attgataaca tggaaatgaa aaaaaaaaaa aaaa 1244

<210> 26

<211> 362

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26 �et Gly Thr Glu Ala Thr Glu Gln �al ser Trp Gly His Tyr ser 1 5 10 15

Gly Asp Glu Glu Asp Ala Tyr ser Ala Glu Pro �eu Pro Glu �eu 20 25 30

Cys Tyr �ys Ala Asp �al Gln Ala Phe ser Arg Ala Phe Gln Pro 35 40 45

ser �al ser �eu Thr �al Ala Ala �eu Gly �eu Ala Gly Asn Gly 50 55 60

�eu �al �eu Ala Thr His �eu Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg ser 65 70 75

Pro Thr ser Ala His �eu �eu Gln �eu Ala �eu Ala Asp �eu �eu 80 85 90

�eu Ala �eu Thr �eu Pro Phe Ala Ala Ala Gly Ala �eu Gln Gly 95 100 105

Trp ser �eu Gly ser Ala Thr Cys Arg Thr Ile ser Gly �eu Tyr 110 115 120

ser Ala ser Phe His Ala Gly Phe �eu Phe �eu Ala Cys Ile ser 125 130 135

Ala Asp Arg Tyr �al Ala Ile Ala Arg Ala �eu Pro Ala Gly Pro 140 145 150

Arg Pro ser Thr Pro Gly Arg Ala His �eu �al ser �al Ile �al 155 160 165

Trp �eu �eu ser �eu �eu �eu Ala �eu Pro Ala �eu �eu Phe ser 170 175 180

Gln Asp Gly Gln Arg Glu Gly Gln Arg Arg Cys Arg �eu Ile Phe 185 190 195

Pro Glu Gly �eu Thr Gln Thr �al �ys Gly Ala ser Ala �al Ala 200 205 210

Gln �al Ala �eu Gly Phe Ala �eu Pro �eu Gly �al �et �al Ala 215 220 225

Cys Tyr Ala �eu �eu Gly Arg Thr �eu �eu Ala Ala Arg Gly Pro 230 235 240

Glu Arg Arg Arg Ala �eu Arg �al �al �al Ala �eu �al Ala Ala 245 250 255

Phe �al �al �eu Gln �eu Pro Tyr ser �eu Ala �eu �eu �eu Asp 260 265 270

Thr Ala Asp �eu �eu Ala Ala Arg Glu Arg ser Cys Pro Ala ser 275 280 285

�ys Arg �ys Asp �al Ala �eu �eu �al Thr ser Gly �eu Ala �eu 290 295 300

Ala Arg Cys Gly �eu Asn Pro �al �eu Tyr Ala Phe �eu Gly �eu 305 310 315

Arg Phe Arg Gln Asp �eu Arg Arg �eu �eu Arg Gly Gly ser ser 320 325 330

Pro ser Gly Pro Gln Pro Arg Arg Gly Cys Pro Arg Arg Pro Arg 335 340 345

�eu ser ser Cys ser Ala Pro Thr Glu Thr His ser �eu ser Trp 350 355 360

Asp Asn

<210> 27

<211> 1066

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27 cctcggttct atcgattgaa ttcatgaaga cattgcctgc catgcttgga 50 actgggaaat tattttgggt cttcttctta atcccatatc tggacatctg 100 gaacatccat gggaaagaat catgtgatgt acagctttat ataaagagac 150 aatctgaaca ctccatctta gcaggagatc cctttgaact agaatgccct 200 gtgaaatact gtgctaacag gcctcatgtg acttggtgca agctcaatgg 250 aacaacatgt gtaaaacttg aagatagaca aacaagttgg aaggaagaga 300

agaacatttc atttttcatt ctacattttg aaccagtgct tcctaatgac 350 aatgggtcat accgctgttc tgcaaatttt cagtctaatc tcattgaaag 400 ccactcaaca actctttatg tgacagatgt aaaaagtgct tcagaacgac 450 cctccaagga cgaaatggca agcagaccct ggctcctgta tagtttactt 500 cctttggggg gattgcctct actcatcact acctgtttct gcctgttctg 550 ctgcctgaga aggcaccaag gaaagcaaaa tgaactctct gacacagcag 600 gaagggaaat taacctggtt gatgctcacc ttaagagtga gcaaacagaa 650 gcaagcacca ggcaaaattc ccaagtactg ctatcagaaa ctggaattta 700 tgataatgac cctgaccttt gtttcagaat gcaggaaggg tctgaagttt 750 attctaatcc atgcctggaa gaaaacaaac caggcattgt ttatgcttcc 800 ctgaaccatt ctgtcattgg actgaactca agactggcaa gaaatgtaaa 850 agaagcacca acagaatatg catccatatg tgtgaggagt taaggatcct 900 ctagagtcga cctgcagaag cttggccgcc atggcccaac ttgtttattg 950 cagcttataa gtgttacaaa taaacaaata atatttctca atttgagaat 1000 ttttacttta gaaatgttca tgttagtgct tgggtctgaa gggtccatag 1050 gacaaatgat taaaat 1066

<210> 28

<211> 289

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28 �et �ys Thr �eu Pro Ala �et �eu Gly Thr Gly �ys �eu Phe Trp 1 5 10 15

�al Phe Phe �eu Ile Pro Tyr �eu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly 20 25 30

�ys Glu ser Cys Asp �al Gln �eu Tyr Ile �ys Arg Gln ser Glu 35 40 45

His ser Ile �eu Ala Gly Asp Pro Phe Glu �eu Glu Cys Pro �al 50 55 60

�ys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His �al Thr Trp Cys �ys �eu Asn 65 70 75

Gly Thr Thr Cys �al �ys �eu Glu Asp Arg Gln Thr ser Trp �ys 80 85 90

Glu Glu �ys Asn Ile ser Phe Phe Ile �eu His Phe Glu Pro �al 95 100 105

�eu Pro Asn Asp Asn Gly ser Tyr Arg Cys ser Ala Asn Phe Gln 110 115 120

ser Asn �eu Ile Glu ser His ser Thr Thr �eu Tyr �al Thr Asp 125 130 135

�al �ys ser Ala ser Glu Arg Pro ser �ys Asp Glu �et Ala ser 140 145 150

Arg Pro Trp �eu �eu Tyr ser �eu �eu Pro �eu Gly Gly �eu Pro 155 160 165

�eu �eu Ile Thr Thr Cys Phe Cys �eu Phe Cys Cys �eu Arg Arg

170 175 180 His Gln Gly �ys Gln Asn Glu �eu ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu 185 190 195 Ile Asn �eu �al Asp Ala His �eu �ys ser Glu Gln Thr Glu Ala 200 205 210 ser Thr Arg Gln Asn ser Gln �al �eu �eu ser Glu Thr Gly Ile 215 220 225 Tyr Asp Asn Asp Pro Asp �eu Cys Phe Arg �et Gln Glu Gly ser 230 235 240 Glu �al Tyr ser Asn Pro Cys �eu Glu Glu Asn �ys Pro Gly Ile 245 250 255 �al Tyr Ala ser �eu Asn His ser �al Ile Gly �eu Asn ser Arg 260 265 270 �eu Ala Arg Asn �al �ys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala ser Ile 275 280 285 Cys �al Arg ser

<210> 29

<211> 2185

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 gttctccttt ccgagccaaa atcccaggcg atggtgaatt atgaacgtgc 50 cacaccatga agctcttgtg gcaggtaact gtgcaccacc acacctggaa 100 tgccatcctg ctcccgttcg tctacctcac ggcgcaagtg tggattctgt 150 gtgcagccat cgctgctgcc gcctcagccg ggccccagaa ctgcccctcc 200 gtttgctcgt gcagtaacca gttcagcaag gtggtgtgca cgcgccgggg 250 cctctccgag gtcccgcagg gtattccctc gaacacccgg tacctcaacc 300 tcatggagaa caacatccag atgatccagg ccgacacctt ccgccacctc 350 caccacctgg aggtcctgca gttgggcagg aactccatcc ggcagattga 400 ggtgggggcc ttcaacggcc tggccagcct caacaccctg gagctgttcg 450 acaactggct gacagtcatc cctagcgggg cctttgaata cctgtccaag 500 ctgcgggagc tctggcttcg caacaacccc atcgaaagca tcccctctta 550 cgccttcaac cgggtgccct ccctcatgcg cctggacttg ggggagctca 600 agaagctgga gtatatctct gagggagctt ttgaggggct gttcaacctc 650 aagtatctga acttgggcat gtgcaacatt aaagacatgc ccaatctcac 700 ccccctggtg gggctggagg agctggagat gtcagggaac cacttccctg 750 agatcaggcc tggctccttc catggcctga gctccctcaa gaagctctgg 800 gtcatgaact cacaggtcag cctgattgag cggaatgctt ttgacgggct 850 ggcttcactt gtggaactca acttggccca caataacctc tcttctttgc 900 cccatgacct ctttaccccg ctgaggtacc tggtggagtt gcatctacac 950 cacaaccctt ggaactgtga ttgtgacatt ctgtggctag cctggtggct 1000 tcgagagtat atacccacca attccacctg ctgtggccgc tgtcatgctc 1050 ccatgcacat gcgaggccgc tacctcgtgg aggtggacca ggcctccttc 1100 cagtgctctg cccccttcat catggacgca cctcgagacc tcaacatttc 1150 tgagggtcgg atggcagaac ttaagtgtcg gactccccct atgtcctccg 1200 tgaagtggtt gctgcccaat gggacagtgc tcagccacgc ctcccgccac 1250 ccaaggatct ctgtcctcaa cgacggcacc ttgaactttt cccacgtgct 1300 gctttcagac actggggtgt acacatgcat ggtgaccaat gttgcaggca 1350 actccaacgc ctcggcctac ctcaatgtga gcacggctga gcttaacacc 1400 tccaactaca gcttcttcac cacagtaaca gtggagacca cggagatctc 1450 gcctgaggac acaacgcgaa agtacaagcc tgttcctacc acgtccactg 1500 gttaccagcc ggcatatacc acctctacca cggtgctcat tcagactacc 1550 cgtgtgccca agcaggtggc agtacccgcg acagacacca ctgacaagat 1600 gcagaccagc ctggatgaag tcatgaagac caccaagatc atcattggct 1650 gctttgtggc agtgactctg ctagctgccg ccatgttgat tgtcttctat 1700 aaacttcgta agcggcacca gcagcggagt acagtcacag ccgcccggac 1750 tgttgagata atccaggtgg acgaagacat cccagcagca acatccgcag 1800 cagcaacagc agctccgtcc ggtgtatcag gtgagggggc agtagtgctg 1850 cccacaattc atgaccatat taactacaac acctacaaac cagcacatgg 1900 ggcccactgg acagaaaaca gcctggggaa ctctctgcac cccacagtca 1950 ccactatctc tgaaccttat ataattcaga cccataccaa ggacaaggta 2000 caggaaactc aaatatgact cccctccccc aaaaaactta taaaatgcaa 2050 tagaatgcac acaaagacag caacttttgt acagagtggg gagagacttt 2100 ttcttgtata tgcttatata ttaagtctat gggctggtta aaaaaaacag 2150 attatattaa aatttaaaga caaaaagtca aaaca 2185

<210> 30

<211> 653

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30 �et �ys �eu �eu Trp Gln �al Thr �al His His His Thr Trp Asn 1 5 10 15

Ala Ile �eu �eu Pro Phe �al Tyr �eu Thr Ala Gln �al Trp Ile 20 25 30

�eu Cys Ala Ala Ile Ala Ala Ala Ala ser Ala Gly Pro Gln Asn 35 40 45

Cys Pro ser �al Cys ser Cys ser Asn Gln Phe ser �ys �al �al 50 55 60

Cys Thr Arg Arg Gly �eu ser Glu �al Pro Gln Gly Ile Pro ser 65 70 75

Asn Thr Arg Tyr �eu Asn �eu �et Glu Asn Asn Ile Gln �et Ile 80 85 90

Gln Ala Asp Thr Phe Arg His �eu His His �eu Glu �al �eu Gln 95 100 105

�eu Gly Arg Asn ser Ile Arg Gln Ile Glu �al Gly Ala Phe Asn 110 115 120

Gly �eu Ala ser �eu Asn Thr �eu Glu �eu Phe Asp Asn Trp �eu 125 130 135

Thr �al Ile Pro ser Gly Ala Phe Glu Tyr �eu ser �ys �eu Arg 140 145 150

Glu �eu Trp �eu Arg Asn Asn Pro Ile Glu ser Ile Pro ser Tyr 155 160 165

Ala Phe Asn Arg �al Pro ser �eu �et Arg �eu Asp �eu Gly Glu 170 175 180

�eu �ys �ys �eu Glu Tyr Ile ser Glu Gly Ala Phe Glu Gly �eu 185 190 195

Phe Asn �eu �ys Tyr �eu Asn �eu Gly �et Cys Asn Ile �ys Asp 200 205 210

�et Pro Asn �eu Thr Pro �eu �al Gly �eu Glu Glu �eu Glu �et 215 220 225

ser Gly Asn His Phe Pro Glu Ile Arg Pro Gly ser Phe His Gly 230 235 240

�eu ser ser �eu �ys �ys �eu Trp �al �et Asn ser Gln �al ser 245 250 255

�eu Ile Glu Arg Asn Ala Phe Asp Gly �eu Ala ser �eu �al Glu 260 265 270

�eu Asn �eu Ala His Asn Asn �eu ser ser �eu Pro His Asp �eu 275 280 285

Phe Thr Pro �eu Arg Tyr �eu �al Glu �eu His �eu His His Asn 290 295 300

Pro Trp Asn Cys Asp Cys Asp Ile �eu Trp �eu Ala Trp Trp �eu 305 310 315

Arg Glu Tyr Ile Pro Thr Asn ser Thr Cys Cys Gly Arg Cys His 320 325 330

Ala Pro �et His �et Arg Gly Arg Tyr �eu �al Glu �al Asp Gln 335 340 345

Ala ser Phe Gln Cys ser Ala Pro Phe Ile �et Asp Ala Pro Arg 350 355 360

Asp �eu Asn Ile ser Glu Gly Arg �et Ala Glu �eu �ys Cys Arg 365 370 375

Thr Pro Pro �et ser ser �al �ys Trp �eu �eu Pro Asn Gly Thr 380 385 390

�al �eu ser His Ala ser Arg His Pro Arg Ile ser �al �eu Asn 395 400 405

Asp Gly Thr �eu Asn Phe ser His �al �eu �eu ser Asp Thr Gly 410 415 420

�al Tyr Thr Cys �et �al Thr Asn �al Ala Gly Asn ser Asn Ala 425 430 435

ser Ala Tyr �eu Asn �al ser Thr Ala Glu �eu Asn Thr ser Asn 440 445 450

Tyr ser Phe Phe Thr Thr �al Thr �al Glu Thr Thr Glu Ile ser 455 460 465

Pro Glu Asp Thr Thr Arg �ys Tyr �ys Pro �al Pro Thr Thr ser 470 475 480

Thr Gly Tyr Gln Pro Ala Tyr Thr Thr ser Thr Thr �al �eu Ile 485 490 495

Gln Thr Thr Arg �al Pro �ys Gln �al Ala �al Pro Ala Thr Asp 500 505 510

Thr Thr Asp �ys �et Gln Thr ser �eu Asp Glu �al �et �ys Thr 515 520 525

Thr �ys Ile Ile Ile Gly Cys Phe �al Ala �al Thr �eu �eu Ala 530 535 540

Ala Ala �et �eu Ile �al Phe Tyr �ys �eu Arg �ys Arg His Gln 545 550 555

Gln Arg ser Thr �al Thr Ala Ala Arg Thr �al Glu Ile Ile Gln 560 565 570

�al Asp Glu Asp Ile Pro Ala Ala Thr ser Ala Ala Ala Thr Ala 575 580 585

Ala Pro ser Gly �al ser Gly Glu Gly Ala �al �al �eu Pro Thr 590 595 600

Ile His Asp His Ile Asn Tyr Asn Thr Tyr �ys Pro Ala His Gly 605 610 615

Ala His Trp Thr Glu Asn ser �eu Gly Asn ser �eu His Pro Thr 620 625 630

�al Thr Thr Ile ser Glu Pro Tyr Ile Ile Gln Thr His Thr �ys 635 640 645

Asp �ys �al Gln Glu Thr Gln Ile 650

<210> 31

<211> 1488

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31 gctgaaaggg ccacgtttgt tttcattaca aataagacca ccgagtgggc 50

tcctggcgtg ggggcgggag cagccgcgcg cagtcttcag aggcagcccc 100

ccaggctgtc tctggagggt gtgtctctgc ttccctttcc ccgtgtttat 150

tttcagacga agccaagtgg cccgggggga ccctccggac tcccagcctt 200

cagagaggag ggcagctcgg gctttcgccg cagtgcttcc tgcccgtcac 250 gtgtgtgctc ctagccgggg tcgggggagc tggtatcttg gcccttctgg 300 gaggacgcgc acagcccgag gaggcagagc cccagacggg aatgggcttt 350 tcagaggtgg ggtgcgggcg aggggacgat gcattatttt taatatttga 400 tttatttttc caactggact tcttcccggg gctctttctg ggcccagctg 450 cctttgtgat cccgcgcccc ggtcctcggc ctctcacctc cagcgccggg 500 gcgccccctg ctgtcggaag cggctgtgac cgggcagagg tgctatctgg 550 gactctgggt tctcagcccg gggacagcga accgaggggc agatgatcca 600 tcagaaaaga gccggcactg cccagccccg cgcccctgcc cctgcctttt 650 tccgggagcg cgccgcgccg cacccgctac ggccgcttga ccccatcttt 700 gagcccggcc ccaagctctg ggaccgtcgt gcccctcatc aaggaagagc 750 caaggacccc aaggagaagg tcaggagcgg cggtgtggat gtcccttggc 800 tgcaggcccc gccgcgcact cccttcagtc cttcccttct ctagggacca 850 ggtagcatca gtgcctggat ctcggccttg tgtgccctgc tccctgcccc 900 acctactaag aaccaagtct ggttcaccgg ctcccaagag ctggaaccca 950 ttctcagcta gctgggggcc caggccaccc cttccctcca gacctgtgtg 1000 ccttctgccc tggctccagg gccccccaca ccgtgaccag ggcgggatcc 1050 ctatggggct ggccagtcgg caccgtgcca ggcccacagt gccctgggcg 1100 tccatggaag tcgttctgtg tctttaaaat cagaaggaag acattaacct 1150 ttaggctgaa gaaaatgttt tagtacacag caataactta tttgtcttta 1200 tccaacagcc ataaaatata actttaaata ttctattgat agagaaagga 1250 gttcatgaag gcagaaatgc ctggggccca cgaacatccc agtgtggccc 1300 tggacgggac atcatgctgg gcaacacagc taaaatgcgg gtgaagacca 1350 gatttcttgc acatggcggt gacgggatgc tccctagaga gcttcaagtg 1400 gattctttgc tttttatttt ctctcttaat aaaaatgtat gatgtttaca 1450 ttgtcagaga acaaacagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1488

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32 �et ser �eu Gly Cys Arg Pro Arg Arg Ala �eu Pro ser �al �eu 1 5 10 15

