BRPI0812691A2 - "anticorpos, polipeptídeos, vetor, célula hospedeira, método de produzir um anticorpo anti-cd79b, imunoconjugado, composições, métodos de inibição, métodos de tratamento, método de determinar a presença de cd79b, método de ligar um anticorpo, usos de um anticorpo e uso de um imunoconjugado - Google Patents

"anticorpos, polipeptídeos, vetor, célula hospedeira, método de produzir um anticorpo anti-cd79b, imunoconjugado, composições, métodos de inibição, métodos de tratamento, método de determinar a presença de cd79b, método de ligar um anticorpo, usos de um anticorpo e uso de um imunoconjugado Download PDF

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BRPI0812691A2
BRPI0812691A2 BRPI0812691-7A BRPI0812691A BRPI0812691A2 BR PI0812691 A2 BRPI0812691 A2 BR PI0812691A2 BR PI0812691 A BRPI0812691 A BR PI0812691A BR PI0812691 A2 BRPI0812691 A2 BR PI0812691A2
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BR
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antibody
fact
seq
cd79b
amino acid
Prior art date
Application number
BRPI0812691-7A
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Yvonne Chen
Mark Dennis
David Dornan
Kristi Elkins
Jagath Reddy Junutula
Andrew Polson
Bing Zheng
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Genentech Inc
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Abstract

ANTICORPOS, POLIPEPTÍDEOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-CD79b, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE INIBIR O CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA, MÉTODO DE TRATAR UM INDIVÍDUO, UM DISTÚRBIO PROLIFERATIVO, UM TUMOR E CANCER, MÉTODOS DE INIBIR A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS, MÉTODOS DE DETERMINAR A PRESENÇA DE CD79B, MÉTODO DE LIGAR UM ANTICORPO, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, CONJUGADO ANTICORPO-DROGA, COMPOSTOS, ENSAIO PARA DETECTAR CÉLULAS, ARTIGO E MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO DE CONJUGADO A presente invenção refere-se a composições de material úteis para o tratamento de tumor hematopiético em mamíferos e a métodos de usar estas composições de material para os mesmos.

Description

[o A DD O | 1 “ANTICORPOS, POLIPEPTÍDEOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-CD79b, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE INIBIÇÃO, MÉTODOS DE TRATAMENTO, MÉTODO DE DETERMINAR A PRESENÇA DE CD79B, MÉTODO DE LIGAR UM ANTICORPO, USOS DE UM ANTICORPO E USO DE UM IMUNOCONJUGADO”
REFERÊNCIA CRUZADA À PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido não provisório, depositado em termos do Título e 37 do CFR 8$1.53(b), reivindica benefícios, conforme faculta o Título 35 USC $119(e), do Pedido Provisório US 60/950.052, depositado em 16 de julho de 2007, Pedido Provisório US 61/025.137, depositado em 31 de janeiro de 2008, Pedido Provisório US 61/032.790, depositado em 29 de fevereiro de 2008 e Pedido Provisório US 61/054.709, depositado em 20 de maio de 2008, sendo que todos eles estão incorporados integralmente ao presente a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições de material útil para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de usar o estas composições de material para o mesmo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Tumores malignos (cânceres) são a segunda causa líder de doença nos Estados Unidos, após a doença cardíaca (Boring et al, CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento no número de células anormais, ou neoplásicas, derivadas de um tecido normal, que proliferam para formar uma massa de tumor, a invasão de tecidos adjacentes por estas células de tumor neoplásicas, e a geração de células malignas que eventualmente se espalham pelo sangue ou sistema linfático para nodos linfáticos regionais e para sítios distantes por um processo denominado metástase.
Em um estado canceroso, uma célula prolifera sob condições em que células normais podem não se desenvolver.
O câncer manifesta-se por si mesmo em uma ampla variedade de formas, caracterizadas por diferentes graus de invasividade e agressividade.
Os cânceres que envolvem células geradas durante hematopoiese, um processo pelo qual os elementos celulares do sangue, como linfócitos, leucócitos, plaquetas, eritrócitos e células exterminadoras naturais (natural killer) são gerados, são referidos como cânceres hematopoiéticos.
Os | oe linfócitos que podem ser encontrados no sangue e tecido linfático e são críticos | para resposta imune são categorizados em duas classes principais de | linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T), que mediam a | imunidade mediada por células e humoral, respectivamente. | As células B amadurecem dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação a antígeno em sua superfície celular.
Quando uma primeira célula B primitiva encontra o antígeno para o qual seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a dividir- se rapidamente e sua progênie diferencia-se na memória de células B e células efetoras denominadas “células do plasma”. Como células B de memória têm o um tempo de vida mais longo e continuam a expressar o anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula parental original como “células do plasma não produzem o anticorpo ligado à membrana, mas, em vez disso, produz o anticorpo em uma forma que pode ser secretada.
Os anticorpos secretados são a maior molécula efetora de imunidade humoral.
As células T amadurecem dentro do timo que fornece um ambiente para a proliferação e diferenciação de células T imaturas.
Durante a maturação das células T, as células T passam por redistribuições de genes que produzem o receptor de células T e a seleção positiva e negativa que ajuda a determinar o fenótipo da superfície celular da célula T madura.
Como
E A o ERR A o E | | 3 características dos marcadores da superfície celular de células T maduras são o complexo do CD3: receptor de célula T e um dos co-receptores, CD4 ou CDB8. | Em tentativas para descobrir como marcações celulares eficazes | 5 para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar polipeptídeos de transmembrana ou de outro modo associados à membrana que são especificamente expressados sobre a superfície de um ou mais tipo(s) particular(es) de célula cancerosa quando comparada a uma ou mais célula(s) | oe não-cancerosa(s) normais.
Frequentemente, tais polipeptídios associados à membrana são mais abundantemente expressados sobre a superfície de células de câncer quando comparados a sobre a superfície de células não- cancerosas.
A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície de células associadas a tumor dá origem à capacidade para marcar especificamente células de câncer para destruição por terapias baseadas em anticorpo.
A este respeito, nota-se que a terapia baseada em anticorpo prova- se muito eficaz no tratamento de certos cânceres.
Por exemplo, HERCEPTINO e RITUXANO (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia) são anticorpos que são usados com sucesso para tratar câncer de mama e linfoma o não-Hodgkin, respectivamente.
Mais especificamente, HERCEPTINO é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA que se liga seletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene do receptor 2 (HER2) do receptor do fator de crescimento epidérmico humano.
A super-expressão da proteína HER? é observada em 25-30% dos cânceres de mama primários.
RITUXANGO é um anticorpo monoclonal de murino/humano quimérico de engenharia genética dirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos B normais e malignos.
Ambos os anticorpos recombinantes são produzidos em células CHO.
Em outras tentativas para descobrir marcações celulares eficazes O O«——p———————. s ML Inn para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar (1) polipeptídeos “associados a não-membranas que são especificamente produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) normal(is) não- cancerosas, (2) polipeptídeos que são produzidos por células de câncer em um —nívelde expressão que é significativamente mais alto do que o de uma ou mais célula(s) não-cancerosas normais, ou (3) polipeptídeos cuja expressão é especificamente limitada a somente um único (ou um número muito limitado de diferente(s)) tipo(s) de tecido tanto no estado canceroso como não-canceroso e (por exemplo, tecido de tumor de próstata e de próstata normal). Estes polipeptídeos podem permanecer localizados intracelularmente ou podem ser | secretados pela célula cancerosa.
Além disso, tais polipeptídeos podem ser | expressos não pela própria célula cancerosa, mas, mais exatamente, por | células que produzem e/ou secretam polipeptídeos tendo um efeito melhorado | da potencialidade e do crescimento sobre como células cancerosas.
Tais —polipeptídeos secretados são frequentemente proteínas, que fornecem células Cancerosas com uma vantagem de crescimento sobre células normais, e incluem elementos tais como, por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de adesão celular, fatores de crescimento, e outros.
Pode-se esperar que a o identificação de antagonistas de tais polipeptíideos associados a não- “membrana sirva como agentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cânceres.
Além disso, a identificação do padrão de expressão de tais polipeptídeos pode ser útil para o diagnóstico de cânceres particulares em mamíferos.
A despeito dos avanços acima identificados em terapia de câncer de mamíferos, há uma grande necessidade de agentes terapêuticos adicionais capazes de detectar a presença de tumor em um mamiífero e para inibir eficazmente o crescimento de célula neoplásica.
Consequentemente, é um objetivo da presente invenção identificar polipeptídeos, polipeptídeos associados a membrana celular ou polipeptídeos intracelulares cuja expressão é especificamente limitada a somente um único (ou um número muito limitado de diferente(s)) tipo(s) de tecido, tecidos hematopoiéticos, tanto em um estado canceroso como não-canceroso, e usar estes polipeptídeos, e seus ácidos 5 —nucleicos de codificação, para produzir composições de material útil no tratamento terapêutico e/ou detecção de câncer hematopoiético em mamíferos. CD79 é o componente de sinalização do receptor de célula B consistindo de um heterodímero covalente contendo CD79a, (Iga, mb-1) e e CD79b (lg, B29). CD79a e CD79b contêm, cada um, um domínio de —imunoglobulina (lg) extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, um domínio motivo de ativação baseado no imunorreceptor de tirosina (ITAM). CD79 é expresso em células B e em células de linfoma não-Hodgkin (NHLs) (Cabezudo et al, Haematologica, 84: 413-418 (1999); D'Arena et al, Am. J. Hematol. 64: 275-281 (2000); Olejniczak et al, Immunol. Invest, 35: 93-114 (2006)) CD79a e CD79b e slg são todos requeridos para expressão na superfície de CD79 (Matsuuchi et a/, Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7)). A expressão média na superfície de CD79b sobre NHLs é similar àquela sobre células B normais, mas com uma faixa maior o (Matsuuchi et al, Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7 (2001)).
Dada a expressão de CD79b, ela é benéfica para produzir anticorpos terapêuticos para o antígeno CD79b que cria mínima ou nenhuma antigenicidade quando administrado a pacientes, especialmente para tratamento crônico. A presente invenção satisfaz esta e outras necessidades. À presente invenção fornece os anticorpos anti-CD79b que superam como limitações das composições terapêuticas atuais, bem como oferecem vantagens adicionais que serão evidentes a partir da descrição detalhada abaixo.
O uso de conjugados de anticorpo-droga (ADC), isto é
MMC imunoconjugados, para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para exterminar ou inibir células de tumor no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005) Curr.
Opinion in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv.
Droga Del.
Rev. 26: 151-172; US 4975278) permite a liberação dirigida da porção de droga em tumores, e o acúmulo intracelular nos mesmos, onde a administração sistêmica destes o agentes de droga não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais bem como células de tumor procuradas para serem eliminadas (Baldwin et a/ (1986) Lancet PP. (15 de março de 1986): 603- 05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cancer Therapy: À Review.”, em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A.
Pinchera et al (ed.s), pp. 475-506). Esforços para aperfeiçoar o índice terapêutico, isto é, eficácia máxima e toxicidade mínima de ADC focaliza a seletividade de anticorpos policlonais (Rowland et a/ (1986) Cancer Immunol.
Immunother., 21: 183-87) e monoclonais (mAbs) bem como propriedades de ligação de droga e de liberação de droga (Lambert, J. (2005) Curr.
Opinion in o Pharmacology 5: 543-549). Porções de droga usadas nos conjugados de droga no anticorpo incluem toxinas de proteína bacteriana tal como toxina de difteria, toxinas de proteína de planta tais como ricina, moléculas pequenas tais como auristatinas, geldanamicina (Mandler et a/ (2000) J. of the Nat.
Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med.
Chem.
Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), —maitansinóides (EP 1391213; Liu et a/ (1996) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 93: 8618-8623), caliqueamicina (Lode et a/ (1998) Cancer Res. 58: 2928; Himman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et al (1986) supra). As porções de droga podem afetar os mecanismos citotóxicos e citostáticos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA, ou inibição de topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas a anticorpos grandes ou ligantes do receptor de proteína.
Os peptídeos de auristatinay auristatihna E (AE) e monormetilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina (WO 02/088172), são conjugados como porções de droga para: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas); (ii) oe CACIO que é específico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4): 1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tal como rituxan (WO 04/032828) para o tratamento de cânceres expressando CD20 e distúrbios imunes; (iv) anticorpo 2H9 anti-EphB2R para o tratamento de câncer —colorretal (Mao et al (2004) Cancer Research 64(3): 781-788; (v) anticorpo de seletina E (Bhaskar et a/ (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394; (vi) trastuzumab (HERCEPTINGO, US 2005/0238649), e (vi) anticorpos anti-cCD30 (WO 03/043583). Variantes de auristatina E são descritas em, US 5767237 e US o 6124431. Conjugados de monometila auristatina E para anticorpos —monoclonais são descritos em Senter et al Proceedings of the American Association for Cancer Research, volume 45. Abstract Number 623, apresentado em 28 de março de 2004. Análogos MMAE e MMAF de auristatina são conjugados a diversos anticorpos (US 2005/0238649). Meios convencionais de fixar, isto é, ligar através de ligações —covalentes, uma porção de droga a um anticorpo geralmente levam a uma mistura heterogênea de moléculas onde as porções de droga são fixadas a um número de sítios no anticorpo. Por exemplo, drogas citotóxicas são tipicamente conjugadas a anticorpos através de resíduos de lisina frequentemente numerosos de um anticorpo, gerando uma mistura de conjugado de anticorpo- droga heterogênea.
Dependendo das condições de reação, a mistura heterogênea contém tipicamente uma distribuição de anticorpos com de 0 a 8, ou mais, porções de droga fixadas.
Além disso, em cada subgrupo de — conjugados com uma relação inteira particular de porções de droga para anticorpo, é uma mistura potencialmente heterogênea onde a porção de droga é fixada em diversos sítios no anticorpo.
Métodos analíticos e preparativos podem ser inadequados para separar e caracterizar como moléculas de oe espécie de conjugado de anticorpo-droga dentro da mistura heterogênea resultante de uma reação de conjugação.
Os anticorpos são grandes, complexos e biomoléculas estruturalmente variadas, frequentemente com muitos grupos funcionais reativos.
Suas reatividades com reagentes de ligantes e intermediários de droga-ligante são dependentes de fatores tais como pH, concentração, concentração de sal e co-solventes.
Além disso, o processo de conjugação em múltiplas etapas pode ser não reprodutível devido a dificuldades em controlar como condições de reação e caracterizar os reagentes e intermediários.
À Tióis cisteína são reativos em pH neutro, diferente da maioria das o aminas que são protonadas e de pH menos nucleofílico próximo de 7. Uma vez que grupos de tióis livres (RSH, sulfidrila) são relativamente reativos, proteínas com resíduos de cisteina existem em sua forma oxidada como oligômeros ligados a dissulfeto ou ligam internamente grupos dissulfeto.
Proteínas extracelulares geralmente não têm tióis livres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, na página 55). Grupos tiol cisteína no anticorpo são geralmente mais reativos, isto é, mais nucleofílicos, para reagentes de conjugação eletrofílica do que grupos amina ou hidroxila no anticorpo.
Resíduos de cisteina são introduzidos em proteínas por técnicas de engenharia genética para formar fixações covalentes para ligantes ou para formar novas ligações de dissulfeto intramolecular (Better et al (1994) J.
Biol.
Chem. 13: 9644-9650; Bernhard et a/ (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1: 247-255; Tu et al (1999) Proc.
Natl.
Acad.
Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of — Biotechnology, 76: 207-214; Chmura et al (2001) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 98(15): 8480-8484; US 6248564). No entanto, a engenharia nos grupos tiol cisteína pela mutação de múltiplos resíduos de aminoácidos de uma proteína para aminoácidos de cisteína é potencialmente problemática, particularmente oe no caso de resíduos não pareados (Cys livre) ou dos que são relativamente acessíveis para reação ou oxidação.
Em soluções concentradas da proteína, se no periplasema de E. coli sobrenadantes da cultura, ou proteína parcialmente ou completamente purificada, resíduos de Cys não pareados sobre a superfície da proteína podem parear e oxidar para formar dissulfetos intermoleculares, e portanto dímeros ou multímeros de proteína.
A formação de —dímeros de dissulfeto torna a nova Cys não reativa para conjugação em uma droga, ligante, ou outro rótulo.
Além disso, se a proteína forma oxidativamente uma ligação de dissulfeto intramolecular entre a Cys recentemente engenheirada e um resíduo de Cys existente, ambos os grupos tiol Cys estão o indisponíveis para interações e participações no sítio ativo.
Além disso, a proteína pode tornar-se inativa ou não específica, por duplicação imperfeita ou perda da estrutura terciária (Zhang et al (2002) Anal.
Biochem. 311: 1-9). Anticorpos submetidos à engenharias com cisteina são designados como fragmentos de anticorpos FAB (thioFab) e expressados como anticorpos monoclonais (thioMab) de IgG, de comprimento completo (Junutula, JR et al (2008) J Immunol Methods 332: 41-52; US 2007/0092940, cujos conteúdos são incorporados por referência). Anticorpos tioFab e tioMab são conjugados através de ligantes nos tióis cisteina recentemente introduzidos com reagentes de ligantes reativos com tiol e reagentes de ligantes de droga para preparar conjugados de anticorpo droga (Thio ADC). Todas como referências citadas aqui, incluindo pedidos e publicações de patente são incorporadas por referência em sua totalidade. | DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO | 5 A presente invenção fornece anticorpos anti-cCD79b ou | fragmentos funcionais dos mesmos, e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que se oÓ liga, de preferência de modo específico, a qualquer um dos polipeptídeos 10 descritos acima e abaixo.
Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo Fab, Fab' F(ab')) e fragmento Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico.
Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinoide, um derivado de doostatina ou uma caliqueamicina, um o antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica, ou outros.
Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e, de preferência, induzem a morte de uma célula à qual eles se ligam.
Para fins de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente rotulados, fixados a um suporte sólido, ou outros.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- CD79b humanizado sendo que a afinidade monovalente (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) ou afinidade em sua forma bivalente do anticorpo para CD79b (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento IgG para CD79b) é substancialmente a mesma que, menor do que, ou maior do que, a afinidade monovalente ou afinidade em sua forma bivalente, respectivamente, de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo de murino como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e o uma cadeia leve como descrito nas figuras 7º-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8º-B (SEQIDNO: 14).
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- CD79b humanizado sendo que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para CD79b) é 0,4 nM, 0,2 nM ou 0,5 nM.
Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, sendo que o anticorpo compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados a partir do grupo consistindo de: (1) HVR-L1 compreendendo sequência A1-A15, sendo que A1-A15 e é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 compreendendo sequência B1-B7, sendo que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 compreendendo Sequência C1-C9, sendo que C1-C9 é QQOSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-H1 compreendendo Sequência D1-D10, sendo que D1- D1I0éGYTFSSYWIE(SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 compreendendo Sequência E1-E18, sendo que E1- E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 compreendendo sequência F1-F10, sendo que F1-
| 12 F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136). Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, sendo que o anticorpo compreende pelo menos uma variante HVR sendo que a sequência da variante HVR compreende modificação de pelo menos um — resíduo da sequência descrita na SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 15 (SEQ ID O no16s116s, Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 15 (SEQ ID NO: 156-158).
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 16 (SEQ ID NO: 183-185).
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo o compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 16 (SEQ ID NO: 175-177).
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1I-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 17 (SEQ ID —NO:202-204).
Em um aspecto, a presente nvenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 17 (SEQ ID
NO: 194-196). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 18 (SEQ ID NO:221-223). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 18 (SEQ ID O no21321s, Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti- CD79b compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado de SEQ SEQ ID NO: 170, 189, 208 ou 227. Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 169, 188, 207 ou 226.
Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti- CD79b submetido à engenharia com cisteina compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livre e a sequência selecionada de SEQ ID NO: 251-
298. O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ligar- o se a um polipeptídeo de CD79b. O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ser preparado por um processo compreendendo substituir um ou mais resíduos de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b parental por cisteína.
Em um aspecto, a presente invenção inclui o anticorpo anti- CD79b submetido à engenharia com cisteína compreendendo um ou mais — aminoácidos de cisteína livres sendo que o anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína liga-se a um polipeptídeo de CD79b e é preparado por um processo compreendendo substituir um ou mais resíduos de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b parente por cisteina sendo que anticorpo parente compreende pelo menos uma sequência de HVR selecionada de: (a) Sequência AI-A15 compreendendo HVR-L1, sendo que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) ou KASQOSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137); (b) Sequência B1-B7 compreendendo HVR-L2, sendo que B1- B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (c) — Sequência C1-C9 compreendendo HVR-L3, sendo que C1- C9 é QQOSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) [CS (d) Sequência DI-DI0O compreendendo HVR-H1, sendo que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (e) Sequência E1-E18 compreendendo HVR-H2, sendo que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (f) Sequência F1-F10 compreendendo HVR-H3, sendo que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138). O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo , quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que o inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico.
Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina ou maitansinoide.
Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e de preferência inibem crescimento ou proliferação de ou induz a morte da célula às quais eles se ligam para fins de diagnóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente rotulados, fixados a um suporte sólido, ou outros.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para produzir um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo CD79b (que,como definido aqui inclui o | comprimento completo e fragmentos do mesmo), dito método compreendendo expressar em uma célula hospedeira apropriada um vetor recombinante da | 5 invenção codificando dia anticorpo (ou fragmento do mesmo), e recuperar dito | anticorpo. | Em um aspecto, presente a invenção é uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção ou um conjugado de 6 anticorpo-droga da invenção, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um artigo de fabricação compreendendo um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, sendo que a composição compreende um ou mais anticorpos CD79b da invenção.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos CD79b da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão.
o Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo CD79b da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um artigo de fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um kit da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico o — as —
e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células. Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir o crescimento de uma célula que expressa CD79b, dito método — compreendendo contatar a dita célula com um anticorpo da invenção desse modo causando uma inibição de crescimento de dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento. e Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um mamífero tendo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, dito método compreendendo administrar a dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando eficazmente dito mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, presente a invenção fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de células associado com a e expressão aumentada de CD79b, dito método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando ou prevenindo eficazmente dito distúrbio proliferativo de células. Em uma modalidade, dito distúrbio proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para inibir o crescimento de uma célula, sendo que o crescimento de dita célula é pelo menos em parte dependente de um efeito potencializador de crescimento de CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com uma
| 17 quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo inibindo o crescimento de dita célula.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento. | Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um tumor em um mamífero, sendo que o crescimento de dito tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito potencializador de crescimento do CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com e uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando eficazmente o dito tumor.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar câncer compreendendo administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado descrito aqui, diluente aceitável, veículo ou excipiente.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir a proliferação de células B compreendendo expor uma célula a um e imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção sob condições —permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de determinar a presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, dito método compreendendo expor dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinar a ligação de dia anticorpo a CD79b em dita amostra sendo que a ligação de dia anticorpo a CD79b em dita amostra é indicativa da presença de dita proteína em dita amostra.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de diagnosticar um distúrbio proliferativo de célula associado com um aumento em células, tal como células B, expressando CD79b é fornecido, o método compreendendo contatar células de teste em uma amostra biológica com qualquer um dos anticorpos acima; determinar o nível de anticorpo ligado às células de teste na amostra detectando a ligação do anticorpo a CD79b; e comparar o nível de anticorpo ligado às células em uma amostra de controle, sendo que o nível de anticorpo ligado é normalizado no número de células expressando CD79b nas amostras de teste e de controle, e sendo que o nível mais alto de anticorpo ligado na amostra de teste como comparado à amostra e de controle indica a presença da distúrbio proliferativo de células associado com células expressando CD79b.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de detectar CD79b solúvel no sangue ou soro, o método compreendendo contatar uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de experimentar um distúrbio proliferativo de células B com um anticorpo anti- CD79b da invenção e detectar um aumento em CD79b solúvel na amostra de teste com relação a uma amostra de controle de sangue ou soro de um mamífero normal.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de ligar e um anticorpo da invenção a uma célula que expressa CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com um anticorpo da invenção. Em uma | modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma | modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) —deum cDNA PRO36249, sendo que SEQ ID NO: 1 é a clone designado aqui como “DNA2Z25786" (também referido aqui como “CD79b”"). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 1 mostrada na figura 1. A figura 3 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) de cadeia leve de anticorpo de murino CD79b quimérico (chMA7Z9b) IgG1 (MA79b é um anticorpo anti-cCD79b monoclonal de murino). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia leve de chMA79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 4 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4), | oe omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos, derivada da o sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 mostrada na figura 3. Regiões variáveis são como regiões não sublinhadas.
A figura 5 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5) de cadeia pesada do anticorpo de murino quimérico (ChRMAZ9b) IgG1 (MA79b é o anticorpo anti-CD79b monocional de murino). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada de chnMAZ79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 6 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) e antes do códon de parada, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 5 mostrada na figura 5. Regiões variáveis são como regiões não sublinhadas.
As figuras 7A-B mostram o alinhamento de sequências de cadeias leves variáveis para o seguinte: a sequência de consenso kappa | humana de cadeia leve (rotulada como “huKl”; SEQ ID NO: 9) com VL-FR1, VL-FR2, VL- FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO: 139-142, respectivamente), anticorpo anti-CD79b de murino (rotulado como “MA79b”; SEQ ID NO: 10), anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (rotulado como “enxerto huMA79b”; SEQ ID NO: 11), variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (rotulado como
“huMA79b.v17”; SEQ ID NO: 169), variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v18"; SEQ ID NO: 188), variante 28 anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b (rotulado como “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 207) e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (rotulado como “huMA79b.v32”; SEQ ID NO: 226). Como posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso de Kappa | leve variável estão mostradas em caixas. o As figuras 8A-B mostram o alinhamento de sequências de vadeias pesadas variáveis para o seguinte: sequência de consenso do subgrupo Ill humana de cadeia pesada (rotulada como “humlll”; SEQ ID NO: 13) com VH- FR1, VH-FR2, VH-FR3, e VH-FR4 (SEQ ID NO: 143-146), anticorpo anti- CD79b de murino (rotulado como “MA79b”; SEQ ID NO: 14), anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b (rotulado como “huMA79b graft”; SEQ ID NO: 15) (contendo 71A, 73T e 78A), variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b (rotulado como “huMA79b.vi7”;, SEQ ID NO: 170) (contendo 71A, 73T e 78A), variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (rotulado como “huMA79b.v18”; SEQ ID NO: 189) (contendo 71A, e 73T e 78A), variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (rotulado como “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 208) (contendo 71A, 73T e 78A) e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b (rotulado como “huMA79b.v32"”; SEQ ID NO: 227) (contendo 71A, 73T e 78A) como posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso do subgrupo Ill pesada
—variávelestão mostradas em caixas.
A figura 9 mostra várias sequências HVR de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b selecionadas (SEQ ID NO: 17- 21) sendo que cada variante tem uma troca de aminoácido única em um HVR único do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (HVR-L1 (SEQ ID NO: 131); HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133)) como sequências das cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis fora das trocas de aminoácido únicas foram idênticas ao enxerto de huMA79b e não são —mostradas. Nenhuma troca foi observada em HVR-H1 (SEQ ID NO: 134), HVR- H2 (SEQ ID NO: 135) ou HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b. A figura 10 mostra várias sequências HVR de variantes de eo anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b selecionadas (SEQ ID NO: 22- 106), incluindo huMA79b L2-2 (também referido to aqui como “L2") um huMA79b H3-10 (também referido to aqui como “H3”) sendo que cada variante tem múltiplas trocas de aminoácidos em uma região de HVR única do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133); HVR-H1 (SEQ ID NO: 134); porção de HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) é mostrada na figura 10 como SEQ ID NO: 107). As sequências de cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis fora das trocas de aminoácidos mostradas foram idênticas ao enxerto de huMA79b e não são mostradas. Nenhuma troca foi observada em HVR-L1 (SEQ ID NO: 131) ou o HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) do anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b.
A figura 11 mostra análise Biacore de anticorpos anti-CD79b selecionados, incluindo anticorpo CD79b de murino (rotulado como “MA79b”), anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (rotulado como “huMA79b graft”), e variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b, incluindo mutações de huMA79b L2-2 (52R, 53K, 55G, 56R; SEQ ID NO: 22), huMA79b —H3-10(98l, 99R, 100L; SEQ ID NO: 94), huMA79b H1-6 (28P, 30T, 31R, 35N; SEQ ID NO: 57) e huMA79b L2/H3 (L2-2 e H3-10 descritas abaixo) para designar antígenos, incluindo o domínio extracelular de CD79b (huCD79beca) humano, o domínio extracelular de CD79b humano ligado a Fc (huCD79becg-
Fc) e um peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b e cChMA79b (SEQ ID NO: 16). A figura 12 mostra análise Biacore de anticorpos anti-CD79b selecionados, incluindo anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b graft”) e variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (rotulado como 1-34 na primeira coluna ou como “toda a estrutura” na primeira coluna) no domínio extracelular humano de CD79b (antígeno huCD79b-ecd). Variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com e MA7Z79b incluem uma variante de “toda a estrutura” onde resíduos de estrutura de murino potencialmente importantes estão presentes e variantes (rotuladas 1-34) com combinações de mutações de estrutura com ou sem mutações de HVR na cadeia leve variável e cadeia pesada variável como designado. À variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ7Z9b (referido aqui como “huMA79b.v17”) é rotulada como 17 na primeira coluna, variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (referida aqui como “huMA79b.v18”) é rotulada como 18 na primeira coluna, variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (referida aqui como “huMA79b.v28”) é rotulada como 28 na primeira coluna e variante 32 de o anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (referida aqui como “huMA79b.v32”) é rotulada como 32 na primeira coluna. A duplicação da ligação covalente é representada como o Kd da variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b particular (rotulada como “Kdrvariante Y/o Kd do anticorpo MA79b quimérico (ChMA79b) (rotulado como “Kdquimera); OS valores sob a coluna rotulada “duplicação de ligação bivalente” representam — Kdvarane/Kdquimera. Nenhuma ligação detectada é designada na figura como “NDB”.
As figuras 13A-B (variável pesada (VH) estruturas de consenso) e a figura 14 (variável leve (VL) estruturas de consenso) descrevem sequências de estruturas de consenso humanas aceptoras exemplificativos para uso na prática da presente invenção com identificadores de sequência como a seguir: (Figuras 13A-B) estrutura de consenso do subgrupo | de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 108), estrutura de consenso do subgrupo | de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 109-111), estrutura de consenso do subgrupo Il de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 112), estrutura de consenso do subgrupo 1! de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 113-115), estrutura de o consenso do subgrupo Ill de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 116), estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 117-119), estrutura aceptora humana de VH menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 120), estrutura aceptora humana de VH menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 121-122), estrutura 2 aceptora humana de VH menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 123) e estrutura 2 aceptora humana de VH menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 124-26) e (Figura 14) estrutura de consenso do subgrupo | de kappa VL humano (SEQ ID NO: 127), estrutura de consenso do subgrupo !l de kappa VL humano (SEQ ID NO: 128), estrutura de consenso do subgrupo Ill de e kappa VL humano (SEQ ID NO: 129) e estrutura de consenso do subgrupo IV —dekappaVWVL humano (SEQ ID NO: 130).
As figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequência de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.vi7). As figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequência de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v17) (SEQ ID NO: 152-159 (Figura 15A) e SEQ ID NO: 160-168 (Figura 15B)). Sequência de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) das cadeias leves e pesadas de huMA79b.v17 são mostradas (SEQ ID NO: 303 (Figura 15A) e 304 (Figura 15B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos de domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 169 (Figura 15A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 170 (Figura 15B para cadeia pesada)).
As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v18). As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio e constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo dainvenção (huMA79b.v18) (SEQ ID NO: 171-178 (Figura 16A) e SEQ ID NO: 179-187 (Figura 16B)). Sequências de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) da cadeia leve e cadeia pesada de huMA?79b.v18 são mostradas (SEQ ID NO: 305 (Figura 16A) e 306 (Figura 16B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As — sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 188 (Figura 16A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 189 (Figura 16B para cadeia pesada)).
As figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram o sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28). À figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28) (SEQ ID NO: 190-197 (Figura 17A) e SEQ ID NO: 198-206 (Figura 17B). Sequências de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) de cadeias leves e pesadas de huMA79b.v28 são mostradas (SEQ ID NO: 307 (Figura 17A) e 308 (Figura 17B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácidos de domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 207 (Figuras
7A-B para cadeia leve) e SEQ ID NO: 208 (Figuras 8A-B para cadeia pesada)). As figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32). Figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32) (SEQ ID NO: 209-216 (Figura 18A) e SEQ ID NO: 217-225 (Figura 18B). Sequências de aminoácidos de comprimento completo o (regiões variáveis e constantes) de cadeias leves e pesadas de huMA79b.v32 são mostradas (SEQ ID NO: 309 (Figura 18A) e 310 (Figura 18B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 226 (Figura 18A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 227 (Figura 18B para cadeia pesada)). A figura 19 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos de CD79b de humano (SEQ ID NO: 2), macaco cynomolgus (cyno) (SEQ ID NO: 7) e camundongo (SEQ ID NO: 8). CD79b de humano e de cyno têm 85% de identidade de aminoácido. A sequência de sinal, peptídeo de teste (o epítopo de 11 aminoácidos para MA79b , chMAZ9b e anti-cyno O anticorpo o CD79b descrito no exemplo 1; ARSEDRYRNPK (SEQ ID NO: 12)), domínio de transmembrana (TM) e domínio do motivo de ativação baseado no imunorreceptor de tirosina (ITAM) são indicados. A região mostrada em caixas é a região de CD79b que está ausente na variante de emenda de CD79b (descrita no exemplo 1).
A figura 20 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase que mostra que a administração do anticorpo anti-CD79bs ((a) chaMA79b-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,9 (Tabela 9) e (b) huMA79b L2/H3-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,4 (Tabela 9)) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanos inibiu significativamente o crescimento do tumor. Os controles incluíram Herceptin& (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti- HER2-SMCC-DM1). A figura 21A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivoemum modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto humano) que mostra que a administração do anticorpo anti-CD79bs ((a) cChMA7Z79b-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,6 (Tabela 10), (b) huMA79b.v1i7-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,4 oe (Tabela 10), (c) huMA79b.v28-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,3 ou 3,4 (Tabela 10), (d) huMA79b.v18-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,4 (Tabela 10) e (e) huMA79b.v32- SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,9 (Tabela 10)) tem camundongos SCID tendo tumores de célula B célula humanos inibiu significativamente o crescimento de tumor. Os controles incluíram Herceptin& (trastuizumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). A figura 21B é um traço em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos do estudo com xenoenxerto Granta-519 (Figura 21A e Tabela 10) mostrando que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 7 dias do estudo.
o “hu” refere-se a anticorpo humanizado e “ch” refere-se a anticorpo quimérico.
