PT2176296E - Anticorpos e imunoconjugados anti-cd79b e métodos de utilização - Google Patents

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cd79b
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Mark Dennis
Yvonne Chen
David Dornan
Kristi Elkins
Jagath Reddy Junutula
Andrew Polson
Bing Zheng
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Genentech Inc
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Description

ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Anticorpos e imunoconjugados anti-CD79b e métodos de utilização"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento dirige-se a composições de matéria úteis para o tratamento de tumores hematopoéticos em mamíferos e a métodos de utilização dessas composições de matéria para o mesmo.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Os tumores malignos (cancros) são a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos, a seguir às doenças cardíacas (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43: 7 (1993)). 0 cancro caracteriza-se pelo aumento no número de células anormais ou neoplásicas, derivadas de um tecido normal que proliferam para formar uma massa tumoral, a invasão dos tecidos adjacentes por estas células tumorais neoplásicas, e a geração de células malignas que eventualmente se disseminam através do sangue ou do sistema linfático para os nódulos linfáticos regionais e para locais distantes através de um processo chamado metástase. Num estado canceroso, uma célula prolifera sob condições em que as células normais não cresceriam. 0 cancro manifesta-se numa grande variedade de formas, caracterizadas por diferentes graus de capacidade de invasão e agressividade.
Os cancros que envolvem as células geradas durante hematopoese, um processo através do qual elementos celulares do sangue, tais como linfócitos, leucócitos, plaquetas, eritrócitos e células assassinas naturais são gerados, são referidos como cancros hematopoéticos. Os linfócitos que se podem encontrar no sangue e tecidos linfáticos e que são críticos para a resposta imunitária, são categorizados em duas classes principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T) , que medeiam a imunidade humoral e mediada por células, respectivamente. 2 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
As células Β maturam na medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação ao antigénio na sua superfície celular. Quando uma célula B ingénua encontra pela primeira vez o antigénio para o qual é específico o seu anticorpo ligado à membrana, a célula começa a dividir-se rapidamente e a sua descendência diferencia-se em células B de memória e células efectoras chamadas "células plasmáticas". As células B de memória têm uma vida mais longa e continuam a expressar o anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula mãe original. As células plasmáticas não produzem anticorpo ligado à membrana mas em vez disso produzem o anticorpo numa forma que pode ser segregada. Os anticorpos segregados são a principal molécula efectora da imunidade humoral.
As células T maturam dentro do timo, que proporciona um ambiente para a proliferação e diferenciação de células T imaturas. Durante a maturação das células T, as células T sofrem os rearranjos genéticos que produzem o receptor de células T e a selecção positiva e negativa, que ajuda a determinar o fenótipo da superfície celular da célula T madura. Marcadores da superfície celular caracteristicos de células T maduras são o complexo CD3:receptor de células T e um dos co-receptores, CD4 ou CD8.
Em tentativas para descobrir alvos celulares eficazes para terapia de cancro, os investigadores têm procurado identificar polipéptidos transmembranares ou de outro modo associados à membrana que sejam especificamente expressos na superfície de um ou mais tipos particulares de células de cancro, em comparação com uma ou mais células normais não-cancerosas. Frequentemente, tais polipéptidos associados à membrana são mais abundantemente expressos na superfície das células de cancro, em comparação com a superfície das células não-cancerosas. A identificação de tais polipéptidos antigénio da superfície celular associados a tumores tem dado origem à capacidade de apontar especificamente células de cancro para destruição através de terapias baseadas em anticorpos. A este respeito, observa-se que a terapia baseada em anticorpos provou ser muito eficaz no tratamento de certos cancros. Por exemplo, HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia) são anticorpos que têm sido 3 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ utilizados com sucesso para tratar cancro da mama e linfoma não-Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente, HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se liga selectivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2). A sobre-expressão da proteína HER2 é observada em 25-30% dos cancros da mama primários. RITUXAN® é um anticorpo monoclonal quimérico murídeo/humano geneticamente modificado dirigido contra o antigénio CD20 verificado na superfície de linfócitos B normais e malignos. Ambos os anticorpos são produzidos de forma recombinante em células CHO.
Noutras tentativas para descobrir alvos celulares eficazes para terapia de cancro, os investigadores têm procurado identificar (1) polipéptidos não-associados à membrana que sejam especificamente produzidos por um ou mais tipos particulares de células de cancro em comparação com um ou mais tipos particulares de células normais não-cancerosas, (2) polipéptidos que sejam produzidos por células de cancro a um nível de expressão que seja significativamente mais elevado que o de uma ou mais células normais não-cancerosas, ou (3) polipéptidos cuja expressão esteja especificamente limitada a apenas um único (ou um número muito limitado de diferentes) tipo(s) de tecido tanto no estado canceroso como no não-canceroso (p.ex., próstata normal e tecido tumoral da próstata). Tais polipéptidos podem permanecer localizados intracelularmente ou podem ser segregados pela célula de cancro. Além disso, tais polipéptidos podem ser expressos não pela célula de cancro em si, mas sim por células que produzam e/ou segreguem polipéptidos possuindo um efeito de potenciação ou estimulação do crescimento em células de cancro. Tais polipéptidos segregados são frequentemente proteínas que proporcionam às células de cancro uma vantagem de crescimento sobre as células normais e incluem coisas tais como, por exemplo, factores angiogénicos, factores de adesão celular, factores de crescimento, e semelhantes. Esperar-se-ia que a identificação de antagonistas de tais polipéptidos não-associados à membrana proporcionasse agentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cancros. Além disso, a identificação do padrão de expressão de tais polipéptidos 4 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ seria útil para o diagnóstico de determinados cancros em mamíferos.
Apesar dos avanços acima identificados na terapia de cancro em mamíferos, há uma grande necessidade de agentes terapêuticos adicionais capazes de detectar a presença de tumores num mamífero e para inibir eficazmente o crescimento de células neoplásicas, respectivamente. Deste modo, é um objectivo do presente invento identificar polipéptidos, polipéptidos associados à membrana celular, segregados ou intracelulares, cuja expressão está especificamente limitada a apenas um único tipo de tecido (ou a um número muito limitado de diferentes tecidos), tecidos hematopoéticos, tanto num estado canceroso como não-canceroso, e utilizar esses polipéptidos, e os ácidos nucleicos que os codificam, para produzir composições de matéria úteis no tratamento terapêutico e/ou na detecção de cancro hematopoético em mamíferos. CD79 é o componente de sinalização do receptor de células B consistindo num heterodímero covalente contendo CD79a (Iga, MB-1) e CD79b (Ig(3, B29) . CD79a e CD79b contêm, cada um, um domínio extracelular de imunoglobulina (Ig), um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, um domínio com o motivo imunorreceptor de activação baseado em tirosina (ITAM). CD79 é expresso em células B e em células de Linfoma não-Hodgkin (NHL) (Cabezudo et al., Hoematologica, 84: 413-418 (1999); D'Arena et al., Am. J. Hematol, 64: 275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol. Invest., 35: 93-114 (2006)). CD79a e CD79b e slg são todos necessários para a expressão à superfície do CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opln. Immunol., 13(3): 270-7)). A expressão média à superfície de CD79b em NHL é semelhante à de células B normais, mas com um intervalo maior (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13 (3): 270-7 (2001)).
Dada a expressão de CD79b, é benéfico produzir anticorpos terapêuticos para o antigénio CD79b que criem antigenicidade mínima ou nenhuma quando administrados a pacientes, especialmente para tratamento crónico. O presente invento satisfaz esta e outras necessidades. O presente invento proporciona anticorpos anti-CD79b que superam as limitações 5 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ das actuais composições terapêuticas, bem como oferece vantagens adicionais que serão evidentes a partir da descrição detalhada abaixo. Os anticorpos anti-CD79b são divulgados em WO 01/71005; Polson et al. (2007), Blood 110 (2). PP 616-623; e Okazaki et al. (1993), Blood 81 (1): págs. 84-94. A utilização de conjugados anticorpo-fármaco (ADC), i.e. imunoconjugados, para a distribuição local de agentes citotóxicos ou citostáticos, i.e., fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento de cancro (Lambert, J. (2005) Curr. Oplnlon in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al. (2005) Nature Blotechnology 23 (9); 1137-1146; Payne, G. (2003) Câncer Cell 3: 207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278) permite uma distribuição direccionada da porção fármaco a tumores, e a acumulação intracelular nos mesmos, quando a administração sistémica destes agentes fármacos não conjugados pode resultar em niveis inaceitáveis de toxicidade para as células normais assim como para as células tumorais que se quer eliminar (Baldwin et al. (1986) Lancet (15 de Março de 1986) : págs. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Citotóxico Agents In Câncer Therapy: A Review, " em "Monoclonal Antibodles 1984: Biological And Clinicai Applications", A. Pinchera et al. (eds), págs. 475-506). Os esforços para melhorar o índice terapêutico, i.e., eficácia máxima e toxicidade mínima de ADC têm-se centrado na selectividade de anticorpos policlonais (Rowland et al. (1986) Câncer Immunol. Immunother., 21: 183-87) e monoclonais (mAbs), bem como nas propriedades de ligação do fármaco e libertação do fármaco (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549). Porções fármaco utilizadas em conjugados anticorpo-fármaco incluem toxinas proteicas bacterianas, tais como a toxina da difteria, toxinas proteicas vegetais tais como o rícino, moléculas pequenas tais como auristatinas, geldanamicina (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al. (1996 ) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623), caliqueamicina (Lode et al., (1998) Câncer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Câncer Res. 53: 3336-3342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland 6 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ et al.r (1986) supra). As porções fármaco podem afectar mecanismos citotóxicos e citostáticos incluindo ligação à tubulina, ligação ao ADN, ou inibição da topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a estar inactivos ou menos activos quando conjugados com grandes anticorpos ou ligandos de receptores proteicos.
Os péptidos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos da dolastatina (WO 02/088172), têm sido conjugados como porções fármaco a: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas), (ii) cAClO que é específico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773; Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4): 1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tais como Rituxan (WO 04/032828) para o tratamento de cancros expressando CD20 e distúrbios imunitários, (iv) anticorpo anti-EphB2R 2H9 para o tratamento de cancro colorrectal (Mao et al. (2004) Câncer Research 64(3): 781-788); (v) anticorpo de E-selectina (Bhaskar et al. (2003) Câncer Res. 63: 6387-6394); (vi) trastuzumab (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), e (vi) anticorpos anti-CD30 (WO 03/043583). Variantes de auristatina E são divulgadas em US 5767237 e US 6124431. Monometilo de auristatina E conjugado com anticorpos monoclonais é descrito em Senter et al., "Proceedings of the American Association for Câncer Research", Volume 45, Resumo Número 623, apresentado a 28 de Março de 2004. Os análogos de auristatina MMAE e MMAF foram conjugados com vários anticorpos (US 2005/0238649).
Meios convencionais de união, i.e., juntando através de ligações covalentes, uma porção fármaco a um anticorpo, conduzem geralmente a uma mistura heterogénea de moléculas onde as porções fármaco estão ligadas a vários locais no anticorpo. Por exemplo, os fármacos citotóxicos têm sido tipicamente conjugados com anticorpos através dos frequentemente numerosos resíduos de lisina de um anticorpo, gerando uma mistura heterogénea de conjugado anticorpo-fármaco. Dependendo das condições reaccionais, a mistura heterogénea contém tipicamente uma distribuição de anticorpos com de 0 a cerca de 8, ou mais, porções fármaco ligadas. Além 7 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ disso, dentro de cada subgrupo de conjugados com uma determinada razão inteira de porções fármaco para anticorpo, está uma mistura potencialmente heterogénea onde a porção fármaco está ligada em vários locais no anticorpo. Métodos analíticos e preparativos podem ser inadeguados para separar e caracterizar as moléculas das espécies de conjugado anticorpo-fármaco dentro da mistura heterogénea resultante de uma reacção de conjugação. Os anticorpos são grandes biomoléculas complexas e estruturalmente diversas, muitas vezes com muitos grupos funcionais reactivos. As suas reactividades com reagentes ligadores e intermediários ligadores de fármacos são dependentes de factores tais como pH, concentração, concentração salina, e co-solventes. Além disso, o processo de conjugação em vários passos pode ser não reprodutível devido a dificuldades no controlo das condições reaccionais e caracterização dos reagentes e intermediários. (Garman, Approach", tiol das reactivos,
Os tióis de cisteina são reactivos a um pH neutro, ao contrário da maioria das aminas que são protonadas e menos nucleófilas próximo de pH 7. Uma vez que os grupos tiol livres (RSH, sulfidrilo) são relativamente reactivos, as proteínas com resíduos de cisteina existem frequentemente na sua forma oxidada como oligómeros ligados com dissulfuretos ou têm internamente grupos dissulfureto ligados em ponte. As proteínas extracelulares não têm geralmente tióis livres 1997, "Non-Radioactive Labeling: A Practical
Academic Press, London, na página 55) . Os grupos cisteínas dos anticorpos são geralmente mais ou seja, mais nucleófilos, em relação a reagentes de conjugação electrófilos que os grupos amina ou hidroxilo dos anticorpos. Resíduos de cisteina foram introduzidos em proteínas através de técnicas de engenharia genética para formar ligações covalentes com ligandos ou para formar novas ligações dissulfureto intramoleculares (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13: 9644-9650; Bernhard et al. (1994)
Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al. (1994)
Therapeutlc Immunology 1: 247-255; Tu et al. (1999) Proc.
Natl. Acad. Scl. USA 96: 4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76: 207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 98(15): 8480-8484; US 6248564). No entanto, a uma engenharia em grupos tiol de cisteínas através da mutação de vários resíduos de aminoácidos de uma proteína para ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aminoácidos cisteína é potencialmente problemática, particularmente no caso de resíduos não emparelhados (Cys livres) ou os que estão relativamente acessíveis para reacção ou oxidação. Em soluções concentradas da proteína, quer no periplasma de E. coli, sobrenadantes de cultura ou proteína parcialmente ou completamente purificada, os resíduos Cys desemparelhados na superfície da proteína podem emparelhar e oxidar para formar dissulfuretos intermoleculares e, portanto, dímeros ou multímeros proteicos. A formação de dímeros de dissulfureto torna a nova Cys não reactiva para conjugação com um fármaco, ligando, ou outro marcador. Além disso, se a proteína formar oxidativamente uma ligação dissulfureto intramolecular entre a Cys recém-modifiçada e um resíduo Cys existente, ambos os grupos tiol de Cys ficam indisponíveis para a participação e interacções do local activo. Além disso, a proteína pode ser tornada inactiva ou não-específica através de má dobragem ou perda da estrutura terciária (Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).
Anticorpos com cisteínas modificadas foram desenhados como fragmentos de anticorpo Fab (tioFab) e expressos como anticorpos monoclonais IgG (tiomAb) inteiros (Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol. Methods 332: 41-52; US 2007/0092940, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Os anticorpos TioFab e TiomAb foram conjugados através de ligadores nos tióis de cisteínas recentemente introduzidos com reagentes ligadores reactivos com tiol e reagentes ligadores do fármaco para preparar conjugados anticorpo-fármaco (Tio ADC) .
SUMÁRIO DO INVENTO O invento proporciona anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais destes, e o seu método de utilização no tratamento de tumores hematopoéticos.
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo que se liga, de preferência especificamente, a qualquer um dos polipéptidos descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo fragmento Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo 9 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo anti-polipéptido CD79b ao seu respectivo epitopo antigénico. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinóide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou semelhantes. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e induzir de preferência a morte de uma célula à qual se ligam. Para efeitos de detecção, os anticorpos do presente invento podem ser marcados de forma detectável, ligados a um suporte sólido, ou semelhantes.
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade monovalente (p.ex., a afinidade do anticorpo como fragmento Fab para CD79b) ou a afinidade na sua forma bivalente do anticorpo para CD79b (p.ex. a afinidade do anticorpo como fragmento de IgG para CD79b) é substancialmente a mesma que, inferior a, ou maior que, a afinidade monovalente ou a afinidade na sua forma bivalente, respectivamente, de um anticorpo de murideo (p.ex., a afinidade do anticorpo de murideo como fragmento Fab ou como fragmento de IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (p.ex., a afinidade do anticorpo quimérico como fragmento Fab ou como fragmento de IgG para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada conforme representado nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e as Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) .
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., a afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,4 nM, 0,2 nM ou 0,5 nM. É aqui descrito um anticorpo que se liga a CD79b, em que o anticorpo compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVR seleccionadas a partir do grupo que consiste em: 10 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (i) HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A15, em que Al-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que Cl-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-H1 compreendendo a sequência D1-D10, em que Dl-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, em que El-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, em que Fl-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); um anticorpo que se liga a CD79b, em que o anticorpo compreende pelo menos uma HVR variante em que a sequência da HVR variante compreende a modificação de pelo menos um resíduo da sequência representada em SEQ ID NOs: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136; um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de HVRl-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 164-166); um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 156-158); um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de HVRl-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 183-185); um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 175-177).
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de HVRl-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 202-204) e/ou a sequência de SEQ ID NO: 207.
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na 11 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Figura 17 (SEQ ID NO: 194-196) e/ou a sequência de SEQ ID NO: 208. E também aqui divulgado um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 221-223); um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 213-215); um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável da cadeia pesada seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 170, 189, 208 ou 227. Noutro aspecto, o invento inclui um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável da cadeia leve seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 169, 188, 207 ou 226; um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos cisteína livres e uma sequência seleccionada a partir de SEQ ID NOS: 251-298. O anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina pode ligar-se a um polipéptido CD79b. O anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína pode ser preparado através de um processo compreendendo a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo-mãe anti-CD79b por cisteína; um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina compreendendo um ou mais aminoácidos cisteína livres em que o anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína liga-se a um polipéptido CD79b e é preparado através de um processo compreendendo a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo-mãe anti-CD79b por cisteína em que o anticorpo-mãe compreende pelo menos uma sequência de HVR seleccionada a partir de: (a) HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A15, em que Al-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) OU KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137); (b) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (c) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) 12 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (d) HVR-H1 compreendendo a sequência D1-D10, em que Dl-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (e) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, em que El-El8 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (f) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, em que Fl-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) OU TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138) . O anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo do polipéptido anti-CD79b ao seu respectivo epitopo antigénico. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina ou maitansinóide. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e inibem de preferência o crescimento ou a proliferação ou induzem a morte de uma célula à qual se ligam. Para fins de diagnóstico, os anticorpos do presente invento podem ser marcados de forma detectável, ligados a um suporte sólido ou semelhantes.
Num aspecto, o invento proporciona métodos para a produção de um anticorpo do invento. Por exemplo, o invento proporciona um método de produção de um anticorpo para CD79b (que, tal como aqui definido inclui o inteiro e fragmentos deste), o referido método compreendendo a expressão numa célula hospedeira adequada de um vector recombinante do invento codificando o referido anticorpo (ou fragmento deste), e recuperação do referido anticorpo.
Num aspecto, o invento é uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo do invento ou um conjugado anticorpo-fármaco do invento, e um diluente, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Num aspecto, o invento proporciona um artigo de fabrico compreendendo um recipiente e uma composição contida dentro do recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos para CD79b do invento. 13 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona um estojo compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos para CD79b do invento; e um segundo recipiente compreendendo um tampão.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um anticorpo para CD79b do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um artigo de fabrico do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, a tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um estojo do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo celular.
Num aspecto, o invento proporciona um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com um anticorpo do invento causando deste modo uma inibição do crescimento da referida célula. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento de forma terapêutica de um mamífero possuindo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo do invento, tratando deste modo de forma eficaz o referido mamífero. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento. 14 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona um método para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular associado a expressão aumentada de CD79b, o referido método compreendendo a administração a um sujeito a necessitar de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, tratando ou prevenindo deste modo de forma eficaz o referido distúrbio proliferativo celular. Numa concretização, o referido distúrbio proliferativo é cancro. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método para inibição do crescimento de uma célula, em que o crescimento da referida célula é pelo menos em parte dependente de um efeito potenciador do crescimento de CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, inibindo deste modo o crescimento da referida célula. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento de forma terapêutica de um tumor num mamífero, em que o crescimento do referido tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito potenciador do crescimento de CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, tratando deste modo de forma eficaz o referido tumor. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento de cancro compreendendo a administração a um paciente da formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado aqui descrito, diluente, transportador ou excipiente aceitável. 15 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona um método de inibição da proliferação de células B compreendendo a exposição de uma célula a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo do invento sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b.
Num aspecto, o invento proporciona um método de determinação da presença de CD79b numa amostra suspeita de conter CD79b, o referido método compreendendo a exposição da referida amostra a um anticorpo do invento, e a determinação da ligação do referido anticorpo a CD79b na referida amostra em que a ligação do referido anticorpo a CD79b na referida amostra é indicativa da presença da referida proteina na referida amostra.
Num aspecto, o invento proporciona um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo celular associado a um aumento de células, tais como células B, expressando CD79b, o método compreendendo o contacto de células de teste numa amostra biológica com qualquer um dos anticorpos de cima; determinação do nivel de anticorpo ligado a células de teste na amostra através da detecção da ligação do anticorpo a CD79b; e comparação do nível de anticorpo ligado às células numa amostra de controlo, em que o nível de anticorpo ligado é normalizado para o número de células expressando CD79b nas amostras de teste e de controlo, e em que um nível superior de anticorpo ligado na amostra de teste em comparação com a amostra de controlo indica a presença de um distúrbio proliferativo celular associado a células expressando CD79b.
Num aspecto, o invento proporciona um método de detecção de CD79b solúvel no sangue ou no soro, o método compreendendo o contacto de uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de apresentar um distúrbio proliferativo de células B com um anticorpo anti-CD79b do invento e detecção de um aumento de CD79b solúvel na amostra de teste relativamente a uma amostra de controlo de sangue ou soro de um mamífero normal.
Num aspecto, o invento proporciona um método de ligação de um anticorpo do invento a uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula 16 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ com um anticorpo do invento. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 1) de um ADNc de PR036249, em que SEQ ID NO: 1 é um clone aqui designado como "DNA225786" (também aqui referido como "CD79b"). A sequência nucleotídica codifica para CD79b com os codões de início e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 1 mostrada na Figura 1. A Figura 3 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 3) da cadeia leve do anticorpo IgGl quimérico de murideo para CD79b (chMA79b) (MA79b é um anticorpo monoclonal de murideo anti-CD79b). A sequência nucleotídica codifica para a cadeia leve de chMA79b com os codões de inicio e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4), sem os primeiros 18 aminoácidos da sequência sinal, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 mostrada na Figura 3. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A Figura 5 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 5) da cadeia pesada do anticorpo IgGl quimérico de murideo (chMA79b) (MA79b é um anticorpo monoclonal de murideo anti-CD79b). A sequência nucleotídica codifica para a cadeia pesada de chMA79b com os codões de inicio e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 6 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6), sem os primeiros 18 aminoácidos da sequência sinal e a última lisina (K) antes do codão de terminação, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 5 mostrada na Figura 5. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. 17 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
As Figuras 7Α-Β mostram o alinhamento de sequências das cadeias leves variáveis para as seguintes: sequência de consenso da cadeia leve humana capa I (marcada como "huKI"; SEQ ID NO: 9) com VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NOS: 139-142, respectivamente), anticorpo anti-CD79b de murideo (marcado como "MA79b"; SEQ ID NO: 10), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b"; SEQ ID NO: 11), variante 17 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.vl7"; SEQ ID NO: 169), variante 18 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.vl8"; SEQ ID NO: 188), variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v28"; SEQ ID NO: 207) e variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v32"; SEQ ID NO: 226). As posições são numeradas de acordo com Kabat e as regiões hipervariáveis (HVR) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso da capa I leve variável estão em caixas.
As Figuras 8A-B mostram o alinhamento de sequências das cadeias pesadas variáveis para as seguintes: sequência de consenso da cadeia pesada humana subgrupo III (marcada como "humIII"; SEQ ID NO: 13) com VH-FRl, VH-FR2, VH-FR3, e VH-FR4 (SEQ ID NOS: 143-146), anticorpo anti-CD79b de murideo (marcado como "MA79b"; SEQ ID NO: 14), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b"; SEQ ID NO: 15) (contendo 71A, 73T e 78A) , variante 17 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.vl7"; SEQ ID NO: 170) (contendo 71A, 73T e 78A) , variante 18 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA7 9b. vl 8"; SEQ ID NO: 189) (contendo 71A, 73T e 78A) , variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA7 9b. v28"; SEQ ID NO: 208) (contendo 71A, 73T e 78A) e variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcada como "huMA79b.v32"; SEQ ID NO: 22 7) (contendo 71A, 73T e 78A). As posições são numeradas de acordo com Kabat e as regiões hipervariáveis (HVR) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso da pesada variável subgrupo III estão em caixas. A Figura 9 mostra várias sequências de HVR de variantes seleccionadas do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (SEQ ID NOS: 17-21) em que cada variante tem uma única mudança 18 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de aminoácidos numa única HVR do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (HVR-L1 (SEQ ID NO: 131); HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133)). As sequências das cadeias leves variáveis e pesadas variáveis fora das mudanças únicas de aminoácidos mostradas foram idênticas ao enxerto huMA79b e não são mostradas. Não foram observadas mudanças em HVR-H1 (SEQ ID NO: 134), HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) OU HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. A Figura 10 mostra várias sequências de HVR de variantes seleccionadas do anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9b (SEQ ID NOS: 22-106), incluindo huMA79b L2-2 (também aqui referido como "L2"), um huMA79b H3-10 (também aqui referido como "H3") em que cada variante tem múltiplas mudanças de aminoácidos numa única região HVR do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133); HVR-H1 (SEQ ID NO: 134); porção de HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) é mostrada na Figura 10 como SEQ ID NO: 107) . As sequências das cadeias leves variáveis e pesadas variáveis fora das mudanças de aminoácidos mostradas foram idênticas ao enxerto huMA79b e não são mostradas. Não foram observadas mudanças em HVR-Ll (SEQ ID NO: 131) ou HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. A Figura 11 mostra a análise de Biacore de anticorpos anti-CD79b seleccionados, incluindo anticorpo para CD79b de murídeo (marcado como "MA79b"), anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b"), e variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, incluindo huMA79b L2-2 (52R, 53K, 55G, 56R; SEQ ID NO: 22), huMA79b H3-10 (981, 99R, 100L; SEQ ID NO: 94), huMA79b Hl-6 (28P, 30T, 3IR, 35N; SEQ ID NO: 57) e huMA79b L2/H3 (mutações L2-2 e H3-10 descritas abaixo) para antigénios designados, incluindo o domínio extracelular do CD79b humano (huCD79beCd), o domínio extracelular do CD79b humano fundido com Fc (huCD79beCd“Fc) e um péptido de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b e chMA79b (SEQ ID NO: 16). A Figura 12 mostra a análise de Biacore dos anticorpos anti-CD79b seleccionados, incluindo anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (marcado como "enxerto huMA79b") e variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9b 19 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (marcadas como 1-34 na primeira coluna ou como "toda a estrutura" na primeira coluna) para o domínio extracelular do CD79b humano (antigénio huCD79b-ecd). Variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b incluem uma variante "toda a estrutura" onde resíduos estruturais de murídeo potencialmente importantes estão presentes e variantes (marcadas 1-34) com combinações de mutações estruturais com ou sem mutações de HVR na cadeia leve variável e cadeia pesada variável conforme designado. A variante 17 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.vl7") é marcada como 17 na primeira coluna, a variante 18 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.vl8") é marcada como 18 na primeira coluna, a variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.v28") é marcada como 28 na primeira coluna e a variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (aqui referida como "huMA79b.v32") é marcada como 32 na primeira coluna. As vezes de ligação bivalente são representadas como a Kd da variante do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b particular (marcada como "Kdvariante")/a Kd do anticorpo quimérico MA79b (chMA79b) (marcado como "Kdquimera") ; os valores na coluna marcada "vezes de ligação bivalente" representam KdVariante/Kdquimera. A ausência de detecção de ligação é designada na Figura como "ADL".
As Figuras 13A-B (estruturas de consenso da pesada variável (VH)) e a Figura 14 (estruturas de consenso da leve variável (VL)) representam exemplos de sequências estruturais de consenso humanas aceitadoras para utilização na prática do presente invento com identificadores de sequência como se segue: (Figuras 13A-B) estrutura de consenso da VH humana subgrupo I menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 108), estrutura de consenso da VH humana subgrupo I menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 109-111), estrutura de consenso da VH humana subgrupo II menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 112), estrutura de consenso da VH humana subgrupo II menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 113-115), estrutura de consenso da VH humana subgrupo III menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 116), estrutura de consenso da VH humana subgrupo III menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 117-119), estrutura aceitadora da VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 120), estrutura aceitadora da VH humana menos 20 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 121-122), estrutura aceitadora 2 da VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 123) e estrutura aceitadora 2 da VH humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 124-26) e (Figura 14) estrutura de consenso da capa VL humana subgrupo I (SEQ ID NO: 127), estrutura de consenso da capa VL humana subgrupo II (SEQ ID NO: 128), estrutura de consenso da capa humana subgrupo III (SEQ ID NO: 129) e estrutura de consenso da capa humana subgrupo IV (SEQ ID NO: 130).
As Figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo do invento (huMA79b.vl7). As Figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos da estrutura (FR) , região hipervariável (HVR), primeiro dominio constante (CL ou CHI) e região Fc (Fc) de uma concretização de um anticorpo do invento (huMA79b.vl7) (SEQ ID NOS: 152-159 (Figura 15A) e SEQ ID NOS: 160-168 (Figura 15B)). As sequências de aminoácidos inteiras (regiões variáveis e constantes) das cadeias leves e pesadas de huMA79b.vl7 são mostradas (SEQ ID NO: 303 (Figura 15A) e 304 (Figura 15B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 169 (Figura 15A para a cadeia leve) e SEQ ID NO: 170 (Figura 15B para a cadeia pesada)).
As Figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo do invento (huMA79b.vl8). As Figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos da estrutura (FR) , região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CHI) e região Fc (Fc) de uma concretização de um anticorpo do invento (huMA79b.vl8) (SEQ ID NOS: 171-178 (Figura 16A) e SEQ ID NOS: 179-187 (Figura 16B)). As sequências de aminoácidos inteiras (regiões variável e constante) das cadeias leves e pesadas de hutMA79b.vl8 são mostradas (SEQ ID NO: 305 (Figura 16A) e 306 (Figura 16B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 188 (Figura 16A para a cadeia leve) e SEQ ID NO: 189 (Figura 16B para a cadeia pesada)). 21 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
As Figuras 17Α (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo do invento (huMA79b.v28). As Figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram as sequências de aminoácidos da estrutura (FR) , região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CHI) e região Fc (Fc) de uma concretização de um anticorpo do invento (huMA79b.v28) (SEQ ID NOS: 190-197 (Figura 17A) e SEQ ID NOS: 198-206 (Figura 17B). As sequências de aminoácidos inteiras (regiões variável e constante) das cadeias leves e pesadas de huMA79b.v28 são mostradas (SEQ ID NO: 307 (Figura 17A) e 308 (Figura 17B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 207 (Figuras 7A-B para a cadeia leve) e SEQ ID NO: 208 (Figuras 8A-B para a cadeia pesada)).
As Figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo do invento (huMA79b.v32). As Figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram as sequências de aminoácidos da estrutura (FR) , região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CHI) e região Fc (Fc) de uma concretização de um anticorpo do invento (huMA79b.v32) (SEQ ID NOS: 209-216 (Figura 18A) e SEQ ID NOS: 217-225 (Figura 18B). As sequências de aminoácidos inteiras (regiões variável e constante) das cadeias leves e pesadas de huMA79b.v32 são mostradas (SEQ ID NO: 309 (Figura 18A) e 310 (Figura 18B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de
aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 226 (Figura 18A para a cadeia leve) e SEQ ID NO: 227 (Figura 18B para a cadeia pesada)). A Figura 19 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos de CD79b de humano (SEQ ID NO: 2), macaco cinomolgo (cyno) (SEQ ID NO: 7) e ratinho (SEQ ID NO: 8). Os CD79b de humano e cyno têm 85% de identidade de aminoácidos. A sequência sinal, o péptido de teste (o epitopo de 11
aminoácidos para MA79b, chMA79b e anticorpo anti-cynoCD79b descrito no Exemplo 1; ARSEDRYRNPK (SEQ ID NO: 12)), domínio transmembranar (TM) e domínio do motivo de activação imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) estão indicados. A 22 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ região numa caixa é a região de CD79b que está ausente na variante de processamento de CD79b (descrita no Exemplo 1). A Figura 20 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase que mostra que a administração de anticorpos anti-CD79b ( (a) chMA79b-SMCC-DMl, a carga de fármaco foi de aproximadamente 2,9 (Tabela 9) e (b) huMA79b L2/H3-SMCC-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 2,4 (Tabela 9)) a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os controlos incluíram Herceptin® (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1) . A Figura 21A é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humanas) que mostra que a administração de anticorpos anti-CD79b ((a) chMA79b-SMCC-DMl, a carga de fármaco foi de aproximadamente 3,6 (Tabela 10), (b) huMA79b.vl7-SMCC-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 3,4 (Tabela 10), (c) huMA79b.v28-SMCC-DMl, a carga de fármaco foi de aproximadamente 3,3 ou 3,4 (Tabela 10), (d) huMA79b.vl8-SMCC-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 3,4 (Tabela 10) e (e) huMA79b.v32-SMCC-DMl, a carga de fármaco foi de aproximadamente 2,9 (Tabela 10)) a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os controlos incluíram Herceptin® (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1. A Figura 21B é um gráfico da alteração percentual do peso nos ratinhos do estudo de xenoenxerto Granta-519 (Figura 21A e Tabela 10) mostrando que não existe uma alteração significativa no peso durante os primeiros 7 dias do estudo, "hu" refere-se a anticorpo humanizado e "ch" refere-se a anticorpo quimérico. A Figura 22 mostra representações de conjugados anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco (ADC) onde uma porção fármaco é ligada a um grupo cisteína introduzido na: cadeia leve (LC-ADC); cadeia pesada (HC-ADC); e região Fc (Fc-ADC) . 23 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A Figura 23 mostra os passos de: (i) redução dos aductos de dissulfureto de cisteínas e dissulfuretos intercadeias e intracadeias num anticorpo anti-CD79b modificado com cisteinas (TioMab) com agente redutor TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina); (ii) oxidação parcial, i.e. reoxidação para reformar dissulfuretos intercadeias e intracadeias, com dhAA (ácido desidroascórbico); e (iii) conjugação do anticorpo reoxidado com um intermediário ligador do fármaco para formar um conjugado de cisteina anti-CD79b-fármaco (ADC). A Figura 24 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 229) e (B) a sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) do anticorpo anti-CD79b humanizado modificado com cisteina (tio-huMA7 9b.vl7-HC-A118C) , em que uma alanina na posição EU 118 (alanina da posição sequencial 118; posição de Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteina. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteina introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. 0 sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 25 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 231) e (B) a sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina humanizado (tio-huMA79b.vl8-HC-A118C), no qual uma alanina na posição EU 118 (alanina da posição sequencial 118; posição de Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteina. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteina introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. O sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas, a região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 26 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 233) e (B) sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina humanizado (tio-huMA79b.v28-HC-A118C), no qual uma alanina na posição EU 118 24 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (alanina da posição sequencial 118; posição de Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. 0 sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 27 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 235) e (B) sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína (tio-MA79b-LC-V205C), uma valina na posição de Kabat 205 (Valina da posição sequencial 209) da cadeia leve foi alterada para uma cisteína. Uma porção fármaco pode ser ligada a um grupo cisteína introduzido na cadeia leve. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. O sublinhado simples indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a um anticorpo modificado com cisteína. A Figura 28 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 237) e (B) sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína (tio-MA79b-HC-A118C), no qual uma alanina na posição EU 118 (alanina da posição sequencial 118; posição de Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. 0 sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a um anticorpo modificado com cisteína.
As Figuras 29A-B são gráficos de FACS indicando que a ligação de conjugados tioMAb anti-CD79b-fármaco (TDC) do invento que se ligam a CD79b expresso na superfície de células BJAB-luciferase é semelhante para (A) variantes tioMAb LC (V205C) e (B) variantes tioMAb HC (A118C) conjugadas de 25 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ chMA79b com MMAF. A detecçao foi com MS anti-IgGhumana-PE. "Tio" refere-se a um anticorpo modificado com cisteína.
As Figuras 30A-D são gráficos de FACS indicando que a ligação de conjugados tioMAb anti-CD79b-fármaco (TDC) do invento que se ligam a CD79b expresso na superfície de células BJAB-luciferase é semelhante para (A) variantes nuas (não conjugadas) tioMAb HC (A118C) de huMA79b.vl8 e variantes tioMAb HC (A118C) de huMA79b.vl8 conjugadas com os diferentes conjugados fármaco mostrados ( (B) MMAF, (C) MMAE e (D) DM1)). A detecção foi com MS anti-IgGhumana-PE. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado.
As Figuras 31A-D são gráficos de FAGS indicando que a ligação de conjugados tioMAb anti-CD79b-fármaco (TDC) do invento que se ligam a CD79b expresso na superfície de células BJAB-luciferase é semelhante para (A) variantes nuas (não conjugadas) tioMAb HC (A118C) de huMA79b.v28 e variantes tioMAb HC (A118C) de huMA79b.v28 conjugadas com os diferentes conjugados fármaco mostrados ( (B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)) . A detecção foi com MS anti-humana-PE. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado.
As Figuras 32A-D são gráficos de FACS indicando que a ligação dos conjugados tioMAb anti-cynoCD79b-fármaco (TDC) do invento que se ligam a CD79b expresso na superfície de células BJAB expressando cynoCD79b é semelhante para (A) variantes nuas (não conjugadas) tioMAb HC (A118C) de anti-cynoCD79b (chIODIO) e variantes tioMAb HC(A118C) de anti-cynoCD79b (chIODIO) conjugadas com os diferentes conjugados fármaco mostrados ( (B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF) ) . A detecção foi com MS anti-huIgG-PE. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína. A Figura 33A é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humanas) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b que variaram na posição da cisteína introduzida (LC (V205C) ou HC (A118C)) e/ou diferentes doses de fármaco a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas inibiu 26 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ significativamente ο crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 11) ou tio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,8 (Tabela 11) mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram hu-antÍ-HER2-MC-MMAF e tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF e chMA79b-MC-MMAF. A Figura 33B é um gráfico da alteração percentual do peso nos ratinhos do estudo de xenoenxerto Granta-519 (Figura 33A e Tabela 11) mostrando que não existe uma alteração significativa no peso durante os primeiros 14 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 34A é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (MCvcPAB-MMAE, BMPE0-DM1 ou MC-MMAF) a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,87 (Tabela 12), tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPC0-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 12), ou tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,95 (Tabela 12), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-BMPE0-DM1, tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF, tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE), controlos de huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMGC-DM1 e tio huMA79b.v28-HC(AI18C)) e controlos de anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HG(A118C)-MC-MMAF). A Figura 34B é um gráfico da alteração percentual do peso nos ratinhos do estudo de xenoenxerto BJAB-luciferase (Figura 34A e Tabela 12) mostrando que não existe uma alteração significativa no peso durante os primeiros 7 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. 27 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A Figura 35Α é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto WSU-DLCL2 (Linfoma de Células Grandes Difusas) gue mostra gue a administração de TDC anti-CD79b conjugado com diferentes porções fármaco ligadoras (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM 1 ou MC-MMAF) a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1, 87 (Tabela 13), tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 13), ou tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,95 (Tabela 13), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-llC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controlos de huMA7 9b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DMl e tio huMA79b.v28-HC(AI18C) ) e controlos de anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). A Figura 35B é um gráfico da alteração percentual do peso nos ratinhos do estudo de xenoenxerto WSU-DLCL2 (Figura 35A e Tabela 13) mostrando que não existe uma alteração significativa no peso durante os primeiros 7 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 36 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto D0HH2 (Linfoma Folicular) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-BMPEO-DMl (a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 14)), tio huMA79b.v28-MC-MMAF (a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,95 (Tabela 14)) ou tio MA79b-HC (AI 18C)-MCvcPAB-MMAE (a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,87 (Tabela 14)) mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-antÍ-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controlos de huMA79b.v28 28 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (huMA79b.ν28-SMCC-DM1 e tio huMA7 9b.v28-HC(AI18C)) e controlos de anti-CD2 2 (tio hu-anti-CD2 2(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF) . "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 37 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (MCvcPAB-MMAE, BMPE0-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrados a diferentes doses tal como mostrado a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPE0-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 15), tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 15), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 15) mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram veículo (apenas tampão), controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A11RC)-BMPE0-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(Al18C)-MCvcPAB-MMAE), controlos de huMA79b.v28 (tio huMA79b.v28-HC(AIIRC)) e controlos de anti-CD22 (tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 38A é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto Granta-619 (Linfoma de Células do Manto Humanas) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (BMPE0-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrados a diferentes doses tal como mostrado para ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118G)-BMPE0-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 16), ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,95 (Tabela 16), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-antÍ-HER2- 29 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF). A Figura 38B é um gráfico da alteração percentual do peso nos ratinhos do estudo de xenoenxerto Granta-519 (Figura 38A e Tabela 16) mostrando que não existe uma alteração significativa no peso durante os primeiros 14 dias do estudo. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 39 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto WSU-DLCL2 (Linfoma de Células Grandes Difusas) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (BMPE0-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) e/ou administrados a diferentes doses tal como mostrado para ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 17), tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 17) ou tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 17), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram veículo (apenas tampão) e controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF, tio hu-anti-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE). "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 40 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humanas) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b conjugados com diferentes porções fármaco ligadoras (BMPEO-DM 1 ou MCvcPAB-MMAE) e/ou administrados a diferentes doses tal como mostrado a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18G)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 18) ou tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,87 (Tabela 18), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram 30 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 41 mostra um gráfico dos resultados do ensaio de proliferação celular in vitro com células tumorais (A) BJAB, (B) Granta-519 ou (C) WSU-DLCL2, tratadas com concentrações variáveis de 0,001 a 10000 ng de TDC por ml, incluindo: (1) controlo de tio hu anti-gD-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, carga de 2,0 MMAE/Ab, (2) controlo de tio hu anti-gD-HC (A118C) -MC-MMAF, carga de 2,1 MMAF/Ab, (3) controlo de tio hu anti-gD-HC (A11-8C)-BMPEO-DM1, carga de 2,1 DMl/Ab, (4) tio huMA79b.vl8-HC(A118C)-MC-MMAF, carga de 1,91 MMAF/Ab, (5) tio huMA79b.vl8-HC(A11BC)-BMPEO-DM1, carga de 1,8 DMl/Ab, e (6) tio huMA79b.V28-HC(Al18C)-MCvcPAB-MMAE, carga de 2,0 MMAE/Ab. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. "gD" refere-se a glicoproteína D. A Figura 42 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 238) de ADNc de PR0283627, em que SEQ ID NO: 235 é um clone designado como "DNA548455" (também aqui referido como "cyno CD79b"). A sequência nucleotídica codifica para CD79b de cinomolgo com os codões de início e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 43 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 239) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 235 mostrada na Figura 42. A Figura 44 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 240) da cadeia leve do anticorpo anti-cyno CD79b (chIODIO). A sequência nucleotídica codifica para a cadeia leve do anticorpo anti-cyno CD79b (chIODIO) com os codões de início e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 45 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 241), sem os primeiros 18 aminoácidos da sequência sinal, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 240 mostrada na Figura 44. As regiões variáveis (SEQ ID NO: 302) são regiões não sublinhadas. 31 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A Figura 46 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 242) da cadeia pesada do anticorpo anti-cyno CD79b (chIODIO). A sequência nucleotídica codifica para a cadeia pesada do anticorpo anti-cyno CD79b (chIODIO) com os codões de início e terminação mostrados a negrito e sublinhados. A Figura 47 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 243), sem os primeiros 18 aminoácidos da sequência sinal e a última lisina (K) antes do codão de terminação, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 242 mostrada na Figura 46. As regiões variáveis (SEQ ID NO: 301) são regiões não sublinhadas. A Figura 48 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 245) e (B) a sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) do anticorpo anti-cynoCD79b modificado com cisteína (Tio-anti-cynoCD79b-HC-A118C), no qual uma alanina na posição EU 118 (alanina da posição sequencial 118; posição de Kabat 114) da cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. O aminoácido D na posição EU 6 (sombreado na Figura) da cadeia pesada pode alternativamente ser E. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. O sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada em itálico. "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteína. A Figura 49 mostra (A) a sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 300) e (B) a sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) do anticorpo anti-cynoCD79b de cisteína introduzida (Tio-anti-cynoCD79b-LC-V205C), no qual uma valina na posição de Kabat 205 (Valina da posição sequencial 209) da cadeia leve foi alterada para uma cisteína. O aminoácido D na posição EU 6 (sombreado na Figura) da cadeia pesada pode alternativamente ser E. Uma porção fármaco pode ser ligada ao grupo cisteína introduzido na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado em texto a negrito com duplo sublinhado. O sublinhado simples indica regiões constantes. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região Fc é marcada 32 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ em itálico. "Tio" refere-se a um anticorpo modificado com cisteina. A Figura 50 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79b) (Linfoma de Burkitt) que mostra que a administração de conjugados TDC anti-CD79b com diferentes porções fármaco ligadoras (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) para ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 19), tio huMA7 9 b.v2 8-HC(AI 18C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 19), ou tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 19), tio anti-cyno CD79b (chi0D10)-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,8 (Tabela 19), tio anti-cynoCD79b (chlODlO)-HC(AI18C)-MC-MMAF, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,9 (Tabela 19) ou tio anti-cynoCD79b (chIODIO)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,86 (Tabela 19), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, tio hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF). "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado. A Figura 51 é um gráfico da inibição do crescimento tumoral in vivo num modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79b) (Linfoma de Burkitt) que mostra que a administração de TDC anti-CD79b com a porção fármaco ligadora BMPEO-DM1 administrados a diferentes doses tal como mostrado, a ratinhos SCID possuindo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento tumoral. Os modelos de xenoenxerto tratados com tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,85 (Tabela 20) ou tio anti-cyno (chlODlO)-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, a carga de fármaco foi de aproximadamente 1,8 (Tabela 20), mostraram uma inibição significativa do crescimento tumoral durante o estudo. Os controlos incluíram controlos de anti-HER2 (tio hu-anti-HER2-HC(AI18C)-BMPEO-DM1) 33 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ e controlos de huMA79b.v28 (tio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controlos de anti-cynoCD79b(chIODIO) (tio anti- cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C)). "Tio" refere-se a anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" se refere a anticorpo humanizado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS O invento proporciona métodos, composições, estojos e artigos de fabrico para identificação de composições úteis para o tratamento de um tumor hematopoético em mamiferos e a métodos de utilização dessas composições de matéria para os mesmos.
Detalhes destes métodos, composições, estojos e artigos de fabrico são proporcionados aqui. I. Técnicas Gerais A prática do presente invento empregará, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, e imunologia, que estão dentro da perícia na técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook estimulação, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et ai., eds., 1987, e actualizações periódicas); "PCR; The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display; A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001). II. Definições
Para efeitos de interpretação deste fascículo, as seguintes definições serão aplicáveis e, sempre que apropriado, os termos usados no singular incluirão também o plural e vice-versa. No caso de qualquer definição estabelecida estar em conflito com qualquer documento aqui 34 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ incorporado por referência, a definição estabelecida abaixo prevalecerá.
Um "marcador de superfície de células B" ou "antigénio de superfície de células B" aqui é um antigénio expresso na superfície de uma célula B que pode ser alvo de um antagonista que se ligue ao mesmo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos para um antigénio da superfície de células B ou uma forma solúvel de um antigénio da superfície de células B capaz de antagonizar a ligação de um ligando ao antigénio de células B de ocorrência natural. Exemplos de marcadores da superfície de células B incluem os marcadores da superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD7 2, CD73, CD74, CDw75, CDw76. CD77, CDw78, CD79a, CD79b. CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, ver "The Leukocyte Antigen Facts Book", 2a Edition. 1997, ed. Barclay et ai., Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York) . Outros marcadores da superfície de células B incluem RP105, F cRH2, CR2 de células B, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA I, FcRH6, BCMA e 239287. O marcador da superfície de células B de particular interesse é de preferência expresso em células B em comparação com outros tecidos sem serem células B de um mamífero e podem ser expressos tanto em células B precursoras como células B maduras. O termo "CD79b", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer CD79b nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (p.ex. humanos, macaco cinomolgo (cyno)) e roedores (p.ex., ratinhos e ratos), a menos que indicado de outro modo. O CD79b humano é também aqui referido como "PR036249" (SEQ ID NO: 2) e codificado pela sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 1) também aqui referida como "DNA225786". O CD79b de cinomolgo é também aqui referido como "cyno CD79b" ou "PR0283627" (SEQ ID NO: 239) e codificado pela sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 238) também aqui referido como "DNA548455". O termo "CD79b" engloba CD79b "inteiro", não processado bem como qualquer forma de CD79b que resulte de processamento na célula. O termo engloba também variantes de ocorrência natural de CD79b, p.ex., variantes de processamento, variantes alélicas e isoformas. Os polipéptidos 35 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aqui CD79b descritos podem ser isolados a partir de um variedade de fontes, tais como a partir de tipos de tecidos humanos ou a partir de outra fonte, ou preparadas através de métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipéptido CD79b de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o correspondente polipéptido CD79b derivado da natureza. Tais polipéptidos CD79b de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos através de meios recombinantes ou sintéticos. 0 termo "polipéptido CD79b de sequência nativa" engloba especificamente formas truncadas ou segregadas de ocorrência natural do polipéptido CD79b especifico (p.ex., uma sequência do dominio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (p.ex., formas de processamento alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido. Em certas concretizações do invento, os polipéptidos CD79b de sequência nativa aqui divulgados são polipéptidos de sequência nativa maduros ou inteiros compreendendo as sequências de aminoácidos inteiras mostradas nas figuras anexas. Os codões de inicio e terminação (se indicados) são mostrados a texto em negrito e sublinhados nas figuras. Os resíduos de ácidos nucleicos indicados como "N" nas figuras anexas são qualquer resíduo de ácido nucleico. No entanto, enquanto é mostrado que os polipéptidos CD79b divulgados nas figuras anexas começam com resíduos metionina aqui designados como aminoácido da posição 1 nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos metionina localizados a montante ou a jusante do aminoácido da posição 1 nas figuras possam ser empregues como o residuo de aminoácido de partida para os polipéptidos CD79b. "MA79b" ou "anticorpo de CD79b de murídeo" ou "anticorpo anti-CD79b de murídeo" é aqui utilizado para se referir especificamente ao anticorpo monoclonal anti-CD79b de murídeo em que o anticorpo monoclonal anti-CD79b de murideo compreende o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Anticorpo monoclonal anti-CD79b de murídeo pode ser adquirido a partir de fontes comerciais tais como Biomeda (anticorpo anti-CD79b humano; Foster City, CA), BDbioscience (anticorpo anti-CD79b humano; San Diego, CA) ou Ancell (anticorpo anti-CD79b humano; Bayport, MN) ou gerado a partir do clone de hibridoma 3A2-2E7 número de designação do 36 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ depósito na American Type Culture Collection (ATCC) HB11413, depositado na ATCC a 20 de Junho de 1993. "chMA79b" ou "anticorpo MA79b quimérico" é aqui utilizado para se referir especificamente ao anticorpo quimérico anti-CD79b humano (tal como anteriormente descrito no Pedido US No. 11/462336, apresentado a 3 de Agosto de 2006) em que o anticorpo quimérico anti-CD79b compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 4 (Figura 4) . A cadeia leve de SEQ ID NO: 4 compreende ainda o dominio variável de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e o domínio constante da cadeia leve da IgGl humana. O anticorpo quimérico anti-CD79b compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 (Figura 6). A cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) e o dominio constante da cadeia pesada da IgGl humana. "anti-cynoCD79b" ou "anti-cyno CD79b" é aqui utilizado para se referir a anticorpos que se ligam a cyno CD79b (SEQ ID NO: 239 da Figura 43) (tal como anteriormente descrito no Pedido US No. 11/462336, apresentado a 3 de Agosto de 2006). "anti-cynoCD79b(chIODIO)" ou "chIODIO" é aqui utilizado para se referir a anti-cynoCD79b quimérico (tal como anteriormente descrito no Pedido US No. 11/462,336, apresentado a 3 de Agosto de 2006) que se liga a cynoCD79b (SEQ ID NO: 239 da Figura 43). Anti-cynoCD79b (chIODIO) ou chIODIO é o anticorpo anti-cynoCD79b quimérico que compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 241 (Figura 45). Anti-cynoCD79b(chIODIO) ou chIODIO compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 243 (Figura 47). "Enxerto MA79b" ou "anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b" ou "enxerto huMA79b" é aqui utilizado para se referir especificamente ao enxerto gerado através da enxertia das regiões hipervariáveis do anticorpo anti-CD79b de murideo (MA79b) na VL capa I de consenso humana aceitadora (huKI) e na VH subgrupo III de consenso humana (huIII) com R71A, N73T e L78A (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992)) (Ver Exemplo IA e Figuras 7 (SEQ ID NO: 11) e 8 (SEQ ID NO: 15)).
Uma "modificação" de um resíduo/posição de aminoácido, tal como aqui utilizado, refere-se a uma mudança de uma 37 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ sequência de aminoácidos primária em comparação com uma sequência de aminoácidos de partida, em que a mudança resulta de uma alteração da sequência envolvendo o referido residuo/posição de aminoácido. Por exemplo, modificações típicas incluem substituição do resíduo (ou na referida posição) por outro aminoácido (p.ex., uma substituição conservativa ou não conservativa), inserção de um ou mais (geralmente menos de 5 ou 3) aminoácidos adjacentes ao referido residuo/posição, e deleção do referido residuo/posição. Uma "substituição de aminoácido", ou variação deste, refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido existente numa sequência de aminoácidos (de partida) predeterminada por um resíduo de aminoácido diferente. Geralmente e de preferência, a modificação resulta na alteração de pelo menos uma actividade fisico-bioquímica do polipéptido variante em comparação com um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de partida (ou "de tipo selvagem"). Por exemplo, no caso de um anticorpo, uma actividade físico-bioquímica que é alterada pode ser a afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação sobre um molécula alvo. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD79b simples (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas, neutralizadores, anticorpos monoclonais inteiros ou intactos), composições de anticorpo anti-CD79b com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos desde que exibam a actividade biológica desejada), formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos anti-CD79b de cadeia simples, e fragmentos de anticorpos anti-CD79b (ver abaixo), incluindo Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv, diacorpos, anticorpos de domínio único (sdAbs), desde que exibam a actividade biológica ou imunológica desejada. 0 termo "imunoglobulina" (Ig) é utilizado alternadamente com o anticorpo aqui. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou de afinidade maturada. 0 termo "anticorpo anti-CD79b" ou "um anticorpo que se liga a CD79b" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD79b com tal suficiente afinidade que o anticorpo é útil 38 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ como agente de diagnóstico e/ou terapêutico a atingir CD79b. De preferência, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD79b a uma proteina não CD79b não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD79b tal como medida, p.ex., através de um radioimunoensaio (RIA). Em certas concretizações, um anticorpo que se liga a CD79b tem uma constante de dissociação (Kd) <1 μΜ, <100 nM, <10 nM, <1 nM, ou <0,1 nM. Em certas concretizações, o anticorpo anti-CD79b liga-se a um epitopo de CD79b que é conservado entre os CD79b de diferentes espécies.
Um "anticorpo isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo tal como determinado através do método de Lowry, e de preferência mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A unidade básica de anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas juntamente com um polipéptido adicional designado cadeia J, e portanto contém 10 locais de ligação ao antigénio, enquanto os anticorpos IgA segregados podem polimerizar para formar montagens polivalentes compreendendo 2-5 das unidades básicas de 4 cadeias juntamente com a cadeia J) . No caso das IgG, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma 39 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cadeia Η através de uma ligação dissulfureto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas uma à outra através de uma ou mais ligações dissulfureto, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L tem também regularmente espaçadas pontes dissulfureto intracadeias. Cada cadeia H tem no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) na sua outra extremidade. 0 VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Crê-se que determinados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. 0 emparelhamento de um VH com um VL juntos forma um único local de ligação ao antigénio. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, p.ex., "Basic and Clinicai Immunology", 8a edição, Daniel P. Stites, Abba I, Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6 . A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, possuindo cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes γ e α são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas na sequência e função de CH, p.ex., os humanos expressam as seguintes subclasses: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2. A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. 0 domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". 0 domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os locais de ligação ao antigénio. 40 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο termo "variável" refere-se ao facto de certos segmentos dos domínios variáveis diferirem amplamente na sequência entre anticorpos. O domínio V medeia a ligação ao antigénio e define a especificidade de um determinado anticorpo para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente em toda a extensão de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes chamados regiões estruturais (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervar iáveis" que têm cada uma 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FR, em grande parte adoptando uma configuração em folha β, ligados através de três regiões hipervariáveis, que formam voltas ligando a, e em alguns casos fazendo parte da, estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade através das FR e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver Kabat et al. , Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
Um anticorpo "intacto" é um que compreende um local de ligação ao antigénio bem como um CL e pelo menos os domínios constantes da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (p.ex. domínios constantes de sequência nativa humanos) ou variantes de sequência de aminoácidos destes. De preferência, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efectoras.
Um "anticorpo nu" para os fins daqui é um anticorpo que não é conjugado com uma porção citotóxica ou marcador radioactivo.
Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a região de ligação ao 41 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ antigénio ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv, diacorpos, anticorpos lineares (ver Patente U.S. No. 5641870, Exemplo 2; Zapata et al., Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Numa concretização, um fragmento de anticorpo compreende um local de ligação ao antigénio do anticorpo intacto e mantém assim a capacidade para se ligar ao antigénio. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, chamados fragmentos "Fab", e um fragmento residual "Fc", uma designação que reflecte a capacidade de cristalizar facilmente. 0 fragmento Fab consiste numa cadeia L inteira, juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH) , e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação ao antigénio, i.e., tem um único local de ligação ao antigénio. O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande que corresponde a aproximadamente dois fragmentos Fab ligados através de dissulfureto com actividade de ligação ao antigénio bivalente e é ainda capaz de se ligar de forma cruzada ao antigénio. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resíduos adicionais no terminal carboxilo do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o resíduo ou resíduos de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de charneira entre eles. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo são também conhecidas. O fragmento Fc compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas através de ligações dissulfureto. As funções efectoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc, região que é também a parte reconhecida pelos receptores de Fc (FcR) verificados em certos tipos de células. 42 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ "Fv" é ο fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Este fragmento consiste num dímero de um domínio da região variável da cadeia pesada e outro da cadeia leve em forte associação não covalente. Numa espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e outro de cadeia leve podem ser ligados covalentemente através de um ligador peptídico flexível de modo a que as cadeias leves e pesadas se possam associar numa estrutura "dimérica" análoga aquela numa espécie de Fv de duas cadeias. A partir da dobragem destes dois domínios emanam seis voltas hipervariáveis (3 voltas de cada cadeia H e L) , que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação ao antigénio e conferem especificidade de ligação ao antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se ao antigénio, embora a uma afinidade mais baixa que o local de ligação completo. 0 "Fv de cadeia simples" também abreviado como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL ligados numa única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipéptido sFv compreende ainda um ligador polipeptídico entre os domínios VH e VL o que permite que sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra. 0 termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao anticorpo, fragmentos que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Os pequenos fragmentos de anticorpo são preparados através da construção de fragmentos sFv (ver parágrafo anterior) com ligadores curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de modo a que seja obtido emparelhamento inter-cadeias mas não intra-cadeias dos domínios V, resultando num fragmento bivalente, i.e., fragmento possuindo dois locais de ligação ao anticorpo. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos 43 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv de "crossover" nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404097; WO 93/11161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003). O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O adjectivo "monoclonal" não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis no presente invento podem ser preparados através da metodologia de hibridoma descrita pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos utilizando métodos de ADN recombinante em células bacterianas, eucarióticas animais ou vegetais (ver, p.ex., Patente U.S. No. 4816567) . Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de biblioteca fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais daqui incluem anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a correspondentes sequências em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencendo 44 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às correspondentes sequências em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (ver Patente U.S. No. 4816567; e Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo sequências de ligação ao antigénio do domínio variável derivadas de um primata não humano (p.ex. Macaco do Velho Mundo, Hominoideos, etc.), e sequências da região constante humana.
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de roedor) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade de anticorpo desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se verificam no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et aí., Nature 321: 522-525 (1986); Ricchmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bíol. 2: 593-596 (1992). Ver também os seguintes artigos de revisão e referências ai citadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Imunol., 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. 45 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Transactions, 23: 1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech., 5: 428433 (1994). "Tio" quando aqui utilizado em relação a um anticorpo refere-se a um anticorpo modificado com cisteina enquanto "hu" quando aqui utilizado em relação a um anticorpo refere-se a um anticorpo humanizado.
Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou que tenha sido produzido utilizando qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos tal como aqui divulqado. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de liqação ao antigénio não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de apresentação fágica. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos métodos descritos em Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Ver também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Anticorpos humanos podem ser preparados através da administração do antigénio a um animal transgénico que tenha sido modificado para produzir tais anticorpos em resposta a confronto antigénico, mas cujos loci endógenos tenham sido desactivados, p.ex. xenoratinhos imunizados (ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 6075181 e 6150584 sobre tecnologia XENOMOUSE™) . Ver também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 103: 3557-3562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas. O termo "região hipervariável", "HVR", ou "HV", quando aqui utilizado refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam voltas estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (Hl, H2, H3) , e três no VL (Ll, L2, L3). Várias delimitações das regiões hipervariáveis estão em uso e são aqui englobadas. As Regiões Determinantes de Complementaridade de Kabat (CDR) 46 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ baseiam-se na variabilidade da sequência e são as mais vulgarmente utilizadas (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se em vez disso à localização das voltas estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196 : 901-917 (1987)). O fim da volta CDR-H1 de Chothia quando numerada utilizando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento da volta (isto é porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiverem presentes, a volta termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a volta termina em 33; se tanto 35A como 35B estiverem presentes, a volta termina em 34). As regiões hipervariáveis de AbM representam um compromisso entre as CDR de Kabat e as voltas estruturais de Chothia, e são utilizadas pelo software de modelação de anticorpos AbM de Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contacto" baseiam-se numa análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são observados abaixo.
Volta Kabat AbM Ll L24-L34 L24-L3 L2 L50-L56 L5 0-L5 L3 L89-L97 L89-L9 Hl H31-H351B H26-H3 (Numeração de Kabat) Hl H31-H35 H26-H3 (Numeração de Chothia] ) H2 H50-H65 H50-H5 H3 H95-H102 H95-H1
Chothia Contacto 4 L24-L34 L30-L36 6 L50-L56 L46-L55 7 L89-L97 L89-L96 5B H26-H32..34 H30-H35B 5 H26-H32 H30-H35 8 H52-H56 H47-H58 02 H95-H102 H93-H101
As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis prolongadas" como se segue: 24-36 ou 24-34 (Ll), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (Hl), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra para cada uma destas definições. 47 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os resíduos "estruturais" ou "FR" são os resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável aqui definida. 0 termo "numeração dos resíduos do domínio variável tal como em Kabat" ou "numeração das posições de aminoácidos tal como em Kabat", e variações deste, refere-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis da cadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al. . "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção numa, FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma inserção de um único aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (p.ex. resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR da cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo através do alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada como Kabat "padrão". 0 sistema de numeração de Kabat é geralmente utilizado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente os resíduos 1-107 da cadeia leve e os resíduos 1-113 da cadeia pesada) (p.ex. Kabat et al., "Sequences of Immunological Interest". 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU " é geralmente utilizado quando se refere um resíduo numa região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (p.ex., o índice EU relatado em Kabat et al., supra) . O "índice EU tal como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgGl humano de EU. A menos que aqui indicado de outro modo, as referências aos números dos resíduos no domínio variável dos anticorpos significam a numeração de resíduos através do sistema de numeração de Kabat. A menos que aqui indicado de outro modo, as referências aos números dos resíduos no domínio constante de anticorpos significam a numeração de resíduos através do 48 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ sistema de numeração de EU (p.ex., ver Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 60/640323, Números para a numeração de EU).
Um anticorpo de "afinidade maturada" é um com uma ou mais alterações numa ou mais HVR deste que resultam numa melhoria na afinidade do anticorpo para o antigénio, em comparação com um anticorpo-mãe que não possua essa ou essas alterações. Os anticorpos de afinidade maturada preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antigénio alvo. Os anticorpos de afinidade maturada são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) descrevem a maturação da afinidade através de baralhação de domínios VH e VL. A mutagénese aleatória de HVR e/ou resíduos estruturais é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei., EUA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995);
Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al. J.
Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
Um anticorpo de "bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a actividade biológica do antigénio a que se liga. Os anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a actividade biológica do antigénio.
Um "anticorpo agonista", tal como aqui utilizado, é um anticorpo que imita pelo menos uma das actividades funcionais de um polipéptido de interesse.
Um "anticorpo dependente da espécie", p.ex., um anticorpo anti-IgE humana de mamífero, é um anticorpo que tem uma afinidade de ligação mais forte para um antigénio de uma primeira espécie de mamífero do que para um homólogo do antigénio de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "liga-se especificamente" a um antigénio humano (i.e., tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais de cerca de 1χ10“7 M, de preferência não mais de cerca de lxlCT8 e de maior preferência não mais de cerca de lxlCT9 M) , mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antigénio de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 49 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraca que a sua afinidade de ligação para o antigénio humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser de qualquer um dos vários tipos de anticorpos tal como definidos acima, mas de preferência é um anticorpo humanizado ou humano. "Afinidade de ligação" refere-se geralmente à força da soma total de interacções não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (p.ex., um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (p.ex., um antigénio). A menos que indicado de outra forma, tal como aqui utilizado, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflecte uma interacção 1:1 entre os membros de um par de ligação (p.ex., anticorpo e antigénio). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode ser geralmente representada através da constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os aqui descritos. Os anticorpos de baixa afinidade ligam-se geralmente ao antigénio lentamente e tendem a dissociar-se facilmente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade ligam-se geralmente ao antigénio mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser utilizado para os fins do presente invento. Concretizações ilustrativas especificas são descritas no seguinte. "Ou melhor" quando utilizado em relação à afinidade de ligação refere-se a uma ligação mais forte entre uma molécula e o seu parceiro de ligação. "Ou melhor" quando aqui utilizado refere-se a uma ligação mais forte, representada por um menor valor numérico de Kd. Por exemplo, um anticorpo que tem uma afinidade para um antigénio de "0,6 nM ou melhor", a afinidade do anticorpo para o antigénio é <0,6 nM, i.e. 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM, etc. ou qualquer valor inferior a 0,6 nM.
Numa concretização, a "Kd" ou "valor de Kd" de acordo com este invento é medida através de um ensaio de ligação ao antigénio marcado radioactivamente (RIA), efectuado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antigénio tal como descrito através do seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação em solução de Fab para o antigénio através do 50 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ equilíbrio do Fab com uma concentração mínima de antigénio marcado com (125I) na presença de uma série de titulação do antigénio não marcado, em seguida captura do antigénio ligado com uma placa revestida de anticorpo anti-Fab (Chen, et ai., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas de um dia para o outro com 5 pg/ml de um anticorpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6) e subsequentemente bloqueado com albumina do soro bovino a 2% (p/v) em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Numa placa não adsorvente (Nunc # 269620) , 125I-antigénio 100 pM ou 26 pM são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (p.ex., consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Câncer Res. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é então incubado de um dia para o outro, no entanto, a incubação pode continuar durante um período mais longo (p.ex., 65 horas) para assegurar que o equilíbrio é alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (p.ex., durante uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1% em PBS. Quando as placas secam, são adicionados 150 μΐ/poço de cintilante (Microscint-20; Packard), e as placas são contadas num contador gama TopCount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que dão menos de, ou igual a, 20% da ligação máxima são escolhidas para utilização em ensaios de ligação competitiva. De acordo com outra concretização, Kd ou o valor de Kd é medido utilizando ensaios de ressonância de plasmão de superfície utilizando um BIAcore™ 2000 ou um BIAcore™ 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 de antigénio imobilizado a «10 unidades de resposta (RU) . Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) são activados com cloridrato de IV-etil-N' - (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antigénio é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, em 5 pg/ml («0,2 μΜ) antes de injecção a um caudal de 5 μΐ/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína ligada. Após a injecção de antigénio, é injectada etanolamina 1 M para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições de cinética, são injectadas 51 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 μΐ/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (k0ff) são calculadas utilizando um simples modelo de ligação de Langmuir um-para-um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) através do ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/kon· Ver, por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Se a taxa on excede ΙΟ6 M_1 S”1 através do ensaio de ressonância de plasmão de superfície acima, então a taxa on pode ser determinada usando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa-banda 16 nm) a 25°C de um anticorpo anti-antigénio 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio medidas num espectrómetro, tal como um espectrofotómetro equipado com paragem de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cuvete vermelha com agitação.
Uma "taxa on" ou "taxa de associação" ou "Kon" de acordo com este invento pode também ser determinada com a mesma técnica de ressonância de plasmão de superfície descrita acima utilizando um BIAcore™ 2000 ou um BIAcore™ 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) tal como descrito acima. A frase "substancialmente semelhante", ou "substancialmente a mesma", tal como aqui utilizado, denota um grau suficientemente elevado de semelhança entre dois valores numéricos (geralmente um associado a um anticorpo do invento e outro associado a um anticorpo de referência/comparador) de modo que um perito na técnica considerará a diferença entre os dois valores de pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto da característica biológica medida pelos referidos valores (p.ex., valores de Kd) . A diferença entre os referidos dois valores é de preferência inferior a cerca de 50%, de preferência inferior a cerca de 40%, de preferência inferior a cerca de 30%, ainda de preferência inferior a cerca de 20%, de preferência inferior a 52 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cerca de 10%, em função do valor para o anticorpo de referência/comparador. A frase "substancialmente reduzido" ou "substancialmente diferente", tal como aqui utilizado, denota um grau suficientemente elevado de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado a um anticorpo do invento e outro associado a um anticorpo de referência/comparador) , de modo que um perito na técnica considerará a diferença entre os dois valores de significância estatística dentro do contexto da característica biológica, medida pelos referidos valores (p.ex., valores de Kd, resposta HAMA). A diferença entre os referidos dois valores é de preferência superior a cerca de 10%, de preferência superior a cerca de 20%, de preferência superior a cerca de 30%, de preferência superior a cerca de 40%, de preferência superior a cerca de 50%, em função do valor para o anticorpo de referência/comparador.
Um "antigénio" é um antigénio pré-determinado ao qual um anticorpo se pode ligar selectivamente. O antigénio alvo pode ser um polipéptido, hidrato de carbono, ácido nucleico, lipido, hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. De preferência, o antigénio alvo é um polipéptido.
Uma "estrutura humana aceitadora" para os fins aqui é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de VL ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana, ou de uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura humana aceitadora "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos desta, ou pode conter alterações pré-existentes da sequência de aminoácidos. Quando estão presentes alterações de aminoácidos pré-existentes, de preferência não estão presentes mais de 5, e de preferência 4 ou menos, ou 3 ou menos alterações pré-existentes de aminoácidos. Quando estão presentes alterações de aminoácidos pré-existentes num VH, de preferência essas alterações estão apenas em três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H, por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Numa concretização, a estrutura aceitadora humana de VL é idêntica em sequência à 53 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ sequência estrutural de imunoglobulina humana de VL ou à sequência estrutural humana de consenso.
Uma "estrutura de consenso humana" é uma estrutura que representa o resíduo de aminoácido de ocorrência mais comum numa selecção de sequências estruturais de imunoglobulina humana de VL ou VH. Geralmente, a selecção de sequências de imunoglobulina humana de VL ou VH é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo tal como em Kabat et al. Numa concretização, para o VL, o subgrupo é o subgrupo capa 1 tal como em Kabat et al. Numa concretização, para o VH, o subgrupo é o subgrupo III tal como em Kabat et al.
Uma "estrutura de consenso de VH subgrupo III" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoácidos no variável da pesada subgrupo III de Kabat et al. Numa concretização, a sequência de aminoácidos estrutural de consenso de VH subgrupo III compreende pelo menos uma porção ou a totalidade de cada uma das seguintes sequências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143)-Hl-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
Uma "estrutura de consenso de VL subgrupo I" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoácidos na variável da leve capa subgrupo I de Kabat et al. Numa concretização, a sequência de aminoácidos da estrutura de consenso de VL subgrupo I compreende pelo menos uma porção ou a totalidade de cada uma das seguintes sequências: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITG (SEQ ID NO: 139)-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FATYYC (SEQ ID NO: 141)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:142).
Uma "estrutura humana não modificada" é uma estrutura humana que tem a mesma sequência de aminoácidos que a estrutura aceitadora humana, p.ex. sem a substituição de aminoácido(s) de humano para não humano na estrutura humana aceitadora. 54 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Uma "região hipervariável alterada" para os fins daqui é uma região hipervariável compreendendo uma ou mais (p.ex. uma a cerca de 16) substituições de aminoácidos aqui.
Uma "região hipervariável não modificada" para os fins daqui é uma região hipervariável possuindo a mesma sequência de aminoácidos que um anticorpo não humano do qual foi derivada, i.e. uma sem uma ou mais substituições de aminoácidos na mesma.
Um anticorpo "que se liga" a um antigénio de interesse, p.ex. um alvo antigénico polipeptídico associado a tumores, é um que se liga ao antigénio com suficiente afinidade de modo a que o anticorpo seja útil como agente terapêutico a atingir uma célula ou tecido expressando o antigénio, e não reage significativamente de forma cruzada com outras proteínas. Em tais concretizações, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína "não-alvo" será inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo à sua proteína alvo particular, tal como determinado através de análise de separação de células activada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Em relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo "ligação específica", ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um determinado polipéptido ou um determinado epitopo num determinado alvo polipeptídico significa ligação que é diferente de forma mensurável de uma interacção não específica. A ligação especifica pode ser medida, por exemplo, através da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controlo, que é geralmente uma molécula de estrutura semelhante que não tem actividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada através de competição com uma molécula de controlo que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, é indicada ligação especifica se a ligação do alvo marcado a um sonda for competitivamente inibida através de um alvo não marcado em excesso. 0 termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um determinado polipéptido ou um epitopo num determinado alvo polipeptídico tal como aqui utilizado pode ser exposto, por exemplo, através uma molécula possuindo uma Kd para o alvo de pelo menos cerca de 1CT4 M, alternativamente pelo menos cerca de 1CT5 M, alternativamente pelo menos cerca 55 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de 1CT6 Μ, alternativamente pelo menos cerca de 10 7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10 8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10~9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10~10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10 11 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-12 M, ou mais. Numa concretização, o termo "ligação especifica" refere-se a ligação em que uma molécula se liga a um determinado polipéptido ou epitopo num determinado polipéptido, sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipéptido ou epitopo polipeptidico.
Um anticorpo que "inibe o crescimento de células tumorais que expressam um polipéptido CD79b" ou um anticorpo "inibidor do crescimento" é um que resulta em inibição do crescimento de forma mensurável de células de cancro expressando ou sobre-expressando o polipéptido CD79b apropriado. O polipéptido CD79b pode ser um polipéptido transmembranar expresso na superfície de uma célula de cancro ou pode ser um polipéptido que é produzido e segregado por uma célula de cancro. Os anticorpos anti-CD79b inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células tumorais expressando CD79b em mais de 20%, de preferência de cerca de 20% a cerca de 50% e ainda de preferência em mais de 50% (p.ex., de cerca de 50% a cerca de 100%) em comparação com o controlo apropriado, sendo o controlo tipicamente células de tumor não tratadas com o anticorpo a testar. Numa concretização, a inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 pg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, onde a inibição do crescimento é determinada Ι-ΙΟ dias após a exposição das células tumorais ao anticorpo. A inibição do crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada de várias formas, tal como é descrito na secção Exemplos Experimentais abaixo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo se a administração do anticorpo anti-CD79b a de cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal resultar na redução do tamanho do tumor ou da proliferação de células tumorais dentro de cerca de 5 dias a 3 meses após a primeira administração do anticorpo, de preferência dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celular programada, tal como determinado através da ligação de 56 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anexina V, fragmentação do ADN, contracção celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas membranares (chamadas corpos apoptóticos). A célula é usualmente uma gue sobre-expressa um polipéptido CD79b. De preferência, a célula é uma célula tumoral, p.ex., uma célula hematopoética, tal como uma célula B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monócito, plaqueta ou eritrócito. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados à apoptose. Por exemplo, a translocação da fosfatidil-serina (PS) pode ser medida através de ligação de anexina; a fragmentação do ADN pode ser avaliada através de separação do ADN; e a condensação nuclear/cromatina juntamente com a fragmentação do ADN podem ser avaliadas através de qualquer aumento nas células hipodiplóides. De preferência, o anticorpo que induz apoptose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, de preferência cerca de 5 a 50 vezes, e de maior preferência cerca de 10 a 50 vezes a indução de ligação de anexina relativamente à célula não tratada num ensaio de ligação de anexina.