Pro Phe ser Arg Asp Gln �al Ala ser �al Pro Gly ser Arg Pro 20 25 30

Cys �al Pro Cys ser �eu Pro His �eu �eu Arg Thr �ys ser Gly 35 40 45

ser Pro Ala Pro �ys ser Trp Asn Pro Phe ser Ala ser Trp Gly

50 55 60

Pro Arg Pro Pro �eu Pro ser Arg Pro �al Cys �eu �eu Pro Trp 65 70 75

�eu Gln Gly Pro Pro His Arg Asp Gln Gly Gly Ile Pro �et Gly 80 85 90

�eu Ala ser Arg His Arg Ala Arg Pro Thr �al Pro Trp Ala ser 95 100 105

�et Glu �al �al �eu Cys �eu 110

<210> 33

<211> 1322

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33 atatatcgat atgctgccga ggctgttgct gttgatctgt gctccactct 50 gtgaacctgc cgagctgttt ttgatagcca gcccctccca tcccacagag 100 gggagcccag tgaccctgac gtgtaagatg ccctttctac agagttcaga 150 tgcccagttc cagttctgct ttttcagaga cacccgggcc ttgggcccag 200 gctggagcag ctcccccaag ctccagatcg ctgccatgtg gaaagaagac 250 acagggtcat actggtgcga ggcacagaca atggcgtcca aagtcttgag 300 gagcaggaga tcccagataa atgtgcacag ggtccctgtc gctgatgtga 350 gcttggagac tcagccccca ggaggacagg tgatggaggg agacaggctg 400 gtcctcatct gctcagttgc tatgggcaca ggagacatca ccttcctttg 450 gtacaaaggg gctgtaggtt taaaccttca gtcaaagacc cagcgttcac 500 tgacagcaga gtatgagatt ccttcagtga gggagagtga tgctgagcaa 550 tattactgtg tagctgaaaa tggctatggt cccagcccca gtgggctggt 600 gagcatcact gtcagaatcc cggtgtctcg cccaatcctc atgctcaggg 650 ctcccagggc ccaggctgca gtggaggatg tgctggagct tcactgtgag 700 gccctgagag gctctcctcc gatcctgtac tggttttatc acgaggatat 750 caccctgggg agcaggtcgg ccccctctgg aggaggagcc tccttcaacc 800 tttccctgac tgaagaacat tctggaaact actcctgtga ggccaacaat 850 ggcctggggg cccagcgcag tgaggcggtg acactcaact tcacagtgcc 900 tactggggcc agaagcaatc atcttacctc aggagtcatt gaggggctgc 950 tcagcaccct tggtccagcc accgtggcct tattattttg ctacggcctc 1000 aaaagaaaaa taggaagacg ttcagccagg gatccactca ggagccttcc 1050 cagccctcta ccccaagagt tcacgtacct caactcacct accccagggc 1100 agctacagcc tatatatgaa aatgtgaatg ttgtaagtgg ggatgaggtt 1150 tattcactgg cgtactataa ccagccggag caggaatcag tagcagcaga 1200 aaccctgggg acacatatgg aggacaaggt ttccttagac atctattcca 1250

ggctgaggaa agcaaacatt acagatgtgg actatgaaga tgctatgtaa 1300

ggttatggaa gattctgctc tt 1322

<210> 34

<211> 429

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

�et �eu Pro Arg �eu �eu �eu �eu Ile Cys Ala Pro �eu Cys Glu 1 5 10 15

Pro Ala Glu �eu Phe �eu Ile Ala ser Pro ser His Pro Thr Glu 20 25 30

Gly ser Pro �al Thr �eu Thr Cys �ys �et Pro Phe �eu Gln ser 35 40 45

ser Asp Ala Gln Phe Gln Phe Cys Phe Phe Arg Asp Thr Arg Ala 50 55 60

�eu Gly Pro Gly Trp ser ser ser Pro �ys �eu Gln Ile Ala Ala 65 70 75

�et Trp �ys Glu Asp Thr Gly ser Tyr Trp Cys Glu Ala Gln Thr 80 85 90

�et Ala ser �ys �al �eu Arg ser Arg Arg ser Gln Ile Asn �al 95 100 105

His Arg �al Pro �al Ala Asp �al ser �eu Glu Thr Gln Pro Pro 110 115 120

Gly Gly Gln �al �et Glu Gly Asp Arg �eu �al �eu Ile Cys ser 125 130 135

�al Ala �et Gly Thr Gly Asp Ile Thr Phe �eu Trp Tyr �ys Gly 140 145 150

Ala �al Gly �eu Asn �eu Gln ser �ys Thr Gln Arg ser �eu Thr 155 160 165

Ala Glu Tyr Glu Ile Pro ser �al Arg Glu ser Asp Ala Glu Gln 170 175 180

Tyr Tyr Cys �al Ala Glu Asn Gly Tyr Gly Pro ser Pro ser Gly 185 190 195

�eu �al ser Ile Thr �al Arg Ile Pro �al ser Arg Pro Ile �eu 200 205 210

�et �eu Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Ala �al Glu Asp �al �eu 215 220 225

Glu �eu His Cys Glu Ala �eu Arg Gly ser Pro Pro Ile �eu Tyr 230 235 240

Trp Phe Tyr His Glu Asp Ile Thr �eu Gly ser Arg ser Ala Pro 245 250 255

ser Gly Gly Gly Ala ser Phe Asn �eu ser �eu Thr Glu Glu His 260 265 270

ser Gly Asn Tyr ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly �eu Gly Ala Gln 275 280 285

Arg ser Glu Ala �al Thr �eu Asn Phe Thr �al Pro Thr Gly Ala 290 295 300

Arg ser Asn His �eu Thr ser Gly �al Ile Glu Gly �eu �eu ser 305 310 315

Thr �eu Gly Pro Ala Thr �al Ala �eu �eu Phe Cys Tyr Gly �eu 320 325 330

�ys Arg �ys Ile Gly Arg Arg ser Ala Arg Asp Pro �eu Arg ser 335 340 345

�eu Pro ser Pro �eu Pro Gln Glu Phe Thr Tyr �eu Asn ser Pro 350 355 360

Thr Pro Gly Gln �eu Gln Pro Ile Tyr Glu Asn �al Asn �al �al 365 370 375

ser Gly Asp Glu �al Tyr ser �eu Ala Tyr Tyr Asn Gln Pro Glu 380 385 390

Gln Glu ser �al Ala Ala Glu Thr �eu Gly Thr His �et Glu Asp 395 400 405

�ys �al ser �eu Asp Ile Tyr ser Arg �eu Arg �ys Ala Asn Ile 410 415 420

Thr Asp �al Asp Tyr Glu Asp Ala �et 425

<210> 35

<211> 685

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35 gatgtgctcc ttggagctgg tgtgcagtgt cctgactgta agatcaagtc 50 caaacctgtt ttggaattga ggaaacttct cttttgatct cagcccttgg 100 tggtccaggt cttcatgctg ctgtgggtga tattactggt cctggctcct 150 gtcagtggac agtttgcaag gacacccagg cccattattt tcctccagcc 200 tccatggacc acagtcttcc aaggagagag agtgaccctc acttgcaagg 250 gatttcgctt ctactcacca cagaaaacaa aatggtacca tcggtacctt 300 gggaaagaaa tactaagaga aaccccagac aatatccttg aggttcagga 350 atctggagag tacagatgcc aggcccaggg ctcccctctc agtagccctg 400 tgcacttgga tttttcttca gagatgggat ttcctcatgc tgcccaggct 450 aatgttgaac tcctgggctc aagtgatctg ctcacctagg cctctcaaag 500 cgctgggatt acagcttcgc tgatcctgca agctccactt tctgtgtttg 550 aaggagactc tgtggttctg aggtgccggg caaaggcgga agtaacactg 600 aataatacta tttacaagaa tgataatgtc ctggcattcc ttaataaaag 650 aactgacttc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 685

<210> 36

<211> 124

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 36 �et �eu �eu Trp �al Ile �eu �eu �al �eu Ala Pro �al ser Gly 1 5 10 15

Gln Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro Ile Ile Phe �eu Gln Pro Pro 20 25 30

Trp Thr Thr �al Phe Gln Gly Glu Arg �al Thr �eu Thr Cys �ys 35 40 45

Gly Phe Arg Phe Tyr ser Pro Gln �ys Thr �ys Trp Tyr His Arg 50 55 60

Tyr �eu Gly �ys Glu Ile �eu Arg Glu Thr Pro Asp Asn Ile �eu 65 70 75

Glu �al Gln Glu ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Ala Gln Gly ser 80 85 90

Pro �eu ser ser Pro �al His �eu Asp Phe ser ser Glu �et Gly 95 100 105

Phe Pro His Ala Ala Gln Ala Asn �al Glu �eu �eu Gly ser ser 110 115 120

Asp �eu �eu Thr

<210> 37

<211> 1337

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37 ggatttttgt gatccgcgat tcgctcccac gggcgggacc tttgtaactg 50 cgggaggccc aggacaggcc caccctgcgg ggcgggaggc agccggggtg 100 agggaggtga agaaaccaag acgcagagag gccaagcccc ttgccttggg 150 tcacacagcc aaaggaggca gagccagaac tcacaaccag atccagaggc 200 aacagggaca tggccacctg ggacgaaaag gcagtcaccc gcagggccaa 250 ggtggctccc gctgagagga tgagcaagtt cttaaggcac ttcacggtcg 300 tgggagacga ctaccatgcc tggaacatca actacaagaa atgggagaat 350 gaagaggagg aggaggagga ggagcagcca ccacccacac cagtctcagg 400 cgaggaaggc agagctgcag cccctgacgt tgcccctgcc cctggccccg 450 cacccagggc cccccttgac ttcaggggca tgttgaggaa actgttcagc 500 tcccacaggt ttcaggtcat catcatctgc ttggtggttc tggatgccct 550 cctggtgctt gctgagctca tcctggacct gaagatcatc cagcccgaca 600 agaataacta tgctgccatg gtattccact acatgagcat caccatcttg 650 gtctttttta tgatggagat catctttaaa ttatttgtct tccgcctgag 700 ttctttcacc acaagtttga gatcctggat gcccgtcgtg gtggtggtct 750 cattcatcct ggacattgtc ctcctgttcc aggagcacca gtttgaggct 800

ctgggcctgc tgattctgct ccggctgtgg cgggtggccc ggatcatcaa 850 tgggattatc atctcagtta agacacgttc agaacggcaa ctcttaaggt 900 taaaacagat gaatgtacaa ttggccgcca agattcaaca ccttgagttc 950 agctgctctg agaagcccct ggactgatga gtttgctgta tcaacctgta 1000 aggagaagct ctctccggat ggctatggga atgaaagaat ccgacttcta 1050 ctctcacaca gccaccgtga aagtcctgga gtaaaatgtg ctgtgtacag 1100 aagagagaga aggaagcagg ctggcatgtt cactgggctg gtgttacgac 1150 agagaacctg acagtcactg gccagttatc acttcagatt acaaatcaca 1200 cagagcatct gcctgttttc aatcacaaga gaacaaaacc aaaatctata 1250 aagatattct gaaaatatga cagaatttga caaataaaag cataaacgtg 1300 taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1337

<210> 38

<211> 255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

�et Ala Thr Trp Asp Glu �ys Ala �al Thr Arg Arg Ala �ys �al 1 5 10 15

Ala Pro Ala Glu Arg �et ser �ys Phe �eu Arg His Phe Thr �al 20 25 30

�al Gly Asp Asp Tyr His Ala Trp Asn Ile Asn Tyr �ys �ys Trp 35 40 45

Glu Asn Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gln Pro Pro Pro Thr 50 55 60

Pro �al ser Gly Glu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Pro Asp �al Ala 65 70 75

Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Arg Ala Pro �eu Asp Phe Arg Gly 80 85 90

�et �eu Arg �ys �eu Phe ser ser His Arg Phe Gln �al Ile Ile 95 100 105

Ile Cys �eu �al �al �eu Asp Ala �eu �eu �al �eu Ala Glu �eu 110 115 120

Ile �eu Asp �eu �ys Ile Ile Gln Pro Asp �ys Asn Asn Tyr Ala 125 130 135

Ala �et �al Phe His Tyr �et ser Ile Thr Ile �eu �al Phe Phe 140 145 150

�et �et Glu Ile Ile Phe �ys �eu Phe �al Phe Arg �eu ser ser 155 160 165

Phe Thr Thr ser �eu Arg ser Trp �et Pro �al �al �al �al �al 170 175 180

ser Phe Ile �eu Asp Ile �al �eu �eu Phe Gln Glu His Gln Phe 185 190 195

Glu Ala �eu Gly �eu �eu Ile �eu �eu Arg �eu Trp Arg �al Ala

200 205 210

Arg Ile Ile Asn Gly Ile Ile Ile ser �al �ys Thr Arg ser Glu 215 220 225

Arg Gln �eu �eu Arg �eu �ys Gln �et Asn �al Gln �eu Ala Ala 230 235 240

�ys Ile Gln His �eu Glu Phe ser Cys ser Glu �ys Pro �eu Asp 245 250 255

<210> 39

<211> 2970

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39 agtgaagggg tttcccatat gaaaaataca gaaagaatta tttgaatact 50 agcaaataca caacttgata tttctagaga acccaggcac agtcttggag 100 acattactcc tgagagactg cagctgatgg aagatgagcc ccaacttcta 150 aaaatgtatc actaccggga ttgagataca aacagcattt aggaaggtct 200 catctgagta gcagcttcct gccctccttc ttggagataa gtcgggcttt 250 tggtgagaca gactttccca accctctgcc cggccggtgc ccatgcttct 300 gtggctgctg ctgctgatcc tgactcctgg aagagaacaa tcaggggtgg 350 ccccaaaagc tgtacttctc ctcaatcctc catggtccac agccttcaaa 400 ggagaaaaag tggctctcat atgcagcagc atatcacatt ccctagccca 450 gggagacaca tattggtatc acgatgagaa gttgttgaaa ataaaacatg 500 acaagatcca aattacagag cctggaaatt accaatgtaa gacccgagga 550 tcctccctca gtgatgccgt gcatgtggaa ttttcacctg actggctgat 600 cctgcaggct ttacatcctg tctttgaagg agacaatgtc attctgagat 650 gtcaggggaa agacaacaaa aacactcatc aaaaggttta ctacaaggat 700 ggaaaacagc ttcctaatag ttataattta gagaagatca cagtgaattc 750 agtctccagg gataatagca aatatcattg tactgcttat aggaagtttt 800 acatacttga cattgaagta acttcaaaac ccctaaatat ccaagttcaa 850 gagctgtttc tacatcctgt gctgagagcc agctcttcca cgcccataga 900 ggggagtccc atgaccctga cctgtgagac ccagctctct ccacagaggc 950 cagatgtcca gctgcaattc tccctcttca gagatagcca gaccctcgga 1000 ttgggctgga gcaggtcccc cagactccag atccctgcca tgtggactga 1050 agactcaggg tcttactggt gtgaggtgga gacagtgact cacagcatca 1100 aaaaaaggag cctgagatct cagatacgtg tacagagagt ccctgtgtct 1150 aatgtgaatc tagagatccg gcccaccgga gggcagctga ttgaaggaga 1200 aaatatggtc cttatttgct cagtagccca gggttcaggg actgtcacat 1250 tctcctggca caaagaagga agagtaagaa gcctgggtag aaagacccag 1300 cgttccctgt tggcagagct gcatgttctc accgtgaagg agagtgatgc 1350 agggagatac tactgtgcag ctgataacgt tcacagcccc atcctcagca 1400 cgtggattcg agtcaccgtg agaattccgg tatctcaccc tgtcctcacc 1450 ttcagggctc ccagggccca cactgtggtg ggggacctgc tggagcttca 1500 ctgtgagtcc ctgagaggct ctcccccgat cctgtaccga ttttatcatg 1550 aggatgtcac cctggggaac agctcagccc cctctggagg aggagcctcc 1600 ttcaacctct ctctgactgc agaacattct ggaaactact cctgtgatgc 1650 agacaatggc ctgggggccc agcacagtca tggagtgagt ctcagggtca 1700 cagttccggt gtctcgcccc gtcctcaccc tcagggctcc cggggcccag 1750 gctgtggtgg gggacctgct ggagcttcac tgtgagtccc tgagaggctc 1800 cttcccgatc ctgtactggt tttatcacga ggatgacacc ttggggaaca 1850 tctcggccca ctctggagga ggggcatcct tcaacctctc tctgactaca 1900 gaacattctg gaaactactc atgtgaggct gacaatggcc tgggggccca 1950 gcacagtaaa gtggtgacac tcaatgttac aggaacttcc aggaacagaa 2000 caggccttac cgctgcggga atcacggggc tggtgctcag catcctcgtc 2050 cttgctgctg ctgctgctct gctgcattac gccagggccc gaaggaaacc 2100 aggaggactt tctgccactg gaacatctag tcacagtcct agtgagtgtc 2150 aggagccttc ctcgtccagg ccttccagga tagaccctca agagcccact 2200 cactctaaac cactagcccc aatggagctg gagccaatgt acagcaatgt 2250 aaatcctgga gatagcaacc cgatttattc ccagatctgg agcatccagc 2300 atacaaaaga aaactcagct aattgtccaa tgatgcatca agagcatgag 2350 gaacttacag tcctctattc agaactgaag aagacacacc cagacgactc 2400 tgcaggggag gctagcagca gaggcagggc ccatgaagaa gatgatgaag 2450 aaaactatga gaatgtacca cgtgtattac tggcctcaga ccactagccc 2500 cttacccaga gtggcccaca ggaaacagcc tgcaccattt ttttttctgt 2550 tctctccaac cacacatcat ccatctctcc agactctgcc tcctacgagg 2600 ctgggctgca gggtatgtga ggctgagcaa aaggtctgca aatctcccct 2650 gtgcctgatc tgtgtgttcc ccaggaagag agcaggcagc ctctgagcaa 2700 gcactgtgtt attttcacag tggagacacg tggcaaggca ggagggccct 2750 cagctcctag ggctgtcgaa tagaggagga gagagaaatg gtctagccag 2800 ggttacaagg gcacaatcat gaccatttga tccaagtgtg atcgaaagct 2850 gttaatgtgc tctctgtata aacaatttgc tccaaatatt ttgtttccct 2900 tttttgtgtg gctggtagtg gcattgctga tgttttggtg tatatgctgt 2950 atccttgcta ccatattggg 2970

<210> 40

<211> 734

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

�et �eu �eu Trp �eu �eu �eu �eu Ile �eu Thr Pro Gly Arg Glu 1 5 10 15

Gln ser Gly �al Ala Pro �ys Ala �al �eu �eu �eu Asn Pro Pro 20 25 30

Trp ser Thr Ala Phe �ys Gly Glu �ys �al Ala �eu Ile Cys ser 35 40 45

ser Ile ser His ser �eu Ala Gln Gly Asp Thr Tyr Trp Tyr His 50 55 60

Asp Glu �ys �eu �eu �ys Ile �ys His Asp �ys Ile Gln Ile Thr 65 70 75

Glu Pro Gly Asn Tyr Gln Cys �ys Thr Arg Gly ser ser �eu ser 80 85 90

Asp Ala �al His �al Glu Phe ser Pro Asp Trp �eu Ile �eu Gln 95 100 105

Ala �eu His Pro �al Phe Glu Gly Asp Asn �al Ile �eu Arg Cys 110 115 120

Gln Gly �ys Asp Asn �ys Asn Thr His Gln �ys �al Tyr Tyr �ys 125 130 135

Asp Gly �ys Gln �eu Pro Asn ser Tyr Asn �eu Glu �ys Ile Thr 140 145 150

�al Asn ser �al ser Arg Asp Asn ser �ys Tyr His Cys Thr Ala 155 160 165

Tyr Arg �ys Phe Tyr Ile �eu Asp Ile Glu �al Thr ser �ys Pro 170 175 180

�eu Asn Ile Gln �al Gln Glu �eu Phe �eu His Pro �al �eu Arg 185 190 195

Ala ser ser ser Thr Pro Ile Glu Gly ser Pro �et Thr �eu Thr 200 205 210

Cys Glu Thr Gln �eu ser Pro Gln Arg Pro Asp �al Gln �eu Gln 215 220 225

Phe ser �eu Phe Arg Asp ser Gln Thr �eu Gly �eu Gly Trp ser 230 235 240

Arg ser Pro Arg �eu Gln Ile Pro Ala �et Trp Thr Glu Asp ser 245 250 255

Gly ser Tyr Trp Cys Glu �al Glu Thr �al Thr His ser Ile �ys 260 265 270

�ys Arg ser �eu Arg ser Gln Ile Arg �al Gln Arg �al Pro �al 275 280 285

ser Asn �al Asn �eu Glu Ile Arg Pro Thr Gly Gly Gln �eu Ile 290 295 300

Glu Gly Glu Asn �et �al �eu Ile Cys ser �al Ala Gln Gly ser 305 310 315

Gly Thr �al Thr Phe ser Trp His �ys Glu Gly Arg �al Arg ser 320 325 330

�eu Gly Arg �ys Thr Gln Arg ser �eu �eu Ala Glu �eu His �al 335 340 345

�eu Thr �al �ys Glu ser Asp Ala Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Ala 350 355 360