A figura 22 mostra descrições de conjugados de anticorpo anti- CD79b droga submetido à engenharias por cisteína (ADC) onde uma porção da droga é fixada e um grupo de cisteína engenheirada na cadeia leve (LC-ADC); na cadeia pesada (HC-ADC); e na região de Fc (Fc-ADC).
A figura 23 mostra as etapas de: (i) reduzir os adultos de dissulfeto cisteina e intercadeia e dissuifetos de intracadeia em um anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína (ThioMab) com o agente de redução TCEP (hidrocloreto de tris(2-carboxietil)fosfina); (ii) oxidando parcialmente, isto é reoxidação para reformar a intercadeia e dissulfetos de intracadeia, com dhAA (ácido de-hidroascórbico); e (ili) conjugação do anticorpo reoxidado com o intermediário ligante de droga para formar um conjugado de cisteína anti-CD79b droga (ADC). A figura 24 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 229) e(B)asequênciade cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) de anticorpo anti- CD79b sumetido à engenharia com cisteina humanizado (thio-huMA79b.v1i7- HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (alanina de posição sequencial 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para uma oe cisteina. Uma porção de droga pode ser fixada ao grupo de cisteina engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de Fc é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 25 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 231) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) de anticorpo anti- CD79b humanizado sumetido à engenharia com cisteína (thio-huMA79b.v18- HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de o alanina 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para uma cisteina, Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica régios constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de Fc é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 26 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 233) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) de anticorpo anti- CD79b humanizado sumetido à engenharia com cisteína (thio-huMA79b.v28-
HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína.
Uma porção a droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada.
Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado.
Sublinhado único indica regiões constantes.
Regiões variáveis são regiões não sublinhadas.
A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteíina enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. oe A figura 27 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 235) e(B)a sequência de cadeia pesada(SEQ ID NO: 234) de anticorpo anti- CD79b sumetido à engenharia com cisteína (thio-MA79b-LC-V205C), uma valina na posição de Kabat 205 (valina na posição sequencial 209) de cadeia leve foi alterada para cisteína.
Uma porção da droga pode ser fixada a um grupo de cisteína engenheirada na cadeia leve.
Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado.
Sublinhado único indica regiões constantes.
Regiões variáveis são regiões não sublinhadas.
A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína. o A figura 28 mostra (A) uma sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 237) e (B) uma sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) de anticorpo anti-CD79b sumetido à engenharia com cisteína (thio-MA79b-HC- A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de alanina 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína.
Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteina engenheirada na cadeia pesada.
Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado.
Sublinhado único indica regiões constantes.
Regiões variáveis são regiões não sublinhadas.
A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína.
As figuras 29A-B são traçados em gráfico de FACS indicando qual ligação de conjugados de anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se ligam a CD79b expressado sobre a superfície de células de BJAB-luciferase é similar para os conjugados (A) variantes de LC (V205C) thioMAb e (B) HC (A118C) variantes de thioMAb de chMA79b com MMAF. A detecção foi com MS anti-humanIgG-PE. “Thio” refere-se ao anticorpo sumetido à engenharia com cisteína. | As figuras 30A-D são traçados em gráfico de FACS indicando oe qual ligação dos conjugados anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se ligam a CD79b expressado sobre a superfície de BJAB-luciferase células é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC (A118C) thioMAb de huMAZ79b.v18 e variantes conjugadas HC (A118C) thioMAb de huMA?79b.v18 com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAF, (C) MMAE e (D) DM1)). A detecção foi com MS anti-humanIgG-PE. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere- se a anticorpo humanizado.
As figuras 31A-D são traçados em gráfico de FACS indicando qual ligação de conjugados anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que o se ligam a CD79b expressado sobre a superfície de células de BJAB-luciferase é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC (A118C) thioMAb s de huMA?79b.v28 e variantes conjugadas HC (A118C) thioMAb de huMA79b.v28 com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)). A detecção foi com MS anti-humano-PE. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. As figuras 32A-D são traçados em gráfico FACS indicando qual ligação de conjugados anti-cynoCD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se liga a CD79b expressado sobre a superfície de células BJAB expressando cynoCD79b é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC(A118C) thioMAb de anti-cynoCD79b (ch10D10) e variantes conjugadas HC(A118C) thioMAb de anti-ccynoCD79b (ch10D10) com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)). A detecção foi com MS anti-hulgG-PE. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína.
A figura 33A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto e humana) que mostra qual administração de anti-CD79b TDCs que variou em posição da cisteína engenheirada (LC (V205C) ou HC (A118C)) e/ou doses de droga diferentes em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 11) ou thio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,8 (Tabela 11) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram hu-anti-HER2-MC-MMAF e thio hu-antrHER2-HC(ANISC)-MC-MMAF e ChMA79b-MC-MMAF. A figura 33B é a traçado em gráfico da troca de peso o percentual no camundongo a partir do estudo com xenoenxerto Granta-519 (a figura 33A e Tabela 11) mostram que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. A figura 34A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs a diferentes porções de drogas ligantes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 12), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 12), ou thio —huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 12), mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo.
Controles incluem controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu- oe anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA?79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti- CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 34B é um traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos a partir do estudo de xenoenxerto BJAB-luciferase (Figura 34A e Tabela 12) mostrando que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 7 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 35A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em a modelo de xenoenxerto WSU-DLCL?2 (linfoma de células grandes Le difusas) que mostra qual administração do conjugado anti-CD79b TDCs a — porções de drogas ligantes diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC- MMAF) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 13), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DMI1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 13), ou thio huMA?79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 13), mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo.
Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti-
HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anticHER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu-antic=HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA?7Z9b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti- CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 35B é um traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos a partir do estudo com xenoenxerto WSU-DLCL?2 (Figura 35A e Tabela 13) mostrando que não houve nenhuma troca significativa de peso durante os primeiros 7 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína oe enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 36 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto DOHH2 (linfoma folicular) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) em camundongos SCID tendo tumores de céluias B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-BMPEO-DM1 (a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 14)) thio huMA79b.v28-MC-MMAF (a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 14)) ou thio MA79b-HC(A118C)-MCvcPAB- o MMAE (a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 14)) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anticHER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1, thio hu-anticHER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC- DM1 e thio huMA7O9b.v28-HC(A118C)) e controles anti-CD22 (thio hu-anti- CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 37 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administtada em doses diferentes doses como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 15), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 15), ou thio oe huMA?79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 15) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo.
Os controles incluíram veículo (tampão sozinho), controles anti-HER2 (thio hu-anticHER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF, controles thio hu-anticHER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE), huMA79b.v28 (thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti-CD22 (thio hu-ant-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteina enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 38A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in o vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-619 (linfoma de célula do manto humana) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrado em doses diferentes como mostrado em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA?7Ob.v28- —HC(A118C)-BMPEO-DMI1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 16), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 16), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo.
Os controles incluíram controles anti-
HER2 (thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 38B é m traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos do estudo com xenoenxerto Granta-519 (figura 38A e Tabela 16) mostrando eu não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. A figura 39 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in oe vivo em um modelo de xenoenxerto WSU-DLCL?2 (linfoma de células grandes, difusas) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB- MMAE) e/ou administtado em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 17), thio huMAZ79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 17) ou thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 o (Tabela 17), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram veículo (tampão sozinho) e controles anti-H[ER2 (thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)- MC-MMAF, thio hu-anti-c-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 40 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto humana) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1 ou MCvcPAB-MMAE)
e/ou administrado em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor.
Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA?79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a caga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 18) ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 18), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo.
Os controles incluíram controles antic=HER2 (thio hu-anticHER2-HC(A118C)- [ BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). “Thio” refere- sea anticorpo sumetido à engenharia com cisteina enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
A figura 41 mostra um traçado em gráfico de resultados de ensaio de proliferação de células in vitro com (A) BJAB, (B) Granta-519 ou (C) células de tumor WSU-DLCL?2, tratado com concentrações variadas de 0,001 to 10000 —ngdeTDC per ml, incluindo: (1) thio hu anticgD-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de controle, carga de 2,0 MMAE/Ab, (2) thio hu anticgD-HC(A118C)-MC- MMAFde controle, carga de 2,1 MMAF/Ab, (3) thio hu anticgD-HC(A118C)- BMPEO-DM1 de controle, carga de 2,1 DM1/Ab, (4) thio huMA79b.vi8- o HC(A118C)-MC-MMAF, carga de 1,91 MMAF/Ab, (5) thio huMA79b.v18- —HC(A118C)-BMPEO-DM1, carga de 1.8 DM1/Ab, e (6) thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, 2.0 carga de MMAE/Ab. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. “gD” refere-se a glicoproteína D.
A figura 42 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 238) de PRO283627 cDNA, sendo que SEQ ID NO: 235 é um clone designado como “DNASA48455” (também referido aqui como “cyno CD79b”). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b cynomolgus com os códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 43 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 239) derivada de uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 235 mostrada na figura 42.
A figura 44 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 240) de cadeia leve do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia leve do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10) com os códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 45 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: oe 241), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos, derivada de uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 240 mostrada na figura 44. Regiões variáveis (SEQ ID NO: 302) são regiões não sublinhadas.
A figura 46 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 242) de cadeia pesada do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10) —comos códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
A figura 47 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 243), omíitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) antes do códon de parada, derivada de uma sequência de codificação o de SEQ ID NO: 242 mostrada na figura 46. Regiões variáveis (SEQ ID NO: 301)são regiões não sublinhadas.
A figura 48 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 245) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) de anticorpo sumetido à engenharia com anticorpo CD79b anti-cyno (Thio-anti-cynoCD79b- HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de —alanina118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína. Aminoácido D na posição Eu 6 (sombreado na figura) de cadeia pesada pode, alternativamente, ser E. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não | sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo | sumetido à engenharia com cisteína. | A figura 49 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: | 300) e (B) a sequência de cadeia pesada(SEQ ID NO: 299) de anticorpo | CD79b anti-cyno sumetido à engenharia com cisteína (Thio-anticcynoCD79b- LC-V205C), em que uma valina na posição de Kabat 205 (valina na posição e sequencial 209) de cadeia leve foi alterada para cisteíina. Aminoácido D na posição EU 6 (sombreado na figura) de cadeia pesada pode, alternativamente, ser E. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes.
Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína.
A figura 50 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79b) (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração o de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes —(BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)- BMPEO-DM!1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 19), thio huMA?79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19), thio CD79b anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM!, a carga de droga foi aproximadamente
1.8 (Tabela 19), thio CD79b anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19) ou thio CD79b anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,86 (Tabela 19), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti- HER2 (thio hu-antrHER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio —hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF).
“Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. oe A figura 51 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in | vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79B (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de anti-CD79b TDCs com a porção de droga ligante BMPEO-DM1 administrada em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMAZ79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 20) ou thio anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,8 (Tabela 20), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor o durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1) e controles huMA?79b.v28 (thio huMA?79b.v28-HC(A118C) e controles anti-ccynoCD79b(ch10D10) (thio anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)). “Thio” refere-se a anticorpo sumetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos de fabricação para identificar composições úteis para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de usar estas composições de material para os mesmos.
Detalhes destes métodos, composições, kits e artigos de fabricação são fornecidos aqui.
LL TÉCNICAS GERAIS A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado ao contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia de células, bioquímica, e imunologia, que estão dentro do entendimento da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tal como, “Molecular Cloning: A o Laboratory Manual”, segundo edição (Sambrook et a/l., 1989); “Oligonucleotide | Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. |. Freshney, ed., 1987); “Métodos in Enzymology" (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausube! et a/l., eds., 1987, e atualizações periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et a/., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: À Laboratory Manual” (Barbas et a/., 2001). Wu. DEFINIÇÕES Para fins de interpretar este relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e sempre que apropriado, os termos usados no o singular também incluirão o plural e vice versa. No caso em que qualquer definição descrita conflite com qualquer documento incorporado aqui por referência, a definição descrita abaixo irá controlar. Um “marcador de superfície de células B" ou “antígeno de superfície de células B”, presentemente, é um antígeno expressado sobre a superfície da B célula que pode ser marcado com um antagonista que se liga a ele, incluindo mas não limitado a, anticorpos em um antígeno de superfície antígeno de células B ou uma forma solúvel de antígeno de superfície de células B capaz de antagonizar a ligação de um ligante ao antígeno de células B ocorrendo naturalmente. Marcadores de superfície de células B exemplificativos incluem os marcadores de superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, ver The Leukocyte Antígeno —FactsBook, 2º Edição. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Outros marcadores de superfície de células B incluem RP105, FcRH2, CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, oe FCRH6, BCMA, e 239287 de células B. O marcador de superfície de células B | de particular interesse é de preferência expressado em células B comparado to outros tecidos de mamífero não de células e pode ser expressado em ambas as células precursoras e células B maduras.
O termo “CD79b”, como usado aqui, refere-se a qualquer CD79b nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo humanos, macaco cynomolgus (cyno)) e roedores (.por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado ao contrário. CD79b humano também é referido aqui como “PRO36249” (SEQ |D NO: 2) e codificado pelo sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) também referido aqui o como “DNA225786”. CD79b de Cynomologus é também referido aqui como “cyno CD79b” ou “PRO283627” (SEQ ID NO: 239) e codificado pela sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 238) também referido aqui como “DNAS48455”. O termo “CD79b” engloba CD79b não processado de “comprimento completo” bem como qualquer forma de CD79b que resulte de processamento na célula. O termo também engloba variantes de CD79b ocorrendo naturalmente, por exemplo, variantes de emenda, variantes alélicas e isoformas. Os polipeptídeos de CD79b descritos aqui podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipeptideo de CD79b de rs o sequência nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos como o polipeptídeo correspondente de CD79b derivado da natureza.
Tais polipeptídeos de CD79b de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meio recombinante ou sintético.
The termo "polipeptídeos de CD79b de sequência nativa" engloba especificamente as formas secretadas ou truncadas ocorrendo naturalmente do | polipeptídeo de CD79b específico (por exemplo, uma sequência de domínio | extracelular), formas de variantes ocorrendo naturalmente (por exemplo, o alternativamente, formas emendadas) e variantes alélicas ocorrendo | naturalmente do polipeptídeo.
Em certas modalidades da invenção, os polipeptídeos CD79b de sequência nativa descritos aqui são polipeptídeos de sequência de nativa de comprimento completo compreendendo as sequências de aminoácidos de comprimento completo mostradas nas figuras anexas.
Códons de partida e de parada (se indicados) são mostrados em fonte negrito e sublinhados nas figuras.
Resíduos de ácido nucleico indicados como “N” nas figuras anexas são qualquer resíduo de ácido nucleico.
No entanto, enquanto o polipeptídeo de CD79b descrito nas figures anexas são mostrados começar com resíduos de metionina designados aqui como posição 1 de aminoácido o nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos de metionina localizados tanto a montante como a jusante da posição 1 de aminoácido nas ' figuras possam ser empregados como o resíduo de aminoácido de partida para | o polipeptídeo de CD79bs. | “MA79b” ou “anticorpo CD79b de murino” ou “anticorpo anti- | CD79b de murino” é usado aqui para referir-se especificamente ao anticorpo | —CD79b monoclonal de murino sendo que o anticorpo CD79b monoclonal de | murino compreende o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 | (Figuras 7A-B) e o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 | (Figuras 8A-B). O anticorpo CD79b monocional de murino pode ser adquirido de fontes comerciais tal como Biomeda (anti-anticorpos humanos CD79b; Foster City, CA), BDbioscience (anti-anticorpos humanos CD79b; San Diego, CA) ou Ancell (anti-anticorpos humanos CD79b; Bayport, MN) ou gerado de clone 3A2-2E7 de hibridoma American Type Culture Collection (ATCC) — designação do depósito número HB11413, depositado com o ATCC em 20 de | julho de 1993. “chMA79b” ou “anticorpo MA79b quimérico” é usado aqui para referir-se especificamente a anticorpo CD79b anti-humano quimérico (as oe previamente descrito no pedido US Nº 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006) sendo que o anticorpo anti-CD79b quimérico compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 4 (Figura 4). A cadeia leve de SEQ ID NO: 4 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e o domínio constante de cadeia leve de IgG1 humano.