Um anticorpo que "induz morte celular" é um que faz com que uma célula viável se torne inviável. A célula é uma que expressa um polipéptido CD79b e é de um tipo celular que expressa ou sobre-expressa especificamente um polipéptido CD79b. A célula pode ser células cancerosas ou normais do tipo celular particular. O polipéptido CD79b pode ser um polipéptido transmembranar expresso na superfície de uma célula de cancro ou pode ser um polipéptido que é produzido e segregado por uma célula de cancro. A célula pode ser uma célula de cancro, p.ex., uma célula B ou célula T. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e de células efectoras imunitárias para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Assim, o ensaio de morte celular pode ser realizado utilizando soro inactivado com calor (i.e., na ausência de complemento) e na ausência de células efectoras imunitárias. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, a perda da integridade da membrana, tal como avaliada através da tomada de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (ver Moore et al., Cytotechnology 17: 1-1 (1995)) ou 7AAD, pode ser avaliada relativamente a células não tratadas. 57 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Anticorpos indutores de morte celular preferidos são os que induzem a tomada de PI no ensaio de tomada de PI em células BT 4 7 4.
As "funções efectoras" dos anticorpos referem-se às actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante da sequência da aminoácidos) de um anticorpo, e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efectoras dos anticorpos incluem: ligação de Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; subregulação de receptores da superfície celular (p.ex., receptor de células B), e activação de células B. 0 termo "região Fc" é aqui usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é geralmente definida como estendendo-se de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até ao terminal carboxilo desta. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração de EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou através de modificação de forma recombinante do ácido nucleico codificando uma cadeia pesada do anticorpo. Concordantemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os residuos K447 removidos, populações de anticorpos sem nenhum resíduo K447 removido, e populações de anticorpos possuindo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
Uma "região Fc funcional" possui uma "função efectora" de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de "funções efectoras" incluem ligação de Clq; CDC; ligação ao receptor de Fc; ADCC; fagocitose; subregulação dos receptores da superfície celular (p.ex., receptor de células B; BCR), etc. Tais funções efectoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (p.ex., um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando vários ensaios tal como divulgado, por exemplo, nas definições aqui. 58 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc verificada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgGl humana de sequência nativa (alotipos não-A e A) ; região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural destas.
Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos, de preferência uma ou mais substituições de aminoácido(s). De preferência, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipéptido-mãe, p.ex. desde cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e de preferência de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos na região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipéptido-mãe. A região Fc variante daqui possuirá de preferência pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipéptido-mãe, e ainda de preferência pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, ainda de preferência pelo menos cerca de 95% homologia com esta. "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que a Ig segregada ligada a receptores de Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (p.ex., células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células citotóxicas efectoras se liguem especificamente a uma célula alvo possuindo um antigénio e, subsequentemente, matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal matança. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991) . Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de 59 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente US No. 5500362 ou 5821337. Células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, p.ex. num modelo animal tal como o descrito em Clynes et al. (EUA) 95: 652-656 (1998). O "receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de processamento alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos destes. O receptor de activação FcyRIIA contém um motivo de activação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (Ver revisão M. in Daêron, Annu. Rev. Imunol. 15: 203-234 (1997)). Os FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Imunol. 9: 457-492 (1991); Capei et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a identificar no futuro, estão englobados pelo termo "FcR" aqui. O termo inclui também o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)). A ligação a FcRn humano in vivo e a semivida sérica de polipéptidos que se ligam com elevada afinidade a FcRn humano podem ser ensaiadas, p.ex., em ratinhos transgénicos ou linhas celulares humanas transfectadas expressando FcRn humano, ou em primatas aos quais são administrados os polipéptidos com uma região Fc variante. WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída a FcR. Ver 60 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e executam funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos FcyRIII e executam uma função efectora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sanque periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo as PBMC e células NK as preferidas. As células efectoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, p.ex. a partir de sangue. "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A activação da via clássica do complemento é iniciada através da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada), que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, p.ex. tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Variantes polipeptídicas com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas (polipéptidos com uma região Fc variante) e capacidade de ligação a Clq aumentada ou diminuída são descritos, p.ex., na Patente US No. 6194551B1 e WO 1999/51642. Ver também, p.ex., Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). 0 termo "anticorpo compreendendo uma região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração de EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou através de engenharia recombinante do ácido nucleico codificando o anticorpo. Concordantemente, uma composição compreendendo um anticorpo possuindo uma região Fc de acordo com o presente invento pode compreender um anticorpo com K447, com toda a K447 removida, ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. O "domínio extracelular" do polipéptido CD79b ou "ECD" refere-se a uma forma do polipéptido CD79b que é essencialmente livre dos domínios transmembranar e 61 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ citoplasmático. Normalmente, um ECD do polipéptido CD79b terá menos de 1% de tal domínio transmembranar e/ou citoplasmático e terá, de preferência, menos de 0,5% de tais domínios. Será entendido que quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos CD79b do presente invento são identificados de acordo com critérios rotineiramente empregues na técnica para identificação do tipo de domínio hidrófobo. Os limites exactos de um domínio transmembranar podem variar, mas muito provavelmente em não mais do que cerca de 5 aminoácidos em qualquer uma das extremidades do domínio, tal como inicialmente aqui identificado. Opcionalmente, portanto, um domínio extracelular de um polipéptido CD79b pode conter de cerca de 5 ou menos aminoácidos em cada um dos lados dos limites do domínio transmembranar/domínio extracelular tal como identificado nos Exemplos ou fascículo e tais polipéptidos, com ou sem o péptido sinal associado, e o ácido nucleico codificando os mesmos, são contemplados pelo presente invento. A localização aproximada dos "péptidos sinal" do polipéptido CD79b aqui divulgado pode ser mostrada no presente fascículo e/ou nas figuras anexas. É de notar, no entanto, que o limite C-terminal de um péptido sinal pode variar, mas muito provavelmente em não mais do que cerca de 5 aminoácidos em cada um dos lados do limite C-terminal do péptido sinal, tal como inicialmente aqui identificado, em que o limite C-terminal do péptido sinal pode ser identificado de acordo com critérios rotineiramente empregues na técnica para identificação do tipo de elemento da sequência de aminoácidos (p.ex., Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). Além disso, é também reconhecido que, nalguns casos, a clivagem de uma sequência sinal de um polipéptido segregado não é inteiramente uniforme, resultando em mais de uma espécie segregada. Estes polipéptidos maduros, onde o péptido sinal é clivado dentro de não mais de cerca de 5 aminoácidos em cada um dos lados do limite C-terminal do péptido sinal, tal como aqui identificado, e os polinucleótidos codificando os mesmos, são contemplados pelo presente invento. "Variante do polipéptido CD79b" significa um polipéptido CD79b, de preferência um polipéptido CD79b activo, tal como 62 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aqui definido possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa inteiro tal como aqui descrito, uma sequência do polipéptido CD79b sem o péptido sinal tal como aqui divulgado, um domínio extracelular de um polipéptido CD79b, com ou sem o péptido sinal, tal como aqui divulgado ou qualquer outro fragmento de uma sequência do polipéptido CD79b inteiro tal como aqui divulgado (tal como os codificados por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipéptido CD79b inteiro). Tais variantes do polipéptido CD79b incluem, por exemplo, polipéptidos CD79b em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou eliminados no terminal N ou C da sequência de aminoácidos nativa inteira. Normalmente, uma variante do polipéptido CD79b terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos, com uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa inteiro tal como aqui divulgado, uma sequência do polipéptido CD79b sem o péptido sinal tal como aqui divulgado, um domínio extracelular de um polipéptido CD79b, com ou sem o péptido sinal, tal como aqui divulgado ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência do polipéptido CD79b inteiro tal como aqui divulgado. Normalmente, os polipéptidos CD79b variantes têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de O CM 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110 , 120 , 130, 140, 150, 160, 170 , 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de comprimento ou mais.
Opcionalmente, os polipéptidos CD79b variantes não terão mais do que uma substituição de aminoácidos conservativa em comparação com a sequência nativa do polipéptido CD79b, alternativamente não mais de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácidos conservativas em comparação com a sequência nativa do polipéptido CD79b. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação a uma sequência peptídica ou 63 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ polipeptídica, i.e. sequências de polipéptidos CD79b aqui identificadas, é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica do péptido ou polipéptido, i.e. a sequência do polipéptido CD79b, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem de identidade de sequência máxima, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de vários modos que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível publicamente, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para a medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. Para os fins daqui, no entanto, os valores da % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela 1 abaixo. 0 programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria de Genentech, Inc. e o código-fonte mostrado na Tabela I abaixo foi apresentado com a documentação do utilizador U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado de acordo com U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível ao público através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte fornecido na Tabela I abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso num sistema operativo UNIX, de preferência digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregue para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (o que pode, alternativamente, ser formulado como uma dada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende uma certa % de 64 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ identidade de sequência de aminoácidos para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
100 vezes a fracção X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos registados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos de B. Será apreciado que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não igualará a % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. "Polinucleótido variante de CD79b" ou "sequência de ácido nucleico variante de CD79b" significa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido CD79b, de preferência um polipéptido CD79b activo, tal como aqui definido e que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de ácido nucleico com uma sequência nucleotidica codificando uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa tal como aqui descrito, uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa inteiro sem o péptido sinal tal como aqui divulgado, um domínio extracelular de um polipéptido CD79b, com ou sem o péptido sinal, tal como aqui divulgado ou qualquer outro fragmento de uma sequência do polipéptido CD79b inteiro tal como aqui divulgado (tal como as codificadas por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipéptido CD79b inteiro). Vulgarmente, um polinucleótido variante de CD79b terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de ácido nucleico, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa inteiro tal como aqui divulgado, uma sequência do polipéptido CD79b de sequência nativa inteiro sem o péptido sinal tal como aqui divulgado, um domínio extracelular de um polipéptido CD79b, com ou sem a sequência sinal, tal como aqui divulgado ou 65 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ qualquer outro fragmento de uma sequência do polipéptido CD79b inteiro tal como aqui divulgado. As variantes não englobam a sequência nucleotídica nativa.
Vulgarmente, os polinucleótidos CD79b variantes têm pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7 CT> 00 O \—1 , 11, 12, 13, 14 , 15, 16 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24 , 25 , 26, 27, 28, 29 , 30, 35 40, 45, 50, , 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 , 95 , 100, 105, 110 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980 990, ou 1000 nucleótidos de comprimento, em que neste contexto o termo "cerca de" significa a sequência nucleotídica referenciada mais ou menos 10% desse comprimento referenciado. "Percentagem (%) de identidade de sequência de ácido nucleico" em relação a sequências de ácido nucleico codificando CD79b aqui identificadas é definido como a percentagem de nucleótidos numa sequência candidata que são idênticos aos nucleótidos na sequência de ácido nucleico de CD79b de interesse, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para os fins daqui, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de ácido nucleico são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela I abaixo. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria de Genentech, Inc. e o código-fonte mostrado na Tabela I abaixo foi apresentado com documentação do utilizador no U.S. Copyright 66 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Office, Washington DC, 20559, onde está registado sob U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível ao público através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte apresentado na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferência UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregue para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de uma dada sequência de ácido nucleico C para, com, ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D (o que pode alternativamente ser formulado como uma dada sequência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácido nucleico para, com, ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D) é calculada como se segue:
100 vezes a fracção W/Z onde W é o número de nucleótidos registados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de C e D, e onde Z é o número total de nucleótidos de D. Será apreciado que quando o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não será igual à % de identidade de sequência de ácido nucleico de D para C. A menos que indicado de outro modo, todos os valores da % de identidade de sequência de ácido nucleico aqui utilizados são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior utilizando o programa de computador ALIGN-2.
Noutras concretizações, os polinucleótidos variantes de CD79b são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido CD79b e que são capazes de hibridar, de preferência sob condições rigorosas de hibridação e lavagem, com sequências nucleotidicas codificando um polipéptido CD79b inteiro, tal como aqui divulgado. Os polipéptidos CD79b 67 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ variantes podem ser os que são codificados por um polinucleótido variante de CD79b. 0 termo "região de codificação inteira" quando utilizado em referência a um ácido nucleico codificando um polipéptido CD79b refere-se à sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido CD79b inteiro do invento (que é frequentemente mostrada entre os codões de inicio e terminação, inclusive, deste, nas figuras anexas). 0 termo "região de codificação inteira" quando utilizado em referência a um ácido nucleico depositado em ATCC refere-se à porção do ADNc codificando o polipéptido CD79b que é inserida no vector depositado na ATCC (que é frequentemente mostrada entre os codões de início e terminação, inclusive, deste, nas figuras anexas (os codões de inicio e terminação estão a negrito e sublinhados nas figuras)). "Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos CD79b aqui divulgados, significa polipéptidos que foram identificados e separados e/ou recuperados a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações terapêuticas do polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos do terminal N ou de uma sequência de aminoácidos interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. 0 polipéptido isolado inclui polipéptido in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido CD79b não estará presente. Normalmente, no entanto, o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação.
Um ácido nucleico codificando um polipéptido CD79b "isolado" ou outro ácido nucleico codificando um polipéptido é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico 68 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ contaminante com a qual está vulgarmente associada na fonte natural do ácido nucleico codificando o polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido isolada é outra que não na forma ou configuração na qual se verifica na natureza. As moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido isoladas são portanto distintas da molécula de ácido nucleico específica codificando o polipéptido tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido isolada inclui as moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido contidas em células que normalmente expressam o polipéptido quando, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da das células naturais. 0 termo "sequências de controlo" refere-se às sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. 0 ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de secreção está operativamente ligado a ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participe na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar ficam contíguas, e, no caso de um líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A união é realizada através de ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, os adaptadores ou ligadores oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional. 69 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο "rigor" das reacções de hibridação é facilmente determinável por um vulgar perito na técnica, e é geralmente um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem, e da concentração salina. Em geral, sondas maiores requerem temperaturas mais elevadas para uma ligação correcta, enquanto sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação depende geralmente da capacidade do ADN desnaturado para se religar quando as cadeias complementares estão presentes num ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais elevado o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridável, mais elevada a temperatura relativa que pode ser utilizada. Em resultado, segue-se que temperaturas relativas mais elevadas tendem a tornar as condições de reacção mais rigorosas, enquanto temperaturas inferiores as diminuem. Para detalhes adicionais e explicação do rigor das reacções de hibridação, ver Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers, (1995). "Condições rigorosas" ou "condições de elevado rigor", tal como aqui definido, podem ser identificadas por as que: (1) empregam baixa força iónica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato de sódio a 0,1% a 50°C, (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C, ou (3) empregam hibridação de um dia para o outro numa solução que emprega formamida a 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0, 075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão sujeito a ultra-sons (50 pg/ml), SDS a 0,1%, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com uma lavagem de 10 minutos a 42°C em SSC 0,2χ (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguido por uma lavagem de alto rigor de 10 minutos consistindo em SSC 0,lx contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadas tal como descrito por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", New York: Cold 70 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de solução de lavagem e condições de hibridação (p.ex. temperatura, força iónica e % de SDS) menos rigorosas gue as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é a incubação de um dia para o outro a 37°C numa solução compreendendo: formamida a 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10%, e 20 mg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado fragmentado, seguido de lavagem dos filtros em SSC lx a cerca de 37-50°C. 0 perito na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iónica, etc., como necessário para acomodar factores tais como o comprimento da sonda e semelhantes. O termo "epitopo marcado" quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido CD79b ou anticorpo anti-CD79b fundido com um "polipéptido etiqueta". O polipéptido etiqueta tem resíduos suficientes para proporcionar um epitopo contra o qual pode ser produzido um anticorpo, no entanto é suficientemente curto para que não interfira com a actividade do polipéptido ao qual está fundido. O polipéptido etiqueta também é de preferência relativamente único de modo a que o anticorpo não reaja substancialmente de forma cruzada com outros epitopos. Os polipéptidos etiqueta adequados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e habitualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos). "Activo" ou "actividade" para os fins daqui refere-se à forma ou formas de um polipéptido CD79b que mantêm uma actividade biológica e/ou imunológica de CD79b nativo ou de ocorrência natural, onde a actividade "biológica" se refere a uma função biológica (inibidora ou estimuladora) causada por um CD79b nativo ou de ocorrência natural que não seja a capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico de um CD79b nativo ou de ocorrência natural e uma actividade "imunológica" refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico possuído por um CD79b nativo ou de ocorrência natural. 71 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο termo "antagonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que bloqueie, iniba, ou neutralize, parcialmente ou totalmente, uma actividade biológica de um polipéptido CD79b nativo. De um modo semelhante, o termo "agonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que imite uma actividade biológica de um polipéptido CD79b nativo. Moléculas agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpo, fragmentos ou variantes das sequências de aminoácidos de polipéptidos CD79b nativos, péptidos, oligonucleótidos anti-sentido, pequenas moléculas orgânicas, etc, agonistas ou antagonistas. Os métodos para identificação de agonistas ou antagonistas de um polipéptido CD79b, podem compreender o contacto de um polipéptido CD79b, com uma molécula agonista ou antagonista candidata e medição de uma alteração detectável numa ou mais actividades biológicas normalmente associadas ao polipéptido CD79b. "Purificado" significa que uma molécula está presente numa amostra a uma concentração de pelo menos 95% em peso, ou pelo menos 98% em peso da amostra na qual está contida.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que está separada de pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico com a qual está normalmente associada, por exemplo, no seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui ainda uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam normalmente a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou numa localização cromossómica que é diferente da sua localização cromossómica natural. 0 termo "vector", tal como é aqui utilizado, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de ADN circular de cadeia dupla na qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector fágico. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem ser ligados no genoma virai. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula 72 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vectores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e vectores de mamífero epissómicos). Outros vectores (p.ex., vectores de mamífero não-epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e serem assim replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são operativamente ligados. Tias vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vectores recombinantes") . Em geral, os vectores de expressão úteis em técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente fascículo, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados indistintamente uma vez que o plasmídeo é a forma mais vulgarmente utilizada de vector. "Polinucleótido", ou "ácido nucleico", como aqui indiferentemente utilizados, referem-se a polímeros de nucleótidos de qualquer comprimento, e incluem ADN e ARN. Os nucleótidos podem ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos ou bases modificados e/ou análogos seus, ou qualquer substrato que possa ser incorporado num polímero através de ADN-polimerase ou ARN-polimerase, ou através de uma reacção de síntese. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos seus. Se estiver presente, a modificação da estrutura nucleotídica pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotidicos. Um polinucleótido pode ainda ser modificado após a síntese, tal como através de conjugação com uma etiqueta. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "protecções", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotidicas tais como, por exemplo, aquelas com ligações sem carga (p.ex., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga (p.ex., fosforotioatos e fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (p.ex., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, poli-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (p.ex., acridina, psoraleno, etc.), aquelas contendo quelantes (p.ex., metais, metais radioactivos, boro, 73 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (p.ex., ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleótido(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxilo vulgarmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores padrão, ou activados para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais, ou pode ser conjugado com suportes sólidos ou semi-sólidos. 0 OH 5' e 3'-terminal pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou porções de grupos de protecção orgânicos com de 1 a 20 átomos de carbono. Outros hidroxilos podem também ser derivados para grupos protectores padrão. Os polinucleótidos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-0-alilo, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílicos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açucares piranose, açúcares furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleósidos abásicos, tais como ribósido de metilo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não se limitam a, concretizações em que o fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR.sub.2("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH.sub.2 ("formacetal"), nos quais cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (-0-), arilo, alcenilo, cicloalquilo, cicloalcenilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleótido necessitam de ser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polipéptidos aqui referidos, incluindo ARN e ADN. "Oligonucleótido," tal como aqui utilizado, refere-se geralmente a polinucleótidos curtos, geralmente de cadeia simples, geralmente sintéticos que são geralmente, mas não necessariamente, inferiores a cerca de 200 nucleótidos de comprimento. Os termos "oligonucleótido" e "polinucleótido" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleótidos é igualmente e totalmente aplicável a oligonucleótidos. 74 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é normalmente caracterizada por um crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas não se limitam a, cancros hematopoéticos ou cancros relacionados com o sangue, tais como linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfóides, mas também cancros do baço e cancros dos nódulos linfáticos e também carcinoma, blastoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de cancro incluem cancros associados a células B, incluindo por exemplo, linfomas de grau elevado, intermédio e baixo (incluindo linfomas de células B, tais como, por exemplo, linfoma de células B de tecido linfóide associado a mucosa e linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de células grandes difusas, linfoma folicular e linfoma de Hodgkin e linfomas de células T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crónica (CLL), tal como leucemia de células B (linfócitos B CD5+), leucemia mielóide, tal como leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, leucemia linfóide, tal como leucemia linfoblástica aguda (ALL) e mielodisplasia) e outros cancros hematológicos e/ou associados a células B ou células T. Estão também incluídos cancros de células hematopoéticas adicionais, incluindo leucócitos polimorfonucleares, tais como basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células assassinas naturais. Estão também incluídos distúrbios proliferativos cancerosos de células B seleccionados a partir dos seguintes: linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto. As origens dos cancros de células B incluem como se segue: o linfoma de células B da zona marginal tem origem em células B de memória na zona marginal, o linfoma folicular e o linfoma de células B grandes difusas têm origem em centrócitos na zona leve de centros germinais, a leucemia linfocítica crónica e a leucemia linfocítica pequena têm origem em células BI (CD5+), o linfoma de células do manto tem origem em células 75 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Β ingénuas na zona do manto e o linfoma de Burkitt tem origem em centroblastos na zona escura dos centros germinais. Tecidos que incluem células hematopoéticas aqui referidos como "tecidos de células hematopoéticas" incluem timo e medula-óssea e tecidos linfóides periféricos, tais como baço, nódulos linfáticos, tecidos linfóides associados a mucosa, tais como tecidos linfóides associados ao intestino, amígdalas, placas de Peyer e apêndice e tecidos linfóides associados a outras mucosas, por exemplo, os revestimentos dos brônquios. Outros exemplos particulares de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioma, cancro cervical, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiróide, carcinoma hepático, leucemia e outros distúrbios linfoproliferativos, e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço.
Uma "malignidade de células B" aqui inclui linfoma não-Hodgkin (NHL), incluindo NHL de grau baixo/folicular, NHL linfocítico de pequenas células (SL), NHL de grau intermédio/folicular, NHL difuso de grau intermédio, NHL imunoblástico de grau elevado, NHL linfoblástico de grau elevado, NHL de pequenas células não clivadas de grau elevado, NHL de doença volumosa, linfoma de células do manto, linfoma relacionado com SIDA, e Macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma não-Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin predominante de linfócitos (LPHD), linfoma linfocítico de pequenas células (SLL), leucemia linfocitica crónica (CLL), NHL indolente incluindo NHL indolente recidivo e NHL indolente refractário a rituximab; leucemia, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocitica crónica (CLL), Leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica; linfoma de células do manto; e outras malignidades hematológicas. Tais malignidades podem ser tratadas com anticorpos dirigidos contra marcadores da superfície de células B, tais como CD79b. Tais doenças são aqui contempladas para serem tratadas através da administração 76 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de um anticorpo dirigido contra um marcador da superfície de células B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado ("nu") ou um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como aqui divulgado. Tais doenças estão também aqui contempladas para serem tratadas através de terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco do invento em combinação com outro anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco, outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. No método de tratamento exemplar do invento, um anticorpo anti-CD79b do invento é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD20, imunoglobulina, ou fragmento de ligação a CD20 desta, conjuntamente ou sequencialmente. 0 anticorpo anti-CD20 pode ser um anticorpo nu ou um conjugado anticorpo-fármaco. Numa concretização da terapia de combinação, o anticorpo anti-CD79b é um anticorpo do presente invento e o anticorpo anti-CD20 é Rituxan® (rituximab). 0 termo "linfoma não-Hodgkin" ou "NHL", tal como aqui utilizado, refere-se a um cancro do sistema linfático diferente de linfornas de Hodgkin. Os linfornas de Hodgkin podem ser geralmente distinguidos de linfomas não-Hodgkin através da presença de células de Reed-Sternberg em linfomas de Hodgkin e a ausência das referidas células em linfomas não-Hodgkin. Exemplos de linfomas não-Hodgkin englobados pelo termo tal como aqui utilizado incluem qualquer um que seja identificado como tal por um perito na técnica (p.ex. , um oncologista ou patologista) de acordo com os esquemas de classificação conhecidos na técnica, tal como o esquema Revised European-American Lymphoma (REAL) tal como descrito em “Color Atlas of Clinicai Hematology" (3a edição), A. Victor Hoffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Ver, em particular, as listas na Fig. 11.57, 11.58 e 11.59. Exemplos mais específicos incluem, mas não se limitam a, NHL recidivo ou refractário, NHL de linha da frente de grau baixo, NHL de Estádio III/IV, NHL resistente a quimioterapia, leucemia e/ou linfoma linfoblástico de precursores de B, linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia linfocítica crónica de células B e/ou leucemia prolinfocítica e/ou linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma prolinfocitico de células B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmacítico, linfoma 77 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ linfoplasmacitico, linfoma de células B da zona marginal, linfoma esplénico da zona marginal, linfoma MALT - extranodal da zona marginal, linfoma nodal da zona marginal, leucemia de células pilosas, plasmacitoma e/ou mieloma de células do plasma, linfoma de grau baixo/folicular, NHL de grau intermédio/folicular, linfoma de células do manto, linfoma do centro do folículo (folicular), NHL difuso de grau intermédio, linfoma de células B grandes difusas, NHL agressivo (incluindo NHL de linha da frente agressivo e NHL recidivo agressivo), NHL recidivo após ou refractário a transplante autólogo de células estaminais, linfoma primário do mediastino de células B grandes, linfoma primário de efusão, NHL imunoblástico de grau elevado, NHL linfoblástico de grau elevado, NHL de pequenas células não clivadas de grau elevado, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocitica granular de precursores (periféricos) grandes, micose fungóide e/ou síndroma de Sezary, linfomas da pele (cutâneos), linfoma anaplásico de grandes células, linfoma angiocêntrico.
Um "distúrbio" é qualquer condição que beneficiaria de tratamento com uma substância/molécula ou método do invento. Isto inclui distúrbios crónicos ou agudos ou doenças incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a tratar aqui incluem condições cancerosas, tais como tumores malignos e benignos; malignidades não-leucemias e linfóides; distúrbios neuronais, gliais, astrocíticos, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofágicos, epiteliais, do estroma, blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, imunológicos e outros relacionados com angiogénese. Os distúrbios incluem ainda condições cancerosas, tais como distúrbios proliferativos de células B e/ou tumores de células B, p.ex., linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Os termos "distúrbio de proliferação celular" e "distúrbio proliferativo" referem-se aos distúrbios que estão 78 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ associados a algum grau de proliferação celular anormal. Numa concretização, o distúrbio celular proliferativo é cancro. "Tumor", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer crescimento e proliferação de células neoplásicas, maligno ou benigno, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Uma "doença auto-imune" aqui é uma doença ou distúrbio que surge de e dirige-se contra os próprios tecidos ou órgãos de um indivíduo ou um co-segregado ou manifestação deste ou condição resultante deste. Em muitos destes distúrbios auto-imunes e inflamatórios, podem existir vários marcadores clínicos e laboratoriais, incluindo, mas não se limitando a, hipergamaglobulinemia, níveis elevados de auto-anticorpos, depósitos de complexos antigénio-anticorpo nos tecidos, benefício de tratamentos com corticosteróides ou imunossupressores, e agregados de células linfóides em tecidos afectados. Sem estar limitado a qualquer teoria sobre doença auto-imune mediada por células B, crê-se que as células B demonstram um efeito patogénico em doenças auto-imunes humanas através de uma multiplicidade de vias mecanicistas, incluindo produção de auto-anticorpos, formação de complexos imunitários, activação de células dendríticas e células T, síntese de citocinas, libertação directa de quimocinas, e proporcionar um ninho para neolinfogénese ectópica. Cada uma destas vias pode participar em diferentes graus na patologia de doenças auto-imunes. "Doença auto-imune" pode ser uma doença específica de um órgão (i.e., a resposta imunitária é especificamente dirigida contra um sistema de órgãos tal como o sistema endócrino, o sistema hematopoético, a pele, o sistema cardiopulmonar, os sistemas gastrointestinal e hepático, o sistema renal, a tiróide, os ouvidos, o sistema neuromuscular, o sistema nervoso central, etc.) ou uma doença sistémica que pode afectar múltiplos sistemas de órgãos (por exemplo, lúpus sistémico eritematoso (SLE), artrite reumatóide, polimiosite, etc.). Doenças preferidas incluem distúrbios reumatológicos auto-imunes (tais como, por exemplo, artrite reumatóide, síndroma de Sjõgren, esclerodermia, lúpus tal como SLE e nefrite de lúpus, polimiosite/dermatomiosite, 79 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ crioglobulinemia, síndroma de anticorpos anti-fosfolípidos, e artrite psoriática), distúrbios gastrointestinais e hepáticos auto-imunes (tais como, por exemplo, doenças inflamatórias dos intestinos (p.ex., colite ulcerosa e doença de Crohn) , gastrite auto-imune e anemia perniciosa, hepatite auto-imune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (tal como, por exemplo, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener, e poliangiite microscópica), distúrbios neurológicos auto-imunes (tais como, por exemplo, esclerose múltipla, síndroma de opsoclonia-mioclonia, miastenia grave, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e polineuropatias auto-imunes), distúrbios renais (tais como, por exemplo, glomerulonefrite, sindroma de Goodpasture, e doença de Berger), distúrbios dermatológicos auto-imunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, erupção da pele, pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso, e lúpus cutâneo eritematoso), distúrbios hematológicos (tais como, por exemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura pós-transfusão e anemia hemolítica auto-imune), aterosclerose, uveíte, doenças auditivas auto-imunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda de audição), doença de Behçet, síndroma de Raynaud, transplante de órgãos, e distúrbios endócrinos auto-imunes (tais como, por exemplo, doenças auto-imunes relacionadas com diabetes, tais como diabetes mellitus insulinodependente (IDDM), doença de Addison, e doença da tiróide auto-imune (p.ex., doença de Graves e tiroidite)). Tais doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatóide, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndroma de Sjógren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroidite e glomerulonefrite.
Exemplos específicos de outras doenças auto-imunes, tal como agui definido, gue nalguns casos, englobam as listadas acima, incluem, mas não se limitam a, artrite (aguda e crónica, artrite reumatóide incluindo artrite reumatóide de surgimento juvenil e estádios tais como sinovite reumatóide, gota ou artrite gotosa, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crónica, artrite degenerativa, artrite induzida por colagénio de tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, 80 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral, osteoartrite, artrite crónica progressiva, artrite deformante, poliartrite primária crónica, artrite reactiva, artrite da menopausa, artrite de depleção de estrogénio, e espondilite anguilosante/espondilite reumatóide), doença linfoproliferativa auto-imune, doenças inflamatórias hiperproliferativas da pele, psoriase, tal como psoriase em placas, psoriase gutata, psoriase pustular e psoriase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tais como febre do feno e sindroma de Job, dermatite incluindo dermatite de contacto, dermatite de contacto crónica, dermatite esfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contacto alérgica, erupções da pele, dermatite herpetiforme, dermatite numular, dermatite seborreica, dermatite não especifica, dermatite de contacto irritante primária, e dermatite atópica, sindroma de hiper-IgM ligada ao X, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas, urticária tal como urticária alérgica crónica e urticária idiopática crónica, incluindo urticária crónica auto-imune, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo esclerodermia sistémica), esclerose, tal como esclerose sistémica, esclerose múltipla (MS), tal como MS espino-óptica, MS primária progressiva (PPMS), e MS remitente recidiva (RRMS), esclerose sistémica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite óptica (NMO), doença inflamatória do intestino (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas pelo sistema auto-imune, inflamação gastrointestinal, colite tal como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante e colite transmural, e doença inflamatória do intestino auto-imune) , inflamação do intestino, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, síndroma de dificuldade respiratória, incluindo síndroma de dificuldade respiratória do adulto ou aguda (ARDS), meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, coroidite, uma doença hematológica auto-imune, doença de enxerto-versus-hospedeiro, angioedema, tal como angioedema hereditário, lesão nervosa craniana tal como em meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurido no escroto, insuficiência ovárica prematura auto-imune, perda súbita de audição devido a uma 81 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ condição auto-imune, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite, tal como encefalite de Rasmussen e encefalite limbica e/ou do tronco cerebral, uveite, tal como uveite anterior, uveite anterior aguda, uveite granulomatosa, uveite não granulomatosa, uveite facoantigénica, uveite posterior, ou uveite auto-imune, glomerulonefrite (GN) com e sem sindroma nefrótica tal como glomerulonefrite crónica ou aguda, tal como GN primária, GN mediada pelo sistema imunitário, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN membrano ou membranosa proliferativa (MPGN), incluindo de Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva (RPGN), nefrite proliferativa, insuficiência endócrina auto-imune poliglandular, balanite incluindo balanite plasmocitária circunscrita, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrómico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, líquen nítido, líquen escleroso e atrófico, líquen simples crónico, líquen espinuloso, líquen plano, ictiose lamelar, hiperqueratose epidermolítica, queratose pré-maligna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, alergias alimentares, alergias a medicamentos, alergias a insectos, distúrbios alérgicos raros, tais como mastocitose, reacção alérgica, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico, e eczema vesicular palmoplantar, asma, tal como asma brônquica, asma bronquial, e asma auto-imune, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, reacções imunitárias contra antigénios externos, tais como grupos sanguíneos A-B-0 fetais durante a gravidez, doença pulmonar inflamatória crónica, miocardite auto-imune, deficiência de adesão leucocitária, lúpus, incluindo nefrite de lúpus, cerebrite de lúpus, lúpus pediátrico, lúpus não-renal, lúpus extra-renal, lúpus discóide e lúpus discóide eritematoso, alopecia de lúpus, SLE, tal como SLE cutâneo ou SLE cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE), e lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de surgimento juvenil (de Tipo I), incluindo IDDM pediátrico, diabetes mellitus de surgimento na idade adulta (diabetes de Tipo II), diabetes auto-imune, diabetes insípido idiopático, retinopatia diabética, nefropatia diabética, colite diabética, distúrbio diabético das grandes artérias, respostas imunitárias associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e 82 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ linfócitos Τ, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite dos grandes vasos tal como polimialgia reumática e arterite de células gigantes (de Takayasu), vasculite dos vasos médios tal como a doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa, imunovasculite, vasculite do SNC, vasculite cutânea, vasculite de hipersensibilidade, vasculite necrosante, tal como vasculite necrosante fibrinóide e vasculite necrosante sistémica, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada a ANCA tal como Síndroma de Churg-Strauss (CSS), granulomatose de Wegener e poliangeíte microscópica, arterite temporal, anemia aplásica, anemia aplásica auto-imune, anemia positiva para Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolitica imunitária, incluindo anemia hemolítica auto-imune (AIHA), anemia perniciosa, doença de Addison, anemia pura de glóbulos vermelhos ou aplasia (PRCA), deficiência do Factor VIII, hemofilia A, neutropenia(s) auto-imune (s), citopenias tais como pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndroma de lesão de múltiplos órgãos tal como as secundária a septicemia, traumatismo ou hemorragia, doenças mediadas pelo complexo antigénio-anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, síndroma de anticorpo anti-fosfolípidos, motoneurite, neurite alérgica, doença/síndroma de Behçet, síndroma de Castleman, síndroma de Goodpasture, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjõgren, síndroma de Stevens-Johnson, penfigóide ou pênfigo, tal como penfigóide bolhoso, penfigóide cicatricial (membrana mucosa) , penfigóide da pele, pênfigo vulgar, pênfigo paraneoplásico, pênfigo foliáceo, penfigóide de pênfigo da membrana mucosa e pênfigo eritematoso, epidermólise bolhosa adquirida, inflamação ocular, de preferência inflamação ocular alérgica, tal como conjuntivite alérgica, doenças bolhosa de IgA linear, inflamação da conjuntiva induzida por auto-imunidade, poliendocrinopatias auto-imunes, doença ou síndroma de Reiter, lesão térmica devido a uma condição auto-imune, pré-eclâmpsia, um distúrbio do complexo imunitário tal como nefrite complexa imunitária, nefrite mediada por anticorpos, distúrbios neuro-inflamatórios, polineuropatias, neuropatia crónica tal como polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, 83 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ trombocitopenia (tal como desenvolvida por pacientes com enfarte do miocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura pós-transfusão (PTP), trombocitopenia induzida por heparina e trombocitopenia auto-imune ou mediada pelo sistema imunitário incluindo, por exemplo, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), incluindo ITP crónica ou aguda, esclerite tal como cerato-esclerite idiopática, episclerite, doença auto-imune do testículo e ovário, incluindo orquite e ooforite auto-imune, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endócrinas auto-imunes, incluindo tiroidite tal como tiroidite auto-imune, doença de Hashimoto, tiroidite crónica (tiroidite de Hashimoto), ou tiroidite subaguda, doença da tiróide auto-imune, hipotiroidismo idiopático, doença de Grave, doença dos olhos de Grave (oftalmopatia ou oftalmopatia associada à tiróide), síndromas poliglandulares tais como síndromas poliglandulares auto-imunes, por exemplo, síndromas paraneoplásicos do tipo I (ou síndromas de endocrinopatia poliglandulares), síndromas paraneoplásicos, incluindo síndromas paraneoplásicos neurológicos tais como síndroma miasténico de Lambert-Eaton ou síndroma de Eaton-Lambert, síndroma de homem hirto ou de pessoa hirta, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave associada a timoma, degenerescência cerebelar, neuromiotonia, opsoclonia ou síndroma de opsoclonia-mioclonia (OMS), e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndroma de Sheehan, hepatite auto-imune, hepatite crónica, hepatite lupóide, hepatite de células gigantes, hepatite activa crónica ou hepatite activa crónica auto-imune, pneumonite tal como pneumonite intersticial linfóide (LIP), bronquiolite obliterante (não transplante) vs NSIP, síndroma de Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, dermatose febril neutrofílica aguda, dermatose pustular subcorneana, dermatose acantolítica transiente, cirrose tal como cirrose biliar primária e pneumonocirrose, síndroma de enteropatia auto-imune, doença Celíaca, psilose celíaca (enteropatia de glúten), psilose refractária, psilose idiopática, crioglobulinemia tal como crioglobulinemia mista, esclerose lateral amilotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig), doença arterial coronária, doença auto-imune do ouvido tal 84 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ como a doença auto-imune do ouvido interno (AIED), perda auditiva auto-imune, policondrite tal como policondrite refractária ou recidiva ou recorrente, proteinose alveolar pulmonar, queratite tal como síndroma de Cogan/queratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndroma de Sweet, rosácea auto-imune, dor associada a zoster, amiloidose, uma linfocitose não-cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose de células B monoclonais (p.ex., gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica, síndroma paraneoplásica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose focal ou segmentar ou focal segmentar (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológico auto-imune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndroma de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes tais como doenças desmielinizantes auto-imunes e polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndroma de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndroma CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade masculina e feminina auto-imune, p.ex., devido a anticorpos anti-espermatozóides, doença mista do tecido conjuntivo, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de agricultor, eritema multiforme, síndroma pós-cardiotomia, síndroma de Cushing, síndroma de pulmão de criador de pássaros, angeíte granulomatosa alérgica, angeíte linfocítica benigna, síndroma de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reacção a transfusão, lepra, malária, doenças parasitárias tais como leishmaniose, tripanossomíase, esquistossomiase, ascaridíase, aspergilose, síndroma de Sampter, síndroma de Caplan, dengue, endocardite, fibrose do endomiocárdio, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, mediastinite fibrosante, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevado e diutino, eritroblastose fetal, faciíte eosinófila, síndroma de Shulman, síndroma de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crónica, ciclite heterocrónica, iridociclite (aguda ou crónica), ou ciclite de 85 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Fuch, púrpura de Henoch-Schõnlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV), SCID, síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA), infecção por ecovírus, sepsia (síndroma de resposta inflamatória sistémica (SIRS)), endotoxemia, pancreatite, tiroxicose, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromas pós-vacinação, infecção congénita de rubéola, infecção por vírus de Epstein-Barr, sarampo, síndroma de Evan, insuficiência das gónadas auto-imune, coreia de Sydenham, nefrite pós-estreptocóccica, tromboangeíte obliterante, tirotoxicose, tabes dorsalis, corioidite, polimialgia de células gigantes, pneumonite de hipersensibilidade crónica, conjuntivite tal como catarro vernal, queratoconjuntivite seca, e queratoconjuntivite epidémica, síndroma nefrítica idiopática, nefropatia de alteração mínima, lesão familiar e de reperfusão por isquemia benigna, reperfusão de órgãos transplantados, auto-imunidade da retina, inflamação das articulações, bronquite, doença obstrutiva crónica das vias respiratórias/pulmonar, silicose, aftas, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos (insuficiência vascular cerebral), tal como encefalopatia arteriosclerótica e retinopatia arteriosclerótica, aspermiogenese, hemólise auto-imune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndroma de fadiga crónica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda auditiva neurossensorial, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática (oftalmite simpática), oftalmite neonatal, neurite óptica, orquite granulomatosa, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tiroidite de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma não maligno, timite linfofolicular, vitiligo, síndroma de choque tóxico, intoxicação alimentar, condições envolvendo infiltração de células T, deficiência na aderência de leucócitos, respostas imunitárias associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, síndroma de lesão de múltiplos órgãos, doenças mediadas pelo complexo antigénio-anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, poliendocrinopatias auto-imunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica 86 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ auto-imune, doenças reumáticas, doença mista do tecido conjuntivo, síndroma nefrótica, insulite, insuficiência poliendócrina, síndromas poliglandulares auto-imunes, incluindo síndroma poliglandular de tipo 1, hipoparatiroidismo idiopático de surgimento no adulto (AOIH), cardiomiopatia tal como cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndroma nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crónica, sinusite etmóide, frontal, maxilar, ou esfenóide, sinusite alérgica, um distúrbio relacionado com eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia de infiltração pulmonar, síndroma de eosinofilia-mialgia, síndroma de Loffler, pneumonia eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumónica, aspergiloma, ou granulomas contendo eosinófilos, anafilaxia, espondiloartropatias, espondiloartritide seronegativa, doença poliendócrina auto-imune, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crónica, síndroma de Bruton, hipogamaglobulinemia transiente da infância, síndroma de Wiskott-Aldrich, síndroma de ataxia-telangiectasia, angiectasia, distúrbios auto-imunes associados a doença de colagénio, reumatismo tal como artrorreumatismo crónico, linfadenite, redução da resposta na pressão arterial, disfunção vascular, lesão dos tecidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral e doença de vascularização acompanhante, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrite, lesão de reperfusão, distúrbio isquémico de reperfusão, lesão de reperfusão de tecidos do miocárdio ou outros, traqueobronquite linfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, insuficiência de múltiplos órgãos, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares e orbitais, síndromas associadas a transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocinas, narcolepsia, inflamação grave aguda, inflamação crónica intratável, pielite, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, vulvite, e endometriose. Tais doenças são aqui contempladas para serem tratadas através da administração de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de células B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado ("nu") ou de um 87 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como aqui divulgado. Tais doenças estão também aqui contempladas para serem tratadas através de terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco do invento em combinação com outro anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco, outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. "Tratar" ou "tratamento" ou "alivio" refere-se a tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objectivo é prevenir ou retardar (diminuir) a condição ou distúrbio patológico alvo. Aqueles a necessitar de tratamento incluem os que já têm o distúrbio bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio deve ser prevenido. Um sujeito ou mamífero é "tratado" com êxito a um cancro expressando o polipéptido CD79b se, depois de receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo anti-CD79b acordo com os métodos do presente invento, o paciente mostrar redução ou ausência observável e/ou mensurável de um ou mais dos seguintes: redução no número de células de cancro ou ausência das células de cancro, redução no tamanho do tumor, inibição (i.e., atraso em certa medida, e de preferência paragem) de infiltração de células de cancro em órgãos periféricos, incluindo a disseminação de cancro para tecido mole e osso; inibição (i.e., atraso em certa medida, e de preferência paragem) da metástase do tumor; inibição, em certa medida, do crescimento do tumor, e/ou alívio em certa medida, de um ou mais dos sintomas associados ao cancro específico; redução da morbilidade e mortalidade e melhoria da qualidade de questões da vida. Na medida em que o anticorpo anti-CD79b pode impedir o crescimento e/ou matar as células de cancro existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. A redução destes sinais ou sintomas pode também ser sentida pelo paciente.
Os parâmetros de cima para avaliar o sucesso do tratamento e a melhoria da doença são facilmente mensuráveis através de procedimentos de rotina familiares a um médico. Para terapia de cancro, a eficácia pode ser medida, por exemplo, através da avaliação do tempo até à progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR). A metástase pode ser determinada através de testes dos estádios 88 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ e através de varrimento dos ossos e testes do nível de cálcio e outras enzimas para determinar a disseminação para os ossos. Varrimentos de TC podem ser também feitos para procurar disseminação para os nódulos pélvicos e linfáticos na área. Raios-X do peito e medição dos níveis de enzimas hepáticas através de métodos conhecidos são utilizadas para procurar metástase para os pulmões e o fígado, respectivamente. Outros métodos de rotina para monitorização da doença incluem a ultra-sonografia transrectal (TRUS) e biopsia por agulha transrectal (TRNB).
Para o cancro da bexiga, que é um cancro mais localizado, métodos para determinar o progresso da doença incluem avaliação citológica urinária através de cistoscopia, monitorizando a presença de sangue na urina, visualização do tracto urinário através de sonografia ou um pielograma intravenoso, tomografia computadorizada (CT) e imagiologia de ressonância magnética (MRI). A presença de metástases distantes pode ser avaliada através de CT do abdómen, raios-X do peito, ou imagiologia de radionuclídeos do esqueleto.
Administração "crónica" refere-se à administração do agente ou agentes num modo contínuo, em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (actividade) durante um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é um tratamento que não é feito consecutivamente, sem interrupção, mas é de natureza cíclica.
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de quinta (tais como vacas), animais de desporto, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), primatas, ratinhos e ratos. Em certas concretizações, um mamífero é um humano. "Mamífero", para fins de tratamento de, ou alívio dos sintomas de um cancro refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, de desporto ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. De preferência, o mamífero é um humano. 89 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva por qualquer ordem. "Transportadores" tal como aqui utilizado incluem transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero a expor ao mesmo nas dosagens e concentrações empregues. Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose, ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sal tais como sódio, e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido" entenda-se uma matriz não aquosa à qual um anticorpo do presente invento pode aderir ou ligar-se. Exemplos de fases sólidas aqui englobadas incluem as formadas parcialmente ou inteiramente por vidro (p.ex., vidro de poro controlado), polissacáridos (p.ex., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; noutras, é uma coluna de purificação (p.ex., uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo inclui também uma fase sólida descontinua de partículas discretas, tal como as descritas na Patente U.S. No. 4275149.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para distribuição de um fármaco (tal como um anticorpo de CD79b) a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão 90 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ normalmente dispostos numa formaçao de bicamada, semelhante à disposição lipídica das membranas biológicas.
Uma molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" é aqui definida como tendo um peso molecular inferior a cerca de 500 Daltons.
Um "indivíduo", "sujeito", ou "paciente" é um vertebrado. Em certas concretizações, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de quinta (tais como vacas), animais de desporto, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), primatas, ratinhos e ratos. Em certas concretizações, um mamífero é um humano. 0 termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está numa forma tal que permite que a actividade biológica do ingrediente activo seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada. Tal formulação pode ser estéril.
Uma formulação "estéril" é asséptica ou livre de quaisquer microorganismos vivos e seus esporos.
Uma "quantidade eficaz" de um anticorpo tal como aqui divulgado é uma quantidade suficiente para realizar um objectivo especificamente indicado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e de uma forma rotineira, em relação ao objectivo indicado. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou outro fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio num sujeito ou mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de cancro; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i.e., atrasar em certa medida e de preferência parar) a infiltração de células de cancro em órgãos periféricos; inibir (i.e. atrasar em certa medida e de preferência parar) a metástase tumoral; inibir, em certa medida, o crescimento tumoral, e/ou aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas associados ao cancro. Veja-se aqui a definição de "tratamento". Na medida em que o fármaco pode 91 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ impedir ο crescimento e/ou matar células de cancro existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e nos períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profiláctica é utilizada em sujeitos antes ou numa fase mais precoce da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um anticorpo anti-CD79b é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente de um tumor, p.ex., célula de cancro, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um anticorpo anti-CD79b para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.
Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente de um tumor, p.ex., célula de cancro, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.
Uma "célula expressando CD79b" é uma célula que expressa um polipéptido CD79b endógeno ou transfectado na superfície da célula ou numa forma segregada. Um "cancro expressando CD79b" é um cancro compreendendo células que têm um polipéptido CD79b presente na superfície da célula ou que produzem e segregam um polipéptido CD79b. Um "cancro expressando CD79b" produz opcionalmente níveis suficientes de polipéptido CD79b na superfície das suas células, tal que um anticorpo anti-CD79b pode ligar-se às mesmas e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro. Noutra concretização, um "cancro expressando CD79b" produz opcionalmente e segrega níveis suficientes de polipéptido CD79b, tal que um antagonista do anticorpo anti-CD79b se pode ligar a estas e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro. Em relação a este último, o antagonista pode ser um oligonucleótido anti-sentido que reduz, inibe ou impede a produção e secreção do polipéptido CD79b segregado 92 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ pelas células tumorais. Um cancro que "sobre-expressa" um polipéptido CD79b é um que tem níveis significativamente mais elevados de polipéptido CD79b na superfície das células deste, ou produz e segrega, em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal sobre-expressão pode ser causada por amplificação génica ou através do aumento da transcrição ou tradução. A sobre-expressão do polipéptido CD79b pode ser determinada num ensaio de detecção ou prognóstico através da avaliação dos níveis aumentados da proteína CD79b presente na superfície de uma célula, ou segregada pela célula (p.ex., através de um ensaio de imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-CD79b preparados contra um polipéptido CD79b isolado que podem ser preparados utilizando tecnologia de ADN recombinante a partir de um ácido nucleico isolado codificando o polipéptido CD79b; análise FACS, etc.). Alternativamente, ou adicionalmente, podem-se medir os níveis de ácido nucleico ou ARNm codificando o polipéptido CD79b na célula, p.ex., através de hibridação in situ fluorescente utilizando uma sonda baseada num ácido nucleico correspondente a um ácido nucleico codificando CD79b ou o complemento deste, (FISH; ver W098/45479 publicado em Outubro de 1998), Southern blotting, Northern blotting, ou técnicas de reacção em cadeia da polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobre-expressão do polipéptido CD79b medindo o antigénio derramado num fluido biológico tal como soro, p.ex., utilizando ensaios baseados em anticorpos (ver também, p.ex., Patente U.S. No. 4933294 concedida a 12 de Junho de 1990; WO91/05264 publicada a 18 de Abril de 1991; Patente U.S. No. 5401638 concedida a 28 de Março de 1995; e Sias et ai., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Além dos ensaios acima referidos, vários ensaios in vivo estão disponíveis para os peritos. Por exemplo, pode-se expor as células dentro do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, p.ex. um isótopo radioactivo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, p.ex., através de varrimento externo da radioactividade ou através da análise de uma biopsia retirada de um paciente previamente exposto ao anticorpo.
Tal como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a 93 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outra que não a do local de reconhecimento e ligação ao antigénio de um anticorpo (ou seja, é "heteróloga"), com uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado directa ou indirectamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado". 0 marcador pode ser detectável por si só (p.ex., marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que seja detectável. 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui utilizado refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição de células. 0 termo pretende incluir isótopos radioactivos (p.ex., At211, I131, I125, Y90,
Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapêuticos, p.ex., metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos destas tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os vários agentes antitumorais ou anticancro divulgados abaixo. Um agente tumoricida causa a destruição de células tumorais. 94 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Uma "toxina" é qualquer substância capaz de ter um efeito prejudicial no crescimento ou na proliferação de uma célula.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro, independentemente do mecanismo de acção. Classes de agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam a: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetais venenosos do fuso, antibióticos citotóxicos/ antitumorais, inibidores da topoisomerase, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores de cinase. Agentes quimioterapêuticos incluem compostos utilizados em "terapia dirigida" e quimioterapia convencional. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem: erlotinib (TARCEVA®),
Genentech/OSI Pharm), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, CAS No. 51-21-8), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina,dicloroplatina(II), CAS No. 15663-27-1), carboplatina (CAS No. 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), a temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, CAS No. 85622-93-1, TEM0DAR®, TEM0DAL®, Schering-Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-l-enil)fenoxi]-N,N- dimetil-etanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®, e doxorrubicina (ADRIAMICINA®) , Akti-1/2, HPPD, e rapamicina.
Mais exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPhamma, AstraZeneca), SF-1126 (inibidor de PI3K, Semafore
Pharmaceuticals), BEZ-235 (inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorin (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafamib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), getitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (livre de Cremophor), formulações de 95 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ nanopartículas de albumina modificada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®) , Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®) ; sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altrelamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, clorambucil, ifosfamida, mecloretamina, prednimustina, nitrosoureias, fotemustina, antibióticos, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona) ; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de azoto, tais como clornafazina, clorofosfamida, estramustina, mecloretamina, cloridrato de óxido de melfalano, novembiquina, fenesterina, trofosfamida, mostarda de uracilo,; tais como carmustina, clorozotocina, lomustina, nimustina e ranimnustina; tais como os antibióticos enediina (p.ex., caliqueamicina, caliqueamicina gama II, caliqueamicina omega II (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos cromoproteicos de enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina e autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, ubenimex carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti- 96 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ metabolitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, β-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios, tais como calusterona, propionato de dromostalona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; glicosideo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina, metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina (NAVELBINE®) ; Novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODAL®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Também estão incluídos na definição de "agente quimioterapêutico": (i) agentes anti-hormonais que actuam regulando ou inibindo a acção hormonal em tumores, tais como anti-estrogénios e moduladores selectivos de receptores de estrogénio (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno) , raloxifeno, 97 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase, que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas supra-renais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestania, fadrozole, RIVISOR® (vorozole), FEMARA® (letrozole; Novartis), e ARIMIDEX® (anastrozole; AstraZeneca); (iii) anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo do nucleósido citosina 1,3-dioxolano), (iv) inibidores da proteina cinase tais como inibidores de MEK (WO 2007/044515), (v) inibidores da cinase de lipidos; (vi) oligonucleótidos anti-sentido, particularmente os que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas em proliferação celular aberrante, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tal como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas, tais como inibidores da expressão de VEGF (p.ex., ANGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de terapia génica, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores da topoisomerase 1 tais como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes anti-angiogénicos tais como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima.
Também estão incluídos na definição de "agente quimioterapêutico" anticorpos terapêuticos, tais como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), e o conjugado anticorpo-fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
Um "agente inibidor do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro expressando CD79b, in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células expressando CD79b 98 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes gue blogueiem a progressão do ciclo celular (num local diferente da fase S), tais como agentes gue induzam paragem em G1 e paragem na fase M. Blogueadores clássicos da fase M incluem os vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores da topoisomerase II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido e bleomicina. Os agentes que param G1 também se espalham para paragem da fase S, por exemplo, agentes alquilantes do ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, e ara-C. Mais informação pode ser encontrada em "The Molecular Basis of Câncer", Mendelsohn e Israel, eds., Capitulo I, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticancro, ambos derivados da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a agregação de microtúbulos a partir dos dimeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos impedindo a despolimerização, o que resulta na inibição de mitose nas células. "Doxorrubicina" é um antibiótico antraciclina. 0 nome químico completo da doxorrubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetra-hidro-6,8,ll-tri-hidroxi-8-(hidroxiacetil)-l-metoxi-5,12-naftacenodiona. O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que actuam noutra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Entre as citocinas estão incluídas a hormona do crescimento, tal como a hormona de crescimento humano, hormona do crescimento humana N-metionilo, e hormona de crescimento bovina; hormona da paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas glicoproteicas tais como hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático, factor de crescimento de fibroblastos; 99 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ prolactina; lactogénio placentário; factor de necrose tumoral-α e β; substância inibidora da muleriana; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoetina (TPO); factores de crescimento dos nervos, tais como NGF-β; factor de crescimento das plaguetas, factores de crescimento transformantes (TGF), tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento semelhante à insulina-I e II; eritropoetina (EPO); factores osteoindutores; interferões, tais como interferão-a, β, e γ; factores estimuladores de colónias (CSF) , tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL), tais como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral, tal como TNF-α ou TNF-β, e outros factores polipeptidicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui utilizado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos das citocinas de sequência nativa. 0 termo "bula" é utilizado para se referir às instruções normalmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos sobre a utilização de tais produtos terapêuticos. 0 termo "metabolito intracelular" refere-se a um composto resultante de um processo metabólico ou reacção dentro de uma célula num conjugado anticorpo-fármaco (ADC). 0 processo metabólico ou de reacção pode ser um processo enzimático, tal como clivagem proteolítica de um ligador peptídico do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tal como uma hidrazona, éster ou amida. Metabolitos intracelulares incluem, mas não se limitam a, anticorpos e fármaco livre que foram sujeitos a clivagem intracelular após entrada, difusão, tomada ou transporte para uma célula.
Os termos "clivado intracelularmente" e "clivagem intracelular" referem-se a um processo metabólico ou reacção dentro de uma célula num conjugado anticorpo-fármaco (ADC), em que a ligação covalente, i.e. o ligador, entre a porção fármaco (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando no 100 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ fármaco livre dissociado do anticorpo no interior da célula. As porções clivadas do ADC são, portanto, metabolitos intracelulares. O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistémica (i.e., níveis sanguíneos/plasmáticos) de uma dada quantidade de fármaco administrada a um paciente. A biodisponibilidade é um termo absoluto que indica a medição tanto do tempo (velocidade) como da quantidade total (extensão) de fármaco que atinge a circulação geral a partir de uma forma de dosagem administrada. O termo "actividade citotóxica" refere-se a um efeito de morte celular, citostático ou inibidor do crescimento de um ADC ou de um metabolito intracelular de um ADC. A actividade citotóxica pode ser expressa como o valor de IC50, que é a concentração (molar ou massa) por unidade de volume à qual metade das células sobrevive. O termo "alquilo" tal como aqui utilizado refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada saturado de um a doze átomos de carbono (C1-C12), em que o radical alquilo pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes descritos abaixo. Noutra concretização, um radical alquilo tem de um a oito átomos de carbono (Ci-C8) , ou um a seis átomos de carbono (Ci-C6) . Exemplos de grupos alquilo incluem, mas não se limitam a, metilo (Me, -CH3) , etilo (Et, -CH2CH3) , 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3) 2) , 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3) CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C (CH3) 3) , 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo (-CH (CH3) CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH (CH2CH3) 2), 2-metil-2-butilo (-C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo (-CH (CH3) CH (CH3) 2) , 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2) , 2-metil-l-butilo (-CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexilo (-CH (CH3 ) CH2CH2CH2CH3) , 3- hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentilo (-C (CH3) CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo (-CH (CH3) CH (CH3) CH2CH3) , 4- metil-2-pentilo (-CH(CH3) CH2CH(CH3) 2) , 3-metil-3-pentilo (-C (CH3) (CH3CH3) 2) , 2-metil-3-pentilo (-CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 101 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3) 2CH(CH3) 2) r 3,3-dimetil-2-butilo (—CH(CH3) C (CH3) 3, 1-heptilo, 1-octilo, e semelhantes. O termo "alcenilo" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um local de insaturação, i.e., uma dupla ligação carbono-carbono sp2 , em que o radical alcenilo pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes aqui descritos, e inclui radicais possuindo orientações "cis" e "trans", ou alternativamente, orientações "E" e "Z". Exemplos incluem, mas não se limitam a, etilenilo ou vinilo (-CH=CH2) , alilo (-CH2CH=CH2) , e semelhantes. O termo "alcinilo" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um local de insaturação, i.e., uma ligação tripla carbono-carbono sp, em que o radical alcinilo pode ser opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes aqui descritos. Exemplos incluem, mas não se limitam a, etinilo (-C=CH), propinilo (propargilo, -CH2C=CH), e semelhantes.
Os termos "carbociclo", "carbociclilo", "anel carbocíclico" e "cicloalquilo" referem-se a um anel não aromático monovalente, saturado ou parcialmente insaturado possuindo de 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como anel bicíclico. Carbociclos biciclicos possuindo 7 a 12 átomos podem ser dispostos, por exemplo, como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5.6] ou [6,6], e carbociclos biciclicos possuindo 9 ou 10 átomos de anel podem ser arranjados como um sistema biciclo [5.6] ou [6,6], ou como sistemas de pontes tais como biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[2.2.2]octano e biciclo[3.2.2]-nonano. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem, mas não se limitam a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclo-hexilo, 1-ciclo-hex-l-enilo, l-ciclo-hex-2-enilo, l-ciclo-hex-3-enilo, ciclo-hexadienilo, ciclo-heptilo, ciclo-octilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo, e semelhantes. 102 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ "Arilo" significa um radical hidrocarboneto aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivado através da remoção de um átomo de hidrogénio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático-mãe. Alguns grupos arilo estão representados nas estruturas exemplares como "Ar". Arilo inclui radicais biciclicos compreendendo um anel aromático fundido com um anel saturado, parcialmente insaturado ou um anel carbociclico aromático. Grupos arilo típicos incluem, mas não se limitam a, radicais derivados de benzeno (fenilo), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenilo, indenilo, indanilo, 1,2-di-hidronaftaleno, 1,2,3,4-tetra-hidronaftilo, e semelhantes. Os grupos arilo são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes aqui descritos.
Os termos "heterociclo", "heterciclilo" e "anel heterocíclico" são aqui utilizados alternadamente e referem-se a um radical carbociclico saturado ou parcialmente insaturado (i.e., tendo uma ou mais ligações duplas e/ou triplas dentro do anel) de 3 a 20 átomos de anel no qual pelo menos um átomo do anel é um heteroátomo seleccionado a partir de azoto, oxigénio, fósforo e enxofre, os restantes átomos do anel sendo C, em que um ou mais átomos do anel são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes descritos abaixo. Um heterociclo pode ser um monociclo possuindo 3 a 7 membros de anel (2 a 6 átomos de carbono ela 4 heteroátomos seleccionados a partir de N, 0, P e S) ou um biciclo possuindo 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 6 heteroátomos seleccionados a partir de N, 0, P e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6]. Os heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principies of Modem Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente os Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 até ao presente), em particular os Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566. "Heterociclilo" inclui também radicais em que os radicais heterocíclicos são fundidos com um anel saturado, parcialmente insaturado ou um anel carbociclico ou heterocíclico aromático. Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas não se limitam a, pirrolidinilo, tetra-hidrofuranilo di-hidrofuranilo homopiperazinilo, tetra- 103 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ hidrotienilo, tetra-hidropiranilo, di-hidropiranilo, tetra-hidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, di-hidropiranilo, di-hidrotienilo, di-hidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo-[ 3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo, azabiciclo-[2.2.2]hexanilo, 3H-indolilquinolizinilo e ureias de N-piridilo. Porções espiro estão também incluídas dentro do âmbito desta definição. Exemplos de um grupo heterociclico em que 2 átomos de carbono do anel são substituídos com porções oxo (=0) são pirimidinonilo e 1,1-dioxo-tiomorfolinilo. Os grupos heterociclo são aqui opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes aqui descritos. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um radical aromático monovalente de anéis de 5, 6 ou 7 membros, e inclui sistemas de anéis fundidos (pelo menos um dos quais é aromático) de 5-20 átomos contendo um ou mais heteroátomos seleccionados independentemente a partir de azoto, oxigénio e enxofre. Exemplos de grupos heteroarilo são piridinilo (incluindo, por exemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (incluindo, por exemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, benzimidazolilo, benzofuranilo, cinolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, e furopiridinilo. Os grupos heteroarilo são opcionalmente substituídos independentemente com um ou mais substituintes aqui descritos.
Os grupos heterociclo ou heteroarilo podem ser unidos em carbono (ligados por carbono), ou azoto (ligados por azoto) onde tal seja possível. Para fins de exemplo e não como limitação, os heterociclos ou heteroarilos unidos por carbono 104 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ estão ligados na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5, ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetra-hidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetra-hidropirrol, posição 2, 4 ou 5 de uma posição oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol, ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma isoquinolina.
Para fins de exemplo e não como limitação, os heterociclos ou heteroarilos ligados por azoto estão ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, ΙΗ-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, a posição 4 de uma morfolina e a posição 9 de um carbazol ou β-carbolina. "Alquileno" refere-se a um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada ou cíclico saturado de 1-18 átomos de carbono, e possuindo dois centros radicais monovalentes derivados através da remoção de dois átomos de hidrogénio a partir dos mesmos ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano-mãe. Radicais alquileno típicos incluem, mas não se limitam a: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-) , 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) e semelhantes.
Um "alquileno Ci-Ci0" é um grupo hidrocarboneto de cadeia linear saturado de fórmula -(CH2)i-io-· Exemplos de um alquileno Ci-Cio incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno e decaleno. "Alcenileno" refere-se a um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada ou cíclico insaturado de 2-18 átomos de carbono, e possuindo dois centros radicais monovalentes derivados através da remoção de dois átomos de hidrogénio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de 105 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ um alceno-mae. Radicais alcenileno típicos incluem, mas não se limitam a: 1,2-etileno (-CH=CH-). "Alcinileno" refere-se a radical hidrocarboneto de cadeia ramificada ou linear ou cíclico insaturado de 2-18 átomos de carbono, e possuindo dois centros radicais monovalentes derivados através da remoção de dois átomos de hidrogénio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcino-mãe. Radicais alcinileno típicos incluem, mas não se limitam a: acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2C=C-), e 4-pentinilo (-ch2ch2ch2c=c-) .
Um "arileno" é um grupo arilo que tem duas ligações covalentes e podem estar nas configurações orto, meta ou para tal como mostrado nas seguintes estruturas:
em que o grupo fenilo pode ser não substituído ou substituído com até quatro grupos, incluindo, mas não se limitando a, alquilo -Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C (O) OR' , -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C (O)N (R' ) 2-NHC (O)R' , -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é seleccionado independentemente a partir de H, alquilo -Ci-C8 e arilo. "Arilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico em que um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical arilo. Grupos arilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, benzilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobenzilo, 2-naftofeniletan-l-ilo e semelhantes. O grupo arilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, p.ex. a porção alquilo, incluindo grupos alcanilo, alcenilo ou alcinilo, do grupo arilalquilo tem 1 a 6 átomos de carbono e a porção arilo tem 5 a 14 átomos de carbono. "Heteroarilalquilo" refere-se a um radical alquilo aciclico em que um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo 106 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarilo. Grupos heteroarilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, 2-benzimidazolilmetilo, 2-furiletilo, e semelhantes. 0 grupo heteroarilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, p.ex. a porção alquilo, incluindo os grupos alcanilo, alcenilo ou alcinilo, do grupo heteroarilalquilo tem 1 a 6 átomos de carbono e a porção heteroarilo tem 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O, P, e S. A porção heteroarilo do grupo heteroarilalquilo pode ser um monociclo possuindo 3 a 7 membros de anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo possuindo 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo[4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6]. O termo "pró-fármaco" tal como utilizado no presente pedido refere-se a uma forma precursora ou derivada de um composto do invento que pode ser menos citotóxica para as células em comparação com o composto ou fármaco de origem e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente activado ou convertido na forma original mais activa. Ver, p.ex., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et ai., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos deste invento incluem, mas não se limitam a, pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptidos, pró-fármacos modificados com D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactamos, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída, pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco citotóxico livre mais activo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados numa forma de pró-fármaco para utilizar neste invento incluem, mas não se limitam a, compostos do invento e agentes quimioterapêuticos tais como descritos acima. 107 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Um "metabolito" é um produto produzido através do metabolismo no corpo de um composto especificado ou um sal seu. Os metabolitos de um composto podem ser identificados utilizando técnicas de rotina conhecidas na técnica e as suas actividades determinadas utilizando testes tais como os aqui descritos. Tais produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática, e semelhantes, do composto administrado. Concordantemente, o invento inclui metabolitos de compostos do invento, incluindo compostos produzidos através de um processo compreendendo o contacto de um composto deste invento com um mamifero durante um período de tempo suficiente para se obter um produto metabólico do mesmo.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para distribuição de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão normalmente dispostos numa formação de bicamada, semelhante à disposição lipídica das membranas biológicas. "Ligador" refere-se a uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que une covalentemente um anticorpo a uma porção fármaco. Em várias concretizações, os ligadores incluem um radical bivalente tal como um alquildiilo, um arildiilo, um heteroarildiilo, porções, tais como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades de repetição de alquiloxi (p.ex. polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) e alquilamino (p.ex. polietilenoamino, Jeffamine™); e éster de diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida. 0 termo "quiral" refere-se a moléculas que possuem a propriedade de não-sobreposição com a sua imagem no espelho, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são sobreponíveis com a sua imagem no espelho. 0 termo "estereoisómeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem no que respeita à disposição dos átomos ou grupos no espaço. 108 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ "Diastereómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens no espelho uma da outra. Os diastereómeros têm diferentes propriedades físicas, p.ex. pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reactividades. As misturas de diastereómeros podem separar-se sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como electroforese e crornatografia. "Enantiómeros" referem-se a dois estereoisómeros de um composto que são imagens não-sobreponíveis no espelho um do outro.
As definições e convenções estereoquímicas aqui utilizadas seguem geralmente S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill "McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms" (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds" (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente activas, i.e., possuem a capacidade de rodar o plano da luz plano-polarizada. Ao descrever um composto opticamente activo, os prefixos D e L ou R e S, são utilizados para denotar a configuração absoluta da molécula em torno do seu centro ou centros quirais. Os prefixos d e 1 ou ( + ) e (-) são empregues para designar o sinal de rotação da luz plano-polarizada pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levogiro. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrogiro. Para uma dada estrutura química, estes estereoisómeros são idênticos, excepto que são imagens no espelho um do outro. Um estereoisómero específico pode também ser referido como um enantiómero, e uma mistura de tais isómeros é frequentemente chamada uma mistura enantiomérica. Uma mistura de enantiómeros 50:50 é referida como uma mistura racémica ou um racemato, o que pode ocorrer quando não houve nenhuma estereo-selecção ou estereo-especificidade numa reacção ou processo químico. Os termos "mistura racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de actividade óptica. 0 termo "tautómero" ou "forma tautomérica" refere-se a isómeros estruturais de diferentes energias, que são convertidos entre si através de uma barreira de baixa energia. 109 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Por exemplo, os tautómeros de protões (também conhecidos como tautómeros prototrópicos) incluem interconversões através da migração de um protão, tal como isomerizações ceto-enol e imina-enamina. Tautómeros de valência incluem interconversões através de reorganização de alguns dos electrões da ligação. A frase "sal farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizada, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto do invento. Sais exemplares incluem, mas não se limitam a, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato "mesilato", etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e pamoato (i.e., 1, 1'-metileno-bis(2-hidroxi-3-naftoato)) . Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula tal como um ião acetato, um ião succinato ou outro contra-ião. 0 contra-ião pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto original. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais do que um átomo com carga na sua estrutura. Casos em que múltiplos átomos com carga fazem parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter vários contra-iões. Assim, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos com carga e/ou um ou mais contra-iões.
Se o composto do invento for uma base, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado através de qualquer método adequado disponível na técnica, por exemplo, o tratamento da base livre com um ácido inorgânico, tal como ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfónico, ácido fosfórico e semelhantes, ou com um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido de piranosidilo, tal como o ácido glucurónico ou ácido galacturónico, um alfa-hidroxiácido, tal como ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido, tal como ácido aspártico ou 110 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ácido glutâmico, um ácido aromático, tal como o ácido benzóico ou ácido cinâmico, um ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenossulfónico ou ácido etanossulfónico, ou semelhante.
Se o composto do invento for um ácido, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado através de qualquer método adequado, por exemplo, tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou orgânica, tal como uma amina (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metal álcali ou hidróxido de metal de terra alcalina, ou semelhante. Exemplos ilustrativos de sais adequados incluem, mas não se limitam a, sais orgânicos derivados de aminoácidos, tais como glicina e arginina, amónia, aminas primárias, secundárias e terciárias, e aminas ciclicas, tais como piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cálcio, potássio, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio. A frase "farmaceuticamente aceitável" indica que a substância ou composição tem de ser quimicamente e/ou toxicologicamente compatível com os outros ingredientes que constituem uma formulação, e/ou com o mamífero a tratar com a mesma.
Um "solvato" refere-se a uma associação ou um complexo de uma ou mais moléculas de solvente e um composto do invento. Exemplos de solventes que formam solvatos incluem, mas não se limitam a, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, e etanolamina. 0 termo "hidrato" refere-se ao complexo em que a molécula de solvente é água. O termo "grupo protector" refere-se a um substituinte que é vulgarmente empregue para bloquear ou proteger uma determinada funcionalidade ao reagir com outros grupos funcionais no composto. Por exemplo, um "grupo amino-protector" é um substituinte ligado a um grupo amino que bloqueia ou protege a funcionalidade amino no composto. Grupos amino-protectores adequados incluem acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benziloxicarbonilo (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Semelhantemente, um "grupo hidroxi-protector" refere-se a um substituinte de um grupo hidroxilo que bloqueia ou protege a funcionalidade 111 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ hidroxilo. Grupos protectores adequados incluem acetilo e sililo. Um "grupo carboxi-protector" refere-se a um substituinte do grupo carboxilo que bloqueia ou protege a funcionalidade carboxilo. Grupos carboxi-protectores vulgares incluem grupos fenilsulfoniletilo, cianoetilo, 2- (trimetilsilil)etilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, 2-(p- toluenossulfonil)-etilo, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etilo, 2- (difenilfosfino)-etilo, nitroetilo e semelhantes. Para uma descrição geral de grupos protectores e sua utilização, ver T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis". John Wiley & Sons, New York, 1991. "Grupo de saída" refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por outro grupo funcional. Certos grupos de saída são bem conhecidos na técnica, e exemplos incluem, mas não se limitam a, um halogeneto (p.ex., cloreto, brometo, iodeto), metanossulfonilo (mesilo), p-toluenossulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) e trifluorometilsulfonato.
Abreviaturas COMPONENTES LIGADORES: MC = 6-maleimidocaproilo
Val-Cit ou "vc" = valina-citrulina (um dipéptido exemplar num ligador clivável com protease)
Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido-pentanóico PAB = p-aminobenziloxicarbonilo (um exemplo de um componente ligador "auto-imolativo")
Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (em que a ligação peptídica do ligador foi modificada para prevenir a sua clivagem pela catepsina B) MC(PEG)6-OH = maleimidocaproil-polietilenoglicol (pode ser ligado a cisteínas de anticorpos). FÁRMACOS CITOTÓXICOS: MMAE = auristatina E mono-metilo (PM 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina no terminal C do fármaco (PM 731,5) 112 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) numa ligação amida à fenilalanina C-terminal (PM 801,5) MMAF-TEG = MMAF com tetraetilenoglicol esterificado com a fenilalanina
MMAF-NtBu = N-t-butilo, ligado como uma amida ao terminal C de MMAF DM1 = N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-l-oxopropil)-maitansina DM3 = N(2')—deacetil—N2—(4—mercapto—1—oxopentil)— maitansina DM4 = N(2')—deacetil—N2—(4—mercapto—4—metil—1—oxopentil)-maitansina
Abreviaturas adicionais são como se segue: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonilo), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazo- dicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é di-isopropilazodicarboxilato, DIEA é N, IV-di-isopropiletilamina, dil é dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é éter dimetilico de etilenoglicol (ou 1,2-dimetoxietano) . DMF é N, N-dimetilf ormamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico), DTPA é ácido dietilenotriaminopentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-di-hidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa por electrospray, EtOAc é acetato de etilo, Fmoc é N- (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , gly é glicina, HATU é hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametilurónio, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia liquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrilo, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetilo (ou 4-metoxitritil), nor é (IS,2R)-( + )-norefedrina, PBS é solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), PEG é polietilenoglicol, Ph é fenilo, Pnp é p-nitrofenilo, MC é β-maleimidocaproilo, phe é L-fenilalanina, PyBrop é hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfónio, SEC é cromatografia de exclusão de tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoroacético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e vai é valina. 113 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Um "aminoácido cisteína livre" refere-se a um resíduo de aminoácido cisteína que foi introduzido num anticorpo-mãe, tem um grupo funcional tiol (-SH) , e não é emparelhado como uma ponte dissulfureto intramolecular ou intermolecular. 0 "valor de reactividade do tiol" é uma caracterização quantitativa da reactividade dos aminoácidos cisteína livres. 0 valor da reactividade de tiol é a percentagem de um aminoácido cisteína livre num anticorpo modificado com cisteína que reage com um reagente reactivo com tiol, e convertido num valor máximo de 1. Por exemplo, um aminoácido cisteína livre num anticorpo modificado com cisteína que reage com um rendimento de 100% com um reagente reactivo com tiol, tal como um reagente biotina-maleimida, para formar um anticorpo marcado com biotina como um valor da reactividade do tiol de 1,0. Outro aminoácido cisteína introduzido no mesmo anticorpo-mãe ou num diferente que reage com um rendimento de 80% com um reagente reactivo com tiol tem um valor de reactividade de tiol de 0,8. Outro aminoácido cisteína introduzido no mesmo anticorpo-mãe ou num diferente que não consegue de todo reagir com um reagente reactivo com tiol tem um valor de reactividade de tiol de 0. A determinação do valor de reactividade de tiol de uma determinada cisteína pode ser conduzida através de ensaio ELISA, espectroscopia de massa, cromatografia líquida, autorradiografia, ou outros testes analíticos quantitativos.