Asp Asn �al His ser Pro Ile �eu ser Thr Trp Ile Arg �al Thr 365 370 375

�al Arg Ile Pro �al ser His Pro �al �eu Thr Phe Arg Ala Pro 380 385 390

Arg Ala His Thr �al �al Gly Asp �eu �eu Glu �eu His Cys Glu 395 400 405

ser �eu Arg Gly ser Pro Pro Ile �eu Tyr Arg Phe Tyr His Glu 410 415 420

Asp �al Thr �eu Gly Asn ser ser Ala Pro ser Gly Gly Gly Ala 425 430 435

ser Phe Asn �eu ser �eu Thr Ala Glu His ser Gly Asn Tyr ser 440 445 450

Cys Asp Ala Asp Asn Gly �eu Gly Ala Gln His ser His Gly �al 455 460 465

ser �eu Arg �al Thr �al Pro �al ser Arg Pro �al �eu Thr �eu 470 475 480

Arg Ala Pro Gly Ala Gln Ala �al �al Gly Asp �eu �eu Glu �eu 485 490 495

His Cys Glu ser �eu Arg Gly ser Phe Pro Ile �eu Tyr Trp Phe 500 505 510

Tyr His Glu Asp Asp Thr �eu Gly Asn Ile ser Ala His ser Gly 515 520 525

Gly Gly Ala ser Phe Asn �eu ser �eu Thr Thr Glu His ser Gly 530 535 540

Asn Tyr ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly �eu Gly Ala Gln His ser 545 550 555

�ys �al �al Thr �eu Asn �al Thr Gly Thr ser Arg Asn Arg Thr 560 565 570

Gly �eu Thr Ala Ala Gly Ile Thr Gly �eu �al �eu ser Ile �eu 575 580 585

�al �eu Ala Ala Ala Ala Ala �eu �eu His Tyr Ala Arg Ala Arg 590 595 600

Arg �ys Pro Gly Gly �eu ser Ala Thr Gly Thr ser ser His ser 605 610 615

Pro ser Glu Cys Gln Glu Pro ser ser ser Arg Pro ser Arg Ile 620 625 630

Asp Pro Gln Glu Pro Thr His ser �ys Pro �eu Ala Pro �et Glu 635 640 645

�eu Glu Pro �et Tyr ser Asn �al Asn Pro Gly Asp ser Asn Pro 650 655 660

Ile Tyr ser Gln Ile Trp ser Ile Gln His Thr �ys Glu Asn ser 665 670 675

Ala Asn Cys Pro �et �et His Gln Glu His Glu Glu �eu Thr �al 680 685 690

�eu Tyr ser Glu �eu �ys �ys Thr His Pro Asp Asp ser Ala Gly 695 700 705

Glu Ala ser ser Arg Gly Arg Ala His Glu Glu Asp Asp Glu Glu 710 715 720

Asn Tyr Glu Asn �al Pro Arg �al �eu �eu Ala ser Asp His 725 730

<210> 41

<211> 3459

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41 ctcaatcagc tttatgcaga gaagaagctt actgagctca ctgctggtgc 50 tggtgtaggc aagtgctgct ttggcaatct gggctgacct ggcttgtctc 100 ctcagaactc cttctccaac cctggagcag gcttccatgc tgctgtgggc 150 gtccttgctg gcctttgctc cagtctgtgg acaatctgca gctgcacaca 200 aacctgtgat ttccgtccat cctccatgga ccacattctt caaaggagag 250 agagtgactc tgacttgcaa tggatttcag ttctatgcaa cagagaaaac 300 aacatggtat catcggcact actggggaga aaagttgacc ctgaccccag 350 gaaacaccct cgaggttcgg gaatctggac tgtacagatg ccaggcccgg 400 ggctccccac gaagtaaccc tgtgcgcttg ctcttttctt cagactcctt 450 aatcctgcag gcaccatatt ctgtgtttga aggtgacaca ttggttctga 500 gatgccacag aagaaggaaa gagaaattga ctgctgtgaa atatacttgg 550 aatggaaaca ttctttccat ttctaataaa agctgggatc ttcttatccc 600 acaagcaagt tcaaataaca atggcaatta tcgatgcatt ggatatggag 650 atgagaatga tgtatttaga tcaaatttca aaataattaa aattcaagaa 700 ctatttccac atccagagct gaaagctaca gactctcagc ctacagaggg 750 gaattctgta aacctgagct gtgaaacaca gcttcctcca gagcggtcag 800 acaccccact tcacttcaac ttcttcagag atggcgaggt catcctgtca 850 gactggagca cgtacccgga actccagctc ccaaccgtct ggagagaaaa 900 ctcaggatcc tattggtgtg gtgctgaaac agtgaggggt aacatccaca 950 agcacagtcc ctcgctacag atccatgtgc agcggatccc tgtgtctggg 1000 gtgctcctgg agacccagcc ctcagggggc caggctgttg aaggggagat 1050 gctggtcctt gtctgctccg tggctgaagg cacaggggat accacattct 1100 cctggcaccg agaggacatg caggagagtc tggggaggaa aactcagcgt 1150 tccctgagag cagagctgga gctccctgcc atcagacaga gccatgcagg 1200 gggatactac tgtacagcag acaacagcta cggccctgtc cagagcatgg 1250 tgctgaatgt cactgtgaga gagaccccag gcaacagaga tggccttgtc 1300 gccgcgggag ccactggagg gctgctcagt gctcttctcc tggctgtggc 1350 cctgctgttt cactgctggc gtcggaggaa gtcaggagtt ggtttcttgg 1400 gagacgaaac caggctccct cccgctccag gcccaggaga gtcctcccat 1450 tccatctgcc ctgcccaggt ggagcttcag tcgttgtatg ttgatgtaca 1500 ccccaaaaag ggagatttgg tatactctga gatccagact actcagctgg 1550 gagaagaaga ggaagctaat acctccagga cacttctaga ggataaggat 1600 gtctcagttg tctactctga ggtaaagaca caacacccag ataactcagc 1650 tggaaagatc agctctaagg atgaagaaag ttaagagaat gaaaagttac 1700 gggaacgtcc tactcatgtg atttctccct tgtccaaagt cccaggccca 1750 gtgcagtcct tgcggcacct ggaatgatca actcattcca gctttctaat 1800 tcttctcatg catatgcatt cactcccagg aatactcatt cgtctactct 1850 gatgttggga tggaatggcc tctgaaagac ttcactaaaa tgaccaggat 1900 ccacagttaa gagaagaccc tgtagtattt gctgtgggcc tgacctaatg 1950 cattccctag ggtctgcttt agagaagggg gataaagaga gagaaggact 2000 gttatgaaaa acagaagcac aaattttggt gaattgggat ttgcagagat 2050 gaaaaagact gggtgacctg gatctctgct taatacatct acaaccattg 2100 tctcactgga gactcacttg catcagtttg tttaactgtg agtggctgca 2150 caggcactgt gcaaacaatg aaaagcccct tcacttctgc ctgcacagct 2200 tacactgtca ggattcagtt gcagattaaa gaacccatct ggaatggttt 2250 acagagagag gaatttaaaa gaggacatca gaagagctgg agatgcaagc 2300 tctaggctgc gcttccaaaa gcaaatgata attatgttaa tgtcattagt 2350 gacaaagatt tgcaacatta gagaaaagag acacaaatat aaaattaaaa 2400 acttaagtac caactctcca aaactaaatt tgaacttaaa atattagtat 2450 aaactcataa taaactctgc ctttaaaaaa agataaatat ttcctacgtc 2500 tgttcactga aataattacc aaccccttag caataagcac tccttgcaga 2550 gaggttttat tctctaaata ccattccctt ctcaaaggaa ataaggttgc 2600 ttttcttgta ggaactgtgt ctttgagtta ctaattagtt tatatgagaa 2650 taattcttgc aataaatgaa gaaggaataa aagaaatagg aagccacaaa 2700 tttgtatgga tatttcatga tacacctact ggttaaataa ttgacaaaaa 2750 ccagcagcca aatattagag gtctcctgat ggaagtgtac aataccacct 2800 acaaattatc catgccccaa gtgttaaaac tgaatccatt caagtctttc 2850 taactgaata cttgttttat agaaaatgca tggagaaaag gaatttgttt 2900 aaataacatt atgggattgc aaccagcaaa acataaactg agaaaaagtt 2950 ctatagggca aatcacctgg cttctataac aaataaatgg gaaaaaaatg 3000 aaataaaaag aagagaggga ggaagaaagg gagagagaag aaaagaaaaa 3050 tgaagaaaag taattagaat attttcaaca taaagaaaag acgaatattt 3100 aaggtgacag atatcccaac tacgctgatt tgatctttac aaattatatg 3150 agtgtatgaa tttgtcacat gtatcacccc caaaaaaaga gaaaaagaaa 3200 aatagaagac atataaatta aatgagacga gacatgtcga ccaaaaggaa 3250 tgtgtgggtc ttgtttggat cctgactcaa attaagaaaa aataaaacta 3300 cctacgaaat actaagaaaa atttgtatac taatattaag aaattgttgt 3350 gtgttttgga tataagtgat agtttattgt agtgatgttt ttataaaagc 3400 aaaaggatat tcactttcag cgcttatact gaagtattag attaaagctt 3450 attaacgta 3459

<210> 42

<211> 515

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42 �et �eu �eu Trp Ala ser �eu �eu Ala Phe Ala Pro �al Cys Gly 1 5 10 15

Gln ser Ala Ala Ala His �ys Pro �al Ile ser �al His Pro Pro 20 25 30

Trp Thr Thr Phe Phe �ys Gly Glu Arg �al Thr �eu Thr Cys Asn 35 40 45

Gly Phe Gln Phe Tyr Ala Thr Glu �ys Thr Thr Trp Tyr His Arg 50 55 60

His Tyr Trp Gly Glu �ys �eu Thr �eu Thr Pro Gly Asn Thr �eu 65 70 75

Glu �al Arg Glu ser Gly �eu Tyr Arg Cys Gln Ala Arg Gly ser 80 85 90

Pro Arg ser Asn Pro �al Arg �eu �eu Phe ser ser Asp ser �eu 95 100 105

Ile �eu Gln Ala Pro Tyr ser �al Phe Glu Gly Asp Thr �eu �al 110 115 120

�eu Arg Cys His Arg Arg Arg �ys Glu �ys �eu Thr Ala �al �ys 125 130 135

Tyr Thr Trp Asn Gly Asn Ile �eu ser Ile ser Asn �ys ser Trp 140 145 150

Asp �eu �eu Ile Pro Gln Ala ser ser Asn Asn Asn Gly Asn Tyr 155 160 165

Arg Cys Ile Gly Tyr Gly Asp Glu Asn Asp �al Phe Arg ser Asn

170 175 180

Phe �ys Ile Ile �ys Ile Gln Glu �eu Phe Pro His Pro Glu �eu 185 190 195

�ys Ala Thr Asp ser Gln Pro Thr Glu Gly Asn ser �al Asn �eu 200 205 210

ser Cys Glu Thr Gln �eu Pro Pro Glu Arg ser Asp Thr Pro �eu 215 220 225

His Phe Asn Phe Phe Arg Asp Gly Glu �al Ile �eu ser Asp Trp 230 235 240

ser Thr Tyr Pro Glu �eu Gln �eu Pro Thr �al Trp Arg Glu Asn 245 250 255

ser Gly ser Tyr Trp Cys Gly Ala Glu Thr �al Arg Gly Asn Ile 260 265 270

His �ys His ser Pro ser �eu Gln Ile His �al Gln Arg Ile Pro 275 280 285

�al ser Gly �al �eu �eu Glu Thr Gln Pro ser Gly Gly Gln Ala 290 295 300

�al Glu Gly Glu �et �eu �al �eu �al Cys ser �al Ala Glu Gly 305 310 315

Thr Gly Asp Thr Thr Phe ser Trp His Arg Glu Asp �et Gln Glu 320 325 330

ser �eu Gly Arg �ys Thr Gln Arg ser �eu Arg Ala Glu �eu Glu 335 340 345

�eu Pro Ala Ile Arg Gln ser His Ala Gly Gly Tyr Tyr Cys Thr 350 355 360

Ala Asp Asn ser Tyr Gly Pro �al Gln ser �et �al �eu Asn �al 365 370 375

Thr �al Arg Glu Thr Pro Gly Asn Arg Asp Gly �eu �al Ala Ala 380 385 390

Gly Ala Thr Gly Gly �eu �eu ser Ala �eu �eu �eu Ala �al Ala 395 400 405

�eu �eu Phe His Cys Trp Arg Arg Arg �ys ser Gly �al Gly Phe 410 415 420

�eu Gly Asp Glu Thr Arg �eu Pro Pro Ala Pro Gly Pro Gly Glu 425 430 435

ser ser His ser Ile Cys Pro Ala Gln �al Glu �eu Gln ser �eu 440 445 450

Tyr �al Asp �al His Pro �ys �ys Gly Asp �eu �al Tyr ser Glu 455 460 465

Ile Gln Thr Thr Gln �eu Gly Glu Glu Glu Glu Ala Asn Thr ser 470 475 480

Arg Thr �eu �eu Glu Asp �ys Asp �al ser �al �al Tyr ser Glu 485 490 495

�al �ys Thr Gln His Pro Asp Asn ser Ala Gly �ys Ile ser ser 500 505 510

�ys Asp Glu Glu ser

<210> 43

<211> 1933

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43 acacacccac aggacctgca gctgaacgaa gttgaagaca actcaggaga 50 tctgttggaa agagaacgat agaggaaaat atatgaatgt tgccatcttt 100 agttccctgt gttgggaaaa ctgtctggct gtacctccaa gcctggccaa 150 accctgtgtt tgaaggagat gccctgactc tgcgatgtca gggatggaag 200 aatacaccac tgtctcaggt gaagttctac agagatggaa aattccttca 250 tttctctaag gaaaaccaga ctctgtccat gggagcagca acagtgcaga 300 gccgtggcca gtacagctgc tctgggcagg tgatgtatat tccacagaca 350 ttcacacaaa cttcagagac tgccatggtt caagtccaag agctgtttcc 400 acctcctgtg ctgagtgcca tcccctctcc tgagccccga gagggtagcc 450 tggtgaccct gagatgtcag acaaagctgc accccctgag gtcagccttg 500 aggctccttt tctccttcca caaggacggc cacaccttgc aggacagggg 550 ccctcaccca gaactctgca tcccgggagc caaggaggga gactctgggc 600 tttactggtg tgaggtggcc cctgagggtg gccaggtcca gaagcagagc 650 ccccagctgg aggtcagagt gcaggctcct gtatcccgtc ctgtgctcac 700 tctgcaccac gggcctgctg accctgctgt gggggacatg gtgcagctcc 750 tctgtgaggc acagaggggc tcccctccga tcctgtattc cttctacctt 800 gatgagaaga ttgtggggaa ccactcagct ccctgtggtg gaaccacctc 850 cctcctcttc ccagtgaagt cagaacagga tgctgggaac tactcctgcg 900 aggctgagaa cagtgtctcc agagagagga gtgagcccaa gaagctgtct 950 ctgaagggtt ctcaagtctt gttcactccc gccagcaact ggctggttcc 1000 ttggcttcct gcgagcctgc ttggcctgat ggttattgct gctgcacttc 1050 tggtttatgt gagatcctgg agaaaagctg ggccccttcc atcccagata 1100 ccacccacag ctccaggtgg agagcagtgc ccactatatg ccaacgtgca 1150 tcaccagaaa gggaaagatg aaggtgttgt ctactctgtg gtgcatagaa 1200 cctcaaagag gagtgaagga cagttctatc atctgtgcgg aggtgagatg 1250 cctgcagccc agtgaggttt catccacgga ggtgaatatg agaagcagga 1300 ctctccaaga accccttagc gactgtgagg aggttctctg ctagtgatgg 1350 tgttctccta tcaacacacg cccaccccca gtctccagtg ctcctcagga 1400 agacagtggg gtcctcaact ctttctgtgg gtccttcagt tcccaagccc 1450 agcatcacag agccccctga gcccttgtcc tggtcaggag cacctgaacc 1500 ctgggttctt ttcttagcag aagaccaacc aatggaatgg gaagggagat 1550 gctcccacca acacacacac ttaggttcaa tcagtgacac tggacacata 1600 agccacagat gtcttctttc catacaagca tgttagttcg ccccaatata 1650 catatatata tgaaatagtc atgtgccgca taacaacatt tcagtcagtg 1700 atagactgca tacacaacag tggtcccata agactgtaat ggagtttaaa 1750 aattcctact gcctagtgat atcatagttg ccttaacatc ataacacaac 1800 acatttctca cgcgtttgtg gtgatgctgg tacaaacaag ctacagcgcc 1850 gctagtcata tacaaatata gcacatacaa ttatgtacag tacactatac 1900 ttgataatga taataaacaa ctatgttact ggt 1933

<210> 44

<211> 392

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

�et �eu Pro ser �eu �al Pro Cys �al Gly �ys Thr �al Trp �eu 1 5 10 15

Tyr �eu Gln Ala Trp Pro Asn Pro �al Phe Glu Gly Asp Ala �eu 20 25 30

Thr �eu Arg Cys Gln Gly Trp �ys Asn Thr Pro �eu ser Gln �al 35 40 45

�ys Phe Tyr Arg Asp Gly �ys Phe �eu His Phe ser �ys Glu Asn 50 55 60

Gln Thr �eu ser �et Gly Ala Ala Thr �al Gln ser Arg Gly Gln 65 70 75

Tyr ser Cys ser Gly Gln �al �et Tyr Ile Pro Gln Thr Phe Thr 80 85 90

Gln Thr ser Glu Thr Ala �et �al Gln �al Gln Glu �eu Phe Pro 95 100 105

Pro Pro �al �eu ser Ala Ile Pro ser Pro Glu Pro Arg Glu Gly 110 115 120

ser �eu �al Thr �eu Arg Cys Gln Thr �ys �eu His Pro �eu Arg 125 130 135

ser Ala �eu Arg �eu �eu Phe ser Phe His �ys Asp Gly His Thr 140 145 150

�eu Gln Asp Arg Gly Pro His Pro Glu �eu Cys Ile Pro Gly Ala 155 160 165

�ys Glu Gly Asp ser Gly �eu Tyr Trp Cys Glu �al Ala Pro Glu 170 175 180

Gly Gly Gln �al Gln �ys Gln ser Pro Gln �eu Glu �al Arg �al 185 190 195

Gln Ala Pro �al ser Arg Pro �al �eu Thr �eu His His Gly Pro 200 205 210

Ala Asp Pro Ala �al Gly Asp �et �al Gln �eu �eu Cys Glu Ala

215 220 225 Gln Arg Gly ser Pro Pro Ile �eu Tyr ser Phe Tyr �eu Asp Glu 230 235 240 �ys Ile �al Gly Asn His ser Ala Pro Cys Gly Gly Thr Thr ser 245 250 255 �eu �eu Phe Pro �al �ys ser Glu Gln Asp Ala Gly Asn Tyr ser 260 265 270 Cys Glu Ala Glu Asn ser �al ser Arg Glu Arg ser Glu Pro �ys 275 280 285 �ys �eu ser �eu �ys Gly ser Gln �al �eu Phe Thr Pro Ala ser 290 295 300 Asn Trp �eu �al Pro Trp �eu Pro Ala ser �eu �eu Gly �eu �et 305 310 315 �al Ile Ala Ala Ala �eu �eu �al Tyr �al Arg ser Trp Arg �ys 320 325 330 Ala Gly Pro �eu Pro ser Gln Ile Pro Pro Thr Ala Pro Gly Gly 335 340 345 Glu Gln Cys Pro �eu Tyr Ala Asn �al His His Gln �ys Gly �ys 350 355 360 Asp Glu Gly �al �al Tyr ser �al �al His Arg Thr ser �ys Arg 365 370 375 ser Glu Gly Gln Phe Tyr His �eu Cys Gly Gly Glu �et Pro Ala 380 385 390 Ala Gln