O anticorpo quimérico anti-CD79b compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 (Figura 6). A cadeia —pesadade SEQ ID NO: 6 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) e o domínio constante de cadeia pesada de IgG1 humano. “Anti-cynoCD79b" ou “CD79b anti-cyno” é usado aqui para referir- | se a anticorpos que se ligam a cyno CD79b (SEQ ID NO: 239 de Figura 43) o (como previamente descrito no pedido US Nº. 11/462,336, depositado em 3 de agosto de 2006). “AnticcynoCD79b(ch10D10)" ou “ch10D10” é usado aqui para referir-se a anti-ccynoCD79b quimérico (como previamente descrito no pedido US Nº. 11/462,336, depositado em 3 de agosto de 2006) que se liga a cynoCD79b (SEQ ID NO: 239 de Figura 43). AnticeynoCD79b(ch10D10) ou ch10D10 é anticorpo anti-cynoCD79b quimérico que compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 241 (Figura 45). AnticcynoCD79b(ch10D10) ou ch1i0D10 compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 243 (Figura 47). “MA79b-graft” ou “anticorpo humanizado enxertado com MA79b-" ou “enxerto de huMA79b” é usado aqui para referir-se especificamente ao
| 43 | | | enxerto gerado pelo enxertamento de regiões hipervariáveis de anticorpo anti- CD79b murino (MA79b) no consenso humano aceptor de VL kappa | (huKl) e | consenso do subgrupo Il! humano VH (hulll) com R71A, N73T e L78A (Carter et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci, USA, 89:4285 (1992)) (Ver exemplo 1A e Figuras 7 (SEQIDNO:11)e8(SEQIDNO:15)). A “modificação” de um resíduo/posição de aminoácido, como usado aqui, refere-se a uma troca da sequência primária de aminoácidos como comparado a uma sequência de aminoácidos de partida, sendo que a troca oe resulta de uma alteração de sequência envolvendo ditos resíduo/posições de aminoácido, por exemplo, modificações típicas incluem substituição do resíduo (ou em dita posição) com outro aminoácido (por exemplo, uma substituição conservativa ou não-conservativa), a inserção de um ou mais (geralmente menos do que 5 ou 3) aminoácidos adjacentes a dito resíduo/posição, e deleção de dito resíduo/posição.
Uma “substituição de aminoácido”, ou variação do mesmo, refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido existente em uma sequência predeterminada (de partida) de aminoácidos com um resíduo de aminoácido diferente.
Geralmente e de preferência, a modificação resulta em alteração em pelo menos uma atividade físico- o bioquímica do polipeptíideo variante comparado a um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de partida (ou do “tipo selvagem”). por exemplo, no caso de um anticorpo, a atividade físico- bioquímica que é alterada pode ser afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação quando de uma molécula de marcação O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpo anti-CD79b monoclonal único (incluindo agonista, antagonista, anticorpos neutralizantes, anticorpo de comprimento completo ou intacto monoclonal), composições de anticorpo anti- CD79b com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, — anticorpos — multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles demonstrem a atividade biológica desejada), formados de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpo anti-CD79b de cadeia única, e fragmentos de anticorpo anti-CD79b (ver abaixo), incluindo fragmentos Fab, Fab, F(ab')) e Fv, diacorpos, anticorpos de domínio único (sdAbs), contanto que eles demonstrem a atividade biológica ou imunológica. O termo “imunoglobulina” (Ig) é usado intercambiável com o presente anticorpo.
Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade. oe O termo “anticorpo anti-CD79b” ou “um anticorpo que se liga a CD79b” refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar CD79b com afinidade suficiente tal que o anticorpo é útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico na marcação de CD79b. De preferência, a extensão de ligação de um anticorpo anti-CD79b para uma proteina não-CD79b, não relacionada, é menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD79b como medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD79b tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 OM, < 100 NM, < 10 nM, < 1 NM, ou € 0,1 NM. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD79b liga-se a um epítopo de CD79b que é conservado entre o CD79b de diferentes espécies.
Um "anticorpo isolado" é que é identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o — anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais de preferência mais do que 99% em peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N- sequência de aminoácidos terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) em homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou de não redução usando Coomassie blue ou, de preferência, coloração prata.
O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente.
Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
As 4 unidades básicas de anticorpo de cadeia é a glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias o pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas junto com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, e consequentemente contêm 10 sítios de ligação a antígeno, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens compreendendo 2-5 das 4 unidades básicas de cadeia junto com a cadeia J). No caso de IgGs, as 4 unidades de cadeia é geralmente cerca de 150,000 —daltons.
Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas umas às outras por uma ou mais ligação dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H.
Cada cadeia H e cadeia L também têm ligações dissulfeto regularmente espaçadas.
Cada o cadeia H tem no término-N, um domínio variável (Vx4) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias a e cadeias y e quatro domínios Cn domínios para os isotipos py e e.
Cada cadeia L tem um N-término, um domínio variável (V,) seguido por um domínio constante (Cr) em sua outra extremidade.
The V, é alinhado com o Vx e o C, é alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada (Cx1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares sejam para formar uma interface entre a cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada.
O pareamento de V,y e V, juntos forma um sítio de ligação a antígeno único.
Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical
Immunology, 8º edição, Daniel P.
Stites, Abba |. Terr and Tristram G.
Parslow (eds.), Appleton & Lange, Nonvalk, CT, 1994, página 71 e capítulo 6. A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser determinada para um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, baseado nas sequências de aminoácidos de seus domínios | constantes.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante | de suas cadeias pesadas (Cx), imunoglobulinas podem ser determinadas para | diferentes classes ou isotipos.
Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, oe I1gD, IgE, IgG, e IgM, tendo cadeias pesadas designadas a, d, e, y, e MU, respectivamene.
As classes y e a são ainda divididas em subclasses na base de diferenças relativamente menores na sequência e função de Cu, por exemplo, os humanos expressam as seguintes subclasses: I9G1, IgG2, 1gG3, 1gGA4, IgA1, e IgA2. A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais de cadeia pesada ou leve do anticorpo.
O domínio variável de cadeia pesada pode ser referido como “VH.” O domínio variável de cadeia leve pode ser referido como “VL.” Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de o ligação a antígeno.
O termo "variável" refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente na sequência entre anticorpos.
O domínio V media a ligação a antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular.
No entanto, a variabilidade não é igualmente distribuída através do espaço de 110 aminoácidos dos domínios variáveis.
Em vez disso, as regiões V consistem de estiramentos relativamente não variantes denominados regiões de estrutura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de regiões de variabilidade extrema denominadas “regiões hipervariáveis" que são cada uma de 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha B, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam conexão em laços, e em alguns casos fazendo parte de, a estrutura em folha B. As regiões —hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelo FRs e, com as regiões hipervariáveis de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (ver Kabat et al, | Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, | oe National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a antígeno, mas demonstram várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Um anticorpo “intacto” é um que compreende um sítio de ligação a antígeno bem como uma C, e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, ChW1, C2 e Ch3. Os domínios constantes podem domínios de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácidos dos mesmos. De preferência, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras. o Um “anticorpo nu” para os presentes fins, é um anticorpo que não é conjugado a um rótulo ou porção citotóxica.
h "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a ligação a antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmento de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab'),, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (ver patente US
5.641.870, exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 ); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende um sítio de ligação a antígeno do anticorpo intacto e assim retém a capacidade para ligar-se a antígeno.
A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", e um fragmento residual "Fc", uma designação refletindo a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L completa junto com o domínio de região variável da cadeia H (V4), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação a antígeno, isto é., ele tem um único sítio de ligação a antígeno. O oe tratamento com pepsina de um anticorpo dá um fragmento grande único F(ab') que corresponde grosseiramente a dois fragmentos Fab ligados a dissulfeto tendo atividade de ligação a antígeno bivalente e é ainda capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos Fab' diferem do fragmento Fab por ter poucos resíduos adicionais no término carbóxi do domínio Ch1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab-SH é a presente designação para Fab' em que um resíduo(s) de cisteina dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. O fragmento F(ab'), de anticorpos originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de articulação entre eles. Outras copulações químicas de fragmento e de anticorpos são também conhecidas.
O fragmento Fc compreende as porções terminas carbóxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, cuja região é também a parte reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém a sítio de ligação e de reconhecimento de antígenos completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e leve em associação não-covalente, firme. Em uma espécie Fv (scFv) de cadeia única,
um domínio variável de cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante de peptídeo flexível tal que as cadeias leves e cadeia pesadas podem associar-se em uma estrutura “dimérica” análoga à de em uma espécie de duas cadeias de Fv, da duplicação destes —doisdomínios surgem seis laços hipervariáveis (3 laços cada um de cadeia H e L) que contribuem para os resíduos de aminoácidos para ligação a antígeno e conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo o somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligação inteiro.
"Cadeia de Fv única" também abreviada como "sFv" ou “scFv” são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpo Vy e V. conectados em uma cadeia de polipeptídeo única. De preferência, o —polipeptídeo de sFy compreendem ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vy e V, que possibilitam o sFv formar a estrutura desejada para ligação a antígeno. Para um estudo de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, o New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmentos compreendem o domínio variável de pesada-cadeia (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Os fragmentos de anticorpos menores são preparado por construindo fragmentos sFv (ver o — parágrafo precedente) com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios Vxy e V, tal que a inter-cadeia, mas não a intra-cadeia, pareando os domínios V é obtida, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento tendo dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois sítios “cruzando” os fragmentos sFvy em que os domínios V"y e V, de dois anticorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeo diferentes. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; Hudsonetal, Nat Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et a/., Nat. Med. 9:129-134 (2003). O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um oe anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos dos indivíduos compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações ocorrendo naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra uma determinante única no antígeno. Além disso, para sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. o O "monoclonal" modificador não deve ser construído como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, o anticorpo monocional útil na presente invenção pode ser preparado pela metodologia de hibridoma primeiramente descrita por Kohler et al/., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito usando métodos DNUm recombinante em células de planta ou de animais eucarióticas, bacterianas (ver, por exemplo, patente US. Nº. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também pode também ser isolado de bibliotecas de anticorpos de fago usando as técnicas descritas em Clackson et a/., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et a/., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os presentes anticorpos monocionais incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção de cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante das cadeia(s) é idêntico com ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada oe (ver patente U.S.
Nº. 4.816.567; e Morrison et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo o domínio variável de sequência de ligação a antígeno derivadas de um primata não-humano (por exemplo, Old
World Macaco, Ape etc), e sequências de região constante humanas. "Formas humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não-humano.
Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região o hipervariável de espécies não-humanas (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade de anticorpo, afinidade e capacidade desejadas.
Em alguns casos, os resíduos da região (FR) da estrutura de imunoglobulina humana são substituídos por resíduos —não-humanos correspondentes.
Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no — anticorpo recipiente ou no anticorpo doador.
Estas modificações são feitas para ainda para aprimorar o desempenho do anticorpo.
Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos de FRs são os da sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também, opcionalmente, compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de — imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para outros detalhes, ver Jones et a/l., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et a/., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver também os seguintes artigos e referências de estudo citados aqui: Vaswani e o Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994).
“Thio” quando usado aqui refere-se a um anticorpo sumetido à engenharia com cisteina enquanto “hu” quando usado aqui refere-se a um anticorpo humanizado.
Um “anticorpo humano” é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou é feita usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos como descrito aqui. Esta definição de anticorpo humano exclui o especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação a antígeno não-humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991). Também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos são métodos descritos in Cole et al, — Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Ver também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados administrando o antígeno a um animal transgênico que é modificado para produzir tais anticorpos em resposta a desafio antigênico, mas cujos loci endógenos é desabilitado, por exemplo, xenocamundongo imunizado (ver, por exemplo, patente U.S.
Pat.
Nºs. 6.075.181 e 6.150.584 com respeito à tecnologia de XENOMOUSE"”). Ver também, por exemplo, Li et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci USA, 103:3557-3562 (2006) com respeito a anticorpos humanos gerados por uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.
O termo “região hipervariável”, “HVR”, ou “HV”, quando usado aqui refere-se às regiõês de um domínio variável de anticorpo que são oe hipervariáveis na sequência e/ou formam laços estruturalmente definidos.
Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). Um número de delineações de região hipervariável está em uso e é englobado aqui.
As regiões determinantes da complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed.
Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se ao contrário à localização dos laços estruturais (Chothia e Lesk J.
Mol.
Biol. 196:901-917 (1987)). A extremidade do laço CDR-H1 de Chothia quando numerada usando o a convenção da numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento do laço (isto é porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, as extremidades do laço em 32; se somente 35A está presente, as extremidades do laço em 33; se ambos 35A e 35B estão presentes, as extremidades do laço em 34). As regiões hipervariáveis ADM representam um compromisso entre os laços estruturais de CDRs de Kabat e de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpo Oxford Molecular's ADM.
As regiões hipervariáveis de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis.
Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são indicados abaixo. Laço Kabat AbM Chothia Contato un L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-LS56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 —L89197 LB89LO7 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Numeração de Kabat) oe Hi H31-H35 —H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 Ha Ho5-H102 Hos-H102 Ho5-H102 H93-H101 As regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hipervariáveis estendidas” como a seguir: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra para cada uma destas definições.
“Estrutura” ou resíduos “FR” são os resíduos de domínio variável e diferentes dos resíduos de região hipervariável presententemente definidos.
O termo “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat" ou “numeração da posição de aminoácidos como em Kabat”, e variações do mesmo, refere-se ao sistema de numeração usado para domínio variável de cadeia pesada ou domínio variável de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º —Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear atual pode conter alguns aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou CDR de domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um inserto de aminoácido único (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc de acordo com Kabat) depois resíduo 82 FR de cadeia pesada.
A numeração de resíduos de —Kabatpode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento a regiões de homologia da sequência d o anticorpo com a sequência numerada de Kabat “padrão”
O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se oe referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et a/., Sequences of Immunological Interest. 5º Ed.
Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice de EU” é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU descrito em Kabat et a/., supra). O “índice de EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo EU de IgG1 humano.
A menos que descrito ao contrário aqui, referências a números de resíduo no domínio variável de anticorpos significa numeração de resíduo pelo sistema de o numeração de Kabat.
A menos que descrito ao contrário aqui, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significa numeração de resíduos pelo sistema de numeração de EU (por exemplo, ver Pedido
Provisório US Nº. 60/640,323, Figuras para numeração de EU). Um anticorpo “amadurecido por afinidade” é um com uma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta em um — aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo para antígeno, comparado a um anticorpo parente que não possui esta(s) alteração(ões). Anticorpos amadurecidos por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno de marcação.
Anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica.
Marks et al.
Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem maturação de afinidade embaralhando os domínios VH e VL.
A mutagênese aleatória de HVR e/ou resíduos na estrutura é descrita por: Barbas et al.
Proc Nat.
Acad.
Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al.
Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al.
J.
Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al, J.
Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J.
Mol.
Biol. 226:889-896 (1992). Um anticorpo “de bloqueio" ou um anticorpo “antagonista” é um que oe inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual ele se liga.
Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.
Um “anticorpo agonista”, como usado aqui, é um anticorpo que imida pelo menos uma das atividades funcionais do polipeptídeo de interesse.
Um “anticorpo dependente da espécie”, por exemplo, um anticorpo IgE antirhumano de mamífero, é um anticorpo que tem uma ligação de afinidade mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem para o homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero.
Normalmente, o anticorpo dependente da espécie “liga-se especificamente” a o um antígeno humano (isto é, tem um valor (Kd) de afinidade de ligação de não —maisdo que cerca de 1 x 10” M, de preferência não mais do que cerca de 1 x 10º e mais de preferência não mais do que cerca de 1 x 10º M),mas tem uma afinidade de ligação para o homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cercas de 500 vezes, ou pelo menos cerca 1000 vezes, mais fraca do que sua — afinidade de ligação para o antígeno humano.
O anticorpo dependente da espécie pode ser de qualquer um de múltiplos tipos de anticorpos como definido acima, mas de preferência é um anticorpo humano ou humanizado “Afinidade de ligação” geralmente refere-se à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único da molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado ao contrário, como usado aqui, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade intrínseca de ligação que reflete uma interação 1:1 entre elementos do par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). À afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os presentemente descritos.
oe Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam o antígeno lentamente e tendem a dissociar-se prontamente, enquanto anticorpos de alta geralmente ligam antígeno mais rápido e tendem a permanecer mais ligados. Uma variedade de métodos de medir afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas são descritas a seguir.
“Ou melhor” quando usado aqui para referir-se a afinidade de ligação refere-se a uma ligação mais forte entre a molécula e seu parceiro de ligação. “Ou melhor” quando usado aqui refere-se a uma ligação mais forte, representada por um valor Kd numérico menor. Por exemplo, um anticorpo que o tem uma afinidade para um antígeno de “0.6 nM ou melhor”, a afinidade do — anticorpo para o antígeno é <.6 nM, isto é, .59 nM, .58 nM, .57 nM etc. ou qualquer valor menor do que 0.6 nM.
Em uma modalidade, “Kd” ou “valor Kdde acordo com esta invenção é medido por uma ligação radiorrotulada a ensaio de antígeno (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito — pelo seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação da solução de Fabs para antígeno equilibrando Fab com uma concentração mínima de antígeno rotulado com (1251) na presença de uma série de titulação de antígeno não rotulado, | então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo
| 58 | anti-Fab (Chen, et a/., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, as placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappe!l Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com2% (p/v)de albumina de soro bovino em PBS durante duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC). Em uma placa não- absorvente (Nunc %269620), 100 pM ou 26 pM -antígeno são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a oe avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar durante um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para assegurar que o equilíbrio é alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, para uma hora). A solução é então removida e a placa é lavada oito vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS. Quando as placas secaram, 150 ul/reservatório de cintilante (MicroScint-20; Packard) são adicionados e as placas são contadas em um contador gama Topcount (Packard) durante dez minutos. Concentrações de cada Fab, que o deram menos do que ou igual a 20% de ligação máxima, são escolhidas para uUusoem ensaios de ligação competitivos. De acordo com outra modalidade o Kd ou valor Kd é medido usando ensaios de ressonância plasmon e superfície usando um BlAcore!M-2000 ou um BlAcore!M-3000 (BlAcore, Inc. Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 de antígeno imobilizado em —-10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrano —carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-ethyl- N* (3-dimetilaminopropil)-carbodiimide (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10mM, pH 4,8, em Sug/ml (-0,2uM) antes de injeção em uma taxa de
MED fluxo de Sul/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína copulada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com
0.05% Tween 20 (PBST) a 25ºC em uma taxa defluxo de aproximadamente | 25ul/min. Taxas de associação (ligado) e taxas de dissociação (Kdesligado) São | calculadas usando um modelo de ligação Langmuir um-para-um simples | (BlAcore Evaluation Software versão3.2) por ajuste simultâneo do sensorgrama oe de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a relação Kigada/Kdesligada por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J.