Um "anticorpo-mãe" é um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos a partir da qual um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por um ou mais resíduos de cisteína. O anticorpo-mãe pode compreender uma sequência nativa ou de tipo selvagem. O anticorpo-mãe pode ter modificações da sequência de aminoácidos pré-existentes (tais como adições, deleções e/ou substituições) em relação a outras formas nativas, de tipo selvagem ou modificadas de um anticorpo. Um anticorpo-mãe pode ser dirigido contra um antigénio alvo de interesse, p.ex. um polipéptido biologicamente importante. Os anticorpos dirigidos contra antigénios não polipeptídicos (tais como antigénios glicolipidicos associados a tumores; ver US 5091178) estão também contemplados. 114 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 1 * C-0 Íiiorcaíicd Imm 12 lo 15
* Z is «vrr.ige of EQ
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* A iMqeenoi! wítò Vi or more <jí rts· etemenfs ACXiTU fe: asssjmed « bc DNA * Output is in fhetsie "aíigH.oul" * The prógmtvi rnsy cresse s tnip fite ia /tuip to hokí tufo «bom traechack. * CMgiiisl versioh devt-ksped uutier 8SJ> 4 j on a vax 8650 */'
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I (void) trectichar *}addy); <void) íretKchar *)ddyfc |v»fd j thxdíefear S)cõ30}; (v»id): fetffdiar *Χ·ο5 i ); 120 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ jr* * pri»K) - t-síly rcutmc ih&mtxlute * * sLt-k;.
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I gtíiiKMÍSx, ly, tSfSígap. tasigap); pr_ar%n(i; ) 121 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ί* * («(£» hack ífic ljtrs! paih, eoret matcfies síaíic jsctmaífís, !y, fetpp, iasigap) (.«( !\, ]y; /* "η-Γο" tsràntiS uwijtupsí */ IM Sirsigap, iastjatp; }· loaiimg itttiKiig «vwtop *> gelmat
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Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo que se liga, de preferência especificamente, a qualquer um dos polipéptidos descritos acima ou abaixo tal como definido nas reivindicações. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo fragmento Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo anti-polipéptido CD79b ao seu respectivo epitopo antigénico. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinóide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolítica ou semelhantes. Os anticorpos do presente invento podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e induzem de preferência morte de uma célula à qual se ligam. Para fins de detecção, os anticorpos do presente invento podem ser marcados de forma detectável, ligados a um suporte sólido ou semelhantes. 130 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b (p.ex. afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) é substancialmente a mesma que a afinidade monovalente de um anticorpo de murideo (p.ex. afinidade do anticorpo de murideo como um fragmento Fab para CD79b) ou um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência do domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) é inferior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes inferior, à afinidade monovalente de um anticorpo de murideo (p.ex., afinidade do anticorpo de murideo como um fragmento Fab para CD79b) ou de um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para CD79h), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência do domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como fragmento Fab para CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior, que a afinidade monovalente de um anticorpo de murideo (p.ex., afinidade do anticorpo de murideo como fragmento Fab para CD79b) ou de um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como fragmento Fab para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). 131 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é substancialmente a mesma que a afinidade de um anticorpo de murideo (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) ou de um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como fragmento Fab para CD79b) na sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ In NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é inferior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes inferior, à afinidade de um anticorpo de murideo (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) ou de um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como fragmento de IgG para CD79b) na sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior, que a afinidade de um anticorpo de murideo (p.ex. afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) ou de um anticorpo quimérico (p.ex. afinidade do anticorpo quimérico como fragmento de IgG para CD79b) na sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente numa sequência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG 132 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ para CD79b) é de 0,4 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,4 nM ± 0,04.
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,3 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,32 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,36 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,4 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,44 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,48 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,5 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,3 nM e 0,5 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,32 nM e 0,48 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,36 nM e 0,44 nM. 133 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Noutro aspecto, ο invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,2 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,2 nM ± 0,02.
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,1 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,12 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,14 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,16 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,18 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,2 nM ou melhor.
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,22 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,24 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,26 nM ou melhor. 134 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Noutro aspecto, ο invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,28 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,30 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,1 nM e 0,3 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,12 nM e 0,28 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,14 nM e 0,26 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,16 nM e 0,24 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,18 nM e 0,22 nM.
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,5 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,5 nM ± 0,1.
Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,4 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 135 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 0,5 ηΜ ou melhor. Noutro aspecto, ο invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como igG para CD79b) é de 0,6 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) é de 0,7 nM ou melhor. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,3 nM e 0,7 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,4 nM e 0,6 nM. Noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo anti-CD79b humanizado em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b (p.ex., afinidade do anticorpo como IgG para CD79b) está entre 0,5 nM e 0,55 nM.
Num aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo de murideo para CD79b é substancialmente a mesma que a afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo as sequências de domínio variável de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Noutro aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo de murideo para CD79h é substancialmente a mesma que a afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo as sequências de domínio variável de um anticorpo gerado a partir do hibridoma depositado na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993 ou do anticorpo quimérico compreendendo os domínios variáveis do anticorpo gerado a partir dos hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993.
Tal como está bem estabelecido na técnica, a afinidade de ligação de um ligando ao seu receptor pode ser determinada utilizando qualquer um de uma variedade de ensaios, e expressa em termos de uma variedade de valores quantitativos. Concordantemente, numa concretização, a afinidade de ligação é expressa como valores de Kd e reflecte a afinidade de ligação intrínseca (p.ex., com efeitos de avidez minimizados). Geralmente e de preferência, a afinidade de ligação é medida in vitro, num cenário sem células ou associado a células. Tal 136 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ como descrito em maior detalhe aqui, as vezes de diferença na afinidade de ligação podem ser quantificadas em termos da razão do valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (p.ex., na forma Fab) com o valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparador (p.ex., na forma Fab) (p.ex., um anticorpo de murideo possuindo sequências da região hipervariável dadora), em que os valores de afinidade de ligação são determinados sob condições de ensaio semelhantes. Assim, numa concretização, as vezes de diferença na afinidade de ligação é determinada como a razão dos valores de Kd do anticorpo humanizado na forma Fab com o do referido anticorpo Fab de referência/comparador. Por exemplo, numa concretização, um anticorpo do invento (A) tem uma afinidade "3 vezes mais baixa" que a afinidade de um anticorpo de referência (M), então se o valor de Kd para A for 3χ, o valor de Kd de M será lx e a razão de Kd de A para Kd de M será 3:1. Inversamente, numa concretização, um anticorpo do invento (C) tem uma afinidade que é "3 vezes maior" que a afinidade de um anticorpo de referência (R), então se o valor de Kd para C for lx, o valor de Kd de R será 3x, e a razão de Kd de C para Kd de R será 1:3. Qualquer um de vários ensaios conhecidos na técnica, incluindo os aqui descritos, pode ser utilizado para obter medições de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.
Num aspecto, é proporcionado um anticorpo que se liga a CD79b, em que o anticorpo compreende: (a) pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVR seleccionadas a partir do grupo que consiste em: (i) HVR-LI compreendendo a sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-Hl compreendendo a sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, em que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e 137 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
Numa concretização, a HVR-L1 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Numa concretização, a HVR-L2 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 132. Numa concretização, a HVR-L3 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Numa concretização, a HVR-H1 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Numa concretização, a HVR-H2 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Numa concretização, a HVR-H3 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Numa concretização, um anticorpo do invento compreendendo estas sequências (em combinação tal como aqui descrito) é humanizado ou humano.
Num aspecto, é proporcionado um anticorpo que se liga a CD79b, em que o anticorpo compreende: (a) pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVR seleccionadas a partir do grupo que consiste em: (i) HVR-LI compreendendo a sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-Hl compreendendo a sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, em que E-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); e
(b) pelo menos uma HVR variante em que a sequência de HVR variante compreende a modificação de pelo menos um resíduo da sequência representada em SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136. Numa concretização, a HVR-Ll de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Numa concretização, a HVR-L2 de um anticorpo do invento compreende 138 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ a sequência de SEQ ID NO: 132. Numa concretização, a HVR-L3 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Numa concretização, a HVR-H 1 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Numa concretização, a HVR-H2 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Numa concretização, a HVR-H3 de um anticorpo do invento compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Numa concretização, um anticorpo do invento compreendendo estas sequências (em combinação, tal como aqui descrito) é humanizado ou humano.
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo uma, dois, três, quatro, cinco ou seis HVR, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente numa sequência seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 134, 135, e 136, e em que SEQ ID NO: 131 corresponde a uma HVR-L1, SEQ ID NO: 132 corresponde a HVR-L2, SEQ ID NO: 133 corresponde a uma HVR-L3, SEQ ID NO: 134 corresponde a uma HVR-H1, SEQ ID NO: 135 corresponde a uma HVR-H2 e SEQ ID NO: 136 corresponde a uma HVR-H3. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, em que cada um, por ordem, compreende SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 e 136.
As HVR variantes num anticorpo de um invento podem ter modificações de um ou mais resíduos dentro da HVR. Numa concretização, uma variante de HVR-L1 compreende uma substituição nas seguintes posições: A4 (K) , A9 (E ou S) e AIO (A ou S). Numa concretização, a variante de HVR-L2 compreende 1-5 (1, 2, 3, 4, ou 5) substituições em qualquer uma ou numa combinação das seguintes posições: B2 (S ou G) , B3 (R ou G) , B4 (K, R, Y, I, H ou Q), B5 (R) , B6 (G, K, A, R, S OU L) e B7 (R, N, T ou G) . Numa concretização, uma variante de HVR-L3 compreende 1-4 (1, 2, 3 ou 4) substituições em qualquer uma ou numa combinação das seguintes posições: Cl (N ou D), C2 (N ou P), C3 (D ou R) , C5 (S, K, A, Q, D, L ou G) , C6 (A, E ou N) , C7 (A) , C8 (R) e C9 (N) . Numa concretização, uma variante de HVR-Hl compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições em qualquer uma ou numa combinação das seguintes posições: Dl (P), D2 (F), D3 (P, S, Y, G ou N) , D4 (L ou V), D5 (T, R, N, K, C, G ou P), D6 (R, T, K ou G) , D8 (F), D9 (V OR L) e D10 (S, Q, N ou D) . Numa concretização, uma variante de HVR-H3 139 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ compreende 1-3 (1, 2 ou 3) substituições em qualquer uma ou numa combinação das seguintes posições: F4 (R ou 1), F6 (I ou F), F7 (K, C, R, V ou F), F8 (L), e F9 (S). A letra ou letras dentro de parênteses a seguir a cada posição indicam um aminoácido de substituição (i.e., troca) ilustrativo; tal como seria evidente para um perito na técnica, a adequação de outros aminoácidos como aminoácidos de substituição no contexto aqui descrito pode ser rotineiramente avaliada utilizando técnicas conhecidas na arte e/ou aqui descritas. Numa concretização, A9 numa HVR-L1 variante é E. Numa concretização, F6 numa HVR-H3 variante é I. Numa concretização, F7 numa HVR-H3 variante é R. Numa concretização, F8 numa HVR-H3 variante é L. Numa concretização um anticorpo do invento compreende uma HVR-H3 variante em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Numa concretização um anticorpo do invento compreende uma HVR-L1 variante em que A9 é E e uma HVR-H3 variante em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Numa concretização, A9 numa HVR-L1 variante é S. Numa concretização um anticorpo do invento compreende uma HVR-L1 variante em que A9 é S e uma HVR-H3 variante em que F6 é 1, F7 é R e F8 é L.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L1 variante em que A4 é K. Nalgumas concretizações, a referida HVR-L1 variante compreende HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NOS: 132, 133, 134, 135 e 136. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-Ll variante compreende ainda uma variante de HVR-Ll em que A9 é E ou S e/ou AIO é A ou S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-Ll variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Nalgumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso de cadeia pesada subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes 140 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é 1, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Nalgumas concretizações destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L2 variante em que B3 é R, B4 é K, B6 é G e B7 é R. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L2 variante em que B3 é R, B4 é Y, B6 é K e B7 é R. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L2 variante em que B3 é R, B4 é K e B6 é G. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L2 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NOS: 131, 133, 134, 135 e 136. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L2 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 em que A9 é E ou S e/ou AIO é A ou S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L2 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Nalgumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma 141 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Nalgumas concretizações destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L3 variante em que C5 é K. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-L3 variante em que C5 é S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NOS: 131, 132, 134, 135 e 136. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 em que A9 é E ou S e/ou AIO é A ou S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-L3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Nalgumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de 142 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e/ou 80 é M. Nalgumas concretizações destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-H1 variante em que D3 é P, D5 é T, D6 é R e D10 é N. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-H1 variante em que D3 é P, D5 é N, D6 é R e D10 é N. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H1 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 135 e 136. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H1 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 em que A9 é E ou S e/ou AIO é A ou S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H1 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Nalgumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F. Numa 143 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e/ou 80 é M. Nalgumas concretizações destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-H3 variante em que F6 é I e F8 é L. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma HVR-H3 variante em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H3 variante compreende ainda HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2 em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 134 e 135. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L1 em que A9 é E ou S e/ou AIO é A ou S. Nalgumas concretizações, o referido anticorpo de HVR-H3 variante compreende ainda uma variante de HVR-L3 em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Nalgumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência de consenso da estrutura da cadeia pesada subgrupo III humana) 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Numa concretização destes 144 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e/ou 80 é M. Nalgumas concretizações destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência estrutural de consenso da estrutura da cadeia leve κΐ humana compreende uma substituição na posição 4 e/ou 47. Nalgumas concretizações destes anticorpos, a posição (da sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as sequências de HVR representadas na Figura 9 (SEQ ID NOS: 17-21) e/ou Figura 10 (SEQ ID NOS: 22-106).
Um agente terapêutico para utilizar num sujeito hospedeiro desencadeia de preferência pouca a nenhuma resposta imunogénica contra o agente no referido sujeito. Numa concretização, o invento proporciona um tal agente. Por exemplo, numa concretização, o invento proporciona um anticorpo humanizado que desencadeia e/ou se espera que desencadeie uma resposta de anticorpos humanos anti-ratinho (HAMA) a um nível substancialmente reduzido em comparação com um anticorpo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10 e 14 num sujeito hospedeiro. Noutro exemplo, o invento proporciona um anticorpo humanizado que desencadeia e/ou se espera que desencadeie uma resposta de anticorpos humanos anti-ratinho (HAMA) mínima ou nenhuma. Num exemplo, um anticorpo do invento desencadeia uma resposta de anticorpos anti-ratinho a um nível, ou abaixo de um nível, clinicamente aceitável. 145 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Um anticorpo humanizado do invento pode compreender uma ou mais sequências da região não hipervariável (p.ex., estrutural) humanas e/ou de consenso humanas no seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Nalgumas concretizações, está presente no invento uma ou mais modificações adicionais dentro das sequências da região não hipervariável humanas e/ou de consenso humanas. Numa concretização, o domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso humana, que numa concretização é a sequência estrutural de consenso subgrupo III. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso subgrupo III variante modificada pelo menos numa posição de aminoácido. Por exemplo, numa concretização, uma sequência estrutural de consenso subgrupo III variante pode compreender uma substituição numa ou mais das posições 71, 73 e/ou 78. Numa concretização, a referida substituição é R71A, N73T e/ou L78A, em qualquer combinação destas. Por exemplo, numa concretização, uma sequência estrutural de consenso de cadeia pesada subgrupo III variante compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Numa concretização, a referida substituição é V481, F67A, 169F, R71A, N73T e/ou L78A. Por exemplo, numa concretização, uma sequência estrutural de consenso de cadeia pesada subgrupo III variante compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Numa concretização, a referida substituição é V481, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A e/ou L80M. Numa concretização, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso humana, que numa concretização é a sequência estrutural de consenso de κΐ. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso de κΐ variante modificada pelo menos numa posição de aminoácido. Por exemplo, numa concretização, uma sequência estrutural de consenso de κΐ variante pode compreender uma substituição na posição 4. Numa concretização, a referida substituição é M4L. Por exemplo, numa concretização, a sequência estrutural de consenso de κΐ variante pode compreender uma substituição na posição 4 e/ou 47. Numa concretização, a referida substituição é M4L e/ou L47F . 146 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tal como é conhecido na técnica, e tal como descrito em maior detalhe aqui abaixo, a posição/limite de aminoácidos delineando uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica (tal como descrito abaixo). Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas por estas posições poderem ser consideradas como estando dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios ao mesmo tempo que podem ser consideradas como estando fora de uma região hipervariável sob um diferente conjunto de critérios. Uma ou mais destas posições podem também ser verificadas em regiões hipervariáveis prolongadas (tal como melhor definido abaixo). 0 invento proporciona anticorpos compreendendo modificações nestas posições hipervariáveis híbridas. Numa concretização, estas posições hipervariáveis incluem uma ou mais posições 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 e 101-102 num domínio variável de cadeia pesada. Numa concretização, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 24-29, 35-36, 46-49, 56 e 97 num domínio variável de cadeia leve. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso de subgrupo humano variante humana modificada numa ou mais posições hipervariáveis híbridas.
Num aspecto, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência estrutural de consenso subgrupo III humana variante modificada numa ou mais das posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição G26P. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição F27Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição T28P, S, Y, G ou N. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição F29L ou F29V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S30T, R, N, K, C, G ou P. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A33W ou A33F. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição M34I, V ou L. Numa concretização S35E, Q, N ou D. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição V48I. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S49G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição 147 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Υ58Ν. Numa concretização, ο anticorpo compreende uma substituição A60N. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição D61E. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S621. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição V63F. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A93T. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição D101S .
Num aspecto, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência estrutural de consenso da capa subgrupo I humana variante modificada numa ou mais das posições 24, 27-29, 56 e 97. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição R24K. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Q27K. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S28D ou E. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição 129G, A ou S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S56R, N, T ou G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição T97N.
Num aspecto, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência estrutural de consenso da subgrupo III humana variante modificada em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou todas as posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Numa concretização, a modificação é seleccionada a partir do grupo que consiste em G26P, F27Y, T28P (S, Y, G ou N), F29L (V), S30T (R, N, K, C, G ou P), A33W (F), M34I (V ou L), S35E (Q, N ou D), V48I, S49G, Y58N, A60N, D61E, S62I, V63F, A93T e D101S. Nalgumas concretizações do invento, um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso da subgrupo III variante modificada na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Numa concretização, a referida substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A e/ou L80M.
Num aspecto, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência estrutural de consenso da capa subgrupo I humana variante modificada em 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as posições 24, 27-29, 56 e 97. Numa concretização, a modificação é seleccionada a 148 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ partir do grupo que consiste em R24K, Q27K, S28D (E), 129G (A ou S), S56R (N, T ou G) e T97N. Nalgumas concretizações do invento, um anticorpo do invento compreende uma sequência estrutural de consenso da κΐ variante modificada na posição 4 e/ou 47. Numa concretização, a referida substituição é M4L e/ou L47F.
Um anticorpo do invento pode compreender quaisquer sequências estruturais humanas ou de consenso humanas de cadeia leve adequadas, desde que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (p.ex., uma afinidade de ligação deseja). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende pelo menos uma porção (ou toda) da sequência estrutural humana da cadeia leve k. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende pelo menos uma porção (ou toda) da sequência estrutural de consenso da κ humana subgrupo I.
Num aspecto, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve compreendendo a sequência estrutural representada na SEQ ID NO: 9 (Figuras 7A-B) e/ou 13 (Figuras 8A-B).
Num aspecto, um anticorpo do invento é um anticorpo anti-CD79b humanizado conjugado com um agente citotóxico. Num aspecto, o anticorpo anti-CD79b humanizado conjugado com um agente citotóxico inibe a progressão do tumor em xenoenxertos.
Num aspecto, tanto o anticorpo humanizado como o anticorpo quimérico são monovalentes. Numa concretização, tanto o anticorpo humanizado como o quimérico compreendem uma única região Fab ligada a uma região Fc. Numa concretização, o anticorpo quimérico de referência compreende as sequências do domínio variável representadas nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) ligadas a uma região Fc humana. Numa concretização, a região Fc humana é a de uma IgG (p.ex., IgGl, 2, 3 ou 4). E aqui divulgado um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 164-166). Numa concretização, o domínio variável 149 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 160-163). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168) . Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163), e de CHI e/ou Fc (Figura 15, SEQ ID NO: 167 e/ou 168). É aqui divulgado um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 156-158). Numa concretização, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 152-155) . Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CLl representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 159) . Numa concretização, o anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155) representada na Figura 15. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), e a sequência de CLl (SEQ ID NO: 159) representada na Figura 15. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155) representada na Figura 15, e a sequência de CLl representada na Figura 15 (SEQ ID NO: 159). 150 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ É aqui divulgado um anticorpo compreendendo um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 183-185). Numa concretização, o dominio variável compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 179-182). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182), e de CHI e/ou Fc (Figura 16, SEQ ID NO: 186 e/ou 187). É aqui divulgado um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 175-177). Numa concretização, o dominio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 171-174). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CL1 representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 178) . Numa concretização, o anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representada na Figura 16. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 178) representada na Figura 16. Numa concretização, um anticorpo do 151 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representada na Figura 16, e a sequência de CL1 representada na Figura 16 (SEQ ID NO: 178).
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 202-204). Numa concretização, o domínio variável compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 198-201). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206) Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201), e a de CHI e/ou Fc (Figura 17, (SEQ ID NO: 205 e/ou 206).
Num aspecto, o invento proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 194-196). Numa concretização, o domínio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 190-193). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CL1 representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 197) . Numa concretização, o anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) 152 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ representada na Figura 17. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 197) representada na Figura 17. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) representada na Figura 17, e a sequência de CL1 representada na Figura 17 (SEQ ID NO: 197). É aqui divulgado um anticorpo compreendendo um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 221-223). Numa concretização, o dominio variável compreende a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 217-220). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 217-220). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência de CHI e/ou Fc representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225). Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um dominio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 217-220), e a de CHI e/ou Fc (Figura 18, SEQ ID NO: 224 e/ou 225). É aqui divulgado um anticorpo compreendendo um dominio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 213-215). Numa concretização, o dominio variável compreende a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 209-212). Numa concretização, o anticorpo compreende a sequência de CL1 153 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 216) . Numa concretização, o anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representada na Figura 18. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência de CL1 (SEQ ID NO: 216) representada na Figura 18. Numa concretização, um anticorpo do invento compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representada na Figura 18, e a sequência de CL1 representada na Figura 18 (SEQ ID NO: 216). São também divulgados anticorpos modificados com cisteína onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo-mãe são substituídos por um aminoácido cisteína livre tal como divulgado em WO2006/034488; US 2007/0092940 (aqui incorporado por referência na sua totalidade). Qualquer forma de anticorpo anti-CD79b pode ser assim modificada, i.e. mutada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fab mãe pode ser modificado para formar um Fab modificado com cisteína, aqui referido como "TioFab". Semelhantemente, um anticorpo monoclonal mãe pode ser modificado para formar um "TioMab". Deve notar-se que uma única mutação num local produz um único resíduo de cisteína introduzido num TioFab, enquanto que uma única mutação num local produz dois resíduos de cisteína introduzidos num TioMab, devido à natureza dimérica do anticorpo IgG. Os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteína do invento incluem anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais humanizados ou quiméricos, e fragmentos de ligação ao antigénio de anticorpos, polipéptidos de fusão e análogos que de preferência se ligam a polipéptidos CD79b associados a células. Um anticorpo modificado com cisteína pode compreender alternativamente um anticorpo compreendendo uma cisteína numa posição aqui divulgada no anticorpo ou Fab, resultante do desenho da sequência e/ou selecção do anticorpo, sem alterar necessariamente um anticorpo-mãe, tal como através do desenho e selecção de anticorpos de apresentação fágica ou através de novo desenho de sequências estruturais e regiões constantes de 154 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cadeia leve e/ou cadeia pesada. Um anticorpo modificado com cisteina compreende um ou mais aminoácidos cisteina livres possuindo um valor de reactividade de tiol nos intervalos de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0 ou 0,8 a 1,0. Um aminoácido cisteina livre é um resíduo de cisteina que foi introduzido no anticorpo-mãe e não faz parte de uma ponte de dissulfureto. Os anticorpos modificados com cisteina são úteis para a ligação de compostos citotóxicos e/ou de imagiologia no local da cisteina introduzida através, por exemplo, de uma maleimida ou haloacetilo. A reactividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo Cys para um grupo maleimida é cerca de 1000 vezes maior em comparação com qualquer outra funcionalidade de aminoácido numa proteína, tal como o grupo amino de resíduos de lisina ou o grupo amino N-terminal. A funcionalidade especifica do tiol em reagentes iodoacetilo e maleimida pode reagir com grupos amina, mas é necessário um pH mais elevado (>9,0) e tempos de reacção mais longos (Garman, 1997, (Garman, 1997, "Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach", Academic Press, London).
Num aspecto, um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina compreende uma cisteina introduzida numa das seguintes posições, onde as posições são numeradas de acordo com Kabat et al. na cadeia leve (ver Kabat et al., (1991) "Sequences of Proteins of Imunological Interesse", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e de acordo com a numeração EU na cadeia pesada (incluindo a região Fc) (ver Kabat et al., (1991), supra), em que a região constante de cadeia leve representada através de sublinhado nas Figuras 24A, 25A, 26A, 27A, 28, 48A e 49A começa na posição 109 (numeração de Kabat) e a região constante de cadeia pesada representada através de sublinhado nas Figuras 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 48B e 49B começa na posição 118 (numeração EU). A posição pode também ser referida através da sua posição em numeração sequencial dos aminoácidos da cadeia leve ou cadeia pesada inteira mostrados em Figuras 24-28, 48 e 49. De acordo com uma concretização do invento, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteina introduzida em LC-V205C (número de Kabat: Vai 205; número sequencial 209 na Figura 27A e 49A modificado para ser Cys nessa posição). A cisteina introduzida na cadeia leve é mostrada em texto a negrito com duplo sublinhado na Figura 27A e 49A. De acordo 155 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ com uma concretização, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteina introduzida em HC-A118C (número EU: Ala 118; número de Kabat 114; número sequencial 118 na Figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado para ser Cys nessa posição). A cisteina introduzida na cadeia pesada é mostrada a texto a negrito com duplo sublinhado na Figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B. De acordo com uma concretização, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteina introduzida em Fc-S400C (número EU: Ser 400; número de Kabat 396; número sequencial 400 na Figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado para ser Cys nessa posição). Noutras concretizações, a cisteina introduzida da cadeia pesada (incluindo a região Fc) está numa das seguintes posições (de acordo com a numeração de Kabat com a numeração EU dentro de parênteses) : 5, 23, 84, 112, 114 (118 em numeração EU) , 116 (120 em numeração EU), 278 (282 em numeração EU) , 371 (375 em numeração EU) ou 396 (400 em numeração EU) . Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições num anticorpo-mãe anti-CD79b humanizado do invento são: V5C, A23C, A84C, S112C, A114C (A118C em numeração EU). T116C (T120C em numeração EU), V278C (V282C em numeração EU), S371C (S375C em numeração EU) ou S396C (S400C em numeração EU) . Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições para um anticorpo-mãe anti-CD79b quimérico do invento são: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (A118C numeração EU), T116C (T120C numeração EU), V278C (V282C numeração EU), S371C (S375C numeração EU) ou S396C (S400C numeração EU) . Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições para um anticorpo-mãe anti-cynoCD79b do invento são: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (A118C numeração EU), T116C (T120C numeração EU), V278C (V282C numeração EU), S371C (S375C numeração EU) ou S396C (S400C numeração EU) . Noutras concretizações, a cisteina introduzida da cadeia leve está em qualquer uma das seguintes posições (de acordo com a numeração de Kabat): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições para um anticorpo-mãe anti-CD79b humanizado do invento são: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C, ou V205C. Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições para um anticorpo-mãe anti-CD79b quimérico do invento são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C, ou V205C. Assim, mudanças de aminoácidos nessas posições para um anticorpo-mãe anti-cynoCD79b do invento são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C, ou V205C. 156 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína compreende um ou mais aminoácidos cisteína livres em que o anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína se liga a um polipéptido CD79b e é preparado através de um processo compreendendo a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo-mãe anti-CD79b por cisteína em que o anticorpo-mae compreende pele seleccionada a partir de: (a) HVR-L1 compreendendo a AI5 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO ID NO: 137) ; (b) HVR-L2 compreendendo a é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (c) HVR-L3 compreendendo a é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (d) HVR-H1 compreendendo a Dl0 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134
(e) HVR-H2 compreendendo a EI8 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID (f) HVR-H3 compreendendo a FIO é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: NO: 138).
menos uma sequência de HVR
sequência A1-A15, em que Al-: 131) ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ sequência B1-B7, em que B1-B7 sequência C1-C9, em que C1-C9 sequência D1-D10, em que Dl- > sequência E1-E18, em que El-NO: 135) e
sequência F1-F10, em que Fl-136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID E aqui divulgado um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos, a um anticorpo modificado com cisteína possuindo uma sequência de aminoácidos inteira tal como aqui divulgado, ou uma sequência de aminoácidos de um anticorpo modificado com cisteína sem o péptido sinal tal como aqui divulgado; um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência nucleotidica que híbrida com o complemento de uma molécula de ADN codificando (a) um anticorpo modificado com cisteína possuindo uma sequência de aminoácidos inteira tal como aqui divulgado, (b) uma sequência de aminoácidos de 157 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ um anticorpo modificado com cisteina sem o péptido sinal tal como aqui divulgado, (c) um domínio extracelular de uma proteína transmembranar de um anticorpo modificado com cisterna, com ou sem o péptido sinal, tal como aqui divulgado, (d) uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma das sequências de ácido nucleico aqui divulgadas ou (e) qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de aminoácidos inteira de um anticorpo modificado com cisteina tal como aqui divulgado; um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina isolado sem a sequência sinal N-terminal e/ou sem a metionina de iniciação e é codificado por uma sequência nucleotidica que codifica uma tal sequência de aminoácidos tal como descrito. São também aqui descritos processos para a produção do mesmo, cujos processos compreendem a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende a molécula de ácido nucleico de codificação apropriada sob condições adequadas para expressão do anticorpo modificado com cisterna e recuperação do anticorpo modificado com cisterna a partir da cultura celular; um anticorpo anti-CD79b modificado com cisterna isolado, que tem o domínio transmembranar suprimido ou inactivado. São também aqui descritos processos para a produção do mesmo, em que esses processes compreendem a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende a molécula de ácido nucleico de codificação apropriada sob condições adequadas para expressão do anticorpo modificado com cisterna e recuperação do anticorpo modificado com cisterna a partir da cultura celular; anticorpos anti-CD79b quiméricos modificados com cisterna isolados compreendendo qualquer um dos anticorpos modificados com cisterna aqui descritos fundidos com um polipéptido heterólogo (não CD79b). Exemplos de tais moléculas quiméricas compreendem qualquer um dos anticorpos modificados com cisterna aqui descritos fundidos com um polipéptido heterólogo tal como, por exemplo, uma sequência de etiqueta epitopo ou uma região Fc de uma imunoglobulina. 158 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um polipéptido anti-CD79b ao seu respectivo epitopo antigénico. Os anticorpos podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinóide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou semelhantes. Os anticorpos podem, opcionalmente, ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e de preferência inibir o crescimento ou a proliferação de, ou induzir a morte de, uma célula à qual se ligam. Para fins de diagnóstico, os anticorpos do presente invento podem ser marcados de forma detectável, ligados a um suporte sólido ou semelhante.
Noutros aspectos do presente invento, o invento proporciona vectores compreendendo ADN codificando qualquer um dos anticorpos anti-CD79b e anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina aqui descritos. São proporcionadas células hospedeiras compreendendo qualquer um desses vectores. Para fins de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células E. coli ou células de levedura. Um processo para produção de qualquer um dos polipéptidos aqui descritos é ainda proporcionado e compreende a cultura de células hospedeiras sob condições adequadas para expressão do polipéptido desejado e recuperação do polipéptido desejado a partir da cultura celular.
Os anticorpos modificados com cisteina podem ser úteis no tratamento de cancro e incluem anticorpos específicos para a superfície celular e receptores transmembranares, e antigénios associados a tumores (TAA). Tais anticorpos podem ser utilizados como anticorpos nus (não conjugados com um fármaco ou porção marcadora) ou como conjugados anticorpo-fármaco (ADC) . Os anticorpos modificados com cisteina do invento podem ser ligados especificamente num local e eficientemente com um reagente reactivo com tiol. 0 reagente reactivo com tiol pode ser um reagente ligador multifuncional, um reagente marcador de captura, um reagente fluoróforo, ou um intermediário 159 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligador a fármacos. 0 anticorpo modificado com cisteina pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado num suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma porção fármaco. A reactividade do tiol pode ser generalizada a qualquer anticorpo em que a substituição de aminoácidos com aminoácidos cisteina reactivos possa ser feita dentro dos intervalos na cadeia leve seleccionados a partir dos intervalos dos aminoácidos: L10-L20, L105-L115 e L109-L119 e L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210, e dentro dos intervalos da cadeia pesada seleccionados a partir dos intervalos de aminoácidos: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119 e H111-H121, e na região Fc, dentro dos intervalos seleccionados a partir de H270-H280, H366-H376 e H391-401, onde a numeração das posições de aminoácidos começa na posição 1 do sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e continua sequencialmente a partir dai tal como divulgado em W02006034488; US 2007/0092940. A reactividade do tiol pode também ser generalizada a certos domínios de um anticorpo, tal como o domínio constante de cadeia leve (CL) e os domínios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Substituições de cisteina que resultem em valores de reactividade de tiol de 0,6 e superiores podem ser feitas em domínios constantes de cadeia pesada α, δ, ε, γ, e μ de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, incluindo as subclasses de IgG: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Tais anticorpos e suas utilizações são divulgados em W02006/034488; US 2007/0092940.
Os anticorpos modificados com cisteina mantêm de preferência a capacidade de ligação ao antigénio dos seus anticorpos-mãe de tipo selvagem equivalentes. Assim, os anticorpos modificados com cisteina são capazes de se ligar, de preferência especificamente, a antigénios. Tais antigénios incluem, por exemplo, antigénios associados a tumores (TAA), proteínas receptoras da superfície celular e outras moléculas da superfície celular, proteínas transmembranares, proteínas de sinalização, factores reguladores da sobrevivência celular, factores reguladores da proliferação celular, moléculas reguladoras associadas a (p.ex., que se saiba ou suspeite que contribuam funcionalmente para) o desenvolvimento ou a 160 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ diferenciação de tecidos, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas na regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas em vasculogénese e moléculas associadas a (p.ex., gue se saiba ou suspeite gue contribuam funcionalmente com) angiogénese. O antigénio associado a tumores pode ser um factor de diferenciação de um grupo (i.e., uma proteína CD, incluindo mas não limitada a CD79b). Os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina do invento mantêm a capacidade de ligação ao antigénio dos anticorpos anti-CD79b seus equivalentes. Assim, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina do invento são capazes de se ligar, de preferência especificamente, a antigénios CD79b incluindo as isoformas humanas de anti-CD79b beta e/ou alfa, incluindo quando tais antigénios são expressos na superfície de células, incluindo, sem limitação, células B.
Num aspecto, os anticorpos do invento podem ser conjugados com qualquer porção marcadora que pode ser unida covalentemente ao anticorpo através de uma porção reactiva, uma porção activada, ou um grupo tiol de cisteina reactivo (Singh et ai., (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. e Lane, D. (1999) "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) "Chemical Reagents for Protein
Modif ication", 2a ed. CRC Press, Boca Raton, FL) . O marcador ligado pode funcionar para: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável proporcionado pelo primeiro ou segundo marcador, p.ex. para dar FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interacções ou aumentar a afinidade de ligação, com o antigénio ou ligando; (iv) afectar a mobilidade, p.ex. mobilidade electroforética ou permeabilidade celular, através da carga, hidrofobicidade, forma ou outros parâmetros fisicos, ou (v) proporcionar uma porção de captura, para modular a afinidade do ligando, a ligação anticorpo/antigénio, ou a complexação iónica.
Os anticorpos modificados com cisteina marcados podem ser úteis em ensaios de diagnóstico, p.ex., para detecção de expressão de um antigénio de interesse em células e tecidos específicos ou soro. Para aplicações de diagnóstico, o 161 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpo será tipicamente marcado com uma porção detectável. Estão disponíveis numerosos marcadores que podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias:
Radioisótopos (radionuclídeos), tais como 3H, 41C, 14C, i8F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 411In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xc, 177Lu, 211At, ou 213Bi. Os anticorpos marcados com radioisótopos são úteis em experiências de imagiologia direccionada a receptores. 0 anticorpo pode ser marcado com reagentes ligandos que se ligam, quelam ou complexam de outro modo um metal radioisótopo em que o reagente é reactivo com o tiol da cisteína introduzida do anticorpo, utilizando as técnicas descritas em "Current Protocols in Imunology", Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Ligandos quelantes que podem complexar com um ião metálico incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, TX) . Os radionuclídeos podem ser direccionados através de complexação com os conjugados anticorpo-fármaco do invento (Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146).
Reagentes ligadores tais como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados através da reacção de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) activado com isopropilcloroformato (Aldrich), seguindo o procedimento de Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 97(4): 1802-1807). Os reagentes DOTA-maleimida reagem com os aminoácidos cisteína livres dos anticorpos modificados com cisteína e proporcionam um ligando que complexa com metais no anticorpo (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9: 72-86). Reagentes de marcação do ligador quelante tais como DOTA-NHS (mono(éster (N-hidroxisuccinimida) do ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético) estão comercialmente disponíveis (Macrocyclics, Dallas, TX) . A imagiologia direccionada a receptores com anticorpos marcados com radionuclídeos pode proporcionar um marcador da activação de vias através da detecção e quantificação da acumulação progressiva de anticorpos em tecido tumoral (Albert et al. (1998) Bloorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210) . Os radio-metais conjugados podem permanecer intracelulares após degradação nos lisossomas. 162 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Complexos metal-quelato adequados como marcadores de anticorpos para experiências de imagiologia estão divulgados: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Métodos 65: 147-157;
Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142: 68-78; Minadeh et al., (1990) Bioconjugate Chem. 1: 59-65; Meares et al. (1990) J. Câncer 1990, Supl. 10: 21-26; Izard et al. (1992)
Bioconjugate Chem. 3: 346-350; Nikula et al., (1995) Nucl.
Med. Biol. 22: 387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20: 955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39: 2105-2110;
Verei et al. (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670; Camera et al. (1994) J. Nucl. Med. 21: 640-646; Ruegg et al. (1990) Câncer
Res. 50: 4221-4226; Verei et al. (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670; Lee et al. (2001) Câncer Res. 61: 4474-4482;
Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44: 1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10: 103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45: 129-137; DeNardo et al. (1998)
Clinicai Câncer Research 4: 2483-90; Blend et al. (2003) Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18: 355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40: 166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39: 829-36; Mardirossian et al. (1993)
Nucl. Med. Biol. 20: 65-74; Roselli et al. (1999) Câncer
Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14: 209-20.
Marcadores fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio), tipos de fluoresceína incluindo FITC, 5-carboxifluoresceina, 6-carboxifluoresceína; tipos de rodamina incluindo TAMRA; dansilo; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Texas Red; e análogos destes. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com anticorpos, utilizando, por exemplo, as técnicas divulgadas em "Current Protocols in Immunology", supra. Os corantes fluorescentes e os reagentes marcadores fluorescentes incluem aqueles que estão comercialmente disponíveis em Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL). Vários marcadores enzima-substrato estão disponíveis ou divulgados (US 4275149). A enzima catalisa geralmente uma alteração química de um substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor num substrato, que pode ser 163 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. As técnicas para quantificação de uma mudança na fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimioluminescente torna-se electronicamente excitado através de uma reacção quimica e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimioluminómetro, por exemplo) ou doar energia a um aceitador fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (p.ex., luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; US 4737456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, malato-desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases (p.ex., glicose-oxidase, galactose-oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterociclicas (tais como uricase e xantina-oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhantes. Técnicas para conjugação de enzimas com anticorpos são descritas em 0'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166.
Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano (HRP) com hidrogénio-peroxidase como substrato, em que a hidrogénio-peroxidase oxida um corante precursor (p.ex., ortofenileno-diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); fosfato de para- (ii) fosfatase alcalina (AP) com nitrofenilo como substrato cromogénico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (p.ex., p-nitrofenil^-D-galactosidase) ou o substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil^-D-galactosidase.
Numerosas outras combinações enzima-substrato estão disponíveis aos peritos na técnica. Para uma revisão geral ver US 4275149 e US 4318980.
Um marcador pode ser indirectamente conjugado com uma cadeia lateral de aminoácido, uma cadeia lateral de aminoácido 164 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ activada, um anticorpo modificado com cisteina e semelhantes. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três vastas categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina ou estreptavidina, ou vice-versa. A biotina liga-se selectivamente a estreptavidina e, assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo deste modo indirecto. Alternativamente, para alcançar uma conjugação indirecta do marcador com a variante polipeptidica, a variante polipeptidica é conjugada com um pequeno hapteno (p.ex., digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com uma variante polipeptidica anti-hapteno (p.ex., anticorpo anti-digoxina). Assim, pode ser alcançada conjugação indirecta do marcador com a variante polipeptidica (Hermanson, G. (1996) em "Bioconjugate Technics Academic Press, San Diego). 0 anticorpo do presente invento pode ser empregue em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ELISA, ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos e indirectos, e ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) "Monoclonal Antibodies: A Manual of Technics, págs. 147-158, CRC Press, Inc.).
Um marcador de detecção pode ser útil para a localização, visualização e quantificação de um evento de ligação ou reconhecimento. Os anticorpos marcados do invento podem detectar receptores da superfície celular. Outra utilização para anticorpos marcados de forma detectável é um método de imunocaptura baseado em contas compreendendo a conjugação de uma conta com um anticorpo marcado com fluorescência e detecção de um sinal fluorescente após ligação de um ligando. Metodologias de detecção de ligação semelhantes utilizam o efeito de ressonância de plasmão de superfície (SPR) para medir e detectar interacções anticorpo-antigénio.
Marcadores de detecção tais como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines e Amino Acids", J. Chem. Soc. Perkin-Trans. 1: 1051-1058) proporcionam um sinal detectável e são geralmente aplicáveis para marcação de anticorpos. De preferência com as 165 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ seguintes propriedades: (i) o anticorpo marcado deve produzir um sinal muito elevado com baixo fundo para que pequenas quantidades de anticorpos possam ser sensivelmente detectadas tanto em ensaios livres de células como baseados em células; e (ii) o anticorpo marcado deve ser foto-estável para que o sinal fluorescente possa ser observado, monitorizado e registado sem foto-extinção significante. Para aplicações envolvendo a ligação à superfície celular do anticorpo marcado a membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, os marcadores de preferência (iii) têm boa solubilidade em água para alcançar uma concentração eficaz de conjugado e sensibilidade de detecção e (iv) são não tóxicos para células vivas de modo a não perturbar os processos metabólicos normais das células ou causar morte celular prematura. A quantificação directa da intensidade da fluorescência celular e enumeração de eventos marcados com fluorescência, p.ex. a ligação à superfície celular de conjugados péptido-corante pode ser conduzida num sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza ensaios de mistura-e-leitura, não radioactivos com células vivas ou contas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4: 193-204). As utilizações de anticorpos marcados incluem também ensaios de ligação a receptores da superfície, ensaios de imunocaptura, ensaios imunossorventes ligados a fluorescência (FLISA), clivagem por caspase (Zheng, "Caspase-3 Controls both cytoplasmic e nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 618-23; US 6372907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Métodos 184: 39-51) e ensaios de citotoxicidade. A tecnologia de ensaio fluorométrico em microvolume pode ser utilizada para identificar a sobre-regulação e a sub-regulação por uma molécula que é direccionada à superfície celular (Swartzman, "A homogeneous e multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271: 143-51). 166 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os anticorpos marcados do invento são úteis como biomarcadores e sondas de imagiologia através dos vários métodos e técnicas de imagiologia biomédica e molecular tais como: (i) MRI (imagiologia de ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computorizada), (iii) SPECT (tomografia computadorizada de emissão de um único fotão), (iv) PET (tomografia por emissão de positrões) Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15: 41-49, (v) bioluminescência; (vi) fluorescência, e (vii) ultra-sons. A imunocintigrafia é um procedimento de imagiologia em que os anticorpos marcados com substâncias radioactivas são administrados a um animal ou paciente humano e é tirada uma fotografia dos locais no corpo onde o anticorpo se localiza (US 6528624). Os biomarcadores de imagiologia podem ser objectivamente medidos e avaliados como um indicador de processos biológicos normais, processos patogénicos, ou respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores podem ser de vários tipos: os de Tipo 0 são marcadores de história natural de uma doença e correlacionam-se longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, p.ex., avaliação de MRI de inflamação sinovial em artrite reumatóide; os marcadores de Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de acção, embora o mecanismo possa não estar associado ao resultado clínico; marcadores de Tipo II funcionam como terminais de substituição em que a alteração ou o sinal do biomarcador prevê um benefício clínico para "validar" a resposta direccionada, tal como erosão óssea medida em artrite reumatóide através de CT. Os biomarcadores de imagiologia podem, portanto, proporcionar informação terapêutica farmacodinâmica (PD) sobre: (i) expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de um agente terapêutico à proteína alvo, i.e., selectividade e (iii) dados farmacocinéticos de eliminação e semivida. As vantagens de biomarcadores de imagiologia in vivo em relação a biomarcadores laboratoriais incluem: tratamento não invasivo, quantificável, avaliação de corpo inteiro, dosagem repetitiva e avaliação, i.e. vários momentos, e efeitos potencialmente transferíveis de resultados pré-clínicos (pequeno animal) para clínicos (humano). Para algumas aplicações, a bioimagiologia suplanta ou minimiza o número de experiências com animais em estudos pré-clínicos. 167
ΕΡ 2 176 296/PT
Os métodos de marcação de péptidos são bem conhecidos. Ver Haugland, 2003, "Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes". Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3: 2; Carman. (1997) "Non Radioactive Labelling: A Practical Approach", Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1: 2; Glazer et al., (1975) "Chemical Modification of Proteins. Laboratory Technics in Biochemistry and Molecular Biology" (T. S. Work e E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. e Noyes, C. M. (1984) "Chemical Reagents for Protein Modification". Vols. I e II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins. Modern Methods in Protein Chemistry". H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin e New York; e Wong (1991) "Chemistry of Protein Conjugation e Cross-linking", CRC Press, Boca Raton, Fia.); De Leon-Rodriguez et al. , (2004) Chem. Eur. J. 10: 1149-1155; Lewis et al., (2001) Bioconjugate Chem. 12: 320-324; Li et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 110-115; Mier et al., (2005) Bioconjugate Chem. 16: 240-237.
Os péptidos e as proteínas marcados com duas porções, um repórter fluorescente e um extintor numa proximidade suficiente, sofrem transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Os grupos repórter são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados por luz a um determinado comprimento de onda e transferem energia para um grupo aceitador, ou extintor, com a mudança de Stokes adequada para emissão com máximo brilho. Corantes fluorescentes incluem moléculas com aromaticidade estendida, tais como fluoresceína e rodamina, e seus derivados. O repórter fluorescente pode ser parcialmente ou substancialmente extinto através da porção extintora num péptido intacto. Após clivagem do péptido por uma peptidase ou protease, pode ser medido um aumento detectável na fluorescência (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).
Os anticorpos marcados do invento podem também ser utilizados como um agente de purificação por afinidade. Neste processo, o anticorpo marcado é imobilizado sobre uma fase sólida tal como uma resina Sephadex ou um papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo 168 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ imobilizado é posto em contacto com uma amostra contendo o antigénio a purificar e, subsequentemente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra excepto o antigénio a purificar, que está ligado à variante polipeptídica imobilizada. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão glicina, pH 5,0, que libertará o antigénio da variante polipeptídica.
Os reagentes de marcação possuem tipicamente uma funcionalidade reactiva que pode reagir (i) directamente com um tiol de cisteína de um anticorpo modificado com cisteína para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente ligador para formar um intermediário ligador-marcador, ou (iii) com um anticorpo ligador para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reactiva dos reagentes de marcação inclui: maleimida, haloacetilo, éster de iodoacetamida-succinimidilo (p.ex., NHS, N-hidroxisuccinimida) , isotiocianato, cloreto de sulfonilo, 2,6-diclorotriazinil, éster de pentafluorofenilo, e fosforamidite, embora outros grupos funcionais possam também ser utilizados.
Um grupo funcional reactivo exemplar é éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) de um substituinte do grupo carboxilo de um marcador detectável, p.ex. biotina ou um corante fluorescente. 0 éster de NHS do marcador pode ser preformado, isolado, purificado, e/ou caracterizado, ou pode ser formado in situ e feito reagir com um grupo nucleófilo de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxilo do marcador é activada através de reacção com alguma combinação de um reagente carbodiimida, p.ex. diciclo-hexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente de urónio, p.ex. TSTU (tetrafluoroborato de 0-(N-Succinimidil)-N,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurónio), HBTU (hexafluorofosfato de 0-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio), ou HATU (hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio), um activador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), e N-hidroxissuccinimida para dar o éster de NHS do marcador. Em alguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser ligados através de activação in situ do marcador e reacção com o anticorpo para formar o conjugado anticorpo-marcador em um passo. Outros reagentes activadores e de ligação incluem TBTU 169 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazo-l-il)-1-1,3,3-tetrametilurónio) , TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de N,N',N' ',N' ' '-tetrametilurónio) , PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio) , EEDQ (2-etoxi-l-etoxicarbonil-1,2-di-hidro-quinolina), DCC (diciclo-hexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSNT (1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-lH-l,2,4-triazol, e halogenetos de aril-sulfonilo, p.ex. cloreto de triisopropil-benzenossulfonilo.
Compostos péptido de ligação à albumina-Fab do invento:
Num aspecto, o anticorpo do invento é fundido com uma proteína de ligação a albumina. A ligação a proteínas plasmáticas pode ser um meio eficaz de melhorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. A albumina é a proteína mais abundante no plasma. Os péptidos de ligação à albumina do soro (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas fundidas com domínios activos, incluindo alteração da tomada, penetração e difusão pelos tecidos. Estes parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados através de selecção especifica da sequência do péptido de ligação à albumina do soro apropriada (US 20040001827). Uma série de péptidos de ligação à albumina foram identificados através de pesquisa por apresentação fágica (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding as a General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J. Biol. Chem. 277: 35035-35043; WO 01/45746). Os compostos do invento incluem sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 20040001827 em [0076] SEQ ID NOS: 9-22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12-13, das quais todas são aqui incorporadas por referência. Péptidos de ligação à albumina (ABP)-Fab são concebidos através da fusão de um péptido de ligação à albumina com o terminal C da cadeia pesada de Fab numa razão estequiométrica 1:1 (1 ABP/1 Fab). Foi mostrado que a associação destes ABP-Fab com a albumina aumentava a semivida dos anticorpos em mais de 25 vezes em coelhos e ratinhos. Os resíduos de Cys reactivos descritos acima podem, portanto, ser introduzidos nestes ABP-Fab e utilizados para conjugação especifica do local com fármacos citotóxicos, seguido de estudos animais in vivo. 170 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Exemplos de sequências peptídicas de ligação à albumina incluem, mas não se limitam às sequências de aminoácidos listadas em SEQ ID NOS: 246-250: CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 246 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 247 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 248 RLIEDICLPRWGGLWEDD SEQ ID NO: 249 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 250
Conjugados Anticorpo-Fármaco
Noutro aspecto, o invento proporciona imunoconjugados, ou conjugados anticorpo-fármaco (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (p.ex., uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, vegetal, fúngica ou animal, ou fragmentos desta), ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado). Noutro aspecto, o invento proporciona ainda métodos de utilização dos imunoconjugados. Num aspecto, um imunoconjugado compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD79b acima covalentemente ligado a um agente citotóxico ou um agente detectável.
Num aspecto, um anticorpo de CD79b do invento liga-se ao mesmo epitopo em CD79b a que se liga outro anticorpo de CD79b. Noutra concretização, um anticorpo de CD79b do invento liga-se ao mesmo epitopo em CD79b a que se liga o fragmento Fab de um anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993, um anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) ou um anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável do anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados na ATCC a 20 de Julho de 1993 e domínios constantes de IgGl, ou os domínios variáveis do anticorpo monoclonal compreendendo as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Noutra concretização, um anticorpo de CD79b do invento liga-se ao mesmo epitopo em CD79b a que se liga outro anticorpo de CD79b (i.e., CB3.1 (BD Biosciences Catálogo 171 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Scrotcc Catálogo #MCA2208; Raleigh, NC) , AT107-2 (AbD Scrotcc Catálogo #MC2209), anticorpo anti-CD79b humano (BD Biosciences Catálogo #557592; San Jose, CA)).
Noutro aspecto, um anticorpo de CD79b do invento é distinto de (i.e., não é) um fragmento Fab do anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993, o anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) , ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável do anticorpo gerado a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993 e domínios constantes de IgGl, ou os domínios variáveis do anticorpo monoclonal compreendendo as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Noutra concretização, um anticorpo de CD79b do invento é distinto de (i.e., não é) um fragmento Fab de outro anticorpo CD79b (i.e., CB3.1 (BD Biosciences Catálogo #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catálogo #MCA2208; Raleigh, NC) , AT107-2 (AbD Serotec Catálogo #MCA2209), anticorpo anti-CD79b humano (BD Biosciences Catálogo #557592; San Jose, CA)).
Num aspecto, um anticorpo do invento liga-se especificamente a CD79b de uma primeira espécie animal e não se liga especificamente a CD79b de uma segunda espécie animal. Numa concretização, a primeira espécie animal é humana e/ou primata (p.ex., macaco cinomolgo) , e a segunda espécie animal é murídeo (p.ex., ratinho) e/ou canina. Numa concretização, a primeira espécie animal é humana. Numa concretização, a primeira espécie animal é primata, por exemplo macaco cinomolgo. Numa concretização, a segunda espécie animal é murídeo, por exemplo ratinho. Numa concretização, a segunda espécie animal é canina.
Num aspecto, o invento proporciona composições compreendendo um ou mais anticorpos do invento e um transportador. Numa concretização, o transportador é farmaceuticamente aceitável.
Num aspecto, o invento proporciona ácidos nucleicos codificando um anticorpo de CD79b do invento. 172 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona vectores compreendendo um ácido nucleico do invento.
Num aspecto, o invento proporciona células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico ou um vector do invento. Um vector pode ser de qualquer tipo, por exemplo um vector recombinante tal como um vector de expressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode ser utilizada. Numa concretização, uma célula hospedeira é uma célula procariótica, por exemplo, E. coli. Numa concretização, uma célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo uma célula de mamifero, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
Num aspecto, o invento proporciona métodos para produção de um anticorpo do invento. Por exemplo, o invento proporciona um método de produção de um anticorpo de CD79b (o qual, tal como aqui definido inclui o inteiro e fragmentos deste), o referido método compreendendo a expressão numa célula hospedeira adequada de um vector recombinante do invento codificando o referido anticorpo (ou fragmento deste), e a recuperação do referido anticorpo.
Num aspecto, o invento proporciona um artigo de fabrico compreendendo um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos de CD79b do invento. Numa concretização, a composição compreende um ácido nucleico do invento. Numa concretização, a composição compreendendo um anticorpo compreende ainda um transportador, que nalgumas concretizações é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, um artigo de fabrico do invento compreende ainda instruções para administração da composição (p.ex., o anticorpo) a um sujeito.
Num aspecto, o invento proporciona um estojo compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos de CD79b do invento; e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Numa concretização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista compreende ainda um transportador, que nalgumas 173 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ concretizações é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, um estojo compreende ainda instruções para administração da composição (p.ex., o anticorpo) a um sujeito.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um anticorpo de CD79b do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um ácido nucleico do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um vector de expressão do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto. 174 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, ο invento proporciona a utilização de uma célula hospedeira do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um artigo de fabrico do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona a utilização de um estojo do invento na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como um cancro, um tumor e/ou um distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o cancro, tumor e/ou distúrbio celular proliferativo é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, o referido 175 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ método compreendendo ο contacto da referida célula com um anticorpo do invento causando deste modo uma inibição do crescimento da referida célula. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratar terapeuticamente um mamífero possuindo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo do invento, tratando deste modo eficientemente o referido mamífero. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método para tratamento ou prevenção de um distúrbio celular proliferativo associado a expressão aumentada de CD79b, o referido método compreendendo a administração a um sujeito a necessitar de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, tratando ou prevenindo deste modo eficientemente o referido distúrbio celular proliferativo. Numa concretização, o referido distúrbio proliferativo é cancro. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método para inibição do crescimento de uma célula, em que o crescimento da referida célula é pelo menos em parte dependente de um efeito de potenciação do crescimento de CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, inibindo deste modo o crescimento da referida célula. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento terapêutico de um tumor num mamífero, em que o 176 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ crescimento do referido tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito de potenciação do crescimento de CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento, tratando deste modo eficientemente o referido tumor. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento de cancro compreendendo a administração a um paciente da formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado aqui descrito, diluente, transportador ou excipiente aceitável. Numa concretização, o cancro é seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocitica aguda (ALL) e linfoma de células do manto. Numa concretização, é administrado ao paciente um agente citotóxico em combinação com o composto conjugado anticorpo-fármaco.
Num aspecto, o invento proporciona um método de inibição de proliferação de células B compreendendo a exposição de uma célula a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo do invento sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado com CD79b. Numa concretização, a proliferação de células B é seleccionada a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL) e linfoma de células do manto. Numa concretização, a célula B é um xenoenxerto. Numa concretização, a exposição ocorre in vitro. Numa concretização, a exposição ocorre in vivo.
Num aspecto, o invento proporciona um método de determinação da presença de CD79b numa amostra suspeita de conter CD79b, o referido método compreendendo a exposição da referida amostra a um anticorpo do invento, e a determinação 177 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ da ligação do referido anticorpo a CD79b na referida amostra em que a ligação do referido anticorpo a CD79b na referida amostra é indicativo da presença da referida proteína na referida amostra. Numa concretização, a amostra é uma amostra biológica. Noutra concretização, a amostra biológica compreende células B. Numa concretização, a amostra biológica é de um mamífero experimentando ou suspeito de experimentar um distúrbio de células B e/ou um distúrbio de células B proliferativo incluindo, mas não se limitando a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de células do manto.
Num aspecto, é proporcionado um método de diagnóstico de um distúrbio celular proliferativo associado a um aumento de células, tais como células B, expressando CD79b, o método compreendendo o contacto de células de teste numa amostra biológica com qualquer um dos anticorpos de cima; a determinação do nível de anticorpo ligado a células de teste na amostra através de detecção da ligação do anticorpo a CD79b; e a comparação do nível de anticorpo ligado a células na amostra de controlo, em que o nível de anticorpo ligado é normalizado para o número de células expressando CD79b nas amostras de teste e de controlo, e em que um nível mais elevado de anticorpo ligado na amostra de teste em comparação com a amostra de controlo indica a presença de um distúrbio celular proliferativo associado a células expressando CD79b.
Num aspecto, um método de detecção de CD79b solúvel no sangue ou soro, o método compreendendo o contacto de uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de experimentar um distúrbio de células B proliferativo com um anticorpo anti-CD79b do invento e a detecção de um aumento de CD79b solúvel na amostra de teste relativamente a uma amostra de controlo de sangue ou soro de um mamífero normal. Numa concretização, o método de detecção é útil como método de diagnóstico de um distúrbio de células B proliferativo associado a um aumento de CD79b solúvel no sangue ou soro de um mamífero. 178 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, um método de ligação de um anticorpo do invento a uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com um anticorpo do invento. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Numa concretização, o anticorpo é conjugado com um agente inibidor do crescimento.
Os métodos do invento podem ser utilizados para afectar qualquer estado patológico adequado, por exemplo, células e/ou tecidos associados a expressão de CD79b. Numa concretização, uma célula que é alvo num método do invento é uma célula hematopoética. Por exemplo, uma célula hematopoética pode ser uma seleccionada a partir do grupo consistindo num linfócito, leucócito, plaqueta, eritrócito e célula assassina natural. Numa concretização, uma célula que é alvo num método do invento é uma célula B ou célula T. Numa concretização, uma célula que é alvo num método do invento é uma célula de cancro. Por exemplo, uma célula de cancro pode ser uma seleccionada a partir do grupo que consiste numa célula de linfoma, células de leucemia, ou célula de mieloma.
Os métodos do invento podem ainda compreender passos adicionais de tratamento. Por exemplo, numa concretização, um método compreende ainda um passo em que uma célula e/ou tecido alvo (p.ex., uma célula de cancro) é exposto a tratamento de radiação ou a um agente quimioterapêutico.
Tal como como aqui descrito, CD79b é um componente de sinalização do receptor de células B. Assim, numa concretização dos métodos do invento, uma célula que é alvo (p.ex., um célula de cancro) é uma em que CD79b é expresso em comparação com uma célula que não expressa CD79b. Noutra concretização, a célula alvo é uma célula de cancro em que a expressão de CD79b é aumentada em comparação com uma célula normal sem ser de cancro do mesmo tipo de tecido. Numa concretização, um método do invento causa a morte de uma célula alvo.
Noutros aspectos do presente invento, o invento proporciona vectores compreendendo ADN codificando qualquer uma dos anticorpos aqui descritos. Células hospedeiras 179 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ compreendendo qualquer um desses vectores são também proporcionadas. Para fins de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli, ou células de levedura. Um processo para produção de qualquer um dos anticorpos aqui descritos é ainda proporcionado e compreende a cultura de células hospedeiras sob condições adequadas para expressão do anticorpo desejado e recuperação do anticorpo desejado a partir da cultura celular.
Ainda noutro aspecto, o invento refere-se a uma composição de matéria compreendendo um anticorpo anti-CD79b tal como aqui descrito, em combinação com um transportador. Opcionalmente, o transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto do presente invento é dirigido à utilização de um anticorpo anti-polipéptido CD79b tal como aqui descrito, para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que responde ao anticorpo anti-polipéptido CD79b.
Outro aspecto do invento é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I onde a carga média de fármaco por anticorpo é de cerca de 2 a cerca de 5, ou de cerca de 3 a cerca de 4.
Outro aspecto do invento é uma composição farmacêutica incluindo um composto ADC de Fórmula I, uma mistura de compostos ADC de Fórmula I, ou um sal ou solvato deste farmaceuticamente aceitável, e um diluente, transportador, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto proporciona uma combinação farmacêutica compreendendo um composto ADC de Fórmula I e um segundo composto possuindo propriedades anticancro ou outros efeitos terapêuticos.
Outro aspecto é um método para matar ou inibir a proliferação de células tumorais ou células de cancro compreendendo o tratamento das células com uma quantidade de um conjugado anticorpo-f ármaco de Fórmula 1, ou um sal ou solvato deste farmaceuticamente aceitável, sendo eficaz para matar ou inibir a proliferação de células tumorais ou células de cancro. 180 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Outro aspecto é um método de tratamento de cancro compreendendo a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composição farmacêutica incluindo um ADC de Fórmula I.
Outro aspecto inclui artigos de fabrico, i.e. estojos, compreendendo um conjugado anticorpo-fármaco, um recipiente, e uma bula ou rótulo indicando um tratamento.
Um aspecto do invento é um método para produção de um composto conjugado anticorpo-fármaco de Fórmula I compreendendo os passos de: (a) fazer reagir um grupo de cisteina introduzida do anticorpo modificado com cisteina com um reagente ligador para formar um intermediário ligador a anticorpos Ab-L; e (b) fazer reagir Ab-L com uma porção fármaco activada D; pelo que é formado o conjugado anticorpo-fármaco; ou compreendendo os passos de: (c) fazer reagir um grupo nucleófilo de uma porção fármaco com um reagente ligador para formar um intermediário ligador a fármacos D-L; e (d) fazer reagir D-L com um grupo de cisteina introduzida do anticorpo modificado com cisteina; pelo que é formado o conjugado anticorpo-fármaco.
Um aspecto do invento é um ensaio para detecção de células de cancro compreendendo: (a) exposição de células a um conjugado anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco; e (b) determinação da extensão da ligação do composto conjugado anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina-fármaco às células. A. Anticorpos Anti-CD79b
Numa concretização, o presente invento proporciona anticorpos anti-CD79b que podem ter utilização aqui como agentes terapêuticos. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos e heteroconjugados. 1. Anticorpos Policlonais
Os anticorpos policlonais são de preferência criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. 181 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Pode ser útil conjugar o antigénio relevante (especialmente quando são utilizados péptidos sintéticos) com uma proteina que seja imunogénica na espécie a imunizar. Por exemplo, o antigénio pode ser conjugado com hemocianina da lapa (KLH), albumina do soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor da tripsina da soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivação, p.ex., éster maleimidobenzoil-sulfossuccinimida (conjugação através de residuos de cisteina), N-hidroxisuccinimida (através de residuos de lisina) , glutaraldeido, anidrido succinico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados, através de combinação, p.ex., de 100 pg ou 5 pg da proteina ou do conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e de injecção da solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao titulo de anticorpo. Os animais são reforçados até o título alcançar um patamar. Os conjugados podem também ser produzidos em cultura de células recombinantes como fusões proteicas. Também, agentes aglomerantes tais como alúmen são adequadamente utilizados para aumentar a resposta imunitária. 2. Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos monoclonais podem ser feitos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (Patente U.S. No. 4816567).
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado tal como descrito acima para desencadear linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados In vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e depois fundidos com uma linha celular de mieloma utilizando um agente de fusão 182 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies e Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibam o crescimento ou a sobrevivência das células parentais de mieloma não fundidas (também referidas como parceiros de fusão). Por exemplo, se as células parentais de mieloma não tiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selectivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Células de mieloma parceiras de fusão preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam uma produção estável de elevado nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas, e são sensíveis a um meio selectivo que selecciona contra as células parentais não fundidas. Linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murídeo, tais como as derivadas dos tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego. Califórnia USA, e SP-2 e derivadas, p.ex., células X63-Ag8-653 disponíveis na American Tipo Culture Collection, Manassas, Virgínia, USA. Linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma ratinho-humano foram também descritas quanto à produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al.r "Monoclonal Antibody Production Technics and Applications", págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)) . O meio de cultura em que as células de hibridoma crescem é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). 183 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Uma vez identificadas células de mieloma que produzam os anticorpos de especificidade, afinidade, e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como tumores de ascites num animal p.ex., através de injecção i.p. das células em ratinhos.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites, ou soro através de procedimentos de purificação de anticorpos convencionais tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (p.ex., utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de permuta iónica, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise, etc. 0 ADN codificando os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotidicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que de outro modo não produzem a proteína do anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais em células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN codificando o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992) .
Noutra concretização, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de 184 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ bibliotecas fágicas de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murideo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (intervalo nM) através de baralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para construção de bibliotecas fágicas muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir polipéptidos de anticorpos quiméricos ou de fusão, por exemplo, através da substituição das sequências do domínio constante de cadeia pesada e cadeia leve de murideo (CH e CL) pelas sequências humanas homólogas (Patente U.S. No. 4816567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81: 6851 (1984)), ou através de fusão da sequência codificando a imunoglobulina com toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina (polipéptido heterólogo). As sequências polipeptídicas sem serem de imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou substituir os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio diferente. 3. Anticorpos Humanos e Humanizados
Os anticorpos anti-CD79b do invento podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (p.ex., de murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de uma 185 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em gue os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos estruturais de Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se verifiquem no anticorpo receptor nem na CDR importada nem nas sequências estruturais. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado de forma óptima compreenderá também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)) . Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colegas (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), através da substituição de CDR ou sequências de CDR humanas pelas correspondentes sequências de um anticorpo de roedor. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4816567), em que substancialmente menos de cerca de um domínio variável humano intacto foi substituído pela correspondente sequência de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e 186 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ possivelmente alguns resíduos de FR sao substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto da leve como da pesada, a utilizar na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e resposta HAMA (anticorpo humano anti-ratinho) quando se pretende o anticorpo para utilização terapêutica humana. A redução ou eliminação de uma resposta HAMA é um aspecto significativo do desenvolvimento clínico de agentes terapêuticos adequados. Ver, p.ex., Khaxzacli et al., J. Natl. Câncer Inst. (1988), 80: 937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41: 572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3: 138; Miller et al., Blood (1983), 62: 988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332: 323; Junghans et al., Câncer Res. (1990), 50: 1495. Tal como aqui descrito, o invento proporciona anticorpos que são humanizados para que a resposta HAMA seja reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ainda ser obtidas utilizando métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais são melhor descritos abaixo. De acordo com o método designado de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecidas. É identificada a sequência do domínio V humano que está mais próxima da de roedor e a região estrutural humana (FR) dentro desta é aceite para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma determinada região estrutural derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993)).
Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo tal como aqui descrito pode servir como uma sequência de partida (mãe) para diversificação da sequência ou sequências estruturais e/ou hipervariáveis. Uma sequência estrutural seleccionada à qual é ligada uma sequência hipervariável de 187 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ partida é aqui referida como uma estrutura aceitadora humana. Enquanto as estruturas aceitadoras humanas podem ser de, ou derivadas de, uma imunoglobulina humana (as regiões VL e/ou VH desta), de preferência as estruturas aceitadoras humanas são de, ou derivadas de, uma sequência estrutural de consenso humana uma vez que se demonstrou que tais estruturas têm uma imunogenicidade mínima, ou nenhuma, em pacientes humanos.
Quando o aceitador é derivado de uma imunoglobulina humana, pode-se seleccionar opcionalmente uma sequência estrutural humana que seja seleccionada com base na sua homologia com a sequência estrutural dadora através de alinhamento da sequência estrutural dadora com várias sequências estruturais humanas numa colecção de sequências estruturais humanas, e seleccionar a sequência estrutural mais homóloga como aceitadora.
Numa concretização, as estruturas de consenso humanas aqui são de, ou derivadas de, sequências estruturais de consenso de VH subgrupo III e/ou VL capa subgrupo I.
Assim, a estrutura aceitadora humana VH pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes sequências estruturais: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo RFTISXiDX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 147), em que Xi é A ou R, X2 é T ou N, e X3 é A ou L, FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
Exemplos de estruturas de consenso de VH incluem: estrutura de consenso de VH subgrupo I humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 108); estrutura de consenso de VH subgrupo I humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 109-111); estrutura de consenso de VH subgrupo II humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 112); estrutura de consenso de VH subgrupo II humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 113-115); 188 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ estrutura de consenso de VH subgrupo III humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 116); estrutura de consenso de VH subgrupo III humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 117-119); estrutura aceitadora de VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 120); estrutura aceitadora de VH humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 121-122); estrutura 2 aceitadora de VH humana menos CDR de Kabat (SEQ ID NO: 123); ou estrutura 2 aceitadora de VH humana menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 124-126).
Numa concretização, a estrutura aceitadora humana de VH compreende uma, duas, três ou todas as seguintes sequências estruturais: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 148), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 150), ou RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 151) FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146). A estrutura aceitadora humana de VL pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes sequências estruturais: FR1 compreendendo DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139), FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140), FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142).
Exemplos de estruturas de consenso de VL incluem: 189 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
estrutura NO: 127); de consenso de VL capa subgrupo I humana (SEQ ID estrutura NO: 128); de consenso de VL capa subgrupo II humana (SEQ ID estrutura NO: 129); de ou consenso de VL capa subgrupo III humana (SEQ ID estrutura NO: 130). de consenso de VL capa subgrupo IV humana (SEQ ID
Embora ο aceitador possa ser idêntico em sequência à sequência estrutural humana seleccionada, seja de uma imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, o presente invento contempla que a sequência aceitadora possa compreender substituições de aminoácidos pré-existentes em relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência estrutural de consenso humana. Estas substituições pré-existentes são, de preferência, mínimas; geralmente apenas quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácidos relativamente à sequência de imunoglobulina humana ou à sequência estrutural de consenso.
Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados nas estruturas aceitadoras humanas de VL e/ou VH. Por exemplo, pode-se incorporar resíduos correspondentes aos resíduos de CDR de Kabat, os resíduos da volta hipervariável de Chothia, os resíduos Abm, e/ou resíduos de contacto. Opcionalmente, são incorporados os resíduos da região hipervariável alargada como se segue: 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35B (Hl), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102,94-102, ou 95-102 (H3).
Embora a "incorporação" de resíduos da região hipervariável seja aqui discutida, será apreciado que esta pode ser alcançada de vários modos, por exemplo, o ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos desejada pode ser gerado através de mutação do ácido nucleico codificando a sequência do domínio variável de ratinho para que os resíduos estruturais deste sejam mudados para resíduos estruturais aceitadores humanos, ou através de mutação do ácido nucleico codificando a sequência do domínio variável humano para que os resíduos do domínio hipervariável sejam mudados para resíduos 190 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ não humanos, ou através de síntese do ácido nucleico codificando a sequência desejada, etc.
Nos exemplos aqui, variantes enxertadas com região hipervariável foram geradas através de mutagénese de Kunkel de ácido nucleico codificando as sequências aceitadoras humanas, utilizando um oligonucleótido separado para cada região hipervariável. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987). As mudanças apropriadas podem ser introduzidas dentro da região estrutural e/ou hipervariável, utilizando técnicas de rotina, para corrigir e reestabelecer as interacções região hipervariável-antigénio correctas. A apresentação fágica (fagomídica) (também aqui referida como apresentação fágica nalguns contextos) pode ser utilizada como um método conveniente e rápido para gerar e pesquisar muitos potenciais anticorpos variantes diferentes numa biblioteca gerada através de aleatorização. No entanto, outros métodos para produção e pesquisa de anticorpos alterados estão disponíveis ao perito. A tecnologia de apresentação fágica (fagomídica) proporcionou uma poderosa ferramenta para a criação e selecção de novas proteínas que se ligam a um ligando, tal como um antigénio. A utilização das técnicas de apresentação fágica (fagomídica) permite a geração de grandes bibliotecas de variantes proteicas que podem ser rapidamente seleccionadas quanto às sequências que se ligam a uma molécula alvo com elevada afinidade. Os ácidos nucleicos codificando polipéptidos variantes são geralmente fundidos com uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de revestimento virai, tal como a proteína do gene III ou a proteína do gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de apresentação fagomídica monovalentes onde a sequência de ácido nucleico codificando a proteína ou o polipéptido é fundida com uma sequência de ácido nucleico codificando uma porção da proteína do gene III (Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman e Wells, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology", 3: 205 (1991)). Num sistema de apresentação fagomídica monovalente, a fusão génica é expressa a níveis baixos e proteínas do gene III de tipo selvagem são também expressas para que a infecciosidade das partículas seja 191 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ mantida. Os métodos de geração de bibliotecas peptídicas e de pesquisa dessas bibliotecas foram divulgados em muitas patentes (p.ex. Patente U.S. No. 5723286, Patente U.S. No. 5432018, Patente U.S. No. 5580717, Patente U.S. No. 5427908 e Patente U.S. No. 5498530).
Bibliotecas de anticorpos ou polipéptidos de ligação ao antigénio foram preparadas de vários modos, incluindo através de alteração de um único gene através de inserção de sequências de ADN aleatórias ou através de clonagem de uma família de genes aparentados. Os métodos para apresentação de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio, utilizando apresentação fágica (fagomídica) foram descritos nas Patentes U.S. Nos. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 e 5658727. A biblioteca é então pesquisada quanto à expressão de anticorpos ou proteínas de ligação ao antigénio com as características desejadas.
Os métodos de substituição de um aminoácido de escolha num ácido nucleico molde estão bem estabelecidos na técnica, alguns dos quais são aqui descritos. Por exemplo, resíduos da região hipervariável podem ser substituídos utilizando o método de Kunkel. Ver, por exemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987). A sequência de oligonucleótidos inclui um ou mais dos conjuntos de codões concebidos para os resíduos da região hipervariável a alterar. Um conjunto de codões é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleótidos utilizadas para codificar os aminoácidos variantes desejados. Os conjuntos de codões podem ser representados utilizando símbolos para designar determinados nucleótidos ou misturas equimolares de nucleótidos tal como mostrado abaixo de acordo com o código IUB.
CÓDIGOS IUB G guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) 192 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Y (C OU T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A ou c ou T) B (C ou G ou T) V (A ou C ou G) D (A ou G ou T) N (A ou C ou G
Por exemplo, no conjunto de codões DVK, D pode ser os nucleótidos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de codões pode apresentar 18 codões diferentes e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys.
Os conjuntos de oligonucleótidos ou iniciadores podem ser sintetizados utilizando métodos padrão. Um conjunto de oligonucleótidos pode ser sintetizado, por exemplo, através de síntese em fase sólida, contendo sequências que representam todas as possíveis combinações de tripletos de nucleótidos proporcionadas pelo conjunto de codões e que codificarão o grupo de aminoácidos desejado. A síntese de oligonucleótidos com "degenerescência" nucleotídica seleccionada em certas posições é bem conhecida nessa técnica. Tais conjuntos de nucleótidos possuindo certos conjuntos de codões podem ser sintetizados utilizando sintetizadores comerciais de ácidos nucleicos (disponíveis em, por exemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) , ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, em Life Technologies, Rockville, MD) . Portanto, um conjunto de oligonucleótidos sintetizados possuindo um determinado conjunto de codões incluirá tipicamente uma pluralidade de oligonucleótidos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de codões dentro da sequência global. Os oligonucleótidos, tal como utilizados de acordo com o invento, têm sequências que permitem a hibridação com um ácido nucleico do domínio variável padrão e podem também incluir locais de enzimas de restrição para fins de clonagem. 193 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num método, as sequências de ácido nucleico codificando aminoácidos variantes podem ser criadas através de mutagénese mediada por oligonucleótidos. Esta técnica é bem conhecida na arte tal como descrito por Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). Resumidamente, sequências de ácido nucleico codificando aminoácidos variantes são criadas através de hibridação de um conjunto de oligonucleótidos codificando os conjuntos de codões desejados para um molde de ADN, onde o molde é a forma de cadeia simples do plasmideo contendo uma sequência de ácido nucleico molde da região variável. Após hibridação, ADN-polimerase é utilizada para sintetizar uma segunda cadeia complementar inteira do molde que incorporará assim o iniciador oligonucleotidico, e conterá os conjuntos de codões conforme proporcionados pelo conjunto oligonucleotidico.