<210> 45

<211> 900

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45 ccattgttct caacattcta gctgctcttg ctgcatttgc tctggaattc 50 ttgtagagat attacttgtc cttccaggct gttctttctg tagctccctt 100 gttttctttt tgtgatcatg ttgcagatgg ctgggcagtg ctcccaaaat 150 gaatattttg acagtttgtt gcatgcttgc ataccttgtc aacttcgatg 200 ttcttctaat actcctcctc taacatgtca gcgttattgt aatgcaagtg 250 tgaccaattc agtgaaagga acgaatgcga ttctctggac ctgtttggga 300 ctgagcttaa taatttcttt ggcagttttc gtgctaatgt ttttgctaag 350 gaagataagc tctgaaccat taaaggacga gtttaaaaac acaggatcag 400 gtctcctggg catggctaac attgacctgg aaaagagcag gactggtgat 450 gaaattattc ttccgagagg cctcgagtac acggtggaag aatgcacctg 500 tgaagactgc atcaagagca aaccgaaggt cgactctgac cattgctttc 550 cactcccagc tatggaggaa ggcgcaacca ttcttgtcac cacgaaaacg 600

aatgactatt gcaagagcct gccagctgct ttgagtgcta cggagataga 650

gaaatcaatt tctgctaggt aattaaccat ttcgactcga gcagtgccac 700

tttaaaaatc ttttgtcaga atagatgatg tgtcagatct ctttaggatg 750

actgtatttt tcagttgccg atacagcttt ttgtcctcta actgtggaaa 800

ctctttatgt tagatatatt tctctaggtt actgttggga gcttaatggt 850

agaaacttcc ttggtttcat gattaaagtc tttttttttc ctgaaaaaaa 900

<210> 46

<211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

�et �eu Gln �et Ala Gly Gln Cys ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp 1 5 10 15

ser �eu �eu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln �eu Arg Cys ser ser 20 25 30

Asn Thr Pro Pro �eu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala ser �al 35 40 45

Thr Asn ser �al �ys Gly Thr Asn Ala Ile �eu Trp Thr Cys �eu 50 55 60

Gly �eu ser �eu Ile Ile ser �eu Ala �al Phe �al �eu �et Phe 65 70 75

�eu �eu Arg �ys Ile ser ser Glu Pro �eu �ys Asp Glu Phe �ys 80 85 90

Asn Thr Gly ser Gly �eu �eu Gly �et Ala Asn Ile Asp �eu Glu 95 100 105

�ys ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile �eu Pro Arg Gly �eu Glu 110 115 120

Tyr Thr �al Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile �ys ser �ys 125 130 135

Pro �ys �al Asp ser Asp His Cys Phe Pro �eu Pro Ala �et Glu 140 145 150

Glu Gly Ala Thr Ile �eu �al Thr Thr �ys Thr Asn Asp Tyr Cys 155 160 165

�ys ser �eu Pro Ala Ala �eu ser Ala Thr Glu Ile Glu �ys ser 170 175 180

Ile ser Ala Arg

<210> 47

<211> 337

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> No seguro

<222> 106, 108, 168, 298

<223> �ase desconocida

<400> 47

cttcccagcc ttcggaacta tggagcccgc actctccagt tcatcaccac 50 cccagcatcc ctactcttgc atctaacagt ttccgctatt ttgcaccacc 100 tgcctngncc ttatgggcaa ctcaaggaag aaaggaaaga agagatagag 150 gaaaaatgga ttcaacanat gaaagtgttc tttctgacta ctgctgtgtt 200 tacaaacatt ttaatcatca aaacatgctt tatttgatag aaagatcaaa 250 tctgcctttg taaaacaaga gactatttta atcattaaga caacacanat 300 gtttgatttg gaggcgtgtt ctcattcaaa accttgc 337

<210> 48

<211> 1922

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48 ggagagtctg accaccatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct 50 tcctcacccc catggaagtc aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg 100 gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc ctcaagggga cctcagatgg 150 ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt aaacccttct 200 taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 250 gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta 300 cctgtgccag ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga 350 cagtcaatgt ggagggcagc ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac 400 ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac aggtcctcag agggccccag 450 ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg tgggccaaag 500 accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtgtccc accgagggac 550 agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac 600 actctggctg tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc aggggccccc 650 tctcctggac ccatgtgcac cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta 700 gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat atgtgggtaa tggagacggg 750 tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag tattattgtc 800 accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca 850 gtactatggc actggctgct gaggactggt ggctggaagg tctcagctgt 900 gactttggct tatctgatct tctgcctgtg ttcccttgtg ggcattcttc 950 atcttcaaag agccctggtc ctgaggagga aaagaaagcg aatgactgac 1000 cccaccagga gattcttcaa agtgacgcct cccccaggaa gcgggcccca 1050 gaaccagtac gggaacgtgc tgtctctccc cacacccacc tcaggcctcg 1100 gacgcgccca gcgttgggcc gcaggcctgg ggggcactgc cccgtcttat 1150 ggaaacccga gcagcgacgt ccaggcggat ggagccttgg ggtcccggag 1200 ccgccgggag tgggcccaga agaagaggaa ggggagggct atgaggaacc 1250 tgacagtgag gaggactccg agttctatga gaacgactcc aaccttgggc 1300 aggaccagct ctcccaggat ggcagcggct acgagaaccc tgaggatgag 1350 cccctgggtc ctgaggatga agactccttc tccaacgctg agtcttatga 1400 gaacgaggat gaagagctga cccagccggt cgccaggaca atggacttcc 1450 tgagccctca tgggtcagcc tgggacccca gccgggaagc aacctccctg 1500 gggtcccagt cctatgagga tatgagagga atcctgtatg cagcccccca 1550 gctccgctcc attcggggcc agcctggacc caatcatgag gaagatgcag 1600 actcttatga gaacatggat aatcccgatg ggccagaccc agcctgggga 1650 ggagggggcc gcatgggcac ctggagcacc aggtgatcct caggtggcca 1700 gcctggatct cctcaagtcc ccaagattca cacctgactc tgaaatctga 1750 agacctcgag cagatgatgc caacctctgg agcaatgttg cttaggatgt 1800 gtgcatgtgt gtaagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtat 1850 acatgccagt gacacttcca gtcccctttg tattccttaa ataaactcaa 1900 tgagctcttc caaaaaaaaa aa 1922

<210> 49

<211> 467

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49 �et Pro Pro Pro Arg �eu �eu Phe Phe �eu �eu Phe �eu Thr Pro 1 5 10 15

�et Glu �al Arg Pro Glu Glu Pro �eu �al �al �ys �al Glu Glu 20 25 30

Gly Asp Asn Ala �al �eu Gln Cys �eu �ys Gly Thr ser Asp Gly 35 40 45

Pro Thr Gln Gln �eu Thr Trp ser Arg Glu ser Pro �eu �ys Pro 50 55 60

Phe �eu �ys �eu ser �eu Gly �eu Pro Gly �eu Gly Ile His �et 65 70 75

Arg Pro �eu Ala Ile Trp �eu Phe Ile Phe Asn �al ser Gln Gln 80 85 90

�et Gly Gly Phe Tyr �eu Cys Gln Pro Gly Pro Pro ser Glu �ys 95 100 105

Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr �al Asn �al Glu Gly ser Gly Glu 110 115 120

�eu Phe Arg Trp Asn �al ser Asp �eu Gly Gly �eu Gly Cys Gly 125 130 135

�eu �ys Asn Arg ser ser Glu Gly Pro ser ser Pro ser Gly �ys 140 145 150

�eu �et ser Pro �ys �eu Tyr �al Trp Ala �ys Asp Arg Pro Glu 155 160 165

Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys �al Pro Pro Arg Asp ser �eu 170 175 180

Asn Gln ser �eu ser Gln Asp �eu Thr �et Ala Pro Gly ser Thr 185 190 195

�eu Trp �eu ser Cys Gly �al Pro Pro Asp ser �al ser Arg Gly 200 205 210

Pro �eu ser Trp Thr His �al His Pro �ys Gly Pro �ys ser �eu 215 220 225

�eu ser �eu Glu �eu �ys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp �et Trp 230 235 240

�al �et Glu Thr Gly �eu �eu �eu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp 245 250 255

Ala Gly �ys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn �eu Thr �et ser Phe 260 265 270

His �eu Glu Ile Thr Ala Arg Pro �al �eu Trp His Trp �eu �eu 275 280 285

Arg Thr Gly Gly Trp �ys �al ser Ala �al Thr �eu Ala Tyr �eu 290 295 300

Ile Phe Cys �eu Cys ser �eu �al Gly Ile �eu His �eu Gln Arg 305 310 315

Ala �eu �al �eu Arg Arg �ys Arg �ys Arg �et Thr Asp Pro Thr 320 325 330

Arg Arg Phe Phe �ys �al Thr Pro Pro Pro Gly ser Gly Pro Gln 335 340 345

Asn Gln Tyr Gly Asn �al �eu ser �eu Pro Thr Pro Thr ser Gly 350 355 360

�eu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala Ala Gly �eu Gly Gly Thr Ala 365 370 375

Pro ser Tyr Gly Asn Pro ser ser Asp �al Gln Ala Asp Gly Ala 380 385 390

�eu Gly ser Arg ser Arg Arg Glu Trp Ala Gln �ys �ys Arg �ys 395 400 405

Gly Arg Ala �et Arg Asn �eu Thr �al Arg Arg Thr Pro ser ser 410 415 420

�et Arg Thr Thr Pro Thr �eu Gly Arg Thr ser ser Pro Arg �et 425 430 435

Ala Ala Ala Thr Arg Thr �eu Arg �et ser Pro Trp �al �eu Arg 440 445 450

�et �ys Thr Pro ser Pro Thr �eu ser �eu �et Arg Thr Arg �et 455 460 465

�ys ser

<210> 50

<211> 3260

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50 ccatcccata gtgagggaag acacgcggaa acaggcttgc acccagacac 50 gacaccatgc atctcctcgg cccctggctc ctgctcctgg ttctagaata 100 cttggctttc tctgactcaa gtaaatgggt ttttgagcac cctgaaaccc 150 tctacgcctg ggagggggcc tgcgtctgga tcccctgcac ctacagagcc 200 ctagatggtg acctggaaag cttcatcctg ttccacaatc ctgagtataa 250 caagaacacc tcgaagtttg atgggacaag actctatgaa agcacaaagg 300 atgggaaggt tccttctgag cagaaaaggg tgcaattcct gggagacaag 350 aataagaact gcacactgag tatccacccg gtgcacctca atgacagtgg 400 tcagctgggg ctgaggatgg agtccaagac tgagaaatgg atggaacgaa 450 tacacctcaa tgtctctgaa aggccttttc cacctcatat ccagctccct 500 ccagaaattc aagagtccca ggaagtcact ctgacctgct tgctgaattt 550 ctcctgctat gggtatccga tccaattgca gtggctccta gagggggttc 600 caatgaggca ggctgctgtc acctcgacct ccttgaccat caagtctgtc 650 ttcacccgga gcgagctcaa gttctcccca cagtggagtc accatgggaa 700 gattgtgacc tgccagcttc aggatgcaga tgggaagttc ctctccaatg 750 acacggtgca gctgaacgtg aagcacaccc cgaagttgga gatcaaggtc 800 actcccagtg atgccatagt gagggagggg gactctgtga ccatgacctg 850 cgaggtcagc agcagcaacc cggagtacac gacggtatcc tggctcaagg 900 atgggacctc gctgaagaag cagaatacat tcacgctaaa cctgcgcgaa 950 gtgaccaagg accagagtgg gaagtactgc tgtcaggtct ccaatgacgt 1000 gggcccggga aggtcggaag aagtgttcct gcaagtgcag tatgccccgg 1050 aaccttccac ggttcagatc ctccactcac cggctgtgga gggaagtcaa 1100 gtcgagtttc tttgcatgtc actggccaat cctcttccaa caaattacac 1150 gtggtaccac aatgggaaag aaatgcaggg aaggacagag gagaaagtcc 1200 acatcccaaa gatcctcccc tggcacgctg ggacttattc ctgtgtggca 1250 gaaaacattc ttggtactgg acagaggggc ccgggagctg agctggatgt 1300 ccagtatcct cccaagaagg tgaccacagt gattcaaaac cccatgccga 1350 ttcgagaagg agacacagtg accctttcct gtaactacaa ttccagtaac 1400 cccagtgtta cccggtatga atggaaaccc catggcgcct gggaggagcc 1450 atcgcttggg gtgctgaaga tccaaaacgt tggctgggac aacacaacca 1500 tcgcctgcgc acgttgtaat agttggtgct cgtgggcctc ccctgtcgcc 1550 ctgaatgtcc agtatgcccc ccgagacgtg agggtccgga aaatcaagcc 1600 cctttccgag attcactctg gaaactcggt cagcctccaa tgtgacttct 1650 caagcagcca ccccaaagaa gtccagttct tctgggagaa aaatggcagg 1700 cttctgggga aagaaagcca gctgaatttt gactccatct ccccagaaga 1750 tgctgggagt tacagctgct gggtgaacaa ctccatagga cagacagcgt 1800 ccaaggcctg gacacttgaa gtgctgtatg cacccaggag gctgcgtgtg 1850 tccatgagcc cgggggacca agtgatggag gggaagagtg caaccctgac 1900 ctgtgagagt gacgccaacc ctcccgtctc ccactacacc tggtttgact 1950 ggaataacca aagcctcccc caccacagcc agaagctgag attggagccg 2000 gtgaaggtcc agcactcggg tgcctactgg tgccagggga ccaacagtgt 2050 gggcaagggc cgttcgcctc tcagcaccct tactgtctac tatagcccgg 2100 agaccatcgg caggcgagtg gctgtgggac tcgggtcctg cctcgccatc 2150 ctcatcctgg caatctgtgg gctcaagctc cagcgacgtt ggaagaggac 2200 acagagccag caggggcttc aggagaattc cagcggccag agcttctttg 2250 tgaggaataa aaaggttaga agggcccccc tctctgaagg cccccactcc 2300 ctgggatgct acaatccaat gatggaagat ggcattagct acaccaccct 2350 gcgctttccc gagatgaaca taccacgaac tggagatgca gagtcctcag 2400 agatgcagag acctccccgg acctgcgatg acacggtcac ttattcagca 2450 ttgcacaagc gccaagtggg cgactatgag aacgtcattc cagattttcc 2500 agaagatgag gggattcatt actcagagct gatccagttt ggggtcgggg 2550 agcggcctca ggcacaagaa aatgtggact atgtgatcct caaacattga 2600 cactggatgg gctgcagcag aggcactggg ggcagcgggg gccagggaag 2650 tccccgagtt tccccagaca ccgccacatg gcttcctcct gcgtgcatgt 2700 gcgcacacac acacacacac gcacacacac acacacacac tcactgcgga 2750 gaaccttgtg cctggctcag agccagtctt tttggtgagg gtaaccccaa 2800 acctccaaaa ctcctgcccc tgttctcttc cactctcctt gctacccaga 2850 aatcatctaa atacctgccc tgacatgcac acctcccctg ccccaccagc 2900 ccactggcca tctccacccg gagctgctgt gtcctctgga tctgctcgtc 2950 attttccttc ccttctccat ctctctggcc ctctacccct gatctgacat 3000 ccccactcac gaatattatg cccagtttct gcctctgagg gaaagcccag 3050 aaaaggacag aaacgaagta gaaaggggcc cagtcctggc ctggcttctc 3100 ctttggaagt gaggcattgc acggggagac gtacgtatca gcggcccctt 3150 gactctgggg actccgggtt tgagatggac acactggtgt ggattaacct 3200 gccagggaga cagagctcac aataaaaatg gctcagatgc cacttcaaag 3250 aaaaaaaaaa 3260

<210> 51

<211> 847 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

�et His �eu �eu Gly Pro Trp �eu �eu �eu �eu �al �eu Glu Tyr 1 5 10 15

�eu Ala Phe ser Asp ser ser �ys Trp �al Phe Glu His Pro Glu 20 25 30

Thr �eu Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys �al Trp Ile Pro Cys Thr 35 40 45

Tyr Arg Ala �eu Asp Gly Asp �eu Glu ser Phe Ile �eu Phe His 50 55 60

Asn Pro Glu Tyr Asn �ys Asn Thr ser �ys Phe Asp Gly Thr Arg 65 70 75

�eu Tyr Glu ser Thr �ys Asp Gly �ys �al Pro ser Glu Gln �ys 80 85 90

Arg �al Gln Phe �eu Gly Asp �ys Asn �ys Asn Cys Thr �eu ser 95 100 105

Ile His Pro �al His �eu Asn Asp ser Gly Gln �eu Gly �eu Arg 110 115 120

�et Glu ser �ys Thr Glu �ys Trp �et Glu Arg Ile His �eu Asn 125 130 135

�al ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln �eu Pro Pro Glu 140 145 150

Ile Gln Glu ser Gln Glu �al Thr �eu Thr Cys �eu �eu Asn Phe 155 160 165

ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln �eu Gln Trp �eu �eu Glu Gly 170 175 180

�al Pro �et Arg Gln Ala Ala �al Thr ser Thr ser �eu Thr Ile 185 190 195

�ys ser �al Phe Thr Arg ser Glu �eu �ys Phe ser Pro Gln Trp 200 205 210

ser His His Gly �ys Ile �al Thr Cys Gln �eu Gln Asp Ala Asp 215 220 225

Gly �ys Phe �eu ser Asn Asp Thr �al Gln �eu Asn �al �ys His 230 235 240

Thr Pro �ys �eu Glu Ile �ys �al Thr Pro ser Asp Ala Ile �al 245 250 255

Arg Glu Gly Asp ser �al Thr �et Thr Cys Glu �al ser ser ser 260 265 270

Asn Pro Glu Tyr Thr Thr �al ser Trp �eu �ys Asp Gly Thr ser 275 280 285

�eu �ys �ys Gln Asn Thr Phe Thr �eu Asn �eu Arg Glu �al Thr 290 295 300

�ys Asp Gln ser Gly �ys Tyr Cys Cys Gln �al ser Asn Asp �al 305 310 315

Gly Pro Gly Arg ser Glu Glu �al Phe �eu Gln �al Gln Tyr Ala

320 325 330

Pro Glu Pro ser Thr �al Gln Ile �eu His ser Pro Ala �al Glu 335 340 345

Gly ser Gln �al Glu Phe �eu Cys �et ser �eu Ala Asn Pro �eu 350 355 360

Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly �ys Glu �et Gln Gly 365 370 375

Arg Thr Glu Glu �ys �al His Ile Pro �ys Ile �eu Pro Trp His 380 385 390

Ala Gly Thr Tyr ser Cys �al Ala Glu Asn Ile �eu Gly Thr Gly 395 400 405

Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu �eu Asp �al Gln Tyr Pro Pro �ys 410 415 420

�ys �al Thr Thr �al Ile Gln Asn Pro �et Pro Ile Arg Glu Gly 425 430 435

Asp Thr �al Thr �eu ser Cys Asn Tyr Asn ser ser Asn Pro ser 440 445 450

�al Thr Arg Tyr Glu Trp �ys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro 455 460 465

ser �eu Gly �al �eu �ys Ile Gln Asn �al Gly Trp Asp Asn Thr 470 475 480

Thr Ile Ala Cys Ala Arg Cys Asn ser Trp Cys ser Trp Ala ser 485 490 495

Pro �al Ala �eu Asn �al Gln Tyr Ala Pro Arg Asp �al Arg �al 500 505 510

Arg �ys Ile �ys Pro �eu ser Glu Ile His ser Gly Asn ser �al 515 520 525

ser �eu Gln Cys Asp Phe ser ser ser His Pro �ys Glu �al Gln 530 535 540

Phe Phe Trp Glu �ys Asn Gly Arg �eu �eu Gly �ys Glu ser Gln 545 550 555

�eu Asn Phe Asp ser Ile ser Pro Glu Asp Ala Gly ser Tyr ser 560 565 570

Cys Trp �al Asn Asn ser Ile Gly Gln Thr Ala ser �ys Ala Trp 575 580 585

Thr �eu Glu �al �eu Tyr Ala Pro Arg Arg �eu Arg �al ser �et 590 595 600

ser Pro Gly Asp Gln �al �et Glu Gly �ys ser Ala Thr �eu Thr 605 610 615

Cys Glu ser Asp Ala Asn Pro Pro �al ser His Tyr Thr Trp Phe 620 625 630

Asp Trp Asn Asn Gln ser �eu Pro His His ser Gln �ys �eu Arg 635 640 645

�eu Glu Pro �al �ys �al Gln His ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gln 650 655 660