Mol Biol 293:865-881. Se a taxa ligada exceder 10º M* S' pelo ensaio de ressonância plasmon acima, então a taxa ligado pode ser determinada usando uma técnica de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou decréscimo na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa banda 16 nm) a 25ºC do anticorpo anti-antígeno de 20nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medida em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro o SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta vermelha de agitação.
Uma “taxa ligada (on-rate)" ou “taxa de associação” ou “taxa associação” ou “Kigado' de acordo com esta invenção também pode ser determinada com a mesma técnica de ressonância plasmon de superfície descrito acima usando um BlAcore!M-2000 ou um BlAcore M-3000 (BlAcore, Inc. Piscataway, NJ) como descrito acima.
A frase “substancialmente similar,” ou “substancialmente a mesma”, como usado aqui, indica um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da MmMPEEIEEIIDDEDEDEDIEIDIDID—————>>—>>>>>>>b>o
| invenção e o outro associado com o anticorpo de referência/comparador) tal | que um dos versados na técnica poderiam considerar a diferença entre os dois valores a ser de pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico dentro | do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, | 5 —valoresKd) A diferença entre ditos dois valores é de preferência menos do que | cerca de 50%, de preferência 40%, de preferência menos do que cerca de 30%, de preferência menos do que cerca de 20%, de preferência menos do que cerca de 10% como uma função do valor para o anticorpo de o referência/comparador. A frase “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente”, como usado aqui, indica um grau suficientemente alto de diferença | entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associado com o anticorpo de referência/comparador) tal que um dos versados na técnica poderiam considerar a diferença entre os dois valores a serem de significado estatístico dentro do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, valores Kd, resposta de HAMA). A diferença entre ditos dois valores é de preferência maior do que cerca de 10%, de preferência maior do que cerca de 20%, de preferência maior o do que cerca de 30%, de preferência maior do que cerca de 40%, de preferência maior do que cerca de 50% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparador.
Um “antígeno” é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode ligar-se seletivamente. O antígeno de marcação pode ser polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto ocorrendo naturalmente ou sintético. De preferência, o antígeno de marcação é um | polipeptídeo.
Uma “estrutura humana aceptora” para os presentes fins é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de VL RM——nnnmn—np—n——nnDDDDLNEINDNDDDEEEEDEDEIMIMILILI—————————— > ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana, ou de uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura aceptora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter trocas de sequências de aminoácidos pré-existentes. Onde trocas de aminoácidos pré-existentes estão presentes, de preferência não mais do que 5 e de preferência 4 ou menos, ou 3 ou menos, trocas de aminoácidos pré- existentes estão presentes. Onde trocas de aminoácidos pré-existentes estão o presentes em um VH, de preferência as trocas são somente em três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, a estrutura humana aceptora VL é idêntica na sequência para a sequência de estrutura de imunoglobulina humana VI ou sequência de estrutura de consenso humana.
“Estrutura de consenso humana” é a estrutura que representa o resíduo de aminoácido ocorrendo mais comumente em uma seleção de imunoglobulina humana VL ou sequências de estrutura de VH. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo o de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como in Kabat et al. Em uma modalidade, para o VL, o subgrupo é subgrupo kappa | como in Kabat et al. Em uma modalidade para o VH. O subgrupo é subgrupo Ill como em Kabat ET AL.
Uma “estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH" compreende a sequência de consenso obtida de uma sequência de aminoácidos no subgrupo ll de variável pesada de Kabat et al. Em uma modalidade, sequência de aminoácidos da estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH compreende pelo menos a porção ou todas de cada uma das seguintes sequências: EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143)-H1-
RMSP
WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144)-H2- | RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145)-H3-WGQGTLVTVSS | (SEQ ID NO: 146). A “estrutura de consenso do subgrupo | de VL”" compreende a — sequência de consenso obtida de uma sequência de aminoácidos no subgrupo | de kappa de variável leve de Kabat et al.
Em uma modalidade, sequência de aminoácidos da estrutura de consenso do subgrupo | de VL compreende pelo menos uma porção ou toda de cada uma das seguintes sequências: oe DIQMTQAQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQID NO: 140)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142). Uma “estrutura humana não modificada” é a estrutura humana que tem a mesma sequência de aminoácidos como a estrutura humana aceptora, por exemplo, desprovida de humanos em substituição(ões) de aminoácidos —não-humanos na estrutura humana aceptora.
Uma “região hipervariável alterada” para os presentes fins é a região hipervariável compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma a cerca de 16) substituição(ões) de aminoácidos. e Uma “região hipervariável não modificada”, com os propósitos desta, é uma região hipervariável com a mesma sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano do qual ela foi derivada, isto é, uma que não tem uma ou mais substituições de aminoácidos nela.
Um anticorpo “que liga" um antígeno de interesse, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo alvo associado a tumor, é um que liga o antígeno com afinidade suficiente, de maneira tal que o anticorpo seja usado como um agente terapêutico no alvejamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não reaja de maneira cruzada significativamente com outras proteínas.
Em tais modalidades, a extensão da ligação do anticorpo a uma tt
63 | proteína “não alvo” será menos que cerca de 10 % da ligação do anticorpo a sua proteína alvo particular da maneira determinada por análise de separação de célula ativada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA).
Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica" ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo particular alvo significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. Ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a e ligação de uma molécula comparada à ligação de uma molécula controle, que em pgeralé uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação.
Por exemplo, ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para" um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo particular alvo, da maneira aqui usada, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10º M, e alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10” M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10º? M ou mais. Em uma modalidade, o termo “ligação específica” refere-se a ligação onde uma molécula liga-se a um polipeptídeo particular ou epítopo em um polipeptídeo particular sem ligar-se substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
Um anticorpo que “inibe o crescimento de células de tumor que RMEEEEn—nornDDDEEDEDEDEIEICDD———————— nn bb expressam um polipeptídeo CD79b” ou um anticorpo “inibitório de crescimento” é um que resulta na inibição de crescimento mensurável de células de câncer que expressam ou superexpressam o polipeptídeo CD79b apropriado. O polipeptídeo CD79b pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso na — superfície de uma célula cancerígena ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma célula cancerígena. Anticorpos anti-CD79b inibitórios de crescimento preferidos inibem o crescimento de células de tumor que expressam CD79b em mais que 20 %, preferivelmente de cerca de 20 % a e cerca de 50 %, e ainda mais preferivelmente, em mais que 50 % (por exemplo, de cerca de 50 % a cerca de 100 %) comparado ao controle apropriado, o controle sendo tipicamente células de tumor não tratadas com o anticorpo que está sendo testado. Em uma modalidade, a inibição de crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 ug/mL ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura de célula, onde a inibição de crescimento é determinada 1-10 dias após exposição das células de tumor ao anticorpo. A inibição de crescimento de células de tumor in vivo pode ser determinada de várias maneiras tal como é descrito na seção de exemplos experimentais a seguir. O anticorpo é inibitório de crescimento in vivo se administração do o anticorpo anti-CD79b em cerca de 1 ug/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resultar em redução no tamanho do tumor ou proliferação de célula de tumor em cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente em cerca de 5 a 30 dias. Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celular programada determinada pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célula é usualmente uma que superexpressa um polipeptídeo CD79b. Preferivelmente, a célula é uma célula de tumor, por exemplo, uma célula
RMSP hematopoiética, tal como uma célula B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monócito, plaqueta ou eritrócito. Vários métodos estão disponíveis para avaliar | os eventos celulares associados a apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida por ligação de anexina; fragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de escada de DNA; e condensação nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento em células hipodiplóides. Preferivelmente, o anticorpo que induz apoptose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferivelmente 6 cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, na | 10 indução de ligação de anexina com relação à célula não tratada em um ensaio de ligação de anexina.
Um anticorpo que “induz morte celular” é um que faz com que uma célula viável se torne não viável. A célula é uma que expressa um polipeptídeo CD79b e é de um tipo celular que expressa especificamente ou superexpressa um polipeptídeo CD79b. A célula pode ser célula cancerosa ou normal do tipo celular particular. O polipeptideo CD79b pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso na superfície de uma célula cancerígena ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma o célula cancerígena. A célula pode ser uma célula cancerígena, por exemplo, uma célula B ou célula T. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetoras imunes para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, o ensaio para morte celular pode ser realizado usando soro inativado pelo calor (isto é, —na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunes. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, a perda de integridade de membrana avaliada pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD pode
PMDE ser estimada com relação a células não tratadas. Anticorpos que induzem morte celular preferidos são aqueles que induzem absorção de PI no ensaio de captação de PI em células BT474. “Funções efetoras” do anticorpo referem-se àquelas atividades — biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou sequência de região Fc variante de aminoácido) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor o Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infrarregulação de receptores superficiais celulares (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B. O termo “região Fc" é aqui usado para definir uma região C terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de | uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia | pesada de IgG humana é usualmente definida para estender de um resíduo de | aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila deste. À lisina do terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) o da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou modificando recombinantemente por engenharia o ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo, Dessa maneira, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem nenhum resíduo K447 removido e populações de anticorpos com uma —misturade anticorpos com e sem resíduo K447. Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. “Funções efetoras” exemplificativos incluem ligação C1g, CDC, ligação de receptor Fc, ADCC, fagocitose, infrarregulação
RR de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B, BCR), etc. Em geral, tais funções efetoras exigem que a região Fc combine com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas usando múltiplos ensaios da maneira revelada, por exemplo, aquinas definições.
Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem e uma região Fc de I9gG1 humana de sequência nativa (Alotipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de I9gG4 humana de sequência nativa bem como variantes de ocorrência natural destas.
Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituição(s) de aminoácido(s). Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado à uma região Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo pai, por exemplo, de o cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de cercade um a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo pai. A região Fc variante possuirá aqui preferivelmente pelo menos cerca de 80 % de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo pai, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de homologia a isso, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % de homologia a isso.
“Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada nos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, Rh
68 | células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite estas | células efetoras citotóxicas se ligarem especificamente a uma célula alvo que | carrega antígeno e matar subsequentemente a célula alvo com citotoxinas. Os | anticorpos “armam” as células citotóxicas e são absolutamente exigidos para tal exterminação. As células primárias para mediar ADCC, células NK, | expressam apenas FcyRiIll, ao passo que monócitos expressam FeyRI, FeyRiIl ' e FCyRIll. A expressão de FCcR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 ) (1991). Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito em patente U.S.
5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetoras usadas para tais ensaios incluem células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por | 15 exemplo, em um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998). "Fc receptor" ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Ú Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. o Além do mais, um FcR preferido é um que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FeyRI, FeyRII e FeyRiII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas unidas destes receptores. Receptores FeyRII incluem FCyRIIA (um "receptor de ativação") e FeyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos destes. O receptor de ativação FCyRIIA contém um motivo de ativação a base de tirosina de imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FCyRIIB contém um motivo de inibição a base de tirosina de imunorreceptor (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver revisão M. em Daêron, Annu. Rev.
Immunol. 15:203-234 (1997)). FCcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu.
Rev.
Immunol. 9:457-492 (1991); Cape! et al., Inmunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J.
Lab.
Clin.
Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a ser identificados no futuro, são aqui incluídos pelo termo "FCcR". O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Guyer et al., J.
Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J.
Immunol. 24:249 (1994)). Ligação no peptídeo FcRn humano in vivo e ligação de FcRn de o meia vida sérica de humano de alta afinidade polipeptídeos podem ser ensaiadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens celulares humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas para os quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados.
WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com maior ou menor ligação a FcRs.
Ver também, por exemplo, Shields et al.
J.
Biol.
Chem. 9(2):6591-6604 (2001). | “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras.
Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIll e realizam funções efetoras de ADCC. o Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), células exterminadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.
As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue. “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se àlisede uma célula alvo na presença de complemento.
A ativação do caminho de complemento clássico é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1qg) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados no seu antígeno cognato.
Para determinar a ativação do complemento,
; | um ensaio CDC, por exemplo, da maneira descrita em Gazzano-Santoro et al, | J.
Immunol.
Métodos 202:163 (1996), pode ser realizado.
Variantes de polipeptídeo com sequências de aminoácidos de região Fc alteradas (polipeptídeos com uma região Fc variante) e maio ou menor capacidade de ligação de Ciq são descritas, por exemplo, em patente U.S. 6.194.551 B1 e WO 1999/51642. Ver também, por exemplo, Idusogie et al.
J.
Immunol. 164: 4178-4184 (2000). O termo “anticorpo que compreende região Fc” refere-se a um oe anticorpo que compreende uma região Fc.
O C-terminal lisina (resíduo 447 de — acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removido, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou modificando recombinantemente por engenharia do ácido nucleico que codifica o anticorpo.
Dessa maneira, uma composição que compreende um anticorpo com uma região Fc de acordo com esta invenção pode compreender um anticorpo com K447, com todo K447 removido, ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. O "domínio extracelular" do polipeptídeo CD79b ou “ECD” refere- se a uma forma do polipeptídeo CD79b que é essencialmente livre da o transmembrana e domínios citoplasmáticos.
Em geral, um ECD de polipeptídeo ' CD79b terá menos que 1 % de tais transmembrana e/ou domínios citoplasmáticos e, preferivelmente, terá menos que 0,5 % de tais domínios.
Será entendido que quaisquer domínios de transmembrana identificados para os polipeptídeos CD79b da presente invenção são identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar qual tipo de domínio hidrofóbico.
Os limites exatos de um domínio transmembrana podem variar, mas muito provavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos em | qualquer extremidade do domínio da maneira inicialmente aqui identificada. | Portanto, opcionalmente, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b | | | rá pode conter de cerca de 5 ou menos aminoácidos em qualquer lado do limite domínio transmembrana/domínio extracelular da maneira identificada nos exemplos ou especificação e tais polipeptídeos, com ou sem o peptídeo sinal associado, e ácido nucleico que codifica-os, são contemplados pela presente invenção.
O local aproximado dos “peptídeos sinais” do polipeptídeo CD79b aqui revelado pode ser mostrado na presente especificação e/ou as figuras que acompanham. Entretanto, nota-se que o limite do terminal C de um peptídeo oe sinal pode variar, mas muito provavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite do terminal C do peptídeo sinal, da maneira inicialmente aqui identificada, em que o limite do terminal C do peptídeo sinal pode ser identificado de acordo com critérios rotineiramente | empregados na técnica para identificar esse tipo de elemento sequência de aminoácidos (por exemplo, Nielsen et a/l., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) e von Heinje et al, Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)) Além do mais, também reconhece-se que, em alguns casos, a clivagem de uma sequência sinal de um polipeptídeo secretado não é completamente uniforme, resultando em mais que uma espécie secretada. Estes polipeptídeos maduros, onde o peptídeo sinal é o clivado em não mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite do terminal C do peptídeo sinal da maneira aqui identificada, e os polinucleotídeos que os codificam, são contemplados pela presente invenção.
"Variante do polipeptideo CD79b" significa um polipeptídeo CD79b, preferivelmente um polipeptídeo CD79b ativo, da maneira aqui definida com pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de polipeptideo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada (tal como aquela codificada por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptideo CD79b de comprimento total). Tais variantes de polipeptideo CD79b incluem, por exemplo, polipeptídeos CD79b em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, nos terminais N ou C da sequência de aminoácidos nativa de comprimento total.
Em geral, uma variante de oe polipeptídeo CD79b terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos, com uma sequência de polipeptideo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo —CD79b que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio | extracelular de um polipeptíideo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira o aqui revelada.
Em geral, variantes de polipeptídeos CD79b têm pelo menos —cercade 10 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de comprimento —oumais.
Opcionalmente, variantes de polipeptídeos CD79b terão não mais que uma substituição conservativa de aminoácido comparado à sequência de polipeptídeo CD79b nativa, alternativamente não mais que 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9 ou 10 substituições conservativas de aminoácido comparado à sequência de polipeptídeo CD79b nativa.
"Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos" com relação a um peptídeo ou sequência de polipeptídeo, isto é, sequências de polipeptídeo CD79b aqui identificadas, é identificado como a porcentagem de — resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no peptídeo ou sequência de polipeptídeo específico, isto é, sequência de polipeptíideo CD79b, após alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade o de sequência, e não considerar quaisquer substituições conservativas como i 10 parte da identidade de sequência. Alinhamento com propósitos de determinar percentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser atingido de várias maneiras que são conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente tais como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, incluindo quaisquer algorítimos necessários para atingir alinhamento máximo com relação ao comprimento total das sequências que são comparadas. Entretanto, com propósitos aqui, os valores de % de identidade de sequência de o aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na tabela 1 a seguir. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na tabela 1 a seguir foi depositado com documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob Nº de Registro de Direito Autoral US TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na tabela 1 a seguir. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um o O OO O OSS SS sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN- 2 e não variam. Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de — sequênciade aminoácidos, o % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (pode ser alternativamente fraseada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de o identidade de sequência de aminoácidos para, com, ou contra uma dada | sequência de aminoácidos B) é calculado da maneira a seguir: | 100 vezes a fração X/Y | em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados | como pares idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Percebe-se que onde o comprimento de : sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento de sequência de aminoácidos B, o % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B 2 não será igual ao % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. o "Polinucleotídeo variante de CD79b" ou “sequência de ácidos —nucleicos variante CD79b” significa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD79b, preferivelmente um polipeptídeo CD79b ativo, da maneira aqui definida e que tem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de — comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer
STD EEE outro fragmento de uma sequência de polipeptideo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada (tal como aquela codificada por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptídeo CD79b de comprimento total). Em geral, um | 5 polinucleotíideo variante de CD79b terá pelo menos cerca de 80 % de | identidade de sequência de ácidos nucleicos, alternativamente pelo menos | cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de | oe sequência de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de polipeptideo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem a sequência sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptíideo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada.
Variantes não incluem a sequência de nucleotídeo nativo.
Em geral, polinucleotídeos variantes de CD79b são pelo menos o cerca de 5 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, —510,520,530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento, em que neste contexto o termo
“cerca de” significa o comprimento da sequência de nucleotídeo referenciado mais ou menos 10 % daquele comprimento referenciado. "Percentual (%) de identidade de sequência de ácidos nucleicos" com relação a sequências de ácido nucleico que codificam CD79b aqui identificadas é definido como a porcentagem de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos na sequência de ácidos nucleicos CD79b de interesse, após alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de e sequência. Alinhamento com propósitos de determinar percentual identidade de sequência de ácidos nucleicos pode ser atingido de várias maneiras que são conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Entretanto, com propósitos aqui, os valores de % de identidade de sequência de ácidos nucleicos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na tabela 1 a seguir. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na tabela 1 a seguir foi o depositado como documentação do usuário no U.S. Copyright Office, “Washington D.C., 20559, onde está registrado em U.S. Copyright Registration No. TXUS10087. O programa ALIGN-2 é publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na tabela 1 a seguir. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de ácidos nucleicos, o % de identidade de sequência de ácidos
, nucleicos de uma dada sequência de ácidos nucleicos C para, com, ou contra uma dada sequência de ácidos nucleicos D (que pode ser alternativamente | fraseada como uma dada sequência de ácidos nucleicos C que tem ou |
| compreende um certo % de identidade de sequência de ácidos nucleicos para, | | 5 — com, ou contrauma dada sequência de ácidos nucleicos D) é calculado da | | maneira a seguir: | 100 vezes a fração W/Z | em que W é o número de nucleotídeos pontuados como pares | oe idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de C e D, e onde Z é o número total de nucleotídeos em D.
Percebe-se que onde o comprimento de sequência de ácidos nucleicos C não é igual ao comprimento de sequência de ácidos nucleicos D, o % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de C para D não será igual ao % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de D para C.
A menos que de —outramaneira especificamente declarada, todos os valores do % de identidade de sequência de ácidos nucleicos aqui usados são obtidos da maneira descrita no parágrafo imediatamente precedente usando o programa de computador ALIGN-2. o Em outras modalidades, polinucleotídeos variantes de CD79b são — moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo CD79b e que são capazes de hibridizar, preferivelmente em condições de hibridização e de lavagem rigorosas, nas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada.
Variantes de polipeptíideos CD79b podem ser aqueles que são codificados por um —polinucleotídeo variante de CD79b.
O termo “região de codificação de comprimento total” quando usado com relação a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD79b refere-se à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo CD79b de comprimento total da invenção (que é frequentemente mostrado entre códons inicial e de parada, inclusive dele, nas figuras que acompanham). O termo “região de codificação de comprimento total” quando usado com relação a um ácido nucleico depositado em ATCC refere-se à porção que codifica — polipeptideo CD79b do DNAc que está inserido no vetor depositado com a ATCC (que é frequentemente mostrado entre códons inicial e de parada, inclusive nele, nas figuras que acompanham (códons inicial e de parada estão em negrito e sublinhados nas figuras)). | o "Isolado", quando usado para descrever os múltiplos —polipeptídeos CD79b aqui revelados, significa polipeptídeo que foi identificado | | e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. | | Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que | interferem tipicamente com usos terapêuticos para o polipeptídeo, e podem | incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de Sequência de aminoácidos N | terminal ou interna pelo uso de uma centrífuga sequenciadora, ou (2) até a homogeneidade por SDS-PAGE em condições de não redução ou redução ' o usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração prata. O polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ em células recombinantes, uma vez que pelo | menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo CD79b não estará presente. Entretanto, em geral, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Um ácido nucleico que codifica polipeptídeo CD79b "isolado" ou outro ácido nucleico que codifica polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula contaminante de ácido nucleico com a qual está em geral associada à fonte natural do ácido nucleico que codifica polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo isolado é diferente da forma ou ambiente no qual é encontrada na natureza. Portanto, moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo isolado são distinguidas da molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo específico uma vez que existem em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo isolado inclui moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo contido em células que expressam em geral o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossômico diferente daquele das oe células naturais.
O termo "sequências controle" refere-se às sequências de DNA necessárias para a expressão de um sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo.
Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e melhoradores.
O ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando é colocado em . uma relação funcional com uma outra sequência de ácidos nucleicos. Por o exemplo, DNA para uma pré sequência ou líder secretório está operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se estiver expresso como uma pré- proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou melhorador está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de maneira a facilitar a tradução. Em geral, "operavelmente ligado" significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, melhoradores não têm que ser contíguos. A ligação realizada por ligação em sítios de restrição convenientes.
Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligantes são usados de acordo com a prática convencional.
A "rigorosidade" de reações de hibridização é facilmente — determinável pelos versados na técnica, e em geral é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal.
Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas mais altas para anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtas precisam de | oe temperaturas mais baixas.
Em geral, a hibridização dependente da capacidade do DNA desnaturado reanelar quando as fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão.
Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre a sonda e sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada.
Portanto, em decorrência disto, temperaturas relativas mais altas tenderiam a tornar as condições de reação mais estritas, enquanto temperaturas mais baixas menos ainda.
Para detalhes adicionais e explicação da rigorosidade de reações de hibridização, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience | Publishers, (1995). o "Condições rigorosas" ou "condições de alta rigorosidade", da maneira aqui definida, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa concentração iônica e alta temperatura para lavar, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M /citrato de sódio 0,0015 M /dodecil sulfato de sódio 0,1 % a 50ºC; (2) empregam durante a hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50 % de (v/v) formamida com albumina sérica bovina 0,1 % /Ficoll 0,1 % /polivinilpirrolidona 0,1 % /tampão de fosfato de sódio SOMM em pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42ºC; ou (3) hibridizam por toda a noite em uma solução que emprega formamida 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1 %, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 ug/mL), SDS 0,1 %, e sulfato de dextran 10 % a 42ºC, com uma lavagem de 10 minutos a 42ºC em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de 10 minutos de —altarigorosidade consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55ºC.
"Condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadas da maneira descrita por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de e solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, concentração iônica e % de SDS) menos estritas que aquelas descritas anteriormente. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é incubação por toda a noite a 37ºC em uma solução que compreende: formamida 20 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, tricitrato de sódio 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextran 10 %, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC em cerca de 37-50ºC. Os versados na técnica identificarão como ajustar a temperatura, concentração iônica, etc. da maneira . necessária para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e e similares.
O termo "epítopo marcado" quando aqui usado refere-se a um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídeo CD79b ou anticorpo anti-CD79b ligado a um "polipeptídeo tag". O polipeptídeo tag tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser produzido, mesmo sendo curto o suficiente, de maneira tal que não interfira com atividade do polipeptíideo no qual está ligado. Preferivelmente, o polipeptídeo tag também é absolutamente exclusivo de maneira tal que o anticorpo não reage substancialmente de forma cruzada com outros epítopos. Polipeptídeos tag adequados em geral têm pelo menos seis resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (preferivelmente, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos). "Ativo" ou "atividade" com os propósitos desta refere-se a forma(s) de um polipeptídeo CD79b que retém uma atividade biológica e/ou imunológica de CD79b nativo ou de ocorrência natural, em que a atividade "biológica" refere-se a uma função biológica (tanto inibitória ou estimulatória) | causada por um CD79b nativo ou de ocorrência natural sem ser a capacidade | de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico dominado ! e por um CD79b nativo ou de ocorrência natural e uma atividade “imunológica” refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico dominado por um CD79b nativo ou de ocorrência natural.
O termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo CD79b nativo.
Em uma maneira similar, otermo "agonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que mimetiza uma atividade biológica de um polipeptídeo CD79b nativo.
Moléculas agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos o ou sequência de aminoácidos variantes de polipeptídeos CD79b nativos, peptídeos, oligonucleotídeos antissentido, moléculas orgânicas pequenas, etc.
Métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo CD79b podem compreender colocar um polipeptídeo CD79b em contato com um molécula agonista ou antagonista candidata e medir uma mudança detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo CD79b. “Purificado” significa que uma molécula está presente em uma amostra em uma concentração de pelo menos 95 % em peso, ou pelo menos 98 % em peso da amostra na qual está contida.
Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é uma molécula de ácido nucleico que é separada de pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico com a qual está em geral associada, por exemplo, em seu ambiente | natural.
Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui adicionalmente uma | molécula de ácido nucleico contida em células que expressam em geral a | molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente | extracromassomicamente ou em um local cromossômico que é diferente de | seu local cromossômico natural. e Pretende-se que o termo "vetor", da maneira aqui usada, refira-se | 10 auma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual foi ligado.
Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA dupla fita circular na qual segmentos adicionais de DNA podem estar ligados.
Outro tipo de vetor é um vetor de fago.
Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem estar ligados no genoma viral, Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais de mamífero) podem e estar integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira, e são por meio disso, replicados junto com o genoma hospedeiro.
Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes nos quais eles estão eficientemente ligados.
Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos.
Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetorr podem ser usados indiferentemente já que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada.
"Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", da maneira aqui usada indiferentemente, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA.
Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética.
Um polinucleotíideo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos.
Se presente, a modificação na oe estrutura do nucleotídeo pode ser concedida antes ou após montagem do !
polímero.
A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes | não nucleotídeos.
Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após síntese, tal como por conjugação com um marcador.
Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "capas", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações —internucleídeos tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, . etc.), aquelas contendo frações pendentes, tal como, por exemplo, proteinas e (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina, etc), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo queladores (por exemplo, metais, metais radioativos, baro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionalmente, quaisquer dos grupos hidroxila, em geral presentes nos açúcares, podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados em suportes sólidos ou semi-sólidos. O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou frações de grupo de capeamento orgânico de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivadas de grupos protetores padrão. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são em geral conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares anoméricos alfa, açúcares epiméricos tal como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares e furanose, psedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo i 10 —abásicos tal como metil riboside. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas sem limitações, modalidades em que fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR.sub.2 ("amidato"), P(O)R, P(O)JOU', CO ou CH.sub.2 ("formacetal"), no qual cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou insubstituída (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação éter (-O-), arilay alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os e polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
"Oligonucleotídeo”, da maneira aqui usada, em geral refere-se a polinucleotídeos curtos, em geral de fita dupla, em geral sintéticos que têm em geral, mas não necessariamente, menos que cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. As palavras "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivas. A descrição anterior para polinucleotídeos é igual e totalmente aplicável aos oligonucleotídeos.
As palavras "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem
86 | limitações, cânceres hamatopoiéticos ou cânceres relacionados ao sangue, tal | como linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfóides, mas também cânceres do baço e cânceres dos linfonodos e também carcinoma, blastoma e | sarcoma.
Exemplos mais particulares de câncer incluem cânceres associados |
—acélulaB, incluindo, por exemplo, linfomas de alto, intermediário e baixo grau | (incluindo linfomas de célula B tais como, por exemplo, linfoma de célula B de | tecido linfóide associado a mucosa e linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de | célula do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de zona | e marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular, e linfoma de | Hodgkin e linfomas de célula T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, | leucemia linfocítica crônica (CLL), tal como leucemia de célula B (linfócitos CD5+ B), leucemia mielóide, tais como leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide, tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL) e mielodisplasia), e outros cânceres hematológicos e/ou associados a | 15 célula B ou a célula T.
São também incluídos cânceres de células | hematopoiéticas adicionais, incluindo leucócitos polimorfonucleares, tais como basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células exterminadoras naturais.
São também incluídos distúrbios o proliferativos de célula B cancerosa selecionados dos seguintes: linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
As origens de cânceres de célula B incluem como se segue: origens de linfoma de célula B de zona marginal em células B de memória na zona | marginal, linfoma folicular e linfoma de célula B grande difusa originam-se em | centrócitos na zona clara de centros germinais, leucemia linfocítica crônica e | leucemia linfocítica pequenaoriginam-se em células B1 (CD5+), linfoma de
Da SS NO A | 87 | célula do manto origina-se em células B simples na zona do manto e linfoma de Burkitt origina-se em centroblastos na zona escura de centros germinais. Tecidos que incluem células hematopoiéticas aqui referidos como as “tecidos de célula hematopoiética” incluem timo e medula óssea e tecidos linfóides — periféricos, tal como baço, linfonodos, tecidos linfóides associados à mucosa, tal como o tecidos linfóides associados ao intestino, tonsilas, placas de Peyer e apêndice e tecidos linfóides associados a outra mucosa, por exemplo, os revestimentos brônquicos. Exemplos particulares adicionais de taé cânceres e incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático, leucemia e outros distúrbios linfoproliferativos e múltiplos tipos de câncer de cabeça e pescoço.
o Uma “malignidade de célula B” inclui aqui linfoma não Hodgkin — (NHL), incluindo NHL de baixo grau/folicular, NHL linfocítico pequeno (SL), NHL de grau intermediário/folicular, NHL de grau intermediário difuso, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de alto grau, NHL de doença volumosa, linfoma de célula do manto, Linfoma relacionado à AIDS, e macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma não Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin com predominância linfocitária (LPHD), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica crônica (CLL), NHL indolente incluindo NHL indolente reincidente e NHL indolente refratário com rituximab; leucemia, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia
88 | linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, leucemia mieloblástica crônica; linfoma de célula do manto; e outras malignidades hematológicas. Tais malignidades podem ser tratadas com anticorpos direcionados contra marcadores de superfície de célula B, tal como CD79b. Pretende-se aqui que tais doenças sejam tratadas pela administração de um anticorpo direcionado contra um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado(“nu”) ou um anticorpo conjugado com um agente citotóxico da maneira aqui revelada. Pretende-se aqui também e que tais doenças sejam tratadas por terapia de combinação incluindo um conjugado de medicamento de anticorpo anti-CD79b ou anticorpo anti-CD79b da invenção em combinação com outro anticorpo ou conjugado de medicamento de anticorpo, outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. No método de tratamento exemplar da invenção, um anticorpo anti-CD79b da invenção é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD20, imunoglobulina, ou fragmento de ligação de CD20 deste, tanto junto quanto sequencialmente. O anticorpo anti-CD20 pode ser um anticorpo nu ou um conjugado de medicamento de anticorpo. Em uma modalidade da terapia de combinação, o o anticorpo anti-CD79b é um anticorpo da presente invenção e o anticorpo anti- CD20 é RituxanO (rituximab).
O termo “linfoma não Hodgkin" ou “NHL”, da maneira aqui usada, refere-se a um câncer do sistema linfático sem serem linfomas de Hodgkin. Os linfomas de Hodgkin podem ser em geral distinguidos de linfomas não Hodgkin pela presença de células de Reed-Sternberg em linfomas de Hodgkin e a —ausência das ditas células em linfomas não Hodgkin. Exemplos de linfomas não Hodgkin incluídos pelo termo da maneira aqui usada incluem quaisquer daqueles que são identificados como tais pelos versados na técnica (por exemplo, um oncologista ou patologista) de acordo com esquemas de
) classificação conhecidos na técnica, tal como o esquema europeu americano | revisado de linfoma (REAL) da maneira descrita em Color Atlas of Clinical | Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt | Publishers Ltd., 2000). Ver, em particular, as listas nas figuras. 11.57, 11.58 e
11.59. Exemplos mais específicos incluem, mas sem limitações, NHL reincidente ou refratário, NHL de grau baixo de linha de frente, NHL estágio IIVIV, NHL resistente à quimioterapia, leucemia linfoblástica de precursor B e/ou linfoma, linfoma linfocítico pequeno, leucemia de célula B linfocítica e crônica e/ou proleucemia linfocítica e/ou linfoma linfocítico pequeno, linfoma —prolinfocítico de célula B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmático, linfoma linfoplasmático, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma esplênico de zona marginal, linfoma MALT de zona marginal extradonal, linfoma nodal de zona marginal, leucemia de célula pilosa, plasmacitoma e/ou mieloma de célula plasmática, linfoma de grau baixo/folicular, NHL de grau intermediário /folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de centro de folículo (folicular), NHL de grau intermediário difuso, linfoma de célula B grande difusa, NHL agressivo (incluindo NHL de linha de frente agressivo e NHL reincidente agressivo), NHL reincidente ou refratário após transplante de célula tronco autóloga, linfoma de o célula B grande mediastinal principal, linfoma de efusão primária, NHL —imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de alto grau, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursora (periférica), micose fungóide e/ou síndrome de Sezary, linfomas de pele (cutâneo), linfona anaplástico de célula grande, linfoma angiocêntrico.
Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficia do tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicas ou agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos
| não limitantes de distúrbios a serem aqui tratados incluem condições cancerosas tais como tumores malignos e benignos; malignidades linfóides e não leucemias; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, imunológicos e outros relacionados à angiogênese. Distúrbios adicionais incluem condições cancerosas tais como distúrbios proliferativos de célula B e/ou tumores de célula B, por exemplo, linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL oe indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Os termos “distúrbio de célula proliferativa” e “distúrbio proliferativo” referem-se à distúrbios que estão associados a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio de célula proliferativa é câncer.
"Tumor", da maneira aqui usada, refere-se a todo crescimento celular e proliferação neoplásicos, quer maligno ou benigno, e todas as células o e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Uma “doença autoimune” aqui é uma doença ou distúrbio que resulta e está direcionado contra os próprios tecidos ou órgãos de um indivíduo ou um co-segregado ou manifestação deste ou condição que resulta deste. Em muitos destes distúrbios autoimunes e anti-inflamatórios, inúmeros marcadores clínicos e laboratorias podem existir, incluindo, mas sem limitação, —hipergamaglobulinemia, altos níveis de autoanticorpos, depósitos de complexo antigeno-anticorpo em tecidos, benefício de tratamentos com corticosteróides ou imunossupressores, e agregados de célula linfóide em tecidos afetados. Sem ficar limitado a nenhuma teoria com relação à doença autoimune mediada por célula B, acredita-se que células B demonstram um efeito patogênico em | doenças autoimunes humanas por meio de uma variedade de caminhos | mecanicistas, incluindo produção de autoanticorpo, formação do complexo | imune, ativação de célula dendrítica e T, síntese de citocina, liberação direta de | 5 — quemocina, e fornecendo um ninho para neolinfogênese ectópica.
Cada um destes caminhos pode participar de diferentes graus na patologia das doenças autoimunes. "Doença autoimune" pode ser uma doença específica de órgão e (isto é, a resposta imune é especificamente direcionada contra um sistema de | 10 órgão tal como o sistema endócrino, o sistema hematopoiético, a pele, o | sistema cardiopulmonar, os sistemas gastrointestinal e hepático, o sistema renal, a tireóide, os ouvidos, o sistema neuromuscular, o sistema nervoso | central, etc.) ou uma doença sistêmica que pode afetar sistemas de órgãos múltiplos (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide, —polimiosite, etc.). Tais doenças preferidas incluem distúrbios reumatológicos autoimunes (tai como, por exemplo, artrite reumatóide, síndrome de Sjógren, escleroderma, lúpus tais como SLE e nefrfte de lúpus, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome de anticorpo anti- o fosfolipídeo, e artrite psoriática), distúrbios gastrointestinais e hepáticos —autoimunes (tais como, por exemplo, doenças intestinais inflamatórias (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, e doença celíaca), vasculite (tais como, por exemplo, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de —Churg-Strauss, granulomatose de Wegener, e poliangiite microscópica), distúrbios neurológicos autoimunes (tal como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome opsoclonus mioclonus, miastenia grave, neuromielite ótica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e polineuropatias autoimunes), distúrbios renais (tal como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, e doença de Berger), distúrbios dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, coceiras, pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso, e lúpus eritematoso cutâneo), distúrbios hetatológicos (tais como, por exemplo, | 5 — púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura após | transfusão, e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveite, doenças | auditivas autoimunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e | perda da audição), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de oe órgão, e distúrbios endócrinos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças —autoimunes relacionadas à diabetes tal como diabetes mellitus dependente de | insulina (IDDM), doença de Addison, e doença da tireóide autoimune (por | exemplo, doença de Graves e tireoidite)). Tais doenças mais preferidas | incluem, por exemplo, artrite reumatóide, colite ulcerativa, vasculite associada a | ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjógren, doença de Graves, | 15 IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite.
Exemplos específicos de outras doenças autoimunes da maneira aqui definida, que em alguns casos incluem aquelas anteriormente listadas, incluem, mas sem limitações, artrite (aguda e crônica, artrite reumatóide o incluindo artrite reumatóide de início juvenil e estágios tais como sinovite reumatóide, gota ou artrite gotosa, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno tipo |l, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral, osteoartrite, artrite crônica pró-gradiente, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa, artrite na menopausa, artrite por diminuição de estrogênio, e espondilite anquilosante/espondilite reumatóide), doença linfoproliferativa autoimune, doenças de pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase em placas, psoríase de gutatte, psoríase pustular, e psoríase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tais Er OEEDETMÇ a como febre de Hay e síndrome de Job, dermatite incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite esfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, coceiras, dermatite de forma herpética, dermatite numular, dermatite seborréica, dermatite não específica, dermatite de contato irritante primária, e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada ao X, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas, urticária tais como urticária alérgica crônica e urticária idiopárica crônica, incluindo urticária autoimune crônica, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise e epidérmica tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmica), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tais como MS espino- ótica, MS progressiva primária (PPMS), e MS reincidente remitente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite ótica (NMO), doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais —mediadas por doença autoimune, inflamação gastrointestinal, colite tais como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante, e colite transmural, e doença intestinal inflamatória autoimune), inflamação intestinal, pioderma gangrenoso, eritema e nodoso, colangite esclerosante primária, síndrome do diestress respiratório, incluindo síndrome do diestress respiratório do adulto ou aguda (ARDS), meningite, inflamação de toda ou partes da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, doença enxerto versus hospedeiro, angioedema tal como angioedema hreditário, dano ao nervo craniano como na meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurido escrotal, insuficiência —ovariana prematura autoimune, perda repentina da audição em virtude de uma condição autoimune, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tais como encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, uveite, tais como uveite anterior, uveite
EERERRRIRIIMMIDL A ID anterior aguda, uveite granulomatosa, uveite não granulomatosa, uveite facoantigênica, uveite posterior, ou uveite autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite crônica ou aguda tais como GN primária, GN mediada por sistema imune, GN membranosa (nefropatia membranosa) GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN proliferativa de membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo | e Tipo Il, e GN rapidamente progressiva (RPGN), nefrite proliferativa, insuficiência endócrina poliglandular autoimune, balanite oe incluindo balanite plasmacelular circunscrita, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrômico persistente, eritema multiforme, granuloma anular, líquen nítido, líquen escleroso e atrópico, líquen simples crônico, líquen espinuloso, líquen plano, ictiose lamelar, hiperceratose epidermolítica, ceratose pré-malígna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, alergias | alimentares, alergias a medicamentos, alergias a insetos, distúrbios alérgicos | 15 raros tais como mastocitose, reação alérgica, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico, e eczema palmoplantar vesicular, asma tal como asma bronquial, asma brônquica, e asma autoimune, condições que envolvem infiltração de células T e respostas | o inflamatórias crônicas, reações imune contra antígenos estrangeiros tais como grupos sanguíneos fetais A-B-O durante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus, incluindo nefrite de lúpus, cerebrite lúpica, lúpus pediátrica, lúpus não renal, lúpus extra renal, lúpus discóide e lúpus eritematoso discóide, alopécia do lúpus, SLE, tal como SLE cutânea ou SLE cutânea subaguda, síndrome de lúpus neonatal (NLE), e lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de início juvenil (Tipo 1), incluindo IDDM pediátrica, diabetes mellitus de início adulto (diabetes Tipo Il), diabetes autoimune, diabetes insípidus idiopática, retinopatia diabética, nefropatia diabética, colite diabética, distúrbio arterial
ES Me MD
| 95 | amplo diabético, respostas imunes associadas a hipersensibilidade aguda e de demora mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, agranulocitose, vasculites (incluindo vasculite de grande vasos tais como polimialgia reumática e arterite de célula gigante (Takayasu), vasculite de vaso médio tais como doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa, imunovasculite, vasculite de CNS, vasculite cutânea, vasculite por hipersensibilidade, vasculite necrotizante tais como vasculite necrotizante fibrinóide e vasculite necrotizante sistêmica, oe vasculite negativa para ANCA, e vasculite associada a ANCA tal como síndrome de Churg-Strauss (CSS), granulomatose de Wegener, e poliangiite microscópica), arterite temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), doença de Addison, anemia ou aplasia pura de célula vermelha (PRCA), deficiência de fator VIIl, hemofíilia A, neutropenia(s) autoimune(s), citopenias tais como pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese de leucócito, distúrbios inflamatórios de CNS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de lesão de o múliplos órgãos tais como aquela secundárias para septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença de membrana de embasamento anti-glomerular, síndrome de anticorpo anti- fosfolipídeo, motoneuritis, neurite alérgica, doença/síndrome de Behçet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide ou pênfigo tais —como penfigóide bolhoso, penfigóide cicatricial (nembrana mucosa), penfigóide de pele, pênfigo vulgar, pênfigo paraneoplástico, pênfigo foliáceo, pênfigo penfigóide de membrana mucosa, e pênfigo eritematoso, epidermólise bolhosa adquirida, inflamação ocular, preferivelmente inflamação ocular alérgica tais
CCC como conjuntivite alérgica, doença bolhosa de IgA linear, inflamação da conjuntiva induzida por doença autoimune, poliendocrinopatias autoimune, doença ou síndrome de Reiter, lesão térmica em virtude de uma condição autoimune, pré-eclampsia, um distúrbio do complexo imune tais como nefrite por complexo imune, nefrite mediada por anticorpo, distúrbios neuroinflamátorios, — polineuropatias, — neuropatia — crônica tal como polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio, por exemplo), incluindo oe púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura após transfusão (PTP), trombocitopenia induzida por heparina, e trombocitopenia mediada por doença autoimune ou imune incluindo, por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática(ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, esclerite tal como cerato- esclerite idiopática, epiesclerite, doença autoimune do testículo e ovário incluindo — orquite e ooforite autoimune, hipotiroidismo — primário, —hipoparatiroidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite tal como tireoidite autoimune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica(tireoidite de Hashimoto), ou tireoidite subaguda, doença da tireóide autoimune, hipotiroidismo idiopático, doença de Grave, doença do olho de Grave o (oftalmopatia ou oftalmopatia associada a tireóide), síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes, por exemplo, tipo | (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas tais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tais como encefalomielite — alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica e experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave associada a timoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus ou síndrome opsoclonus mioclonus (OMS), e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal,
RRRNEREEE síndrome de Sheeha, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupóide, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite tais como pneumonite intersticial linfóide (LIP), bronquiolite obliterante (non-transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, | 5 — doença de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia por IgA idiopática, dermatose por IgA linear, dermatose neutrofílica febril aguda, dermatose pustular | subcorneal, dermatose acantolítica transiente, cirrose tal como cirrose biliar | primária e pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, celíaca ou oe doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia por glúten), psilose refratária, —psilose idiopática, crioglobulinemia tal como crioglobulinemia mista, esclerose amilotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), doença arterial coronária, doença do ouvido autoimune tal como doença do ouvido interno autoimune (AIED), perda da audição autoimune, policondrite tal como policondrite refratária ou reincidiva ou reincidente, proteinase alveolar pulmonar, ceratite tais como síndrome de Cogan/ceratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndrome de Sweet, rosacea autoimune, dor associada a zoster, amiloidose, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal o benígna e gamopatia monoclional de signidicância não determinada, MGUS), —neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatias do CNS, autismo, miopatia inflamatória, glomerulosclerose focal ou segmental ou focal segmental (FSGS), oftalmopatia endócrina, úveorretinite, coriorretinite, distúrbio hematológico autoimune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes tais como doenças desmielinizantes autoimunes e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Dressler, alopécia areata, alopécia total,
RR o o 98 síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, por exemplo, em virtude de anticorpos anti-espermatozóico, doença de tecido conjuntivo misto, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome após cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão dos criadores de aves, angiite granulomatosa alérgica, angiite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tais como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, oe reação de transfusão, leprose, malária, doenças parasíticas tais como leishmaniose, tripanossomiase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose miocárdica, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, mediastinite fibrosante, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum e diutinum, eritroblastose fetal, faciite —eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariose, ciclite tais como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociíclite (aguda ou crônica), ou ciclte de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), SCID, síndrome de imunodeficiência adquirida e (AIDS), infecção por ecovírus, sepse (síndrome da resposta inflamatória sistênica (SIRS)) endotoxemia, pancreatite, tiroxicose, infecção por parvovirus, infecção por vírus da rubéola, síndromes após vacinação, infecção por rubéloa congênita, infecção por Epstein-Barr vírus, caxumba, síndrome de Evan, insuficiência gonodal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós estreptocócica, tromboangite obliterante, tirotoxicose, tabes dorsalis, corioidite, —polimialgia de célula gigantes, pneumonite por hipersensibilidade crônica, conjuntivite, tal como catarro vernal, ceratoconjuntivite seca, e ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia de mudança mínima, lesão por repserfusão-isquemia familiar benigna, reperfusão
CCR
| de órgão de transplante, autoimunidade retinal, inflamação articular, bronquite, doença pulmonar/canal de vetilação obstrutiva crônica, silicose, afta, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos (insuficiência vascular cerebral) tais como encefalopatia arteriosclerótica e retinopatia arteriosclerótica, aspermiogênese, — hemólise autoimune, doença Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de | Hamman-Rich, perda da audição sensoneural, hemoglobinúria paroxismática, oe hipogonadismo, ileite regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática (oftalmite simpática), oftalmite neonatal, neurite ótica, orquite granulomatosa, pancreatite, poliradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia esplênica adquirida, timoma não maligno, timite linfofolicular, vitiligo, síndrome do choque tóxico, intoxicação alimentar, condições que envolvem infiltração de célulasT, deficiência de adesão de leucócito, respostas imunes associadas a hipersensibilidade mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócito, síndrome de lesão de múliplos órgãos, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença antimemembrana basal o glomerular, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primária, gastrite atrófica autoimune, doenças reumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, insuficiência poliendócrina, síndromes poliglandulares — autoimunes, incluindo síndrome poliglandular tipo |, hipoparatiroidismo idiopático de início adulto (AOIH), cardiomiopatia tal como cardiomiopatia — dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmóide, frontal, maxilar, ou esfenóide, sinusite alérgica, um distúrbio relacionado a eosinófilo tais como eosinofilia, eosinofilia por infiltração
CNC pulmonar, síndrome de mialgia por eosinofíilia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar — tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma, ou granulomas contendo eosinófilos,
anafilaxia, —espondiloartropatias, —espondiloartrte — seronegativa, “doença autoimune poliendócrina,y colangite esclerosante, esclera, epiesclera,
candidiase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transiente da infância, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasis, distúrbios autoimunes associados a doença de oe colágeno, reumatismo tal como artrorreumatismo crônico, linfadenite, redução em resposta de pressão sanguínea, disfunção vascular, lesão de tecido,
isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, e doença relacionada a vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica,
glomerulonefrites, lesão por reperfusão, distúrbio isquêmico por reperfusão,
lesão por reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, traqueobronquite linfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, falência múltipla de órgãos, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares e orbitais, síndromes o associadas a transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocina,
—narcolepsia, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite,
hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulite e endometriose.
Pretende-se aqui que tais doenças sejam tratadas pela administração de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado (“nu”) ou um anticorpo
—conjugado com um agente citotóxico da maneira aqui revelada.
Pretende-se também aqui que tais doenças sejam tratadas por terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado de medicamento de anticorpo anti-CD79b da invenção em combinação com um outro anticorpo ou conjugado de medicamento de anticorpo, um outro agente cititóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. | "Tratar" ou “tratamento” ou “alívio” refere-se tanto ao tratamento | terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou reduzir (diminuir) a condição ou distúrbio patológico alvejado.
Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm o distúrbio bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles cujo distúrbio pode ser prevenido. Um sujeito ou mamífero é "tratado" com êxito com relação a um o câncer que expressa polipeptídeo CD79b se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo anti-CD79b de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostrar redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução no número de células de câncer ou ausência das células de câncer; redução no tamanho do tumor; inibição (isto é, diminuir alguma extensão e, preferivelmente, parar) de infiltração de célula cancerígena em órgãos periféricos incluindo a propagação do câncer no tecido mole e osso; inibição (isto é, diminuir alguma extensão e, preferivelmente, parar) de metástase do tumor; inibição, até alguma extensão, do crescimento do tumor; e/ou alívio até alguma extensão, de um ou mais dos o sintomas associados com o câncer específico; morbidade e mortalidade reduzida, e melhoria na qualidade de vida. Até a extensão, o anticorpo anti- CD79b pode prevenir o crescimento e/ou matar células de câncer existentes, pode ser citoestático e/ou citotóxico. A redução destes sinais ou sintomas também pode ser percebida pelo paciente.