Geralmente, são utilizados oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido óptimo terá 12 a 15 nucleótidos que são completamente complementares ao molde de ambos os lados do nucleótido ou nucleótidos codificando para a mutação ou mutações. Isto assegura que o oligonucleótido hibridará correctamente com a molécula de ADN molde de cadeia simples. Os oligonucleótidos são facilmente sintetizados utilizando técnicas conhecidas na arte tais como as descritas por Crea et al., Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA, 75: 5765 (1978). O molde de ADN é gerado através daqueles vectores que são derivados de vectores do bacteriófago M13 (os vectores M13mpl8 e M13mpl9 comercialmente disponíveis são adequados), ou daqueles vectores que contêm uma origem de replicação fágica de cadeia simples tal como descrito por Viera el al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Assim, o ADN a mutar pode ser inserido num destes vectores para gerar molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples é descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., acima.
Para alterar a sequência de ADN nativa, o oligonucleótido é hibridado com o molde de cadeia simples sob condições de hibridação adequadas. Uma enzima de polimerização de ADN, habitualmente ADN-polimerase T7 ou o fragmento Klenow da ADN-polimerase I, é então adicionada para sintetizar a cadeia 194 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ complementar do molde utilizando o oligonucleótido como iniciador para a síntese. É assim formada uma molécula heteroduplex tal que uma cadeia de ADN codifica a forma mutada do gene 1, e a outra cadeia (o molde original) codifica a sequência do gene 1 nativa e inalterada. Esta molécula heteroduplex é então transformada numa célula hospedeira adequada, habitualmente um procariota tal como E. coli JM101. Após crescimento das células, estas são plaqueadas em placas de agarose e pesquisadas utilizando o iniciador oligonucleotídico marcado radioactivamente com um 32-Fosfato para identificar as colónias bacterianas que contêm o ADN mutado. 0 método descrito imediatamente acima pode ser modificado para que uma molécula homoduplex seja criada em que ambas as cadeias do plasmídeo contêm a mutação ou mutações. As modificações são como se segue: 0 oligonucleótido de cadeia simples é ligado ao molde de cadeia simples tal como descrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP) , desoxirriboguanosina (dGTP), e desoxirribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada designada dCTP-(aS) (que pode ser obtida em Amersham). Esta mistura é adicionada ao complexo molde-oligonucleótido. Após adição de ADN-polimerase a esta mistura, é gerada uma cadeia de ADN idêntica ao molde excepto quanto às bases mutadas. Adicionalmente, esta nova cadeia de ADN conterá dCTP-(aS) em vez de dCTP, que serve para a proteger da digestão com endonucleases de restrição. Após a cadeia molde do heteroduplex de cadeia dupla ser cortada com uma enzima de restrição apropriada, a cadeia molde pode ser digerida com a nuclease ExoIII ou outra nuclease apropriada após a região que contém o local ou locais a mutar. A reacção é então parada para deixar uma molécula que seja apenas parcialmente de cadeia simples. Uma homoduplex de ADN de cadeia dupla completo é então formado utilizando ADN-polimerase na presença de todos os quatro desoxirribonucleótidos-trifosfato, ATP, e ADN-ligase. Esta molécula homoduplex pode então ser transformada numa célula hospedeira adequada.
Tal como indicado anteriormente a sequência do conjunto de oligonucleótidos é de comprimento suficiente para hibridar 195 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ com ο ácido nucleico molde e pode também, mas não necessariamente, conter locais de restrição. 0 molde de ADN pode ser gerado através daqueles vectores que são derivados de vectores do bacteriófago M13 ou vectores que contenham uma origem de replicação fágica de cadeia simples tal como descrito por Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Assim, o ADN a mutar tem de ser inserido num destes vectores para gerar molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples é descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.
De acordo com outro método, a ligação ao antigénio pode ser restaurada durante a humanização de anticorpos através da selecção de regiões hipervariáveis reparadas (ver Pedido No. 11/061841, apresentado a 18 de Fevereiro de 2005). O método inclui a incorporação de regiões hipervariáveis não humanas numa estrutura aceitadora e introdução ainda de uma ou mais substituições de aminoácidos numa ou mais regiões hipervariáveis sem modificação da sequência estrutural aceitadora. Alternativamente, a introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos pode ser acompanhada de modificações na sequência estrutural aceitadora.
De acordo com outro método, uma biblioteca pode ser gerada proporcionando conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, cada conjunto possuindo uma multiplicidade de oligonucleótidos com diferentes sequências, as diferentes sequências estabelecidas pelos conjuntos de codões proporcionados dentro da sequência dos oligonucleótidos. Os conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, juntamente com uma sequência de ácido nucleico molde do dominio variável, podem ser utilizados numa reacção em cadeia da polimerase para gerar uma "biblioteca" de produtos de PCR. Os produtos de PCR podem ser referidos como "cassetes de ácido nucleico", uma vez que podem ser fundidos com outras sequências de ácido nucleico relacionadas ou não relacionadas, por exemplo, proteínas de revestimento virai e domínios de dimerização, utilizando técnicas de biologia molecular estabelecidas. A sequência dos iniciadores de PCR inclui um ou mais dos conjuntos de codões concebidos para as posições acessíveis ao 196 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ solvente e altamente diversas numa região hipervariável. Tal como descrito acima, um conjunto de codões é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleótidos utilizadas para codificar os aminoácidos variantes desejados.
Os anticorpos seleccionados que verificam os critérios desejados, conforme seleccionados através dos passos de pesquisa/selecção apropriados podem ser isolados e clonados utilizando técnicas recombinantes padrão. É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com manutenção da elevada afinidade de ligação ao antigénio e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares aos peritos na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências receptoras e de importação para que seja alcançada a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antigénio(s) alvo(s). Em geral, os resíduos da região hipervariável estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio. Várias formas de um anticorpo anti-CD79b humanizado estão contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto. 197 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (p.ex. ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção da imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica da região de união da cadeia pesada do anticorpo do anticorpo (JH) em ratinhos quiméricos e de linha germinativa mutante resulta em completa inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série génica de imunoglobulina da linha germinativa humana para tal ratinho de linha germinativa mutante resultará na produção de anticorpos humanos após confronto com o antigénio. Ver, p.ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in
Imuno., 7: 33 (1993); Patentes U.S. Nos. 5545806, 5569825, 5591669 (todas de GenPharm) ; 5545807; e WO 97/17852.
Alternativamente, a tecnologia de apresentação fágica (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulinas de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpo são clonados enquadrados num gene de proteína de revestimento principal ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos funcionais de anticorpo à superfície da partícula fágica. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma fágico, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também na selecção do gene codificando o anticorpo exibindo essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades das células B. A apresentação fágica pode ser efectuada numa variedade de formatos, revisto em, p.ex., Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993) . Várias fontes de segmentos do gene de V podem ser utilizadas para apresentação fágica. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes de V derivada dos baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes de V de dadores 198 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma série diversa de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al. , EMBO J. 12: 725-734 (1993). Ver, também, Patentes U.S. Nos. 5565332 e 5573905.
Tal como discutido acima, os anticorpos humanos podem também ser gerados através de células B activadas in vitro (ver Patentes US Nos. 5567610 e 5229275). 4. Fragmentos de anticorpo
Em certas circunstâncias existem vantagens na utilização de fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite uma eliminação rápida, e pode conduzir a um melhor acesso a tumores sólidos.
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al., Journal of Biochemical e Bíophyslcal Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem ser agora produzidos directamente através de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem ser todos expressos em, e segregados a partir de, E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. O fragmento Fab e F(ab')2 com maior semivida in vivo compreendendo resíduos de um epitopo de ligação ao receptor de salvação são descritos na Patente U.S. No. 5869046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão aparentes aos peritos executantes. Noutras concretizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de 199 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185; Patente U.S. No. 5571894; e Patente U.S. No. 5587458. Fv e sFv são a única espécie com locais de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes; assim, são adequados para redução de ligação não específica durante a utilização in vivo. Proteínas de fusão de sFv podem ser construías para produzir a fusão de uma proteína efectora num dos terminais amino ou carboxilo de um sFv. Ver "Antibody Engineering", ed. Borrebaeck, supra. Os fragmentos de anticorpo podem também ser um "anticorpo linear", p.ex., tal como descrito na Patente U.S. 5641870 por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecificos ou biespecificos. 5. Anticorpos Biespecificos
Anticorpos biespecificos são anticorpos que possuem especificidades de ligação a pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecificos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes de uma proteína CD79b tal como aqui descrito. Outros desses anticorpos podem combinar um local de ligação a CD79b com um local de ligação a outra proteína. Alternativamente, um braço de anti-CD79b pode ser combinado com um braço que se ligue a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula de um receptor de células T (p.ex. CD3) , ou receptores de Fc para IgG (FcyR) , tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de modo a focar e localizar mecanismos de defesa celular na célula expressando CD79b. Os anticorpos biespecificos podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem CD79b. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a CD79b e um braço que se liga ao agente citotóxico (p.ex., saporina, anti-interferão-α, alcaloide vinca, cadeia A de rícino, metotrexato ou hapteno isótopo radioactivo). Anticorpos biespecificos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpo (p.ex., anticorpos biespecificos F(ab')2) · WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcYRIII biespecífico e a Patente U.S. No. 5837234 divulga um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/anti-FcYRI. Um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fca é mostrado em WO98/02463. A Patente U.S. No. 5821337 ensina um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3. 200 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos inteiros baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305: 537-539 (1983)). Devido à separação aleatória das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é habitualmente feita através de passos de cromatografia de afinidade, é bastante difícil, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829, e em Traunecker et ai., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulinas. De preferência, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menos parte das regiões charneira, CH2, e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o local necessário para ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados, e são co-transfectados numa célula hospedeira adequada. Isto proporciona maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações quando as razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam o rendimento óptimo do anticorpo biespecífico desejado. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num único vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm um efeito significativo no rendimento da combinação de cadeias desejada.
Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são constituídos por uma cadeia 201 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrido (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada em WO 94/04690. Para mais detalhes de geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo. Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. No. 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 . Neste método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (p.ex., tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensadoras de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia ou cadeias laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo através da substituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes por umas menores (p.ex., alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de reticulação ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. No. 4676980), e para tratamento de infecção de HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089) . Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Tais agentes de reticulação são bem conhecidos na técnica, e são divulgados na Patente U.S. No. 4676980, juntamente com várias técnicas de reticulação. 202 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Técnicas para geração de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecificos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e prevenir a formação de dissulfuretos intermoleculares. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. O progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente ligados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico totalmente humanizada F(ab')2. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado a partir de E. coli e sujeito a ligação química dirigida in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células sobre-expressando o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como de desencadear a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humanos. Várias técnicas para produção e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecificos directamente a partir da cultura de células recombinantes foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecificos foram produzidos utilizando fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Os péptidos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão génica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região charneira para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a 203 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para produção de fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um VH ligado a um VL através de um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Concordantemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando deste modo dois locais de ligação ao anticorpo. Outra estratégia para produção de fragmentos de anticorpo biespecificos através da utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (sFv) foi também relatada. Ver Gruber et al.f J. Immunol., 152: 5368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos trispecificos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991). 6. Anticorpos Heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados estão também dentro do âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são constituídos por dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. No. 4676980], e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360; WO 92/2011373; EP 03089) . Está contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese proteica, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reacção de permuta de dissulfuretos ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na Patente U.S. No. 4676980. 7. Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais depressa que um anticorpo bivalente por uma célula expressando um antigénio ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos do presente invento podem ser anticorpos 204 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ multivalentes (que são diferentes dos da classe IgM) com três ou mais locais de ligação ao antigénio (p.ex. anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos através de expressão recombinante de ácido nucleico codificando as cadeias polipeptidicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação ao antigénio. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região charneira. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais locais de ligação ao antigénio amino-terminais à região Fc. O anticorpo multivalente aqui preferido compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas de preferência quatro, locais de ligação ao antigénio. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptidica (e de preferência duas cadeias polipeptidicas), em que a cadeia ou cadeias polipeptidicas compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptidicas podem compreender VDI-(XI)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VDI é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptidica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptidicas podem compreender: cadeia VH-CHl-ligador flexível-VH-CHl-região Fc; ou cadeia VH-CHl-VH-CHl-região Fc. O anticorpo multivalente aqui compreende de preferência ainda pelo menos dois (e de preferência quatro) polipéptidos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente aqui pode, por exemplo, compreender de cerca de dois a cerca de oito polipéptidos de domínio variável de cadeia leve. Os polipéptidos de domínio variável de cadeia leve aqui contemplados compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda um domínio CL. 8. Engenharia da Função Efectora
Pode ser desejável modificar o anticorpo do invento em relação às funções efectoras, p.ex., para aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente do antigénio (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, o resíduo ou 205 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo deste modo a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma capacidade de internalização melhorada e/ou maior matança celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes. B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com maior actividade anti-tumoral podem também ser preparados utilizando ligadores cruzados heterobifuncionais tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser modificado um anticorpo que possua regiões Fc duplas e pode deste modo ter maiores capacidades de lise do complemento e de ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Para aumentar a semivida sérica do anticorpo, pode incorporar-se um epitopo de ligação ao receptor de salvação no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) tal como descrito na Patente U.S. 5739277, por exemplo. Tal como aqui utilizado, o termo "epitopo de ligação ao receptor de salvação" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (p.ex., IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida sérica in vivo da molécula de IgG. 9. Imunoconjugados O invento refere-se também a imunoconjugados (alternadamente referidos como "conjugados anticorpo-fármaco", ou "ADC") compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (p.ex., uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, ou fragmentos desta), ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado).
Em certas concretizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente activas e fragmentos destas que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos activos que não se ligam da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas 206 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aeruginosa), cadeia A do rícino, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I,131ln. 90Y, e 186Re. Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando uma variedade de agentes de ligação de proteínas bifuncionais tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo-HCL), ésteres activos (tais como suberato de disuccinimidilo) , aldeídos (tais como glutaraldeído) , compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina) , derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina) , diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada tal como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). O ácido isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminopentaacético 14 (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleótidos ao anticorpo. Ver WO94/11026.
Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, péptidos de auristatina, tais como monometilauristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina), maitansinóides, tais como DM1, um tricoteno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem actividade de toxina, são também aqui contemplados.
Imunoconjugados Exemplares - Conjugados Anticorpo-Fármaco
Um imunoconjugado (ou "conjugado anticorpo-fármaco" ("ADC") ) do invento pode ser de Fórmula I, abaixo, em que um anticorpo é conjugado (i.e., ligado covalentemente) a uma ou mais porções fármaco (D) através de um ligador opcional (L) . Os ADC podem incluir conjugados tioMAb-fármaco ("TDC"). 207 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Ab-(L-D)ρ I
Concordantemente, ο anticorpo pode ser conjugado com o fármaco directamente ou através de um ligador. Na Fórmula I, p é o número médio de porções fármaco por anticorpo, que pode variar, p.ex., de cerca de 1 a cerca de 20 porções fármaco por anticorpo, e em certas concretizações, de 1 a cerca de 8 porções fármaco por anticorpo. 0 invento inclui uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I onde a carga média de fármaco por anticorpo é de cerca de 2 a cerca de 5, ou de cerca de 3 a cerca de 4. a. Ligadores Exemplares
Um ligador pode compreender um ou mais componentes ligadores. Componentes ligadores exemplares incluem 6- maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" ou "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenxiloxicarbonilo (um "PAB"), e aqueles resultantes de conjugação com reagentes ligadores: 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC", também aqui referido como "MCC"), e (4-iodo- acetil)aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB"). Vários componentes ligadores são conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo.
Um ligador pode ser um "ligador clivável", facilitando a libertação de um fármaco na célula. Por exemplo, pode ser utilizado um ligador instável em ácido (p.ex., hidrazona), ligador sensivel a protease (p.ex., sensivel a peptidase), ligador foto-lábil, ligador de dimetilo ou ligador contendo dissulfureto (Chari et ai., Câncer Research 52: 127-131 (1992); Patente U.S. No. 5208020).
Em certas concretizações, um ligador é tal como mostrado na seguinte Fórmula II:
-Aa-Ww-Yy- II em que A é uma unidade de prolongamento, e a é um inteiro de 0 a 1; W é uma unidade de aminoácidos, e w é um inteiro de 0 a 208 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 12; Υ é uma unidade espaçadora, e y é 0, 1, ou 2; e Ab, D e p são definidos tal como acima para a Fórmula I. As concretizações exemplares de tais ligadores são descritas em US 2005-0238649 Al, que é expressamente aqui incorporada por referência.
Nalgumas concretizações, um componente ligador pode compreender uma "unidade de prolongamento" que liga um anticorpo a outro componente ligador ou a uma porção fármaco. Unidades de prolongamento exemplares são mostradas abaixo (em que a linha ondulada indica locais de ligação covalente a um anticorpo):
O
Nalgumas concretizações, um componente ligador pode compreender uma unidade de aminoácidos. Numa dessas concretizações, a unidade de aminoácidos permite a clivagem do 209 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligador por uma protease, facilitando deste modo a libertação do fármaco a partir do imunoconjugado após exposição a proteases intracelulares, tais como enzimas lisossómicas. Ver, p.ex., Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784. Unidades de aminoácidos exemplares incluem, mas não se limitam a, um dipéptido, um tripéptido, um tetrapéptido, e um pentapéptido. Dipéptidos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); ou N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Tripéptidos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Uma unidade de aminoácidos pode compreender resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, tais como citrulina. As unidades de aminoácidos podem ser desenhadas e optimizadas na sua selectividade para clivagem enzimática através de uma determinada enzima, por exemplo, uma protease associada a um tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.
Nalgumas concretizações, um componente ligador pode compreender uma unidade "espaçadora" que liga o anticorpo a uma porção fármaco, directamente ou por meio de uma unidade de prolongamento e/ou uma unidade de aminoácidos. Uma unidade espaçadora pode ser "auto-imolativa" ou "não auto-imolativa". Uma unidade espaçadora "não auto-imolativa" é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à porção fármaco após clivagem enzimática (p.ex., proteolítica) do ADC. Exemplos de unidade espaçadoras não auto-imolativas incluem, mas não se limitam a, uma unidade espaçadora de glicina e uma unidade espaçadora glicina-glicina. Outras combinações de espaçadores peptídicos susceptíveis a clivagem enzimática específica da sequência estão também contempladas. Por exemplo, a clivagem enzimática de um ADC contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina por uma protease associada a uma célula tumoral resultaria na libertação de uma porção glicina-glicina-fármaco do restante do ADC. Numa tal concretização, a porção glicina-glicina-fármaco é então sujeita a um passo de hidrólise separado na célula tumoral, clivando assim a unidade espaçadora glicina-glicina da porção fármaco. 210 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Uma unidade espaçadora "auto-imolativa" permite a libertação da porção fármaco sem um passo de hidrólise separado. Em certas concretizações, uma unidade espaçadora de um ligador compreende uma unidade p-aminobenzilo. Numa tal concretização, um álcool p-aminobenzílico é ligado a uma unidade de aminoácidos através de uma ligação amida, e é produzido um carbamato, metilcarbamato, ou carbonato entre o álcool benzilico e um agente citotóxico. Ver, p.ex., Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103. Numa concretização, a unidade espaçadora é p-aminobenziloxicarbonilo (PAB). Em certas concretizações, a porção fenileno de uma unidade p-aminobenzilo é substituída com Qm, em que Q é alquilo -Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs) , -halogénio,-nitro ou -ciano; e m é um inteiro variando de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras auto-imolativas incluem ainda, mas não se limitam a, compostos aromáticos que sejam electronicamente semelhantes a álcool p-aminobenzílico (ver, p.ex., US 2005/0256030 Al) , tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) e orto- ou para-aminobenzilacetais. Podem ser utilizados espaçadores que sofrem ciclização após hidrólise da ligação amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2: 223); sistemas de anéis biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94: 5815); e amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55: 5867). A eliminação de fármacos contendo amina que são substituídos na posição α da glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27: 1447) são também exemplos de espaçadores auto-imolativos úteis em ADC.
Numa concretização, a unidade espaçadora é uma unidade de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificada tal como representado abaixo, que pode ser utilizada para incorporar e libertar múltiplos fármacos. 211 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
clivagem enzimática ν 2 fármacos em que Q é alquilo -Ci-C8, -0-(alquilo Ci-Cs), -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a cerca de 20.
Noutra concretização, o ligador L pode ser um ligador de tipo dendritico para ligação covalente de mais de uma porção fármaco através de uma porção ligadora ramificada, multifuncional a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003)
Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Os ligadores dendriticos podem aumentar a razão molar de fármaco para anticorpo, i.e. a carga, que está relacionada com a potência do ADC. Assim, quando um anticorpo modificado com cisteina possui apenas um grupo tiol reactivo de cisteina, uma multiplicidade de porções fármaco pode ser ligada através de um ligador dendritico.
Componentes ligadores exemplares e combinações destes são mostrados abaixo no contexto dos ADC de Fórmula II: 212 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
MC-val-cíl Ο
Os componentes ligadores, incluindo unidades de prolongamento, espaçadoras e de aminoácidos, podem ser sintetizados através de métodos conhecidos na técnica, tal como os descritos em US 2005-0238649 AI. b. Porções Fármaco Exemplares (1) Maitansina e maitansinóides
Nalgumas concretizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas de maitansinóides. Os maitansinóides são inibidores mitóticos que actuam através da inibição da polimerização da tubulina. A 213 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto da África oriental Maytenus serrata (Patente U.S. No. 3896111). Subsequentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinóides, tal como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (Patente U.S. No. 4151042). O maitansinol sintético e derivados e análogos destes são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; e 4371533.
As porções fármaco de maitansinóide são porções fármaco atractivas em conjugados anticorpo-fármaco porque são: (i) relativamente fáceis de preparar através de fermentação ou modificação quimica ou derivação de produtos de fermentação, (ii) passíveis de derivação com grupos funcionais adequados para conjugação através de ligadores dissulfureto e não dissulfureto com anticorpos, (iii) estáveis em plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhas celulares tumorais.
Compostos de maitansina adequados para utilizar como porções fármaco de maitansinóide são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos utilizando engenharia genética e técnicas de fermentação (US 6790952; US 2005/0170475; Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973). O maitansinol e análogos de maitansinol podem também ser preparados de forma sintética de acordo com métodos conhecidos.
Porções fármaco de maitansinóide exemplares incluem aquelas possuindo um anel aromático modificado, tal como: C-l9-descloro (Pat. US No. 4256746) (preparado através de redução por hidreto de litio-aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxilo (ou C-20-desmetilo) +/-C-19-descloro (Pat. US Nos. 4361650 e 4307016) (preparado através de desmetilação utilizando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração utilizando LAH); e C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (Pat. U.S. No. 4294757) (preparado através de acilação utilizando cloretos de acilo) e aqueles possuindo modificações noutras posições. 214 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Porções fármaco de maitansinóide exemplares incluem também aquelas possuindo modificações tais como: C-9-SH (Pat. US No. 4424219) (preparado através da reacção de maitansinol com H2S ou P2S5) ; C-14-alcoximetil (desmetoxi/CH2OR) (US 4331598); C-14-hidroximetilo ou aciloximetilo (CH2OH ou CH2OAc) (Pat. US No. 4450254) (preparado em Nocardia); C-15- hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado através da conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Pat. US Nos. 4313946 e 4315929) (isolado a partir de Trewia nudiflora); C-18-N-desmetilo (Pat. US Nos. 4362663 e 4322348) (preparado através da desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desoxi (US 4371533) (preparado através da redução de tricloreto de titânio/LAH do maitansinol).
Sabe-se que muitas posições em compostos de maitansina são úteis como posição de liqação, dependendo do tipo de liqação. Por exemplo, para formação de uma ligação éster, a posição C-3 possuindo um grupo hidroxilo, a posição C-14 modificada com hidroximetilo, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo e a posição C-20 possuindo um grupo hidroxilo são todas adequadas (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972).
CH3O
Porções possuindo a e onde a linha ondulada indica a ligaçao covalente do átomo de enxofre da porção fármaco de maitansinóide a um ligador de um 215 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ADC. R pode, independentemente, ser H ou um alquilo C1-C6. A cadeia de alcileno unindo o grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanilo, etanilo, ou propilo, i.e., m é 1, 2, ou 3 (US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari et al. (1992) Câncer Res. 52: 127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623).
Todos os estereoisómeros da porção fármaco de maitansinóide estão contemplados para os compostos do invento, i.e. qualquer combinação das configurações R e S nos carbonos quirais de D. Numa concretização, a porção fármaco de maitansinóide terá a seguinte estereoquimica:
Concretizações de porções fármaco de maitansinóide exemplares incluem: DM1; DM3; e DM4, possuindo as estruturas: ch3o
DM1 216 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
em que a linha ondulada indica a ligaçao covalente do átomo de enxofre do fármaco a um ligador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (WO 2005/037992; US 2005/0276812 Ai).
Outros conjugados anticorpo-fármaco de maitansinóide exemplares têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que Ab é anticorpo e p é de 1 a cerca de 8): 217 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Ρ
Ab Âb-SMCC-DMl
Conjugados anticorpo-fármaco exemplares onde DM1 é ligado através de um ligador BMPEO a um grupo tiol do anticorpo têm a estrutura e abreviatura: 218 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos de produção dos mesmos, e sua utilização terapêutica são divulgados, por exemplo, em Erickson, et al. (2006) Câncer Res. 66(8): 4426-4433; Patentes U.S. Nos. 5208020, 5416064, US 2005/0276812 Al, e Patente Europeia EP 0425235 Bl, cujas divulgações são deste modo expressamente incorporadas por referência.
Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparados através da ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem diminuir significativamente a actividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinóide. Ver, p.ex., Patente U.S. No. 5208020 (cuja divulgação é deste modo expressamente incorporada por referência). Os maitansinóides podem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na Patente U.S. No. 5208020 e nas outras patentes e publicações sem ser de patentes aqui referidas acima, tal como maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou noutras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres de maitansinol.
Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para produção de conjugados anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, os divulgados na Patente U.S. No. 219 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 5208020 ou Patente ΕΡ 0425235 Bl; Chari et al., Câncer Research 52: 127-131 (1992); e US 2005/016993 Al, cujas divulgações são deste modo expressamente incorporadas por referência. Os conjugados anticorpo-maitansinóide compreendendo o componente ligador SMCC podem ser preparados conforme divulgado em US 2005/0276812 Al, "Antibody-drug conjugates and Methods". Os ligadores compreendem grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos sensíveis a ácidos, grupos foto-sensíveis, grupos sensíveis a peptidases, ou grupos sensíveis a esterases, conforme divulgado nas patentes acima identificadas. Ligadores adicionais são aqui descritos e exemplificados.
Conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de conjugação de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil-adipimidato-HCl), ésteres activos (tal como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Em certas concretizações, o agente de conjugação é N-succinimidilo-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) ou N-succinimidilo-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfureto. O ligador pode ser ligado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada através de reacção com um grupo hidroxilo utilizando técnicas de conjugação convencionais. A reacção pode ocorrer na posição C-3 possuindo um grupo hidroxilo, na posição C-14 modificada com hidroximetilo, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo, e na posição C-20 possuindo um grupo hidroxilo. Numa concretização, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol. 220 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (2) Auristatinas e dolastatinas
Nalgumas concretizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado com dolastatina ou um análogo ou derivado peptidico de dolastatina, p.ex., uma auristatina (Pat. US Nos. 5635483; 5780588). Foi mostrado que as dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, a hidrólise do GTP e a divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e têm actividade anticancerigena (Pat. US No. 5663149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). A porção fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxilo) da porção fármaco peptidica (WO 02/088172).
Concretizações exemplares de auristatina incluem o terminal N ligado a porções fármaco de monometilauristatina DE e DF (US 2005/0238649, divulgado em Senter et al., "Proceedings of the American Association for Câncer Research", Volume 45, Resumo Número 623, apresentado a 28 de Março de 2004, cuja divulgação é expressamente aqui incorporada por referência na sua totalidade).
Uma porção fármaco peptidica pode ser seleccionada a partir das Fórmulas DE e DF abaixo:
em que a linha ondulada de DE e DF indica o local de ligação covalente a um anticorpo ou componente ligador do anticorpo, e independentemente em cada localização: 221 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ R2 é seleccionado a partir de H e alquilo Ci-C8; R3 é seleccionado a partir de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-Ce) r heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-Cs- (heterociclo C3-C8) ; R4 é seleccionado a partir de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-Cs- (heterociclo C3-C8) ; R5 é seleccionado a partir de H e metilo; ou R4 e R5 conjuntamente formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CR3Rb)n- em que Ra e Rb são, independentemente, seleccionados a partir de H, alquilo Ci-Cs e carbociclo C3-C8 e n é seleccionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é seleccionado a partir de H e alquilo Ci-Cs; R7 é seleccionado a partir de H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-Cs-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo Ci-C8), heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é, independentemente, seleccionado a partir de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 e 0-(alquilo Ci-C8) ; R9 é seleccionado a partir de H e alquilo Ci-C8; R10 é seleccionado a partir de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é seleccionado a partir de H, alquilo C1-C2CV arilo, heterociclo C3-Cs, - (R130) m-R14, ou - (R130)m-CH (R15) 2; m é um inteiro variando de 1-1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é, independentemente, H, COOH, - (CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-S03H ou - (CH2) n-S03-alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R16 é, independentemente, H, alquilo C1-C0, ou - (CH2) n-COOH; R18 é seleccionado a partir de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2- (heterociclo C3-C8) , e -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8); e n é um inteiro variando de 0 a 6. 222 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Numa concretização, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H ou metilo. Numa concretização exemplar, R3 e R4 são cada um isopropilo, R5 é -H e R7 é sec-butilo.
Ainda noutra concretização, R2 e R6 são cada um metilo, e R9 é -H.
Ainda noutra concretização, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Em concretizações exemplares, R3 e R4 são cada um isopropilo, R2 e R6 são cada um metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Numa concretização, Z é -0- ou -NH-
Numa concretização, R10 é arilo.
Numa concretização exemplar, R10 é -fenilo -O-, R11 é -H, é -CH(R15)2, em ou - (CH2) n-COOH. é -CH(R15)2, em
Numa concretização exemplar, quando Z é metilo ou t-butilo. 11
Numa concretização, quando Z é -NH, R que R15 é - (CH2) n-N (R16) 2, e R16 é -alquilo Ci-Cg
Noutra concretização, quando Z é -NH, R11 que R15 é - (CH2)n-S03H.
Uma concretização de auristatina exemplar de fórmula DE é MMAE, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
MMAE
Uma concretização de auristatina exemplar de fórmula DF é MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um 223 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (ver US 2005/0238649 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124) :
Outras concretizações exemplares incluem compostos de monometilvalina possuindo modificações no carboxilo da fenilalanina no terminal C da porção fármaco pentapeptidica de auristatina (WO 2007/008848) e compostos monometilvalina possuindo modificações na cadeia lateral de fenilalanina no terminal C da porção fármaco pentapeptídica de auristatina (WO 2007/008603) .
Outras porções fármaco incluem os seguintes derivados MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligador (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
224 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
SOgH 225 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Num aspecto, grupos hidrófilos incluindo mas não limitados a, ésteres de trietilenoglicol (TEG), tal como mostrado acima, podem ser ligados à porção fármaco em R11. Sem estar ligado a qualquer teoria em particular, os grupos hidrófilos auxiliam na internalização e não aglomeração da porção fármaco.
Concretizações exemplares de ADC de Fórmula I compreendendo uma auristatina/dolastatina ou derivado destes são descritos em US 2005-0238649 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124, que é expressamente aqui incorporada por referência. Concretizações exemplares de ADC de Fórmula I compreendendo MMAE ou MMAF e vários componentes ligadores têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que "Ab" é um anticorpo; péla cerca de 8, "Val-Cit" ou "vc" é um dipéptido valina-citrulina; e "S" é um átomo de enxofre. Observar-se-á aqui que em certas descrições estruturais do ADC ligado com enxofre, o anticorpo é representado como "Ab-S" meramente para indicar a caracteristica de ligação de enxofre e não para indicar que um determinado átomo de enxofre possui múltiplas porções ligador-fármaco. Os parênteses esquerdos das 226 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ seguintes estruturas podem também ser colocados à esquerda do átomo de enxofre, entre Ab e S, o que seria uma descrição equivalente do ADC do invento aqui descrito.
Ab-MC-voPAB -MM AF Ab-Sv / ΟΥ Η O Y" vOA N Ύ N'f"' Ν'Ν-^'ν-Ν * O A, * O., Ô í> / v-f ç
Ab-MC-vc-PAB-MMAB
S U o H
P Ab-MC-MMAf-
Ab-MC-MMAP
Concretizações exemplares dos ADC de Fórmula I compreendendo MMAF e vários componentes ligadores incluem ainda Ab-MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. Curiosamente, mostrou-se que os imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo através de um ligador que não seja proteoliticamente clivável possuem uma actividade comparável a imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo através de um ligador proteoliticamente clivável. Ver, Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124. Em tais casos, crê-se que a libertação do fármaco seja efectuada através de degradação do anticorpo na célula. Id.
Tipicamente, porções fármaco baseadas em péptidos podem ser preparadas através da formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (ver E. 227 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Schrõder e Κ. Liibke, "The Peptides", volume 1, págs. 7 6-136, 1965. Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptidos. As porções fármaco de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 2005-0238649 Al; Pat. US No. 5635483; Pat. US No. 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al. (1999) Anti-Cancer Drug-Deslgn 13: 243-277; Pettit. G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkln Trans. 15: 859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784.
Em particular, porções fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula DF, tais como MMAF e derivados desta, podem ser preparadas utilizando métodos descritos em US 2005-0238649 Al e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem., 17: 114-124. Porções fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula DE, tais como MMAE e derivados desta, podem ser preparadas utilizando métodos descritos em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21: 778-784. Porções ligador a fármacos MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, e MC-vc-PAB-MMAE podem ser convenientemente sintetizadas através de métodos de rotina, p.ex., tal como descrito em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21: 778-784, e Publicação de Pedido de Patente No. US 2005/0238649 Al, e depois conjugadas com um anticorpo de interesse. (3) Caliqueamicina
Noutras concretizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos das caliqueamicinas é capaz de produzir quebras no ADN de cadeia dupla a concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família das caliqueamicinas, ver Pat. U.S. Nos. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (todas para American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicinas que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, γι1, cq1, oq1, N-acetil-γι1, PSAG e Θ1! (Hinman et al., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58: 2925-2928 (1998), e as patentes U.S. acima mencionadas para American Cyanamid). Outro fármaco anti-tumoral ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como QFA têm locais 228 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ intracelulares de acção e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a tomada celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos. c. Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados com um anticorpo incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluorouracilo, a família de agentes conhecidos colectivamente como complexo LL-E33288, descritos nas Pat. US Nos. 5053394, 5770710, bem como esperamicinas (Pat. US No. 5877296).
Enzimaticamente as toxinas activas e fragmentos destas que podem ser utilizados incluem cadeia A da difteria, fragmentos activos que não se ligam da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadeia A do rícino, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado a 29 de Outubro de 1993. O presente invento contempla ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolítica (p.ex., uma ribonuclease ou uma ADN-endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; ADNase).
Em certas concretizações, um imunoconjugado pode compreender um átomo altamente radioactivo. Uma variedade de isótopos radioactivos está disponível para a produção de anticorpos radiocon jugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Quando o imunoconjugado é utilizado para detecção, pode compreender um átomo radioactivo para estudos cintigráficos, por exemplo Tc99m ou I123, ou um marcador de spin para imagiologia de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagiologia de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganésio ou ferro. 229 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os marcadores radioactivos ou outros podem ser incorporados no imunoconjugado através de formas conhecidos. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Marcadores tais como Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo de cisteína no péptido. 0 ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. 0 método de IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
Em certas concretizações, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo conjugado com uma enzima activadora de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (p.ex., um agente quimioterapêutico de peptidilo, ver WO 81/01145) num fármaco activo, tal como um fármaco anticancro. Tais imunoconjugados são úteis em terapia de pró-fármacos mediada por enzimas dependente de anticorpos ("ADEPT"). Enzimas que podem ser conjugadas com um anticorpo incluem, mas não se limitam a, fosfatases alcalinas, que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatases, que são úteis para conversão de pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase, que é útil para conversão de 5-fluorocitosina não tóxica mo fármaco anticancro 5-fluorouracilo; proteases, tal como protease de serratia, termolisina, sublilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L) , que são úteis para converter pró-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, que são úteis para conversão de pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que clivam hidratos de carbono tais como β-galactosidase e neuraminidase, que são úteis para conversão de pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, que é útil para conversão de fármacos derivados com β-lactamos em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase e penicilina G-amidase, que são úteis para converter fármacos derivados nos azotos das suas aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. As 230 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ enzimas podem ser covalentemente ligadas a anticorpos através de técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica. Ver, p.ex., Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984). d. Carga de Fármaco A carga de fármaco é representada por p, o número médio de porções fármaco por anticorpo numa molécula de Fórmula I. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 porções fármaco (D) por anticorpo. ADC de Fórmula I incluem colecções de anticorpos conjugados com um intervalo de porções fármaco, de 1 a 20. O número médio de porções fármaco por anticorpo em preparações de ADC a partir de reacções de conjugação pode ser caracterizado através de meios convencionais tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Nalguns casos, a separação, purificação, e caracterização de ADC homogéneos onde p é um certo valor de ADC com outras cargas de fármaco podem ser alcançadas através de meios tais como HPLC de fase inversa ou electroforese. Formulações farmacêuticas de Fórmula I de conjugados anticorpo-fármaco podem assim ser uma mistura heterogénea de tais conjugados com anticorpos ligados a 1, 2, 3, 4, ou mais porções fármaco.
Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado através do número de locais de ligação no anticorpo. Por exemplo, onde a ligação é um tiol de cisteina, tal como nas concretizações exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteina, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reactivos através dos quais um ligador pode ser ligado. Em certas concretizações, uma carga mais elevada de fármaco, p.ex. p>5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco. Em certas concretizações, a carga de fármaco para um ADC do invento varia de 1 a cerca de 8; de cerca de 2 a cerca de 6; ou de cerca de 3 a cerca de 5. De facto, mostrou-se que para certos ADC, a razão óptima de porções fármaco por anticorpo pode ser inferior a 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 5. Ver US 2005-0238649 Al. 231 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Em certas concretizações, menos de cerca do máximo teórico de porções fármaco são conjugadas com um anticorpo durante uma reacção de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário ligador a fármacos ou reagente ligador, tal como discutido abaixo. Geralmente, os anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reactivos que possam ser ligados a uma porção fármaco; de facto a maioria dos resíduos tiol de cisteína em anticorpos existe como pontes dissulfureto. Em certas concretizações, um anticorpo pode ser reduzido com um agente de redução tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol de cisteína reactivos. Em certas concretizações, um anticorpo é sujeito a condições desnaturantes para revelar grupos nucleófilos reactivos tais como lisina ou cisteína. A carga (razão f ármaco / anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes modos, p.ex., através de: (i) limitação do excesso molar do intermediário ligador a fármacos ou reagente ligador relativamente ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou da temperatura de reacção de conjugação, e (iii) condições redutoras parciais ou limitantes para modificação do tiol de cisteína.
Deve entender-se que quando mais de um grupo nucleófilo reage com um intermediário ligador a fármacos ou reagente ligador seguido de um reagente de porção fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais porções fármaco ligadas a um anticorpo. 0 número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura através de um ensaio de anticorpos ELISA duplo, que é específico para o anticorpo e especifico para o fármaco. As moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura através de espectroscopia de massa e separadas através de HPLC, p.ex. cromatografia de interacção hidrófoba. (ver, p.ex., McDonagh et ai. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7): 299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Câncer Res. 10: 7063-7070; Hamblett. K.J., et al., "Effect of Drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-Drug conjugate". Resumo No. 624, American Association for Câncer 232 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de Março de 2004, Proceedings of the AACR. Volume 45, Março de 2004; Alley, S.C., et al., "Controlling the location of Drug attachment in antibody-Drug conjugates", Resumo No. 627, American Association for Câncer Research, 2004 Annual Meeting. 27-31 de Março de 2004, Proceedings of the AACR. Volume 45. Março de 2004). Em certas concretizações, um ADC homogéneo com um único valor de carga pode ser isolado da mistura de conjugação através de electroforese ou cromatografia. e. Certos Métodos de Preparação de Imunoconjugados
Um ADC de Fórmula I pode ser preparado através de várias vias empregando reacções de guimica orgânica, condições, e reagentes conhecidos dos peritos na técnica, incluindo: (1) reacção de um grupo nucleófilo de um anticorpo com um reagente ligador bivalente para formar Ab-L através de uma ligação covalente, seguido de reacção com uma porção fármaco D; e (2) reacção de um grupo nucleófilo de uma porção fármaco com um reagente ligador bivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguido de reacção com um grupo nucleófilo de um anticorpo. Métodos exemplares para preparação de um ADC de Fórmula I através da última via são descritos em US 2005-0238649 Al, que é expressamente aqui incorporado por referência.
Grupos nucleófilos nos anticorpos incluem, mas não se limitam a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina da cadeia lateral, p.ex. lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, p.ex. cisteína, e (iv) grupos hidroxilo ou amino de açúcares onde o anticorpo é glicosilado. Os grupos amina, tiol, e hidroxilo são nucleófilos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em porções ligadoras e reagentes ligadores incluindo: (i) ésteres activos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, e halogenetos ácidos, (ii) halogenetos de alquilo e benzilo, tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxilo e maleimida. Certos anticorpos têm dissulfuretos intercadeias redutíveis, i.e. pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reactivos para conjugação com reagentes ligadores através de tratamento com um agente de redução tal como DTT (ditiotreitol) ou tricarboniletilfosfina 233 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (TCEP), tal que ο anticorpo é totalmente ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína formará assim, teoricamente, dois tióis nucleófilos reactivos. Grupos nucleófilos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da modificação de resíduos de lisina, p.ex., fazendo reagir resíduos de lisina com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina num tiol. Grupos tiol reactivos podem ser introduzidos num anticorpo através da introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (p.ex., através da preparação de anticorpos variantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos cisteína não nativos).
Os conjugados anticorpo-fármaco do invento podem também ser produzidos através da reacção entre um grupo electrófilo num anticorpo, tal como um grupo carbonilo de aldeído ou cetona, com um grupo nucleófilo num reagente ligador ou fármaco. Grupo nucleófilos úteis num reagente ligador incluem, mas não se limitam a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida. Numa concretização, um anticorpo é modificado para introduzir porções electrófilas que sejam capazes de reagir com substituintes nucleófilos num reagente ligador ou fármaco. Noutra concretização, os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, p.ex. com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina dos reagentes ligadores ou porções fármaco. Os resultantes grupos imina base de Schiff podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, p.ex. por reagentes de hidreto de boro para formar ligações de amina estáveis. Numa concretização, a reacção da porção hidrato de carbono de um anticorpo glicosilado com galactose-oxidase ou meta-periodato de sódio pode produzir grupos carbonilo (aldeído e cetona) no anticorpo que podem reagir com grupos apropriados no fármaco (Hermanson, Bioconjugale Technics). Noutra concretização, anticorpos contendo resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído em vez do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5362852). Pode-se fazer reagir um tal aldeído com uma porção fármaco ou nucleófilo ligador. 234 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Grupos nucleófilos numa porção fármaco incluem, mas não se limitam a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida, capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em porções ligadoras e reagentes ligadores incluindo: (i) ésteres activos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e benzilo, tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxilo e maleimida.
Os compostos do invento contemplam expressamente, mas não se limitam a, ADC preparados com os seguintes reagentes de reticulação: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfono)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (p.ex., em Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A; ver páginas 467-498, 2003-2004
Applications Handbook and Catalog).
Imunoconjugados compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico podem também ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de ligação de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil-adipimidato-HCl), ésteres activos (tais como disuccinimidil-suberato), aldeídos (tais como glutaraldeido), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada tal como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleótidos ao anticorpo. Ver W09 4/11026.
Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico pode ser produzida, p.ex., 235 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ através de técnicas recombinantes ou síntese peptídica. Uma molécula de ADN recombinante pode compreender regiões codificando as porções anticorpo e citotóxicas do conjugado adjacentes uma à outra ou separadas através de uma região codificando um péptido ligador que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Ainda noutra concretização, um anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-alvejamento de tumores em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido da remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e depois administração de um "ligando" (p.ex., avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (p.ex., um radionucleótido).
Imunoconjugados Exemplares - Conjugados Tio-Anticorpo-Fármaco a. Preparação de Anticorpos Anti-CD79b Modificados com Cisteina 0 ADN codificando uma variante de sequência de aminoácidos dos anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina e anticorpos anti-CD79b parentais do invento é preparado através de uma variedade de métodos que incluem, mas não se limitam a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural), preparação através de mutagénese dirigida ao local (ou mediada por oligonucleótidos) (Cárter (1985) et al., Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77: 51-59; Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488; Liu et al. (1998) J. Bíol. Chem. 273: 20252- 20260), mutagénese por PCR (Higuchi (1990) em "PCR Protocols", págs. 177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102: 67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; e
Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17: 723-733), e mutagénese de cassete (Wells et al. (1985) Gene 34: 315-323) de um ADN preparado anteriormente codificando o polipéptido. Os protocolos, estojos, e reagentes de mutagénese estão comercialmente disponíveis, p.ex. QuikChange® Multi Site-Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutações únicas são também geradas através de mutagénese dirigida por 236 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ oligonucleótidos utilizando ADN plasmidico de cadeia dupla como molde através de mutagénese baseada em PCR (Sambrook e Russel, (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edição; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100: 468-500; Zoller, M.J. e Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10: 6487-6500). Variantes de anticorpos recombinantes podem também ser construídas através de manipulação de fragmentos de restrição ou através de PCR de prolongamento da sobreposição com oligonucleótidos sintéticos. Os iniciadores mutagénicos codificam a substituição ou substituições dos codões de cisteína. Técnicas de mutagénese padrão podem ser empregues para gerar ADN codificando tais anticorpos modificados com cisteína mutantes (Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; e Ausubel et al.r "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing e Wiley-Interscience. New York, N.Y., 1993). A tecnologia de apresentação fágica (McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-553) pode ser utilizada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpo anti-CD79b humanos in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, genes do domínio V de anticorpo são clonados enquadrados num gene de proteína de revestimento principal ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula fágica. Como as partículas filamentosas contêm uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma fágico, selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também em selecção do gene codificando o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades das células B (Johnson et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275) .
Anticorpos anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizados utilizando metodologia de síntese de oligopéptidos conhecida ou podem ser preparados e purificados utilizando tecnologia recombinante. A sequência de aminoácidos apropriada, ou 237 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ porções desta, pode ser produzida através de síntese peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (Stewart et ai., "Solid-Phase Peptide Synthesis", (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154). Síntese proteica in vitro pode ser efectuada utilizando técnicas manuais ou através de automatização. Síntese em fase sólida automatizada pode ser alcançada, por exemplo, empregando aminoácidos protegidos com t-BOC ou Fmoc e utilizando um Applied Biosystems Peptide Sintesizer (Foster City, CA) utilizando instruções do fabricante. Várias porções do anticorpo anti-CD79b ou polipéptido CD79b podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o anticorpo anti-CD79b ou polipéptido CD79b desejado.
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (Morimoto et ai. (1992) Journal of Biochemical e Biophysical Methods 24: 107-117; e Brennan et al. (1985) Science, 229: 81), ou produzidos directamente através de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv anti-CD79b podem ser todos expressos em, e segregados a partir de, E. coli, permitindo assim a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos tal como discutido aqui. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente ligados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. (1992) Bio/Technology 10: 163-167), ou isolados directamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. O anticorpo anti-CD79b pode ser um fragmento Fv de cadeia simples (scFv) (WO 93/16185; US 5571894; US 5587458). O fragmento de anticorpo anti-CD79b pode também ser um "anticorpo linear" (US 5641870). Tais fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de anticorpos anti-CD79b através da cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b. ADN codificando 238 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpos anti-CD79b pode ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se crê possuir o ARNm de anticorpo anti-CD79b e o expressa a um nível detectável. Concordantemente, ADN de anticorpo anti-CD79b humano ou polipéptido CD79b pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano. 0 gene codificando o anticorpo anti-CD79b pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos (p.ex., síntese automatizada de ácido nucleico). 0 desenho, a selecção e os métodos de preparação do invento permitem anticorpos anti-CD79b modificados com cisteína que são reactivos com funcionalidade electrófila. Estes métodos permitem ainda compostos conjugados com anticorpos tais como compostos conjugados anticorpo-fármaco (ADC) com moléculas de fármaco em locais designados, desenhados e selectivos. Os resíduos de cisteína reactivos na superfície de um anticorpo permitem conjugar especificamente uma porção fármaco através de um grupo tiol reactivo tal como maleimida ou haloacetilo. A reactividade nucleófila da funcionalidade tiol de um resíduo de Cys com um grupo maleimida é cerca de 1000 vezes superior em comparação com qualquer outra funcionalidade de aminoácido numa proteína, tal como resíduos de grupos amino de lisina ou o grupo amino N-terminal. A funcionalidade tiol específica em reagentes iodoacetilo e maleimida pode reagir com grupos amina, mas é requerido um pH mais elevado (>9, 0) e tempos de reacção mais longos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). A quantidade de tiol livre numa proteína pode ser estimada através do ensaio padrão de Ellman. A imunoglobulina M é um exemplo de um pentâmero ligado por dissulfureto, enquanto a imunoglobulina G é um exemplo de uma proteína com pontes dissulfureto internas ligando as subunidades umas às outras. Em proteínas tais como esta, a redução das pontes dissulfureto com um reagente tal como ditiotreitol (DTT) ou selenol (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-156) é necessária para gerar o tiol livre reactivo. Esta abordagem pode resultar em perda da estrutura terciária do anticorpo e da especificidade de ligação ao antigénio. 239 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο Ensaio PHESELECTOR (ELISA de Fagos para Selecção de Tióis Reactivos) permite a detecção de grupos de cisteina reactivos em anticorpos num formato de ELISA de fagos auxiliando deste modo no desenho de anticorpos modificados com cisteina (Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol. Methods 332: 41-52; WO 2006/034488; US 20007/0092940). O anticorpo modificado com cisteina é revestido na superfície de poços, seguido de incubação com partículas fágicas, adição de anticorpo secundário marcado com HRP, e detecção de absorvância. As proteínas mutantes apresentadas nos fagos podem ser pesquisadas de um modo rápido, robusto e de elevada tiragem. Bibliotecas de anticorpos modificados com cisteina podem ser produzidas e sujeitas a selecção por ligação utilizando a mesma abordagem para identificar locais apropriadamente reactivos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas fágicas de proteínas aleatórias de anticorpos ou outras proteínas. Esta técnica inclui a reacção de proteínas mutantes com cisteina apresentadas em fagos com um reagente de afinidade ou grupo repórter que é também reactivo com tiol. O ensaio PHESELECTOR permite a pesquisa de grupos tiol reactivos em anticorpos. A identificação da variante A121C através deste método é exemplar. A molécula Fab inteira pode ser pesquisada eficazmente para identificar mais variantes TioFab com grupos tiol reactivos. Foi empregue uma acessibilidade de superfície paramétrica e fraccional, para identificar e quantificar a acessibilidade do solvente aos resíduos de aminoácidos num polipéptido. A acessibilidade de superfície pode ser expressa como a area de superfície (A ) que pode contactar com uma molécula de solvente, p.ex. água. O espaço ocupado pela água é aproximado a uma esfera de 1,4 Â de raio. O software está disponível gratuitamente ou é licenciável (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, ou através da internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) como o CCP4 Suite de programas de cristalografia que emprega algoritmos para calcular a acessibilidade de superfície de cada aminoácido de uma proteína com coordenadas derivadas de cristalografia de raios X conhecidas ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50: 760-763). Dois módulos de software exemplares que efectuam 240 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cálculos de acessibilidade de superfície são "AREAIMOL" e "SURFACE", baseados nos algoritmos de B. Lee e F.M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400. AREAIMOL define a superfície acessível ao solvente de uma proteína no locus do centro de uma esfera de sonda (representando uma molécula de solvente) à medida que rola sobre a superfície de Van der Waals da proteína. AREAIMOL calcula a área da superfície acessível ao solvente através da geração de pontos de superfície numa esfera estendida cerca de cada átomo (a uma distância do centro do átomo igual à soma dos raios do átomo e da sonda), e eliminando aqueles que residem dentro de esferas equivalentes associadas a átomos vizinhos. AREAIMOL encontra a área de átomos acessível ao solvente num ficheiro de coordenadas PDB e resume a área acessível por resíduo, por cadeia e para toda a molécula. As áreas acessíveis (ou diferenças de área) para átomos individuais podem ser escritas num pseudo-ficheiro de resultados PBD. AREAIMOL assume um único raio para cada elemento, e apenas reconhece um número limitado de diferentes elementos. AREAIMOL e SURFACE relatam acessibilidades absolutas, i.e. o número de Angstroms quadrados (Â) . A acessibilidade de superfície fraccional é calculada através de referência a um estado padrão relevante para um aminoácido dentro de um polipéptido. 0 estado de referência é o tripéptido Gly-X-Gly, onde X é o aminoácido de interesse, e o estado de referência deve estar numa conformação "estendida", i.e. semelhante à das cadeias beta. A conformação estendida maximiza a acessibilidade de X. Uma área acessível calculada é dividida pela área acessível num estado de referência de tripéptido Gly-X-Gly e relata o quociente, que é a acessibilidade fraccional. A percentagem de acessibilidade é a acessibilidade fraccional multiplicada por 100. Outro algoritmo exemplar para cálculo da acessibilidade de superfície é baseado no módulo SOLV do programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche. Basel) que calcula a acessibilidade fraccional de um resíduo de aminoácido a uma esfera de água baseada nas coordenadas de raios X do polipéptido. A acessibilidade de superfície fraccional para cada aminoácido num anticorpo pode ser calculada utilizando a informação da estrutura cristalina (Eigenbrot et al. (1993) J. Mol. Biol. 229: 969-995). 241 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ADN codificando os anticorpos modificados com cisteina é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murideo). As células de hibridoma servem como fonte de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou outras células hospedeiras de mamífero, tais como células de mieloma (US 58077715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que não produzem de outro modo a proteína do anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
Após desenho e selecção, os anticorpos modificados com cisteina, p.ex. TioFabs, com os resíduos de Cys desemparelhados altamente reactivos introduzidos, "aminoácidos de cisteina livre", podem ser produzidos através de: (i) expressão num sistema bacteriano, p.ex. E. coli (Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262; Pliickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151-188) ou num sistema de cultura de células de mamífero (WO 01/00245), p.ex. células de ovário de hamster chinês (CHO); e (ii) purificação utilizando técnicas de purificação de proteínas comuns (Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17): 10982-10988).
Os grupos tiol de Cys introduzidos reagem com reagentes ligadores electrófilos e intermediários ligadores a fármacos para formar conjugados anticorpo modificado com cisteína-fármaco e outros anticorpos modificados com cisteina marcados. Os resíduos de Cys de anticorpos modificados com cisteina, e presentes nos anticorpos parentais, que são emparelhados e formam ligações dissulfureto intercadeias e intracadeias não possuem quaisquer grupos tiol reactivos (a menos que tratados com um agente redutor) e não reagem com reagentes ligadores electrófilos ou intermediários ligadores a fármacos. O resíduos de Cys introduzidos recentemente podem permanecer desemparelhados e capazes de reagir com, i.e. conjugados com, um reagente ligador electrófilo ou intermediário ligador a fármacos, tal como um fármaco maleimida. Intermediários 242 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligadores a fármacos exemplares incluem: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE, e MC-vc-PAB-MMAF. As posições estruturais dos resíduos de Cys introduzidos das cadeias pesadas e leves são numeradas de acordo com um sistema de numeração sequencial. Este sistema de numeração sequencial está correlacionado com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Imunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) a começar no terminal N, difere do esquema de numeração de Kabat (seta inferior) através das inserções anotadas por a,b,c. Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Os locais variantes modificados da cadeia pesada da cisteína são identificados através dos esquemas de numeração sequencial e numeração de Kabat.
Numa concretização, o anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína é preparado através de um processo compreendendo: (a) substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo-mãe anti-CD79b por cisteína; e (b) determinação da reactividade do tiol do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína fazendo reagir o anticorpo modificado com cisteína com um reagente reactivo com tiol. 0 anticorpo modificado com cisteína pode ser mais reactivo que o anticorpo-mãe com o reagente reactivo com tiol.
Os resíduos de aminoácidos cisteína livres podem estar localizados nas cadeias pesadas ou leves, ou nos dominios constantes ou variáveis. Fragmentos de anticorpo, p.ex. Fab, podem também ser modificados com um ou mais aminoácidos cisteína substituindo aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpo modificados com cisteína.
Outra concretização do invento proporciona um método de preparação (produção) de um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína, compreendendo: (a) introdução de um ou mais aminoácidos cisteína num anticorpo-mãe anti-CD79b para gerar o anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína; e 243 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (b) determinação da reactividade de tiol do anticorpo modificado com cisteina com um reagente reactivo com tiol; em que o anticorpo modificado com cisteina é mais reactivo que o anticorpo-mãe com o reagente reactivo com tiol. 0 passo (a) do método de preparação de um anticorpo modificado com cisteina pode compreender: (i) a mutagenização de uma sequência de ácido nucleico codificando o anticorpo modificado com cisteina; (ii) a expressão do anticorpo modificado com cisteina; e (iii) o isolamento e a purificação do anticorpo modificado com cisteina. 0 passo (b) do método de preparação de um anticorpo modificado com cisteina pode compreender a expressão do anticorpo modificado com cisteina numa partícula virai seleccionada a partir de um fago ou uma partícula fagomidica. 0 passo (b) do método de preparação de um anticorpo modificado com cisteina pode também compreender: (i) fazer reagir o anticorpo modificado com cisteina com um reagente de afinidade reactivo com tiol para gerar um anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade; e (ii) a medição da ligação do anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade, a um meio de captura.
Outra concretização do invento é um método de pesquisa de anticorpos modificados com cisteina com aminoácidos cisteina desemparelhados, altamente reactivos, quanto a reactividade do tiol compreendendo: (a) a introdução de um ou mais aminoácidos cisteina num anticorpo-mãe para gerar um anticorpo modificado com cisteina; (b) fazer reagir o anticorpo modificado com cisteina com um reagente de afinidade reactivo com tiol para gerar um anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade; e (c) a medição da ligação do anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade, a um meio de captura; e (d) a determinação da reactividade de tiol do anticorpo modificado com cisteina com um reagente reactivo com tiol. 244 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο passo (a) do método de pesquisa de anticorpos modificados com cisteina pode compreender: (i) a mutagenização da sequência de ácido nucleico codificando o anticorpo modificado com cisteina; (ii) a expressão do anticorpo modificado com cisteina; e (iii) o isolamento e a purificação do anticorpo modificado com cisteina. 0 passo (b) do método de pesquisa de anticorpos modificados com cisteina pode compreender a expressão do anticorpo modificado com cisteina numa partícula virai seleccionada a partir de um fago ou uma partícula fagomídica. 0 passo (b) do método de pesquisa de anticorpos modificados com cisteina pode também compreender: (i) fazer reagir o anticorpo modificado com cisteina com um reagente de afinidade reactivo com tiol para gerar um anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade; e (ii) a medição da ligação do anticorpo modificado com cisteina, marcado por afinidade, a um meio de captura. b. Introdução de Cisteínas em Variantes de IgG Anti-CD79b A cisteina foi introduzida no local 118 da cadeia pesada (numeração EU) (equivalente à posição 118 da cadeia pesada, numeração sequencial) nos anticorpos monoclonais anti-CD79b quiméricos parentais inteiros ou no local 205 da cadeia leve (numeração de Kabat) (equivalente à posição 209 da cadeia leve, numeração sequencial) nos anticorpos monoclonais anti-CD79b quiméricos parentais inteiros através dos métodos de modificação com cisteínas aqui descritos.
Os anticorpos modificados com cisteina com cisteina na cadeia pesada 118 (numeração EU) gerados foram: (a) tio-MA79b.vl7-HC(A118C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 229), Figura 24; (b) tio-MA79b.vl8-HC(A118C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 231), Figura 25; (c) tio-MA79b.v28-HC(A118C), com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) e sequência da 245 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cadeia leve (SEQ ID NO: 233), Figura 26; (d) tio-MA79b- HC (Al 18C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 237). Figura 28; e (e) tio-anti-cynoCD79b-HC(A118C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 245), Figura 48.
Os anticorpos modificados com cisteina com cisteina na cadeia leve 205 (numeração de Kabat) gerados foram: (a) tio-MA79b-LC(V205C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 235), Figura 27 e (b) tio-anti-cynoCD79b(chIODIO)-LC(V205C) com sequência da cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) e sequência da cadeia leve (SEQ ID NO: 300), Figura 49.
Estes anticorpos monoclonais modificados com cisteina foram expressos em células CHO (Ovário de Hamster Chinês) através de fermentação transiente em meio contendo cisteina 1 mM.
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina MA79b humanizados compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 251-259, Tabela 2).
Tabela 2: Comparação da numeração Sequencial, de Kabat e EU da cadeia pesada para variantes do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina MA79b humanizado SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT NUMERAÇÃO EU SEQ ID NO: EVQLCESGGG V5C V5C 251 LRLSCCASGYT A23C A23C 252 MNSLRCEDTAV A88C A84C 253 TLVTVCSASTK S116C S112C 254 VTVSSCSTKGP A118C A114C A118C 255 VSSASCKGPSV T120C T116C T120C 256 WYVDGCEVHNA V282C V278C V282C 257 KGFYPCDIAVE S375C S371C S375C 258 PPVLDCDGSFF S400C S396C S400C 259 246 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 260-268 , Tabela 3) 1 . Tabela 3: Comparação da numeração Sequencial, de Kabat e EU da cadeia pesada para variantes do anticorpo anti- -CD7 9b modificado com cisteina chMA79b: SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT NUMERAÇÃO EU SEQ ID NO: EVQLCQSGAE Q5C Q5C 260 VKISCCATGYT K23C K23C 261 LSSLTCEDSAV S88C S84C 262 TSVTVCSASTK S116C S112C 263 VTVSSCSTKGP A118C A114C A118C 264 VSSASCKGPSV T120C T116C T120C 265 WYVDGCEVHNA V282C V278C V282C 266 KGFYPCDIAVE S375C S371C S375C 267 PPVLDCDGSFF S400C S396C S400C 268
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina anti-cynoCD79b(chIODIO) compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 269-277, Tabela 4).
Tabela 4: Comparação da numeração Sequencial, de Kabat e EU da cadeia pesada para variantes do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina anti-cynoCD79b(chIODIO): SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT NUMERAÇÃO EU SEQ ID NO: EVQLCESGPG Q5C Q5C 269 LSLTCCVTGYS T23C T23C 270 LNSVTCEDTAT S88C S84C 271 TTLTVCSASTK S111C S112C 272 LTVSSCSTKGP A113C A114C A118C 273 VSSASCKGPSV T115C T116C T120C 274 WYVDGCEVHNA V282C V278C V282C 275 KGFYPCDIAVE S370C S371C S375C 276 PPVLDCDGSFF S395C S396C S400C 277 247 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina MA79b humanizados compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 278-284, Tabela 5).
Tabela 5: Comparação da numeração Sequencial e de Kabat da cadeia leve para variantes do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina MA79b humanizado: SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT SEQ ID NO: SLSASCGDRVT V15C V15C 278 EIKRTCAAPSV V114C V110C 279 TVAAPCVFIFP S118C S114C 280 FIFPPCDEQLK S125C S121C 281 DEQLKCGTASV S131C S127C 282 VTEQDCKDSTY S172C S168C 283 GLSSPCTKSFN V209C V205C 284
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 285-291, Tabela 6).
Tabela 6: Comparação da numeração Sequencial e de Kabat da cadeia leve para variantes do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina MA79b quimérico: SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT SEQ ID NO: SLAVSCGQRAT L15C L15C 285 ELKRTCAAPSV V114C V110C 286 TVAAPCVFIFP S118C S114C 287 FIFPPCDEQLK S125C S121C 288 DEQLKCGTASV S131C S127C 289 VTEQDCKDSTY S172C S168C 290 GLSSPCTKSFN V209C V205C 291
De acordo com uma concretização, os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina anti-cynoCD79b(chIODIO) compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteina livre (SEQ ID NOS: 292-298, Tabela 7). 248 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 7: Comparação da numeração Sequencial e de Kabat da cadeia leve para variantes do anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina anti-cynoCD79b(chi0D10) SEQUÊNCIA NUMERAÇÃO SEQUENCIAL NUMERAÇÃO DE KABAT SEQ ID NO: SLAVSCGQRAT L15C L15C 292 EIKRTCAAPSV V114C V110C 293 TVAAPCVFIFP S118C S114C 294 FIFPPCDEQLK S125C S121C 295 DEQLKCGTASV S131C S127C 296 VTEQDCKDSTY S172C S168C 297 GLSSPCTKSFN V209C V205C 298 c. Anticorpos Anti-CD79b Modificados com Cisteina Marcados
Os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina podem ser ligados de forma especifica do local e eficazmente com um reagente reactivo com tiol. 0 reagente reactivo com tiol pode ser um reagente ligador multifuncional, um reagente marcador de captura, i.e. de afinidade (p.ex. um reagente ligador a biotina), um marcador de detecção (p.ex. um reagente fluoróforo), um reagente de imobilização de fase sólida (p.ex. SEPHAROSE™, polistireno, ou vidro), ou um intermediário ligador a fármacos. Um exemplo de um reagente reactivo com tiol é N-etilmaleimida (NEM). Numa concretização exemplar, a reacção de um TioFab com um reagente ligador a biotina proporciona um TioFab biotinilado através do qual a presença e reactividade do resíduo de cisteina introduzido podem ser detectadas e medidas. A reacção de um TioFab com um reagente ligador multifuncional proporciona um TioFab com um ligador funcionalizado que pode ainda reagir com um reagente de porção fármaco ou outro marcador. A reacção de um TioFab com um intermediário ligador a fármacos proporciona um conjugado TioFab-fármaco.
Os métodos exemplares aqui descritos podem ser geralmente aplicados à identificação e produção de anticorpos, e mais geralmente, a outras proteínas através da aplicação dos passos de desenho e pesquisa aqui descritos. 249 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Uma tal abordagem pode ser aplicada à conjugação de outros reagentes reactivos com tiol nos quais o grupo reactivo, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfureto de piridilo, ou outro parceiro de conjugação reactivo com tiol (Haugland, 2003, "Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes", Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3: 2; German. 1997, "Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach", Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1: 2; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press. San Diego, págs. 40-55, 643-671). O reagente reactivo com tiol pode ser uma porção fármaco, um fluoróforo tal como um corante fluorescente como fluoresceina ou rodamina, um agente quelante para um metal de imagiologia ou radioterapia, um marcador peptidilo ou não peptidilo ou uma etiqueta de detecção, ou um agente de modificação da eliminação tal como vários isómeros de polietilenoglicol, um péptido que se liga a um terceiro componente, ou outro hidrato de carbono ou agente lipófilo. d. Utilizações de Anticorpos Anti-CD79b Modificados com Cisteína
Os anticorpos anti-CD79b modificados com cisteína, e conjugados destes podem ser empregues como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico. O presente invento proporciona ainda métodos de prevenção, gestão, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio relacionado com células B. Em particular, o presente invento proporciona métodos de prevenção, gestão, tratamento, ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio celular proliferativo, tal como cancro, p.ex., linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto. O presente invento proporciona ainda métodos para diagnóstico de um distúrbio relacionado com CD79b ou predisposição a desenvolver um tal distúrbio, bem como métodos para identificação de anticorpos, e fragmentos de 250 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpo de ligação ao antigénio, que de preferência se ligam a polipéptidos CD79b associados a células B.
Outra concretização do presente invento dirige-se à utilização de um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que responde a um distúrbio relacionado com células B. e. Conjugados Anticorpo Modificado com Cisteína-Fármaco (Conjugados Tio-Anticorpo-Fármaco (TDC))
Outro aspecto do invento é um composto conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina (Ab), e uma porção fármaco de auristatina (D) em que o anticorpo modificado com cisteina é ligado através de um ou mais aminoácidos cisteina livres através de uma porção ligadora (L) a D; o composto possuindo a Fórmula I:
Ab-(L-D)p I onde p é 1, 2, 3, ou 4; e em que o anticorpo modificado com cisteina é preparado através de um processo compreendendo a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo-mãe anti-CD79b por um ou mais aminoácidos cisteina livres.
Outro aspecto do invento é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I onde a carga média de fármaco por anticorpo é de cerca de 2 a cerca de 5, ou cerca de 3 a cerca de 4.
As Figuras 24-28 e 48-49 mostram concretizações de conjugados anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco (ADC) onde uma porção fármaco de auristatina é ligada a um grupo cisteina introduzido: na cadeia leve (LC-ADC) ou na cadeia pesada (HC-ADC).
Potenciais vantagens dos conjugados anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco incluem melhor segurança (maior índice terapêutico), melhores parâmetros de PK, as 251 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligações dissulfureto intercadeias do anticorpo serem mantidas o que pode estabilizar o conjugado e manter a sua conformação de ligação activa, os locais de conjugação com o fármaco são definidos, e a preparação de conjugados anticorpo modificado com cisteina-fármaco a partir da conjugação de anticorpos modificados com cisteina com reagentes ligadores a fármacos resulta num produto mais homogéneo.
Ligadores "Ligador", "Unidade Ligadora", ou "união" significa uma porção quimica compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma porção fármaco. Em várias concretizações, um ligador é especificado como L. Um "Ligador" (L) é uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser utilizada para unir uma ou mais porções Fármaco (D) e uma unidade anticorpo (Ab) para formar conjugados anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula I. Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) podem ser convenientemente preparados utilizando um Ligador possuindo uma funcionalidade reactiva para ligação ao Fármaco e ao Anticorpo. Um tiol de cisteina de um anticorpo modificado com cisteina (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional electrófilo de um reagente ligador, uma porção fármaco ou intermediário ligador a fármacos.
Num aspecto, um Ligador tem um local reactivo que tem um grupo electrófilo que é reactivo com uma cisteina nucleófila presente num anticorpo. 0 tiol de cisteina do anticorpo é reactivo com um grupo electrófilo num Ligador e forma uma ligação covalente a um Ligador. Grupos electrófilos úteis incluem, mas não se limitam a, grupos maleimida e haloacetamida.
Ligadores incluem um radical bivalente tal como um alquildiilo, um arileno, um heteroarileno, porções tais como: - (CR2) nO (CR2) n-, unidades de repetição de alquiloxi (p.ex. polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) e alquilamino (p.ex. polietilenoamino, Jeffamine™); e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. 252 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os anticorpos modificados com cisteina reagem com reagentes ligadores ou intermediários ligadores a fármacos, com grupos funcionais electrófilos tais como maleimida ou a-halo-carbonilo, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773, e de acordo com o protocolo do Exemplo 6. 0 ligador pode ser composto por um ou mais componentes ligadores. Componentes ligadores exemplares incluem 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" ou "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe" ou "af"), p-aminobenziloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)-pentanoato ("SPP"), N-succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato ("SMCC"), N-
Succinimidil-(4-iodo-acetil)aminobenzoato ("SIAB"), etilenoxi-CH2CH2O- como uma ou mais unidades de repetição ("EO" ou "PEO"). Os componentes ligadores adicionais são conhecidos na técnica e alguns são agui descritos.
Numa concretização, o ligador L de um ADC tem a fórmula: -Aa-Ww-Yy- em que: -A- é uma unidade de Prolongamento ligada covalentemente a um tiol de cisteina do anticorpo (Ab); a é 0 ou 1; cada -W- é, independentemente, uma unidade de Aminoácidos; w é, independentemente, um inteiro variando de 0 a 12; -Y- é uma unidade Espaçadora ligada covalentemente à porção fármaco; e y é 0, 1 ou 2.
Unidade de Prolongamento A unidade de Prolongamento (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácidos (-W-) . A este respeito um anticorpo (Ab) tem um grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de um Prolongador. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes num anticorpo, naturalmente ou através de 253 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ manipulação química incluem, mas não se limitam a, sulfidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxilo, o grupo hidroxilo anomérico de um hidrato de carbono, e carboxilo. Num aspecto, os grupos funcionais do anticorpo são sulfidrilo ou amino. Os grupos sulfidrilo podem ser gerados através de redução de uma ligação dissulfureto intramolecular de um anticorpo. Alternativamente, grupos sulfidrilo podem ser gerados através de reacção de um grupo amino de uma porção lisina de um anticorpo utilizando 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou outro reagente gerador de sulfidrilo. Numa concretização, um anticorpo (Ab) tem um grupo tiol de cisteína livre que pode formar uma ligação com um grupo funcional electrófilo de uma Unidade de Prolongamento. As unidades de prolongamento exemplares nos conjugados de Fórmula I são representadas pelas Fórmulas II e III, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definido acima, e R17 é um radical bivalente seleccionado a partir de (CH2) r-carbociclilo C3-C8, 0-(CH2)r, arileno, (CH2) r-arileno, -arileno-(CH2) r-, (CH2) r-(carbociclilo C3-C8) , (carbociclilo C3-C8) - (CH2) r, heterociclilo C3-C8, (CH2)r-(heterociclilo C3-C8) , -(heterociclilo C3-C8) - (CH2) r-, - (CH2CH20) (CH2CH20) , -ch2-. - (CH2) rC (0) NRb (CH2) r-, - (CH2) ,C (0)NRb(CH2CH20)r-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2-, e - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2) r-; onde Rb é H, alquilo C2-C6, fenilo, ou benzilo; e r é independentemente, um inteiro variando de 1-10. - (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2-,
Arileno inclui radicais hidrocarbonetos aromáticos bivalentes de 6-20 átomos de carbono derivados através da remoção de dois átomos de hidrogénio dos sistemas de anéis aromáticos. Grupos arileno típicos incluem, mas não se limitam a, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenilo e semelhantes.
Grupos heterociclilo incluem um sistema de anéis em que um ou mais átomos dos anéis é um heteroátomo, p.ex. azoto, oxigénio e enxofre. 0 radical heterociclo compreende 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, 0, P, e S. Um heterociclo pode ser um monociclo com um anel de 3 a 7 membros (2 a 6 átomos de carbono ela 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, 0, P e S) ou um biciclo possuindo 7 a 10 membros nos anéis (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos seleccionados a partir de N, 0, 254 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ρ, e S) , por exemplo: um sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Os heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente os Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 até ao presente), em particular os Volumes 13, 14, 16, 19, e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.
Exemplos de heterociclos incluem para fins de exemplo e não como limitação, piridilo, di-hidropiridilo, tetra-hidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiofenilo de enxofre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetra-hidrofuranilo, bis-tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, bis-tetra-hidropiranilo, tetra-hidro-quinolinilo, tetra-hidroisoquinolinilo, deca-hidroquinolinilo, octa-hidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, lH-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4Ah-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
Grupos carbociclilo incluem um anel saturado ou insaturado possuindo 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Os carbociclos monociclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Os carbociclos biciclicos têm 7 a 12 átomos no anel, p.ex. dispostos como um sistema de biciclo 255 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema de biciclo [5,6] ou [6,6] . Exemplos de carbociclos monociclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclo-hexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, ciclo-heptilo e ciclooctilo.
Deve entender-se a partir de todas as concretizações exemplares de ADC de Fórmula I, tal como II-VI, mesmo quando não expressamente indicado, que de 1 a 4 porções fármaco estão ligadas a um anticorpo (p = 1-4), dependendo do número de resíduos de cisterna introduzidos.
H
Ab—S—f~CH2—CONH~R^-CCO)—Ww-Yv—D ui
Uma unidade de Prolonqamento de Fórmula II ilustrativa é derivada de maleimido-caproilo (MC) em que R17 é -(0¾) 5-;
MC
Uma unidade de Prolongamento ilustrativa de Fórmula II, e é derivada de maleimido-propanoilo (MP) em que R17 é -(CH2)2-:
256 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Outra unidade de Prolongamento ilustrativa de Fórmula II em que R17 é - (CH2CH20) r-CH2- e r é 2:
Outra unidade de Prolongamento ilustrativa de Fórmula II em que R17 é - (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2- onde Rb é H e cada r é 2 :
Uma unidade de Prolongamento ilustrativa de Fórmula III em que R17 é -(CH2)5-;
O \
Noutra concretização, a unidade de Prolongamento está ligada ao anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina através de uma ligação dissulfureto entre o átomo de enxofre do anticorpo modificado com cisteina e um átomo de enxofre da unidade de Prolongamento. Uma unidade de Prolongamento representativa desta concretização é representeada através da Fórmula IV, em que R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definido acima.