Gly Thr Asn ser �al Gly �ys Gly Arg ser Pro �eu ser Thr �eu 665 670 675

Thr �al Tyr Tyr ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg �al Ala �al 680 685 690

Gly �eu Gly ser Cys �eu Ala Ile �eu Ile �eu Ala Ile Cys Gly 695 700 705

�eu �ys �eu Gln Arg Arg Trp �ys Arg Thr Gln ser Gln Gln Gly 710 715 720

�eu Gln Glu Asn ser ser Gly Gln ser Phe Phe �al Arg Asn �ys 725 730 735

�ys �al Arg Arg Ala Pro �eu ser Glu Gly Pro His ser �eu Gly 740 745 750

Cys Tyr Asn Pro �et �et Glu Asp Gly Ile ser Tyr Thr Thr �eu 755 760 765

Arg Phe Pro Glu �et Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu ser 770 775 780

ser Glu �et Gln Arg Pro Pro Arg Thr Cys Asp Asp Thr �al Thr 785 790 795

Tyr ser Ala �eu His �ys Arg Gln �al Gly Asp Tyr Glu Asn �al 800 805 810

Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu Gly Ile His Tyr ser Glu �eu 815 820 825

Ile Gln Phe Gly �al Gly Glu Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn �al 830 835 840

Asp Tyr �al Ile �eu �ys His 845

<210> 52

<211> 1670

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52 ccaaccacaa gcaccaaagc agaggggcag gcagcacacc acccagcagc 50 cagagcacca gcccagccat ggtccttgag gtgagtgacc accaagtgct 100 aaatgacgcc gaggttgccg ccctcctgga gaacttcagc tcttcctatg 150 actatggaga aaacgagagt gactcgtgct gtacctcccc gccctgccca 200 caggacttca gcctgaactt cgaccgggcc ttcctgccag ccctctacag 250 cctcctcttt ctgctggggc tgctgggcaa cggcgcggtg gcagccgtgc 300 tgctgagccg gcggacagcc ctgagcagca ccgacacctt cctgctccac 350 ctagctgtag cagacacgct gctggtgctg acactgccgc tctgggcagt 400 ggacgctgcc gtccagtggg tctttggctc tggcctctgc aaagtggcag 450 gtgccctctt caacatcaac ttctacgcag gagccctcct gctggcctgc 500 atcagctttg accgctacct gaacatagtt catgccaccc agctctaccg 550 ccgggggccc ccggcccgcg tgaccctcac ctgcctggct gtctgggggc 600

tctgcctgct tttcgccctc ccagacttca tcttcctgtc ggcccaccac 650 gacgagcgcc tcaacgccac ccactgccaa tacaacttcc cacaggtggg 700 ccgcacggct ctgcgggtgc tgcagctggt ggctggcttt ctgctgcccc 750 tgctggtcat ggcctactgc tatgcccaca tcctggccgt gctgctggtt 800 tccaggggcc agcggcgcct gcgggccatg cggctggtgg tggtggtcgt 850 ggtggccttt gccctctgct ggacccccta tcacctggtg gtgctggtgg 900 acatcctcat ggacctgggc gctttggccc gcaactgtgg ccgagaaagc 950 agggtagacg tggccaagtc ggtcacctca ggcctgggct acatgcactg 1000 ctgcctcaac ccgctgctct atgcctttgt aggggtcaag ttccgggagc 1050 ggatgtggat gctgctcttg cgcctgggct gccccaacca gagagggctc 1100 cagaggcagc catcgtcttc ccgccgggat tcatcctggt ctgagacctc 1150 agaggcctcc tactcgggct tgtgaggccg gaatccgggc tcccctttcg 1200 cccacagtct gacttccccg cattccaggc tcctccctcc ctctgccggc 1250 tctggctctc cccaatatcc tcgctcccgg gactcactgg cagccccagc 1300 accaccaggt ctcccgggaa gccaccctcc cagctctgag gactgcacca 1350 ttgctgctcc ttagctgcca agccccatcc tgccgcccga ggtggctgcc 1400 tggagcccca ctgcccttct catttggaaa ctaaaacttc atcttcccca 1450 agtgcgggga gtacaaggca tggcgtagag ggtgctgccc catgaagcca 1500 cagcccaggc ctccagctca gcagtgactg tggccatggt ccccaagacc 1550 tctatatttg ctcttttatt tttatgtcta aaatcctgct taaaactttt 1600 caataaacaa gatcgtcagg accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1650 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1670

<210> 53

<211> 368

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53 �et �al �eu Glu �al ser Asp His Gln �al �eu Asn Asp Ala Glu 1 5 10 15

�al Ala Ala �eu �eu Glu Asn Phe ser ser ser Tyr Asp Tyr Gly 20 25 30

Glu Asn Glu ser Asp ser Cys Cys Thr ser Pro Pro Cys Pro Gln 35 40 45

Asp Phe ser �eu Asn Phe Asp Arg Ala Phe �eu Pro Ala �eu Tyr 50 55 60

ser �eu �eu Phe �eu �eu Gly �eu �eu Gly Asn Gly Ala �al Ala 65 70 75

Ala �al �eu �eu ser Arg Arg Thr Ala �eu ser ser Thr Asp Thr 80 85 90

Phe �eu �eu His �eu Ala �al Ala Asp Thr �eu �eu �al �eu Thr 95 100 105

�eu Pro �eu Trp Ala �al Asp Ala Ala �al Gln Trp �al Phe Gly 110 115 120

ser Gly �eu Cys �ys �al Ala Gly Ala �eu Phe Asn Ile Asn Phe 125 130 135

Tyr Ala Gly Ala �eu �eu �eu Ala Cys Ile ser Phe Asp Arg Tyr 140 145 150

�eu Asn Ile �al His Ala Thr Gln �eu Tyr Arg Arg Gly Pro Pro 155 160 165

Ala Arg �al Thr �eu Thr Cys �eu Ala �al Trp Gly �eu Cys �eu 170 175 180

�eu Phe Ala �eu Pro Asp Phe Ile Phe �eu ser Ala His His Asp 185 190 195

Glu Arg �eu Asn Ala Thr His Cys Gln Tyr Asn Phe Pro Gln �al 200 205 210

Gly Arg Thr Ala �eu Arg �al �eu Gln �eu �al Ala Gly Phe �eu 215 220 225

�eu Pro �eu �eu �al �et Ala Tyr Cys Tyr Ala His Ile �eu Ala 230 235 240

�al �eu �eu �al ser Arg Gly Gln Arg Arg �eu Arg Ala �et Arg 245 250 255

�eu �al �al �al �al �al �al Ala Phe Ala �eu Cys Trp Thr Pro 260 265 270

Tyr His �eu �al �al �eu �al Asp Ile �eu �et Asp �eu Gly Ala 275 280 285

�eu Ala Arg Asn Cys Gly Arg Glu ser Arg �al Asp �al Ala �ys 290 295 300

ser �al Thr ser Gly �eu Gly Tyr �et His Cys Cys �eu Asn Pro 305 310 315

�eu �eu Tyr Ala Phe �al Gly �al �ys Phe Arg Glu Arg �et Trp 320 325 330

�et �eu �eu �eu Arg �eu Gly Cys Pro Asn Gln Arg Gly �eu Gln 335 340 345

Arg Gln Pro ser ser ser Arg Arg Asp ser ser Trp ser Glu Thr 350 355 360

ser Glu Ala ser Tyr ser Gly �eu 365

<210> 54

<211> 2109

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54 gagggaagaa cacaatggat ctggtgctaa aaagatgcct tcttcatttg 50

gctgtgatag gtgctttgct ggctgtgggg gctacaaaag tacccagaaa 100

ccaggactgg cttggtgtct caaggcaact cagaaccaaa gcctggaaca 150 ggcagctgta tccagagtgg acagaagccc agagacttga ctgctggaga 200 ggtggtcaag tgtccctcaa ggtcagtaat gatgggccta cactgattgg 250 tgcaaatgcc tccttctcta ttgccttgaa cttccctgga agccaaaagg 300 tattgccaga tgggcaggtt atctgggtca acaataccat catcaatggg 350 agccaggtgt ggggaggaca gccagtgtat ccccaggaaa ctgacgatgc 400 ctgcatcttc cctgatggtg gaccttgccc atctggctct tggtctcaga 450 agagaagctt tgtttatgtc tggaagacct ggggccaata ctggcaagtt 500 ctagggggcc cagtgtctgg gctgagcatt gggacaggca gggcaatgct 550 gggcacacac accatggaag tgactgtcta ccatcgccgg ggatcccgga 600 gctatgtgcc tcttgctcat tccagctcag ccttcaccat tactgaccag 650 gtgcctttct ccgtgagcgt gtcccagttg cgggccttgg atggagggaa 700 caagcacttc ctgagaaatc agcctctgac ctttgccctc cagctccatg 750 accccagtgg ctatctggct gaagctgacc tctcctacac ctgggacttt 800 ggagacagta gtggaaccct gatctctcgg gcacttgtgg tcactcatac 850 ttacctggag cctggcccag tcactgccca ggtggtcctg caggctgcca 900 ttcctctcac ctcctgtggc tcctccccag ttccaggcac cacagatggg 950 cacaggccaa ctgcagaggc ccctaacacc acagctggcc aagtgcctac 1000 tacagaagtt gtgggtacta cacctggtca ggcgccaact gcagagccct 1050 ctggaaccac atctgtgcag gtgccaacca ctgaagtcat aagcactgca 1100 cctgtgcaga tgccaactgc agagagcaca ggtatgacac ctgagaaggt 1150 gccagtttca gaggtcatgg gtaccacact ggcagagatg tcaactccag 1200 aggctacagg tatgacacct gcagaggtat caattgtggt gctttctgga 1250 accacagctg cacaggtaac aactacagag tgggtggaga ccacagctag 1300 agagctacct atccctgagc ctgaaggtcc agatgccagc tcaatcatgt 1350 ctacggaaag tattacaggt tccctgggcc ccctgctgga tggtacagcc 1400 accttaaggc tggtgaagag acaagtcccc ctggattgtg ttctgtatcg 1450 atatggttcc ttttccgtca ccctggacat tgtccagggt attgaaagtg 1500 ccgagatcct gcaggctgtg ccgtccggtg agggggatgc atttgagctg 1550 actgtgtcct gccaaggcgg gctgcccaag gaagcctgca tggagatctc 1600 atcgccaggg tgccagcccc ctgcccagcg gctgtgccag cctgtgctac 1650 ccagcccagc ctgccagctg gttctgcacc agatactgaa gggtggctcg 1700 gggacatact gcctcaatgt gtctctggct gataccaaca gcctggcagt 1750 ggtcagcacc cagcttatca tgcctggtca agaagcaggc cttgggcagg 1800 ttccgctgat cgtgggcatc ttgctggtgt tgatggctgt ggtccttgca 1850 tctctgatat ataggcgcag acttatgaag caagacttct ccgtacccca 1900 gttgccacat agcagcagtc actggctgcg tctaccccgc atcttctgct 1950 cttgtcccat tggtgagaac agccccctcc tcagtgggca gcaggtctga 2000 gtactctcat atgatgctgt gattttcctg gagttgacag aaacacctat 2050 atttccccca gtcttccctg ggagactact attaactgaa ataaatactc 2100 agagcctga 2109

<210> 55

<211> 661

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

�et Asp �eu �al �eu �ys Arg Cys �eu �eu His �eu Ala �al Ile 1 5 10 15

Gly Ala �eu �eu Ala �al Gly Ala Thr �ys �al Pro Arg Asn Gln 20 25 30

Asp Trp �eu Gly �al ser Arg Gln �eu Arg Thr �ys Ala Trp Asn 35 40 45

Arg Gln �eu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg �eu Asp Cys 50 55 60

Trp Arg Gly Gly Gln �al ser �eu �ys �al ser Asn Asp Gly Pro 65 70 75

Thr �eu Ile Gly Ala Asn Ala ser Phe ser Ile Ala �eu Asn Phe 80 85 90

Pro Gly ser Gln �ys �al �eu Pro Asp Gly Gln �al Ile Trp �al 95 100 105

Asn Asn Thr Ile Ile Asn Gly ser Gln �al Trp Gly Gly Gln Pro 110 115 120

�al Tyr Pro Gln Glu Thr Asp Asp Ala Cys Ile Phe Pro Asp Gly 125 130 135

Gly Pro Cys Pro ser Gly ser Trp ser Gln �ys Arg ser Phe �al 140 145 150

Tyr �al Trp �ys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln �al �eu Gly Gly 155 160 165

Pro �al ser Gly �eu ser Ile Gly Thr Gly Arg Ala �et �eu Gly 170 175 180

Thr His Thr �et Glu �al Thr �al Tyr His Arg Arg Gly ser Arg 185 190 195

ser Tyr �al Pro �eu Ala His ser ser ser Ala Phe Thr Ile Thr 200 205 210

Asp Gln �al Pro Phe ser �al ser �al ser Gln �eu Arg Ala �eu 215 220 225

Asp Gly Gly Asn �ys His Phe �eu Arg Asn Gln Pro �eu Thr Phe 230 235 240

Ala �eu Gln �eu His Asp Pro ser Gly Tyr �eu Ala Glu Ala Asp 245 250 255

�eu ser Tyr Thr Trp Asp Phe Gly Asp ser ser Gly Thr �eu Ile 260 265 270

ser Arg Ala �eu �al �al Thr His Thr Tyr �eu Glu Pro Gly Pro 275 280 285

�al Thr Ala Gln �al �al �eu Gln Ala Ala Ile Pro �eu Thr ser 290 295 300

Cys Gly ser ser Pro �al Pro Gly Thr Thr Asp Gly His Arg Pro 305 310 315

Thr Ala Glu Ala Pro Asn Thr Thr Ala Gly Gln �al Pro Thr Thr 320 325 330

Glu �al �al Gly Thr Thr Pro Gly Gln Ala Pro Thr Ala Glu Pro 335 340 345

ser Gly Thr Thr ser �al Gln �al Pro Thr Thr Glu �al Ile ser 350 355 360

Thr Ala Pro �al Gln �et Pro Thr Ala Glu ser Thr Gly �et Thr 365 370 375

Pro Glu �ys �al Pro �al ser Glu �al �et Gly Thr Thr �eu Ala 380 385 390

Glu �et ser Thr Pro Glu Ala Thr Gly �et Thr Pro Ala Glu �al 395 400 405

ser Ile �al �al �eu ser Gly Thr Thr Ala Ala Gln �al Thr Thr 410 415 420

Thr Glu Trp �al Glu Thr Thr Ala Arg Glu �eu Pro Ile Pro Glu 425 430 435

Pro Glu Gly Pro Asp Ala ser ser Ile �et ser Thr Glu ser Ile 440 445 450

Thr Gly ser �eu Gly Pro �eu �eu Asp Gly Thr Ala Thr �eu Arg 455 460 465

�eu �al �ys Arg Gln �al Pro �eu Asp Cys �al �eu Tyr Arg Tyr 470 475 480

Gly ser Phe ser �al Thr �eu Asp Ile �al Gln Gly Ile Glu ser 485 490 495

Ala Glu Ile �eu Gln Ala �al Pro ser Gly Glu Gly Asp Ala Phe 500 505 510

Glu �eu Thr �al ser Cys Gln Gly Gly �eu Pro �ys Glu Ala Cys 515 520 525

�et Glu Ile ser ser Pro Gly Cys Gln Pro Pro Ala Gln Arg �eu 530 535 540

Cys Gln Pro �al �eu Pro ser Pro Ala Cys Gln �eu �al �eu His 545 550 555

Gln Ile �eu �ys Gly Gly ser Gly Thr Tyr Cys �eu Asn �al ser 560 565 570

�eu Ala Asp Thr Asn ser �eu Ala �al �al ser Thr Gln �eu Ile 575 580 585

�et Pro Gly Gln Glu Ala Gly �eu Gly Gln �al Pro �eu Ile �al 590 595 600

Gly Ile �eu �eu �al �eu �et Ala �al �al �eu Ala ser �eu Ile 605 610 615

Tyr Arg Arg Arg �eu �et �ys Gln Asp Phe ser �al Pro Gln �eu 620 625 630

Pro His ser ser ser His Trp �eu Arg �eu Pro Arg Ile Phe Cys 635 640 645

ser Cys Pro Ile Gly Glu Asn ser Pro �eu �eu ser Gly Gln Gln 650 655 660

�al

<210> 56

<211> 2772

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 56 cagtcggcac cggcgaggcc gtgctggaac ccgggcctca gccgcagccg 50 cagcggggcc gacatgacga cagctcccca ggagcccccc gcccggcccc 100 tccaggcggg cagtggagct ggcccggcgc ctgggcgcgc catgcgcagc 150 accacgctcc tggccctgct ggcgctggtc ttgctttact tggtgtctgg 200 tgccctggtg ttccgggccc tggagcagcc ccacgagcag caggcccaga 250 gggagctggg ggaggtccga gagaagttcc tgagggccca tccgtgtgtg 300 agcgaccagg agctgggcct cctcatcaag gaggtggctg atgccctggg 350 agggggtgcg gacccagaaa ccaactcgac cagcaacagc agccactcag 400 cctgggacct gggcagcgcc ttctttttct cagggaccat catcaccacc 450 atcggctatg gcaatgtggc cctgcgcaca gatgccgggc gcctcttctg 500 catcttctat gcgctggtgg ggattccgct gtttgggatc ctactggcag 550 gggtcgggga ccggctgggc tcctccctgc gccatggcat cggtcacatt 600 gaagccatct tcttgaagtg gcacgtgcca ccggagctag taagagtgct 650 gtcggcgatg cttttcctgc tgatcggctg cctgctcttt gtcctcacgc 700 ccacgttcgt gttctgctat atggaggact ggagcaagct ggaggccatc 750 tactttgtca tagtgacgct taccaccgtg ggctttggcg actatgtggc 800 cggcgcggac cccaggcagg actccccggc ctatcagccg ctggtgtggt 850 tctggatcct gctcggcctg gcttacttcg cctcagtgct caccaccatc 900 gggaactggc tgcgagtagt gtcccgccgc actcgggcag agatgggcgg 950 cctcacggct caggctgcca gctggactgg cacagtgaca gcgcgcgtga 1000 cccagcgagc cgggcccgcc gccccgccgc cggagaagga gcagccactg 1050 ctgcctccac cgccctgtcc agcgcagccg ctgggcaggc cccgatcccc 1100 ttcgcccccc gagaaggctc agctgccttc cccgcccacg gcctcggccc 1150 tggattatcc cagcgagaac ctggccttca tcgacgagtc ctcggatacg 1200 cagagcgagc gcggctgccc gctgccccgc gcgccgagag gtcgccgccg 1250 cccaaatccc cccaggaagc ccgtgcggcc ccgcggcccc gggcgtcccc 1300 gagacaaagg cgtgccggtg taggggcagg atccctggcc gggcctctca 1350 agggcttcgt ttctgctctc cccggcatgc ctggcttgtt tgaccaaaga 1400 gccctctttc cacgagactg aagtctgggg aggaggctac agttgcctct 1450 ccgcctcctc cctggccccg gcccttccct cacttccatc catctctaga 1500 cccccccaag gctttctgtg tcgctgcccc gggcgggtgt atccctcaca 1550 gcacctcacg actgtgcctc aaagcctgca tcaataaatg aaaacggtct 1600 gcaccgctgc gggcgtgacg ctcccggacg cgagtgggtg tggaattgct 1650 ttcctcgggc caccgtgggg gcacctctgg cctcccgtga cccccaggcc 1700 gagggtcccc gggcacccag gtcggtcaag tctcggccct ctcaggcccg 1750 cgtctctgcc tggaggagac tgtgtagggt ccggcgtggg gatcagccgg 1800 gatgggctgc gcgtctccag cctctgcaca cacattggcg ggtggggtgc 1850 agggagggag aggcagggga gagagaatgg catctcgcgt ggagggctgt 1900 cgtttgaact ctcccagcgc gagagaccct gccccgcccc cttcctggag 1950 cgttgactcc cttctcgtct cgaggcctgt ggcgtctggg tccgttgggg 2000 cagaaccatg gaggaaaagc cttcgaaagt gtcgctcaag tcttccgacc 2050 gccaaggctc ggacgaggag agcgtgcata gcgacactcg ggacctgtgg 2100 accacgacca cgctgtccca ggcacagctg aacatgccgc tgtccgaggt 2150 ctgcgagggc ttcgacgagg agggccgcaa cattagcaag acccgcgggt 2200 ggcacagccc ggggcggggc tcgttggacg aggggtacaa ggccagccac 2250 aagccggagg aactggacga gcacgcgctg gtggagctgg agttgcaccg 2300 cggcagctcc atggaaatca atctggggga gaaggacact gcatcccaga 2350 tcgaggccga aaagtcttcc tcaatgtcat cactcaatat tgcgaagcac 2400 atgccccatc gagcctactg ggcagagcag cagagcaggc tgccactgcc 2450 cctgatggaa ctcatggaga atgaagctct ggaaatcctc accaaagccc 2500 tccggagcta ccagttaggg atcggcaggg accacttcct gactaaggag 2550 ctgcagcgat acatcgaagg gctcaagaag cgccggagca agaggctgta 2600 cgtgaattaa aaacgccacc ttgggctcga gcagcgaccc gaaccagccc 2650 cgtgccagcc cggtccccag acccaagcct gaccccatcc gagtggaatt 2700 tgagtcctaa agaaataaaa gagtcgatgc atgaaaaaaa aaaaaaaaaa 2750 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2772