-O
Ab”StS~R’7“C<0)~W
!V 257 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Ainda noutra concretização, o grupo reactivo do Prolongador contém um grupo funcional reactivo com tiol que pode formar uma ligação com um tiol de cisteina livre de um anticorpo. Exemplos de grupo funcionais de reacção com tiol incluem, mas não se limitam a, maleimida, a-haloacetilo, ésteres activados tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. As unidades de Prolongamento representativas desta concretização são representadas através das Fórmulas Va e Vb, em que -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são tal como definido acima;
Vb
Noutra concretização, o ligador pode ser um ligador de tipo dendritico para ligação covalente de mais de uma porção fármaco através de uma porção ligador multifuncional de ramificação, a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43: 1987-1990). Os ligadores dendriticos podem aumentar a razão molar de fármaco para anticorpo, i.e. a carga, que está relacionada com a potência do ADC. Assim, quando um anticorpo modificado com cisteina possui apenas um grupo tiol de cisteina reactivo, uma multiplicidade de porções fármaco pode ser ligada através de um ligador dendritico.
Unidade de Aminoácidos O ligador pode compreender resíduos de aminoácidos. A unidade de Aminoácidos (-Ww-), quando presente, liga o anticorpo (Ab) à porção fármaco (D) do conjugado anticorpo modificado com cisteína-fármaco (ADC) do invento. 258 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ —Ww— é uma unidade dipeptídica, tripeptidica, tetrapeptídica, pentapeptídica, hexapeptídica, heptapeptídica, octapeptídica, nonapeptídica, decapeptídica, undecapeptídica ou dodecapeptídica. Os resíduos de aminoácidos que compreendem a unidade de Aminoácidos incluem os de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, tais como citrulina. Cada unidade -W-, independentemente, tem a fórmula indicada abaixo nos parêntesis rectos, e w é um inteiro variando de 0 a 12:
em que R19 é hidrogénio, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, benzilo, p-hidroxibenzilo, -CH2OH,-CH(OH)CH3, -ch2ch2sch3, -ch2conh2, -ch2cooh, -ch2ch2conh2, -ch2ch2cooh, - (CH2) 3NHC (=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3nhcoch3, - (CH2) 3nhcho, - (CH2) 4NHC (=NH)NH2, - (CH2) 4nh2, - (CH2) 4nhcoch3, - (CH2) 4nhcho, - (CH2) 3NHCONH2, - (CH2) 4NHCONH2, -CH2CH2CH (OH) CH2NH2, 2- piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclo-hexilo,
Quando R19 é diferente de hidrogénio, o átomo de carbono ao qual R19 se liga é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R19 259 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ se liga está, independentemente, na configuração (S) ou (R), ou numa mistura racémica. As unidades de Aminoácidos podem assim ser enantiomericamente puras, racémicas, ou diastereoméricas.
Unidades de Aminoácidos -Ww- exemplares incluem um dipéptido, um tripéptido, um tetrapéptido ou um pentapéptido. Dipéptidos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripéptidos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendem um componente ligador de aminoácidos incluem os de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos de ocorrência não natural, tais como citrulina. A unidade de Aminoácidos pode ser enzimaticamente clivada através de uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumores, para libertar a porção Fármaco (-D) , que numa concretização é protonada in vivo após libertação para proporcionar um Fármaco (D) . Os componentes ligadores de aminoácidos podem ser desenhados e optimizados na sua selectividade para clivagem enzimática através de determinadas enzimas, por exemplo, uma protease associada a tumores, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.
Unidade Espaçadora A unidade Espaçadora (-Yy-), quando presente (y = 1 ou 2), liga uma unidade de Aminoácidos (-Ww-) à porção fármaco (D) quando uma unidade de Aminoácidos está presente (w = 1-12). Alternativamente, a unidade Espaçadora liga a unidade de Prolongamento à porção Fármaco quando a unidade de Aminoácidos está ausente. A unidade Espaçadora liga também a porção fármaco à unidade de anticorpo quando tanto a unidade de Aminoácidos como a unidade de Prolongamento estão ausentes (w, y = 0). As unidades Espaçadoras são de dois tipos gerais: auto-imolativo e não auto-imolativo. Uma unidade Espaçadora não auto-imolativa é uma em que parte ou o total da unidade Espaçadora permanece ligada à porção Fármaco após clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de Aminoácidos do conjugado anticorpo-fármaco ou da porção ligador a Fármacos. 260 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Quando um ADC contendo uma unidade Espaçadora glicina-glicina ou uma unidade espaçadora glicina sofre clivagem enzimática através de uma protease associada a células tumorais, uma protease associada a células de cancro ou uma protease associada a linfócitos, uma glicina-glicina-porção Fármaco ou uma glicina-porção Fármaco é clivada de Ab-Aa-Ww-. Numa concretização, uma reacção de hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo, clivando a glicina-porção Fármaco ligada e libertando o Fármaco.
Noutra concretização, -Yy- é uma unidade de p-aminobenzilcarbamoilo (PAB) cuja porção fenileno é substituída com Qm em que Q é -alquilo Ci-C8, -O-(alquilo Ci-Cs) , -halogénio, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro variando de 0-4.
Concretizações exemplares de uma unidade Espaçadora não auto-imolativa (-Y-) são: -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val-
Cit-.
Numa concretização, é proporcionada uma porção ligador a Fármacos ou um ADC em que a unidade Espaçadora está ausente (y = 0), ou um sal ou solvato seu farmaceuticamente aceitável.
Alternativamente, um ADC contendo uma unidade Espaçadora auto-imolativa pode libertar -D. Numa concretização, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -Ww- através do átomo de azoto do amino do grupo PAB, e ligado directamente a -D através de um grupo carbonato, carbamato ou éter, onde o ADC tem a estrutura exemplar:
em que Q é -alquilo Ci-C8, -O-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de 0-4; e p varia de 1 a 4. 261 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem, mas não se limitam a, compostos aromáticos que são electronicamente semelhantes ao grupo PAB tais como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med.
Chem. Lett. 9: 2237), análogos heterocíclicos de PAB (US 2005/0256030), beta-glucuronido (WO 2007/01196R), e orto ou para-aminobenzilacetais. Podem ser utilizados espaçadores que sofrem ciclização após hidrólise de ligações amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anéis biciclo[2.2.1] e biciclo [ 2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55: 5867). A eliminação de fármacos contendo amidas que são substituídas na glicina (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 1447) são também exemplos de espaçadores auto-imolativos úteis em ADC.
Unidades Espaçadoras (-Yy-) exemplares são representadas pelas Fórmulas X-XII:
f —HN—CH2—CO—I x}
|“NHCH2C{0)-N HCHjCÍO)— I Ϊ I XJi
Ligadores dendríticos
Noutra concretização, o ligador L pode ser um ligador de tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção fármaco através de uma porção ligadora multifuncional de ramificação a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Os ligadores dendríticos podem aumentar a razão molar de fármaco para anticorpo, i.e. a carga, que está relacionada com a potência do ADC. Assim, quando um anticorpo modificado com cisteína 262 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ possui apenas um grupo tiol de cisteína reactivo, uma multiplicidade de porções fármaco pode ser ligada através de um ligador dendritico. Concretizações exemplares de ligadores dendriticos ramificados incluem unidades dendriméricas de 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol e 2,4,6-tris(hidroximetil)-fenol (WO 2004/01993; Szalai et ai. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125: 15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126: 1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4494-4499) .
Numa concretização, a unidade Espaçadora é um bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado, que pode ser utilizado para incorporar e libertar múltiplos fármacos, possuindo a estrutura:
compreendendo uma unidade dendrimérica 2 — (4 — aminobenzilideno)propano-1,3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4490-4494), em que Q é -alquilo Ci-Cs, -0-(alquilo Ci-Cs), -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um inteiro variando de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a 4.
Concretizações exemplares dos compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I incluem XlIIa (MC), XlIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit), e XlIId (MC-val-cit-PAB):
XHia XHÍb 263 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Outras concretizações exemplares de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula Ia incluem XlVa-e:
XlVa
O O
Ab-S~+~CH2C-Y-C--D
XiVb
Ab—S'
XlVc
xrvd XIVc 264 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ onde X é:
Υ é:
R i -N-e R é, independentemente, H ou alquilo Ci-C&; e n é 1 a 12.
Noutra concretização, um Ligador tem um grupo funcional reactivo que tem um grupo nucleófilo que é reactivo com um grupo electrófilo presente num anticorpo. Grupos electrófilos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a, grupos carbonilo de aldeidos e cetonas. 0 heteroátomo de um grupo nucleófilo de um Ligador pode reagir com um grupo electrófilo num anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Grupos nucleófilos úteis num Ligador incluem, mas não se limitam a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida. 0 grupo electrófilo num anticorpo proporciona um local conveniente para ligação a um Ligador.
Tipicamente, os Ligadores de tipo peptidico podem ser preparados através da formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptidicos. Tais ligações peptidicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de sintese em fase líquida (E. Schrõder e K. Lúbke (1965) "The Peptides", volume 1, págs. 76-136, 265 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptidos. Os intermediários Ligadores podem ser montados com qualquer combinação ou sequência de reacções incluindo unidades Espaçadora, Prolongadora e de Aminoácidos. As unidades Espaçadora, Prolongadora e de Aminoácidos podem empregar grupos funcionais reactivos que sejam de natureza electrófila, nucleófila ou de radicais livres. Grupos funcionais reactivos incluem, mas não se limitam a carboxilos, hidroxilos, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato, e grupos de saída, tais como O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br, -I; ou maleimida.
Por exemplo, um substituinte com carga tal como sulfonato (-S03~) ou amónio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reacção de ligação do reagente ligador com o anticorpo ou a porção fármaco, ou facilitar a reacção de ligação de Ab-L (intermediário ligador a anticorpos) com D, ou D-L (intermediário ligador a fármacos) com Ab, dependendo da via sintética empregue para preparar o ADC.
Reagentes ligadores
Conjugados do anticorpo e auristatina podem ser produzidos utilizando uma variedade de reagentes ligadores bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil-adipimidato-HC1), ésteres activos (tais como dissuccinimidil-suberato), aldeídos (tais como glutaraldeído) , compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina) , derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etitenodiamina) , diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-activo (tal como 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzeno).
Os conjugados anticorpo-fármaco podem também ser preparados com reagentes ligadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, Sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfono)benzoato), e incluindo reagentes bis-maleimida: 266 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ DTME, ΒΜΒ, BMDB, ΒΜΗ, ΒΜΟΕ, 1,8-bis-maleimidodietilenoglicol (ΒΜ(ΡΕΟ)2) , e 1,11-bis-maleimidotrietilenoglicol (ΒΜ(ΡΕΟ)3), que estão comercialmente disponíveis em Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, e outros fornecedores de reagentes. Os reagentes de bis-maleimida permitem a ligação do grupo tiol de um anticorpo modificado com cisteína a uma porção fármaco contendo tiol, marcador, ou intermediário ligador, de um modo sequencial ou concorrente. Outros grupos funcionais além da maleimida, que são reactivos com um grupo tiol de um anticorpo modificado com cisteína, porção fármaco, marcador, ou intermediário ligador incluem iodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, dissulfureto, piridildisulfido, isocianato e isotiocianato.
Reagentes ligadores úteis podem também ser obtidos através de outras fontes comerciais, tais como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), ou sintetizados de acordo com procedimentos descritos em Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60: 5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; e WO 04/032828.
Prolongadores de fórmula (Illa) podem ser introduzidos num Ligador fazendo reagir os seguintes reagentes ligadores com o terminal N de uma unidade de Aminoácidos:
onde n é um inteiro variando de 1-10 e T é -H ou -S03Na; 267 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
onde η é um inteiro variando de 0-3;
Unidades de Prolongamento podem ser introduzidas Ligador fazendo reagir os seguintes reagentes bifuncionais o terminal N de uma unidade de Aminoácidos: num com
268 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ onde X é Br ou 1.
Unidades de Prolongamento da fórmula podem também ser introduzidas num Ligador fazendo reagir os seguintes reagentes bifuncionais com o terminal N de uma unidade de Aminoácidos:
Um reagente ligador dipeptidico de valina-citrulina (val-cit ou vc) exemplar possuindo um Prolongador de maleimida e um Espaçador auto-imolativo de para-aminobenzilcarbamoilo (PAB) tem a estrutura:
Um reagente ligador dipeptidico phe-lys (Mtr, mono-4-metoxitritilo) exemplar possuindo uma unidade de Prolongamento de maleimida e uma unidade Espaçadora auto-imolativa de PAB pode ser preparado de acordo com Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38: 5257-60, e tem a estrutura: 269 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Preparação de conjugados anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco 0 ADC de Fórmula I pode ser preparado através de várias vias, empregando reacções de química orgânica, condições, e reagentes conhecidos dos peritos na técnica, incluindo: (1) reacção de um grupo cisteína de um anticorpo modificado com cisteína com um reagente ligador, para formar o intermediário ligador a anticorpos Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida de reacção com uma porção fármaco activada D; e (2) reacção de um grupo nucleófilo de uma porção fármaco com um reagente ligador, para formar o intermediário ligador a fármacos D-L, através de uma ligação covalente, seguida de reacção com um grupo cisteína de um anticorpo modificado com cisteína. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregues com uma variedade de anticorpos modificados com cisteína, porções fármaco, e ligadores para preparar os conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I.
Os grupos tiol de cisteína de anticorpos são nucleófilos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em reagentes ligadores e intermediários ligadores a fármacos incluindo: (i) ésteres activos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e benzilo, tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxilo e maleimida; e (iv) dissulfuretos, incluindo dissulfuretos de piridilo, através de permuta de sulfuretos. Grupos nucleófilos numa porção fármaco incluem, mas não se limitam a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em porções ligadoras e reagentes ligadores. 270 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os anticorpos modificados com cisteina podem ser tornados reactivos para conjugação com reagentes ligadores através de tratamento com um agente de redução tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou cloridrato de TCEP (tris (2-carboxietil)fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly. MA), seguido de reoxidação para formar novamente ligações dissulfureto intercadeias e intracadeias (Exemplo 5). Por exemplo, anticorpos monoclonais modificados com cisteina (TioMabs) inteiros expressos em células CHO são reduzidos com cerca de um excesso molar de 50 vezes de TCEP durante 3 h a 37°C para reduzir as ligações dissulfureto em adutores de cisteina que se possam formar entre os resíduos de cisteina recentemente introduzidos e a cisteina presente no meio de cultura. O TioMab reduzido é diluído e carregado numa coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3 M. As ligações dissulfureto foram reestabelecidas entre os resíduos de cisteina presentes no mAb parental com sulfato de cobre aquoso (CuS04) diluído (200 nM) à temperatura ambiente, de um dia para o outro. Alternativamente, ácido desidroascórbico (DHAA) é um oxidante eficaz para reestabelecer os grupos dissulfureto intracadeias do anticorpo modificado com cisteina após clivagem redutora dos adutores de cisteina. Outros oxidantes, i.e. agentes oxidantes, e condições oxidantes, que são conhecidos na técnica podem ser utilizados. A oxidação do ar ambiente também é eficaz. Este passo de reoxidação suave, parcial forma dissulfuretos intracadeias eficientemente com elevada fidelidade e preserva os grupos tiol dos resíduos de cisteina recentemente introduzidos. Um excesso molar de aproximadamente 10 vezes de intermediário ligador a fármacos, p.ex. MC-vc-PAB-MMAE, foi adicionado, misturado, e deixado a repousar durante cerca de uma hora à temperatura ambiente para efectuar a conjugação e formar o conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco. A mistura de conjugação foi filtrada em gel e carregada e eluída através de uma coluna HiTrap S para remover o excesso de intermediário ligador a fármacos e outras impurezas. A Figura 23 mostra o processo geral para preparar um anticorpo modificado com cisteina expresso a partir de cultura celular para conjugação. Quando o meio de cultura celular contém cisteina, dissulfureto adutores podem formar-se entre o 271 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aminoácido cisteína recentemente introduzido e a cisteina do meio. Estes adutores de cisteina, representados como um circulo nos TioMab exemplares (esquerda) na Figura 23, têm de ser reduzidos para gerar anticorpos modificados com cisteina reactivos para conjugação. Os adutores de cisteina, presumivelmente juntamente com várias ligações dissulfureto intercadeias, são clivados de forma redutora para dar uma forma reduzida do anticorpo com agentes redutores tais como TCEP. As ligações dissulfureto intercadeias entre resíduos de cisteína emparelhados são novamente formadas sob condições de oxidação parcial com sulfato de cobre, DHAA, ou exposição a oxigénio ambiente. Os resíduos de cisteína recentemente introduzidos, modificados, e desemparelhados permanecem disponíveis para reacção com reagentes ligadores ou intermediários ligadores a fármacos para formar os conjugados de anticorpo do invento. Os TioMabs expressos em linhas celulares de mamífero resultam em adutor de Cys conjugado externamente com um Cys modificado através da formação de ligações -S-S-. Assim os TioMabs purificados são tratados com os procedimentos de redução e reoxidação tal como descrito no Exemplo 5 para produzir TioMabs reactivos. Estes TioMabs são utilizados para conjugar com fármacos citotóxicos contendo maleimida, fluoróforos, e outros marcadores. 10. Imunolipossornas
Os anticorpos anti-CD79b aqui divulgados podem também ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para distribuição de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão vulgarmente dispostos numa formação de bicamada, semelhante à disposição lipídica das membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82.3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030 (1980); Pat. U.S. Nos. 4485045 e 4544545; e W097/38731 publicado a 23 de Outubro de 1997. Lipossomas com maior tempo de circulação são divulgados na Patente U.S. No. 5013556. 272 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase inversa com uma composição lipidica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfalidiletanolamina derivada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudidos através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento podem ser conjugados com os lipossomas tal como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reacção de permuta de dissulfuretos. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81(19): 1484 (1989). B. Certos Métodos de Produção de Anticorpos I. Pesquisa de Anticorpos Anti-CD79b com as Propriedades Desejadas
As técnicas para gerar anticorpos que se liguem a polipéptidos CD79b foram descritas acima. Pode-se seleccionar ainda anticorpos com certas caracteristicas biológicas, conforme desejado.
Os efeitos inibidores do crescimento de um anticorpo anti-CD79b do invento podem ser avaliados através de métodos conhecidos na técnica, p.ex. utilizando células que expressem um polipéptido CD79b endogenamente ou após transfecção com o gene de CD79b. Por exemplo, linhas celulares tumorais apropriadas e células transfectadas com CD79b podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-CD79b do invento a várias concentrações durante alguns dias (p.ex., 2-7) e coradas com violeta cristal ou MTT ou analisadas através de um outro ensaio colorimétrico. Outro método de medição da proliferação será através da comparação da tomada de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência de um anticorpo anti-CD79b do invento. Após tratamento, as células foram colhidas e a quantidade de radioactividade incorporada no ADN quantificado num contador de cintilações. Controlos positivos apropriados incluem tratamento de uma linha celular seleccionada com um anticorpo inibidor do crescimento que se sabe inibir o crescimento dessa linha celular. A inibição do 273 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada de vários modos conhecidos na técnica. A célula tumoral pode ser uma que sobre-expresse um polipéptido CD79b. 0 anticorpo anti-CD79b inibirá a proliferação celular de uma célula tumoral expressando CD79b in vitro ou in vivo em cerca de 25-100% em comparação com a célula tumoral não tratada, de preferência, em cerca de 30-100%, e ainda de preferência em cerca de 50-100% ou 70-100%, numa concretização, a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. A inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 yg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, onde a inibição do crescimento é determinada 1-10 dias após a exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo se a administração do anticorpo anti-CD79b a de cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resultar na redução do tamanho do tumor ou na redução da proliferação das células tumorais dentro de cerca de 5 dias a 3 meses desde a primeira administração do anticorpo, de preferência dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Para seleccionar um anticorpo anti-CD79b que induza morte celular, a perda de integridade da membrana tal como indicado através de, p.ex., tomada de iodeto de propidio (PI), azul de tripano ou 7AAD, pode ser avaliada relativamente ao controlo. Um ensaio da tomada de PI pode ser efectuado na ausência de células do complemento e imunitárias efectoras. As células tumorais expressando polipéptido CD79b são incubadas apenas com meio ou com meio contendo o anticorpo anti-CD79b apropriado (p.ex., a cerca de 10 pg/ml). As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após cada tratamento, as células são lavadas e aliquotadas em 12 χ 75 tubos de 35 mm com tampas de rosca (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de aglomerados de células. Os tubos recebem então PI (10 pg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN® e software CellQuest FACSCONVERT® (Becton Dickinson). Os anticorpos anti-CD79b que induzam níveis estatisticamente significativos de morte celular conforme determinado através da tomada de PI podem ser seleccionados como anticorpos anti-CD79b indutores de morte celular. 274 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Para pesquisar anticorpos que se liguem a um epitopo num polipéptido CD79b ao qual se liga um anticorpo de interesse, pode ser efectuado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como o descrito em "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988). Este ensaio pode ser utilizado para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo local ou epitopo que um anticorpo anti-CD79b conhecido. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser efectuado mapeamento de epitopos através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a sequência do anticorpo pode ser sujeita a mutagénese tal como através de varrimento de alaninas, para identificar resíduos de contacto. 0 anticorpo mutante é inicialmente testado quanto à ligação com um anticorpo policlonal para assegurar uma dobragem correcta. Num método diferente, péptidos correspondendo a diferentes regiões de um polipéptido CD79b podem ser utilizados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epitopo caracterizado ou conhecido. 2. Certos Métodos de Pesquisa de Bibliotecas
Os anticorpos anti-CD79b do invento podem ser produzidos utilizando bibliotecas combinatórias para pesquisar anticorpos com a actividade ou actividades desejadas. Por exemplo, é conhecida na técnica uma variedade de métodos para gerar bibliotecas de apresentação fágica e pesquisa de tais bibliotecas quanto a anticorpos possuindo as características de ligação desejadas. Tais métodos são descritos geralmente em Hoogenboom et al. (2001) em "Methods in Molecular Biology" 178: 1-37 (0'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), e em certas concretizações, em Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340: 1073-1093.
Em principio, clones de anticorpos sintéticos são seleccionados através de pesquisa de bibliotecas fágicas contendo o fago que apresenta vários fragmentos da região variável do anticorpo (Fv) fundidos com proteína de revestimento fágica. Tais bibliotecas fágicas são pesquisadas através de cromatografia de afinidade contra o antigénio desejado. Os clones expressando fragmentos Fv capazes de se ligar ao antigénio desejado são adsorvidos aos antigénio e 275 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ assim separados dos clones que não se ligam na biblioteca. Os clones que se ligam são então eluidos do antigénio e podem ainda ser enriquecidos através de ciclos adicionais de adsorção/eluição. Qualquer um dos anticorpos anti-CD79b do invento pode ser obtido através do desenho de um procedimento de pesquisa de antigénio adequado para seleccionar o clone fágico de interesse seguido de construção de um clone do anticorpo anti-CD79b inteiro utilizando as sequências de Fv do clone fágico de interesse e de sequências da região constante (Fc) adequadas descritas em Kabat et al., "Sequences of Proteins of Imunological Interest", Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
Em certas concretizações, o domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo é formado a partir de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, uma de cada uma das cadeias leve (VL) e pesada (VH), que apresentam ambas três voltas hipervariáveis (HVR) como regiões determinantes de complementaridade (CDR). Os domínios variáveis podem ser apresentados funcionalmente no fago, como fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) , em que VH e VL são covalentemente ligados através de um péptido curto, flexível, ou como fragmentos Fab, em que cada um pode ser fundido com um domínio constante e interagir não covalentemente, tal como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Tal como aqui utilizado, os clones fágicos codificando scFv e os clones fágicos codificando Fab são referidos colectivamente como "clones fágicos de Fv" ou "clones de Fv".
Os repertórios de genes de VH e VL podem ser separadamente clonados através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas fágicas, que podem então ser pesquisadas quanto a clones que se liguem ao antigénio tal como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). As bibliotecas de fontes imunizadas proporcionam anticorpos de elevada afinidade a um imunogénio sem necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório ingénuo pode ser clonado para proporcionar uma única fonte de anticorpos humanos a uma ampla variedade de não auto-antigénios e também auto-antigénios sem qualquer imunização tal como descrito por Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993). Finalmente, as bibliotecas de 276 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ inocentes podem também ser produzidas sinteticamente através de clonagem dos segmentos dos genes V não arranjados de células estaminais, e utilizando iniciadores de PCR contendo sequências aleatórias para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para obter o rearranjo in vitro tal como descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Em certas concretizações, o fago filamentoso é utilizado para apresentar fragmentos de anticorpo através de fusão com a proteína de revestimento menor pIII. Os fragmentos de anticorpo podem ser apresentados como fragmentos Fv de cadeia simples, em que os domínios VH e VL são ligados na mesma cadeia polipeptídica através de um espaçador polipeptídico flexível, p.ex. tal como descrito por Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia é fundida com pIII e a outra é segregada para o periplasma da célula hospedeira bacteriana onde a montagem de uma estrutura Fab-proteína de revestimento que fica apresentada na superfície do fago através do deslocamento de algumas das proteínas de revestimento de tipo selvagem, p.ex. tal como descrito em Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) .
Em geral, ácidos nucleicos codificando fragmentos do gene do anticorpo são obtidos a partir de células imunitárias colhidas de humanos ou animais. Se é desejada uma biblioteca inclinada a favor de clones anti-CD79b, o sujeito é imunizado com CD79b para gerar uma resposta de anticorpos, e as células do baço e/ou células B em circulação ou outros linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperadas para construção da biblioteca. Numa concretização preferida, uma biblioteca de fragmentos de genes de anticorpos humanos inclinada a favor de clones anti-CD79b é obtida através da geração de um resposta de anticorpos anti-CD79b em ratinhos transgénicos possuindo um conjunto de genes de imunoglobulina humanos funcional (e sem um sistema de produção de anticorpos endógenos funcional) de modo a que a imunização de CD79b dê origem a células B produtoras de anticorpos humanos contra CD79b. A geração de ratinhos transgénicos produtores de anticorpos humanos é descrita abaixo. 277 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο enriquecimento adicional de populações de células reactivas com anti-CD79b pode ser obtido utilizando um procedimento de pesquisa adequado para isolar células B expressando anticorpo especifico de CD79b ligado à membrana, por exemplo, através de separação de células utilizando cromatografia de afinidade de CD79b ou adsorção de células a CD79b marcado com fluorocromo seguido de separação de células activada por fluxo (FACS).
Alternativamente, a utilização de células do baço e/ou células B ou outros PBL de um dador não imunizado proporciona uma melhor representação do repertório de anticorpos possível, e permite também a construção de uma biblioteca de anticorpos utilizando qualquer espécie animal (humano ou não humano) em que CD79b não seja antigénico. Para bibliotecas incorporando a construção do gene do anticorpo in vitro, as células estaminais são colhidas a partir do sujeito para proporcionar ácidos nucleicos codificando para segmentos do gene do anticorpo não rearranjados. As células imunitárias de interesse podem ser obtidas a partir de uma variedade de espécies animais, tais como espécies humana, ratinho, rato, lagomorfo, lupinas, caninas, felinas, suínas, bovinas, equinas e aviárias, etc. 0 ácido nucleico codificando segmentos variáveis do gene do anticorpo (incluindo os segmentos VH e VL) é recuperado a partir de células de interesse e amplificado. No caso de bibliotecas de genes de VH e VL rearranjados, o ADN desejado pode ser obtido através do isolamento de ADN genómico ou de ARNm a partir de linfócitos seguido de reacção em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores coincidindo com as extremidades 5' e 3' dos genes de VH e VL rearran jados tal como descrito em Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), produzindo deste modo diversos repertórios de genes de V para expressão. Os genes de V podem ser amplificados a partir de ADNc e ADN genómico, com iniciadores inversos na extremidade 5' do exão codificando o domínio V maduro e iniciadores directos dentro do segmento J tal como descrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para amplificação a partir de ADNc, os iniciadores inversos podem também estar no exão líder tal como descrito em Jones et al., Biotechnol., 9: 278 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 88-89 (1991), e os iniciadores directos dentro da região constante tal como descrito em Sastry et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, pode ser incorporada degenerescência nos iniciadores tal como descrito em Orlandi et ai. (1989) ou Sastry et ai. (1989). Em certas concretizações, a diversidade da biblioteca é maximizada utilizando iniciadores de PCR direccionados a cada família de genes de V para amplificar todos os arranjos de VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico da célula imunitária, p.ex. tal como descrito no método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ou tal como descrito no método de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonagem do ADN amplificado em vectores de expressão, podem ser introduzidos locais de restrição raros dentro do iniciador de PCR como etiqueta numa extremidade tal como descrito em Orlandi et al. (1989), ou através de mais amplificação por PCR com um iniciador etiquetado tal como descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).
Os repertórios de genes de V sinteticamente rearranjados podem ser derivados in vitro a partir de segmentos de genes de V. A maioria dos segmentos de genes de VH humanos foi clonada e sequenciada (relatado em Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992 )), e mapeada (relatado em Matsuda et al.,
Nature Genet., 3: 88-94 (1993)); estes segmentos clonados (incluindo todos as conformações principais das voltas Hl e H2) podem ser utilizados para gerar diversos repertórios de genes de VH com iniciadores de PCR codificando voltas H3 de sequência e comprimento diversos, tal como descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Os repertórios de VH podem também ser feitos com todas a diversidade de sequências focada numa volta H3 longa com um único comprimento tal como descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Os segmentos de Vk e VX humanos foram clonados e sequenciados (relatado em Williams e Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser utilizados para fazer repertórios sintéticos de cadeias leves. Os repertórios sintéticos de genes de V, baseados numa variedade de voltas de VH e VL, e comprimentos L3 e H3, codificarão anticorpos de diversidade estrutural considerável. Após amplificação dos ADN de codificação do gene 279 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de V, os segmentos do gene de V da linha germinativa podem ser rearranjados in vitro de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Os repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos através da combinação dos repertórios de genes de VH e VL de vários modos. Cada repertório pode ser criado em vectores diferentes, e os vectores recombinados in vitro, p.ex., tal como descrito em Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), ou in vivo através de infecção combinatória, p.ex., o sistema loxP descrito em Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266. (1993). A abordagem de recombinação in vivo explora a natureza de duas cadeias dos fragmentos Fab para ultrapassar o limite do tamanho da biblioteca imposto pela eficiência de transformação de E. coli. Os repertórios de VH e VL ingénuos são clonados separadamente, um num fagomídeo e o outro num vector fágico. As duas bibliotecas são então combinadas através de infecção fágica de bactérias contendo o fagomídeo para que cada célula contenha uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca seja limitado apenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vectores contêm sinais de recombinação in vivo de modo a que os genes de VH e VL sejam recombinados num único replicão e sejam co-empacotados em viriões fágicos. Essas enormes bibliotecas proporcionam um grande número de anticorpos diversos de boa afinidade (Kd_1 de cerca de 1CT8 M) .
Alternativamente, os repertórios podem ser clonados sequencialmente no mesmo vector, p.ex. tal como descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 88: 7978-7982 (1991), ou montados juntos através de PCR e depois clonados, p.ex. tal como descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem por PCR pode também ser utilizada para unir os ADN de VH e VL com ADN codificando um péptido espaçador flexível para formar repertórios de Fv de cadeia simples (scFv). Ainda noutra técnica, a "montagem por PCR na célula" é utilizada para combinar genes de VH e VL dentro de linfócitos através de PCR e depois clonar os repertórios de genes ligados tal como descrito em Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992). 280 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os anticorpos produzidos por bibliotecas ingénuas (naturais ou sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd-1 de cerca de 106 a 107 M-1), mas a maturação de afinidade pode também ser imitada in vitro através da construção e nova selecção de anticorpos secundários tal como descrito em Winter et al. (1994), supra. Por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vitro utilizando polimerase tendente ao erro (relatado em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser efectuada mutando aleatoriamente uma ou mais CDR, p.ex. utilizando PCR com iniciadores possuindo sequências aleatórias abrangendo a CDR de interesse, em clones de Fv individuais seleccionados e pesquisa dos clones de maior afinidade. WO 9607754 (publicado a 14 de Março de 1996) descreveu um método para induzir mutagénese numa região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeia leve. Outra abordagem eficaz é recombinar os domínios VH ou VL seleccionados através de apresentação fágica com repertórios de variantes de domínios V de ocorrência natural obtidos a partir de dadores não imunizados e pesquisa da afinidade mais elevada em vários ciclos de rebaralhação de cadeias tal como descrito em Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades de cerca de 1CT9 M ou menos. A pesquisa de bibliotecas pode ser alcançada através de várias técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, CD79b pode ser utilizada para revestir os poços de placas de adsorção, expressa em células hospedeiras fixadas em placas de adsorção ou utilizada em separação celular, ou conjugada com biotina para captura com contas revestidas com estreptavidina, ou utilizada em qualquer outro método para pesquisa de bibliotecas de apresentação fágica.
As amostras de bibliotecas fágicas são colocadas em contacto com a CD79b imobilizada sob condições adequadas para ligação pelo menos a uma porção das partículas fágicas com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iónica, temperatura e semelhantes são seleccionadas para 281 ΕΡ 2 176 296/PT imitar condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e depois eluídos através de ácido, p.ex. tal como descrito em Barbas et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou através de base, p.ex. tal como descrito em Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou através de competição do antigénio CD79b, p.ex. num procedimento semelhante ao método de competição de antigénios de Clacks on et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecidos 20-1000 vezes num único ciclo de selecção. Além disso, os fagos enriquecidos podes ser criados em cultura bacteriana e sujeitos a mais ciclos de selecção. A eficiência da selecção depende de muitos factores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e de se múltiplos fragmentos de anticorpo num único fago podem, simultaneamente, interagir com o antigénio. Anticorpos com rápida cinética de dissociação (e fracas afinidades de ligação) podem ser mantidos através da utilização de lavagens curtas, apresentação fágica multivalente e elevada densidade de revestimento de antigénio em fase sólida. A elevada densidade não só estabiliza o fago através de interaeções multivalentes, como favorece a religação de fagos que se dissociaram. A selecção de anticorpos com uma cinética de dissociação lenta (e boas afinidades de ligação) pode ser promovida através da utilização de lavagens longas e apresentação fágica monovalente tal como descrito em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) e em WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antigénio tal como descrito em Marks et al., Biotechnol., 10. 779-783 (1992). É possível seleccionar entre anticorpos fágicos de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que diferem ligeiramente, para CD79b. No entanto, a mutação aleatória de um anticorpo seleccionado (p.ex. tal como realizada nalgumas técnicas de maturação da afinidade) é provável que dê origem a muitos mutantes, a maioria ligando-se ao antigénio, e poucos com afinidade mais elevada. Com CD79b limitante, raros fagos de elevada afinidade podem competir. Para manter todos os mutantes de afinidade mais elevada, os fagos podem ser incubados com excesso de CD79b biotinilada, mas com a CD79b biotinilada a uma concentração de menor molaridade que a constante de afinidade molar alvo para CD79b. Fagos de ligação 282 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de elevada afinidade podem então ser capturados através de contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Tal "captura de equilíbrio" permite que os anticorpos sejam seleccionados de acordo com as suas afinidades de ligação, com uma sensibilidade que permite o isolamento de clones mutantes com uma afinidade apenas duas vezes mais elevada a partir de um grande excesso de fagos com menor afinidade. As condições utilizadas na lavagem de fagos ligados a uma fase sólida podem também ser manipuladas para discriminar com base na cinética de dissociação.
Clones anti-CD79b podem ser seleccionados com base na actividade. Em certas concretizações, o invento proporciona anticorpos anti-CD79b que se ligam a células vivas que expressam naturalmente CD79b. Numa concretização, o invento proporciona anticorpos anti-CD79b que bloqueiam a ligação entre um ligando de CD79b e CD79b, mas não bloqueiam a ligação entre um ligando de CD79b e uma segunda proteína. Os clones de Fv correspondendo a tais anticorpos anti-CD79b podem ser seleccionados através de (1) isolamento de clones anti-CD79b de uma biblioteca fágica tal como descrito acima, e opcionalmente amplificação da população isolada de clones fágicos criando a população num hospedeiro bacteriano adequado; (2) selecção de CD79b e de uma segunda proteína contra a qual a actividade de bloqueio e não bloqueio, respectivamente, é desejada; (3) adsorção dos clones fágicos anti-CD79b à CD79b imobilizada; (4) utilização de um excesso da segunda proteína para eluir quaisquer clones indesejados que reconheçam determinantes de ligação a CD79b que se sobreponham ou sejam partilhados com os determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) eluição dos clones que permaneçam adsorvidos após o passo (4). Opcionalmente, os clones com as propriedades de bloqueio/não bloqueio desejadas podem ainda ser enriquecidos através de repetição dos procedimentos de selecção aqui descritos, uma ou mais vezes. 0 ADN codificando anticorpos monoclonais derivados de hibridoma ou de clones de Fv de apresentação fágica do invento é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex. através da utilização de iniciadores oligonucleotídicos desenhados para amplificar especificamente as regiões de codificação das cadeias pesada e leve de 283 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ interesse a partir de um molde de ADN de hibridoma ou fago) . Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN codificando o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151 (1992). 0 ADN codificando os clones de Fv do invento podem ser combinados com sequências de ADN conhecidas codificando as regiões constantes da cadeia pesada e/ou da cadeia leve (p.ex. as sequências de ADN apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et al., supra) para formar clones codificando cadeias pesadas e/ou leves inteiras ou parciais. Será apreciado que as regiões constantes de qualquer isotipo possam ser utilizadas para este fim, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquer humano ou espécie animal. Um clone de Fv derivado do ADN de domínio variável de uma espécie animal (tal como humano) e depois fundido com o ADN da região constante de outra espécie animal para formar a sequência ou sequências de codificação para a cadeia pesada e/ou cadeia leve "híbridas", inteiras é incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" tal como aqui utilizado. Em certas concretizações, um clone de Fv derivado de ADN variável humano é fundido com ADN da região constante humana para formar a sequência ou sequências de codificação para as cadeias pesada e/ou leve humanas inteiras ou parciais. O ADN codificando o anticorpo anti-CD79b derivado de um hibridoma pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição da sequência de codificação para os domínios constantes das cadeias pesada e leve humanas em vez de sequências homólogas de murídeo derivadas do clone de hibridoma (p.ex. tal como no método de Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). O ADN codificando um anticorpo ou fragmento derivado de hibridoma ou de um clone 284 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de Fv pode ainda ser modificado através de ligação covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina. Deste modo, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" que têm a especificidade de ligação dos anticorpos derivados do clone de Fv ou de hibridoma do invento. C. Terapia de Pró-fármacos Mediada por Enzimas Dependente de Anticorpos (ADEPT)
Os anticorpos do presente invento podem também ser utilizados em ADEPT através da conjugação do anticorpo com uma enzima activadora de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (p.ex., um agente quimioterapêutico peptidilo, ver WO81/01145) num fármaco anticancro activo. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. No. 4975278. A componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar num pró-fármaco de modo a convertê-lo na sua forma citotóxica, mais activa.
Enzimas que são úteis no método deste invento incluem, mas não se limitam a, fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticancro, 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como as catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que clivam hidratos de carbono tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para converter fármacos derivados com β-lactamos em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G-amidase, útil para converter fármacos derivados nos azotos das suas aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, anticorpos com actividade 285 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser utilizados para converter os pró-fármacos do invento em fármacos activos livres (ver, p.ex., Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Os conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados tal como aqui descrito para distribuição da abzima a uma população de células tumorais.
As enzimas deste invento podem ser covalentemente ligadas aos anticorpos anti-CD79b através de técnicas bem conhecidas na arte tais como a utilização dos reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antigénio de um anticorpo do invento ligada a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima do invento pode ser construída utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte (ver, p.ex., Neuberger et al. , Nature 312: 604-608 (1984). D. Anticorpo Anti-CD79b
Para além dos anticorpos anti-CD79b aqui descritos, está contemplado que podem ser preparadas variantes do anticorpo anti-CD79b. As variantes do anticorpo anti-CD79b podem ser preparadas através da introdução de mudanças de nucleótidos apropriadas no ADN de codificação, e/ou através de síntese do anticorpo ou polipéptido desejado. Os peritos na técnica apreciarão que as mudanças de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução do anticorpo anti-CD79b, tal como a mudança do número ou da posição dos locais de glicosilação ou a alteração das características de ancoragem à membrana.
As variações nos anticorpos anti-CD79b aqui descritas, podem ser feitas, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e linhas orientadoras para mutações conservativas e não conservativas expostas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5364934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões codificando o anticorpo ou polipéptido que resulta numa mudança na sequência de aminoácidos em comparação com o anticorpo ou polipéptido de sequência nativa. Opcionalmente a variação é através de substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido num ou mais dos domínios do anticorpo anti-CD79b. 286 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Orientação na determinação de que resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou suprimido sem afectar adversamente a actividade desejada pode ser verificada através da comparação da sequência do anticorpo anti-CD79b com a de moléculas proteicas conhecidas homólogas e da minimização do número de mudanças na sequência de aminoácidos feitas em regiões de elevada homologia. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado da substituição de um aminoácido com outro aminoácido possuindo propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tal como a substituição de uma leucina com uma serina, i.e., substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou deleções podem estar opcionalmente no intervalo de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada através da realização sistemática de inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e do teste das variantes resultantes quanto à actividade exibida pela sequência nativa inteira ou madura. São aqui proporcionados fragmentos de anticorpo anti-CD79b. Tais fragmentos podem ser truncados no terminal N ou C, ou podem não ter residuos internos, por exemplo, quando comparados com um anticorpo ou proteína nativo inteiro. Certos fragmentos não possuem resíduos de aminoácidos que não sejam essenciais para uma actividade biológica desejada do anticorpo anti-CD7 9b.
Fragmentos de anticorpos anti-CD79b podem ser preparados através de qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos peptídicos desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de anticorpo ou polipéptido através de digestão enzimática, p.ex., tratando a proteína com uma enzima que se sabe clivar proteínas em locais definidos por residuos de aminoácidos particulares, ou através da digestão do ADN com enzimas de restrição adequadas e isolamento do fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de ADN codificando um fragmento de anticorpo ou polipéptido desejado, através de reacção em cadeia da polimerase (PCR). Os oligonucleótidos que definem os terminais desejados do fragmento de ADN são empregues nos iniciadores 5' e 3' na PCR. De preferência, os fragmentos de ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ζο7 anticorpo anti-CD79b partilham pelo menos uma actividade biológica e/ou imunológica com o anticorpo anti-CD79b nativo aqui divulgado.
Em concretizações particulares, as substituições conservativas de interesse são mostradas na Tabela 8 sob o cabeçalho de substituições preferidas. Se tais substituições resultarem numa mudança na actividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela 8, ou como melhor descrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos pesquisados.
Tabela 8
Residuo Original Substituições Exemplares Substituiçõe s Preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe; leu norleucina Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; ile phe Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; leu norleucina 288 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do anticorpo anti-CD79b são alcançadas através da selecção das substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os residuos de ocorrência natural são divididos em grupos baseados em propriedades da cadeia lateral comuns: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservativas implicarão permuta de um membro de uma destas classes por outro de outra classe. Tais residuos substituídos podem também ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou, de preferência, nos restantes locais (não conservados).
As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na técnica tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alaninas, e mutagénese por PCR. Mutagénese dirigida ao local (Cárter et al. , Nucl. Acids Res. , 13: 4331 (1986); Zoller et al. , Nucl.
Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénese de cassete (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), mutagénese de selecção de restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) ou outras técnicas conhecidas podem ser efectuadas sobre o ADN clonado para produzir o ADN variante do anticorpo anti-CD79b.
Análise de varrimento de aminoácidos pode também ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varrimento preferidos estão aminoácidos neutros, relativamente pequenos. 289 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteina. A alanina é tipicamente um aminoácido de varrimento preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante (Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). A alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Mais, verifica-se frequentemente tanto em posições ocultas como expostas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)). Se a substituição de alanina não produzir quantidades de variante adequadas, pode ser utilizado um aminoácido isotérico.
Qualquer residuo de cisteina não envolvido na manutenção da conformação correcta do anticorpo anti-CD79b pode também ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir uma reticulação aberrante. Inversamente, uma ligação ou mais de cisteina podem ser adicionadas ao anticorpo anti-CD79b para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo-mãe (p.ex., um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a variante ou variantes resultantes seleccionadas para mais desenvolvimento terão propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo-mãe a partir do qual são geradas. Um modo conveniente para gerar tais variantes de substituição envolve maturação de afinidade utilizando apresentação fágica. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (p.ex., 6-7 locais) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada local. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas de uma forma monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusões com o produto do gene III de M13 empacotadas dentro de cada partícula. As variantes apresentadas por fagos são então pesquisadas quanto à sua actividade biológica (p.ex., afinidade de ligação) tal como aqui divulgado. Para identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, pode ser efectuada mutagénese de varrimento de alaninas para identificar resíduos 290 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ da região hipervariável contribuindo significativamente para ligação ao antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-antigénio para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o polipéptido CD79b. Tais residuos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas tais variantes, o painel de variantes é sujeito a pesquisa tal como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores num ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para posterior desenvolvimento.
As moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR, e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo anti-CD79b. E. Modificações de Anticorpos Anti-CD79b
Modificações covalentes de anticorpos anti-CD79b estão incluídas no âmbito deste invento. Um tipo de modificação covalente inclui a reacção de resíduos de aminoácidos alvo de um anticorpo anti-CD79b com um agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou os resíduos N- ou C-terminais do anticorpo anti-GD79b. A derivação com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação do anticorpo anti-CD79b com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilização no método para purificação de anticorpos anti-CD79b e vice-versa. Agentes de reticulação vulgarmente utilizados incluem, p.ex., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de disuccinimidilo tal como 3,3'— ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tais 291 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-( (p-azidofenil)ditio)propioimidato.
Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo nos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, "Proteins: struture and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-CD79b incluído dentro do âmbito deste invento compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do anticorpo ou polipéptido. Pretende-se que "alteração do padrão de glicosilação nativo" para os fins daqui signifique a supressão de uma ou mais porções hidrato de carbono verificadas no anticorpo anti-CD79b de sequência nativa (quer através da remoção do local de glicosilação subjacente quer através da supressão da glicosilação através de meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo anti-CD79b de sequência nativa. Além disso, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, que envolvem uma mudança na natureza e proporções das várias porções hidrato de carbono presentes. A glicosilação de anticorpos e outros de polipéptidos é tipicamente ligada em N ou ligada em 0. A ligada em N refere-se à ligação da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. A glicosilação ligada em 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora 292 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ possa também ser utilizado 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo anti-CD79b é convenientemente realizada através da alteração da sequência de aminoácidos para que este contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas acima descritas (para locais de glicosilação ligada em N) . A alteração pode também ser feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo anti-CD79b original (para locais de glicosilação ligada em 0) . A sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b pode ser opcionalmente alterada através de alterações ao nível do ADN, particularmente através da mutação do ADN codificando o anticorpo anti-CD79b em bases pré-seleccionadas para que sejam gerados codões que se traduzirão nos aminoácidos desejados.
Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono no anticorpo anti-CD79b é através de ligação química ou enzimática de glicósidos ao polipéptido. Tais métodos estão descritos na técnica, p.ex., em WO 87/05330 publicado a 11 de Setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981). A remoção das porções hidrato de carbono presentes no anticorpo anti-CD79b pode ser alcançada quimicamente ou enzimaticamente ou através da substituição por mutação de codões codificando para resíduos de aminoácidos que servem como alvos para glicosilação. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas na arte e descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono em polipéptidos pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo-glicosidases e exo-glicosidases tal como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-CD79b compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, p.ex., polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, do modo exposto nas Patentes U.S. Nos. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 293 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ou 4179337. Ο anticorpo também pode ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato) , respectivamente), em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980). O anticorpo anti-CD79b do presente invento pode também ser modificado de modo a formar moléculas quiméricas compreendendo um anticorpo anti-CD79b fundido com outra sequência polipeptidica ou de aminoácidos heteróloga.
Numa concretização, uma tal molécula quimérica compreende uma fusão do anticorpo anti-CD79b com um polipéptido etiqueta que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo anti-etiqueta se pode ligar selectivamente. A etiqueta epitopo é geralmente colocada nos terminais amino ou carboxilo do anticorpo anti-CD79b. A presença de tais formas etiquetadas com epitopo do anticorpo anti-CD79b podem ser detectadas utilizando um anticorpo contra o polipéptido etiqueta. Também, o proporcionar da etiqueta epitopo permite que o anticorpo anti-CD79b seja facilmente purificado através de purificação de afinidade utilizando um anticorpo anti-etiqueta ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue à etiqueta epitopo. Vários polipéptidos etiqueta e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem etiquetas poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipéptido etiqueta HA da gripe e seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); a etiqueta c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para esta (Evan et al., Molecular and Cellular Blology, 5: 3610-3616 (1985)); e a etiqueta glicoproteína D do virus Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Englneering, 3(6): 547-553 (1990)). Outros polipéptidos etiqueta incluem o péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)); o péptido epitopo KT3 (Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)); um péptido epitopo de a-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 294 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (1991)); e a etiqueta peptídica da proteína do gene 10 de T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 6393-6397 (1990)) .
Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode compreender a molécula quimérica pode compreender uma fusão do anticorpo anti-CD79b com uma imunoglobulina ou uma determinada região de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como "imunoadesina"), uma tal fusão pode ser com a região Fc de uma molécula de IgG. A fusões de Ig incluem de preferência a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembranar suprimido ou inactivado) de um anticorpo anti-CD79b em vez de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de Ig. Numa concretização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões charneira, CH2 e CH3, ou charneira, CHi, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina ver também Patente U.S. No. 5428130 concedida a 27 de Junho de 1995. F. Preparação de Anticorpos Anti-CD79b A descrição abaixo refere-se primariamente à produção de anticorpos anti-CD79b através da cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico codificando o anticorpo anti-CD79b. Está, como é claro, contemplado que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem ser empregues para preparar anticorpos anti-CD79b. Por exemplo, a sequência de aminoácidos apropriada, ou porções desta, pode ser produzida através de síntese peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (ver, p.ex., Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)). Síntese proteica in vitro pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou através de automação. Síntese automática pode ser alcançada, por exemplo, utilizando um Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando instruções do fabricante. Várias porções do anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o anticorpo anti-CD79b desejado. 295 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 1. Isolamento de ADN Codificando o Anticorpo Anti- CD79b ADN codificando o anticorpo anti-CD79b pode ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se crê possuir ARNm do anticorpo anti-CD79b e expressá-lo a um nível detectável. Concordantemente, ADN do anticorpo anti-CD79b humano pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano. 0 gene codificando o anticorpo anti-CD79b pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de procedimentos de síntese conhecidos (p.ex., síntese de ácidos nucleicos automática).
As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por este. A pesquisa do ADNc ou da biblioteca genómica com a sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene codificando o anticorpo anti-CD79b é a utilização de metodologia de PCR (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
As técnicas para pesquisa de uma biblioteca de ADNc são bem conhecidas na técnica. As sequências oligonucleotídicas seleccionadas como sondas devem ter um comprimento suficiente e ser suficientemente inequívocas para que os falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleótido é de preferência marcado para que possa ser detectado após hibridação com o ADN na biblioteca a pesquisar. Os métodos de marcação são bem conhecidos na técnica, e incluem a utilização de marcadores radioactivos como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo rigor moderado e rigor elevado, são proporcionadas em Sambrook et al., supra.
As sequências identificadas em tais métodos de pesquisa de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras 296 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ sequências conhecidas depositadas e disponíveis em base de dados públicas tais como GenBank ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade da sequência (ao nível dos aminoácidos ou dos nucleótidos) dentro de regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência inteira pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na técnica e tal como descrito aqui . Ácido nucleico possuindo a sequência de codificação da proteína pode ser obtido através de pesquisa de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui divulgada pela primeira vez, e, se necessário, utilizando procedimentos de extensão de iniciadores convencionais tal como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de ARNm que possam não ter sido transcritos de forma inversa em ADNc. 2. Selecção e Transformação de Células Hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem aqui descritos para produção de anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhantes, podem ser seleccionadas pelo perito na técnica sem demasiada experimentação. Em geral, os princípios, protocolos, e as técnicas práticas para maximização da produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et ai., supra.
Os métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas, o que significa a introdução de ADN no hospedeiro para que o ADN seja replicável, como um ADN extracromossómico ou através de integrante cromossómico, são conhecidos do perito na técnica, por exemplo, CaCl2, CaPCh, mediados por lipossomas, polietilenoglicol/DMSO e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é efectuada utilizando 297 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ técnicas padrão apropriadas a tais células. 0 tratamento de cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et ai., supra, ou electroporação é geralmente utilizado para procariotas. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et ai., Gene, 23: 315 (1983) e WO 89/05859 publicado a 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Os aspectos gerais de transfecções de sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. No. 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et ai., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76: 3829 (1979). No entanto, outros métodos para introdução de ADN em células, tal como através de microinjecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina, podem também ser utilizados. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et ai., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) e Mansour et ai.,
Nature, 336: 348-352 (1988). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores aqui incluem células procariotas, de levedura ou de eucarióticas superiores. a. Células Hospedeiras Procarióticas
Procariotas adequados incluem mas não se limitam a arquebactérias e eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como a estirpe MM294 de E. coli K12 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); as estirpes W3110 (ATCC 27325) e K5 772 (ATCC 53635) de E. coli. Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, p.ex., E. coli. Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ex., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. 298 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ licheniformis (p.ex., Β. licheniformis 41Ρ divulgado em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido porque é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. De preferência, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteoliticas. Por exemplo, a estirpe W3110 (Bachmann, "Cellular and Molecular Biology", vol. 2 (Washington, D.C.: "American Society for Microbiology", 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27325) pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas ao hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo a estirpe 1A2 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA; a estirpe 9E4 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA ptr3; a estirpe 2 7C7 de E. coli W3110 (ATCC 55244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; a estirpe 37D6 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; a estirpe 40B4 de E. coli W3110, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de deleção degP não resistente a canamicina; a estirpe 33D3 de E. coli W3110 possuindo o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. No. 5639635) e uma estirpe de E. coli possuindo a protease mutante periplasmática divulgada na Patente U.S. No. 4946783 concedida a 7 de Agosto de 1990. Outras estirpes e derivadas destas, tais como E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli\ 1776 (ATCC 31537) e E. coli RV308 (ATCC 31608) são também adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. Os métodos para construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas possuindo genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). É geralmente necessário seleccionar as bactérias apropriadas tendo em consideração a replicabilidade do replicão na células de uma bactéria. Por exemplo, espécies de E. coli, Serratia, ou Salmonella podem ser utilizadas de forma adequada como o hospedeiro quando plasmídeos bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são utilizados para fornecer o replicão. Tipicamente a célula hospedeira deve segregar 299 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ quantidades mínimas de enzimas proteoliticas, e inibidores de proteases adicionais podem ser desejavelmente incorporados na cultura celular. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vitro, p.ex., PCR ou outras reacções de polimerases de ácido nucleico. 0 anticorpo inteiro, fragmentos de anticorpo e proteínas de fusão de anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efectora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (p.ex., uma toxina) e o imunoconjugado por si próprio mostra eficácia na destruição de células tumorais. Os anticorpos inteiros têm maior semivida em circulação. A produção em E. coli é mais rápida e mais barata. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipéptidos em bactérias, ver, p.ex., U.S. 5648237 (Cárter et ai.), U.S. 5789199 (Joly et al.), e U.S. 5840523 (Simmons et al. ) que descrevem a região de iniciação da tradução (TIR) e sequências sinal para optimização de expressão e secreção, sendo estas patentes aqui incorporadas por referência. Após expressão, o anticorpo é isolado a partir da pasta celular de E. coli numa fracção solúvel e pode ser purificado através de, p.ex., uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de forma semelhante ao processo para purificação do anticorpo expresso p.ex., em células CHO. b. Células Hospedeiras Eucarióticas
Além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiro de clonagem ou expressão adequados para vectores codificando anticorpo anti-CD79b. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior vulgarmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139383 publicada a 2 de Maio de 1985); Kluyveromyces (Patente U.S. No. 4943529; Fleer et ai., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tal como, p.ex., K. lactis (PM98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et ai., J. Bacteriol., 154(2): 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906; Van den Berg et ai., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans, e K. 300 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ marxianus; yarrowia (ΕΡ 402226); Pichia pastoris (ΕΡ 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa (Case et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis (EP 394538 publicada a 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, p.ex., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado a 10 de Janeiro de 1991), e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 (1984)) e A. niger (Kelly e Hynes. EMBO J., 4: 475-479 (1985)). As leveduras metilotróficas são adequadas aqui e incluem, mas não se limitam a, leveduras capazes de crescer em metanol seleccionadas a partir dos géneros consistindo em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies especificas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, "The Bioquímica of Metilotrophs", 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo anti-CD79b glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insecto tais como S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera, bem como células vegetais, tais como culturas celulares de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco. Numerosas estirpes baculovirais e variantes e correspondentes células de insecto hospedeiras permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Bomhyx mori foram identificadas. Uma variedade de estirpes virais para transfecção está disponível ao público, p.ex., a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser utilizados como o vírus daqui de acordo com o presente invento, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
No entanto, o interesse vertebrados e a propagação cultura (cultura de tecidos) tem sido maior em células de de células de vertebrados em tornou-se um procedimento de 301 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ rotina. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc.
Natl. Acad. Sei. EUA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo
(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CGL51); células TRI (Mather et al., Anais N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2) .
As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem acima descritos para produção do anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes, ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. 3. Selecção e Utilização de um Vector Replicável
Para produção recombinante de um anticorpo do invento, o ácido nucleico (p.ex., ADNc ou ADN genómico) codificando-o é isolado e inserido num vector replicável para mais clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. O ADN codificando o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vectores estão disponíveis. A escolha do vector depende em parte da célula hospedeira a utilizar. Geralmente, as células hospedeiras preferidas são de origem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamífero). 302 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο vector pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vector através de uma variedade de procedimentos. Em geral, o ADN é inserido num ou mais locais de endonucleases de restrição apropriados utilizando técnicas conhecidas na arte. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais de uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas dos peritos na arte. A CD79b pode ser produzida de forma recombinante não só directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou do polipéptido maduro. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector, ou pode ser uma parte do ADN codificando o anticorpo anti-CD79b que é inserido no vector. A sequência sinal pode ser uma sequência sinal procariótica seleccionada, por exemplo, a partir do grupo de líderes da fosfatase alcalina, penicilinase, lpp, ou enterotoxina II termo-estável. Para secreção de levedura a sequência sinal pode ser, p.ex., o líder da invertase de levedura, o líder do factor alfa (incluindo líderes do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Patente U.S. No. 5010182), ou o líder da fosfatase ácida, o líder da glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicada a 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado a 15 de Novembro de 1990. Em expressão em células de mamífero, sequências sinal de mamífero podem ser utilizadas para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies aparentadas, bem como líderes de secreção virai. a. Células Hospedeiras Procarióticas
Sequências polinucleotídicas codificando componentes polipeptidicos do anticorpo do invento podem ser obtidas utilizando técnicas recombinantes padrão. As sequências 303 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ polinucleotídicas desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleótidos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de nucleótidos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências codificando os polipéptidos são inseridas num vector recombinante capaz de se replicar e expressar polinucleótidos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vectores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser utilizados para os fins do presente invento. A selecção de um vector apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a inserir no vector e da célula hospedeira particular a transformar com o vector. Cada vector contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão do polinucleótido heterólogo, ou ambas) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que reside.
Em geral, vectores plasmídicos contendo sequências de replicão e de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são utilizados em conjunto com estes hospedeiros. Tanto os vectores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas, bem como sequências marcadoras que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem de replicação do plasmideo pBR322, que contém genes codificando resistência a ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e proporciona assim um meio fácil para identificação de células transformadas, é adequada para a maioria de bactérias Gram-negativas, a origem do plasmideo 2μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos podem também conter, ou ser modificados para conterem, promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para expressão de determinados anticorpos são descritos em detalhe em Cárter et al.f Patente U.S. No. 5648237. 304 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Adicionalmente, vectores fágicos contendo sequências de replicão e de controlo que sejam compatíveis com os microorganismos hospedeiros podem ser utilizados como vectores de transformação em conjunto com estes hospedeiros. Por exemplo, um bacteriófago tal como À.GEM.TM.-ll pode ser utilizado na produção de um vector recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras susceptíveis tais como E. coli LE392. O vector de expressão do invento pode compreender dois ou mais pares promotor-cistrão, codificando cada um dos componentes polipeptídicos. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a montante (5') de um cistrão que modula a sua expressão. Os promotores procarióticos recaem tipicamente em duas classes, indutíveis e constitutivos. Um promotor indutível é um promotor que inicia maiores níveis de transcrição do cistrão sob o seu controlo em resposta a mudanças nas condições de cultura, p.ex. a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura.
Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras é bem conhecido. O promotor seleccionado pode ser operativamente ligado ao ADN do cistrão codificando a cadeia leve ou pesada através da remoção do promotor do ADN fonte através de digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector do invento. Tanto a sequência promotora nativa como muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou expressão dos genes alvo. Nalgumas concretizações, são utilizados promotores heterólogos uma vez que permitem geralmente maior transcrição e rendimentos mais elevados do gene alvo expresso em comparação com o promotor do polipéptido alvo nativo.
Promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores da β-galactamase e lactose (Chang et ai., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); 305 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ΕΡ 36776) e promotores híbridos tais como o promotor tac (deBoer et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: 21-25 (1983)) ou o trc. Os promotores para utilizar em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN codificando o anticorpo anti-CD79b. No entanto, outros promotores que sejam funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos ou fágicos conhecidos) são também adequados. As suas sequências nucleotídicas foram publicadas, permitindo deste modo que um perito os ligue a cistrões codificando as cadeias leves e pesadas alvo (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) utilizando ligadores ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.
Num aspecto do invento, cada cistrão dentro do vector recombinante compreende um componente sequência sinal de secreção que dirige a translocação dos polipéptidos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector, ou pode ser uma parte do ADN do polipéptido alvo que é inserido no vector. A sequência sinal seleccionada para os fins deste invento deve ser uma que seja reconhecida e processada (i.e. clivada através de uma sinal-peptidase) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam sequências sinal nativas dos polipéptidos heterólogos, a sequência sinal é substituída por uma sequência sinal procariótica seleccionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste nos líderes da fosfatase alcalina, penicilinase, lpp, ou enterotoxina II termo-estável (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Numa concretização do invento, as sequências sinal utilizadas em ambos os cistrões do sistema de expressão são sequências sinal STII ou variantes destas.
Noutro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com o invento pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e portanto não requer a presença de sequências sinal de secreção dentro de cada cistrão. A este respeito, as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas estirpes hospedeiras (p.ex., as estirpes trxB~ de E. coli) proporcionam condições de citoplasma que são favoráveis à formação de ligações dissulfureto, permitindo 306 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ deste modo a dobragem e montagem apropriadas das subunidades proteicas expressas. Proba e Pluckthun Gene, 159: 203 (1995). O presente invento proporciona um sistema de expressão em gue a razão guantitativa dos componentes polipeptidicos expressos pode ser modulada para maximizar o rendimento dos anticorpos do invento segregados e montados correctamente. Tal modulação é alcançada pelo menos em parte através da modulação simultânea de forças de transdução para os componentes polipeptidicos.
Uma técnica para modulação da força de tradução é divulgado em Simmons et al., Pat. U.S. No. 5840523. Utiliza variantes da região de iniciação da tradução (TIR) dentro de um cistrão. Para uma dada TIR, pode ser criada uma série de variantes da seguência de aminoácidos ou de ácido nucleico com um intervalo de forças de tradução, proporcionando deste modo um meio conveniente através do gual se pode ajustar este factor quanto ao nível de expressão da cadeia específica desejado. As variantes de TIR podem ser geradas através de técnicas de mutagénese convencionais que resultam em mudanças de codões que podem alterar a sequência de aminoácidos, embora sejam preferidas mudanças silenciosas na sequência nucleotídica. Alterações nas TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento das sequências de Shine-Dalgarno, juntamente com alterações na sequência sinal. Um método para criação de sequências sinal mutantes é a geração de um "banco de codões" no início de uma sequência de codificação que não muda a sequência de aminoácidos da sequência sinal (i.e., as mudanças são silenciosas). Isto pode ser alcançado através da mudança da terceira posição nucleotídica de cada codão; adicionalmente, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina, e arginina, têm múltiplas primeiras e segundas posições que podem adicionar complexidade na produção do banco. Este método de mutagénese é descrito em detalhe em Yansura et al., (1992) "Methods: A Companion to Methods in Enzymol", 4: 151-158.
De preferência, é gerado um conjunto de vectores com uma variedade de forças de TIR para cada cistrão aí. Este conjunto limitado proporciona uma comparação de níveis de expressão de cada cadeia bem como do rendimento dos produtos anticorpo 307 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ desejados sob várias combinações de forças de TIR. As forças de TIR podem ser determinadas através da quantificação do nível de expressão de um gene repórter tal como descrito em detalhe em Simmons et al., Pat. U.S. No. 5840523. Com base na comparação das forças de tradução, as TIR individuais desejadas são seleccionadas para serem combinadas nas construções de vectores de expressão do invento. b. Células Hospedeiras Eucarióticas
Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição. (1) Componente sequência sinal
Um vector para utilizar numa célula hospedeira eucariótica pode também conter uma sequência sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteina ou do polipéptido maduro de interesse. A sequência sinal heteróloga seleccionada é de preferência uma que seja reconhecida e processada (i.e., clivada através de uma sinal-peptidase) pela célula hospedeira. Em expressão celular de mamífero, sequências sinal de mamífero bem como líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis. O ADN para tal região precursora está ligado em enquadramento de leitura ao ADN codificando o anticorpo. (2) Origem de replicação
Geralmente, um componente origem de replicação não é necessário para vectores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem de SV40 pode ser tipicamente utilizada apenas porque contém o promotor inicial. (3) Componente gene de selecção
Os vectores de expressão e clonagem conterão tipicamente um gene de selecção, também designado um marcador 308 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ seleccionável. Genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, p.ex., o gene codificando D-alanina-racemase para Bacilli.
Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência a um fármaco e sobrevivem assim ao regime de selecção. Exemplos de tal selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico codificando o anticorpo anti-CD79b, tal como DHFR ou timidina-cinase, metalotioneína-I e II, de preferência genes de metalotioneína de primata, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular CHO deficiente em actividade de DHFR (p.ex., ATCC CRL-9096), preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980). Por exemplo, células transformadas com o gene de selecção de DHFR são primeiro identificadas através da cultura de todos os transformantes num meio de cultura contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiras de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN codificando um anticorpo, proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador seleccionável tal como aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) podem ser seleccionadas através de crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para um marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosidico, p.ex., canamicina, neomicina ou G418. Ver Patente U.S. No. 4965199. 309 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)). O gene trpl gene proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). (4) Componente Promotor
Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico codificando o anticorpo anti-CD79b para dirigir a síntese de ARNm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos.
Virtualmente todos os genes eucarióticos possuem uma região rica em AT localizada a aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência verificada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli-A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são inseridas de forma adequada em vectores de expressão eucarióticos.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzima Reg., 7: 149 (1968); Holland, Bioquímica, 17: 4900 (1978)), tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexocinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-cinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglicose-isomerase, e glucocinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões 310 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilizar em expressão em levedura são ainda descritos em EP 73657. A transcrição do anticorpo anti-CD79b a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, através de promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus da varíola aviária (UK 2211504 publicada a 5 de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, p.ex., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque-térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
Os promotores inicial e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação virai de SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para expressão de ADN em hospedeiros de mamífero utilizando o vírus de papiloma bovino como vector é divulgado na Patente U.S. No. 4419446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. No. 4601978. Ver também Reyes et al., Nature 297: 598.601 (1982) sobre expressão de ADNc de β-interferão humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-cinase a partir de vírus herpes simplex. Alternativamente, pode ser utilizada como promotor a repetição terminal longa do Vírus de Sarcoma de Rous. (5) Componente Elemento Estimulador A transcrição de um ADN codificando o anticorpo anti-CD79b por eucariotas superiores pode ser aumentada através da inserção de uma sequência estimuladora no vector. Estimuladores são elementos de acção em cis do ADN, habitualmente de cerca de 10 a 300 pb, que actuam num promotor 311 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aumentando a sua transcrição. Muitas sequências estimuladoras são agora conhecidas dos genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um estimulador de um vírus de uma célula eucariótica. Exemplos incluem o estimulador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus, o estimulador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e estimuladores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos estimuladores para activação de promotores eucarióticos. O estimulador pode ser ligado no vector numa posição a 5' ou 3' da sequência de codificação do anticorpo anti-CD79b, mas é de preferência localizado num local a 5' do promotor. (6) Componente Terminação da Transcrição
Os vectores de expressão utilizados em células eucarióticas hospedeiras (células de levedura, fungos, insectos, plantas, animais, humanos, ou nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também as sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilizar o ARNm. Tais sequências estão geralmente disponíveis na extremidade 5' e ocasionalmente, 3', das regiões não traduzidas de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica o anticorpo anti-CD79b. Um componente terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona de crescimento bovina. Ver WO94/11026 e o vector de expressão aí divulgado.
Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de anticorpo anti-CD79b em cultura de células de vertebrado recombinantes são descritos em Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117060; e EP 117058. 4. Cultura das Células Hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo anti-CD79b deste invento podem ser cultivadas numa variedade de meios. 312 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ a. Células Hospedeiras Procarióticas
As células procarióticas utilizadas para produzir os polipéptidos do invento são criadas em meios conhecidos na técnica e adequados para cultura das células hospedeiras seleccionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo de luria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Nalgumas concretizações, os meios contêm também um agente de selecção, escolhido com base na construção do vector de expressão, para permitir selectivamente o crescimento de células procarióticas contendo o vector de expressão. Por exemplo, é adicionada ampicilina ao meio para crescimento de células expressando o gene resistente a ampicilina.
Quaisquer suplementos necessários para além de fontes de carbono, azoto, e fosfato inorgânico podem também ser incluídos a concentrações apropriadas sozinhos ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte de azoto complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores seleccionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procarióticas são cultivadas a temperaturas adequadas. Para cultura de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de cerca de 20°C a cerca de 39°C, de preferência de cerca de 25°C a cerca de 37°C, ainda de preferência a cerca de 30°C. 0 pH do meio pode ser qualquer pH variando de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é de preferência de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, e de maior preferência cerca de 7,0.
Se for utilizado um promotor indutível no vector de expressão do invento, a expressão proteica é induzida sob condições adequadas à activação do promotor. Num aspecto do invento, promotores PhoA são utilizados para controlo da transcrição dos polipéptidos. Concordantemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas num meio de fosfato limitante para indução. De preferência, o meio de fosfato limitante é o meio C.R.A.P (ver, p.ex., Simmons et al., J. 313
ΕΡ 2 176 296/PT
Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vector empregue, tal como é conhecido na técnica.
Numa concretização, os polipéptidos expressos do presente invento são segregados para e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. A recuperação da proteína envolve tipicamente romper o microorganismo, geralmente através de meios tais como choque osmótico, ultra-sons ou lise. Uma vez as células rompidas, os restos celulares ou células inteiras podem ser removidos através de centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser ainda purificadas, por exemplo, através de cromatografia de afinidade em resina. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para meios de cultura e isoladas aí. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura ser filtrado e concentrado para mais purificação das proteínas produzidas. Os polipéptidos expressos podem ainda ser isolados e identificados utilizando métodos vulgarmente conhecidos tais como electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.
Num aspecto do invento, a produção do anticorpo é conduzida em grande quantidade através de um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação em larga escala com alimentação em fornadas estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações em larga escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, de preferência cerca de 1000 a 100000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam propulsores agitadores para distribuir oxigénio e nutrientes, especialmente glicose (fonte de carbono/energia preferida). A fermentação em pequena escala refere-se geralmente a uma fermentação num fermentador que não tem mais de aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
Num processo de fermentação, a indução da expressão da proteína é tipicamente iniciada após as células serem cultivadas sob condições adequadas a uma densidade desejada, p.ex., uma DO550 de cerca de 180-220, estádio no qual as 314 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ células estão na fase estacionária inicial. Pode ser utilizada uma variedade de indutores, de acordo com a construção de vector empregue, tal como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas durante cerca de 12-50 horas, embora possa ser utilizado um tempo de indução mais longo ou mais curto.
Para melhorar o rendimento e a qualidade da produção dos polipéptidos do invento, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e dobragem correctas dos polipéptidos de anticorpo segregados, vectores adicionais sobre-expressando proteínas de acompanhamento, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil-cis, trans-isomerase com actividade acompanhante) podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticas hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas acompanhantes facilitam a dobragem e solubilidade correctas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al., (1999) J. Bio. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et al.,
Patente U.S. No. 6083715; Georgiou et al., Patente U.S. No. 6027888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol . Chem. 275: 17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol . Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Mlcroblol. 39: 199-210.
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas estirpes hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas podem ser utilizadas para o presente invento. Por exemplo, estirpes de células hospedeiras podem ser modificadas para realizar uma ou mais mutações genéticas nos genes codificando proteases bacterianas conhecidas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações destas. Algumas estirpes de E. coli deficientes em proteases estão disponíveis e descritas em, por exemplo, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente U.S. No. 5264365; Georgiou et al., Patente U.S. No. 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996) . 315 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Numa concretização, estirpes de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmideos sobre-expressando uma ou mais proteínas acompanhantes são utilizadas como células hospedeiras no sistema de expressão do invento. b. Células Hospedeiras Eucarióticas
Meios comercialmente disponíveis tais como FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Blochem. 102: 255 (1980), Pat. U.S. Nos. 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; ou 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presente a concentrações finais no intervalo micromolar) , e glicose ou uma fonte energética equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas do perito na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão, e serão aparentes ao vulgar perito na técnica. 5. Detecção de Amplificação/Expressão do Gene A amplificação e/ou expressão do gene pode ser medida directamente numa amostra, por exemplo, através de Southern blotting convencional, Northern hlottlng para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 5201-5205 (1980)), dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada apropriadamente, com base nas sequências aqui proporcionadas. 316 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer dúplexes específicos, incluindo dúplexes de ADN, dúplexes de ARN, e dúplexes híbridos de ADN-ARN ou dúplexes de ADN-proteína. Os anticorpos podem, por sua vez, ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando o dúplex está ligado a uma superfície, para que após a formação do dúplex à superfície, a presença do anticorpo ligado ao dúplex possa ser detectada. A expressão do gene pode, alternativamente, ser medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e ensaio de cultura celular ou fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Os anticorpos úteis, para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos da amostra, podem ser monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido CD79b de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com ADN de CD79b e codificando um epitopo do anticorpo específico. 6. Purificação do Anticorpo Anti-CD79b
As formas do anticorpo anti-CD79b podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou de lisados das células hospedeiras. Se ligado à membrana, pode ser libertado da membrana utilizando uma solução detergente adequada (p.ex. Triton-X 100) ou através de clivagem enzimática. As células empregues na expressão do anticorpo anti-CD79b podem ser rompidas através de vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, rompimento mecânico, ou agentes de lise celular.
Pode ser desejado purificar o anticorpo anti-CD79b a partir de proteínas ou polipéptidos celulares recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação adequados: através de fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel 317 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG, e colunas de quelantes metálicos para ligar formas do anticorpo anti-CD79b etiquetadas com epitopo. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregues e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, "Protein Purification; Principies and Practice", Springer-Verlag, New York (1982). 0 passo ou passos de purificação seleccionados dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do anticorpo anti-CD79b particular produzido.
Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou directamente segregado para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeiro passo, os restos particulados, as células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 min. Os restos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases tal como PMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise, e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que esteja presente no 318 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiam nas cadeia pesadas humanas γΐ, γ2 ou y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para a γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual o ligando de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos que os que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina-Sepharose™, cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amónio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a recuperar.
Após qualquer ou quaisquer passos de purificação preliminares, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interacção hidrófoba de pH baixo utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizada a baixas concentrações salinas (p.ex., de cerca de 0-0,25 M de sal). G. Formulações Farmacêuticas
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) do invento podem ser administrados através de qualquer via apropriada à condição a tratar. Os ADC serão tipicamente administrados por via parentérica, i.e. infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural.
Para tratamento destes cancros, numa concretização, o conjugado anticorpo-fármaco é administrado através de infusão intravenosa. A dosagem administrada através de infusão está no intervalo de cerca de 1 yg/m2 a cerca de 10000 yg/m2 por dose, 319 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ geralmente uma dose por semana para um total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, o intervalo de dosagem é de cerca de 1 yg/m2 a cerca de 1000 yg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 800 yg/m2, cerca de 1 yg/m2 a cerca de 600 yg/m2, cerca de 1 yg/m2 a cerca de 40C i yg/m2, cerca de 10 yg/m2 a cerca de 500 yg/m2, cerca de 10 yg/m2 a cerca de 3 00 yg/m2, cerca de 10 yg/m2 a cerca de 200 yg/m2, e cerca de 1 yg/m2 a cerca de 200 pg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, múltiplas vezes por semana mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para atenuar ou aliviar os sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer um dos intervalos divulgados até à remissão do tumor ou dos sintomas do linfoma, leucemia a tratar. A administração pode continuar após a remissão ou o alivio dos sintomas ser alcançado quando tal remissão ou alívio são prolongados por tal administração continuada. O invento proporciona também um método de alívio de uma doença auto-imune, compreendendo a administração a um paciente sofrendo da doença auto-imune, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado anticorpo MA7 9b humanizado-fármaco de qualquer uma das concretizações anteriores. Em concretizações preferidas o anticorpo é administrado intravenosamente ou subcutaneamente. O conjugado anticorpo-fármaco é administrado intravenosamente a uma dosagem no intervalo de cerca de 1 yg/m2 a cerca de 100 mg/m2 por dose e, numa concretização especifica, a dosagem é de 1 yg/m2 a cerca de 500 yg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, múltiplas vezes por semana mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para atenuar ou aliviar os sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer um dos intervalos divulgados até remissão ou alívio dos sintomas da doença auto-imune a tratar. A administração pode continuar após a remissão ou o alívio dos sintomas ser alcançado quando tal remissão ou alívio são prolongados por tal administração continuada. 320 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο invento proporciona também um método de tratamento de um distúrbio de células B compreendendo a administração a um paciente sofrendo de um distúrbio de células B, tal como um distúrbio proliferativo de células B (incluindo sem limitação linfoma e leucemia) ou uma doença auto-imune, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo MA79b humanizado de qualquer uma das concretizações anteriores, anticorpo esse que não é conjuqado com uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente administrado num intervalo de dosagem de cerca de 1 yg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.
Num aspecto, o invento proporciona ainda formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b do invento e/ou pelo menos um imunoconjugado deste e/ou pelo menos um conjugado anticorpo anti-CD79b-fármaco do invento. Nalgumas concretizações, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo do invento e/ou um imunoconjugado deste, e (2) um transportador farmaceuticamente aceitável. Nalgumas concretizações, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo do invento e/ou um imunoconjugado deste, e, opcionalmente, (2) pelo menos um agente terapêutico adicional. Agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não se limitam aos descritos abaixo. O ADC será tipicamente administrado por via parentérica, i.e. infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural.
Formulações terapêuticas compreendendo um imunoconjugado de anticorpo anti-CD79b ou CD79b utilizado de acordo com o presente invento são preparadas para armazenamento através de mistura do anticorpo ou imunoconjugado, possuindo o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais ("Remington's Pharmaceutical Sciences" 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como acetato, Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil- 321 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; álcool fenólico, butilico ou benzilico; parabenos de alquilo tais como parabeno de metilo ou propilo; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; tonificantes tais como trealose e cloreto de sódio; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensioactivo tal como polissorbato; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (p.ex., complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG). As formulações farmacêuticas a utilizar para administração in vivo são geralmente estéreis. Isto é facilmente alcançado através de filtração através de membranas de filtração estéril.
As formulações aqui podem também conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência, aqueles com actividades complementares que não se afectam adversamente. Por exemplo, além de um anticorpo anti-CD79b, pode ser desejável incluir numa formulação, um anticorpo adicional, p.ex., um segundo anticorpo anti-CD79b que se ligue a um epitopo diferente no polipéptido CD79b, ou um anticorpo para algum outro alvo tal como um factor de crescimento que afecte o crescimento do cancro particular. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode ainda compreender um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento, agente anti-hormonal, e/ou cardioprotector. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e 322 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser preparadas preparações de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes que estão na forma de artigos moldados, p.ex., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustida incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli (álcool vinílico)), poliláctidos (Pat. U.S. No. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando as imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo durante muito tempo, podem desnaturar ou agregar em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Podem ser concebidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se descobrir que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de intercâmbio tio-dissulfureto, a estabilização pode ser alcançada através da modificação de resíduos de sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilizando aditivos apropriados e do desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas.
Um anticorpo pode ser formulado em qualquer forma adequada para distribuição a uma célula/tecido alvo. Por exemplo, os anticorpos podem ser formulados como 323 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para distribuição de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão vulgarmente dispostos numa formação de bicamada, semelhante à disposição lipídica das membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82.3688 (1985); Hwang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030 (1980); Pat. U.S. Nos. 4485045 e 4544545; e W097/38731 publicado a 23 de Outubro de 1997. Lipossomas com maior tempo de circulação são divulgados na Patente U.S. No. 5013556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase inversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são entrudados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento podem ser conjugados com os lipossomas tal como descrito em Martin et ai., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reacção de intercâmbio de dissulfuretos. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81(19): 1484 (1989).
As formulações a utilizar para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é facilmente alcançado por filtração através de membranas de filtração estéril. H. Tratamento com Anticorpos Anti-CD79b
Para determinar a expressão de CD79b no cancro, estão disponíveis vários ensaios de detecção. Numa concretização, a sobre-expressão do polipéptido CD79b pode ser analisada através de imuno-histoquímica (IHC). Secções de tecido impregnado em parafina de uma biopsia de tumor podem ser sujeitas ao ensaio IHC e ter atribuídos os critérios de intensidade de coloração de uma proteína CD79b como se segue: 324 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Registo 0 - nenhuma coloração é observada nem uma coloração de membrana é observada em menos de 10% das células tumorais.
Registo 1+ - uma ligeira/quase imperceptível coloração de membrana é detectada em mais de 10% das células tumorais. As células estão apenas coradas em parte da sua membrana.
Registo 2+ - uma coloração de membrana completa fraca a moderada é observada em mais de 10% das células tumorais.
Registo 3+ - uma coloração de membrana completa moderada a forte é observada em mais de 10% das células tumorais.
Os tumores com registos de 0 ou 1+ para expressão do polipéptido CD79b podem ser caracterizados como não sobre-expressando CD79b, enquanto os tumores com registos 2+ ou 3+ pode ser caracterizados como sobre-expressando CD79b.
Alternativamente ou adicionalmente, ensaios FISH tal como o INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido tumoral fixado com formalina, embebido em parafina para determinar a extensão (se houver) de sobre-expressão de CD79b no tumor. A sobre-expressão ou amplificação de CD79b pode ser avaliada utilizando um ensaio de detecção in vivo, p.ex., através de administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que se liga à molécula a detectar e é etiquetada com um marcador detectável (p.ex., um isótopo radioactivo ou um marcador fluorescente) e externamente pesquisando o paciente quanto à localização do marcador.
Tal como descrito acima, os anticorpos anti-CD79b do invento têm várias aplicações não terapêuticas. Os anticorpos anti-CD79b do presente invento podem ser úteis para classificar os estádios de cancros que expressam o polipéptido CD79b (p.ex., em radioimagiologia). Os anticorpos são também úteis para purificação ou imunoprecipitação do polipéptido CD79b a partir de células, para detecção e quantificação do polipéptido CD79b in vitro, p.ex., num ELISA ou um Western blot, para matar e eliminar células expressando CD79b a partir 325 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de uma população de células mista como passo na purificação de outras células.
Actualmente, dependendo do estádio do cancro, o tratamento do cancro envolve uma ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remover o tecido canceroso, terapia de radiação e quimioterapia. A terapia de anticorpos anti-CD79b pode ser especialmente desejável em pacientes idosos que não tolerem bem a toxicidade e os efeitos secundários da quimioterapia bem como em doença metastática, onde a terapia de radiação tem uma utilidade limitada. Os anticorpos anti-CD79b do invento direccionados para um tumor são úteis para aliviar cancros expressando CD79b após diagnóstico inicial da doença ou durante relapso. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-CD79b pode ser utilizado sozinho, ou em terapia de combinação com, p.ex., hormonas, anti-angiogénios, ou compostos marcados radioactivamente, ou com cirurgia, crioterapia, e/ou radioterapia. 0 tratamento de anticorpos anti-CD79b pode ser administrado em conjunto com outras formas de terapia convencional, consecutivamente com, terapia pré- ou pós-convencional. Fármacos quimioterapêuticos tais como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina e mitoxantrona são utilizados em tratamento de cancro, em particular, em pacientes de bom risco. No presente método do invento para tratamento ou alivio de cancro, pode ser administrado anticorpo anti-CD79b ao paciente de cancro em conjunto com tratamento com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos anteriores. Em particular, está contemplada terapia de combinação com paclitaxel e derivados modificados (ver, p.ex., EP0600517). 0 anticorpo anti-CD79b será administrado com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico. Noutra concretização, o anticorpo anti-CD79b é administrado em conjunto com quimioterapia para aumentar a actividade e eficácia do agente quimioterapêutico, p.ex., paclitaxel. "The Physicians' Desk Reference" (PDR) divulga dosagens destes agentes que foram utilizadas em tratamento de vários cancros. 0 regime de dosagem e as dosagens destes fármacos quimioterapêuticos acima mencionados que são terapeuticamente eficazes dependerão do cancro particular a tratar, da extensão da doença e de outros factores familiares ao médico perito na técnica e podem ser determinados pelo médico. 326 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Numa concretização particular, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. De preferência, o imunoconjugado ligado à proteína CD79b é internalizado pela célula, resultando num aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado a matar a célula de cancro à qual se liga. Numa concretização preferida, o agente citotóxico atinge ou interfere com o ácido nucleico na célula de cancro. Exemplos de tais agentes citotóxicos são descritos acima e incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e ADN-endonucleases.
Os anticorpos anti-CD79b ou conjugados de toxinas destes são administrados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, p.ex, como um bolo ou através de infusão contínua durante um período de tempo, através das vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica, ou por inalação. É preferida a administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo.
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo anti-CD79b. A administração combinada inclui co-administração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva por qualquer ordem, em que existe de preferência um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas. De preferência tal terapia combinada resulta num efeito terapêutico sinergístico.
Pode também ser desejável combinar a administração do anticorpo ou anticorpos anti-CD79b, com a administração de um anticorpo dirigido contra outro antigénio tumoral associado ao cancro particular.
Noutra concretização, os métodos de tratamento terapêuticos do presente invento envolvem a administração combinada de um anticorpo (ou anticorpos) anti-CD79b, e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do 327 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ crescimento, incluindo co-administração de misturas de diferentes agentes quimioterapêuticos, ou outro ou outros agentes citotóxicos ou outro ou outros agentes terapêuticos que também inibam o crescimento tumoral. Agentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracilo, melfalano, ciclofosfamida, hidroxiureia e hidroxiureiataxanos (tais como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos antraciclinas. Programas da preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou determinados empiricamente pelo praticante perito. Programas da preparação e dosagem para tal quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service" Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . 0 anticorpo pode ser combinado com um composto anti-hormonal; p.ex., um composto anti-estrogénio tal como tamoxifeno; um anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616812); ou um anti-androgénio tal como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Quando o cancro a tratar é um cancro independente de androgénios, o paciente pode ter sido previamente sujeito a terapia anti-androgénio e, após o cancro se tornar independente de androgénios, o anticorpo anti-CD79b (e opcionalmente outros agentes tal como aqui descrito) pode ser administrado ao paciente.
Por vezes pode ser benéfico co-administrar também um cardioprotector (para prevenir ou reduzir disfunção do miocárdio associada à terapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Adicionalmente aos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser sujeito a remoção cirúrgica de células de cancro e/ou terapia de radiação (p.ex. feixe de irradiação externo ou terapia com um agente marcador radioactivo, tal como um anticorpo), antes, simultaneamente, ou após terapia de anticorpos. As dosagens adequadas para qualquer um dos agentes co-administrados acima são as actualmente utilizadas e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente com anticorpo anti-CD79b. A composição de anticorpo do invento será formulada, doseada e administrada de um modo consistente com a boa prática médica. Factores a considerar neste contexto incluem o distúrbio particular a tratar, o mamífero particular a tratar, 328 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o local de distribuição do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros factores conhecidos dos médicos assistentes. 0 anticorpo não precisa de ser, mas opcionalmente é, formulado com um ou mais agentes actualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos do invento presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros factores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração tal como aqui utilizadas anteriormente ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregues anteriormente.
Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dosagem e o modo de administração serão escolhidos pelo médico de acordo com critérios conhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a tratar, tal como definido acima, da gravidade e do curso da doença, de se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo é administrado de modo adequado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. De preferência, o anticorpo é administrado através de infusão intravenosa ou através de injecções subcutâneas. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, de cerca de 1 yg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal (p.ex., cerca de 0,1-15 mg/kg/dose) de anticorpo pode ser uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, ou através de infusão contínua. Um regime de dosagem pode compreender a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida de uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-CD79b. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 yg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas de doença. O progresso desta terapia pode ser facilmente monitorizado através de métodos e 329 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ensaios convencionais e baseados em critérios conhecidos do médico ou outros peritos na técnica.
Além da administração da proteína anticorpo ao paciente, o presente pedido contempla a administração do anticorpo através de terapia génica. Tal administração de ácido nucleico codificando o anticorpo é englobada pela expressão "administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo". Ver, por exemplo, WO96/07321 publicado a 14 de Março de 1996 em relação à utilização de terapia génica para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens principais para colocar o ácido nucleico (opcionalmente contido num vector) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para distribuição in vivo o ácido nucleico é injectado directamente no paciente, habitualmente no local onde o anticorpo é necessário. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente directamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (ver, p.ex., Patentes U.S. Nos. 4892538 e 5283187). Está disponível uma variedade de técnicas para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células em cultura in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, electroporação, microinjecção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vector vulgarmente utilizado para distribuição ex vivo do gene é um vector retroviral. Técnicas de transferência in vivo de ácidos nucleicos actualmente preferidas incluem transfecção com vectores virais (tais como adenovírus, vírus Herpes simplex I, ou vírus adeno-associados) e sistemas baseados em lípidos (lípidos úteis para transferência mediada por lípidos do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Para uma revisão dos protocolos de marcação de genes e terapia génica actualmente conhecidos ver Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992). Ver também WO 93/25673 e as referências aí citadas. 330 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os anticorpos anti-CD79b do invento podem estar nas diferentes formas englobadas pela definição de "anticorpo" aqui. Assim, os anticorpos incluem anticorpo inteiro ou intacto, fragmentos de anticorpo, anticorpo de sequência nativa ou variantes de aminoácidos, anticorpos humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados, e fragmentos funcionais destes. Nos anticorpos de fusão uma sequência de anticorpo é fundida com uma sequência polipeptídica heteróloga. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para proporcionar funções efectoras desejadas. Tal como discutido com maior detalhe nas secções aqui, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu ligado na superfície celular pode induzir citotoxicidade, p.ex., através de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou através de recrutamento do complemento em citotoxicidade dependente do complemento, ou algum outro mecanismo. Alternativamente, quando é desejável eliminar ou reduzir a função efectora, de modo a minimizar efeitos secundários ou complicações terapêuticas, podem ser utilizadas certas outras regiões Fc.
Numa concretização, o anticorpo compete pela ligação ou liga-se substancialmente ao mesmo epitopo que os anticorpos do invento. Anticorpos possuindo as características biológicas dos presentes anticorpos anti-CD79b do invento estão também contemplados, especificamente incluindo o alvejamento in vivo de tumores e qualquer inibição da proliferação celular ou características citotóxicas.
Os métodos de produção dos anticorpos acima são aqui descritos em detalhe.
Os presentes anticorpos anti-CD79b são úteis para tratar um cancro expressando CD79b ou aliviar um ou mais sintomas do cancro num mamífero. Um tal cancro inclui, mas não se limita a, cancros hematopoéticos ou cancros relacionados com o sangue, tais como linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfóides, mas também cancros do baço e cancros dos nódulos linfáticos. Exemplos mais particulares de tais cancros associados a células B, incluindo por exemplo linfomas de grau elevado, intermédio e baixo (incluindo linfomas de células B tais como, por exemplo, linfoma de células B de tecido 331 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ linfóide associado à mucosa e linfoma não-Hodgkin, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocitico de pequenas células, linfoma da zona marginal, linfoma de grandes células difusas, linfoma folicular, e linfoma de Hodgkin e linfornas de células T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocitica crónica, tal como leucemia de células B (linfócitos B CD5+), leucemia mielóide, tal como leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, leucemia linfóide, tal como leucemia linfoblástica aguda e mielodisplasia), e outros cancros hematológicos e/ou associados a células B ou células T. Os cancros englobam cancros metastáticos de qualquer um dos anteriores. 0 anticorpo é capaz de se ligar a pelo menos uma porção da células de cancro que expressam o polipéptido CD79b no mamifero. Numa concretização preferida, o anticorpo é eficaz a destruir ou matar células tumorais expressando CD79b ou a inibir o crescimento de tais células tumorais, in vitro ou in vivo, após ligação ao polipéptido CD79b na célula. Um tal anticorpo inclui um anticorpo anti-CD79b nu (não conjugado com qualquer agente). Anticorpos nus que tenham propriedades citotóxicas ou de inibição do crescimento celular podem ser ainda reforçados com um agente citotóxico para os tornar ainda mais potentes na destruição de células tumorais. As propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo anti-CD79b, p.ex., através da conjugação do anticorpo com um agente citotóxico, para formar um imunoconjugado tal como aqui descrito. 0 agente citotóxico ou um agente inibidor do crescimento é de preferência uma molécula pequena. São preferíveis toxinas tais como caliqueamicina ou um maitansinóide e análogos ou derivados destas. 0 invento proporciona uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD79b do invento, e um transportador. Para os fins de tratamento de cancro, as composições podem ser administradas ao paciente a necessitar de tal tratamento, em que a composição pode compreender um ou mais anticorpos anti-CD79b presentes como um imunoconjugado ou como o anticorpo nu. Noutra concretização, as composições podem compreender estes anticorpos em combinação com outros agentes terapêuticos tais como agentes citotóxicos ou inibidores do crescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. 0 invento proporciona também formulações compreendendo um anticorpo anti-CD79b do 332 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ invento, e um transportador. Numa concretização, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto do invento é ácidos nucleicos isolados codificando os anticorpos anti-CD79b. Ácidos nucleicos codificando tanto as cadeias H como L e especialmente os resíduos da região hipervariável, cadeias que codificam o anticorpo de sequência nativa bem como variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo, estão englobados. 0 invento proporciona também métodos úteis para tratamento de um cancro expressando um polipéptido CD79b ou para aliviar um ou mais sintomas do cancro num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD79b ao mamífero. As composições terapêuticas de anticorpo podem ser administradas a curto prazo (aguda) ou crónica, ou intermitente tal como indicado pelo médico. São também proporcionados métodos de inibição do crescimento e morte de uma célula expressando polipéptido CD79b. 0 invento proporciona também estojos e artigos de fabrico compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b. Estojos contendo anticorpos anti-CD79b têm utilidade, p.ex., para ensaios de morte de células de CD79b, para purificação ou imunoprecipitação do polipéptido CD79b a partir de células. Por exemplo, para isolamento e purificação de CD79b, o estojo pode conter um anticorpo anti-CD79b ligado a contas (p.ex., contas de sepharose). Podem ser proporcionados estojos que contenham os anticorpos para detecção e quantificação de CD79b in vitro, p.ex., num ELISA ou um Western blot. Tal anticorpo útil para detecção pode ser proporcionado com um marcador tal como um marcador fluorescente ou radioactivo. I. Tratamentos de Conjugado Anticorpo-Fármaco
Está contemplado que os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) do presente invento possam ser utilizados para tratar várias doenças ou distúrbios, p.ex. caracterizados pela sobre-expressão de um antigénio tumoral. Condições exemplares ou distúrbios hiperproliferativos incluem tumores benignos ou 333 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ malignos; leucemia e malignidades linfóides. Outros incluem distúrbios neuronais, gliais, de astrócitos, hipotalâmicos, glandulares, de macrófagos, epiteliais, do estroma, blastocélicos, inflamatórios, angiogénicos e imunológicos, incluindo distúrbios auto-imunes.
Os compostos ADC que são identificados nos modelos animais e ensaios baseados em células podem ser ainda testados em primatas superiores possuindo tumores e ensaios clinicos humanos. Os ensaios clinicos humanos podem ser desenhados para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-CD79b ou imunoconjugado do invento em pacientes experimentando um distúrbio proliferativo de células B incluindo sem limitação linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto. 0 ensaio clinico pode ser desenhado para avaliar a eficácia de um ADC em combinações com regimes terapêuticos conhecidos, tais como radiação e/ou quimioterapia envolvendo agentes quimioterapêuticos e/ou citotóxicos conhecidos.
Geralmente, a doença ou o distúrbio a tratar é uma doença hiperproliferativa tal como um distúrbio proliferativo de células B e/ou um cancro de células B. Exemplos de cancro a tratar aqui incluem, mas não se limitam a, distúrbio proliferativo de células B seleccionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL), e linfoma de células do manto. 0 cancro pode compreender células expressando CD79b, tal que os ADC do presente invento sejam capazes de se ligar às células de cancro. Para determinar a expressão de CD79b no cancro, vários ensaios de diagnóstico/prognóstico estão disponíveis. Numa concretização, a sobre-expressão de CD79b pode ser analisada através de IHC. Secções de tecido 334 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ impregnadas em parafina de uma biopsia de tumor podem ser sujeitas ao ensaio de IHC e ter atribuídos critérios de intensidade de coloração de proteína CD79b em relação ao grau de coloração e em gue proporção de células tumorais examinadas.
Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dosagem apropriada de um ADC dependerá do tipo de doença a tratar, tal como definido acima, da gravidade e do curso da doença, de se a molécula é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia anterior, da história clínica do paciente e resposta imunitária ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. A molécula é administrada de forma adequada ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 yg/kg a 15 mg/kg (p.ex. 0,1-20 mg/kg) da molécula é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 yg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a administrar a um paciente está no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente.
Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas de doença. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido de uma dose semanal de manutenção de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-ErbB2. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado através de técnicas e ensaios convencionais. J. Terapia de Combinação
Um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) do invento pode ser combinado numa formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto possuindo propriedades anticancro. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem 335 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ tem de preferência actividades complementares ao ADC da combinação tal que não se afectem adversamente um ao outro. 0 segundo composto pode ser um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento, agente anti-hormonal, e/ou cardioprotector. Tais moléculas estão presentes de forma adequada em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos. Uma composição farmacêutica contendo um ADC do invento pode também ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico tal como um inibidor da formação de tubulina, um inibidor da topoisomerase, ou um ligador de ADN.
Num aspecto, o primeiro composto é um ADC anti-CD79b do invento e o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 (um anticorpo nu ou um ADC). Numa concretização o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®) ou 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Outros anticorpos úteis para imunoterapia combinada com ADC anti-CD79b do invento incluem sem limitação, anti-VEGF (p.ex., Avastin®) .
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de um agente anticancro identificado de acordo com este invento, incluindo sem limitação terapia de radiação e/ou transplantes de medula óssea e sangue periférico, e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, ou um agente inibidor do crescimento. Numa dessas concretizações, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêuticos tais como anti-CD20 (p.ex., Rituxan®) ou anti-VEGF (p.ex., Avastin®) . A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui co-administração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva por qualquer ordem, em que existe de preferência um período de 336 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas.
Numa concretização, o tratamento com um ADC envolve a administração combinada de um agente anticancro aqui identificado, e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo co-administração de misturas de diferentes agentes quimioterapêuticos. Agentes quimioterapêuticos incluem taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos antraciclinas. A preparação e os programas de dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo médico assistente. A preparação e os programas de dosagem para tal quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Dosagens adequadas para qualquer um dos agentes co-administrados acima são as actualmente utilizadas e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente recentemente identificado e de outros agentes ou tratamentos quimioterapêuticos. A terapia de combinação pode proporcionar "sinergia" e mostra-se "sinergística", i.e. o efeito alcançado quando os ingredientes activos são utilizados juntos é maior que a soma dos efeitos que resultam da utilização dos compostos separadamente. Um efeito sinergístico pode ser obtido quando os ingredientes activos são: (1) co-formulados e administrados ou distribuídos simultaneamente numa formulação de unidade de dosagem combinada; (2) distribuídos através de alternância ou em paralelo como formulações separadas; ou (3) através de algum outro regime. Quando distribuídos em terapia alternada, um efeito sinergístico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou distribuídos sequencialmente, p.ex. através de diferentes injecções em seringas separadas. Em geral, durante a terapia alternada uma dosagem eficaz de cada ingrediente activo é administrada sequencialmente, i.e. em série, enquanto que em terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes activos são administradas juntas. 337 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Κ. Artigos de Fabrico e Estojos
Outra concretização do invento é um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento, a prevenção e/ou o diagnóstico de cancro expressando CD79b. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto no, ou associado ao, recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente guarda uma composição que é eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição de cancro e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um anticorpo anti-CD79b do invento. A etiqueta ou o folheto indica que a composição é utilizada para tratamento de cancro. A etiqueta ou o folheto compreenderá ainda instruções para administração da composição de anticorpo ao paciente de cancro. Além disso, o artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. São também proporcionados estojos que são úteis para vários fins, p.ex., para ensaios de morte de células expressando CD79b, para purificação ou imunoprecipitação do polipéptido CD79b a partir de células. Para isolamento e purificação do polipéptido CD79b, o estojo pode conter um anticorpo anti-CD79b ligado a contas (p.ex., contas de sepharose). Podem ser proporcionados estojos que contêm os anticorpos para detecção e quantificação do polipéptido CD79b in vitro, p.ex., num ELISA ou num Western blot. Tal como com o artigo de fabrico, o estojo compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto no, ou associado ao, recipiente. 0 recipiente guarda uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b do invento. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contêm, p.ex., diluentes e tampões, 338 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpos de controlo. A etiqueta ou o folheto pode proporcionar uma descrição da composição bem como instruções para a utilização ou detecção in vitro pretendida. L. Utilizações para Polipéptidos CD79b São aqui divulgados métodos de pesquisa de compostos para identificar os que imitam o polipéptido CD79b (agonistas) ou previnem o efeito do polipéptido CD79b (antagonistas). Os ensaios de pesquisa de fármacos antagonistas candidatos são desenhados para identificar compostos que se liguem ou complexem com os polipéptido CD79b codificados pelos genes aqui identificados, ou que interfiram de outro modo com a interacção dos polipéptidos codificados com outras proteínas celulares, incluindo p.ex., inibição da expressão do polipéptido CD79b a partir de células. Tais ensaios de pesquisa incluirão ensaios passíveis de pesquisa de elevada tiragem de bibliotecas químicas, tornando-os particularmente adequados para identificação de candidatos a fármacos de molécula pequena.
Os ensaios podem ser efectuados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e ensaios baseados em células, que estão bem caracterizados na técnica.
Todos os ensaios de antagonistas são comuns por exigirem o contacto do fármaco candidato com um polipéptido CD79b codificado por um ácido nucleico aqui identificado sob condições e durante um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.
Em ensaios de ligação, a interacção é ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular, o polipéptido CD79b codificado pelo gene aqui identificado ou o fármaco candidato é imobilizado numa fase sólida, p.ex., sobre uma placa de microtitulação, através de ligações covalentes ou não-covalentes. A ligação não-covalente é geralmente alcançada através de revestimento da superfície sólida com uma solução do polipéptido CD79b e secagem. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, p.ex., um anticorpo monoclonal, específico para o 339 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ polipéptido CD79b a imobilizar pode ser utilizado para o ancorar numa superfície sólida. 0 ensaio é realizado adicionando o componente não imobilizado, que pode ser marcado com um marcador detectável, ao componente imobilizado, p.ex., a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção está completa, os componentes que não reagiram são removidos, p.ex., através de lavagem, e os complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado possui um marcador detectável, a detecção de marcador imobilizado na superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não possui um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo utilizando um anticorpo marcado que se ligue especificamente ao complexo imobilizado.
Se o composto candidato interagir com, mas não se ligar a, um determinado polipéptido CD79b codificado por um gene aqui identificado, a sua interacção com esse polipéptido pode ser ensaiada através de métodos bem conhecidos para detecção de interacções proteína-proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tais como, p.ex., reticulação, co-imunoprecipitação, e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, as interacções proteína-proteína podem ser monitorizadas utilizando um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9578-9582 (1991)) conforme divulgado por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muitos activadores da transcrição, tais como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente discretos, um actuando como domínio de ligação a ADN, o outro funcionando como domínio de activação da transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações anteriores (geralmente referido como "sistema de dois híbridos") aproveita esta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteína alvo é fundida com o domínio de ligação a ADN de GAL4, e outra, em que proteínas de activação candidatas são fundidas com o domínio de activação. A expressão de um gene repórter GAL1-lacZ sob controlo de um promotor activado por GAL4 depende da reconstituição da actividade de GAL4 através da interacção proteína-proteína. As colónias contendo polipéptidos que 340 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ interagem são detectadas com um substrato cromogénico para β-galactosidase. Um estojo completo (MATCHMAKER™) para identificação de interacções proteína-proteína entre duas proteínas específicas utilizando a técnica de dois híbridos está comercialmente disponível em Clontech. Este sistema pode também ser estendido para mapear domínios proteicos envolvidos em interacções proteicas específicas bem como para identificar resíduos de aminoácidos que sejam cruciais para estas interacções.
Os compostos que interferem com a interacção de um gene codificando um polipéptido CD79b aqui identificado e outros componentes intra ou extracelulares podem ser testados como se segue: geralmente é preparada uma mistura reaccional contendo o produto do gene e o componente intra ou extracelular sob condições e durante um tempo que permitam a interacção e ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto candidato para inibir a ligação, a reacção é corrida na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, pode ser adicionado um placebo a uma terceira mistura reaccional, para servir como controlo positivo. A ligação (formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra ou extracelular presente na mistura é monitorizada como aqui descrito acima. A formação de um complexo na reacção ou reacções de controlo mas não na mistura reaccional contendo o composto de teste indica que o composto de teste interfere com a interacção do composto de teste e do seu parceiro de reacção.
Para ensaiar quanto a antagonistas, o polipéptido CD79b pode ser adicionado a uma célula juntamente com o composto a pesquisar quanto a uma determinada actividade e a capacidade do composto para inibir a actividade de interesse na presença do polipéptido CD79b indica que o composto é um antagonista para o polipéptido CD79b. Alternativamente, podem ser detectados antagonistas através da combinação do polipéptido CD79b e um potencial antagonista com receptores ou receptores recombinantes do polipéptido CD79b ligado à membrana sob condições adequadas para um ensaio de inibição competitiva. O polipéptido CD79b pode ser marcado, tal como através de radioactividade, de modo a que o número de moléculas de polipéptido CD79b ligadas ao receptor possa ser utilizado para 341 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ determinar a eficácia do potencial antagonista. 0 gene codificando o receptor pode ser identificado através de numerosos métodos conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo, peneira de ligandos e separação por FACS. Coligan et al.r Current Protocols in Immun., 1(2): Capitulo 5 (1991). De preferência, é empregue clonagem de expressão em que ARN poliadenilado é preparado a partir de uma célula que responde ao polipéptido CD79b e uma biblioteca de ADNc criada a partir deste ARN é dividida em bancos e utilizada para transfectar células COS ou outras células que não respondam ao polipéptido CD79b. As células transfectadas que são cultivadas em lâminas de vidro são expostas a polipéptido CD79b marcado. 0 polipéptido CD79b pode ser marcado através de uma variedade de meios incluindo iodação ou inclusão de um local de reconhecimento para uma proteina cinase especifica do local. Após fixação e incubação, as lâminas são sujeitas a análise autorradiográfica. Os bancos positivos são identificados e são preparados sub-bancos que são re-transfectados utilizando um processo interactivo de sub-agrupamento e re-pesquisa, produzindo eventualmente um único clone que codifica o putativo receptor.
Como abordagem alternativa para identificação de receptores, o polipéptido CD79b marcado pode ser ligado por fotoafinidade à membrana celular ou a preparações de extractos que expressem a molécula receptora. 0 material reticulado é separado através de PAGE e exposto a película de raios X. 0 complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, separado em fragmentos peptídicos, e sujeito a micro-sequenciação de proteínas. A sequência de aminoácidos obtida a partir de micro-sequenciação seria utilizada para desenhar um conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para pesquisar uma biblioteca de ADNc para identificar o gene codificando o putativo receptor.
Noutro ensaio para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação de membrana expressando o receptor seriam incubadas com polipéptido CD79b marcado na presença do composto candidato. A capacidade do composto para aumentar ou bloquear esta interacção poderia então ser medida. 342 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Exemplos mais específicos de potenciais antagonistas incluem um oligonucleótido que se liga às fusões de imunoglobulina com polipéptido CD79b, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos policlonais e monoclonais e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos anti-idiotípicos e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Alternativamente, um potencial antagonista pode ser uma proteína intimamente aparentada, por exemplo, uma forma mutada do polipéptido CD79b que reconhece o receptor mas não lhe confere qualquer efeito, inibindo deste modo competitivamente a acção do polipéptido CD79b.
Os anticorpos ligando-se especificamente a um polipéptido CD79b aqui identificado, bem como outras moléculas identificadas através dos ensaios de pesquisa aqui divulgados acima, podem ser administrados para o tratamento de vários distúrbios, incluindo cancro, na forma de composições farmacêuticas.
Se o polipéptido CD79b for intracelular e forem utilizados anticorpos inteiros como inibidores, são preferidos anticorpos que se internalizem. No entanto, podem também ser utilizadas lipofecções ou lipossomas para distribuir o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, para as células. Quando são utilizados fragmentos de anticorpo, é preferido o menor fragmento inibidor que se ligue especificamente ao dominio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem ser desenhadas moléculas peptídicas que mantenham a capacidade para se ligarem à sequência proteica alvo. Tais péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos através de tecnologia de ADN recombinante. Ver, p.ex., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893 (1993). A formulação aqui pode também conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência aqueles com actividades complementares que não se afectam adversamente. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente que estimula a sua função, tais como, por exemplo, um agente 343 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico, ou agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão presentes de forma adequada em combinação em quantidades que são eficazes pra os fins pretendidos. M. Anticorpos Derivados
Os anticorpos do presente invento podem ainda ser modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e que estão facilmente disponíveis. De preferência, as porções adequadas para derivação do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil-pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,β-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil-pirrolidona)-polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (p.ex., glicerol), álcool polivinílico, e misturas destes. Propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens no fabrico devido à sua estabilidade em água. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. 0 número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se estiver ligado mais de um polímero, estes podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações incluindo, mas não limitadas às, propriedades ou funções particulares do anticorpo a melhorar, quer o anticorpo derivado seja utilizado numa terapia sob condições definidas, etc. N. Método de Pesquisa
Ainda outra concretização do presente invento é dirigida a um método de determinação da presença de um polipéptido CD79b numa amostra suspeita de conter o polipéptido CD79b, em que o método compreende a exposição da amostra a um conjugado anticorpo-fármaco deste, que se liga ao polipéptido CD79b e a 344 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ determinação da ligação do conjugado anticorpo-fármaco deste, ao polipéptido CD79b na amostra, em que a presença de tal ligação é indicativa da presença do polipéptido CD79b na amostra. Opcionalmente, a amostra pode conter células (que podem ser células de cancro) suspeitas de expressar o polipéptido CD79b. 0 conjugado anticorpo-fármaco deste, empregue no método pode ser opcionalmente marcado de forma detectável, ligado a um suporte sólido ou semelhantes.
Outra concretização do presente invento é dirigida a um método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o método compreende (a) contacto de uma amostra de teste compreendendo células de tecido obtidas a partir do mamífero com um conjugado anticorpo-f ármaco deste, que se liga a um polipéptido CD79b e (b) detecção da formação de um complexo entre o conjugado anticorpo-fármaco deste, e o polipéptido CD79b na amostra de teste, em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumor no mamífero. Opcionalmente, o conjugado anticorpo-fármaco deste, é marcado de forma detectável, ligado a um suporte sólido ou semelhantes, e/ou a amostra de teste das células do tecido é obtida a partir de um indivíduo suspeito de possuir um tumor canceroso. IV. Outros Métodos de Utilização de Anticorpos e Imunoconjugados Anti-CD79b A. Métodos de Diagnóstico e Métodos de Detecção
Num aspecto, anticorpos e imunoconjugados anti-CD79b do invento são úteis para detecção da presença de CD79b numa amostra biológica. 0 termo "detecção" tal como aqui utilizado engloba a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas concretizações, a amostra biológica compreende uma célula ou um tecido. Em certas concretizações, tais tecidos incluem tecidos normais e/ou cancerosos que expressam CD79b a níveis mais elevados relativamente a outros tecidos, por exemplo, células B e/ou tecidos associados a células B.
Num aspecto, o invento proporciona um método de detecção da presença de CD79b numa amostra biológica. Em certas concretizações, o método compreende o contacto da amostra biológica com um anticorpo anti-CD79b sob condições 345 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ permissivas para a ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e a detecção de se é formado um complexo entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b.
Num aspecto, o invento proporciona um método de diagnóstico de um distúrbio associado a expressão aumentada de CD79b. Em certas concretizações, o método compreende o contacto de uma célula de teste com um anticorpo anti-CD79b; determinação do nível de expressão (guantitativamente ou gualitativamente) de CD79b pela célula de teste através de detecção da ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b; e comparação do nível de expressão de CD79b pela célula de teste com o nível de expressão de CD79b por uma célula de controlo (p.ex., uma célula normal com a mesma origem de tecido gue a célula de teste ou uma célula que expresse CD79b a níveis comparáveis aos de uma tal célula normal), em que um nível mais elevado de expressão de CD79b pela célula de teste em comparação com a célula de controlo indica a presença de um distúrbio associado a expressão aumentada de CD79b. Em certas concretizações, a célula de teste é obtida a partir de um indivíduo suspeito de possuir um distúrbio associado a expressão aumentada de CD79b. Em certas concretizações, o distúrbio é um distúrbio celular proliferativo, tal como um cancro ou a tumor.
Distúrbios celulares proliferativos exemplares que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo do invento incluem um distúrbio de células B e/ou um distúrbio proliferativo de células B incluindo, mas não se limitando a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Em certas concretizações, um método de diagnóstico ou detecção, tal como os descrito acima, compreende a detecção de ligação de um anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso na superfície de uma célula ou numa preparação de membrana obtida a partir de uma célula expressando CD79b à sua superfície. Em certas concretizações, o método compreende o contacto de uma 346 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ célula com um anticorpo anti-CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e detecção de se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b na superfície celular. Um ensaio exemplar para detecção de ligação de um anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso na superfície de uma célula é um ensaio de "FACS".
Certos outros métodos podem ser utilizados para detectar ligação de anticorpos anti-CD79b a CD79b. Tais métodos incluem, mas não se limitam a, ensaios de ligação ao antigénio que são bem conhecidos na técnica, tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzimas), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, e imuno-histoquímica (IHC).
Em certas concretizações, os anticorpos anti-CD79b são marcados. Marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou porções que são detectados directamente (tais como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos em electrões, quimioluminescentes, e radioactivos) , bem como porções, tais como enzimas ou ligandos, que são detectados indirectamente, p.ex., através de uma reacção enzimática ou interacção molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, e 131I, fluoróforos tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferases, p.ex., luciferase do pirilampo e luciferase bacteriana (Pat. U.S. No. 4737456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases, p.ex., glicose-oxidase, galactose-oxidase, e glicose-6-fosfate-desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina-oxidase, ligados com uma enzima que emprega peróxido de hidrogénio para oxidar uma precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriofágicos, radicais livres estáveis e semelhantes.
Em certas concretizações, os anticorpos anti-CD79b são imobilizados numa matriz insolúvel. A imobilização implica a separação do anticorpo anti-CD79b de qualquer CD79b que 347 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ permaneça livre em solução. Isto é convencionalmente alcançado através de insolubilização do anticorpo anti-CD79b antes do procedimento de ensaio, tal como através de adsorção a uma matriz insolúvel em água ou superfície (Bennich et ai., U.S. 3720760), ou através de ligação covalente (por exemplo, utilizando reticulação por glutaraldeído), ou através de insolubilização do anticorpo anti-CD79b após formação de um complexo entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b, p.ex., através de imunoprecipitação.
Qualquer uma das concretizações acima de diagnóstico ou detecção pode ser realizada utilizando um imunoconjugado do invento em vez de ou além de um anticorpo anti-CD79b. B. Métodos Terapêuticos
Um anticorpo ou imunoconjugado do invento pode ser utilizado em, por exemplo, métodos terapêuticos in vitro, ex vivo, e in vivo. Num aspecto, o invento proporciona métodos para inibição de crescimento ou proliferação celular, in vivo ou in vitro, o método compreendendo a exposição de uma célula a um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado deste sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b. "Inibição de crescimento ou proliferação celular" significa diminuição do crescimento ou da proliferação de uma célula em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100%, e inclui indução de morte celular. Em certas concretizações, a célula é um tumor celular. Em certas concretizações, a célula é uma célula B. Em certas concretizações, a célula é um xenoenxerto, p.ex., tal como aqui exemplificado.
Num aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado do invento é utilizado para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de células B. Em certas concretizações, o distúrbio celular proliferativo está associado a maior expressão e/ou actividade de CD79b. Por exemplo, em certas concretizações, o distúrbio proliferativo de células B está associado a expressão aumentada de CD79b na superfície de uma célula B. Em certas concretizações, o distúrbio proliferativo de células B é um tumor ou um cancro. Exemplos de distúrbios proliferativos de células B a tratar através dos anticorpos ou imunoconjugados 348 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ do invento incluem, mas não se limitam a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Num aspecto, o invento proporciona métodos para tratamento de um distúrbio proliferativo de células B compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado deste. Em certas concretizações, um método para tratamento de um distúrbio proliferativo de células B compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado anti-CD79b e, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os proporcionados abaixo. Em certas concretizações, um método para tratamento de um distúrbio celular proliferativo compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo 1) um imunoconjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b e um agente citotóxico; e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os proporcionados abaixo.
Num aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos ou imunoconjugados do invento podem ligar-se a CD79b de uma espécie diferente da humana. Assim, os anticorpos ou imunoconjugados do invento podem ser utilizados para se ligarem a CD79b, p.ex., numa cultura celular contendo CD79b, em humanos, ou noutros mamíferos possuindo um CD79b com o qual um anticorpo ou imunoconjugado do invento reaja de forma cruzada (p.ex. chimpanzé, babuino, sagui, macacos cinomolgo e rhesus, porco ou ratinho). Numa concretização, um anticorpo ou imunoconjugado anti-CD79b pode ser utilizado para alvejar CD79b em células B através do contacto do anticorpo ou imunoconjugado com CD79b para formar um complexo anticorpo ou imunoconjugado-antigénio para que uma citotoxina conjugada do imunoconjugado aceda ao interior da célula. Numa concretização, o CD79b é CD79b humano. 349 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Numa concretização, um anticorpo ou imunoconjugado anti-CD79b pode ser utilizado num método para ligação a CD79b num indivíduo sofrendo de distúrbio associado a expressão e/ou actividade aumentada de CD79b, o método compreendendo a administração ao indivíduo do anticorpo ou imunoconjugado para que se ligue ao CD79b no indivíduo. Numa concretização, o anticorpo ou imunoconjugado ligado é internalizado na célula B expressando CD79b. Numa concretização, o CD79b é CD79b humano, e o indivíduo é um indivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero expressando CD79b ao qual se liga um anticorpo anti-CD79b. Mais ainda, o indivíduo pode ser um mamífero no qual foi introduzido CD79b (p.ex., através de administração de CD79b ou através de expressão de um transgene codificando CD79b).
Um anticorpo ou imunoconjugado anti-CD79b pode ser administrado a um humano para fins terapêuticos. Além disso, um anticorpo ou imunoconjugado anti-CD79b pode ser administrado a um mamífero não-humano expressando CD79b com o qual o anticorpo reage de forma cruzada (p.ex., um primata, porco, rato ou ratinho) para fins veterinários ou como modelo animal de doença humana. Relativamente a este último, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos ou imunoconjugados do invento (p.ex., testes de dosagens e cursos de tempo de administração).
Os anticorpos ou imunoconjugados do invento podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outras composições numa terapia. Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado do invento pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Em certas concretizações, um agente terapêutico adicional é um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, ou um agente inibidor do crescimento. Numa dessas concretizações, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêuticos tais como anti-CD20 (p.ex., Rituxan®) ou anti-VEGF (p.ex., Avastin®) , em que a terapia de combinação é útil no tratamento de cancros e/ou distúrbios de células B tal como distúrbios 350 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ proliferativos de células B incluindo linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
Tais terapias de combinação acima referidas englobam administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas), e administração separada, caso em que a administração do anticorpo ou imunoconjugado do invento pode ocorrer antes, simultaneamente, e/ou após a administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Os anticorpos ou imunoconjugados do invento podem também ser utilizados em combinação com terapia de radiação.
Um anticorpo ou imunoconjugado do invento (e qualquer agente terapêutico ou adjuvante adicional) pode ser administrado através de qualquer meio, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, intralesional. Infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Adicionalmente, o anticorpo ou imunoconjugado é administrado de forma adequada através de infusão por pulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo ou imunoconjugado. A dosagem pode ser através de qualquer via adequada, p.ex. através de injecções, tais como injecções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crónica.
Os anticorpos ou imunoconjugados do invento serão formulados, doseados, e administrados de um modo consistente com a boa prática médica, factores a considerar neste contexto incluem o distúrbio particular a tratar, o mamífero particular a tratar, a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o local de distribuição do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros factores conhecidos dos médicos assistentes. 0 anticorpo ou imunoconjugado não necessita de ser, mas é opcionalmente 351 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ formulado com um ou mais agentes actualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou imunoconjugado presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros factores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração tal como as aqui descritas, ou de cerca de 1 a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e através de qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.
Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou imunoconjugado do invento (quando utilizado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais, tais como agentes quimioterapêuticos) dependerá do tipo de doença a tratar, do tipo de anticorpo ou imunoconjugado, da gravidade e curso da doença, de se o anticorpo ou imunoconjugado é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia anterior, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo ou imunoconjugado, e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo ou imunoconjugado é administrado de forma adequada ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 yg/kg a 100 mg/kg (p.ex. 0,1 mg/kg - 20 mg/kg) de anticorpo ou imunoconjugado pode ser uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão continua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 yg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento será geralmente sustido até ocorrer a supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo ou imunoconjugado estará no intervalo de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, podem ser administradas ao paciente uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) de anticorpo ou imunoconjugado. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, p.ex. cada semana ou cada três semanas (p.ex. tal que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou p.ex. cerca de seis doses do anticorpo ou 352 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ imunoconjugado). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais elevada, seguida de uma ou mais doses inferiores. Um regime exemplar de dosagem compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida de uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem. 0 progresso desta terapia é facilmente monitorizado através de técnicas e ensaios convencionais. C. Ensaios de Actividade
Os anticorpos e imunoconjugados anti-CD79b do invento pode ser caracterizados quanto às suas propriedades físicas/químicas e/ou actividades biológicas através de vários ensaios conhecidos na técnica. 1. Ensaios de actividade
Num aspecto, são proporcionados ensaios para identificação de anticorpos anti-CD79b ou imunoconjugados destes possuindo actividade biológica. A actividade biológica pode incluir, p.ex., a capacidade para inibir crescimento ou proliferação celular (p.ex., actividade de "assassínio celular"), ou a capacidade para induzir morte celular, incluindo morte celular programada (apoptose). São também proporcionados anticorpos ou imunoconjugados possuindo tal actividade biológica in vivo e/ou in vitro.
Em certas concretizações, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado deste é testado quanto à sua capacidade para inibir o crescimento ou a proliferação celular in vitro. Ensaios da inibição do crescimento ou da proliferação celular são bem conhecidos na técnica. Certos ensaios para proliferação celular, exemplificados pelos ensaios de "assassínio celular" aqui descritos, medem a viabilidade celular. Um desses ensaios é o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo™, que está comercialmente disponível em Promega (Madison, WI). Esse ensaio determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, que é uma indicação de células metabolicamente activas. Ver Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88, Pat. US No. 6602677. O ensaio pode ser 353 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ conduzido no formato de 96 ou 384 poços, tornando-o passível de pesquisa de elevada tiragem automatizada (HTS). Ver Cree et ai. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404. O procedimento de ensaio envolve a adição de um único reagente (Reagente CellTiter-Glo®) directamente às células em cultura. Isto resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente produzido através de uma reacção de luciferase. O sinal luminescente é proporcional à quantidade de ATP presente, que é directamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cultura. Os dados podem ser registados através de um luminómetro ou dispositivo de imagiologia de câmara CCD. O resultado da luminescência é expresso como unidades relativas de luz (RLU).
Outro ensaio para proliferação celular é o ensaio "MTT", um ensaio colorimétrico que mede a oxidação de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio em formazan através da redutase mitocondrial. Tal como o ensaio CellTiter-Glo™, ente ensaio indica o número de células metabolicamente activas presentes numa cultura celular. Ver, p.ex., Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63, e Zhang et al. (2005) Câncer Res. 65: 3877-3882.
Num aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua capacidade para induzir morte celular in vitro. Ensaios de indução de morte celular são bem conhecidos na técnica. Nalgumas concretizações, tais ensaios medem, p.ex., a perda de integridade da membrana tal como indicado pela tomada de iodeto de propídio (PI), azul tripano (ver Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17: 1-11), ou 7AAD. Num ensaio de tomada de PI exemplar, as células são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM) : F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS termo-inactivado a 10% (Hyclone) e L-glutamina 2 mM. Assim, o ensaio é efectuado na ausência de complemento e células imunitárias efectoras. As células são semeadas a uma densidade de 3xl06 por caixa em caixas de 100x20 mm e deixadas aderir de um dia para o outro. O meio é removido e substituído apenas por meio fresco ou por meio contendo várias concentrações do anticorpo ou imunoconjugado. As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e desprendidas através de tripsinização. As células são então centrifugadas a 354 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, o sedimento é ressuspenso em 3 ml de tampão de ligação de Ca2+ frio (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) e aliquotado em tubos de 12x75 mm com tampa de rosca de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de grumos celulares. Os tubos receberam então PI (10 pg/ml). As amostras são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). São assim identificados anticorpos ou imunoconjugados que induzam níveis estatisticamente significativos de morte celular conforme determinado pela tomada de PI.
Num aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado anti-CD79b é testado quanto à sua capacidade para induzir apoptose (morte celular programada) In vitro. Um ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzam apoptose é um ensaio de ligação de anexina. Num ensaio de ligação de anexina exemplar, as células são cultivadas e semeadas em caixas tal como discutido no parágrafo anterior. O meio é removido e substituído apenas por meio fresco ou por meio contendo 0,001 a 10 pg/ml do anticorpo ou imunoconjugado. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e desprendidas através de tripsinização. As células são então centrifugadas, ressuspensas em tampão de ligação de Ca2+, e aliquotadas em tubos tal como discutido no parágrafo anterior. Os tubos recebem então anexina marcada (p.ex. anexina V-FITC) (1 yg/ml). As amostras são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CellQuest (BD Biosciences). São assim identificados anticorpos ou imunoconjugados que induzam níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina relativamente ao controlo. Outro ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzam apoptose é um ensaio colorimétrico ELISA de ADN de histona para detecção de degradação internucleossómica de ADN genómico. Tal ensaio pode ser efectuado utilizando, p.ex., o estojo Cell Death Detection ELISA (Roche, Paio Alto, CA). Células para utilizar em qualquer um dos ensaios in vitro acima incluem células ou linhas celulares que expressem naturalmente CD79b ou que foram modificadas para expressar CD79b. Tais células incluem células tumorais que sobre- 355 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ expressam CD79b relativamente às células normais com origem no mesmo tecido. Tais células incluem também linhas celulares (incluindo linhas celulares tumorais) que expressam CD79b e linhas celulares que normalmente não expressam CD79b mas que foram transfectadas com ácido nucleico codificando CD79b.
Num aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado deste é testado quanto à sua capacidade para inibir crescimento ou proliferação celular in vivo. Em certas concretizações, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado deste é testado quanto à sua capacidade para inibir o crescimento tumoral in vivo. Sistemas modelo in vivo, tais como modelos de xenoenxertos, podem ser utilizados para tais testes. Num sistema de xenoenxerto exemplar, células tumorais humanas são introduzidas num animal não humano imunocomprometido de modo adequado, p.ex., um ratinho SCID. Um anticorpo ou imunoconjugado do invento é administrado ao animal. A capacidade do anticorpo ou imunoconjugado para inibir ou reduzir o crescimento do tumor é medida. Em certas concretizações do sistema de xenoenxerto acima, as células tumorais humanas são células tumorais de um paciente humano. Tais células úteis para a preparação de modelos de xenoenxerto incluem linhas celulares de leucemia e linfoma humanas, que incluem, sem limitação, as células BJAB-luc (uma linha celular de linfoma de Burkitt negativa para EBV transfectada com o gene repórter da luciferase), células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923), células SuDHL-4 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha, AAC 495), células DoHH2 (ver Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 5: 221-224 (1991), e Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8: 1385-1391 (1994)), células Granta-519 (ver Jadayel, D.M. et al., Leukemia 11(1): 64-72 (1997)). Em certas concretizações, as células tumorais humanas são introduzidas num animal não humano imunocomprometido de forma adequada através de injecção subcutânea ou através de transplantação num local adequado, tal como uma almofada de gordura mamária. 2. Ensaios de ligação e outros ensaios
Num aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua actividade de ligação ao antigénio. Por exemplo, em certas concretizações, um anticorpo anti-CD79b é testado quanto à sua 356 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ capacidade para se ligar a CD79b expresso na superfície de uma célula. Um ensaio DE FACS pode ser utilizado para tais testes.
Num aspecto, podem ser utilizados ensaios de competição para identificar um anticorpo monoclonal que compita com o anticorpo de murídeo MA79b, anticorpo MA79b.vl7 humanizado e/ou MA79b.vl8 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado pela ligação a CD79b. Em certas concretizações, um tal anticorpo competidor liga-se ao mesmo epitopo (p.ex., um epitopo linear ou conformacional) ao qual se liga o anticorpo MA79b de murídeo, anticorpo MA79bv.l7 humanizado e/ou anticorpo MA79b.vl8 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado. Ensaios de competição exemplares incluem, mas não se limitam a, ensaios de rotina tais como os proporcionados em Harlow e Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos exemplares detalhados para mapear um epitopo ao qual se liga um anticorpo são proporcionados em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", em Methods in Molecular Blology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) . Dois anticorpos são referidos como ligando-se ao mesmo epitopo se cada um bloquear a ligação do outro em 50% ou mais.
Num ensaio de competição exemplar, CD79b imobilizado é incubado numa solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga a CD79b (p.ex., anticorpo MA79b de murídeo, anticorpo MA79b.vl7 humanizado e/ou anticorpo MA79b.vl8 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado) e um segundo anticorpo não marcado que esteja a ser testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo pela ligação a CD79b. O segundo anticorpo pode estar presente num sobrenadante de hibridoma. Como controlo, o CD79b imobilizado é incubado numa solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a CD79b, o excesso de anticorpo não ligado é removido e é medida a quantidade de marcador associado a CD79b imobilizado. Se a quantidade de marcador associado a CD79b imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste relativamente à amostra de controlo, então isso indica que o segundo anticorpo 357 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ está a competir com o primeiro anticorpo pela ligação a CD79b. Em certas concretizações, o CD79b imobilizado está presente na superfície de uma célula ou numa preparação de membrana obtida a partir de uma célula expressando CD79b na sua superfície.
Num aspecto, anticorpos anti-CD79b purificados podem ser ainda caracterizados através de uma série de ensaios incluindo, mas não se limitando a, sequenciação N-terminal, análise de aminoácidos, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) não desnaturante de exclusão de tamanho, espectrometria de massa, cromatografia de permuta iónica e digestão com papaína.
Numa concretização, o invento contempla um anticorpo alterado que possui algumas mas não todas as funções efectoras, o que o torna um candidato desejável para muitas aplicações em que a semivida do anticorpo in vivo é importante, contudo certas funções efectoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em certas concretizações, as actividades de Fc do anticorpo são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas são mantidas. Podem ser conduzidos ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo para confirmar a redução/depleção das actividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, podem ser conduzidos ensaios de ligação ao receptor de Fc (FcR) para assegurar que o anticorpo não tem ligação a FcyR (sendo assim provável que não tenha actividade de ADCC), mas mantém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na Patente U.S. No. 5500362 ou 5821337. Células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, p.ex., num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). Podem também ser realizados ensaios de ligação de Clq para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a Clq e não possui assim 358 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ actividade de CDC. Para avaliar a activação do complemento, pode ser efectuado um ensaio de CDC, p.ex. tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202: 163 (1996). Determinações de ligação a FcRn e da eliminação/semivida in vivo podem também ser efectuadas utilizando métodos conhecidos na técnica.
Os seguintes exemplos são dados apenas para fins ilustrativos, e não se pretende que limitem o âmbito do presente invento de qualquer forma.
EXEMPLOS
Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que indicado em contrário. Os anticorpos utilizados nos exemplos incluem anticorpos comercialmente disponíveis e incluem, mas não se limitam a, anti-CD79b (anticorpo adquirido em Biomeda (Foster City, CA) ou BDbioscience (San Diego, CA) ou Ancell (Bayport, MN)), anti-CD79b (gerado a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993), e anticorpos quiméricos anti-CD79b (compreendendo domínios variáveis de anticorpos gerados a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993). A fonte dessas células identificadas nos seguintes exemplos, e ao longo do fascículo, pelos números de acesso ATCC, é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. EXEMPLO 1: Geração de Anticorpo anti-CD79b Humanizado
Os números dos resíduos são de acordo com Kabat (Kabat et al., "Sequences of proteins of imunological interest", 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, MD (1991)). São utilizadas as abreviaturas de aminoácidos de uma letra. As degenerescências do ADN são representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/(I/T, V = A/C/G, B = C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T). A. Enxerto de Anticorpo ant±-CD79b Humanizado
Foram gerados vários anticorpos anti-CD79b humanizados. Os domínios VL e VH do anticorpo MA79b de murideo (MA79b) 359 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ (Roswell Park Câncer Institute; Okazaki et al., Blood, 81: 84-94 (1993)) foram alinhados com os domínios VL capa I de consenso humano (huKI) e VH de consenso subgrupo III humano (huIII). Para fazer o enxerto de HVR, foi utilizada a estrutura VH aceitadora, que difere do domínio VH de consenso subgrupo III humano em 3 posições: R71A, N73T, e L78A (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 (1992)). As regiões hipervariáveis do MA79b de murídeo (MA79b) foram introduzidas na estrutura de consenso aceitadora humana para gerar um enxerto de HVR directo de MA79b (aqui referido como "enxerto de MA79b" ou "enxerto MA79b" ou "anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b" ou "enxerto huMA79b"). No domínio VL foram enxertadas as seguintes regiões no aceitador de consenso humaNO: posições 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) (Figuras 7A-B). No domínio VH, foram enxertadas as posições 26-35 (Hl), 49-65 (H2) e 93-102 (H3) (Figuras 8A-B). MacCallum et al. (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)) analisaram as estruturas cristalinas do complexo do anticorpo com o antigénio e verificaram que as posições 49, 93 e 94 da cadeia pesada fazem parte da região de contacto e estão assim incluídas na definição de HVR-H2 e HVR-H3 quando se humanizam os anticorpos. A variante de enxerto directo (enxerto huMA79b) foi gerada através de mutagénese de Kunkel, tanto como o Fab apresentado pelo fago como uma IgG, utilizando um oligonucleótido separado para cada região hipervariável. Os clones correctos foram avaliados através de sequenciação de ADN. B. Variantes de Enxerto do Anticorpo anti-CD79b Humanizado
Variantes de enxerto do anticorpo anti-CD79b que incluíam diversidade mutacional nas regiões hipervariáveis do anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9 b foram geradas utilizando bibliotecas fágicas. As variantes de enxerto do anticorpo anti-CD79b incluiam uma variação de uma única posição nas HVR (Figura 9) ou variações de múltiplas posições nas HVR (Figura 10). 360 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ C. Selecção Fágica
Para selecção fágica, o domínio extracelular de CD79b (huCD79beCd) (2 yg/ml) foi imobilizado em PBS em placas de microtitulação MaxiSorp (Nunc) de um dia para o outro a 4°C. As placas foram bloqueadas durante pelo menos 1 h utilizando Bloqueador de Caseína (Pierce) . Os fagos foram colhidos a partir dos sobrenadantes da cultura e suspensos em PBS contendo BSA a 0,5% e Tween 20 a 0,05% (PBSBT). Após adição da biblioteca fágica e selecção fágica durante 2 h, os poços de microtitulação foram lavados extensivamente com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBST) para remover os fagos não ligados e os fagos ligados foram eluídos através de incubação dos poços com HC1 100 mM durante 3 0 min. O rigor de selecção pode ser aumentado durante ciclos sucessivos de selecção através do aumento do número de lavagens com PBST ou através de incubação com huCD79bCCd solúvel para aumento dos períodos de tempo antes da eluição.
Os fagos eluídos foram neutralizados com Tris 1 M, pH 8 e amplificados utilizando células XLl-Blue e o fago auxiliar M13/K07 e cultivados de um dia para o outro a 37°C em 2YT, 50 pg/ml de carbenicilina. Os titulos dos fagos eluídos de um poço contendo o alvo foram comparados com os títulos de fagos recuperados a partir de um poço não contendo alvo para avaliar o enriquecimento.
D. Produção de Fab e Produção de IgG
Para expressar a proteína Fab para medições de afinidade, foi introduzido um codão de terminação entre a cadeia pesada e g3 no vector de apresentação fágica. Os clones foram transformados para células E. coli 34B8 e cultivados em meio C.R.A.P. Completo a 30°C (Presta et al., Câncer Res. 57: 4593-4599 (1997)). As células foram colhidas através de centrifugação, suspensas em PBS, PMSF 100 μΜ, benzamidina 100 μΜ, EDTA 2,4 mM e rompidas utilizando uma microfluidificadora. O Fab foi purificado com cromatografia de afinidade de
Proteína G.
Para fins de pesquisa, as variantes de IgG foram inicialmente produzidas em células 293. Os vectores 361 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ codificando para VL e VH (25 pg) foram transfectados para células 293 utilizando o sistema FuGene. 500 μΐ de FuGene foram misturados com 4, 5 ml de meio DMEM não contendo FBS e incubados à temperatura ambiente durante 5 min. Cada cadeia (25 pg) foi adicionada a esta mistura e incubada à temperatura ambiente durante 20 min e depois transferida para um balão para transfecção de um dia para o outro a 37°C em CO2 a 5%. No dia seguinte o meio contendo a mistura de transfecção foi removido e substituído por 23 ml de meio PS04 com 0,1 ml/1 de elementos vestigiais (Ά0934) e 10 mg/1 de insulina (A0940). As células foram incubadas durante 5 mais dias após o gue o meio foi colhido a 1000 rpm durante 5 min e esterilizado por filtração utilizando um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,22 pm. As amostras podiam ser armazenadas a 4°C após adição de 2,5 ml de PMSF a 0,1% para cada 125 ml de meio. E. Determinação da Afinidade (Análise de Biacore)
Para determinação da afinidade das variantes de anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9b, o domínio extracelular do CD79b humano (huCD79beCd) foi expresso em células CHO sozinho ou como uma fusão com Fc (huCD79beCd-Fc) e purificado através de meios convencionais. Adicionalmente, um péptido de 16 aminoácidos (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16) contendo o epitopo para MA79b foi sintetizado através de meios convencionais. A caracterização do epitopo para o anticorpo MA79b (marcado como "péptido de teste" na Figura 19) foi anteriormente divulgada no Pedido US No. 11/462336, apresentado a 3 de Agosto de 2006. O epitopo para MA79b foi localizado na região peptídica extracelular distai ao domínio transmembranar e estava presente nas formas inteira e truncada do CD79b humano (Cragg, Blood, 100(9): 3068-76 (2002)), que foi descrito em células B normais e malignas (Hashimoto, S. et al., Mol. Immunol., 32(9): 651-9 (1995); Alfarano et al., Blood, 93(7): 2327-35 (1999)). A forma truncada de CD79b não possui todo o domínio extracelular semelhante a Ig (o domínio extracelular semelhante a Ig gue não está presente na forma truncada processada de CD79b está numa caixa na Figura 19). 362 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A ligação de Fab e variantes de IgG de MA79b, do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b a huCD79beCd ou huCD79b-Fc imobilizado ou o péptido de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b foi medida através de ressonância de plasma de superfície. As determinações de afinidade foram efectuadas através de ressonância de plasmão de superfície utilizando um BIAcore™-2000. 0 antigénio, huCD79becd ou huCD79b-Fc foi imobilizado (aproximadamente 50-200 RU) em acetato de sódio 10 mM, pH 4,8 num chip sensor CM5. Devido a um grande efeito de avidez, as medições de afinidade foram sensíveis à guantidade de huCD79beCd imobilizado. Por esta razão, as afinidades, determinadas para amostras corridas em dias diferentes, foram normalizadas para MA79b gue foi corrido juntamente com um padrão. Em experiências gue medem a ligação ao péptido de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA7 9b (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16), o péptido biotinilado foi capturado (aproximadamente 20 RU) num chip sensor revestido com estreptavidina. A variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b purificada (tal como Fab ou IgG) (uma diluição em série de 2 vezes de 0,5 a 1000 nM em PBST) foi injectada a um caudal de 30 μΐ/min. Cada amostra foi analisada com associação de 4 minutos e dissociação de 10 minutos. Após cada injecção o chip foi regenerado utilizando Glicina 10 mM, pH 1,7. A resposta de ligação foi corrigida através da subtracção de uma célula de controlo de fluxo das células de fluxo da variante de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (como Fab ou IgG). Um modelo de Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e koff foi utilizado para a análise cinética. F. Análise de Ligação (Análise de FACS)
Para melhor determinar a ligação das variantes de Fab do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou de variantes de anticorpo, a ligação de variantes de Fab e/ou IgG a células DoHH-2 foi analisada utilizando análise de FACS. Mais, a ligação de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b a células BJAB-luciferase foram analisadas utilizando análise de FACS. 363 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Para análise de FACS de variantes de Fab das variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (versão IgG utilizada como controlo)), células DoHH-2 (lxlO6 num volume de 100 μΐ) foram primeiro incubadas com ou sem 1 yg de anticorpo monoclonal anti-CD79b de ratinho original (MA79b) durante 30 minutos, antes da adição de 1 yg de variante de Fab individual (ou anticorpo de controlo). A cadeia leve capa de ratinho anti-Ig humana conjugada com PE (clone G20-193, BD Biosciences, San Diego, CA) foi utilizada como anticorpo secundário de detecção, uma vez que todas as variantes de Fab possuem a cadeia leve capa e as células DoHH-2 não expressam a cadeia leve capa na superfície celular.
Para análise de FACS adicional de variante de IgG das variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (versão IgG de chMA79b utilizada como controlo), 1,0 yg, 0,1 yg ou 0,01 yg de anticorpo foram titulados por milhão de células de células BJAB-luciferase. O anti-Ig humano de ratinho conjugado com PE foi utilizado como anticorpo secundário de detecção. G. Determinação de Afinidade (Análise de Scatchard)
Para melhor determinar a ligação das variantes de IgG possuindo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), a ligação de variantes de IgG iodadas a células BJAB expressando CD79b humano e CD79b de cinomolgo foi analisada e foi efectuada análise de Scatchard.
Para a análise de Scatchard, MA79b ou huMA79b L2/H3 marcado com I125 0, 5 nM foi colocado a competir contra MA79b ou huMA79b L2/H3 não marcado, respectivamente, variando de 50 a 0,02 nM (diluição em série 1:2 em 12 passos) na presença de uma linha BJAB transfectada expressando estavelmente CD79b de cinomolgo e CD79b humano endógeno. Após uma incubação de quatro horas a 4°C, as células foram lavadas e as contagens dos sedimentos celulares foram lidas através de um contador gama (1470 WIZARD Automatic Gamma Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA) . Todos os pontos foram feitos em triplicado e contados durante 10 minutos. A CPM média foi utilizada para 364 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ cálculo de Kd utilizando o programa New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA).
Resultados e Discussão A. Resultados da Geração de Anticorpo anti-CD79b Humanizado A estrutura aceitadora humana utilizada para a geração de anticorpo anti-CD79b humanizado compreende o domínio VL capa I humano de consenso e uma variante do domínio VH de consenso subgrupo III humano. 0 domínio VH variante tem 3 mudanças em relação ao consenso humaNO: R71A, N73T e L78A. Os domínios VL e VH de MA79b foram alinhados com os domínios capa I e subgrupo III humanos; cada HVR foi identificada e depois enxertada na estrutura aceitadora humana para gerar um enxerto de HVR que podia ser apresentado como um Fab no fago (Figuras 7 e 8) .
Os fagos apresentando o enxerto MA79b como Fab ligaram-se a huCD79bCCd imobilizado (dados não mostrados). No entanto, quando a sequência do enxerto huMA79b foi expressa como IgG, a análise de FACS da sua afinidade para huCD79bCCd indicou que a afinidade de ligação tinha sido reduzida em mais de 100 vezes (dados não mostrados) e a análise de Biacore indicou uma perda de mais de 50 vezes (Figura 11).
1. Reparação da CDR
As variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b que foram capazes de se ligar a huCD79beCd imobilizado com as seguintes mudanças de sequência foram identificadas.
Apenas mudanças de sequência direccionadas para HVR em VL foram observadas nas bibliotecas contendo mudanças de posições únicas e são mostradas na Figura 9 (para mutações de Ll: Q27K (SEQ ID NO: 17; mutação SPL-2), (para mutações de L2 : L54R (SEQ ID NO: 18); E55K (SEQ ID NO: 19)), e (para mutações de
L3: E93S (SEQ ID NO: 20; mutação SPL-5), E93K (SEQ ID NO: 21)). 365 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Apenas mudanças de sequência direccionadas para HVR em L2, L3, Hl e H3 foram observadas nas bibliotecas contendo
múltiplas mudanças de posições e são mostradas na Figura 10 (para mutações de L2: S52R, N53K, E55G e S56R (SEQ ID NO: 22; mutação L2-2); N53R (SEQ ID NO: 23); S52R, N53K, E55G e S56N
(SEQ ID NO: 24); S52R N53K, E55K e S56R (SEQ ID NO: 25); S52R, N53Y, E55K e S56R (SEQ ID NO: 26; mutação L2-29); S52R, N53K e E55K (SEQ ID NO: 27); S52R, N53K e E55A (SEQ ID NO: 28); S52G, N531, E55A e S56R (SEQ ID NO: 29); S52R, N53K, E55R (SEQ ID NO: 30); S52R, N53K e E55G (SEQ ID NO: 31; mutação L2-38); S52R, N53H, E55K e S56R (SEQ ID NO: 32); A51S, S52R, N53Y,
E55S e S56R (SEQ ID NO: 33); A51G, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 34); L54R e E55K (SEQ ID NO: 35); N53K e E55G (SEQ ID NO: 36); S52R, N53Y, E55R e S56R (SEQ ID NO: 37); S52R, N53R, E55R e S56T (SEQ ID NO: 38); S52R, N53R, E55G e S56R (SEQ ID NO: 39); S52R, N53Q, L54R, E55K e S56R (SEQ ID NO: 40); S52R, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 41); S52R, N53K, E55K e S56N (SEQ ID NO: 42); S52R, N53K, E55G e S56T (SEQ ID NO: 43); S52R, N53K, E55G e S56G (SEQ ID NO: 44); e S52R, N53K, E55A e S56R (SEQ ID NO: 45)), (para mutações de L3: E93A (SEQ ID NO: 46); E93Q (SEQ ID NO: 47); sem mutação (SEQ ID NO: 48); E93D (SEQ ID NO: 49); E93L (SEQ ID NO: 50); Q89N, Q90N, E93G e T97N (SEQ ID NO: 51); Q90P, S91D, D94A e L96R (SEQ ID NO: 52); Q89D, S91R e E93A (SEQ ID NO: 53)), (para mutações de Hl:
T28P, S30T, S31R e E35S (SEQ ID NO: 54); T28P, S30R e E35Q (SEQ ID NO: 55); T28P, S30T e E35N (SEQ ID NO: 56); T28P, S30T, S31R e E36N (SEQ ID NO: 57; mutação Hl-6)); S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 58); T28S e S30K (SEQ ID NO: 59); G26P, T28S,
F29L, S30C, S31T, W33F e E35D (SEQ ID NO: 60); T28Y e S30T
(SEQ ID NO: 61); T28P, S30G, S31R, I34V e E35N (SEQ ID
NO: 62); S30K e S31K (SEQ ID NO: 63); T28P, S30T e E35Q (SEQ ID NO: 64); T28P, S30R e S31R (SEQ ID NO: 65); T28P, F29V,
S30G, S31R e E35S (SEQ ID NO: 66); T28P, S30N, S31R e E35N
(SEQ ID NO: 67; mutação Hl- D; T28G, S30T e E35S (SEQ ID NO: 68); S30T, I34L e E35S (SEQ ID NO: 69); S30T (SEQ ID NO: 70); S31G e E35N (SEQ ID NO: 71) ; S30R, S31R e E35N 1 ! SEQ ID NO: 72); T28S, S30R e E35N (SEQ ID NO: 73); T28S, S30R,
S31R e E35N (SEQ ID NO: 74); T28S, S30R e S31R (SEQ ID NO: 75); T28S, S30P, I34L e E35Q (SEQ ID NO: 76); T28P, S30T e S31R (SEQ ID NO: 77); T28P e S31G (SEQ ID NO: 78); T28P, S30R e E35S (SEQ ID NO: 79); T28P, S30R e E35N (SEQ ID NO: 80); T28P, S30R e S31G (SEQ ID NO: 81); T28P, S30N e S31R (SEQ ID 366 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ΝΟ: 82); Τ28Ρ, S30N, S31G e Ε35Ν (SEQ ID ΝΟ: 83); Τ28Ν, F29V, I34L e E35S (SEQ ID ΝΟ: 84); Y27F, Τ28Ρ, S30T e E35S (SEQ ID NO: 85); e Y27F, T28P, S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 86)) e (para mutações de H3: V98I e F100L (SEQ ID NO: 87; mutação H3- 12); sem mutação (SEQ ID NO : 88); Y99K e F100L (SEQ ID NO: 89); F100L (SEQ ID NO: 90) ; V9 81 (SEQ ID NO: 91) ; V98F, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 92); F100L i ! SEQ ID NO: 93) ; V98I, Y99R e F100L (SEQ ID NO: 94; mutação H3- 10) ; V981, Y99K e F100L (SEQ ID NO: 95); V981 e Y99R (SEQ ID NO: 96); V981 (SEQ ID NO: 97); D101S (SEQ ID NO: 98); Y99V e F100L (SEQ ID NO: 99); Y99R e F100L (SEQ ID NO: 100); Y99R (SEQ ID NO: 101); Y99F e F100L (SEQ ID NO: 102); V981 e F100L (SEQ ID NO: 103); V98I (SEQ ID NO: 104); V96R, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 105); e V961 (SEQ ID NO: 106)).
Os clones seleccionados foram reformatados como Fab para análise por FACS e como IgG para posterior análise por Biacore e Scatchard. a. Determinação da Afinidade (Análise de
Biacore)
Tal como mostrado na Figura 11, mostrando a análise de Biacore, esta abordagem de reparação da CDR identificou muitas mudanças individuais da sequência que melhoram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. Os ensaios de ressonância de plasmão de superfície mostraram que embora nenhuma das variantes testadas com mudanças únicas de HVR tivesse uma afinidade semelhante a MA79b, a combinação de mudanças identificadas em HVR-L2 e HVR-H3 (variante L2/H3 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b; também aqui referida como huMA79b L2/H3) conduziu a uma variante com afinidade semelhante (Figura 11) a MA79b quando se liga a huCD79bCCd ou huCD79bCCd-Fc imobilizado ou ao péptido de 16 aminoácidos contendo o epitopo para MA79b conforme determinado através de análise de Biacore. A análise de ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) de MA79b ao antigénio (huCD79beCd-Fc) (Figura 11, fila 1, comparar as colunas de Fab com IgG) sugeriu que um componente de avidez de 100 vezes presente em MA79b pode estar ausente nas variantes de afinidade melhorada. 367 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Especificamente, na variante L2-2 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (também aqui referida como huMA79b L2-2) que demonstra uma melhoria de 5 vezes na ligação monomérica em comparação com MA7 9b (Figura 11, filas 1 e 3, comparar as colunas de Fab), não se ganha afinidade aparente após reformatação de huMA79b L2-2 como IgG) (Figura 11, fila 4, comparar a coluna de Fab com IgG). Adicionalmente, o anticorpo inicial "humanizado" enxertado com HVR de MA79b (enxerto de huMA79b) demonstra a perda da sua componente de avidez na ligação (Figura 11, fila 2, comparar as colunas de Fab com IgG) . A capacidade para aumentar a ligação através da avidez pode ser desejável na ligação de antigénios da superfície celular. b. Determinação de Afinidade (Análise de
Scatchard)
Tal como avaliado através de análise de Scatchard, esta abordagem de reparação de CDR identificou muitas mudanças individuais na sequência que melhoraram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b. Especificamente, os ensaios de ligação celular mostraram que a afinidade de MA79b e da variante L2/H3 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b L2/H3) (reformatado como IgG) para ligação a células BJAB expressando estavelmente CD79b de cinomolgo e CD79b humano endógeno tinha os valores de Kd de 0,63 nM (MA 7 9b; Kd = 0,63±0,14 nM) e 0,52 nM (huMA79b L2/H3; Kd = 0,52±0,1 nM) , respectivamente (dados não mostrados), determinado através de análise de Scatchard. c. Determinação de Ligação (Análise de FACS)
Tal como avaliado através de análise de FACS, esta abordagem de reparação de CDR identificou muitas mudanças individuais na sequência que melhoraram a ligação do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto huMA79b) a células DoHH-2 (dados não mostrados). Especificamente, a análise de FACS de variantes de Fab (mutações L2-2, H3-10 e Hl-1) identificadas a partir das bibliotecas SP e 6 SR para células DoHH-2 mostrou ligação das variantes de Fab e enxerto huMA79b (formatado como IgG) a células DoHH-2 (dados não mostrados). Mais, a análise de FACS das variantes de Fab mostrou que a 368 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligação das variantes de Fab a células DoHH-2 foi bloqueada através de pré-incubação com o anticorpo monoclonal anti-CD79b de murídeo (MA79b) (dados não mostrados). 2. Reparação da Estrutura
As mudanças na sequência de HVR introduzidas em HVR-L2 da variante huMA79b L2/H3 foram radicalmente diferentes das observadas em qualquer linha germinativa humana. Foi observado que a variante huMA79b L2/H3, quando conjugada com DM1, é eficaz a inibir crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de ratinho in vivo (Tabela 9) . Uma vez que a análise da ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) da variante huMA79b L2/H3 ao antigénio mostrou uma perda de avidez (Figura 11), a reparação da estrutura foi efectuada tal como descrito abaixo.