<210> 57

<211> 419

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

�et Thr Thr Ala Pro Gln Glu Pro Pro Ala Arg Pro �eu Gln Ala 1 5 10 15

Gly ser Gly Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Ala �et Arg ser Thr 20 25 30

Thr �eu �eu Ala �eu �eu Ala �eu �al �eu �eu Tyr �eu �al ser 35 40 45

Gly Ala �eu �al Phe Arg Ala �eu Glu Gln Pro His Glu Gln Gln 50 55 60

Ala Gln Arg Glu �eu Gly Glu �al Arg Glu �ys Phe �eu Arg Ala 65 70 75

His Pro Cys �al ser Asp Gln Glu �eu Gly �eu �eu Ile �ys Glu 80 85 90

�al Ala Asp Ala �eu Gly Gly Gly Ala Asp Pro Glu Thr Asn ser 95 100 105

Thr ser Asn ser ser His ser Ala Trp Asp �eu Gly ser Ala Phe 110 115 120

Phe Phe ser Gly Thr Ile Ile Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asn �al 125 130 135

Ala �eu Arg Thr Asp Ala Gly Arg �eu Phe Cys Ile Phe Tyr Ala 140 145 150

�eu �al Gly Ile Pro �eu Phe Gly Ile �eu �eu Ala Gly �al Gly 155 160 165

Asp Arg �eu Gly ser ser �eu Arg His Gly Ile Gly His Ile Glu 170 175 180

Ala Ile Phe �eu �ys Trp His �al Pro Pro Glu �eu �al Arg �al 185 190 195

�eu ser Ala �et �eu Phe �eu �eu Ile Gly Cys �eu �eu Phe �al 200 205 210

�eu Thr Pro Thr Phe �al Phe Cys Tyr �et Glu Asp Trp ser �ys 215 220 225

�eu Glu Ala Ile Tyr Phe �al Ile �al Thr �eu Thr Thr �al Gly 230 235 240

Phe Gly Asp Tyr �al Ala Gly Ala Asp Pro Arg Gln Asp ser Pro 245 250 255

Ala Tyr Gln Pro �eu �al Trp Phe Trp Ile �eu �eu Gly �eu Ala 260 265 270

Tyr Phe Ala ser �al �eu Thr Thr Ile Gly Asn Trp �eu Arg �al 275 280 285

�al ser Arg Arg Thr Arg Ala Glu �et Gly Gly �eu Thr Ala Gln 290 295 300

Ala Ala ser Trp Thr Gly Thr �al Thr Ala Arg �al Thr Gln Arg

305 310 315

Ala Gly Pro Ala Ala Pro Pro Pro Glu �ys Glu Gln Pro �eu �eu 320 325 330

Pro Pro Pro Pro Cys Pro Ala Gln Pro �eu Gly Arg Pro Arg ser 335 340 345

Pro ser Pro Pro Glu �ys Ala Gln �eu Pro ser Pro Pro Thr Ala 350 355 360

ser Ala �eu Asp Tyr Pro ser Glu Asn �eu Ala Phe Ile Asp Glu 365 370 375

ser ser Asp Thr Gln ser Glu Arg Gly Cys Pro �eu Pro Arg Ala 380 385 390

Pro Arg Gly Arg Arg Arg Pro Asn Pro Pro Arg �ys Pro �al Arg 395 400 405

Pro Arg Gly Pro Gly Arg Pro Arg Asp �ys Gly �al Pro �al 410 415

<210> 58

<211> 2814

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 58 gccaacactg gccaaacaga agcctccggt cggcctgcag tgcccaagtc 50 ccatggcgag ggcagcccga gtggccgtcg cggctgtagg tccgcatgcc 100 gggcaccgca ccaggcgtct agcagatgga cacaggaaga tccagaagct 150 agtggcacat ctagcaacag agccagatca gaacccagat gctaaactcc 200 tggtggactg cagaggagag ggattcagtc ttctcctgat gtcgattgcg 250 atttctgctg ggagctcaag acgggcgagc tgcccgagat ctcttcgaga 300 taccccaggg gaggaggaga tgggcaggat ttagtaggac aactcggtta 350 ctaatgactt ggcggctggc tgcgaccccc cgggaaatca ggtgcaagca 400 tgtttgcctg taggtacctg agttgacacc gaaggtgcct aaagatgctg 450 agcggcgttt ggttcctcag tgtgttaacc gtggccggga tcttacagac 500 agagagtcgc aaaactgcca aagacatttg caagatccgc tgtctgtgcg 550 aagaaaagga aaacgtactg aatatcaact gtgagaacaa aggatttaca 600 acagttagcc tgctccagcc cccccagtat cgaatctatc agctttttct 650 caatggaaac ctcttgacaa gactgtatcc aaacgaattt gtcaattact 700 ccaacgcggt gactcttcac ctaggtaaca acgggttaca ggagatccga 750 acgggggcat tcagtggcct gaaaactctc aaaagactgc atctcaacaa 800 caacaagctt gagatattga gggaggacac cttcctaggc ctggagagcc 850 tggagtatct ccaggccgac tacaattaca tcagtgccat cgaggctggg 900 gcattcagca aacttaacaa gctcaaagtg ctcatcctga atgacaacct 950 tctgctttca ctgcccagca atgtgttccg ctttgtcctg ctgacccact 1000 tagacctcag ggggaatagg ctaaaagtaa tgccttttgc tggcgtcctt 1050 gaacatattg gagggatcat ggagattcag ctggaggaaa atccatggaa 1100 ttgcacttgt gacttacttc ctctcaaggc ctggctagac accataactg 1150 tttttgtggg agagattgtc tgtgagactc cctttaggtt gcatgggaaa 1200 gacgtgaccc agctgaccag gcaagacctc tgtcccagaa aaagtgccag 1250 tgattccagt cagaggggca gccatgctga cacccacgtc caaaggctgt 1300 cacctacaat gaatcctgct ctcaacccaa ccagggctcc gaaagccagc 1350 cggccgccca aaatgagaaa tcgtccaact ccccgagtga ctgtgtcaaa 1400 ggacaggcaa agttttggac ccatcatggt gtaccagacc aagtctcctg 1450 tgcctctcac ctgtcccagc agctgtgtct gcacctctca gagctcagac 1500 aatggtctga atgtaaactg ccaagaaagg aagttcacta atatctctga 1550 cctgcagccc aaaccgacca gtccaaagaa actctaccta acagggaact 1600 atcttcaaac tgtctataag aatgacctct tagaatacag ttctttggac 1650 ttactgcact taggaaacaa caggattgca gtcattcagg aaggtgcctt 1700 tacaaacctg accagtttac gcagacttta tctgaatggc aattaccttg 1750 aagtgctgta cccttctatg tttgatggac tgcagagctt gcaatatctc 1800 tatttagagt ataatgtcat taaggaaatt aagcctctga cctttgatgc 1850 tttgattaac ctacagctac tgtttctgaa caacaacctt cttcggtcct 1900 tacctgataa tatatttggg gggacggccc taaccaggct gaatctgaga 1950 aacaaccatt tttctcacct gcccgtgaaa ggggttctgg atcagctccc 2000 ggctttcatc cagatagatc tgcaggagaa cccctgggac tgtacctgtg 2050 acatcatggg gctgaaagac tggacagaac atgccaattc ccctgtcatc 2100 attaatgagg tgacttgcga atctcctgct aagcatgcag gggagatact 2150 aaaatttctg gggagggagg ctatctgtcc agacagccca aacttgtcag 2200 atggaaccgt cttgtcaatg aatcacaata cagacacacc tcggtcgctt 2250 agtgtgtctc ctagttccta tcctgaacta cacactgaag ttccactgtc 2300 tgtcttaatt ctgggattgc ttgttgtttt catcttatct gtctgttttg 2350 gggctggttt attcgtcttt gtcttgaaac gccgaaaggg agtgccgagc 2400 gttcccagga ataccaacaa cttagacgta agctcctttc aattacagta 2450 tgggtcttac aacactgaga ctcacgataa aacagacggc catgtctaca 2500 actatatccc cccacctgtg ggtcagatgt gccaaaaccc catctacatg 2550 cagaaggaag gagacccagt agcctattac cgaaacctgc aggagttcaa 2600 gaccagccta gagaacatat ggagaccctg tcttcacaaa aaataaaaaa 2650 gtcagccaag cgtggtggtg tgtgcctgta gttacttagg aggctgaggc 2700 aggacgatcg cttaagccca ggagtttgag gctgtggtga gctacaattg 2750 cgccactgca cgccagcctg gctacagaac gagaccctgc ctctctaaaa 2800 aaaaaaaaaa aaaa 2814

<210> 59

<211> 733

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59 �et �eu ser Gly �al Trp Phe �eu ser �al �eu Thr �al Ala Gly 1 5 10 15

Ile �eu Gln Thr Glu ser Arg �ys Thr Ala �ys Asp Ile Cys �ys 20 25 30

Ile Arg Cys �eu Cys Glu Glu �ys Glu Asn �al �eu Asn Ile Asn 35 40 45

Cys Glu Asn �ys Gly Phe Thr Thr �al ser �eu �eu Gln Pro Pro 50 55 60

Gln Tyr Arg Ile Tyr Gln �eu Phe �eu Asn Gly Asn �eu �eu Thr 65 70 75

Arg �eu Tyr Pro Asn Glu Phe �al Asn Tyr ser Asn Ala �al Thr 80 85 90

�eu His �eu Gly Asn Asn Gly �eu Gln Glu Ile Arg Thr Gly Ala 95 100 105

Phe ser Gly �eu �ys Thr �eu �ys Arg �eu His �eu Asn Asn Asn 110 115 120

�ys �eu Glu Ile �eu Arg Glu Asp Thr Phe �eu Gly �eu Glu ser 125 130 135

�eu Glu Tyr �eu Gln Ala Asp Tyr Asn Tyr Ile ser Ala Ile Glu 140 145 150

Ala Gly Ala Phe ser �ys �eu Asn �ys �eu �ys �al �eu Ile �eu 155 160 165

Asn Asp Asn �eu �eu �eu ser �eu Pro ser Asn �al Phe Arg Phe 170 175 180

�al �eu �eu Thr His �eu Asp �eu Arg Gly Asn Arg �eu �ys �al 185 190 195

�et Pro Phe Ala Gly �al �eu Glu His Ile Gly Gly Ile �et Glu 200 205 210

Ile Gln �eu Glu Glu Asn Pro Trp Asn Cys Thr Cys Asp �eu �eu 215 220 225

Pro �eu �ys Ala Trp �eu Asp Thr Ile Thr �al Phe �al Gly Glu 230 235 240

Ile �al Cys Glu Thr Pro Phe Arg �eu His Gly �ys Asp �al Thr 245 250 255

Gln �eu Thr Arg Gln Asp �eu Cys Pro Arg �ys ser Ala ser Asp 260 265 270

ser ser Gln Arg Gly ser His Ala Asp Thr His �al Gln Arg �eu 275 280 285

ser Pro Thr �et Asn Pro Ala �eu Asn Pro Thr Arg Ala Pro �ys 290 295 300

Ala ser Arg Pro Pro �ys �et Arg Asn Arg Pro Thr Pro Arg �al 305 310 315

Thr �al ser �ys Asp Arg Gln ser Phe Gly Pro Ile �et �al Tyr 320 325 330

Gln Thr �ys ser Pro �al Pro �eu Thr Cys Pro ser ser Cys �al 335 340 345

Cys Thr ser Gln ser ser Asp Asn Gly �eu Asn �al Asn Cys Gln 350 355 360

Glu Arg �ys Phe Thr Asn Ile ser Asp �eu Gln Pro �ys Pro Thr 365 370 375

ser Pro �ys �ys �eu Tyr �eu Thr Gly Asn Tyr �eu Gln Thr �al 380 385 390

Tyr �ys Asn Asp �eu �eu Glu Tyr ser ser �eu Asp �eu �eu His 395 400 405

�eu Gly Asn Asn Arg Ile Ala �al Ile Gln Glu Gly Ala Phe Thr 410 415 420

Asn �eu Thr ser �eu Arg Arg �eu Tyr �eu Asn Gly Asn Tyr �eu 425 430 435

Glu �al �eu Tyr Pro ser �et Phe Asp Gly �eu Gln ser �eu Gln 440 445 450

Tyr �eu Tyr �eu Glu Tyr Asn �al Ile �ys Glu Ile �ys Pro �eu 455 460 465

Thr Phe Asp Ala �eu Ile Asn �eu Gln �eu �eu Phe �eu Asn Asn 470 475 480

Asn �eu �eu Arg ser �eu Pro Asp Asn Ile Phe Gly Gly Thr Ala 485 490 495

�eu Thr Arg �eu Asn �eu Arg Asn Asn His Phe ser His �eu Pro 500 505 510

�al �ys Gly �al �eu Asp Gln �eu Pro Ala Phe Ile Gln Ile Asp 515 520 525

�eu Gln Glu Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Asp Ile �et Gly �eu 530 535 540

�ys Asp Trp Thr Glu His Ala Asn ser Pro �al Ile Ile Asn Glu 545 550 555

�al Thr Cys Glu ser Pro Ala �ys His Ala Gly Glu Ile �eu �ys 560 565 570

Phe �eu Gly Arg Glu Ala Ile Cys Pro Asp ser Pro Asn �eu ser 575 580 585

Asp Gly Thr �al �eu ser �et Asn His Asn Thr Asp Thr Pro Arg 590 595 600

ser �eu ser �al ser Pro ser ser Tyr Pro Glu �eu His Thr Glu 605 610 615

�al Pro �eu ser �al �eu Ile �eu Gly �eu �eu �al �al Phe Ile 620 625 630

�eu ser �al Cys Phe Gly Ala Gly �eu Phe �al Phe �al �eu �ys 635 640 645

Arg Arg �ys Gly �al Pro ser �al Pro Arg Asn Thr Asn Asn �eu 650 655 660

Asp �al ser ser Phe Gln �eu Gln Tyr Gly ser Tyr Asn Thr Glu 665 670 675

Thr His Asp �ys Thr Asp Gly His �al Tyr Asn Tyr Ile Pro Pro 680 685 690

Pro �al Gly Gln �et Cys Gln Asn Pro Ile Tyr �et Gln �ys Glu 695 700 705

Gly Asp Pro �al Ala Tyr Tyr Arg Asn �eu Gln Glu Phe �ys Thr 710 715 720

ser �eu Glu Asn Ile Trp Arg Pro Cys �eu His �ys �ys 725 730

<210> 60

<211> 3679

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 60 aaggaggctg ggaggaaaga ggtaagaaag gttagagaac ctacctcaca 50 tctctctggg ctcagaagga ctctgaagat aacaataatt tcagcccatc 100 cactctcctt ccctcccaaa cacacatgtg catgtacaca cacacataca 150 cacacataca ccttcctctc cttcactgaa gactcacagt cactcactct 200 gtgagcaggt catagaaaag gacactaaag ccttaaggac aggcctggcc 250 attacctctg cagctccttt ggcttgttga gtcaaaaaac atgggagggg 300 ccaggcacgg tgactcacac ctgtaatccc agcattttgg gagaccgagg 350 tgagcagatc acttgaggtc aggagttcga gaccagcctg gccaacatgg 400 agaaaccccc atctctacta aaaatacaaa aattagccag gagtggtggc 450 aggtgcctgt aatcccagct actcaggtgg ctgagccagg agaatcgctt 500 gaatccagga ggcggaggat gcagtcagct gagtgcaccg ctgcactcca 550 gcctgggtga cagaatgaga ctctgtctca aacaaacaaa cacgggagga 600 ggggtagata ctgcttctct gcaacctcct taactctgca tcctcttctt 650 ccagggctgc ccctgatggg gcctggcaat gactgagcag gcccagcccc 700 agaggacaag gaagagaagg catattgagg agggcaagaa gtgacgcccg 750 gtgtagaatg actgccctgg gagggtggtt ccttgggccc tggcagggtt 800 gctgaccctt accctgcaaa acacaaagag caggactcca gactctcctt 850 gtgaatggtc ccctgccctg cagctccacc atgaggcttc tcgtggcccc 900 actcttgcta gcttgggtgg ctggtgccac tgccactgtg cccgtggtac 950 cctggcatgt tccctgcccc cctcagtgtg cctgccagat ccggccctgg 1000 tatacgcccc gctcgtccta ccgcgaggct accactgtgg actgcaatga 1050 cctattcctg acggcagtcc ccccggcact ccccgcaggc acacagaccc 1100 tgctcctgca gagcaacagc attgtccgtg tggaccagag tgagctgggc 1150 tacctggcca atctcacaga gctggacctg tcccagaaca gcttttcgga 1200 tgcccgagac tgtgatttcc atgccctgcc ccagctgctg agcctgcacc 1250 tagaggagaa ccagctgacc cggctggagg accacagctt tgcagggctg 1300 gccagcctac aggaactcta tctcaaccac aaccagctct accgcatcgc 1350 ccccagggcc ttttctggcc tcagcaactt gctgcggctg cacctcaact 1400 ccaacctcct gagggccatt gacagccgct ggtttgaaat gctgcccaac 1450 ttggagatac tcatgattgg cggcaacaag gtagatgcca tcctggacat 1500 gaacttccgg cccctggcca acctgcgtag cctggtgcta gcaggcatga 1550 acctgcggga gatctccgac tatgccctgg aggggctgca aagcctggag 1600 agcctctcct tctatgacaa ccagctggcc cgggtgccca ggcgggcact 1650 ggaacaggtg cccgggctca agttcctaga cctcaacaag aacccgctcc 1700 agcgggtagg gccgggggac tttgccaaca tgctgcacct taaggagctg 1750 ggactgaaca acatggagga gctggtctcc atcgacaagt ttgccctggt 1800 gaacctcccc gagctgacca agctggacat caccaataac ccacggctgt 1850 ccttcatcca cccccgcgcc ttccaccacc tgccccagat ggagaccctc 1900 atgctcaaca acaacgctct cagtgccttg caccagcaga cggtggagtc 1950 cctgcccaac ctgcaggagg taggtctcca cggcaacccc atccgctgtg 2000 actgtgtcat ccgctgggcc aatgccacgg gcacccgtgt ccgcttcatc 2050 gagccgcaat ccaccctgtg tgcggagcct ccggacctcc agcgcctccc 2100 ggtccgtgag gtgcccttcc gggagatgac ggaccactgt ttgcccctca 2150 tctccccacg aagcttcccc ccaagcctcc aggtagccag tggagagagc 2200 atggtgctgc attgccgggc actggccgaa cccgaacccg agatctactg 2250 ggtcactcca gctgggcttc gactgacacc tgcccatgca ggcaggaggt 2300 accgggtgta ccccgagggg accctggagc tgcggagggt gacagcagaa 2350 gaggcagggc tatacacctg tgtggcccag aacctggtgg gggctgacac 2400 taagacggtt agtgtggttg tgggccgtgc tctcctccag ccaggcaggg 2450 acgaaggaca ggggctggag ctccgggtgc aggagaccca cccctatcac 2500 atcctgctat cttgggtcac cccacccaac acagtgtcca ccaacctcac 2550 ctggtccagt gcctcctccc tccggggcca gggggccaca gctctggccc 2600 gcctgcctcg gggaacccac agctacaaca ttacccgcct ccttcaggcc 2650 acggagtact gggcctgcct gcaagtggcc tttgctgatg cccacaccca 2700 gttggcttgt gtatgggcca ggaccaaaga ggccacttct tgccacagag 2750 ccttagggga tcgtcctggg ctcattgcca tcctggctct cgctgtcctt 2800 ctcctggcag ctgggctagc ggcccacctt ggcacaggcc aacccaggaa 2850 gggtgtgggt gggaggcggc ctctccctcc agcctgggct ttctggggct 2900 ggagtgcccc ttctgtccgg gttgtgtctg ctcccctcgt cctgccctgg 2950 aatccaggga ggaagctgcc cagatcctca gaaggggaga cactgttgcc 3000 accattgtct caaaattctt gaagctcagc ctgttctcag cagtagagaa 3050 atcactagga ctacttttta ccaaaagaga agcagtctgg gccagatgcc 3100 ctgccaggaa agggacatgg acccacgtgc ttgaggcctg gcagctgggc 3150 caagacagat ggggctttgt ggccctgggg gtgcttctgc agccttgaaa 3200 aagttgccct tacctcctag ggtcacctct gctgccattc tgaggaacat 3250 ctccaaggaa caggagggac tttggctaga gcctcctgcc tccccatctt 3300 ctctctgccc agaggctcct gggcctggct tggctgtccc ctacctgtgt 3350 ccccgggctg caccccttcc tcttctcttt ctctgtacag tctcagttgc 3400 ttgctcttgt gcctcctggg caagggctga aggaggccac tccatctcac 3450 ctcggggggc tgccctcaat gtgggagtga ccccagccag atctgaagga 3500 catttgggag agggatgccc aggaacgcct catctcagca gcctgggctc 3550 ggcattccga agctgacttt ctataggcaa ttttgtacct ttgtggagaa 3600 atgtgtcacc tcccccaacc cgattcactc ttttctcctg ttttgtaaaa 3650 aataaaaata aataataaca ataaaaaaa 3679