Para explorar o papel das posições estruturais na ligação dimérica ao antigénio, foi construída uma variante de posições de "toda a estrutura" em que posições estruturais de murídeo potencialmente importantes foram incorporadas no anticorpo "humanizado" enxertado com HVR de MA79b (enxerto huMA79b). Esta variante (referida na Figura 12 como "toda a estrutura"), sem quaisquer mudanças na HVR, possuía uma afinidade de ligação dimérica semelhante ao anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) (Figura 12) avaliado através de análise de Biacore e análise de Scatchard.
Foram geradas variantes de IgG, incluindo resíduos estruturais de murídeo nas posições 4 e/ou 47 (VL) e/ou posições 47, 48, 67, 69, 71, 73, 74, 78 e/ou 80 (VH) para determinar o conjunto mínimo de posições estruturais necessárias para manter uma ligação dimérica de elevada afinidade (Figura 12). Os resíduos estruturais de murídeo são mostrados nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). Verificou-se que as posições estruturais 47 em VL, e 75 e 80 em VH eram dispensáveis tal como evidenciado pela variante 17 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.vl7) (Figura 12, fila marcada como 17). A variante 18 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (MA79b.vl8; Figura 12, fila marcada como 18), que inclui 369 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ resíduos estruturais de murídeo nas posições 4 em VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH e inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como "H3-10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, mostrou uma melhoria adicional de 2 vezes (Figura 12, fila marcada como 28) na ligação dimérica em comparação com a variante 17 (Figura 12, fila marcada como 17).
Para evitar potenciais problemas de fabrico, um potencial local de formação de ácido iso-aspártico (Asp-Gly) em HVR-L1 das variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foi eliminado através da conversão de D28 em Glu (ácido glutâmico) (D28E; ver variante 28; também aqui referida como "huMA79b.v28"; Figura 12, fila marcada como 28). Outras substituições para estabilidade em VL das variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foram também toleradas incluindo D28 para Ser (serina) (D28E; ver variante 32; também aqui referida como "huMA79b.v32"; Figura 12, fila marcada como 32). A variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b. v28; Figura 12, fila marcada como 28), que inclui: (1) resíduos estruturais de murídeo nas posições 4 em VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH; (2) inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como "H3-10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V981, Y99R e F100L, e (3) inclui ainda mudanças em HVR-L1 (D28E, descrita acima) foi caracterizada através de análise de Biacore. A variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9b (MA79b.v32; Figura 12, fila marcada como 32), que inclui: (1) resíduos estruturais de murídeo nas posições 4 em VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH; (2) inclui ainda mudanças em HVR-H3 (referidas na Figura 12 como "H3-10" e descritas acima como mutação H3-10), incluindo V981, Y99R e F100L, e (3) inclui ainda mudanças em HVR-L1 (D28S, descrita acima) foi caracterizada através de análise de Biacore. a. Determinação de Afinidade (Análise de
Biacore)
Tal como mostrado na Figura 12, que mostra a análise de Biacore, esta abordagem de reparação da estrutura identificou 370 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ muitas mudanças individuais na sequência que melhoram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b para huCD79bCCd· Os ensaios de ressonância de plasmão de superfície mostraram que uma variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v28; com as posições estruturais de murídeo 4 em VL, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V981, Y99R e F100L (também descrita acima) e uma mutação D28E em HVR-L1 (para estabilidade, ver descrição acima); Figura 12, fila marcada como 28) e uma variante do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v32; com as posições estruturais de murídeo 4 em VL, 47, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V981, Y99R e F100L (também descrita acima) e uma mutação D28S em HVR-Ll (para estabilidade, ver descrição abaixo); Figura 12, fila marcada como 32) teve uma afinidade equivalente à do anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) ao ligar-se a huCD79bCcd imobilizado determinado através de análise de Biacore. b. Determinação de Afinidade (Análise de
Scatchard)
Tal como avaliado através de análise de Scatchard, semelhante à análise de Biacore, esta abordagem de reparação da estrutura identificou muitas mudanças individuais na sequência que melhoram a afinidade do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto huMA79b) . Os ensaios de ligação celular mostraram que a afinidade de MA79b, da variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.v28; ver Figura 12, fila marcada como 28) (reformatada como IgG), e da variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b. v32; ver Figura 12, fila marcada como 32) para se ligarem a células BJAB expressando estavelmente CD79b de cinomolgo e CD79b humano endógeno tinha um valor de Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63±0,14 nM) , 0,44 nM (huMA79b.v28; Kd = 0, 44±0, 0 4 nM) , e 0,24 nM (huMA79b. v32 ; Kd = 0,24±0,02 nM) , respectivamente (dados não mostrados), determinado através de análise de Scatchard. c. Determinação de Ligação (Análise de FACS)
Tal como avaliado através de análise de FACS, esta abordagem de reparação da estrutura identificou muitas 371 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ mudanças individuais na sequência que melhoram a ligação do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (enxerto huMA79b) a células BJAB-luciferase (dados não mostrados).
Especificamente, a análise de FACS de variantes de IgG de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (variantes huMA79b.v28 e huMA79b.v32) para células BJAB-luciferase mostrou ligação às células BJAB-luciferase (dados não mostrados). B. Discussão da geração de anticorpos anti-CD79b humanizados
Partindo de um enxerto das 6 HVR de MA79b de murideo (definidas como posições 24-34 (Ll), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (Hl), 49-65 (H2) e 93-102 (H3)) no VL capa I de consenso humano e VH subgrupo III (contendo A71, T73 e A78), a reparação da CDR foi utilizada para identificar mudanças nas HVR 1-6 que melhoram a afinidade de ligação. As mudanças da sequência de HVR identificadas na Figura 10 e 11 ou combinações destas mudanças conduziram a variantes humanizadas de MA79b com afinidades semelhantes a MA79b.
Alternativamente, foi utilizada reparação da estrutura para recapturar a avidez da ligação dimérica através da adição de posições estruturais 4 em VL, e 48, 67, e 69 em VH ao enxerto huMA79b (que inclui resíduos estruturais de murideo a 71, 73 e 78 de VH) (Figura 12; variante 17 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.vl7)). A afinidade destas variantes de mutação estrutural para o antigénio huCD79beCd foi ainda aumentada através da adição de 3 mudanças em HVR-H3: V99I, Y99R e F100L (Figura 12; variante 18 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.vl8)). Um potencial local de formação de ácido iso-aspártico em HVR-L1 foi eliminado com uma mutação D28E (Figura 12; variante 28 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA7 9b.v28) ) . EXEMPLO 2: Geração de Conjugados Anticorpo Anti-CD79b-Fármaco (ADC)
Para testar a eficácia das variantes de IgG de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, as variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b foram conjugadas 372 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ com fármacos, tais como DM1. As variantes conjugadas com DM1 incluiam as variantes possuindo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), huMA79b.vl7, huMA79b.vl8, huMA79b.v28 e huMA79b.v32.
Os fármacos utilizados para geração de conjugados anticorpo-fármaco (ADC) para anticorpos anti-CD79b incluíram os derivados de maitansinóide DM1 e dolastatina 10 monometilauristatina E (MMAE) e monometilauristatina F (MMAF). (US 2005/0276812; US 2005/0238649; Doronina et al.r Bioconjug. Chem., 17: 114-123 (2006); Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003); Erickson et al., Câncer Res., 66: 4426-4433 (2006), todos estes incorporados por referência na sua totalidade). Ligadores úteis para geração dos ADC são BMPEO, SPP ou SMCC (também aqui referidos como "MCC") para DM1 e MC ou MC-vc-PAB para MMAE e MMAF. Para DM1, os anticorpos foram ligados ao grupo tio de DM1 e através do grupo ε-amino da lisina utilizando o reagente ligador SMCC. Alternativamente, para DM1, os anticorpos foram ligados a DM1 através do grupo e-amino de lisina utilizando o ligador SPP. SPP (N-succinimidil-4-(2'-piridilditio)-pentanoato) reage com o grupo épsilon amino das lisinas para deixar um ligador 2-piridildissulfureto reactivo na proteína. Com ligadores SPP, após reacção com um sulfidral livre (p.ex. DM1), o grupo piridilo é deslocado, deixando o DM1 ligado através de uma ligação dissulfureto redutível. O DM1 ligado através de um ligador SPP é libertado sob condições redutoras (i.e., por exemplo, dentro das células) enquanto o DM1 ligado através do ligador SMCC é resistente a clivagem em condições redutoras. Mais, os ADC SMCC-DM1 induzem toxicidade celular se o ADC for internalizado e dirigido ao lisossoma causando a libertação de lisina-ISt-DMl, que é um agente anti-mitótico eficaz dentro da célula, e quando libertado da célula, a lisina-NE-DMl não é tóxica (Erickson et al., Câncer Res., 66: 4426-4433 (2006)). Para MMAE e MMAF, os anticorpos foram ligados a MMAE ou MMAF através da cisteína pelo maleimidocaproil-valina-citrulina (vc)-p-aminobenziloxicarbonilo (MC-vc-PAB). Para MMAF, os anticorpos foram alternativamente ligados a MMAF através da cisteína pelo ligador maleimidocaproilo (MC). O ligador MC-vc-PAB é clivável por proteases intercelulares tais como catepsina B e quando clivado, liberta fármaco livre (Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003)) enquanto o 373 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ ligador MC é resistente a clivagem por proteases intracelulares.
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) para anti-CD79b, utilizando SMCC e DM1, foram gerados de modo semelhante ao procedimento descrito em US 2005/0276812. O tampão dos anticorpos anti-CD79b purificados foi mudado para uma solução contendo fosfato de potássio 50 mM e EDTA 2 mM, pH 7,0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford. IL) foi dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado à solução de anticorpo para produzir uma razão molar final de SMCC/Ab de 10:1. A reacção foi deixada prosseguir durante três horas à temperatura ambiente com mistura. O anticorpo modificado com SMCC foi subsequentemente purificado numa coluna de dessalga GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em citrato de sódio 35 mM com NaCl 150 mM e EDTA 2 mM, pH 6,0. DM1, dissolvido em DMA, foi adicionado à preparação de anticorpo SMCC para dar uma razão molar de DM1 para anticorpo de 10:1. A reacção foi deixada prosseguir durante 4-20 h à temperatura ambiente com mistura. A solução de anticorpo modificado com DM1 foi diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover o DM1 que não reagiu, esterilizada por filtração, e armazenada a 4°C. Tipicamente foi alcançado através deste processo um rendimento de 40-60% de anticorpo. A preparação foi habitualmente >95% monomérica tal como avaliado através de filtração em gel e dispersão de luz laser. Uma vez que DM1 tem um máximo de absorção a 252 nm, a quantidade de fármaco ligado ao anticorpo pode ser determinada através de medições de absorção diferencial a 252 e 280 nm. Tipicamente, a razão de fármaco para anticorpo foi de 3 a 4.
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) para os anticorpos anti-CD79b aqui descritos utilizando ligadores SPP-DM1 podem ser gerados de modo semelhante ao procedimento descrito em US 2005/0276812. É mudado o tampão dos anticorpos anti-CD79b purificados para uma solução contendo fosfato de potássio 50 mM e EDTA 2 mM, pH 7,0. SPP (Imunogen) foi dissolvido em DMA e adicionado à solução de anticorpo para produzir uma razão molar final de SPP/Ab de aproximadamente 10:1, a razão exacta dependendo da carga de fármaco desejada do anticorpo. Uma razão de 10:1 resultará habitualmente numa razão de fármaco para anticorpo de aproximadamente 3-4. O SPP é deixado 374 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ reagir durante 3-4 horas à temperatura ambiente com mistura. 0 anticorpo modificado com SPP é subsequentemente purificado numa coluna de dessalga GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em citrato de sódio 35 mM com NaCl 150 mM e EDTA 2 mM, pH 6,0 ou solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. 0 DM1 é dissolvido em DMA e adicionado à preparação de SPP e anticorpo para dar um razão molar de DM1 para anticorpo de 10:1, que resulta num excesso molar de 3-4 vezes em relação aos ligadores SPP disponíveis no anticorpo. A reacção com DM1 é deixada prosseguir durante 4-20 h à temperatura ambiente com mistura. A solução de anticorpo modificado com DM1 é diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover o DM1 que não reagiu, esterilizada por filtração, e armazenada a 4°C. Tipicamente, um rendimento de anticorpo de 40-60% ou mais é alcançado com este processo. O conjugado anticorpo-fármaco é habitualmente >95% monomérico tal como avaliado através de filtração em gel e dispersão de luz laser. A quantidade de fármaco ligado é determinada através de medições diferenciais da absorção a 252 e 280 nm tal como descrito para a preparação de conjugados SMCC-DM1 (descritos acima).
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) para os anticorpos anti-CD79b aqui descritos utilizando os ligadores a fármaco MC-MMAF, MC-MMAE, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE ou MC-val-cit (vc)-PAB-MMAF podem também ser gerados de modo semelhante ao procedimento descrito em US 2005/0238649. O anticorpo anti-CD79b purificado é dissolvido em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM a pH 8,0 e tratado ainda com um excesso de ditiotreitol (DTT) 100 mM. Após incubação a 37°C durante cerca de 30 minutos, é mudado o tampão através de eluição sobre resina Sephadex G25 e elui-se com PBS com DTPA 1 mM. O valor de tiol/Ab é verificado através de determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol através de reacção com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvância a 412 nm. O anticorpo reduzido é dissolvido em PBS e arrefecido em gelo. O ligador a fármaco, por exemplo, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE, em DMSO, é dissolvido em acetonitrilo e água, e adicionado ao anticorpo reduzido arrefecido em PBS. Após uma incubação de uma hora, é adicionado um excesso de maleimida para extinguir a reacção e tapar quaisquer grupos tiol do anticorpo que não tenham reagido. A mistura reaccional 375 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ é concentrada através de ultrafiltração em centrífuga e o conjugado anticorpo-fármaco é purificado e dessalgado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 ym sob condições estéreis, e congelado para armazenamento.
Os conjugados anticorpo-fármaco (utilizando anticorpos anti-CD79b aqui descritos) foram diluídos a 2x10 yg/ml em meio de ensaio. Os conjugados foram ligados com ligadores cruzados SMCC (um ligador de dissulfureto alternativo pode ser utilizado para SPP, à toxina maitansinóide DM1) (ver US 2005/0276812 e US 2005/0238649). Mais, os conjugados podem ser ligados a MC-valina-citrulina (vc)-PAB ou MC a derivados de dolastatina 10, toxina monometilauristatina E (MMAE) ou toxina monometilauristatina F (MMAF) (ver Pedido US No. 11/141344, apresentado a 31 de Maio de 2005 e Pedido US No. 10/983340, apresentado a 5 de Novembro de 2004). Os controlos negativos incluíram conjugados (SMCC-DM1 ou SPP-DM1 ou MC-vc-MMAE ou MC-vc-MMAF) baseados em HERCEPTIN® (trastuzumab) (anti-HER2). Os controlos positivos podem incluir o equivalente L-DM1 livre para a dose de carga de conjugado. As amostras foram sujeitas a vórtice para assegurar uma mistura homogénea antes da diluição.
Anticorpos anti-CD79b para conjugação com fármaco incluíram anticorpos MA79b quiméricos (chMA79b) e a variante do anticorpo huMA79b L2/H3 e huMA79b.vl7, huMA79b.vl8, huMA79b.v28 e huMA79b.v32 aqui descritos (ver Exemplo 1). Mais anticorpos para conjugação podem incluir quaisquer anticorpos aqui descritos (ver Exemplo 1). EXEMPLO 3: Ensaio de Morte de Células Tumorais In vivo A. Xenoenxertos
Para testar a eficácia das variantes de IgG de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA7 9b possuindo mudanças em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), a variante huMA79b L2/H3 foi conjugada com DM1 e o efeito da variante conjugada em tumores em ratinhos foi analisado. 376 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Especificamente, pode ser examinada a capacidade dos anticorpos para regredir tumores em múltiplos modelos de xenoenxertos, incluindo células RAMOS, células BJAB (linha celular de linfoma de Burkitt que contém a translocação 1(2;8)(pll2;q24) (IGK-MYC), um gene p53 mutado e é negativa para o vírus de Epstein-Barr (EBV)) (Drexler, H.G., "The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book", San Diego: Academic Press, 2001)), células Granta 519 (linha celular de linfoma de células do manto que contém a translocação t(ll;14)(ql3;q32) (BCL1-IGH) que resulta na sobre-expressão da ciclina Dl (BCL1), contém as deleções P16INK4B e P16INK4A e é positiva para EBV) (Drexler, H.G., "The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book", San Diego: Academic Press, 2001)), células U698M (linha de células B de linfossarcoma linfoblástico; (Drexler, H.G., "The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book", San Diego. Academic Press, 2001) e células DoHH2 (linha celular de linfoma folicular que contém a translocação característica do linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) que resulta na sobre-expressão de Bcl-2 dirigida pela cadeia pesada de Ig, contém a deleção P16INK4A, contém a translocação t(8;14)(q24;q32) (IGH-MYC) e é negativa para EBV) (Drexler, H.G., "The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book", San Diego: Academic Press, 2001)).
Para análise da eficácia de variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b, ratinhos fêmeas CB17 ICR SGID (6-8 semanas de idade de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) foram inoculados subcutaneamente com 2xl07 células BJAB-luciferase ou células Granta-519 através de injecção nos flancos de ratinhos SCID CB17 ICR e os tumores xenoenxerto foram deixados crescer até terem em média 200 mm2. O dia 0 refere-se ao dia em que os tumores tinham em média 200 mm2 e em que a primeira/ou única dose de tratamento foi administrada, a menos que indicado especificamente abaixo. O volume tumoral foi calculado com base em duas dimensões, medido utilizando paquímetros, e foi expresso em mm3 de acordo com a fórmula: V = 0,5a χ b2, onde a e b são os diâmetros maior e menor do tumor, respectivamente. Os dados colhidos a partir de cada grupo experimental foram expressos como médialEP. Grupos de 10 ratinhos foram tratados com uma única dose intravenosa (i.v.) de entre 50 pg e 210 pg de fármaco ligado a anticorpo/m2 de ratinho (correspondendo a «1-4 mg/kg 377 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de ratinho) com variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b ou conjugados anticorpo-fármaco de controlo. Os tumores foram medidos uma vez ou duas vezes por semana ao longo da experiência. Os pesos corporais dos ratinhos foram medidos uma vez ou duas vezes por semana ao longo da experiência. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia antes dos volumes tumorais alcançarem 3000 mm3 ou quando os tumores apresentavam sinais de ulceração iminente. Todos os protocolos foram aprovados por um Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Os ligadores entre o anticorpo e a toxina que foram utilizados foram o agente de reticulação tioéter SMCC para DM1. Ligadores adicionais podem incluir o ligador dissulfureto SPP ou agente de reticulação tioéter SMCC para DM1 ou MC ou MC-valina-citrulina(vc)-PAB ou um reagente ligador dipeptídico (valina-citrulina (vc)) possuindo um componente maleimida e um componente para-aminobenzilcarbamoilo (PAB) auto-imolativo para monometilauristatina E (MMAE) ou monometilauristana F (MMAF). As toxinas utilizadas foram DM1. Toxinas adicionais podem incluir MMAE ou MMAF.
Os anticorpos CD79b para esta experiência incluíram anticorpos MA79b quiméricos (chMA79b) tal como descritos no Pedido US No. 11/462336, apresentado a 3 de Agosto de 2006 bem como variantes do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b aqui descrito (ver Exemplo IA) . Anticorpos adicionais podem incluir anticorpos comercialmente disponíveis, incluindo anticorpo anti-CD79b, e anticorpos monoclonais MA79b gerados a partir de hibridomas depositados na ATCC como HB11413 a 20 de Julho de 1993.
Controlos negativos incluíram conjugados baseados em anti-HER2 (HERCEPTIN® (trastuzumab)) (SMCC-DM1). B. Resultados 1. Xenoenxertos de BJAB-Luclferase
Num decurso de tempo de 35 dias com conjugados de fármaco e doses tal como mostrado na Tabela 9, a variante L2/H3 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (variante huMA79b L2/H3) (reformatada como IgG) e o anticorpo quimérico anti- 378 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ CD79b (chMA79b) conjugados com DM1 (huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DMl, respectivamente) , mostraram inibição do crescimento tumoral em ratinhos SCID com tumores BJAB-luciferase em comparação com o controlo negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMl (anti-HER2-SMCC-DMl). Os ADC foram administrados numa única dose (tal como indicado na Tabela 9) no dia 0 para todos os ADC e controlos. Especificamente, os anticorpos huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 (reformatados como IgG) e chMA79b-SMCC-DMl inibiram significativamente o crescimento tumoral (Figura 20). Mais, na Tabela 9, é indicado o número de ratinhos, do número total de ratinhos testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) .
Tabela 9
Anticorpo administrado (Tratamento) RP RC Dose de Fármaco-DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) Razão de Fármaco (Fármaco/Ab) Controlo anti-HER2-SMCC-DM1 0/10 0/10 100 2 3, 3 chMA79b-SMCC-DMl 3/10 3/10 100 2,4 2,9 chMA79b-SMCC-DMl 1/10 0/10 50 1,2 2,9 huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 2/10 0/10 100 2,9 2,4 huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 0/10 0/10 50 1,4 2,4 2. Xenoenxertos de Granta-519
Num decurso de tempo de 14 dias com conjugados de fármaco e doses tal como mostrados na Tabela 10, a variante 17, variante 18, variante 28 e variante 32 do anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b (huMA79b.vl7, huMA79b.vl8, huMA79b.v28 e huMA79b.v32, respectivamente) (reformatadas como IgG) e o anticorpo quimérico anti-CD79b (chMA79b) conjugados com DM1 (huMA7 9 b.vl7-SMCC-DMl, huMA79b.vl8-SMCC-DM1, huMA79b.v28-SMCC-DMl, huMA79b.v32-SMCC-DMl e chMA79b-SMCC-DMl, respectivamente), mostraram inibição do crescimento tumoral em ratinhos SCID com tumores Granta-519 em comparação com o controlo negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMl (anti- 379 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ HER2-SMCC-DM1). Os ADC foram administrados numa única dose (tal como indicado na Tabela 10) no dia 0 para todos os ADC e controlos. Especificamente, os anticorpos huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DMl, huMA79b.vl7-SMCC-DMl e huMA79b.vl8-SMCC-DM1 (reformatados como IgG) e chMA79b-SMCC-DMl inibiram significativamente o crescimento tumoral (Figura 21A). Mais, o tratamento com huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.vl7-SMGC-DM1, huMA79b.vl8-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DMl e HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DM (antÍ-HER2-SMCC-DM1) de controlo não resultou numa diminuição na percentagem do peso corporal nos ratinhos (Figura 21B). Mais ainda, na Tabela 10, é indicado o número de ratinhos, de um número total de dez ratinhos testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (em que o volume tumoral em qualquer momento q após a administração caiu para 0 mm ) .
Tabela 10
Anticorpo administrado (Tratamento) RP RC Dose de Fármaco-DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) Razão de Fármaco (Fármaco/Ab) Controlo anti-HER2-SMCC-DM1 0/10 0/10 208 4 3,4 chMA79b-SMCC-DMl 0/10 0/10 107 2 3, 6 chMA79b-SMCC-DMl 1/10 0/10 213 4 3, 6 huMA79b.vl7-SMCC-DMl 0/10 0/10 202 4 3,4 huMA79b.vl8-SMCC-DM1 4/10 0/10 196 4 3, 3 huMA79b.v2 8-SMCC-DM1 0/10 0/10 101 2 3,4 huMA79b.v2 8-SMCC-DM1 2/10 2/10 202 4 3,4 huMA79b.V32-SMCC-DM1 0/10 0/10 172 4 2,9 À luz da capacidade dos ADC de anticorpo "humanizado" enxertado com MA79b para inibir significativamente a progressão tumoral em xenoenxertos, as moléculas de CD79b podem ser excelentes alvos para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cancros associados a células B, tais como linfomas (i.e. Linfoma não-Hodgkin), leucemias (i.e. leucemia linfocítica crónica), e outros cancros de células hematopoéticas. Mais, os ADC "humanizados" enxertados com MA79b são úteis para reduzir in vivo o crescimento tumoral de 380 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ tumores, incluindo cancros associados a células B, tais como linfornas (i.e. Linfoma não-Hodgkin), leucemias (i.e. leucemia linfocitica crónica), e outros cancros de células hematopoéticas. EXEMPLO 4: Co-localização de Anticorpo CD79b
Para determinar quando os anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b e variantes de anticorpos são distribuídos após internalização na célula, estudos de co-localização dos anticorpos anti-CD79b internalizados em linhas de células B podem ser avaliados em linhas de células Ramos. LAMP-1 é um marcador para endossomas tardios e lisossomas (Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology, 139(3): 639-649 (1997); Hunziker et ai., Bioessays, 18: 379-389 (1996); Mellman et ai., Annu. Rev. Dev. Biology, 12: 575-625 (1996)), incluindo compartimentos MHC de classe II (MIIC) , que é um compartimento semelhante a endossoma tardio/lisossoma. HLA-DM é um marcador para MIIC. Células Ramos são incubadas durante 3 horas a 37°C com 1 pg/ml de anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b e variantes de anticorpos, bloqueio de FcR (Miltenyi) e 25 yg/ml de Alexaõ47-Transferrina (Molecular Probes) em meio completo sem carbonato (Gibco) com a presença de 10 yg/ml de leupeptina (Roche) e pepstatina 5 μΜ (Roche) para inibir a degradação lisossómica. As células são então lavadas duas vezes, fixadas com paraformaldeído a 3% (Electron Microscopy Sciences) durante 20 minutos à temperatura ambiente, extintas com NH4G1 50 mM (Sigma), permeabilizadas com Saponina a 0,4%/FBS a 2%/BSA a 1% durante 20 minutos e depois incubadas com 1 yg/ml de Cy3 anti-ratinho (Jackson Immunoresearch) durante 20 minutos. A reacção é então bloqueada durante 20 minutos com IgG de ratinho (Molecular Probes), seguido de uma incubação de 30 minutos com Image-iT FX Signal Enhancer (Molecular Probes). As células são finalmente incubadas com Zenon anti-LAMPl de ratinho marcado com Alexa488 (BD Pharmingen), um marcador tanto para lisossomas como MIIC (um compartimento semelhante ao lisossoma que faz parte da via de MHC de classe II), durante 20 minutos, e pós-fixadas com PFA a 3%. As células são ressuspensas em 20 μΐ de tampão saponina e deixadas aderir a lâminas revestidas com poli-lisina (Sigma) antes de montagem 381 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ de uma lamela com VectaShield contendo DAPI (Vector Laboratories). Para imunofluorescência dos MIIC ou lisossomas, as células são fixadas, permeabilizadas e estimuladas como acima, depois co-coradas com Alexa555-HLA-DM marcado com Zenon (BD Pharmingen) e Alexa488-Lampl na presença de excesso de IgG de ratinho de acordo com as instruções do fabricante (Molecular Probes).
Assim, a co-localização de anticorpos "humanizados" enxertados com MA79b ou variantes de anticorpos com MIIC ou lisossomas de linhas de células B avaliada através de imunofluorescência pode indicar as moléculas como excelentes agentes para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cancros associados a células B, tais como linfomas (i.e. Linfoma não-Hodgkin), leucemias (i.e. leucemia linfocítica crónica), e outros cancros de células hematopoéticas. EXEMPLO 5: Preparação de Anticorpos Anti-CD79b Modificados com Cisteina A preparação de anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina foi efectuada tal como é aqui divulgado. 0 ADN codificando o anticorpo MA79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 4, Figura 4; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 5, Figura 5), foi mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve e a cadeia pesada. 0 ADN codificando o anticorpo MA79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 5; Figura 5) pode também ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a região Fc da cadeia pesada. 0 ADN codificando o anticorpo huMA79b.vl7 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 304, Figura 15) foi mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo huMA79b.vl7 (cadeia leve, SEQ ID NO: 303; Figura 15; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 304; Figura 15), pode também ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo huMA79b.vl8 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 306, Figura 16) foi mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia pesada. O ADN codificando o 382 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ anticorpo huMA79b.vl8 (cadeia leve, SEQ ID NO: 305; Figura 16; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 306; Figura 16), pode também ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, Figura 17), foi mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia leve, SEQ ID NO: 307, Figura 17; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, Figura 17), pode também ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve ou a região Fc da cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo huMA79b.v32 (cadeia leve, SEQ ID NO: 310, Figura 18; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 309, Figura 18) pode ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve e a cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo anti-cynoCD79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 241; Figura 45 e cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figura 47), foi mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a cadeia leve e a cadeia pesada. O ADN codificando o anticorpo anti-cynoCD79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figura 47), pode também ser mutado através de métodos aqui divulgados para modificar a região Fc da cadeia pesada.
Na preparação dos anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina, o ADN codificando a cadeia leve foi mutado para substituir valina por cisteina na posição de Kabat 205 na cadeia leve (posição sequencial 209) tal como mostrado na Figura 27 (cadeia leve SEQ ID NO: 235 do tioMAb MA79b) e Figura 49 (cadeia leve SEQ ID NO: 300 do tioMAb anti-cynoCD79b (chIODIO)). O ADN codificando a cadeia pesada foi mutado para substituir alanina por cisteina na posição EU 118 na cadeia pesada (posição sequencial 118; número de Kabat 114) tal como mostrado na Figura 48 (cadeia pesada SEQ ID NO: 244 do anticorpo tioMAb anti-cynoCD79b (chIODIO)), Figura 28 (cadeia pesada SEQ ID NO: 236 do tioMAb MA79b), Figura 24 (cadeia pesada SEQ ID NO: 228 do tioMAb huMA79b.vl7), Figura 25 (cadeia pesada SEQ ID NO: 230 do tioMAb huMA79b.vl8) e na Figura 26 (cadeia pesada SEQ ID NO: 232 do tioMAb 383 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ huMA79b.v28). A região Fc de anticorpos anti-CD79b pode ser mutada para substituir serina por cisteina na posição EU 400 na região Fc da cadeia pesada (posição seguencial 400; número de Kabat 396) tal como mostrado nas Tabelas 2-4. A. Preparação de anticorpos anti-CD79b modificados com cisteina para conjugação por redução e re-oxidação
Anticorpos monoclonais anti-CD79b inteiros modificados com cisteina (TioMabs) foram expressos em células CHO e purificados numa cromatografia de afinidade de proteína A seguida de cromatografia de exclusão de tamanho. Os anticorpos purificados são reconstituídos em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM a cerca de pH 8,0 e reduzidos com um excesso molar de cerca de 50-100 vezes de TCEP 1 mM (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina; Getz et al. (1999)
Anal. Biochem. Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante cerca de 1-2 h a 37°C. O TioMab reduzido é diluído e carregado numa coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3 Μ. O TioMab reduzido eluído é tratado com ácido desidroascórbico (dhAA) 2 mM a pH 7 durante 3 horas ou sulfato de cobre aquoso (CuSCh) 2 mM à temperatura ambiente de um dia para o outro. Oxidação ao ar ambiente pode também ser eficaz. O tampão é mudado através de eluição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com DTPA 1 mM. O valor de tiol/Ab é estimado através da determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorção a 280 nm da solução e da concentração de tiol através de reacção com DTNB (Aldrich, Milwattkee, WI) e determinação da absorvância a 412 nm. EXEMPLO 6: Preparação de Conjugados Anticorpo Anti-CD79b
Modificado com Cisteína-Fármaco através de Conjugação de Anticorpos Anti-CD79b Modificados com Cisteina com Intermediários Ligadores a Fármacos Após os procedimentos de redução e re-oxidação do
Exemplo 5, o anticorpo anti-CD79b modificado com cisteina é reconstituído em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e arrefecido em gelo. Cerca de 1,5 equivalentes molares relativamente às cisteinas introduzidas por anticorpo de um intermediário ligador a fármacos de auristatina, tal 384 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ como MC-MMAE (maleimidocaproil-monometil-auristatina E) , MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE, ou MC-val-cit-PAB-MMAF, com um grupo tiol reactivo funcional tal como maleimido, são dissolvidos em DMSO, diluídos em acetonitrilo e água, e adicionados ao anticorpo reduzido, re-oxidado, arrefecido, em PBS. Após cerca de uma hora, é adicionado um excesso de maleimida para extinguir a reacção e tapar qualquer grupo tiol do anticorpo que não tenha reagido. A mistura reaccional é concentrada através de ultrafiltração em centrífuga e o conjugado anticorpo anti-CD79b modificado com cisteína-fármaco é purificado e dessalgado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 ym sob condições estéreis, e congelado para armazenamento. A preparação do tioMAb huMA79b.vl8-HC(A118C)-BMPEO-DM1 foi efectuada como se segue. A cisterna livre no tioMAb huMA79b.vl8-HC(A118C) foi modificada através do reagente bis-maleimido BM(PEO)3 (Pierce Chemical), deixando um grupo maleimido sem reagir na superfície do anticorpo. Isto foi alcançado através da dissolução de BM(PEO)3 numa mistura de etanol a 50%/água a uma concentração de 10 mM e adição de um excesso molar de dez vezes de BM(PE0)3 a uma solução contendo o tioMAb huMA79b.vl8-HC(A118C) em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolar) e permitindo que reagisse durante 1 hora. O BM(PEO)3 em excesso foi removido através de filtração em gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em citrato 30 mM, pH 6 com tampão NaCl 150 mM. Um excesso molar de aproximadamente 10 vezes de DM1 dissolvido em dimetil-acetamida (DMA) foi adicionado ao intermediário tioMAb huMA79b.vl8-HC(A118C)-BMPEO. Dimetilformamida (DMF) pode também ser empregue para dissolver o reagente porção fármaco. A mistura reaccional foi deixada reagir de um dia para o outro antes de filtração em gel ou diálise em PBS para remover o f ármaco que não reagiu. A filtração em gel em colunas S200 em PBS foi utilizada para remover agregados de elevado peso molecular e proporcionar tioMAb huMA79b.vl8-HC(A118C)-BMPEO-DM1 purificado.
Através dos mesmos protocolos, foi gerado o controlo tio hu-anti-HER.2-HC (A11BC) -BMPE0-DM1, o controlo tio hu-antÍ-HER2-HG(A118C)-MC-MMAF, o controlo tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e o controlo tio anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF. 385 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ os seguintes com cisteína-
Através dos procedimentos de cima, conjugados anticorpo anti-CD79b modificado fármaco (TDC) foram preparados e testados: 1. tio huMA79b.V18-HC(A118C)-MC-MMAF conjugação do A118C tio huMA79b.v!8-HC(A118C) e através MC-MMAF; de 2. tio huMA79b.vl8-HC(A118C)-BMPE0-DM1 conjugação do A118C tio huMA79b.v!8-HC(A118C) e através BMPE0-DM1; de 3. tio huMA79b.vl8-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE através de conjugação do A118C tio huMA79b.vl8-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 4. tio huMA79b.v28-HG(AI18C)-MC-MMAF através de conjugação do A118C tio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-MMAF; 5. tio huMA79b.v28-HG(A118C)-BMPE0-DM1 através de conjugação do tio huMA79b.v28-HC(A118C) e BMPEO-DM 1; 6. tio huMA79b.V28-HC(A118C)-MC-val-cit-PAB-MMAE através de conjugação do tio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE ; 7. tio anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C)-MC-MMAF através de conjugação do A118C tio anti-cynoCD79b (chIODIO)-HC(A118C) e MC-MMAF; 8. tio anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C)-BMPE0-DM1 através de conjugação do A118C tio anti-cynoCD79b (chIODIO)-HC(AI18C) e BMPE0-DM1; 9. tio anti-cynoCD79b(chIODIO)-13C(A118C)-MCvcPA13-MMAE através de conjugação do A118C tio anti-cynoCD79b (chIODIO)-HC(AI18C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 10. tio MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF através de conjugação do tio MA79b-HC(A118C) e MC-MMAF; e 11. tio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF através de conjugação do tio MA79b-LC(V205C) e MC-MMAF. EXEMPLO 7: Caracterização da Afinidade de Ligação de Conjugados TioMAb Modificados com Cisteína-Fármaco ao Antigénio da Superfície Celular A afinidade de ligação de conjugados tio hnMA79b.vl8, tio huMA79b.v28-fármaco e conjugados tio MA79b-fármaco a CD79b 386 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ expresso em células BJAB-luciferase foi determinada através de análise de FACS. Mais, a afinidade de ligação de conjugados tio anti-cynoCD79b(chlODlO)-fármaco a CD79b expresso em células BJAB expressando cynoCD79b foi determinada através de análise de FACS.
Resumidamente, aproximadamente lxlO6 células em 100 μΐ foram colocadas em contacto com quantidades variáveis (1,0 yg, 0,1, yg ou 0,01 yg de Ab por milhão de células BJAB-luciferase ou de células BJAB expressando cynoCD79b (para tioMAb anti-cynoCD79b)) de um dos seguintes conjugados tioMAb anti-CD79b-fármaco ou nu (Ab não conjugado como controlo): (1) tio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF ou (2) tio MA79b-HC(AIIRC)-MC-MMAF (Figuras 29A-B, respectivamente); (3) tio huMA79b.vl8-HC(AI18C)-MC-MMAF, (4) tio huMA79b.vl8-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE ou (5) tio huMA79b.vl8-HC(A118C)-BMPEO-DM1 (Figuras 30B-D, respectivamente); (6) tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, (7) tio huMA79b.v28-HC (A118C)-BMPEO-DM1, OU (8) tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF (ver Figuras 31B-31D, respectivamente); ou (9) tio anti-cynoCDb79(chIODIO)-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, (10) tio anti-cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 ou (11) tio anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(AI18C)-MC-MMAF (ver Figuras 32B-32D, respectivamente). Anti-Ig humana de ratinho conjugado com PE foi utilizado como anticorpo secundário de detecção (BD Cat#555787). 0 anticorpo anti-CD79b ligado à superfície celular foi detectado utilizando anti-Ig humana de ratinho conjugado com PE. Os gráficos das Figuras 29-32 indicam que a ligação ao antigénio foi aproximadamente a mesma para todos os conjugados tioMAb-fármaco testados. EXEMPLO 8: Ensaio para Redução da Proliferação Celular In vitro através de Conjugados TioMab Anti-CD79b-Fármaco A potência ín vitro dos conjugados TioMAb anti-CD79b-fármaco (incluindo tio huMA79b.vl8-HC(AI18C)-MCMMAF, tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.vl8-HG(AI18C)-BMPEO-DM1), foi medida através de um ensaio de proliferação celular (Figura 41A, BJAB-luciferase; Figura 41B, Granta-519; Figura 41C, WSU-DLCL2). O Ensaio de Viabilidade de Células Luminescente CellTiter-Glo® é um método de ensaio 387 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ homogéneo comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, WI), baseado na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670). O ensaio de proliferação celular determina o número células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente activas (Crouch et al.f J. Immunol. Meto., 160: 81-88 (1993); US 6602677). O Ensaio CellTiter-Glo® foi conduzido no formato de 96 poços, tornando possível a pesquisa automática de elevada tiragem (HTS) (Cree et al., AntiCancer Drugs, 6: 398-404 (1995)). O procedimento de ensaio homogéneo envolve a adição de um único reagente (O Reagente CellTiter-Glo®) directamente a células cultivadas em meio suplementado com soro. O formato homogéneo "adicionar-misturar-medir" resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. O substrato, Luciferina de Besouro, é oxidativamente descarboxilado por luciferase do pirilampo recombinante com conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fotões. As células viáveis são reflectidas em unidades relativas de luminescência (RLU). Os dados podem ser registados através de um luminómetro ou imagens de câmara CCD. O resultado de luminescência é apresentado como RLU, medido ao longo do tempo. A % de RLU é a percentagem de RLU normalizadas em comparação com um controlo "não conjugado com fármaco". Alternativamente, os fotões da luminescência podem ser contados num contador de cintilações na presença de um cintilante. As unidades de luz podem ser representadas então como CPS (contagens por segundo). A eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco foi medida através de um ensaio de proliferação celular empregando o seguinte protocolo, adaptado do Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes CellTiter-Glo, Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza et al., Câncer Res., 62: 5485-5488 (2002)): 1. Uma aliquota de 40 μΐ de cultura celular contendo cerca de 3000 células BJAB, Granta-519 ou WSU-DLCL2 em meio foi depositada em cada poço de uma placa de 384 poços, de paredes opacas. 2. O TDC (Conjugado TioMab-Fármaco) (10 μΐ) foi adicionado a poços experimentais em quadruplicado até uma 388 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ concentração final de 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 13, 7, 4,6 ou 1,5 ng/ml, com os poços de controlo "conjugado sem fármaco" recebendo apenas meio, e incubou-se durante 3 dias. 3. As placas foram equilibradas à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 4. Foi adicionado o Reagente CellTiter-Glo (50 μΐ). 5. O conteúdo foi misturado durante 2 minutos num agitador orbital para induzir lise celular. 6. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência. 7. A luminescência foi registada e reportada em gráficos como % de RLU (unidades relativas de luminescência).
Os dados das células incubadas com meio sem conjugado de fármaco foram representados a 0,51 ng/ml.
Meio: células BJAB, Granta-519 e WSU-DLCL2 criadas em RPMI1640/FBS a 10%/glutamina 2 mM. EXEMPLO 9: Ensaio para Inibição do Crescimento Tumoral in vivo através de Conjugados TioMab Anti-CD79b-Fármaco A. Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia de conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano) em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 11, abaixo. O Ab de controlo foi hu-anti-HER2-MC-MMAF ou MA79b-MC-MMAF. O tioMAb HC(A118C) de controlo foi o tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MMAF. Os resultados são mostrados na Tabela 11 e Figura 33. A Figura 33A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de Granta-519 em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C ou cadeia leve V205C, nas doses mostradas na Tabela 11. Especificamente, a administração de 389 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF e tio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF mostrou inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (anti-hu-HER2-MC-MMAF e tio-hu-antÍ-HER2-HC(AI18G)-MC-MMAF). Outros controlos incluíram MA79b-MC-MMAF.
Mais, no mesmo estudo, a variação percentual do peso corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 33B) indicaram que a administração destes conjugados tioMAb-fármaco não resultou numa diminuição significativa na percentagem de peso corporal ou perda de peso durante este tempo.
Mais ainda, na Tabela 11, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo)
Tabela 11
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio chMA79b-HC(A118C) ou Tio chMA79b-LC(V205C)-MMAF em Xenoenxertos de Granta-519 em
Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) hu-anti-HER2-MC-MMAF de Controlo 0/8 0/8 413 00 to 4,0 Tio hu-anti-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF de Controlo 0/9 0/9 191 00 to 1, 85 chMA79b-MC-MMAF de Controlo 1/8 0/8 100 2,3 O 00 chMA79b-MC-MMAF de Controlo 8/9 1/9 300 00 to o 00 Tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF 0/8 0/8 63 2,3 1/9 Tio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF 4/9 0/9 190 6,8 1/9 Tio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF 0/8 0/8 60 2,3 1/8 Tio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF 5/9 4/9 180 6,8 1/8 390 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Β. Xenoenxertos de BJAB-Luciferase (Linfoma de Burkitt)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, a eficácia de fármacos conjugados adicionais foi testada em xenoenxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em Ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármacos e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 12, abaixo. O anticorpo de controlo foi huMA79b.v28 (conjugado com SMCC-DM1). O tioMAb HC (A118C) de controlo foi o anticorpo tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPEO-DMl, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMAb tio huMA79b.v28-HC(A118G) ou tioMAb tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C) (conjugado com MC-MMAF) . Os resultados são mostrados na Tabela 12 e Figura 34, abaixo. A Figura 34A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo nos xenoenxertos de BJAB-luciferase em ratinhos SCID CB17 tratados com os conjugados tioMAb-fármaco huMA79b.v28-HG(A118C) tal como mostrado na Tabela 12. Especificamente, a administração do conjugado tioMAb-fármaco tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPEO-DMl, tio-huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE mostrou uma inibição no crescimento tumoral em comparação com os conjugados anticorpo-fármaco de controlo negativo (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DMl, tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e tio-hu-anti-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE). Outro controlos foram tio-huMA79b.v28-HC(A118C) , huMA7 9 b.v2 8-SMCC-DM1 e tio-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF .
Mais, no mesmo estudo, a variação percentual do peso corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 34B) indicaram que a administração destes conjugados tioMAb-fármaco não causou uma diminuição significativa na percentagem do peso corporal ou perda de peso durante este tempo. 391 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Mais ainda, na Tabela 12, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo)
Tabela 12
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) MMAE, MMAF, e DM1 em Xenoenxertos de BJAB-Luciferase em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/1 0 0/10 57 2 1, 86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 1/1 0 0/10 58 2 1,9 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de Controlo 0/1 0 0/10 46 2 1,55 huMA79b.V28-SMCC-DM1 de Controlo 2/1 0 3/10 101 2 3,4 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 3/1 0 2/10 55 2 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 0/1 0 10/1 0 57 2 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE 0/1 0 10/1 0 54 2 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 0/1 0 0/10 NA 2 NA Tio hu-anti- CD2 2(10F4v3)-HC(A118C)- MC-MMAF de Controlo 1/1 0 4/10 59 2 1,96 392 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ C. Xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Grandes Células Difusas)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de linfoma folicular WSU-DLCL2 (Linfoma de Grandes Células Difusas) em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco e as doses são mostrados na Tabela 13, abaixo. 0 anticorpo de controlo foi huMA79b.v28 (conjugado com SMCC-DM1). 0 tioMAb de controlo HC(A118C) foi o anticorpo tioMAb tio hu-antÍ-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPE0-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMAb tio huMA79b.v28-HC(AI18C) ou tioMAb tio anti-CD22 10F4v3-HC(A118C) (conjugado com MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 13, abaixo. A Figura 35A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL2 (Linfoma de Grandes Células Difusas) em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 13. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HG(AI18C)-BMPE0-DM1, tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF e tio huMA79b.v2R-HC(AI18c)-MCvcPAB-MMAE mostrou inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio-hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MC-MMAF, tio-hu-antÍ-HER2-HG(A118C)-MGvcPAB-MMAE, tio-huMA79b.v28- HC(A118C)). Outros controlos incluíram tio-huMA79b,v28-14C(AI18C), huMA79b.V2R-SMGC-DM1 e tio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(AI18C)-MC-MMAF. 0 TDC tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MGvcPAB-MMAE pareceu ser o mais eficaz dos agentes de teste neste estudo.
Mais, no mesmo estudo, a variação percentual do peso corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 35B) indicaram que a administração destes conjugados tioMAb-fármaco não causou uma 393 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ diminuição significativa na percentagem do peso corporal ou perda de peso durante este tempo.
Mais ainda, na Tabela 13, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (em que o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (em que o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo)
Tabela 13
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) MMAE, MMAF, e DM1 em Xenoenxertos de WSU-DLCL2 em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/10 0/10 114 4 1,86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/10 0/10 115 4 1,9 Tio hu-anti-HER2- HC(AI18 C)-MCvcPAB-MMAE de Controlo 0/10 0/10 92 4 1,55 huMA79b.v2 8—SMCC—DM1 de Controlo 1/10 0/10 202 4 3,4 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 0/10 0/10 110 4 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 3/10 1/10 115 4 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 4/10 3/10 108 4 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 0/10 0/10 NA 4 NA Tio 10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 1/10 0/10 118 4 1,96 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 0/10 0/10 NA 4 NA 394 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ D. Xenoenxertos de D0HH2 (Linfoma Folicular)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a capacidade dos conjugados tioMAb-fármaco para reduzir o volume tumoral de células B em modelos de xenoenxertos de D0HH2 em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 14, abaixo. 0 Ab de controlo foi huMA79b.v28 (conjugado com SMCC-DM1). 0 tioMAb HC(A118C) de controlo foi o tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPE0-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), tioMab tio huMA79b.v28-HC(A118C) e tio hu-anti-CD22-HC(A118C) (conjugado com MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 14 e Figura 36. A Figura 36A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de células D0HH2 em ratinhos SCID CB17 tratados com TDC de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 14. Especificamente, a administração dos conjugados tioMAb-fármaco tio huMA79b.V28-HC-(A118C)-BMPE0-DM1, tio huMA79b.v28-HC(AI18G)-MC-MMAF e tio huMA796 .v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE nas doses mostradas na Tabela 14 mostrou uma inibição no crescimento tumoral em comparação com os conjugados de fármaco de controlo negativo (Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1 de Controlo, Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo, Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de Controlo). Outros controlos incluíram Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo, Tio anti-CD22-HG(AI18C)-MC-MMAF de Controlo e Tio huMA79b.v28-HC(AI18C) de Controlo e huMA79b.v28-SMCC-DMl de Controlo.
Mais ainda, na Tabela 14, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 395 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο mm3) e ΝΑ = nao aplicável. (RFA = Razao Fármaco para Anticorpo)
Tabela 14
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(Al18C) DM1, MMAF e MMAE em Xenoenxerto de D0HH2 em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose MMAF ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPE0-DM1 de Controlo 0/9 0/9 114 4 1,86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/9 0/9 115 4 1,9 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE de Controlo 0/9 0/9 92 4 1,55 huMA79b.v2 8-SMCC-DM1 de Controlo 1/8 1/8 202 4 3,4 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 1/9 1/9 110 4 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF 5/9 4/9 115 4 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 0/9 9/9 108 4 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 1/9 0/9 NA 4 NA Tio anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/9 0/9 118 4 1,96 E. Xenoenxertos de BJAB-Luciferase (Linfoma de Burkitt)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3, variando os conjugados anticorpo-fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados de fármaco em xenoenxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco e as 396 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 15, abaixo. 0 anticorpo de controlo foi veículo (apenas tampão (para ADC)). 0 tioMAb HC(A118C) de controlo foi o anticorpo tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPE0-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF), tioMAb tio huMA7 9 b.v2 8-HC(AI18C) ou tioMAb tio anti-CD22 10F4v3-HC(A118C) (conjugado com MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 15, abaixo. A Figura 37A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de BJAB-luciferase em ratinhos SCID CB17 tratados com o TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 15. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.v28-HG(AI18C)-MC-MMAF mostrou inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-anti-HER2-HC(A118C)-BMPE0-DM1, tio-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, tio-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). Outros controlos incluíram tio huMA79b.v28-HC(A118C) e tio-10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF .
Mais ainda, na Tabela 15, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 397
ΕΡ 2 176 296/PT
Tabela 15
Redução do Volume Tumoral in vivo, Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) MMAE, MMAF, e DM1 em Xenoenxertos de BJAB-Luciferase em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Veículo de Controlo 0/10 0/10 NA NA NA Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPE0-DM1 de Controlo 0/10 1/10 57 2 1, 86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de Controlo 0/10 0/10 23 1 1, 55 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/10 0/10 29 1 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 2/10 0/10 27 1 1, 85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 4/10 0/10 55 2 1, 85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 4/10 1/10 27 1 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 3/8 1/8 28 1 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 0/10 0/10 NA I NA Tio 10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/10 1/10 30 1 1, 96 F. Xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano) em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco 398 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 16, abaixo. 0 tioMAb HC(A118C) de controlo foi o tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPE0-DM1 ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 16 e Figura 38. A Figura 38A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de Granta 519 em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 16. Especificamente, a administração dos conjugados tioMAb-fármaco tio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM e tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF nas doses mostradas na Tabela 16 mostrou uma inibição no crescimento tumoral em comparação com os conjugados de fármaco de controlo.
Mais, no mesmo estudo, a variação percentual do peso corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (Figura 38B) indicaram que a administração destes conjugados tioMAb-fármaco não resultou numa diminuição na percentagem do peso corporal ou perda de peso durante este tempo.
Na Tabela 16, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) . (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 399 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 16
Redução do Volume Tumoral in vivo, Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) DM1 e MMAF em Xenoenxertos de Granta-519 em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose MMAF ou DMl (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco /Ab) Tio hu-anti-HER2- HG(A118C)-BMPEO- DMl de Controlo 0/8 0/R 342 12 1,86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/8 0/8 346 12 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 0/6 0/6 55 2 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 0/8 0/8 110 4 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 4/8 4/8 219 8 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPE0-DM1 3/8 5/8 329 12 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 1/8 1/8 57 2 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 2/8 1/8 115 4 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 6/8 2/8 229 8 1,95 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 4/8 4/8 344 12 1,95 G. Xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Grandes Células Difusas)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Grandes Células Difusas) em ratinhos SCID CB17. Os conjugados de fármaco e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 17, abaixo. 400 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ Ο anticorpo de controlo foi veiculo (apenas tampão (para ADC) ) . Os tio MAb de controlo foram os anticorpos tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPE0-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na Tabela 17 e Figura 39. A Figura 39 é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL2 em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 17. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF e tio huMA79b. v2 8-HC (AI 18C)-MCvcPAB-MMAE (na dose de Ab de 0,5, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou uma inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-hu-anti-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE, tio-hu-antÍ-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e veículo A).
Mais ainda, na Tabela 17, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 401 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 17
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) MMAE, MMAF, e DM1 em Xenoenxertos de WSU-DLCL2 em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Veículo de Controlo 0/9 0/9 NA NA NA Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/9 0/9 114 4 1, 86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE de Controlo 0/9 0/9 92 4 1, 55 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/9 0/9 115 4 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 5/9 2/9 112 4 1,9 Tio huMA79b.v2 8-HC(A118C)-BMPEO-DM1 4/9 0/9 110 4 1, 85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 1/9 0/9 14 0,5 1,9 Tio huMA79b.v2 8-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 0/9 0/9 27 1,0 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 2/9 1/9 55 2, 0 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 1/9 7/9 110 4,0 1,9 H. Xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano)
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estuda a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Células do Manto Humano) em ratinhos SCID GB17. Os conjugados de fármaco 402 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 18, abaixo.
Os tioMAb de controlo foram os anticorpos tioMAb tio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugado com BMPEO-DM1) e tio hu-anti-HER2-HC(A118C)—MCvcPAB-MMAE. Os resultados são mostrados na Tabela 18, abaixo. A Figura 40A é um gráfico representando mudanças no volume tumoral médio ao longo do tempo no xenoenxerto de
Granta-519 em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 18. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 e tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE (na dose de Ab de 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou uma inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 e tio-antÍ-HER2-HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE) .
Mais ainda, na Tabela 18, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 403 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 18
Redução do Volume Tumoral in vivo, Administração do Conjugado Tio HuMA79b.v28-HC(A118C) DM1 e MMAE em Xenoenxertos de Granta-519 em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco /Ab) Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/10 0/10 114 4 1, 86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE de Controlo 2/10 1/10 92 4 1, 55 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 3/10 0/10 110 4 1,85 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 0/10 1/10 13 0, 5 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 1/10 0/10 27 1/0 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 1/10 7/10 54 2, 0 1,87 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 0/10 10/1 0 108 4,0 1, 87 I. Xenoenxertos de BJAB-cynoCD79b
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxertos de células BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando cynoCD79b (BJAB-cynoCD79b) em SCID CB17. Os conjugados de fármacos e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 18, abaixo. sao O Ab de controlo foi veiculo (apenas tampão). Os tio MAb de controlo foram os anticorpos tioMAb tio-hu-antÍ-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e tio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Os resultados mostrados na Tabela 19 e Figura 50. 404 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ A Figura 50 é um gráfico representando a inibição do crescimento tumoral ao longo do tempo no xenoenxerto de BJAB-cynoCD79b em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b de cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 19. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, tio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF bem como tio-anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-anti-cynoCD79b-(chlODlO)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio-anti-cynoCD79b-(chi0D10)-HC(AI18C)-MC-MMAF mostrou inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, tio-antÍ-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e tio-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e veiculo A).
Mais ainda, na Tabela 19, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a qualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 405 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 19
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração do Conjugado Tio anti-cynoCD79b(chi0D10)-HC(AI18C) DM1, MMAF ou MMAE ou tio HuMA79b.v28 DM1, MMAF ou MMAE em Xenoenxertos de BJAB-cynoCD79b em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Veículo de Controlo 0/9 0/9 NA NA NA Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/9 0/9 57 2 1, 86 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de Controlo 0/9 0/9 23 1 1,55 Tio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de Controlo 0/9 0/9 29 1 1,9 Tio anti- cynoCD79b(chl0D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 3/8 1/8 53 2 1,8 Tio anti- cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 1/9 2/9 27 1 1, 86 Tio anti- cynoCD79b(chi0D10)-HC(AI18C)-MC-MMAF 0/9 1/9 28 1 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 3/9 0/9 55 2 1, 85 Tio huMA79b.v28- HC(AI18C)-MCvcPAB-MMAE 2/9 2/9 27 1 1,9 Tio huMA79b.v28-HC(AI18C)-MC-MMAF 7/9 1/9 28 1 1,9 J. Xenoenxertos de BJAB-cynoCD79b
Num estudo semelhante, utilizando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto conforme divulgado no Exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de fármaco e as doses administradas, foi estudada a eficácia dos conjugados tioMAb-fármaco em xenoenxerto de BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando cynoCD79b (BJAB cynoCD79b) em ratinhos SCID CB17. 406 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Os conjugados de fármaco e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADC e controlos) são mostrados na Tabela 19, abaixo.
Os tioMAb de controlo foram os anticorpos tioMAb tio-hu-antÍ-HER2-HC(AI18C)-BMPEO-DM1, tio-huMA79b.v2 8-HC(AI18C), e tio-anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C). Os resultados são mostrados na Tabela 20 e Figura 51. A Figura 51 é um gráfico representando a inibição do crescimento tumoral ao longo do tempo no xenoenxerto de BJAB-cynoCD79b em ratinhos SCID CB17 tratados com os TDC anti-CD79b da cadeia pesada A118C, nas doses mostradas na Tabela 20. Especificamente, a administração de tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 bem como tio-anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 mostrou inibição do crescimento tumoral em comparação com os controlos negativos (tio-anti-HER2-HC(AI18C)-BMPEO-DM1). Outros controlos incluíram tio-hu-MA79b.V28-HC(A118C) e tio-anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C).
Os resultados são mostrados na Tabela 20, abaixo. Na Tabela 20, é indicado o número de ratinhos, do número total de testados, mostrando RP = Regressão Parcial (onde o volume tumoral a gualquer momento após a administração caiu abaixo de 50% do volume tumoral medido no dia 0) ou RC = Remissão Completa (onde o volume tumoral em qualquer momento após a administração caiu para 0 mm3) e NA = não aplicável. (RFA = Razão Fármaco para Anticorpo) 407 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tabela 20
Redução do Volume Tumoral in vivo,
Administração de Conjugado Tio anti-cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C) DM1 ou tio HuMA79b.v28-HC(Ai 18C) DM1 em Xenoenxertos de BJAB-cynoCD79b em Ratinhos SCID CB17
Anticorpo administrado RP RC Dose de MMAF, MMAE ou DM1 (pg/m2) Dose de Ab (mg/kg) RFA (Fármaco/ Ab) Tio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de Controlo 0/10 0/10 57 2 1,86 Tio huMA79b.v28-HC(A118C) de Controlo 0/10 0/10 NA 2 NA Tio anti- cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C) de Controlo 0/10 0/10 NA 2 NA Tio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 1/10 0/10 27 1 1,85 Tio huMA796.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 0/10 2/10 55 2 1,85 Tio anti- cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 0/10 0/10 27 1 1,8 Tio anti- cynoCD79b(chi0D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 0/10 1/10 53 2 1,8 408 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Listagem das Sequências <110> Genentech, Inc.
Chen, Yvonne Dennis, Mark Dornan, David Elkins, Kristi Junutula, Jagath Reddy Polson, Andrew Zheng, Bing
<120> ANTICORPOS E IMUNOCONJUGADOS ANTI-CD79B E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO
<130> P5111R1 WO <150> US 60/950052 <151> 2007-07-16 <150> US 61/025,137 <151> 2008-01-31 <150> US 61/032790 <151> 2008-02-29 <150> US 61/054709 <151> 2008-05-20 <160> 310
<210> 1 <211> 1270 <212> ADN <213> Homo sapiens 409 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 1 caggggacag gctgcagccg gtgcagttac acgttttcct ccaaggagcc 50 tcggacgttg tcacgggttt ggggtcgggg acagagcagt gaccatggcc 100 aggctggcgt tgtctcctgt gcccagccac tggatggtgg cgttgctgct 150 gctgctctca gctgagccag taccagcagc cagatcggag gaccggtacc 200 ggaatcccaa aggtagtgct tgttcgcgga tctggcagag cccacgtttc 250 atagccagga aacggggctt cacggtgaaa atgcactgct acatgaacag 300 cgcctccggc aatgtgagct ggctctggaa gcaggagatg gacgagaatc 350 cccagcagct gaagctggaa aagggccgca tggaagagtc ccagaacgaa 4 00 tctctcgcca ccctcaccat ccaaggcatc cggtttgagg acaatggcat 450 ctacttctgt cagcagaagt gcaacaacac ctcggaggtc taccagggct 500 gcggcacaga gctgcgagtc atgggattca gcaccttggc acagctgaag 550 cagaggaaca cgctgaagga tggtatcatc atgatccaga cgctgctgat 600 catcctcttc atcatcgtgc ctatcttcct gctgctggac aaggatgaca 650 gcaaggctgg catggaggaa gatcacacct acgagggcct ggacattgac 700 cagacagcca cctatgagga catagtgacg ctgcggacag gggaagtgaa 750 gtggtctgta ggtgagcacc caggccagga gtgagagcca ggtcgcccca 800 tgacctgggt gcaggctccc tggcctcagt gactgcttcg gagctgcctg 850 gctcatggcc caaccccttt cctggacccc ccagctggcc tctgaagctg 900 gcccaccaga gctgccattt gtctccagcc cctggtcccc agctcttgcc 950 aaagggcctg gagtagaagg acaacagggc agcaacttgg agggagttct 1000 ctggggatgg acgggaccca gccttctggg ggtgctatga ggtgatccgt 1050 ccceacacat gggatggggg aggcagagac tggtccagag cccgcaaatg 1100 gactcggagc cgagggcctc ccagcagagc ttgggaaggg ccatggaccc 1150 aactgggccc cagaagagcc acaggaacat cattcctctc ccgcaaccac 1200 tcccacccca gggaggccct ggcctccagt gccttccccc gtggaataaa 1250 cggtgtgtcc tgagaaacca 1270 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens 410 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 2
Met 1 Ala Arg Leu Ala 5 Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu 20 Leu Ser Ser Glu Asp Arg Tyr 35 Arg Asn Ile Trp Gin Ser Pro 50 Arg Phe Vai Lys Met His Cys 65 Tyr Met Trp Leu Trp Lys Gin 80 Glu Met Leu Glu Lys Gly Arg 95 Met Glu Thr Leu Thr ile Gin 110 Gly ile Phe Cys Gin Gin Lys 125 Cys Asn Cys Gly Thr Glu Leu 140 Arg Val Leu Lys Gin Arg Asn 155 Thr Leu Thr Leu Leu Ile Ile 170 Leu Phe Leu Asp Lys Asp Asp 185 Ser Lys Tyr Glu Gly Leu Asp 200 Ile Asp vai Thr Leu Arg Thr 215 Gly Glu Pro Gly Gin Glu
Pro Val Pro Ser His Trp Met Val 10 15 Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg 25 30 Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg 40 45 Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 55 60 Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser 70 75 Asp Glu Asn Pro Gin Gin Leu Lys 85 90 Glu Ser Gin Asn Glu Ser Leu Ala 100 105 Arg Phe Glu Asp Asn Gly ile Tyr 115 120 Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gin Gly 130 135 Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gin 145 150 Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gin 160 165 Ile ile Val Pro lie Phe Leu Leu 175 180 Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr 190 195 Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp ile 205 210 Val Lys Trp Ser vai Gly Glu His 220 225
<210> 3 <211> 929 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia Leve de Anticorpo Quimérico (chMA79b) 411 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 3 cactcccagc tccaactgca cctcggttct atcgattgaa ttccaccatg 50 ggatggtcat gtatcatcct ttttctagta gcaactgcaa ctggagtaca 100 ttcagatatc gtgctgaccc aatctccagc ttctttggct gtgtctctgg 150 ggcagagggc caccatctcc tgcaaggcca gccaaagtgt tgattatgat 200 ggtgatagtt ttttgaactg gtaccaacag aaaccaggac agccacccaa 250 actcttcatc tatgctgcat ccaatctaga atctgggatc ccagccaggt 300 ttagtggcag tgggtctggg acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg 350 gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt cagcaaagta atgaggatcc 400 gctcacgttc ggggcaggca ccgagctgga actcaaacgg accgtggctg 450 caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 500 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa 550 agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga 600 gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 650 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga 700 agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg 750 gagagtgtta agcttggccg ccatggccca acttgtttat tgcagcttat 800 aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 850 tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 900 atcatgtctg gatcgggaat taattcggc 929
<210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Leve de Anticorpo Quimérico (chMA79b) 412 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gin Arg Ala Thr ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Xyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Gin Pro Pro Lys Leu Phe ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu ASp Ala Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly 95 100 105 Thr GlU Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe 110 115 120 lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 5 <211> 1469 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Pesada de Anticorpo Quimérico (chMA79b) 413 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 5 ' 4 V V' —' tcggttctat cgattgaatt ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt 50 ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt cagaagttca gctgcagcag 100 tctggggctg aactgatgaa gcctggggcc tcagtgaaga tatcctgcaa 150 ggctactggc tacacattca gtagttactg gatagagtgg gtaaagcaga 200 ggcctggaca tggccttgag tggattggag agattttacc tggaggtggt 250 gatactaact acaatgagat tttcaagggc aaggccacat tcactgcaga 300 tacatcctcc aacacagcct acatgcaact cagcagcctg acatctgagg 350 actctgccgt ctattactgt acaagacgag taccggttta ctttgactac 400 tggggccaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc 450 atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag 500 cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 550 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 600 cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg actgtgccct 650 ctagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 700 agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac 750 tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag 800 tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 850 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 900 caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 950 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1000 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt 1050 ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1100 aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 1150 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1200 tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1250 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1300 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt 1350 ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga 1400 gcctctccct gtctccgggt aaatgagtgc gacggcccta gagtcgacct 1450 gcagaagctt ggccgccat 1469 414 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 6 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia Pesada de Anticorpo Quimérico (chMA79b) <400> 6
Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly HiS Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Ile Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala ASp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser val Thr val Ser Ser Ala Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 185 190 195 Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 200 205 210 Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HiS Thr 215 220 225 415 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu Val HÍS 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg vai vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu HiS Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 380 385 390 Iyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 7 <211> 231 <212> PRT <213> Macaca fascicularís 416 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 7 Met 1 Ala Arg Leu Ala 5 Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu 20 Leu Ser Lys Ser Glu Asp Leu 35 Tyr Pro Arg Ile Trp Gin Ser Pro Arg 50 Thr val Lys Met His 65 Cys Tyr Vai Ser Trp Leu Arg 30 Lys Arg Vai Asn Leu Glu Gin 95 Gly His Vai Thr Thr Leu Ile 110 Ile Gin Ile Tyr Phe Cys Gin 125 Gin Glu Arg Gly Cys Gly Thr 140 Glu Leu Ala Gin Leu Lys Gin 155 Arg Asn ile Gin Thr Leu Leu 170 Ile Ile Leu Leu Leu Asp Lys 185 Asp Asp His Thr Tyr Glu Gly 200 Leu Asp Asp Ile Val Thr Leu 215 Arg Thr Glu HÍS Pro Gly Gin 230 Glu
Pro Val Ser Ser His Trp Leu vai 10 15 Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala 25 30 Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 40 45 Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe 55 60 Val Thr Asn Ser Thr Phe Ser lie 70 75 Glu Thr Asp Lys Glu Pro Gin Gin 85 90 Met His Gin Thr Gin Asn Ser Ser 100 105 Asp Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly 115 120 Cys Ser Lys Thr Ser Glu Val Tyr 130 135 Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu 145 150 Thr Leu Lys Asp Gly Ile lie Met 160 165 Leu Phe Ile Ile Val Pro ile Phe 175 180 Ser Lys Ala Gly Met Glu Ala ASp 190 195 Ile Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu 205 210 Gly Glu Val Lys Trp Sér Val Gly 220 225
<210> 8 <211> 228 <212> PRT <213> Mus musculus 417 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 8
Met 1 Ala Thr Leu Val 5 Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu 20 Phe Ser Ser Ser Asp Leu Pro 35 Leu Asn lie Trp Gin HiS Pro 50 Arg Phe vai Lys Phe HiS Cys 65 Tyr Thr Phe Arg Lys Arg Gly 80 Ser Gin Glu Gly Arg Ile Val 95 Gin Thr Thr Ile Gin Asn ne 110 Gin Tyr Lys Gin Lys Cys Asp 125 Ser Ala Gly Thr Glu Leu Leu 140 Val Leu Lys Arg Arg Asn Thr 155 Leu Lys Leu Leu Ile Ile Leu 170 Phe Ile Asp Lys Asp Asp Gly 185 Lys Ala Glu Gly Leu Asn Ile 200 Asp Gin Thr Leu Arg Thr Gly 215 Glu Val Gly Gin Glu
Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu 10 15 Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr 25 30 Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin 40 45 Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met 55 60 Asn HiS Ser Gly Ala Leu Thr Trp 70 75 Gin Pro Gin Glu Leu Val Ser Glu 85 90 Gin Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu 100 105 GlU ASp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys 115 120 Asn HiS Asn Val Thr Asp Ser Cys 130 135 Gly Phe Ser Thr Leu Asp Gin Leu 145 150 Asp Gly Ile ile Leu He Gin Thr 160 165 Ile Val Pro ile Phe Leu Leu Leu 175 180 Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr 190 195 Thr Ala Thr Tyr Glu Asp He val 205 210 Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro 220 225
<210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens 418 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 9
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser 20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 95 100 105
Ile Lys Arg <210> 10 <211> 111
<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Quimérico <223> Domínio Variável de Cadeia Leve de Anticorpo (chMA79b) <400> 10
Asp 1 ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly Gin Arg Ala Thr 20 Ile Ser Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ser Val Asp 30 Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Asn Trp Tyr 40 Gin Lys Pro Gly Gin 45 Pro Pro Lys Leu Phe 50 Ile Tyr Ala Ala Ser 55 Asn Leu Glu Ser Gly 60 ile Pro Ala Arg Phe 65 Ser Gly Ser Gly Ser 70 Gly Thr Asp Phe Thr 75 Leu Asn Ile His Pro 80 Val Glu Glu Glu Asp 85 Ala Ala Thr Tyr Tyr 90 Cys Gin Gin Ser Asn 95 Glu Asp Pro Leu Thr 100 Phe Gly Ala Gly Thr 105 Glu Leu Glu Leu Lys 110 Arg 419 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Domínio Variável de Cadeia Leve de Enxerto de Anticorpo Humanizado (enxerto de huMA79b) <400> 11
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp 20 25 30
Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90
Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105
Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 110
<210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12
Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys 5 10
<210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens 420 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 13
Glu 1 vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai Ser Val 50 Ile Ser Gly Asp Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala ASp Ser val Lys 65 Gly Arg Phe Thr ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Gly Phe 100 Asp Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Leu val Thr 110 Val Ser Ser
<210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Quimérico <223> Domínio Variável de Cadeia Pesada de Anticorpo (chMA79b) <400> 14
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Ile Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Vai Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 421 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Domínio Variável de Cadeia Pesada de Enxerto de Anticorpo Humanizado (enxerto de huMA79b) <400> 15
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Vai Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu lie Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr vai Ser Ser 110 115 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16
Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys ‘ 1 5 10 Lys <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 17
Lys Ala Ser Lys Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15 422
ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 18
Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser 5
<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 19
Ala Ala Ser Asn Leu Lys Ser 5
<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 20
Gin Gin Ser Asn Ser Asp Pro Leu Thr 5
<210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 21
Gin Gin Ser Asn Lys Asp Pro Leu Thr 5
<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial 423 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 22
Ala Ala Arg Lys Leu Gly Arg 5
<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 23
Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser 5
<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 24
Ala Ala Arg Lys Leu Gly Asn 5
<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 25
Ala Ala Arg Lys Leu Lys Arg 5
<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 26
Ala Ala Arg Tyr Leu Lys Arg 5 424
ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 27
Ala Ala Arg Lys Leu Lys Ser 5
<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 28
Ala Ala Arg Lys Leu Ala Ser 5
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 29
Ala Ala Gly Ile Leu Ala Arg 5
<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 30
Ala Ala Arg Lys Leu Arg Ser 5
<210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial 425 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 31
Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ser 5
<210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 32
Ala Ala Arg His Leu Lys Arg 5
<210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 33
Ala Ser Arg Tyr Leu Ser Arg 5
<210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 34
Ala Gly Ser Lys Leu Leu Arg 5
<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 35
Ala Ala Ser Asn Arg Lys Ser 5 426 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 36
Ala Ala Ser Lys Leu Gly Ser 5
<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 37
Ala Ala Arg Tyr Leu Arg Arg 5
<210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 38
Ala Ala Arg Arg Leu Arg Thr 5
<210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 39
Ala Ala Arg Arg Leu Gly Arg 5
<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial 427 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 40
Ala Ala Arg Gin Arg Lys Arg 5
<210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 41
Ala Ala Arg Lys Leu Leu Arg 5
<210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 42
Ala Ala Arg Lys Leu Lys Asn 5
<210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 43
Ala Ala Arg Lys Leu Gly Thr 5
<210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Variante de Anticorpo <400> 44
Ala Ala Arg Lys Leu Gly Gly 5 428 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 45
Ala Ala Arg Lys Leu Ala Arg 5
<210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 46
Gin Gin Ser Asn Ala Asp Pro Leu Thr 5
<210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 47
Gin Gin Ser Asn Gin Asp Pro Leu Thr 5
<210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 48
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5
<210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 429 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 49
Gin Gin Ser Asn Asp Asp Pro Leu Thr 5 <210> <211 > <212 > <213 > 50 9 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 50
Gin Gin Ser Asn Leu Asp Pro Leu Thr 5 <210> <211 > <212> <213 > 51 9 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 51
Asn Asn Ser Asn Gly Asp Pro Leu Asn 5 <210> <211 > <212 > <213 > 52 9 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 52
Gin Pro Asp Asn Glu Ala Pro Arg Thr 5 <210> <211> <212 > <213> 53 9 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 53
Asp Gin Arg Asn Ala Asp Pro Leu Thr 5 430 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> <211 > <212 > <213 > 54 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 54
Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Trp Ile Ser 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 55 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 55
Gly Tyr Pro Phe Arg Ser Tyr Trp Ile Gin 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 56 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 56
Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 57 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 57
Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Trp Ile Asn 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 58 10 PRT Sequência artificial 431 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 58 Gly Ty r Thr Phe Asn Arg Tyr Trp Ile Asn 5 10 <210> 59 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 59 Gly Ty r Ser Phe Lys Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 60 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 60 Pro Tyr Ser Leu Cys Thr Tyr Phe ile Asp 5 10 <210> 61 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 61 Gly Tyr Tyr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 62 <211> 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 62 Gly Tyr Pro Phe Gly Arg Tyr Trp Vai Asn 5 10 432 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 63 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 63 Gly Tyr Thr Phe Lys Lys Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 64 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 64 Gly Ty r PrO Phe Thr Ser Tyr Trp : [le Gin 5 10 <210> 65 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 65 Gly Tyr Pro Phe Arg Arg Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 66 <211> 10 <212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 66 Gly Tyr Pro Vai Gly Arg Tyr Trp Ile Ser 5 10 <210> 67 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial 433 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 67
Gly Tyr Pro Phe Asn Arg Tyr Trp Ile Asn 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 68 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 68
Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ser 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 69 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 69
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu Ser 5 10 <210> <211> <212 > <213> 70 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 70
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 71 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 71
Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr Trp Ile Asn 5 10 434 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 72 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> a sequência é sintetizada <400> 72 Gly Tyr Thr Phe Arg Arg Tyr Xrp Ile Asn 5 10 <210> 73 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 73 Gly Tyr Ser Phe Arg Ser Tyr Trp ile Asn . 5 10 <210> 74 <211> 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 74 Gly Tyr Ser Phe Arg Arg Tyr Trp Ile Asn 5 10 <210> 75 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 75 Gly Tyr Ser Phe Arg Arg Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 76 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial 435 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 76 Gly Tyt Ser Phe Pro Ser Tyr Trp Leu Gin 5 io <210> 77 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 77 Gly Tyr Pro Phe Thr Arg Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 78 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 78 Gly Tyr Pro Phe Ser Gly Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 79 <211 > 10 <212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 79 Gly Tyr Pro Phe Arg Ser Tyr Trp lie Ser 5 10 <210> 80 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 80 Gly Tyr Pro Phe Arg Ser Tyr Trp Ile Asn 5 10 436 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 81
Gly Tyr Pro Phe Arg Gly Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 8_2
Gly Tyr Pro Phe Asn Arg Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 83
Gly Tyr Pro Phe Asn Gly Tyr Trp Ile Asn 5 10
<210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 84
Gly Tyr Asn Vai Ser Ser Tyr Trp Leu Ser 5 10
<210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 437 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 85
Gly Phe Pro Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ser 5 10
<210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 86
Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr Trp Ile Asn 5 10
<210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 87
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Tyr Leu Asp 5 10
<210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 88
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Asp 5 10
<210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 89
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Lys Leu Asp 5 10 438 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> <211 > <212 > <213 > 90 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 90
Cys Thr Arg Arg vai Pro vai Tyr Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 91 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 91
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Tyr Phe Asp 5 10 <210> <211> <212 > <213> 92 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 92
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Phe Cys Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 93 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 93
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 94 10 PRT Sequência artificial 439 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 94
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Arg Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 95 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 95
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Lys Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 96 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado < 4 0 0 > 9 6
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Arg Phe Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 97 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 97
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Tyr Phe Asp 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 98 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 98
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Ser 5 10 440 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 99 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 99 Cys Thr Arg Arg val Pro vai val Leu Asp 5 10 <210> 100 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 100 Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Arg Leu Asp 5 10 <210> 101 <211 > 10 <212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 101 Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Arg Phe Asp 5 10 <210> 102 <211 > 10 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 102 Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Phe Leu Asp 5 10 <210> 103 <211> 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial 441 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 103
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Tyr Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 104 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 104
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Tyr Phe Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 105 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 105
Cys Thr Arg Arg Arg Pro Vai Cys Leu Asp 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 106 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de Anticorpo Humanizado <400> 106
Cys Thr Arg Arg Ile Pro Vai Tyr Phe Asp 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 107 10 PRT Mus musculus <400> 107
Cys Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Asp 5 10 442 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 108 <211 > 87 <212 > PRT <213 > Homo sapiens <400> 108
Gin Vai Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg 35 40 45 val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 109 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30 Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 50 Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu vai Thr Vai Ser Ser 80
<210> 110 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens 443 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 110
Gin 1 Vai Gin Leu vai 5 Gin Ser Gly Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys LyS Pro Gly Gin Gly Leu 35 Glu Trp Met Thr Ser Thr Ser Thr 50 Ala Tyr Met Glu Asp Thr Ala Val 65 Tyr Tyr Cys Vai Thr Vai Ser Ser
Aia Glu val Lys Lys Pro Gly 10 15 Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 25 30 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 40 45 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 55 60 Ala Trp .Gly Gin Gly Thr Leu 70 75
<210> 111 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111
Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly 10 15 Ala Ser Trp Vai Arg Gin Ala 25 30 Arg vai Thr Ile Thr Ala Asp 40 45 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 55 60 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai "70 75
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5
Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys 20
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 50
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 65
Thr Vai Ser Ser
<210> 112 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens 444 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 112
Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Vai Lys Pro Ser 15 Gin Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr vai Ser 25 Gly Gly Ser Vai Ser 30 Trp He Arg Gin Pro 35 Pro Gly Lys Gly Leu 40 Glu Trp ile Arg vai 45 Thr ile Ser Vai Asp 50 Thr Ser Lys Asn Gin 55 Phe Ser Leu Lys Leu 60 Ser Ser Val Thr Ala 65 Ala Asp Thr Ala Vai 70 Tyr Tyr Cys Ala Arg 75 Trp Gly Gin Gly Thr 80 Leu Vai Thr Vai Ser 85 Ser
<210> 113 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp ile Arg Gin Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg val Thr He Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80
<210> 114 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens 445 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 114
Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Gin Thr Leu Ser Leu 20 Pro Gly Lys Gly Leu 35 Thr Ser Lys Asn Gin 50 Ala Asp Thr Ala Val 65 Vai Thr Vai Ser Ser 80
Glu Ser Gly Pro Gly 10 Thr Cys Thr Val Ser 25 Glu Trp Ile Arg val 40 Phe Ser Leu Lys Leu 55 Tyr Tyr Cys Ala Trp 70
Leu Val Lys Pro Ser 15 Trp Ile Arg Gin Pro 30 Thr Ile Ser Val Asp 45 Ser Ser val Thr Ala 60 Gly Gin Gly Thr Leu 75 <210> 115 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115
Gin 1 <—1 aí > Gin Leu Gin 5 Gin Thr Leu Ser Leu 20 Pro Gly Lys Gly Leu 35 Thr Ser Lys Asn Gin 50 Ala Asp Thr Ala Val 65 Thr Val Ser Ser
Glu Ser Gly Pro Gly 10 Thr Cys Thr Val Ser 25 Glu Trp Ile Arg Val 40 Phe Ser Leu Lys Leu 55 Tyr Tyr Cys Trp Gly 70
Leu Val Lys Pro Ser 15 Trp Ile Arg Gin Pro 30 Thr Ile Ser Val Asp 45 Ser Ser Val Thr Ala 60 Gin Gly Thr Leu Val 75
<210> 116 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens 446 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 116
Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 * 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 50 55 60 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 117 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp vai Arg Gin Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp 35 40 45 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75 Leu Vai Thr Val Ser Ser 80 <210> 118 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp val Arg Gin Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp 447
ΕΡ 2 176 296/PT 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75
Vai Thr Vai Ser Ser 80
<210> 119 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Vai Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 65 70 75
Thr Vai Ser Ser
<210> 120 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120
Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asn Ile Lys 30 Trp Vai Arg Gin Ala 35 Pro Gly Lys Gly Leu 40 Glu Trp Vai Ser Arg 45 Phe Thr ile Ser Ala 50 Asp Thr Ser Lys Asn 55 Thr Ala Tyr Leu Gin 60 Met Asn Ser Leu Arg 65 Ala Glu Asp Thr Ala 70 Vai Tyr Tyr Cys Ser 75 Arg Trp Gly Gin Gly SO Thr Leu Vai Thr Vai 85 Ser Ser 448 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 121 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Glu Vai Gin 1 Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser CyS Ala Ala Ser 25 Trp Vai Arg Gin Ala 30 Pro Gly Lys Gly Leu 35 Glu Trp Vai Arg Phe 40 Thr Ile Ser Ala Asp 45 Thr Ser Lys Asn Thr 50 Ala Tyr Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Glu Asp Thr Ala Vai 65 Tyr Tyr Cys Ser Arg 70 Trp Gly Gin Gly Thr 75 Leu Vai Thr Vai Ser 80 Ser <210> 122 <211> 80 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 122 Glu Vai Gin 1 Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Trp vai Arg Gin Ala 30 Pro Gly Lys Gly Leu 35 Glu Trp vai Arg Phe 40 Thr ile Ser Ala ASp 45 Thr Ser Lys Asn Thr 50 Ala Tyr Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Glu Asp Thr Ala Vai 65 Tyr Tyr Cys Ser Trp 70 Gly Gin Gly Thr Leu 75
Vai Thr Vai Ser Ser 80
<210> 123 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens 449 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 123
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asn Ile Lys 30 Trp Val Arg Gin Ala 35 Pro Gly Lys Gly Leu 40 Glu Trp Val Ser Arg 45 Phe Thr Ile Ser Ala 50 Asp Thr Ser Lys Asn 55 Thr Ala Tyr Leu Gin 60 Met Asn Ser Leu Arg 65 Ala Glu Asp Thr Ala 70 Val Tyr Cys Ala Arg 75 Trp Gly Gin Gly Thr 80 Leu Val Thr Val Ser 85 Ser <210> 124 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapi ens <400> 124 Glu 1 val Gin Leu val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Trp Val Arg Gin Ala 30 Pro Gly Lys Gly Leu 35 Glu Trp val Arg Phe 40 Thr Ile Ser Ala Asp 45 Thr Ser Lys Asn Thr 50 Ala Tyr Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Glu Asp Thr Ala Val 65 Tyr Tyr Cys Ala Arg 70 Trp Gly Gin Gly Thr 75
Leu Val Thr Vai Ser Ser 80
<210> 125 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens 450 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 125
Glu vai Gin 1 Leu Vai 5 Glu Ser Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Pro Gly Lys Gly Leu 35 Glu Trp Thr Ser Lys Asn Thr 50 Ala Tyr Glu Asp Thr Ala Vai 65 Tyr Tyr Vai Thr Vai Ser Ser 80 <210> 126 <211> 79 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 126 Glu Vai Gin 1 Leu vai 5 Glu Ser Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Pro Gly Lys Gly Leu 35 Glu Trp Thr Ser Lys Asn Thr 50 Ala Tyr Glu Asp Thr Ala Vai 65 Tyr Tyr Thr Vai Ser Ser
Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Ala Ala Ser 25 Trp Val Arg Gin Ala 30 val Arg Phe 40 Thr Ile Ser Ala Asp 45 Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Cys Ala Trp 70 Gly Gin Gly Thr Leu 75
Gly Gly Gly 10 Leu vai Gin Pro Gly 15 Ala Ala Ser 25 Trp Val Arg Gin Ala 30 Val Arg Phe 40 Thr Ile Ser Ala Asp 45 Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Cys Trp Gly 70 Gin Gly Thr Leu val 75
<210> 127 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens 451 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 127 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75 Lys Vai Glu Ile Lys 80
<210> 128 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Pro 1 5 10 15 Gly GlU Pro Ala Ser ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30 Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Val pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg vai 50 55 60 Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Lys Vai Glu Ile Lys 80
<210> 129 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens 452 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 129
Glu iie vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser CyS Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30 Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 50 55 60 Glu Pro Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75 Lys vai Glu ile Lys 80 <210> 130 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30 Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ue Ser Ser Leu 50 55 60 Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75 Lys Vai Glu Ile Lys 80
<210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR1-LC de enxerto de huMA79b <400> 131
Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15 453 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 132 <211 > 7 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-LC de enxerto de huMA79b <400> 132 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 5 <210> 133 <211 > 9 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-LC de enxerto de huMA79b <400> 133 Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5 <210> 134 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-HC de enxerto de huMA79b <400> 134 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 135 <211> 18 <212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-HC de enxerto de huMA79b <400> 135 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp T] 1 5 Phe Lys Gly <210> 136 <211 > 10 <212 > PRT <213> Sequência artificial
Ile15 10 454 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> HVR3-HC de enxerto de huMA79b <400> 136
Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Asp Tyr 5 10
<210> 137 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.V28) <400> 137
Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15
<210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.V28) <400> 138
Thr Arg Arg Vai Pro Ile Arg Leu Asp Tyr 5 10
<210> 139 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
<210> 140 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 141 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens 455 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 141
Ser Gly Thr Asp Phe 15 Asp Phe Ala Thr Tyr 30
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 1 5 10
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 20 25
Tyr Cys
<210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 5 10
<210> 143 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 144 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 5 10
<210> 145 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 456 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 146
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 5 10
<210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-HC Compósita de Variantes de Anticorpo Humanizado <22 0> <221> Xaa <222> 6
<223> Xaa é A ou R <22 0> <221> Xaa <222> 8
<223> Xaa é T ou N <22 0> <221> Xaa <222> 13 <223> Xaa é A ou L <400> 147
Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Thr xaa Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ala
<210> 149 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens 457 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 149
Arg 1 Phe Thr Ile Ser 5 Ala Asp Thr Ser Lys 10 Asn Thr Ala Tyr Leu 15 Gin Met Asn Ser Leu 20 Arg Ala Glu Asp Thr 25 Ala Vai Tyr Tyr Cys 30
Ala Arg
<210> 150 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ser
<210> 151 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151
Arg 1 Phe Thr Ile Ser 5 Ala Asp Thr Ser Lys 10 Asn Thr Ala Tyr Leu 15 Gin Met Asn Ser Leu 20 Arg Ala Glu Asp Thr 25 Ala val Tyr Tyr Cys 30
Ser Arg
<210> 152 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 152
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
<210> 153 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial 458 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <220> <223> FR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 153
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 154 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 154
Gly 1 Vai Pro Ser Arg 5 Phe Ser Gly Ser Gly 10 Ser Gly Thr Asp Phe 15 Thr Leu Thr Ile Ser 20 Ser Leu Gin Pro Glu 25 Asp Phe Ala Thr Tyr 30
Tyr Cys
<210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 155
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 5 10
<210> 156 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVRl-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 156
Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15
<210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huKA79b.vl7) 459 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 157
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 5
<210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 158
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5
<210> 159 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CLl-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> _159
Thr 1 Vai Ala Ala Pro 5 Ser Vai Phe Ile Phe 10 Pro Pro Ser ASp Glu 15 Gin Leu Lys Ser Gly 20 Thr Ala Ser Val Val 25 Cys Leu Leu Asn Asn 30 Phe Tyr Pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val Asp Asn Ala 45 Leu Gin Ser Gly Asn 50 Ser Gin Glu Ser Val 55 Thr Glu Gin Asp Ser 60 Lys Asp Ser Thr Tyr 65 Ser Leu Ser Ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser Lys 75 Ala Asp Tyr Glu Lys 80 His Lys val Tyr Ala 85 Cys Glu Val Thr His 90 Gin Gly Leu Ser Ser 95 Pro vai Thr Lys Ser 100 Phe Asn Arg Gly Glu 105
Cys
<210> 160 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) 460 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 160
Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25
<210> 161 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 161
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10
<210> 162 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 162
Arg 1 Ala Thr Phe Ser 5 Ala Asp Thr Ser Lys 10 Asn Thr Ala Tyr Leu 15 Gin Met Asn Ser Leu 20 Arg Ala Glu Asp Thr 25 Ala Vai Tyr Tyr Cys 30
<210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR4-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 163
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 5 10
<210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) 461 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 164
Gly Tyr Thr Píie Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 165 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 165
Gly Glu lie Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Xle 15 10 15
Phe Lys Gly
<210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 166
Thr Arg Arg Vai Pro Vai Tyr Phe Asp Tyr 5 10
<210> 167 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CHl-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) 462 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 167
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 20 25 30 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala 35 40 45 Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 50 55 60 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai vai Thr Val Pro Ser Ser Ser 65 70 75 Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn Hrs Lys Pro Ser 80 85 90 Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 95 100 105
Thr His Thr
<210> 168 <211> 221 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fc-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 168
Cys 1 Pro Pro Cys Pro 5 Ala Pro Glu Leu Leu 10 Gly Gly Pro Ser Val 15 Phe Leu Phe Pro Pro 20 Lys Pro Lys Asp Thr 25 Leu Met Ile Ser Arg 30 Thr Pro Glu vai Thr 35 Cys Val Val vai Asp 40 Val Ser His Glu Asp 45 Pro Glu vai Lys Phe 50 Asn Trp Tyr vai Asp 55 Gly Val Glu Val His 60 Asn Ala Lys Thr Lys 65 Pro Arg Glu Glu Gin 70 Tyr Asn Ser Thr Tyr 75 Arg Val vai Ser vai 80 Leu Thr Val Leu His 85 Gin Asp Trp Leu Asn 90 463 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Gly Lys Glu Tyr Lys 95 Cys Lys Val Ser Asn 100 Lys Ala Leu Pro Ala 105 Pro lie GlU Lys Thr 110 Ile Ser Lys Ala Lys 115 Gly Gin Pro Arg GlU 120 Pro Gin Vai Tyr Thr 125 Leu Pro Pro Ser Arg 130 Glu Glu Met Thr Lys 135 Asn Gin vai Ser Leu 140 Thr Cys Leu Val Lys 145 Gly Phe Tyr Pro Ser 150 ASp Ile Ala Vai Glu 155 Trp Glu Ser Asn Gly 160 Gin Pro Glu Asn Asn 165 Tyr Lys Thr Thr Pro 170 Pro vai Leu Asp Ser 175 Asp Gly Ser Phe Phe 180 Leu Tyr Ser Lys Leu 185 Thr Val Asp Lys Ser 190 Arg Trp Gin Gin Gly 195 Asn Vai Phe Ser Cys 200 Ser Vai Met His Glu 205 Ala Leu His Asn His 210 Tyr Thr Gin Lys Ser 215 Leu Ser Leu Ser Pro 220 Gly
<210> 169 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Domínio Variável de LC-HC de Variante de Anticorpo (huMA79b.vl7) 464 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 169
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg vai Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ser Val Asp 30 Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Asn Trp Tyr 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Lys Ala Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Ala Ala 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Val Pro Ser Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr Ile Ser 80 Ser Leu Gin Pro Glu 85 Asp Phe Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gin Gly 105 Thr Lys val Glu ile 110 Lys Arg
<210> 170 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio Variável de HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl7) <400> 170
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Trp Ile Glu 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Glu 50 Ile Leu Pro Gly Gly 55 Gly Asp Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Ile Phe Lys 65 Gly Arg Ala Thr Phe 70 Ser Ala Asp Thr Ser 75 Lys Asn Thr Ala Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Arg Val 100 Pro val Tyr Phe Asp 105 Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Val Thr Val 115 Ser Ser 465 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 171 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 171
Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
<210> 172 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 172
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 173 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 173
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu ASp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 174 <211 .> 11 <212 ! > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 174
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 5 10 466 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 175 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 175
Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15
<210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 176
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 5
<210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 177
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5
<210> 178 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CL1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) 467 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 178
Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 20 25 30 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 35 40 45 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 50 55 60 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 65 70 75 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 80 85 90 Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 95 100 105
Cys
<210> 179 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 179
Glu 1 vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai 10 Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25
<210> 180 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 180
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10
<210> 181 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial 468 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <220> <223> FR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 181
Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 182
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 5 10
<210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 183
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 184 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 184
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile 15 io 15
Phe Lys Gly
<210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) 469 ΕΡ 2 176 296/PT <400> 185
Thr Arg Arg Vai Pro He Arg Leu Asp Tyr 5 10
<210> 186 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CH1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 186
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LyS 20 25 30 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 35 40 45 Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gin Ser Ser 50 55 60 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 65 70 75 Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 80 85 90 Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys vai Giu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 95 100 105
Thr His Thr
<210> 187 <211> 221 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fc-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.vl8) <400> 187
Cys 1 Pro Pro Cys PrO 5 Ala Pro Glu Leu Leu 10 Gly Gly Pro Ser Val 15 Phe Leu Phe Pro PrO 20 LyS PrO Lys Asp Thr 25 Leu Met Ile Ser Arg 30 Thr Pro Glu Val Thr 35 Cys val Val Val Asp 40 Val Ser His Glu Asp 45 Pro Glu Val Lys Phe 50 Asn Trp Tyr Val Asp 55 Gly Val Glu Val His 60 470 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 Arg Val Val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 80 85 90 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 95 100 105 Pro Ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 110 115 120 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 125 130 135 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 14 0 145 150 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 155 160 165 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 170 175 180 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 185 190 195 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 200 205 210 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 215 220
<210> 188 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Variante de Anticorpo Humanizado <223> Domínio Variável de LC de (huMA79b.vl8) 471 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 188
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ser Vai Asp 30 Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Asn Trp Tyr 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Lys Ala Pro Lys Leu 50 Leu ile Tyr Ala Ala 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Vai Pro Ser Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr He Ser 80 Ser Leu Gin Pro GlU 85 Asp Phe Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Vai Glu He 110 Lys Arg
<210> 189 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Domínio Variável de HC de Variante de Anticorpo (huMA79b.vl8) <400> 189
Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 GlU Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu I le Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp 95 100 105
Ser Ser
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 110 115 472 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 190 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 190
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
<210> 191 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 191
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15
<210> 192 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 192
Gly 1 vai Pro Ser Arg 5 Phe Ser Gly Ser Gly 10 Ser Gly Thr Asp Phe 15 Thr Leu Thr ile Ser 20 Ser Leu Gin Pro Glu 25 Asp Phe Ala Thr Tyr 30
Tyr Cy3
<210> 193 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR4-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 193
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 5 10 473 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 194 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 194
Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn 1 5 10 15
<210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 195
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 5
<210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 196
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5
<210> 197 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CL1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) 474 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 197
Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 20 25 30 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 35 40 45 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 50 55 60 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 65 70 75 Ala Asp Tyr Glu Lys HiS Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 80 85 90 Gin Gly Leu Ser Ser Pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 95 100 105
Cys
<210> 198 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FRl-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 198
Glu 1 Vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25
<210> 199 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 199
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10
<210> 200 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial 475 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> FR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 200
Arg 1 Ala Thr Phe Ser 5 Ala Asp Thr Ser Lys 10 Asn Thr Ala Tyr Leu 15 Gin Met Asn Ser Leu 20 Arg Ala Glu Asp Thr 25 Ala Vai Tyr Tyr Cys 30
<210> 201 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 201
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 5 10
<210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 202
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 203 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR2-HLC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 203
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile 15 10 15
Phe Lys Gly
<210> 204 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) 476
ΕΡ 2 176 296/PT <400> 204
Thr Arg Arg Vai Pro Ile Arg Leu Asp Tyr 5 10
<210> 205 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CH1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 205
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Vai Phe Pro 10 Leu Ala Pro Ser Ser 15 Lys Ser Thr Ser Gly 20 Gly Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Val Lys 30 Asp Tyr Phe Pro Glu 35 Pro Vai Thr val Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gly Vai 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Val Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser Leu 65 Ser Ser Vai Val Thr 70 Val Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Gin Thr 80 Tyr lie Cys Asn val 85 Asn His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Vai Asp 95 Lys Lys Vai Glu Pro 100 Lys Ser Cys Asp Lys 105
Thr His Thr
<210> 206 <211> 221 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Fc-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.V28) <400> 206
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 15 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 477 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp val Ser HiS Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 80 85 90 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 95 100 105 Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 110 115 120 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 125 130 135 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 140 145 150 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 155 160 165 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 170 175 180 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 185 190 195 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 200 205 210 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 215 220
<210> 207 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Domínio variável de LC de (huMA79b.v28) 478 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 207
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser vai Asp 20 25 30 Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 110
<210> 208 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio Variável de HC de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v28) <400> 208
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu ile Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 479
ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 209 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 209
Asp He Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20
<210> 210 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 210
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile Tyr 15 10 15
<210> 211 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 211
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30
Tyr Cys
<210> 212 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FR4-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 212
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 5 10 480 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 213 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 213
Lys Ala Ser Gin Ser vai Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Phe Leu Asn 15 10 15
<210> 214 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR2-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 214
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 5
<210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 215
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 5
<210> 216 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CL1-LC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) 481
ΕΡ 2 176 296/PT <400> 216
Thr 1 Val Ala Ala Pro 5 Ser Val Phe Ile Phe 10 Pro Pro Ser Asp Glu 15 Gin Leu Lys Ser Gly 20 Thr Ala Ser val Val 25 Cys Leu Leu Asn Asn 30 Phe Tyr Pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val Asp Asn Ala 45 Leu Gin Ser Gly Asn 50 Ser Gin Glu Ser vai 55 Thr Glu Gin Asp Ser 60 Lys Asp Ser Thr Tyr 65 Ser Leu Ser ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser Lys 75 Ala Asp Tyr Glu Lys 80 His Lys Val Tyr Ala 85 Cys Glu Val Thr His 90 Gin Gly Leu Ser Ser 95 Pro Val Thr Lys Ser 100 Phe Asn Arg Gly Glu 105
Cys
<210> 217 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FRl-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 217
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 218
Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10
<210> 219 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) 482 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 219
Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 220 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 220
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 5 10
<210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 221
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10
<210> 222 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HVR2-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 222
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile 15 10 15
Phe Lys Gly
<210> 223 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR3-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) 483 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 223
Thr Arg Arg vai Pro Ile Arg Leu Asp Tyr 5 10
<210> 224 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CH1-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) <400> 224
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Vai Phe Pro 10 Leu Ala Pro Ser Ser 15 Lys Ser Thr Ser Gly 20 Gly Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Val Lys 30 Asp Tyr Phe Pro Glu 3S Pro Vai Thr vai Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gly vai 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Vai Leu Gin Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser Leu 65 Ser Ser Vai Vai Thr 70 Val Pro Ser Ser Ser 75 Leu Gly Thr Gin Thr 80 Tyr Ile Cys Asn Vai 85 Asn His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Vai Asp 95 Lys Lys Vai Glu Pro 100 Lys Ser Cys Asp Lys 105
Thr His Thr
<210> 225 <211> 221 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fc-HC de Variante de Anticorpo Humanizado (huMA79b.v32) 484
ΕΡ 2 176 296/PT <400> 225
Cys 1 Pro Pro Cys Pro 5 Ala Pro Glu Leu Leu 10 Gly Gly Pro Ser Val 15 Phe Leu Phe Pro Pro 20 Lys Pro Lys Asp Thr 25 Leu Met Ile Ser Arg 30 Thr Pro Glu Vai Thr 35 Cys Val Val val Asp 40 val Ser HiS Glu Asp 45 Pro Glu Vai Lys Phe 50 Asn Trp Tyr Val Asp 55 Gly val Glu Val His 60 Asn Ala Lys Thr Lys 65 Pro Arg Glu Glu Gin 70 Tyr Asn Ser Thr Tyr 75 Arg Vai Vai Ser val 80 Leu Thr val Leu HiS 85 Gin Asp Trp Leu Asn 90 Gly LyS Glu Tyr Lys 95 Cys Lys Val Ser Asn 100 Lys Ala Leu Pro Ala 105 Pro Ile Glu Lys Thr 110 Ile Ser Lys Ala Lys 115 Gly Gin Pro Arg Glu 120 Pro Gin Vai Tyr Thr 125 Leu Pro Pro Ser Arg 130 Glu Glu Met Thr Lys 135 Asn Gin Vai Ser Leu 140 Thr Cys Leu vai Lys 145 Gly Phe Tyr Pro Ser 150 Asp Ile Ala Vai Glu 155 Trp Glu Ser Asn Gly 160 Gin Pro Glu Asn Asn 165 Tyr Lys Thr Thr Pro 170 Pro Val Leu Asp Ser 175 Asp Gly Ser Phe Phe 180 Leu Tyr Ser Lys Leu 185 Thr Val Asp Lys Ser 190 Arg Trp Gin Gin Gly 195 Asn Vai Phe Ser Cys 200 Ser Val Met His Glu 205 Ala Leu His Asn His 210 Tyr Thr Gin Lys Ser 215 Leu Ser Leu Ser Pro 220 Gly
<210> 226 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
Humanizado <223> Domínio Variável de LC de Variante de Anticorpo (huMA79b.v32) 485 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 226
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg vai Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ser Vai Asp 30 Tyr Ser Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu 50 Phe Ile Tyr Ala Ala 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly vai Pro Ser Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr Ile Ser 80 Ser Leu Gin Pro Glu 85 Asp Phe Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gin Gly 105 Thr Lys Vai Glu Ile 110 Lys Arg
<210> 227 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>
Humanizado <223> Domínio Variável de HC de Variante de Anticorpo (huMA79b.v32) <400> 227
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu ile Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Vai Pro Ile Arg Leu Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 486 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 228 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HC da Variante TioMAb-huMA79b.vl7-HC(A118C) <400> 228
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp He Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly ASp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Ile Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser vai Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 185 190 195 Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 200 205 210 Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 215 220 225 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val 230 235 240 487 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 2 60 265 270 Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Vai vai Ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 380 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu ASp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val ASp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 229 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC da Variante TioMAb-huMA79b.vl7-HC(AI18C) 488 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 229
Asp 1 lie Gin Leu Thr 5 Gin Ser Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Lya Ala Pro Lys Leu 50 Leu Ile Gly Vai Pro Ser Arg 65 Phe Ser Thr Leu Thr He Ser 80 Ser Leu Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Thr Lys Val Glu Ile 110 Lys Arg He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 125 vai Val Cys Leu Leu 140 Asn Asn Gin Trp Lys Val Asp 155 Asn Ala Ser vai Thr Glu Gin 170 Asp Ser Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Tyr Ala Cys Glu Val 200 Thr His Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 10 15 Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 25 30 Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 70 75 Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 85 90 Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 100 105 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 160 165 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 175 180 Ala ASp Tyr Glu Lys His Lys Val 190 195 Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 205 210 Cys
<210> 230 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HC da Variante TioMAb-huMA79b.v!8-HC(A118C) 489 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 230 Glu 1 Vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ser Tyr Trp ile GlU 35 Trp Val Glu Trp lie Gly Glu 50 Ile Leu Asn Glu Ile Phe Lys 65 Gly Arg Lys Asn Thr Ala Tyr 80 Leu Gin Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Thr Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Ser Gly Gly Thr Ala 140 Ala Leu Pro Glu Pro vai Thr 155 Val Ser Gly val His Thr Phe Π0 Pro Ala Ser Leu Ser Ser Val 185 Val Thr Gin Thr Tyr iie Cys 200 Asn vai Vai Asp Lys Lys val 215 Glu Pro Cys Pro Pro Cys PrO 230 Ala Pro Phe Leu Phe Pro Pro 245 Lys Pro Thr Pro Glu vai Thr 260 Cys Val Pro Glu Val Lys Phe 275 Asn Trp Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 10 15 Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 25 30 Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 40 45 Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 55 60 Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 70 75 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90 Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp 100 105 Val Thr val Ser Ser Cys Ser Thr 115 120 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 160 165 val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 175 180 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 190 195 Asn HÍS Lys Pro Ser Asn Thr Lys 205 210 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 220 225 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 235 240 Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg 250 255 val Val Asp Val ser His Glu Asp 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 280 235 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 2 95 300 290 490 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin ASp Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 3S0 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser ASp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410' 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 231 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> LC da Variante TioMAb-huMA79b.vl8-HC(A118C) <400> 231
Asp 1 ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ser Val Asp 30 Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Asn Trp Tyr 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Lys Ala Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Ala Ala 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Vai Pro Ser Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr Ile Ser 80 Ser Leu Gin Pro Glu 85 Asp Phe Ala Thr Tyr 90 491 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gin Gly 105 Thr Lys Vai Glu ile 110 Lys Arg Thr Val Ala 115 Ala Pro Ser Val Phe 120 Ile Phe Pro Pro Ser 125 ASp Glu Gin Leu Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 vai Vai Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Tyr Pro 145 Arg Glu Ala Lys Val 150 Gin Trp Lys Vai Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160 Gly Asn Ser Gin Glu 165 Ser Vai Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys His Lys Val 195 Tyr Ala Cys Glu Vai 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Val Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys
<210> 232 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HC da Variante TioMAb-huMA79b.ν28-HC(AI18C) <400> 232
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin PrO Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Trp Ile Glu 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Glu 50 ile Leu Pro Gly Gly 55 Gly Asp Thr Asn Tyr 60 Asn Glu ile Phe Lys 65 Gly Arg Ala Thr Phe 70 Ser Ala ASp Thr Ser 75 492 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met. 80
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg 95
Tyr Trp Giy Gin Gly Thr Leu vai 110
Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140
Pro Glu Pro va1 Thr vai Ser Trp 155
Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90
Arg vai Pro lie Arg Leu Asp 100: LOS
Thr Vai Ser Ser Cys Ser Thr 115 120
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 13 0. 135
Cys Lêu vai Lys Asp Tyr Phe 14:5 150
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 160 165:
Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai 170
Ser Leu Ser Sér Vai Vai Thr Vai ,185
Gin Thr Tyr 1 l.e Cys Asn Vai Asn 20C Vâl Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 21:5
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 230
Phe Leu Phe Pro Pró Lys Pro Lys 245
Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai :26d
Pro Glu Vai: Lys Phe Asn Trp: Tyr >27 5
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290
Arg Vai Vai Ser vai Leu Thr Vai 305
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 17'3; 180
Pro. Ser Ser Ser Leu Giy Thr 190 195
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 205 210
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 220 * 225
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 235 240
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 250 255
Vai Asp Val Ser His Glu Asp 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His 280 285
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 295 300 Léu: His Gin Asp Trp Leu Asn 310 315 493 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro iie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 335 340 34 5 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 37 5 Asp iie Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 380 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu HiS Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 233 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> LC da Variante TioMAb-huMA79b.v28-HC(A118C) <400> 233
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 494 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ lie Phe Pro Pro Ser 125 Asp GlU Gin Leu Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Val Val Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Tyr Pro 145 Arg Glu Ala Lys Val 150 Gin Trp Lys val Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160 Gly Asn Ser Gin Glu 165 Ser Val Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys HiS Lys Val 195 Tyr Ala Cys GlU vai 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Val Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys
<210> 234 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HC da Variante TioMAb-chMA79b-LC(V205C) <400> 234
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Ile Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Val Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 110 115 120 495 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Lys Gly Pro Ser Val 125 Ser Gly Gly Thr Ala 140 Pro Glu Pro val Thr 155 Gly vai His Thr Phe 170 Ser Leu Ser Ser val 185 Gin Thr Tyr He Cys 200 Vai Asp Lys Lys Val 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Phe Leu Phe Pro Pro 245 Thr Pro Glu Val Thr 260 Pro GlU Vai Lys Phe 275 Asn Ala Lys Thr Lys 290 Arg Vai Vai Ser Val 305 Gly Lys Glu Tyr Lys 320 Pro Ile Glu Lys Thr 335 Pro Gin Vai Tyr Thr 350 Asn Gin Vai Ser Leu 365
Phe Pro Leu Ala Pro 130 Ala Leu Gly Cys Leu 145 vai Ser Trp Asn Ser 160 Pro Ala Val Leu Gin 175 Val Thr val Pro Ser 190 Asn Val Asn His Lys 205 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Lys Pro Lys Asp Thr 250 Cys Val Val val Asp 265 Asn Trp Tyr val Asp 280 Pro Arg Glu Glu Gin 295 Leu Thr Val Leu His 310 Cys Lys Val Ser Asn 325 Ile Ser Lys Ala Lys 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Thr Cys Leu val Lys 370
Ser Ser Lys Ser Thr 135 Val Lys Asp Tyr Phe 150 Gly Ala Leu Thr Ser 165 Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Ser Leu Gly Thr 195 Pro Ser Asn Thr Lys 210 ASp Lys Thr His Thr 225 Gly Gly Pro Ser Val 240 Leu Met Ile Ser Arg 255 Val Ser His Glu Asp 270 Gly val Glu Val His 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 Gin Asp Trp Leu Asn 315 Lys Ala Leu Pro Ala 330 Gly Gin Pro Arg Glu 345 Glu Glu Met Thr Lys 360 Gly Phe Tyr Pro Ser 375 496 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 380 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn HiS 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 235 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC da Variante TioMAb-chMA79b-LC(V205C) <400> 235
Asp ile val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Gin Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly 95 100 105 Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 ile Phe Pro Pro Ser ASp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 vai val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 497 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Gin Trp Lys vai Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160 Gly Asn Ser Gin Glu 165 Ser Vai Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys His Lys Vai 195 Tyr Ala Cys Glu Vai 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Cys Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys
<210> 236 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HC da Variante TioMAb-chMA79b-HC(A118C) <400> 236
Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lyg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp vai Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu lie Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Vai Pro Val Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser Cys Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 498 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Gly val HiS Thr Phe 170 Ser Leu Ser Ser Val 185 Gin Thr Tyr Ile Cys 200 Vai Asp Lys Lys Val 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Phe Leu Phe Pro Pro 245 Thr Pro Glu Val Thr 260 Pro Glu Val Lys Phe 275 Asn Ala Lys Thr Lys 290 Arg vai Val Ser Val 305 Gly Lys Glu Tyr Lys 320 Pro Ile Glu Lys Thr 335 Pro Gin Val Tyr Thr 350 Asn Gin val Ser Leu 365 Asp Ile Ala Val Glu 380 Tyr Lys Thr Thr Pro 395 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Asn Val Phe Ser Cys 425
Pro Ala vai Leu Gin 175 Val Thr Val Pro Ser 190 Asn Val Asn HiS Lys 205 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Lys Pro Lys Asp Thr 250 Cys Val Val Val Asp 255 Asn Trp Tyr Val Asp 280 Pro Arg Glu Glu Gin 295 Leu Thr vai Leu His 310 Cys Lys val Ser Asn 325 Ile Ser Lys Ala Lys 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Thr Cys Leu Val Lys 370 Trp Glu Ser Asn Gly 385 Pro Val Leu ASp Ser 400 Thr val Asp Lys Ser 415 Ser val Met HiS Glu 430
Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Ser Leu Gly Thr 195 Pro Ser Asn Thr Lys 210 Asp Lys Thr His Thr 225 Gly Gly Pro Ser Val 240 Leu Met Ile Ser Arg 255 val Ser His Glu Asp 270 Gly Val Glu Val His 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 Gin Asp Trp Leu Asn 315 Lys Ala Leu Pro Ala 330 Gly Gin Pro Arg Glu 345 Glu Glu Met Thr Lys 360 Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Gin Pro Glu Asn Asn 390 Asp Gly Ser Phe Phe 405 Arg Trp Gin Gin Gly 420 Ala Leu His Asn His 435
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 499 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 237 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC da Variante TioMAb-chMA79b-HC(AI18C) <400> 237
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Asp Gly ASp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Gin Pro Pro Lys Leu Phe ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly ne Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Asn Ile HÍ3 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly 95 100 105 Thr Glu Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Vai val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 1 90 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 238 <211> 893 <212> ADN <213> Macaca fascicularis 500 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 238 tcatggtgat ggtgatgatg accggtacgc gtagaatcga gaccgaggag 50 agggttaggg ataggcttac cttcgaaccg cgggccctct agactcgagc 100 ggccgccact gtgctggata tctgcagaat tgcccttggg gacagagcag 150 tgaccatggc caggctggcg ttgtctcctg tgtccagcca ctggctggtg 200 gcgttgctgc tgctgctctc agcagctgag ccagtgccag cagccaaatc 250 agaggacctg tacccgaatc ccaaaggtag tgcttgttct cggatctggc 300 agagcccacg tttcatagcc aggaaacggg gcttcacggt gaaaatgcac 350 tgctacgtga ccaacagcac cttcagcatc gtgagctggc tccggaagcg 400 ggagacggac aaggagcccc aacaggtgaa cctggagcag ggccacatgc 450 atcagaccca aaacagctct gtcaccaccc tcatcatcca agacatccgg 500 tttgaggaca acggcatcta cttctgtcag caggagtgca gcaagacctc 550 ggaggtctac cggggctgcg gcacggagct gcgagtcatg gggttcagca 600 ccttggcaca gctgaagcag aggaacacgc tgaaggatgg catcatcatg 650 atccagacgc tgctgatcat cctcttcatc atcgtgccca tcttcctgct 700 gctggacaag gatgacagca aggccggcat ggaggaagat cacacctacg 750 agggcctgga cattgaccag acggccacct acgaggacat agtgacgctg 800 cggacagggg aagtgaagtg gtctgtgggt gagcacccag gtcaggagtg 850 agagccagga cctccccacg gcctgggtgc aggctcccca gcc 893
<210> 239 <211> 231 <212> PRT <213> Macaca fascicularis ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 239
Met 1 Ala Arg Leu Ala 5 Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu 20 Leu Ser Lys Ser Glu Asp Leu 35 Tyr Pro Arg ile Trp Gin Ser 50 Pro Arg Thr Val Lys Met His 65 Cys Tyr vai Ser Trp Leu Arg 80 Lys Arg Val Asn Leu Glu Gin 95 Gly His Vai Thr Thr Leu rie 110 Ile Gin I le Tyr Phe Cys Gin 125 Gin Glu Arg Gly Cys Gly Thr 140 Glu Leu Ala Gin Leu Lys Gin 155 Arg Asn Ile Gin Thr Leu Leu 170 Ile Ile Leu Leu Leu Asp Lys 185 Asp Asp His Thr Tyr Glu Gly 200 Leu Asp ASp ile Val Thr Leu 215 Arg Thr Glu His Pro Gly Gin 230 Glu
Pro val Ser Ser His Trp Leu Val 10 15 Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala 25 30 Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 40 45 Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe 55 60 Val Thr Asn Ser Thr Phe Ser Ile 70 75 Glu Thr ASp Lys Glu Pro Gin Gin 85 90 Met His Gin Thr Gin Asn Ser Ser 100 105 Asp Ile Arg Phe Glu ASp Asn Gly 115 120 Cys Ser Lys Thr Ser Glu Val Tyr 130 135 Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu 145 150 Thr Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met 160 165 Leu Phe Ile lie Val Pro Ile Phe 175 180 Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 190 195 Ile Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu 205 210 Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly 220 225
<210> 240 <211> 800 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC de anti-cynoCD79b (chIODIO) Quimérico 502 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 240 acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc 50 tttttctagt agcaactgca actggagtac attcagatat cgtgctgacc 100 caatctccac cctctttggc tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatatc 150 ctgcagagcc agtgaaagtg ttgatagtta tggcaaaact tttatgcact 200 ggcaccagca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctatcgtgta 250 tccaacctag aatctgggat ccctgccagg ttcagtggca gtgggtcaag 300 gacagacttc accctcacca ttaatcctgt ggaggctgat gatgttgcaa 350 cctattactg tcagcaaagt aatgaggatc cgttcacgtt cggtggaggc 400 accaagctgg aaatcaaacg gaccgtggct gcaccatctg tcttcatctt 450 cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc 500 tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 550 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 600 caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 650 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 700 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aagcttggcc 750 gccatggccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 800
<210> 241 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC de anti-cynoCD79b (chIODIO) Quimérico <400> 241
Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Vai Ser Leu 15 10 15
Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Asp 20 25 30
Ser Tyr Gly Lys Thr Phe Met His Trp His Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45
Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Vai Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe 65 70 75 503 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Thr Leu Thr ile Asn Pro val Glu Ala ASp Asp Val Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly 95 100 105 Thr Lys Leu Glu ile Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai 140 145 150 Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys HÍS Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Vai Thr HÍS Gin Gly Leu Ser Ser Pro val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 242 <211> 1500 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC de anti-cyno CD79b (chIODIO) Quimérico <400> 242 cacctcggtt ctatcgattg aattccacca tgggatggtc atgtatcatc 50 ctttttctag tagcaactgc aaotggagta cattcagaag ttcagctgca 100 ggagtcggga cctggcctgg tgaaaccttc tcagtctctg tccctcacct 150 gcactgtcac tggctactca atcaccagtg attatgcctg gaactggatc 200 cggcagtttc caggaaacaa actggagtgg atgggcaaca tatggtacag 250 tggtagcact acctacaacc catctctcaa aagtcgaatc tctatcactc 300 gagacacatc caagaaccag ttcttcctgc agttgaattc tgtgacttct 350 gaggacacag ccacatatta ctgttcaaga atggacttct ggggtcaagg 400 caccactctc acagtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc 450 ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 500 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc 550 504 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct 600 caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ctgtgccctc tagcagcttg 650 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa 700 ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc 750 caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 800 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac 850 atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact 900 ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 950 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 1000 ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1050 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1100 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa 1150 gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 1200 tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1250 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 1300 caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 1350 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1400 tctccgggta aatgagtgcg acggccctag agtcgacctg cagaagcttg 1450 gccgccatgg cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 1500
<210> 243 <211> 441 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC de anti-cynoCD79b (chIODIO) Quimérico 505 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 243
Glu 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin •Ser Leu Ser Leu 20 Ser Asp Tyr Ala Trp 35 Leu Glu Trp Met Gly 50 Asn Pro Ser Leu Lys 65 Lys Asn Gin Phe Phe 80 Thr Ala Thr Tyr Tyr 95 Thr Thr Leu Thr Val 110 Phe Pro Leu Ala Pro 125 Ala Leu Gly Cys Leu 14 0 Val Ser Trp Asn Ser 155 Pro Ala Val Leu Gin 170 Val Thr Val Pro Ser 185 Asn Val Asn His Lys 200 Glu Pro Lys Ser Cys 215 Ala Pro Glu Leu Leu 230 Lys Pro Lys Asp Thr 2 4 5 Cys Val Val Val ASP 260 Asn Trp Tyr Val Asp 275
Glu Ser Gly Pro Gly 10 Thr Cys Thr val Thr 25 Asn Trp Ile Arg Gin 40 Asn He Trp Tyr Ser 55 Ser Arg Ile Ser ile 70 Leu Gin Leu Asn Ser 85 Cys Ser Arg Met Asp 100 Ser Ser Ala Ser Thr 115 Ser Ser Lys Ser Thr 130 Val Lys Asp Tyr Phe 145 Gly Ala Leu Thr Ser 160 Ser Ser Gly Leu Tyr 175 Ser Ser Leu Gly Thr 190 Pro Ser Asn Thr Lys 205 Asp Lys Thr His Thr 220 Gly Gly Pro Ser Val 235 Leu Met Ile Ser Arg 250 Val Ser His Glu Asp 265 Gly Val Glu Val His 280
Leu vai Lys Pro Ser 15 Gly Tyr Ser Ile Thr 30 Phe Pro Gly Asn Lys 45 Gly Ser Thr Thr Tyr 60 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Val Thr Ser Glu Asp 90 Phe Trp Gly Gin Gly 105 Lys Gly Pro Ser Val 120 Ser Gly Gly Thr Ala 135 Pro Glu Pro Val Thr 150 Gly Val His Thr Phe 165 Ser Leu Ser Ser Val 180 Gin Thr Tyr lie Cys 195 Val Asp Lys Lys Val 210 Cys Pro Pro Cys Pro 225 Phe Leu Phe Pro Pro 240 Thr Pro Glu Val Thr 255 Pro Glu val Lys Phe 270 Asn Ala Lys Thr Lys 285 506 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val 290 295 300 Leu Thr val Leu HiS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 320 325 330 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 335 340 345 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 350 355 360 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu 365 370 375 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 380 385 390 Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 395 400 405 Thr Vai ASp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 410 415 420 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 425 430 435 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440
<210> 244 <211> 441 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> HC da Variante Tio-MAb-anti-cynoCD79b(chIODIO)-HC(A118C) <400> 244
Asp 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Gin Ser Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Thr 25 Gly Tyr Ser Ile Thr 30 Ser Asp Tyr Ala Trp 35 Asn Trp Ile Arg Gin 40 Phe Pro Gly Asn Lys 45 Leu Glu Trp Met Gly 50 Asn Ile Trp Tyr Ser 55 Gly Ser Thr Thr Tyr 60 Asn Pro Ser Leu Lys 65 Ser Arg Ile Ser Ile 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 507 ΕΡ 2 176 296/PT Lys Asn Gin Phe Phe 80 Thr Ala Thr Tyr Tyr 95 Thr Thr Leu Thr Val 110 Phe Pro Leu Ala Pro 125 Ala Leu Gly Cys Leu 140 Val Ser Trp Asn Ser 155 Pro Ala Val Leu Gin 170 val Thr Val Pro Ser 185 Asn Val Asn HÍS Lys 2 00 Glu Pro Lys Ser Cys 215 Ala Pro Glu Leu Leu 230 Lys Pro Lys Asp Thr 245 Cys val Val Val Asp 260 Asn Trp Tyr val ASp 275 Pro Arg Glu Glu Gin 290 Leu Thr vai Leu His 305 Cys Ly3 Val Ser Asn 320 Ile Ser Lys Ala Lys 335
Leu Gin Leu Asn Ser 85 Cys Ser Arg Met Asp 100 Ser Ser Cys Ser Thr 115 Ser Ser Lys Ser Thr 130 Val Lys Asp Tyr Phe 145 Gly Ala Leu Thr Ser 160 Ser Ser Gly Leu Tyr 175 Ser Ser Leu Gly Thr 190
Pro Ser Asn Thr Lys 205 Asp Lys Thr His Thr 220 Gly Gly Pro Ser Val 235 Leu Met Ile Ser Arg 250 val Ser His Glu Asp 265 Gly Val Glu vai His 280 Tyr Asn Ser Thr Tyr 2 95 Gin Asp Trp Leu Asn 310 Lys Ala Leu Pro Ala 325 Gly Gin Pro Arg Glu 340
Val Thr Ser Glu Asp 90 Phe Trp Gly Gin Gly 105 Lys Gly Pro Ser Val 120 Ser Gly Gly Thr Ala 135 Pro Glu Pro Val Thr 150 Gly val His Thr Phe 165 Ser Leu Ser Ser val 180 Gin Thr Tyr Ile Cys 195 val Asp Lys Lys vai 210 Cys Pro Pro Cys Pro 225 Phe Leu Phe Pro Pro 240 Thr Pro Glu vai Thr 255 Pro Glu Val Lys Pha 270 Asn Ala Lys Thr Lys 285 Arg Val Val Ser val 300 Gly Lys Glu Tyr Lys 315 Pro Ile Glu Lys Thr 330 Pro Gin Val Tyr Thr 345 508 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Leu Pro Pro Ser Arg 350 Glu Glu Met Thr Lys 355 Asn Gin Vai Ser Leu 360 Thr Cys Leu Vai Lys 365 Gly Phe Tyr Pro Ser 370 Asp lie Ala Vai Glu 375 Trp Glu Ser Asn Gly 380 Gin Pro Glu Asn Asn 385 Tyr Lys Thr Thr Pro 390 Pro Vai Leu Asp Ser 395 Asp Gly Ser Phe Phe 400 Leu Tyr Ser Lys Leu 405 Thr Vai Asp Lys Ser 410 Arg Trp Gin Gin Gly 415 Asn Vai Phe Ser Cys 420 Ser vai Met His Glu 425 Ala Leu His Asn His 430 Tyr Thr Gin Lys Ser 435 Leu Ser Leu Ser Pro 440 Gly
<210> 245 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> LC da Variante Tio-MAb-anti-cynoCD79b(chl0D10)-HC(A118C) <400> 245
Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Vai Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Asp 20 25 30 Ser Tyr Gly Lys Thr Phe Met His Trp His Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Arg Vai Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr ile Asn Pro Vai Glu Ala Asp Asp Vai Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly 95 100 105 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 110 115 120 509 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 14 0 145 150 Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu Lys HiS Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 246 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido de ligação a albumina <400> 246
Cys 1 ASp Lys Thr HiS 5 Thr Gly Gly Gly Ser 10 Gin Arg Leu Met Glu 15 Asp Ile Cys Leu Pro 20 Arg Trp Gly Cys Leu 25 Trp Glu Asp Asp Phe 30
<210> 247 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido de ligação a albumina <400> 247
Gin Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 15 10 15
Trp Glu Asp Asp Phe 20
<210> 248 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência artificial 510 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Péptido de ligação a albumina <400> 248
Gin Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 15 10 15
Trp Glu Asp Asp Phe 20
<210> 249 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido de ligação a albumina <400> 249
Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15
Glu Asp Asp
<210> 250 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido de ligação a albumina <400> 250
Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 5 10
<210> 251 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 251
Glu Vai Gin Leu Cys Glu Ser Gly Gly Gly 5 10
<210> 252 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial 511 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 252
Leu Arg Leu Ser Cys Cys Ala Ser Gly Tyr Thr 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 253 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 253
Met Asn Ser Leu Arg Cys Glu Asp Thr Ala Vai 5 10 <210> <211 > 254 11 <212 > <213 > PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 254
Thr Leu Vai Thr Vai Cys Ser Ala Ser Thr Lys 5 10 <210> <211> <212 > <213 > 255 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 255
Vai Thr Vai Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 256 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 256
Vai Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser vai 5 10 512
ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 257 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 257
Trp Tyr Vai Asp Gly Cys Glu Vai His Asn Ala 5 10
<210> 258 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-huMA79b <400> 258
Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Vai Glu 5 10
<210> 259 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 259
Pro Pro Vai Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe 5 10
<210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 260
Glu Vai Gin Leu Cys Gin Ser Gly Ala Glu 5 10
<210> 261 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial 513 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 261
Vai Lys Ile Ser Cys Cys Ala Thr Gly Tyr Thr 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 262 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 262
Leu Ser Ser Leu Thr Cys Glu Asp Ser Ala Vai 5 10 <210> <211 > 263 11 <212 > <213 > PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 263
Thr Ser Vai Thr Vai Cvs Ser Ala Ser Thr Lys S 10 <210> <211> <212 > <213 > 264 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 264
Vai Thr Vai Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 265 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 265
Vai Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Vai 5 10 514 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> <211 > <212 > <213 > 266 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 266
Trp Tyr Vai Asp Gly Cys Glu Vai His Asn Ala 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 267 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 267
Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Vai Glu 5 10 <210> <211> <212 > <213 > 268 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-chMA79b <400> 268
Pro Pro Vai Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 269 10 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 269
Glu Vai Gin Leu Cys Glu Ser Gly Pro Gly 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 270 11 PRT Sequência artificial 515 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 270
Leu Ser Leu Thr Cys Cys Vai Thr Gly Tyr Ser 5 10
<210> 271 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 271
Leu Asn Ser Vai Thr Cys Glu Asp Thr Ala Thr 5 10
<210> 272 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 272
Thr Thr Leu Thr Vai Cys Ser Ala Ser Thr Lys 5 10
<210> 273 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 273
Leu Thr Vai Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro 5 10
<210> 274 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 274
Vai Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Vai 5 10 516 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> <211> <212> <213> 275 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio-anti-cynoCD79b (chIODIO) <400> 275
Trp Tyr Vai Asp Gly Cys Glu Vai His Asn Ala
Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Vai Glu 5 10 <210> <211> <212> <213> 277 11 PRT Sequência artificial <220> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 277
Pro Pro Vai Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe 5 10 <210> <211> <212> <213> 278 11 PRT Sequência artificial <220> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 278
Ser Leu Ser Ala Ser Cys Gly Asp Arg Vai Thr 5 10 <210> <211> <212> <213> 279 11 PRT Sequência artificial 5 10 <210> <211 > <212> <213> 276 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 276 <220> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b 517 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 279
Glu Ile Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Vai 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 280 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 280
Thr val Ala Ala Pro Cys vai Phe ile Phe Pro 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 281 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 281
Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gin Leu Lys 5 10 <210> <211 > <212 > <213> 282 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 282
Asp Glu Gin Leu Lys Cys Gly Thr Ala Ser Val 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 283 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 283 val Thr Glu Gin Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 5 10 518 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> <211 > <212 > <213 > 284 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-huMA79b <400> 284
Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 5 10 <210> <211 > 285 11 <212> <213 > PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 285
Ser Leu Ala vai Ser Cys Gly Gin Arg Ala Thr 5 10 <210> <211> <212 > <213> 286 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 286
Glu Leu Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Vai 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 287 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 287
Thr vai Ala Ala Pro Cys Vai Phe Ile Phe Pro 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 288 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b 519 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 288
Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gin Leu Lys 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 289 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 289
Asp Glu Gin Leu Lys Cys Gly Thr Ala Ser Vai 5 10 <210> <211> <212 > <213> 290 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 290
Vai Thr Glu Gin Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 5 10 <210> <211 > <212 > <213 > 291 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de LC de Tio-chMA79b <400> 291
Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 5 10 <210> <211 > <212> <213 > 292 11 PRT Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 292
Ser Leu Ala Vai Ser Cys Gly Gin Arg Ala Thr 5 10 520 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <210> 293 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 293 Glu ile Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Vai 5 10 <210> 294 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 294 Thr Vai Ala Ala Pro Cys vai Phe Ile Phe Pro 5 10 <210> 295 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 295
Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gin Leu Lys 5 10
<210> 296 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) <400> 296
Asp Glu Gin Leu Lys Cys Gly Thr Ala Ser Vai 5 10
<210> 297 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chIODIO) 521 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 297
Vai Ihr Glu Gin Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 5 10
<210> 298 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de HC de Tio anti-cynoCD79b(chlODlO) <400> 298
Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 5 10
<210> 299 <211> 441 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HC da Variante Tio anti-cynoCD79b-LC(V205C) <400> 299
Asp 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Gin Ser Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Thr 25 Gly Tyr Ser Ile Thr 30 Ser Asp Tyr Ala Trp 35 Asn Trp Ile Arg Gin 40 Phe Pro Gly Asn Lys 45 Leu Glu Trp Met Gly 50 Asn ile Trp Tyr Ser 55 Gly Ser Thr Thr Tyr 60 Asn Pro Ser Leu Lys 65 Ser Arg Ile Ser Ile 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Lys Asn Gin Phe Phe 80 Leu Gin Leu Asn Ser 85 Val Thr Ser Glu Asp 90 Thr Ala Thr Tyr Tyr 95 Cys Ser Arg Met ASp 100 Phe Trp Gly Gin Gly 105 Thr Thr Leu Thr Val 110 Ser Ser Ala Ser Thr 115 Lys Gly Pro Ser Val 120 Phe Pro Leu Ala Pro 125 Ser Ser Lys Ser Thr 130 Ser Gly Gly Thr Ala 135 Ala Leu Gly Cys Leu 14 0 Val Lys Asp Tyr Phe 145 Pro Glu Pro Val Thr 150 522 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 155 160 165 :Pro Ala vai Leu Gin Ser Ser Gly Léu tyr Ser Leu Ser Ser val 170 175 180 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Léu Gly Thr Gin Thr Tyr Tle Cys 185 190 195 Asxv Vai Asn HÍS Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val ASp Lys Lys Val 200 205 210 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys PrO Pro Cys Pró 215 220 225 Ala Pro Glu Léu Leu Gly G X y Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met I le Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 25:5 Cys Vai Vai Vâl Asp Val ;S©:r His Glu Asp Pro Glu vai LyS: Phe 2 50 265 27 0' Asn trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Vai HiS Asn Ala Lys Thr: Ly:'S: 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Val Ser val 2 90: 295 300 T.CU Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 320 325 330 ile Ser LVS Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr 335 340 345 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Glri Val Ser Leu 350 355 360 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile Ala Vai Glu 365 370 375 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 380 385 390 Pro Vai Leu Asp Ser ASP Gly: Ser Phe ph© Leu Tyr Ser Lys Leu 395 400 40 5 Xhr vai Asp Lys Ser Arg Trp: Gin Gin Gly Ásin vál Phe Ser Cys 410 415 420 Ser vai Met His G1 u Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 425 430 435' Léu Ser Leu Ser Pro 61 y 440 523 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 300 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> LC da Variante Tio anti-cynoCD79b(chIODIO)-LC(V205C) <400> 300
Asp 1 ile Vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Pro Ser 10 Leu Ala Vai Ser Leu 15 Gly Gin Arg Ala Thr 20 Ile Ser Cys Arg Ala 25 Ser Glu Ser Vai Asp 30 Ser Tyr Gly Lys Thr 35 Phe Met His Trp His 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Gin Pro Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Arg Vai 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Ile Pro Ala Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Arg Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr ile Asn 80 Pro vai Glu Ala Asp 85 Asp Vai Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Pro Phe 100 Thr Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Leu Glu Ile 110 Lys Arg Thr vai Ala 115 Ala Pro Ser Vai Phe 120 Ile Phe Pro Pro Ser 125 ASp Glu Gin Leu Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Vai Vai Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Tyr Pro 145 Arg Glu Ala Lys vai 150 Gin Trp Lys Vai Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160 Gly Asn Ser Gin Glu 165 Ser Vai Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys His Lys Vai 195 Tyr Ala Cys Glu Vai 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Cys Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys
<210> 301 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial 524 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Variável de HC de anti-cynoCD79b (chIODIO) <400> 301
Glu Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys 35 40 45 Leu Glu Trp Met Gly Asn ile Trp Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Gin Phe Phe Leu Gin Leu Asn Ser val Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Arg Met Asp Phe Trp Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 110
<210> 302 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Variável de LC de anti-cynoCD79b (chIODIO) <400> 302
Asp 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Pro Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly Gin Arg Ala Thr 20 Ile Ser Cys Arg Ala 25 Ser Glu Ser Val Asp 30 Ser Tyr Gly Lys Thr 35 Phe Met His Trp His 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Gin Pro Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Arg Val 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Ile Pro Ala Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Arg Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr Ile Asn 80 Pro Val Glu Ala Asp 85 Asp Val Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Pro Phe 100 Thr Phe Gly Gly Gly 105
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 110 525 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
<210> 303 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 7 <223> Cadeia Leve de huMA79bv. <400> 303
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Tyr Asp Gly Asp Ser 35 Phe Leu Asn Lys Ala Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg 65 Phe Ser Gly Thr Leu Thr Ile Ser B0 Ser Leu Gin Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Asn Glu Asp Thr Lys Val Glu lie 110 Lys Arg Thr Ile Phe Pro Pro Ser 125 Asp Glu Gin Val val Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Gin Trp Lys Val Asp 155 Asn Ala Leu Ser Val Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Tyr Ala Cys Glu Val 200 Thr HiS Gin Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 10 15 Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 25 30 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 70 75 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 85 90 Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 100 105 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 160 165 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 175 180 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 190 195 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 205 210
<210> 304 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial 526 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <22 0> <223> Cadeia Pesada de huMA79bv.17 <400> 304 Cia Vai Gin 1 Lsu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Se r Cys Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 $«r Tyr Trp Ile Glu 35 Trp Vai Ar çt Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glv Trp lie Gly Glu 50 He Leu Pro Qiy Gly 55 Gly Asp Thr Asn Tyr 6.0 Asn Glu lie Phe Lys 65 Gly Arg Ala Thr Phe 70 Ser Ala Asp Thr Ser 75 Lys Asa Thr Ala Tyr· 80 Leu Gin S4et Asn Ser 85 Leu Arg Ala Slú Asp 90 Thr Alá: Vai Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Arg Vai 130 Pro vai Tyr phe Asp 105 Tyr Trp Gly Gin Gly lio·: Thr: Leu vai Thr Vai 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro; Ser vai 125 phe Prõ Leu Ala Pro 130 Ser Ser Lys Ser Thr 135 Ser Gly Gly Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys Leu 145 vai Lys Asp Tyr Phe 150 Pro 61« Pro vai Thr 155 vai Ser Trp Asn Ser ISO Gly Ala Leu Thr Ser 163 Gly vai His Thr Phe i?0 Pro Ala vai Leu Gin 173 Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser leu Ser Ser 'Vai 185 Vai Thr Vai Pro Ser 1-90 Ser Ser Leu Gly Thr 135 Gl n Thr Tyr Tle CVS 200 Asn Vai Asn His Lys 205 Pro Ser Asn Thr Lys ,210 vai Asp Lys Lys Vai 215 Glu Pro Lys Ser Cys 2 20 Asp :LyS: Thr HiS Thr 2 25 Cys; Pro P ro Cys Pro 230 Ala pro Glu Leu Lau 235 Gly Gly Pro Ser VSl 240 Phe Lee Phe Pró· Pro 2:45 'Lys Pro Lys Asp Thr 230 Leu Met lie Ser Arg 255: Thr Pro Glu val Thr 260 Cys Vai Vai Vai Asp 265 Vai Ser His GlU Asp 270 527 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Pro Glu Vai Lys Phe 275 Asn Trp Tyr Val Asp 280 Gly Val Glu Val His 285 Asn Ala Lys Thr Lys 290 Pro Arg Glu Glu Gin 295 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys 320 Cys Lys Val Ser Asn 325 Lys Ala Leu Pro Ala 330 PrO Ile Glu Lys Thr 335 ile Ser Lys Ala Lys 340 Gly Gin Pro Arg Glu 345 Pro Gin Vai Tyr Thr 350 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Glu Glu Met Thr Lys 360 Asn Gin Vai Ser Leu 365 Thr Cys Leu val Lys 370 Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Asp Ile Ala Vai Glu 380 Trp Glu Ser Asn Gly 385 Gin Pro Glu Asn Asn 390 Tyr Lys Thr Thr Pro 395 Pro val Leu Asp Ser 400 Asp Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr Vai Asp Lys Ser 415 Arg Trp Gin Gin Gly 420 Asn Vai Phe Ser Cys 425 Ser Val Met His Glu 430 Ala Leu His Asn HiS 435 Tyr Thr Gin Lys Ser 440 Leu Ser Leu Ser Pro 445 Gly
<210> 305 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Leve de huMA79bv,18 528 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 305 ASp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 61 y Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Asp Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Fro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hls Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 306 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Pesada de huMA79bv.l8 529 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ <400> 306
Glu 1 Vai Gin Leu Val 5 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Tyr Trp Ile Glu 35 Glu Trp iie Gly Glu 50 As η Glu Ile Phe Lys 65 Lys Asn Thr Ala Tyr 80 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Lya Gly Pro Ser Val 125 ser Gly Gly Thr Ala 140 Pro Glu Pro val Thr 155 Gly Vai His Thr Phe 170 Ser Leu Ser Ser Val 185 Gin Thr Tyr Ile Cys 200 Vai Asp Lys Lys Val 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Phe Leu Phe Pro Pro 245 Thr Pro Glu Val Thr 260 Pro Glu vai Lys Phe 275 Asn Ala Lys Thr LyS 290
Glu Ser Gly Gly Gly 10 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Trp Val Arg Gin Ala 40 ile Leu Pro Gly Gly 55 Gly Arg Ala Thr Phe 70 Leu Gin Met Asn Ser 85 Cys Thr Arg Arg vai 100 Thr Leu Val Thr Val 115 Phe Pro Leu Ala Pro 130 Ala Leu Gly Cys Leu 145 val Ser Trp Asn Ser 160 Pro Ala Val Leu Gin 175 Val Thr Val Pro Ser 190 Asn Val Asn His Lys 205 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Lys Pro Lys Asp Thr 250 Cys Val Val Val Asp 265 Asn Trp Tyr Val Asp 280 Pro Arg Glu Glu Gin 295
Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Gly Asp Thr Asn Tyr 60 Ser Ala Asp Thr Ser 75 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Pro Ile Arg Leu Asp 105 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Ser Ser Lys Ser Thr 135 Val Lys Asp Tyr Phe 150 Gly Ala Leu Thr Ser 165 Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Ser Leu Gly Thr 195 Pro Ser Asn Thr Lys 210 Asp Lys Thr His Thr 225 Gly Gly Pro Ser Val 240 Leu Met lie Ser Arg 255 Val Ser His Glu Asp 270 Gly Val Glu Vai His 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 530 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Val Leu His Gin ASP Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin PrO Glu Asn Asn 380 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 410 415 420 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445
<210> 307 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Leve de huMA79bv.28 <400> 307
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Glu Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 531 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai 140 145 150 Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly GlU Cys 215
<210> 308 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cadeia Pesada de huMA79bv.28 <400> 308
Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Trp Ile Glu 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Glu 50 ile Leu Pro Gly Gly 55 Gly Asp Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Ile Phe Lys 65 Gly Arg Ala Thr Phe 70 Ser Ala Asp Thr Ser 75 Lys Asn Thr Ala Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu ASp 90 Thr Ala vai Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Arg vai 100 Pro Ile Arg Leu Asp 105 Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Vai Thr vai 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 532 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Lys Gly Pro Ser Vai 125 Ser Gly Gly Thr Ala 140 Pro Glu Pro Vai Thr 155 Gly Vai His Thr Phe 170 Ser Leu Ser Ser Vai 185 Gin Thr Tyr Ile Cys 200 Vai Asp Lys Lys Vai 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Phe Leu Phe Pro Pro 245 Thr Pro Glu Vai Thr 2 60 Pro Glu Vai Lys Phe 275 Asn Ala Lys Thr LyS 290 Arg Vai Vai Ser Vai 305 Gly Lys Glu Tyr Lys 320 Pro Ile Glu Lys Thr 335 Pro Gin Vai Tyr Thr 350 Asn Gin Vai Ser Leu 365 Asp Ile Ala Vai Glu 380 Tyr Lys Thr Thr Pro 395
Phe Pro Leu Ala Pro 130 Ala Leu Gly Cys Leu 145 Vai Ser Trp Asn Ser 160 Pro Ala Vai Leu Gin 175 Vai Thr Vai Pro Ser 190 Asn vai Asn His Lys 205 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Lys Pro Lys Asp Thr 250 Cys Vai Vai Vai Asp 2 65 Asn Trp Tyr Vai Asp 280 Pro Arg Glu Glu Gin 295 Leu Thr Vai Leu His 310 Cys Lys Vai Ser Asn 325 ile Ser Lys Ala Lys 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Thr Cys Leu Vai Lys 370 α ^>4 H Glu Ser Asn Gly 385 Pro Vai Leu Asp Ser 400
Ser Ser Lys Ser Thr 135 Vai Lys Asp Tyr Phe 150 Gly Ala Leu Thr Ser 165 Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Ser Leu Gly Thr 195 Pro Ser Asn Thr Lys 210 Asp Lys Thr His Thr 225 Gly Gly Pro Ser Vai 240 Leu Met lie Ser Arg 255 Vai Ser His Glu Asp 270 Gly Vai Glu Vai His 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 Gin Asp Trp Leu Asn 315 Lys Ala Leu Pro Ala 330 Gly Gin Pro Arg Glu 345 Glu Glu Met Thr Lys 360 Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Gin Pro Glu Asn Asn 390 Asp Gly Ser Phe Phe 405 533 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr Vai Asp Lys Ser 415 Arg Trp Gin Gin Gly 420 Asn Vai Phe Ser Cys 425 Ser Vai Met His Glu 430 Ala Leu His Asn His 435 Tyr Thr Gin Lys Ser 440 Leu Ser Leu Ser Pro 445 Gly <210> 309 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia Leve de huMA79bv.32 <400> 309
Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp 20 25 30 Tyr Ser Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105 Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai 140 145 150 Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 155 160 165 Ser vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 534 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Ser Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 GlU Lys His Lys Vai 195 Tyr Ala Cys Glu Vai 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Vai Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly Glu Cys <210> 310 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Cadeia Pesada de huMA79bv.32 <400> 310
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Ile Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Vai Pro ile Arg Leu ASP 95 100 105 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 185 190 195 535 ΕΡ 2 176 296/ΡΤ
Gin Thr Tyr Ile Cys 200 Vai Asp Lys Lys Vai 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Phe Leu Phe Pro Pro 245 Thr Pro Glu Vai Thr 260 Pro Glu Vai Lys Phe 275 Asn Ala Lys Thr Lys 290 Arg Vai Vai Ser Vai 305 Gly Lys Glu Tyr Lys 320 Pro Ile Glu Lys Thr 335 Pro Gin Vai Tyr Thr 350 Asn Gin Vai Ser Leu 365 Asp lie Ala Vai Glu 380 Tyr Lys Thr Thr Pro 395 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Asn Vai Phe Ser Cys 425 Tyr Thr Gin Lys Ser 440
Asn vai Asn His Lys 205 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Lys Pro Lys Asp Thr 250 Cys Vai vai Vai Asp 265 Asn Trp Tyr Val Asp 280 Pro Arg Glu Glu Gin 295 Leu Thr Vai Leu His 310 Cys Lys Vai Ser Asn 325 ile Ser Lys Ala Lys 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Thr Cys Leu vai Lys 370 Trp Glu Ser Asn Gly 385 Pro Vai Leu Asp Ser 400 Thr vai Asp Lys Ser 415 Ser Vai Met His Glu 430 Leu Ser Leu Ser Pro 445
Pro Ser Asn Thr Lys 210 Asp Lys Thr HiS Thr 225 Gly Gly Pro Ser Val 240 Leu Met ile Ser Arg 255 Val Ser His Glu Asp 270 Gly val Glu Val HÍS 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr 300 Gin Asp Trp Leu Asn 315 Lys Ala Leu Pro Ala 330 Gly Gin Pro Arg Glu 345 Glu Glu Met Thr Lys 360 Gly Phe Tyr Pro Ser 375 Gin Pro Glu Asn Asn 390 Asp Gly Ser Phe Phe 405 Arg Trp Gin Gin Gly 420 Ala Leu His Asn His 435
Gly
Lisboa, 2012-04-30

Claims (20)

  1. ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 1/8 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-CD79b compreendendo as seguintes sequências de HVR: (i) HVR-LI compreendendo a sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 194) (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 195) (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 196) (iv) HVR-Hl compreendendo a sequência D1-D10, em que D1-D100 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 202) (v) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E18, em que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 203) (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 204); em que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14, um anticorpo compreendendo os domínios variáveis de SEQ ID NO: 207 e SEQ ID NO: 208 ou um anticorpo compreendendo a sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 307 e a sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 308.
  2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, anticorpo esse que se liga a um epitopo dentro de uma região de CD79b desde o aminoácido 29-39 de SEQ ID NO: 2 ou aminoácido 1-11 de SEQ ID NO: 16.
  3. 3. Anticorpo da reivindicação 1, que é (i) um anticorpo monoclonal; (ii) um fragmento de anticorpo seleccionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2? e/ou (iii) um anticorpo quimérico ou humanizado, opcionalmente um anticorpo monovalente ou bivalente, opcionalmente compreendendo uma única região Fab ligada a uma região Fc.
  4. 4. Anticorpo humanizado da reivindicação 3 (iii) em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para CD79b humano é substancialmente a mesma ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior que a afinidade de um anticorpo de murídeo ou quimérico compreendendo uma sequência de cadeia ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 2/8 leve e de cadeia pesada tal como representada nas Figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e Figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) na sua forma bivalente, em que a afinidade de ligação é opcionalmente expressa como valor de Kd, e em que a afinidade de ligação é opcionalmente medida através de Biacore ou radioimunoensaio.
  5. 5. Anticorpo humanizado da reivindicação 3(iii) ou reivindicação 4 compreendendo a sequência estrutural de consenso da cadeia leve capa subgrupo I humana e/ou a sequência estrutural de consenso da cadeia pesada subgrupo III humana.
  6. 6. Anticorpo da reivindicação 5 em que: (i) a sequência estrutural da cadeia pesada compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78, opcionalmente V481, F67A, I69F, R71A, N73T e/ou L78A; e/ou (ii) a sequência estrutural da cadeia leve compreende uma substituição na posição 4 e/ou posição 47, opcionalmente M4L e/ou L47F; e/ou (iii) a sequência estrutural da cadeia leve compreende um ou mais de FR1-LC de SEQ ID NO: 190, FRI-LC de SEQ ID NO: 191, FR3-LC de SEQ ID NO: 193 e FR4-LC de SEQ ID NO: 194 e/ou a sequência estrutural da cadeia pesada compreende um ou mais de FR1-HC de SEQ ID NO: 198, FR2-HC de SEQ ID NO: 199, FR3-HC de SEQ ID NO: 200 e FR4-HC de SEQ ID NO: 201; e/ou (iv) o anticorpo compreende ainda a sequência de CLl, CHI e/ou Fc mostrada em SEQ ID NO: 197, 205 e/ou 206; e/ou (v) o anticorpo compreende (a) a sequência da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 307, e (b) a sequência da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 308.
  7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 que é produzido através do processo de: (a) cultura de uma célula expressando um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um domínio variável de cadeia leve de qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) isolamento do anticorpo a partir da referida célula em cultura. ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 3/8
  8. 8. Método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o método compreende (a) cultura de uma célula hospedeira seleccionada a partir do grupo compreendendo uma célula eucariótica e uma célula CHO sob condições adequadas para expressão do polinucleótido codificando o anticorpo, e (b) isolamento do anticorpo.
  9. 9. Polipéptido compreendendo a sequência da reivindicação 6(v)(a) ou reivindicação 6(v)(b).
  10. 10. Imunoconjugado compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ligado covalentemente a: (i) um agente citotóxico, opcionalmente um agente quimioterapêutico, uma porção fármaco, um antibiótico, um isótopo radioactivo, e uma enzima nucleolítica; ou (ii) um marcador de captura, opcionalmente um marcador de captura de biotina; ou (iii) um marcador de detecção, opcionalmente um marcador de detecção corante fluorescente tal como do tipo fluoresceina, um tipo rodamina, dansilo, Lissamina, uma cianina, uma ficoeritrina, Vermelho Texas, e um análogo destes, ou um marcador de detecção radionuclideo seleccionado 18T 3Ga, 86Y, 213T 32p 35 g 9 9 r 'Tc, niIn, Ί, "“I, ^I, ±J±I, ±JJXe, x' 'Lu, z±±At, e """Bi; em que o anticorpo é opcionalmente ligado ao marcador de detecção através de um ligando quelante, opcionalmente DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA ou TETA. a partir de H, C, C, ±0F, 123 τ 12 4 T 125 t 131-, 133, 64 Cu,
  11. 11. Imunoconjugado da reivindicação 10, em que o imunoconjugado tem a fórmula Ab-(L-D)p, em que: (a) Ab é o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (b) L é um ligador; e (c) D é uma porção fármaco, em que opcionalmente L é 6-maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-aminobenziloxicarbonilo (PAB), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)-pentanoato (SPP), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC), ou ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 4/8 aminobenzoato de N-succinimidil-(4-iodo-acetilo) (SIAB); e/ou D é uma auristatina ou dolostatina.
  12. 12. 0 imunoconjugado da reivindicação 10 compreendendo uma porção fármaco de auristatina ou maitansinóide (D) em que o anticorpo é ligado através de uma porção ligadora (L) a D; o composto possuindo a Fórmula I: Ab-(L-D)p I onde p é 1 a 8; em que opcionalmente (i) L tem a fórmula: Aa WW Yy onde : A é uma unidade Prolongadora; a é 0 ou 1; cada W é, independentemente, uma unidade de Aminoácidos; w é um inteiro variando de 0 a 12; Y é uma unidade Espaçadora ligada à porção fármaco; e y é 0, 1 ou 2. (ii) o composto imunoconjugado tem a fórmula:
    (iii) L é SMCC, SPP ou SPDB; (iv) D é MMAE, possuindo a estrutura:
    ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 5/8 em que a linha ondulada indica o local de ligação ao ligador L; (v) D é MMAF, possuindo a estrutura:
    em que a linha ondulada indica o local de ligaçao ao ligador L; (vi) D é DM1 ou DM4, possuindo as estruturas:
    local de ligaçao ao em que a linha ondulada indica o ligador L; ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 6/8 (vii) ο composto imunoconjugado é seleccionado a partir das estruturas:
    Ab-MC-v c- PAB-MMAF
    Ab-MC-MMAE
    Ab-MC-MMAF ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 7/8
    em que Vai é valina e Cit é citrullina; e/ou (viii) L é MC-val-cit-PAB ou MC.
  13. 13. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunoconjugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12 e um transportador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em combinação com um agente citotóxico.
  14. 14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para utilizar como medicamento.
  15. 15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunocon jugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12 para utilização no tratamento de um distúrbio proliferativo, opcionalmente em combinação com um agente citotóxico.
  16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14 para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido distúrbio proliferativo é cancro, opcionalmente linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocitica crónica (CLL), linfoma linfocitico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocitica aguda (ALL) e linfoma de células do manto. ΕΡ 2 176 296/ΡΤ 8/8
  17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunoconjugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12 para utilização em inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, em que a referida célula é uma célula tumoral.
  18. 18. Método de determinação da presença de uma proteína CD79b numa amostra suspeita de conter a referida proteína, o referido método compreendendo a exposição da referida amostra a um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunoconjugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12 e a determinação da ligação do referido anticorpo ou imunoconjugado à referida proteína CD79b na referida amostra, em que a ligação do anticorpo à referida proteína é indicativa da presença da referida proteína na referida amostra; em que a amostra é opcionalmente de um paciente suspeito de possuir um distúrbio proliferativo de células B, opcionalmente linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL refractário, NHL indolente refractário, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de células do manto.
  19. 19. Método in vitro de inibição do crescimento de uma célula que expressa CD79b, o referido método compreendendo o contacto da referida célula com um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunocon jugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que a referida célula é opcionalmente uma célula B e/ou uma célula tumoral.
  20. 20. Ensaio para detecção de células B compreendendo: (a) exposição de células a um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou o imunocon jugado de qualquer uma das reivindicações 10 a 12; e (b) determinação da extensão de ligação do composto de anticorpo ou imunoconjugado às células. Lisboa, 2012-04-30
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