<210> 61

<211> 713

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61 �et Arg �eu �eu �al Ala Pro �eu �eu �eu Ala Trp �al Ala Gly 1 5 10 15

Ala Thr Ala Thr �al Pro �al �al Pro Trp His �al Pro Cys Pro 20 25 30

Pro Gln Cys Ala Cys Gln Ile Arg Pro Trp Tyr Thr Pro Arg ser 35 40 45

ser Tyr Arg Glu Ala Thr Thr �al Asp Cys Asn Asp �eu Phe �eu 50 55 60

Thr Ala �al Pro Pro Ala �eu Pro Ala Gly Thr Gln Thr �eu �eu 65 70 75

�eu Gln ser Asn ser Ile �al Arg �al Asp Gln ser Glu �eu Gly 80 85 90

Tyr �eu Ala Asn �eu Thr Glu �eu Asp �eu ser Gln Asn ser Phe 95 100 105

ser Asp Ala Arg Asp Cys Asp Phe His Ala �eu Pro Gln �eu �eu 110 115 120

ser �eu His �eu Glu Glu Asn Gln �eu Thr Arg �eu Glu Asp His 125 130 135

ser Phe Ala Gly �eu Ala ser �eu Gln Glu �eu Tyr �eu Asn His 140 145 150

Asn Gln �eu Tyr Arg Ile Ala Pro Arg Ala Phe ser Gly �eu ser 155 160 165

Asn �eu �eu Arg �eu His �eu Asn ser Asn �eu �eu Arg Ala Ile 170 175 180

Asp ser Arg Trp Phe Glu �et �eu Pro Asn �eu Glu Ile �eu �et 185 190 195

Ile Gly Gly Asn �ys �al Asp Ala Ile �eu Asp �et Asn Phe Arg 200 205 210

Pro �eu Ala Asn �eu Arg ser �eu �al �eu Ala Gly �et Asn �eu 215 220 225

Arg Glu Ile ser Asp Tyr Ala �eu Glu Gly �eu Gln ser �eu Glu 230 235 240

ser �eu ser Phe Tyr Asp Asn Gln �eu Ala Arg �al Pro Arg Arg 245 250 255

Ala �eu Glu Gln �al Pro Gly �eu �ys Phe �eu Asp �eu Asn �ys 260 265 270

Asn Pro �eu Gln Arg �al Gly Pro Gly Asp Phe Ala Asn �et �eu 275 280 285

His �eu �ys Glu �eu Gly �eu Asn Asn �et Glu Glu �eu �al ser 290 295 300

Ile Asp �ys Phe Ala �eu �al Asn �eu Pro Glu �eu Thr �ys �eu 305 310 315

Asp Ile Thr Asn Asn Pro Arg �eu ser Phe Ile His Pro Arg Ala 320 325 330

Phe His His �eu Pro Gln �et Glu Thr �eu �et �eu Asn Asn Asn 335 340 345

Ala �eu ser Ala �eu His Gln Gln Thr �al Glu ser �eu Pro Asn 350 355 360

�eu Gln Glu �al Gly �eu His Gly Asn Pro Ile Arg Cys Asp Cys 365 370 375

�al Ile Arg Trp Ala Asn Ala Thr Gly Thr Arg �al Arg Phe Ile 380 385 390

Glu Pro Gln ser Thr �eu Cys Ala Glu Pro Pro Asp �eu Gln Arg 395 400 405

�eu Pro �al Arg Glu �al Pro Phe Arg Glu �et Thr Asp His Cys 410 415 420

�eu Pro �eu Ile ser Pro Arg ser Phe Pro Pro ser �eu Gln �al 425 430 435

Ala ser Gly Glu ser �et �al �eu His Cys Arg Ala �eu Ala Glu

440 445 450

Pro Glu Pro Glu Ile Tyr Trp �al Thr Pro Ala Gly �eu Arg �eu 455 460 465

Thr Pro Ala His Ala Gly Arg Arg Tyr Arg �al Tyr Pro Glu Gly 470 475 480

Thr �eu Glu �eu Arg Arg �al Thr Ala Glu Glu Ala Gly �eu Tyr 485 490 495

Thr Cys �al Ala Gln Asn �eu �al Gly Ala Asp Thr �ys Thr �al 500 505 510

ser �al �al �al Gly Arg Ala �eu �eu Gln Pro Gly Arg Asp Glu 515 520 525

Gly Gln Gly �eu Glu �eu Arg �al Gln Glu Thr His Pro Tyr His 530 535 540

Ile �eu �eu ser Trp �al Thr Pro Pro Asn Thr �al ser Thr Asn 545 550 555

�eu Thr Trp ser ser Ala ser ser �eu Arg Gly Gln Gly Ala Thr 560 565 570

Ala �eu Ala Arg �eu Pro Arg Gly Thr His ser Tyr Asn Ile Thr 575 580 585

Arg �eu �eu Gln Ala Thr Glu Tyr Trp Ala Cys �eu Gln �al Ala 590 595 600

Phe Ala Asp Ala His Thr Gln �eu Ala Cys �al Trp Ala Arg Thr 605 610 615

�ys Glu Ala Thr ser Cys His Arg Ala �eu Gly Asp Arg Pro Gly 620 625 630

�eu Ile Ala Ile �eu Ala �eu Ala �al �eu �eu �eu Ala Ala Gly 635 640 645

�eu Ala Ala His �eu Gly Thr Gly Gln Pro Arg �ys Gly �al Gly 650 655 660

Gly Arg Arg Pro �eu Pro Pro Ala Trp Ala Phe Trp Gly Trp ser 665 670 675

Ala Pro ser �al Arg �al �al ser Ala Pro �eu �al �eu Pro Trp 680 685 690

Asn Pro Gly Arg �ys �eu Pro Arg ser ser Glu Gly Glu Thr �eu 695 700 705

�eu Pro Pro �eu ser Gln Asn ser 710

<210> 62

<211> 1186

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> No seguro

<222> 54-55

<223> �ase desconocida

<400> 62 ggcacgagcc ggcaagccga gctagggtga aaactggggg cgcaccagga 50

tgtnngacag aaaagcagaa gatgagactc tgttcattca cttttcctag 100 gcccatcctg tggtcatctt tccccctccc atcatacctc ctccttcctg 150 gagcctctgc cggcttggct gtaatggtgg cacttacctg gatatttcag 200 tgggaggatg aaaggcgaga ctcaccctac gcggtgggac agatggggag 250 aggaaaaagg cagagatggc caggagaggg gtgcaggaca aaccagagag 300 gttgggtcag gggaaaaggg tggggagaaa gaggggtgca ggccctgcag 350 gccggttagc cagcagctgc ggcctccccg ggcccttggc atccaacttc 400 gcagacaggg taccagcctc ctggtgtgta tcataggatt tgttcacata 450 gtgttatgca tgatcttcgt aaggttaaga agccgtggtg gtgcaccatg 500 acatccaacc cgtatatata aagataaata tatatatata tgtatgtaaa 550 ttatggcacg agaaattata gcactgaggg ccctgctgcc ctgctggacc 600 aagcaaaact aagccttttg gtttgggtat tatgtttcgt tttgttattt 650 gtttgttttt gtggcttgtc ttatgtcgtg atagcacaag tgccagtcgg 700 attgctctgt attacagaat agtgttttta attcatcaat gttctagtta 750 atgtctacct cagcacctcc tcttagccta attttaggag gttgcccaat 800 tttgtttctt caattttact ggttactttt ttgtacaaat caatctcttt 850 ctctctttct ctcctcccca cctctcaccc ttgccctctc catctccctc 900 tcccgccctc ccctcctccc tctggctccc cgtctcattt ctgtccactc 950 cattctctct ccctctctcc tgcctcctgc tgccccctcc ccagcccact 1000 tccccgagtt gtgcttgccg ctccttatct gttctagttc cgaagcagtt 1050 tcactcgaag ttgtgcagtc ctggttgcag ctttccgcat ctgccttcgt 1100 ttcgtgtaga ttgacgcgtt tctttgtaat ttcagtgttt ctgacaagat 1150 ttaaaaaaaa aaaaaggaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1186

<210> 63

<211> 145

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63 �et ser Thr ser Ala Pro Pro �eu ser �eu Ile �eu Gly Gly Cys 1 5 10 15

Pro Ile �eu Phe �eu Gln Phe Tyr Trp �eu �eu Phe Cys Thr Asn 20 25 30

Gln ser �eu ser �eu Phe �eu ser ser Pro Pro �eu Thr �eu Ala 35 40 45

�eu ser Ile ser �eu ser Arg Pro Pro �eu �eu Pro �eu Ala Pro 50 55 60

Arg �eu Ile ser �al His ser Ile �eu ser Pro ser �eu �eu Pro 65 70 75

Pro Ala Ala Pro ser Pro Ala His Phe Pro Glu �eu Cys �eu Pro 80 85 90

�eu �eu Ile Cys ser ser ser Glu Ala �al ser �eu Glu �al �al 95 100 105

Gln ser Trp �eu Gln �eu ser Ala ser Ala Phe �al ser Cys Arg 110 115 120

�eu Thr Arg Phe Phe �al Ile ser �al Phe �eu Thr Arg Phe �ys 125 130 135

�ys �ys �ys Arg �ys �ys �ys �ys �ys �ys 140 145

<210> 64

<211> 1685

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64 cccacgcgtc cgcacctcgg ccccgggctc cgaagcggct cgggggcgcc 50 ctttcggtca acatcgtagt ccaccccctc cccatcccca gcccccgggg 100 attcaggctc gccagcgccc agccagggag ccggccggga agcgcgatgg 150 gggccccagc cgcctcgctc ctgctcctgc tcctgctgtt cgcctgctgc 200 tgggcgcccg gcggggccaa cctctcccag gacgacagcc agccctggac 250 atctgatgaa acagtggtgg ctggtggcac cgtggtgctc aagtgccaag 300 tgaaagatca cgaggactca tccctgcaat ggtctaaccc tgctcagcag 350 actctctact ttggggagaa gagagccctt cgagataatc gaattcagct 400 ggttacctct acgccccacg agctcagcat cagcatcagc aatgtggccc 450 tggcagacga gggcgagtac acctgctcaa tcttcactat gcctgtgcga 500 actgccaagt ccctcgtcac tgtgctagga attccacaga agcccatcat 550 cactggttat aaatcttcat tacgggaaaa agacacagcc accctaaact 600 gtcagtcttc tgggagcaag cctgcagccc ggctcacctg gagaaagggt 650 gaccaagaac tccacggaga accaacccgc atacaggaag atcccaatgg 700 taaaaccttc actgtcagca gctcggtgac attccaggtt acccgggagg 750 atgatggggc gagcatcgtg tgctctgtga accatgaatc tctaaaggga 800 gctgacagat ccacctctca acgcattgaa gttttataca caccaactgc 850 gatgattagg ccagaccctc cccatcctcg tgagggccag aagctgttgc 900 tacactgtga gggtcgcggc aatccagtcc cccagcagta cctatgggag 950 aaggagggca gtgtgccacc cctgaagatg acccaggaga gtgccctgat 1000 cttccctttc ctcaacaaga gtgacagtgg cacctacggc tgcacagcca 1050 ccagcaacat gggcagctac aaggcctact acaccctcaa tgttaatgac 1100 cccagtccgg tgccctcctc ctccagcacc taccacgcca tcatcggtgg 1150 gatcgtggct ttcattgtct tcctgctgct catcatgctc atcttccttg 1200 gccactactt gatccggcac aaaggaacct acctgacaca tgaggcaaaa 1250 ggctccgacg atgctccaga cgcggacacg gccatcatca atgcagaagg 1300 cgggcagtca ggaggggacg acaagaagga atatttcatc tagaggcgcc 1350 tgcccacttc ctgcgccccc caggggccct gtggggactg ctggggccgt 1400 caccaacccg gacttgtaca gagcaaccgc agggccgccc ctcccgcttg 1450 ctccccagcc cacccacccc cctgtacaga atgtctgctt tgggtgcggt 1500 tttgtactcg gtttggaatg gggagggagg agggcggggg gaggggaggg 1550 ttgccctcag ccctttccgt ggcttctctg catttgggtt attattattt 1600 ttgtaacaat cccaaatcaa atctgtctcc aggctggaga ggcaggagcc 1650 ctggggtgag aaaagcaaaa aacaaacaaa aaaca 1685

<210> 65

<211> 398

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

�et Gly Ala Pro Ala Ala ser �eu �eu �eu �eu �eu �eu �eu Phe 1 5 10 15

Ala Cys Cys Trp Ala Pro Gly Gly Ala Asn �eu ser Gln Asp Asp 20 25 30

ser Gln Pro Trp Thr ser Asp Glu Thr �al �al Ala Gly Gly Thr 35 40 45

�al �al �eu �ys Cys Gln �al �ys Asp His Glu Asp ser ser �eu 50 55 60

Gln Trp ser Asn Pro Ala Gln Gln Thr �eu Tyr Phe Gly Glu �ys 65 70 75

Arg Ala �eu Arg Asp Asn Arg Ile Gln �eu �al Thr ser Thr Pro 80 85 90

His Glu �eu ser Ile ser Ile ser Asn �al Ala �eu Ala Asp Glu 95 100 105

Gly Glu Tyr Thr Cys ser Ile Phe Thr �et Pro �al Arg Thr Ala 110 115 120

�ys ser �eu �al Thr �al �eu Gly Ile Pro Gln �ys Pro Ile Ile 125 130 135

Thr Gly Tyr �ys ser ser �eu Arg Glu �ys Asp Thr Ala Thr �eu 140 145 150

Asn Cys Gln ser ser Gly ser �ys Pro Ala Ala Arg �eu Thr Trp 155 160 165

Arg �ys Gly Asp Gln Glu �eu His Gly Glu Pro Thr Arg Ile Gln 170 175 180

Glu Asp Pro Asn Gly �ys Thr Phe Thr �al ser ser ser �al Thr 185 190 195

Phe Gln �al Thr Arg Glu Asp Asp Gly Ala ser Ile �al Cys ser 200 205 210

�al Asn His Glu ser �eu �ys Gly Ala Asp Arg ser Thr ser Gln 215 220 225

Arg Ile Glu �al �eu Tyr Thr Pro Thr Ala �et Ile Arg Pro Asp 230 235 240

Pro Pro His Pro Arg Glu Gly Gln �ys �eu �eu �eu His Cys Glu 245 250 255

Gly Arg Gly Asn Pro �al Pro Gln Gln Tyr �eu Trp Glu �ys Glu 260 265 270

Gly ser �al Pro Pro �eu �ys �et Thr Gln Glu ser Ala �eu Ile 275 280 285

Phe Pro Phe �eu Asn �ys ser Asp ser Gly Thr Tyr Gly Cys Thr 290 295 300

Ala Thr ser Asn �et Gly ser Tyr �ys Ala Tyr Tyr Thr �eu Asn 305 310 315

�al Asn Asp Pro ser Pro �al Pro ser ser ser ser Thr Tyr His 320 325 330

Ala Ile Ile Gly Gly Ile �al Ala Phe Ile �al Phe �eu �eu �eu 335 340 345

Ile �et �eu Ile Phe �eu Gly His Tyr �eu Ile Arg His �ys Gly 350 355 360

Thr Tyr �eu Thr His Glu Ala �ys Gly ser Asp Asp Ala Pro Asp 365 370 375

Ala Asp Thr Ala Ile Ile Asn Ala Glu Gly Gly Gln ser Gly Gly 380 385 390

Asp Asp �ys �ys Glu Tyr Phe Ile 395

<210> 66

<211> 681

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66 cttggatctg cctgccaggc catcctgggc gctgcaggaa gcaacatgac 50 ttaggtaact gcccagaggt gcaccagaca tgatgcagca gccgcgagtg 100 gagacagata ccatcggggc tggcgagggg ccacagcagg cagtgcctgg 150 tcagcctggg tcacgaggca tggctgggtg cgctggtggg tgagccacat 200 gcccccgagc tggatccagt ggtggagcac ctcgaactgg cggcaaccgc 250 tgcagcgcct gctgtggggt ctggagggga tactctacct gctgctggca 300 ctgatgttgt gccatgcact cttcaccact ggctcccacc tgctgagctc 350 cttgtggcct gtcgtggccg cggtgtggcg ccacctgcta ccggctctcc 400 tgctgctggt gctcagtgct ctgcctgccc tcctcttcac ggcctccttc 450

ctgctgctct tctccacact gctgagcctt gtgggcctcc tcacctccat 500 gactcaccca ggcgacactc aggatttgga tcaatagaag ggcaacccca 550 tcccactgcc tgtgtttgtt gagccctggc ctagggcctg agaccccacg 600 gggagaggga gggcaatggg atcagggctc cctgccttgg cagggcccag 650 acccctagtc cctaacaggt aggctggcct g 681

<210> 67

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67 �et Pro Pro ser Trp Ile Gln Trp Trp ser Thr ser Asn Trp Arg 1 5 10 15

Gln Pro �eu Gln Arg �eu �eu Trp Gly �eu Glu Gly Ile �eu Tyr 20 25 30

�eu �eu �eu Ala �eu �et �eu Cys His Ala �eu Phe Thr Thr Gly 35 40 45

ser His �eu �eu ser ser �eu Trp Pro �al �al Ala Ala �al Trp 50 55 60

Arg His �eu �eu Pro Ala �eu �eu �eu �eu �al �eu ser Ala �eu 65 70 75

Pro Ala �eu �eu Phe Thr Ala ser Phe �eu �eu �eu Phe ser Thr 80 85 90

�eu �eu ser �eu �al Gly �eu �eu Thr ser �et Thr His Pro Gly 95 100 105

Asp Thr Gln Asp �eu Asp Gln 110

<210> 68

<211> 2600

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 68 acatgcgccc tgacagccca acaatggcgg cgcccgcgga gtcgctgagg 50 aggcggaaga ctgggtactc ggatccggag cctgagtcgc cgcccgcgcc 100 ggggcgtggc cccgcaggct ctccggccca tcttcacacg ggcaccttct 150 ggctgacccg gatcgtgctc ctgaaggccc tagccttcgt gtacttcgtg 200 gcattcctgg tggctttcca tcagaacaag cagctcatcg gtgacagggg 250 gctgcttccc tgcagagtgt tcctgaagga cttccagcag tacttccagg 300 acaggacaag ctgggaagtc ttcagctaca tgcccaccat cctctggctg 350 atggactggt cagacatgaa ctccaacctg gacttgctgg ctcttctcgg 400 actgggcatc tcgtctttcg tactgatcac gggttgcgcc aacatgcttc 450 tcatggctgc cctgtggggc ctctacatgt ccctggttaa tgtgggccat 500 gtctggtact ctttcggatg ggagtcccag cttctggaga cgggattcct 550 ggggatcttc ctgtgccctc tgtggacgct gtcaaggctg ccccagcata 600 cccccacatc ccggattgtc ctgtggggct tccggtggct gatcttcagg 650

atcatgcttg gagcaggcct gatcaagatc cggggggacc ggtgctggcg 700 agacctcacc tgcatggact tccactatga gacccagccg atgcccaatc 750 ctgtggcata ctacctgcac cactcaccct ggtggttcca tcgcttcgag 800 acgctcagca accacttcat cgagctcctg gtgcccttct tcctcttcct 850 cggccggcgg gcgtgcatca tccacggggt gctgcagatc ctgttccagg 900 ccgtcctcat cgtcagcggg aacctcagct tcctgaactg gctgactatg 950 gtgcccagcc tggcctgctt tgatgacgcc accctgggat tcttgttccc 1000 ctctgggcca ggcagcctga aggaccgagt tctgcagatg cagagggaca 1050 tccgaggggc ccggcccgag cccagattcg gctccgtggt gcggcgtgca 1100 gccaacgtct cgctgggcgt cctgctggcc tggctcagcg tgcccgtggt 1150 cctcaacttg ctgagctcca ggcaggtcat gaacacccac ttcaactctc 1200 ttcacatcgt caacacttac ggggccttcg gaagcatcac caaggagcgg 1250 gcggaggtga tcctgcaggg cacagccagc tccaacgcca gcgcccccga 1300 tgccatgtgg gaggactacg agttcaagtg caagccaggt gaccccagca 1350 gacggccctg cctcatctcc ccgtaccact accgcctgga ctggctgatg 1400 tggttcgcgg ccttccagac ctacgagcac aacgactgga tcatccacct 1450 ggctggcaag ctcctggcca gcgacgccga ggccttgtcc ctgctggcac 1500 acaacccctt cgcgggcagg cccccgccca ggtgggtccg aggagagcac 1550 tacaggtaca agttcagccg tcctgggggc aggcacgccg ccgagggcaa 1600 gtggtgggtg cggaagagga tcggagccta cttccctccg ctcagcctgg 1650 aggagctgag gccctacttc agggaccgtg ggtggcctct gcccgggccc 1700 ctctagacgt gcaccagaaa taaaggcgaa gacccagccc ctcggcggct 1750 cagcaacgtt tgcccttccc tgcgcccagc ccaagctggg catcgccaag 1800 agagacgtgg agaggagagc ggtgggaccc agcccccagc acgggggtcc 1850 agggtggggt ctgttgtcac atactgtggc ggctcccagg ccctgcccac 1900 ctggggcccc acatccaggc caacccttgt cccaggcgcc aggggctctg 1950 atctcccatc catcccaccc tcctcccaga ggcccagcct ggggctgtgc 2000 cgcccacagg agttgagaca atggcaatcc tgacaccttc ctccactaca 2050 gccctgacca tagacccagc caggtagctc ttggggtctc tagcgtccca 2100 gggcctggtt tctgttccct cttcaatggt gtgttcccag ccaggtcctg 2150 accctcagag ccaagtccct gtcacgtctg gggcagccaa accctcgccc 2200 cacagggacc tggacacgcc cggccaggat gtggggttgg atgggccatt 2250 ttctgtccta tccctcatct ccacccccgc cacagcctac acgcatccca 2300 cacatgcagg cacacacagc ctgtgcacac atgtgttctt ggcccggttt 2350 catcccccca tgactggtgt ctgtgaggtg cagatggaca cagcgcacac 2400 ccagaccctc caccaggctg tgacctcgct gcctctgagg ccttgacaag 2450 gcccctcaat cggaggacag ccggccgtgc acactttcat catcgtcgga 2500 caaacagcgt ctactgcaca tttttcttat tcctattctt gagccatagc 2550 tatggcatat tcttctacta ttcctattat accacttacc agcttactcg 2600

<210> 69

<211> 567

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69 �et Arg Pro Asp ser Pro Thr �et Ala Ala Pro Ala Glu ser �eu 1 5 10 15

Arg Arg Arg �ys Thr Gly Tyr ser Asp Pro Glu Pro Glu ser Pro 20 25 30

Pro Ala Pro Gly Arg Gly Pro Ala Gly ser Pro Ala His �eu His 35 40 45

Thr Gly Thr Phe Trp �eu Thr Arg Ile �al �eu �eu �ys Ala �eu 50 55 60

Ala Phe �al Tyr Phe �al Ala Phe �eu �al Ala Phe His Gln Asn 65 70 75

�ys Gln �eu Ile Gly Asp Arg Gly �eu �eu Pro Cys Arg �al Phe 80 85 90

�eu �ys Asp Phe Gln Gln Tyr Phe Gln Asp Arg Thr ser Trp Glu 95 100 105

�al Phe ser Tyr �et Pro Thr Ile �eu Trp �eu �et Asp Trp ser 110 115 120

Asp �et Asn ser Asn �eu Asp �eu �eu Ala �eu �eu Gly �eu Gly 125 130 135

Ile ser ser Phe �al �eu Ile Thr Gly Cys Ala Asn �et �eu �eu 140 145 150

�et Ala Ala �eu Trp Gly �eu Tyr �et ser �eu �al Asn �al Gly 155 160 165

His �al Trp Tyr ser Phe Gly Trp Glu ser Gln �eu �eu Glu Thr 170 175 180

Gly Phe �eu Gly Ile Phe �eu Cys Pro �eu Trp Thr �eu ser Arg 185 190 195

�eu Pro Gln His Thr Pro Thr ser Arg Ile �al �eu Trp Gly Phe 200 205 210

Arg Trp �eu Ile Phe Arg Ile �et �eu Gly Ala Gly �eu Ile �ys 215 220 225

Ile Arg Gly Asp Arg Cys Trp Arg Asp �eu Thr Cys �et Asp Phe 230 235 240

His Tyr Glu Thr Gln Pro �et Pro Asn Pro �al Ala Tyr Tyr �eu 245 250 255

His His ser Pro Trp Trp Phe His Arg Phe Glu Thr �eu ser Asn

260 265 270

His Phe Ile Glu �eu �eu �al Pro Phe Phe �eu Phe �eu Gly Arg 275 280 285

Arg Ala Cys Ile Ile His Gly �al �eu Gln Ile �eu Phe Gln Ala 290 295 300

�al �eu Ile �al ser Gly Asn �eu ser Phe �eu Asn Trp �eu Thr 305 310 315

�et �al Pro ser �eu Ala Cys Phe Asp Asp Ala Thr �eu Gly Phe 320 325 330

�eu Phe Pro ser Gly Pro Gly ser �eu �ys Asp Arg �al �eu Gln 335 340 345

�et Gln Arg Asp Ile Arg Gly Ala Arg Pro Glu Pro Arg Phe Gly 350 355 360

ser �al �al Arg Arg Ala Ala Asn �al ser �eu Gly �al �eu �eu 365 370 375

Ala Trp �eu ser �al Pro �al �al �eu Asn �eu �eu ser ser Arg 380 385 390

Gln �al �et Asn Thr His Phe Asn ser �eu His Ile �al Asn Thr 395 400 405

Tyr Gly Ala Phe Gly ser Ile Thr �ys Glu Arg Ala Glu �al Ile 410 415 420

�eu Gln Gly Thr Ala ser ser Asn Ala ser Ala Pro Asp Ala �et 425 430 435

Trp Glu Asp Tyr Glu Phe �ys Cys �ys Pro Gly Asp Pro ser Arg 440 445 450

Arg Pro Cys �eu Ile ser Pro Tyr His Tyr Arg �eu Asp Trp �eu 455 460 465

�et Trp Phe Ala Ala Phe Gln Thr Tyr Glu His Asn Asp Trp Ile 470 475 480

Ile His �eu Ala Gly �ys �eu �eu Ala ser Asp Ala Glu Ala �eu 485 490 495

ser �eu �eu Ala His Asn Pro Phe Ala Gly Arg Pro Pro Pro Arg 500 505 510

Trp �al Arg Gly Glu His Tyr Arg Tyr �ys Phe ser Arg Pro Gly 515 520 525

Gly Arg His Ala Ala Glu Gly �ys Trp Trp �al Arg �ys Arg Ile 530 535 540

Gly Ala Tyr Phe Pro Pro �eu ser �eu Glu Glu �eu Arg Pro Tyr 545 550 555

Phe Arg Asp Arg Gly Trp Pro �eu Pro Gly Pro �eu 560 565

<210> 70

<211> 1900

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 70

ggcacgagga gaagactttg gtggggtagt ctcggggcag ctcagcggcc 50 cgctgtgccc gtttctggcc tcgctcgcag cttgcacgtc gagactcgta 100 ggccgcaccg tagggcgagc gtgcgggtcg ccgccgcggc cgcctcgggg 150 tctgggccca gccgcagcct cttctaccgc ggccggttgg gagtcgccgc 200 gagatgcagc ctccgggccc gcccccggcc tatgccccca ctaacgggga 250 cttcaccttt gtctcctcag cagacgcgga agatctcagt ggttcaatag 300 catccccaga tgtcaaatta aatcttggtg gagattttat caaagaatct 350 acagctacta catttctgag acaaagaggt tatggctggc ttctggaagt 400 tgaagatgat gatcctgaag ataacaagcc actcttggaa gaattggaca 450 ttgatctaaa ggatatttac tacaaaatcc gatgtgtttt gatgccaatg 500 ccatcacttg gttttaatag acaagtggtg agagacaatc ctgacttttg 550 gggtcctctg gctgttgttc ttttcttttc catgatatca ttatatggac 600 agtttagggt ggtctcatgg attataacca tttggatatt tggttcacta 650 acaattttct tactggccag agttcttggt ggagaagttg catatggcca 700 agtccttgga gttataggat attcattact tcctctcatt gtaatagccc 750 ctgtactttt ggtggttgga tcatttgaag tggtgtctac acttataaaa 800 ctgtttggtg tgttttgggc tgcctacagt gctgcttcat tgttagtggg 850 tgaagaattc aagaccaaaa agcctcttct gatttatcca atctttttat 900 tatacattta ttttttgtcg ttatatactg gtgtgtgatc caagttatac 950 atgaatagaa aaagatggtg ttaaatttgt gtgtaggctg ggaattcttg 1000 ctgaaggaat tggagaaaac ctgttgctgc aaaattttac atgttccaga 1050 tggaaaggga agtctaagcg ctttttaaaa caattttttt ttgtatttaa 1100 ttaagcaatt gcagttatct gggatttttg ggtcagaatt ttaaattctg 1150 tttgattctc catattccag tgaataaaat acaaaagcat tgtgttttta 1200 agattgtgtc gatattcacc taaaaacttg tgccaaaagc acctggattg 1250 gtaattatat ttcacttaaa gggtaaattt gacaatatct tgataatcaa 1300 aagtgcaatt tttttcttca aaatgttttc tccagcatca cagatcctgc 1350 agatatatat ttatatttat acatatatat ttatgaaata attcttactc 1400 acaaaatata tttctgataa acattaagat attaaatctg atgcacaaac 1450 tttaatttgg ccattaatct tttttattta aaaatttaaa tttgttttta 1500 aaattgtata tagtttttaa aatctcacac atgcttcgat acttccttgt 1550 taagaattct taataactac taaaactgat ttttaatagt tgctgatata 1600 tatttggttt gtttgggtat acttttcaaa accatttttg aatgtccaaa 1650 catctgattt aaagtttctg tttatctttc tgaccaaagg agcaagaggt 1700 ataatggata tggcattcat taaaatcttt actatgtaca aaaacagtaa 1750

tatttacagc atcagtaaat atttttaagt ggtacttcta aatcataaaa 1800

gttggggaaa gagaccttta aaatcttgtg gtgttgaaca atgttatatg 1850

aagtagaaaa aataaaatac ttcccagttg tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1900

<210> 71

<211> 240

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

�et Gln Pro Pro Gly Pro Pro Pro Ala Tyr Ala Pro Thr Asn Gly 1 5 10 15

Asp Phe Thr Phe �al ser ser Ala Asp Ala Glu Asp �eu ser Gly 20 25 30

ser Ile Ala ser Pro Asp �al �ys �eu Asn �eu Gly Gly Asp Phe 35 40 45

Ile �ys Glu ser Thr Ala Thr Thr Phe �eu Arg Gln Arg Gly Tyr 50 55 60

Gly Trp �eu �eu Glu �al Glu Asp Asp Asp Pro Glu Asp Asn �ys 65 70 75

Pro �eu �eu Glu Glu �eu Asp Ile Asp �eu �ys Asp Ile Tyr Tyr 80 85 90

�ys Ile Arg Cys �al �eu �et Pro �et Pro ser �eu Gly Phe Asn 95 100 105

Arg Gln �al �al Arg Asp Asn Pro Asp Phe Trp Gly Pro �eu Ala 110 115 120

�al �al �eu Phe Phe ser �et Ile ser �eu Tyr Gly Gln Phe Arg 125 130 135

�al �al ser Trp Ile Ile Thr Ile Trp Ile Phe Gly ser �eu Thr 140 145 150

Ile Phe �eu �eu Ala Arg �al �eu Gly Gly Glu �al Ala Tyr Gly 155 160 165

Gln �al �eu Gly �al Ile Gly Tyr ser �eu �eu Pro �eu Ile �al 170 175 180

Ile Ala Pro �al �eu �eu �al �al Gly ser Phe Glu �al �al ser 185 190 195

Thr �eu Ile �ys �eu Phe Gly �al Phe Trp Ala Ala Tyr ser Ala 200 205 210

Ala ser �eu �eu �al Gly Glu Glu Phe �ys Thr �ys �ys Pro �eu 215 220 225

�eu Ile Tyr Pro Ile Phe �eu �eu Tyr Ile Tyr Phe �eu ser �eu 230 235 240

<210> 72

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72 gggcaccaag aaccgaatca t 21

<210> 73

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73 cctagaggca gcgattaagg g 21

<210> 74

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74 tcagcacgtg gattcgagtc a 21

<210> 75

<211> 18

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75 gtgaggacgg ggcgagac 18

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Anticuerpo aislado que se une a un polip�ptido de la secuencia de amino�cidos SEQ ID NO: 51, con o sin su p�ptido señal asociado, en el que dicho anticuerpo est� conjugado a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citot�xico y est� internalizado por una célula de linfoma difuso de célula grande, una célula de linfoma folicular o una célula de linfoma de células del manto que expresan dicho polip�ptido, e inhibe el crecimiento de las mismas, para utilizar en un método de tratamiento del linfoma difuso de célula grande, linfoma folicular o linfoma de células del manto en un sujeto.

2. 2.

   Utilización de un anticuerpo aislado que se une a un polip�ptido de la secuencia de amino�cidos SEQ ID NO: 51, con o sin su p�ptido señal asociado, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del linfoma difuso de célula grande, linfoma folicular o linfoma de células del manto, en la que dicho anticuerpo est� conjugado a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citot�xico y est� internalizado por una célula de linfoma difuso de célula grande, una célula de linfoma folicular o una célula de linfoma de células del manto que expresan dicho polip�ptido, e inhibe el crecimiento de las mismas.

3. 3.

   Anticuerpo para utilizar, según la reivindicación 1, o la utilización, según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo est� conjugado al agente inhibidor del crecimiento o al agente citot�xico a través de un enlazador.

4. 4.

   Anticuerpo para utilizar o la utilización, según la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo est� conjugado a través de un enlazador sensible a peptidasa.

5. 5.

   Anticuerpo para utilizar o la utilización, según la reivindicación 4, en el que el agente citot�xico es monometil auristatina (MMAE) y/o en el que el enlazador sensible a peptidasa comprende un reactivo enlazador dip�ptido valina-citrulina (vc) que tiene un componente maleimida y un componente auto-inmolador paraaminobencilcarbamo�lo (PAB) (MC-vc-PAB).

6. 6.

   Anticuerpo para utilizar, según la reivindicación 1, o la utilización, según la reivindicación 2, en el que el agente citot�xico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleol�ticas.

7. 7.

   Anticuerpo para utilizar o la utilización, según la reivindicación 6, en el que la toxina se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina (MMAE), maitansinoide y caliqueamicina.

8. 8.

   Anticuerpo para utilizar o la utilización, según la reivindicación 7, en el que el maitansinoide o la caliqueamicina est�n conjugados al anticuerpo a través de un enlazador seleccionado del grupo que consiste en sulfosuccinimidil maleimidometil ciclohexano carboxilato (SMCC) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP).

9. 9.

   Anticuerpo para utilizar o la utilización, según la reivindicación 7, en el que la MMAE est� conjugada al anticuerpo a través de un enlazador sensible a peptidasa.

10. 10.

    Anticuerpo para utilizar o la utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o es un fragmento de anticuerpo, o es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

11. 11.

    Utilización o anticuerpo para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo se produce en bacterias o se produce en células CHO.

12. 12.

    Utilización o anticuerpo para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho tratamiento comprende además exponer dicha célula a un tratamiento con radiación o a un agente quimioterap�utico.

13. 13.

    Utilización o anticuerpo para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que provoca la muerte de dicha célula.

    Figura 50A Figura 50B Figura 51A

    Secuencia señal

    Amino�cidos 1-19

    Dominio transmembrana

    Amino�cidos 685-705

    Dominio de inmunoglobulina

    Amino�cidos 154-221, 258-311, 346-398, 435-486, 522-573, 609-611

    Sitio de N-glicosilaci�n

    Amino�cidos 67-7, 101-104, 112-115, 135-138, 164-167, 231-234, 363-366, 445-448, 479-482, 574-577, 634-637, 724-727

    Sitio de fosforilaci�n de la proteína quinasa dependiente de AMPc y GMPc

    Amino�cidos 420-423

    Sitio de fosforilaci�n de la proteína quinasa C

    Amino�cidos 21-23, 45-47, 68-70, 79-81, 125-127, 137-139, 194-196, 241-243, 285-287, 304-306, 641-643, 764766

    Figura 51B

    Sitio de fosforilaci�n de caseína quinasa II

    5 Amino�cidos 69-72, 79-82, 123-126, 200-2503, 249-252, 270-273, 347-350, 452-455, 562-565, 601-604, 628-631, 789-792

    Sitio de fosforilaci�n de tirosina quinasa

    Amino�cidos 788-796

    Sitio de N-miristoilaci�n

    Amino�cidos 392-397, 522-527, 567-572, 578-583, 655-660, 691-696, 693-698, 720-725, 759-764, 819-824

    Sitio de amidaci�n

    15 Amino�cidos 684-687

    Sitio de unión a lípido de lipoprote�na de membrana procariota

    Amino�cidos 386-396

    Figura 91A Figura 91B Figura 91C Figura 91D