Os parâmetros anteriores para determinar o tratamento bem —sucedidoe melhoria na doença são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico. Para terapia de câncer, a eficiência pode ser medida, por exemplo, determinando o tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinando a taxa de resposta (RR). A metástase pode ser determinada a por testes de estágio e por varredura óssea e testes para nível de cálcio e outras enzimas para determinar propagação para o osso. As varreduras CT também podem ser realizadas para procurar propagação na pélvis e linfonodos na área. Raios X de tórax e medições de níveis de enzimas hepáticas por métodos conhecidos são usados para procurar metástase nos pulmões e fígado, respectivamente. Outros métodos de rotina para monitorar a doença | incluem ultrassonografia transretal (TRUS) e biópsia por agulha transretal | (TRNB). | o Para câncer na bexiga, que é um câncer mais localizado, métodos | 10 para determinar o progresso da doença incluem avaliação citológica urinária | por cistoscopia, monitoramento da presença de sangue na urina, visualização do trato urinário por sonografia ou um pielograma intravenoso, tomografia computadorizada (CT) e imageamento por ressonância magnética (MRI). A presença de metástase distante pode ser determinada por CT do abdome, Raios Xde tórax, ou imageamento radionuclideo do esqueleto.
Administração "crônica" refere-se a administração do(s) agente(s) em um modo contínuo da maneira contrária a um modo agudo, de maneira a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo o prolongado. Administração “intermitente” é o tratamento que não é realizado — sucessivamente sem interrupção, mas certamente é cíclico na natureza.
Um “indivíduo” é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem limitações, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esportes, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas —modalidades, um mamífero é um humano.
"Mamiífero", com propósitos do tratamento de aliviar os sintomas de um câncer, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico,
| esportes, ou de estimação, tais como cachorros, gatos, gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras, coelhos, etc.
Preferivelmente, o mamífero é humano.
A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem. | "Veículos", da maneira aqui usada, incluem veículos, excipientes, ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, que não são tóxicos para a | célula ou mamífero que está sendo exposto a estes nas dosagens e oe concentrações empregadas.
Em geral, o veículo fisiologicamente aceitável é | 10 uma solução aquosa de pH tamponado.
Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoóis de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contra íons que forma sal tal como sódio; e/ou o agentes tensoativos não iônicos tais como TWEENGO, polietileno glicol (PEG), e —PLURONICSO. . "Fase sólida" ou “suporte sólido” significa uma matriz não aquosa na qual um anticorpo da presente invenção pode se aderir ou anexar.
Exemplos de fases sólidas aqui incluídos são aqueles formados parcial ou totalmente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones.
Em certas modalidades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; em outras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). Este E a a ——— |— —— — astvíºa termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tal como aquela descrita na patente U.S. 4.275.149. | Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de múltiplos | | tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou agente tensoativo que é usado para distribuição de um medicamento (tal como um anticorpo CD79b) a um mamífero.
Os componentes do lipossoma estão comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas | biológicas. o Uma molécula “pequena” ou molécula orgânica “pequena” é aqui definida pata ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons.
Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um vertebrado.
Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero.
Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos.
Em certas modalidades, um mamífero é humano.
O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma que permite a atividade biológica do ingrediente ativo seja efetiva, e que não contém nenhum componente adicional que é o inaceitavelmente tóxico para um sujeito ao qual a formulação é administrada. —Talformulação pode ser estéril.
Uma formulação “estéril” é asséptica e livre de todos os microrganismos vivos e seus esporos.
Uma “quantidade efetiva” de um anticorpo da maneira aqui revelada é uma quantidade suficiente para executar um propósito especificamente declarado.
Uma “quantidade efetiva” pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina, com relação ao propósito declarado.
O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou outro medicamento efetivo para “tratar” uma doença ou distúrbio em um sujeito ou mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente efetiva do medicamento pode reduzir o número de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, reduzir até — alguma extensão e, preferivelmente, parar) a infiltração da célula cancerígena nos órgãos periféricos; inibir (isto é, reduzir até alguma extensão e, preferivelmente, parar) a metástase do tumor; inibir, até certa extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certa extensão um ou mais dos sintomas oe associados ao câncer. Ver a definição aqui de “tratar”. Até certa extensão o medicamento pode prevenir crescimento e/ou matar células de câncer existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Uma “quantidade profilaticamente efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático | desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.
Uma “quantidade inibitória de crescimento” de um anticorpo anti- o CD79b é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula cancerígena, tanto in vitro quanto in vivo. Uma “quantidade inibitória de crescimento” de um anticorpo anti-CD79b com propósitos de inibir crescimento celular neoplásico pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina. Uma “quantidade citotóxica” de um anticorpo anti-CD79b é uma — quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula cancerígena, tanto in vitro quanto in vivo. Uma “quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-CD79b com propósitos de inibir crescimento celular neoplásico pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina.
Uma “célula que expressa CD79b” é uma célula que expressa um polipeptídeo CD79b endógeno ou transfectado tanto na superfície celular quanto em uma forma secretada. Um “câncer que expressa CD79b" é um — câncer que compreende células que têm um polipeptídeo CD79b presente na superfície celular ou que produzem e secretam um polipeptídeo CD79b. Um “câncer que expressa CD79b"” produz opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo CD79b na superfície de células deste, de maneira tal que um o anticorpo anti-CD79b possa se ligar a ele e tenha um efeito terapêutico com | 10 relação ao câncer. Em uma outra modalidade, um “câncer que expressa | CD79b” produz e secreta opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo | CD79b, de maneira tal que um anticorpo anti-CD79b antagonista possa se ligar a ele e tenha um efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação ao último, o antagonista pode ser um oligonucleotídeo antissentido que reduz, inibe ou previne a produção e secreção do polipeptídeo CD79b secretado por células de tumor. Um câncer que “superexpressa” um polipeptídeo CD79b é um que tem níveis significativamente maiores de polipeptídeo CD79b na superfície celular deste ou produz e secreta, comparado a um célula não o cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por maior transcrição ou tradução. A superexpressão do polipeptídeo CD79b pode ser determinada em um ensaio de detecção ou prognóstico avaliando maiores níveis da proteina CD79b presente na superfície de uma célula, ou secretada pela célula (por exemplo, por meio de um ensaio imuno-histoquímico usando anticorpos anti-CD79b preparados contra um —polipeptídeo CD79b isolado que pode ser preparado usando tecnologia do DNA recombinante a partir de um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo CD79b; análise de FACS, etc.). Alternativamente, ou adicionalmente, pode-se medir níveis de ácido nucleico que codifica polipeptíideo CD79b ou RNAm na célula, por exemplo, por meio de hibridização por fluorescência in situ usando um ácido nucleico a base de sonda correspondente a um ácido nucleico que | codifica CD79b ou o complemento deste; (FISH; ver WO98/45479 publicado | em outubro de 1998), Southern blotting, Northern blotting, ou técnicas de | 5 reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativo em tempo | real (RT-PCR). Pode-se também estudar a superexpressão de polipeptídeo CD79b medindo antígeno espalhado em um fluido biológico tal como soro, por exemplo, usando ensaios a base de anticorpo (ver também, por exemplo, oe patente U.S. 4,933,294 depositada em 12 de junho de 1990; WOS91/05264 —publicadaem 18 de abril de 1991; patente U.S. 5,401,638 depositada em 28 de março de 1995; e Sias et al., J.
Immunol.
Métodos 132:73-80 (1990)). Os ensaios anteriores à parte, múltiplos ensaios in vivo são disponíveis aos versados na técnica.
Por exemplo, pode-se expor células no corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, por varredura externa para radioatividade ou analisando uma biópsia obtida de um paciente previamente exposto ao anticorpo. o Da maneira aqui usada, o termo "imunoadesina" significa moléculas semelhantes a anticorpo que combinam a especificidade da ligação : : de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina.
Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade da ligação desejada que é sem ser o sítio de reconhecimento e ligação do antígeno de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina.
A parte adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência contígua de aminoácido compreendendo pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um elemento rr E o E] RO SO OOO de ligação. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tais como subtipos IgG-1, IgG-2, I9gG-3, ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM.
A palavra "marcador" quando aqui usada refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente no anticorpo de maneira a gerar um anticorpo "marcado". o marcador pode ser detectável sozinha (por exemplo, marcas de radioisótopos ou marcas o fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
O termo "agente citotóxico", da maneira aqui usada, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. Pretende-se que o termo inclua isótopos radioativos (por exemplo, 15º AP, 191, (725, 0, Re!, Re", sm! Bi2!?, P*? e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides da | vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, | clorambucila, daunorubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e | o fragmentos destes tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, .vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os múltiplos agentes antitumor ou anticâncer revelados a seguir. Outros agentes citotóxicos são descritos a seguir. Um agente tumoricida causa destruição de células de tumor.
: Uma “toxina” é qualquer substância capaz de ter um efeito danoso no crescimento ou proliferação de uma célula. Um "agente quimioterápico" é um composto químico usado no tratamento de câncer, indiferente do mecanismo de ação. Classes de agentes E ———————————— ss ssCCOSSS EE
| | quimioterápicos incluem, mas sem limitações: agentes de alquilação, antimetabólitos, alcalóides de planta de veneno fusorial, antibióticos citotóxico/antitumor, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotossintetizantes, e inibidores de quinase.
Agentes quimioterápicos incluem compostos usados na “terapia alvejada” e quimioterapia convencional.
Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinib (TARCEVAGO, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTEREGO, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluoruracila, 5-fluoruracila, CAS No. 51-21-8), gemcitabine (GEMZARG, Lilly), PD-0325901 (CAS No. oe 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatinum(ll), CAS No. 15663-27-1), carboplatina (CAS No. 41575-94-4), paclitaxel (TAXOLO, Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTINGE, Genentech), temozolomida (4-metil-5-0x0- 2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4.3.0] nona-2,7,9-trieno- 9-carboxamida, CAS No. 85622-93-1, TEMODARO, TEMODALO, Schering Plough), tamoxifen ((2)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenóxi]- N,N-dimeti-etanamina, — NOLVADEXO, ISTUBALO, VALODEXO) e doxorubicina (ADRIAMICINAG), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATINO, Sanofi), bortezomib (VELCADEGO, Millennium Pharm.), sutent e (SUNITINIBO, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARAG, Novartis), imatinib mesilato (GLEEVECO, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO — 2007/044515), ARRY-886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inibidor de PISK, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inibidor de PISK, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEXG, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNEG, Wyeth), lapatinib (TYKERBO, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafamib (SARASART'Y, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVARG, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSAGO, AstraZzeneca), irinotecan (CAMPTOSARGO, CPT-11, Pfizer), CC ——.-..""——
tipifarnib (ZARNESTRA'Y, Johnson & Johnson) ABRAXANE"" (sem Cremofor), formulações de nanopartícula de albumina modificadas por engenharia de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, |l), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMAG, AstraZeneca), cloranmbucila, AG1478, AG1I571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISELO, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTAG, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXANGO, NEOSARGO); sulfonatos de alquila tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, e meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamide e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinone); uma camptotecina (incluindo o topotecan análogo sintético); brioestatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolaestatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratiestatina; uma sarcodictiina; espongiestatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cliridratro de óxido de, o melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosouréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, : lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enediína (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama Il, caliqueamicina ômega 1l (Angew Chem.
Intl.
Ed.
Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como —neocarzinostatina cromóforo e cromóforos de antibiótico cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, — cactinomicina, — carabicina, — carminomicina, — carzinofilina, cromomicinais, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-0x0-L-
|
EA ssSsSsSSSSCSESsSE SCE norleucina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino- doxorubicina e desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomíicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, — olivomicinas, — peplomicina, — porfiromícina, — puromicina, —quelamicinay rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinoestatina, zorubicina; anti-metabólitos tal como metotrexato e 5- fluoruracil (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6- oe mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, prorpionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti- adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; | ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de | eliptínio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de galo; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; — maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; o mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK& (JHS Natural Products, Eugene, OU); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2' 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; —mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINEO); novantrona; LE o A A SSSSSSSSSSCSSSSSSSCCEE teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODAG, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinóides tal como ácido retinóico; e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
São também incluídos na definição de "agente quimioterápico": (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir ação do hormônio em tumores tais como anti-estrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindo NOLVADEXO; oe citrato de tamoxifen), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, —ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTONO (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tai como, por exemplo, 4(5)- imidazóis, aminoglutetimida, MEGASEO (acetato de megestrol), AROMASINO (exemestane; Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISORO (vorozol), FEMARAO (letrozol;i Novartis), e ARIMIDEXO (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti- andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); (iv) inibidores de proteína quinase tais como inibidores de MEK (WO oe 2007/044515); (v) inibidores de quinase lipídica; (vi) oligonucleotídeos —antissentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em caminhos de sinalização implicados na proliferação celular aberrante, por B exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tal como oblimersen (GENASENSEG, Genta Inc.); (vii) ribozimas tal como inobidores de expressão de VEGF (por exemplo, | ANGIOZYMEG) e inobidores de expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de terapia de gene, por exemplo, ALLOVECTINO, LEUVECTINGO, e VAXIDO; PROLEUKINO ril-2; inibidores de topoisomerase 1, tal como LURTOTECANGO; ABARELIXO rmRH; (ix) agentes anti-angiogênicos tal como bevacizumab (AVASTINO, Genentech); e sais, ácidos e derivados
E LI SS CV farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
São também incluídos na definição de "agente quimioterápico" anticorpos terapêuticos tais como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTINO, Genentech); cetuximab (ERBITUXG, Imclone); panitumumab | 5 (VECTIBIXO, Amgen), rituximab (RITUXANG, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG'Y, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTING, | Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), e o conjugado de medicamento de | anticorpo, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARGO, Wyeth). | oe Um "agente inibitório de crescimento" quando aqui usado refere- seaum composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerígena que expressa CD79b, tanto in vitro quanto in vivo.
Assim, o agente inibitório de crescimento pode ser um que reduz significativamente o percentual de célula que expressa CD79bs na fase S.
Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local sem ser a fase S), tais como agentes que induzem captura de G1 e captura de fase M.
Bloqueadores clássicos de fase M incluem os vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de topoisomerase || tais como doxorubicina, epirubicina, o daunorubicina, etoposida e bleomicina.
Aqueles agentes que capturam G1 também agem na captura da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoruracila, e ara-C.
Informação adicional pode ser observada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic — drugs" por Murakami et a/. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. O taxanos (paclitaxel e docetaxel) são medicamentos anticâncer ambos derivados da árvore de teixo.
Docetaxel (TAXOTEREG, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético de paclitaxel ND]
(TAXOLGO, Bristol-Myers Squibb) Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos prevenindo a depolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células. “Doxorubicina" é um antibiótico antraciclina.
O nome químico completo de doxorubicina é (8S-cis)10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo- hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11-triildroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metóxi- 5,12-naftacenediona.
O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas e por uma população celular que agem em outra célula como mediadores | intercelulares.
Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeo tradicionais.
Estão incluídos entre as citocinas hormônio de crescimento tal como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-a e beta.
De necrose tumoral; substância que inibe muleriana; o peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de crescimento endoteila vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tal como NGF-B; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-a e TGF-B; fator de crescimento semelhante a insulina -| e -ll; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tais como interferon -a, -B, e -y; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito- macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL- 1a, I1L-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, 11-12; um fator de necrose tumoral tal como TNF-a ou TNF-RB; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e estojo de elemento de ligação (KL). Da maneira aqui usada, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.
O termo “instrução para uso” é usado para referir-se à instruções normalmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos | que contêm informação acerca das indicações, uso, dosagem, administração, | contraindicações e/ou cuidados com relação ao uso de tais produtos | e terapêuticos.
O termo “metabólito intracelular” refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um conjugado de anticorpo-medicamento (ADC). O processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático, tal como clivagem proteolítica de um ligante de peptídeo do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tais como uma —hidrazona, éster ou amida.
Metabólitos intracelulares incluem, mas sem limitações, anticorpos e medicamento livre que tem sido submetido a clivagem intracelular após entrada, difusão, absorção ou transporte em uma célula.
Os termos “clivado intracelularmente” e “clivagem intracelular” o referem-se a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um conjugado de anticorpo-medicamento (ADC) por meio do qual a anexação covalente, isto é, ligante, entre a fração de medicamento (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando no medicamento livre dissociado do anticorpo dentro da célula.
As frações clivadas do ADC são assim metabólitos intracelulares.
O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistêmica (isto é, níveis de sangue/plasma) de uma dada quantidade de medicamento administrado a um paciente.
Biodisponibilidade é um termo absoluto que indica medição tanto do tempo (taxa) quanto da quantidade total (extensão) de medicamento que atinge a circulação geral de uma forma de dosagem administrada.
O termo “atividade citotóxica” referese a um efeito de crescimento de exterminação celular, citostático ou inibitório de um ADC ou um metabólito intracelular de um ADC. Atividade citotóxica pode ser expressa comoo Vvalor!Cs,, que é a concentração (molar ou de massa) por unidade de volume no qual a metade das células sobrevive.
O termo "alquila" da maneira aqui usada refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramiíficada saturado de um a | e doze átomos de carbono (C:-C1), em que o radical alguila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos a seguir. Em outra modalidade, um radical alquila tem um a oito átomos de carbono (C,-Cg), ou um a seis átomos de carbono (C1-Cç6). Exemplos de grupos alquila incluem, mas sem limitações, metil (Me, - CH), etil (Et, -CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i- —propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CHCH2CH2C0H;3), 2-metil-1-propil (i- Bu, i-butil, -CHXCH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2- propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CHCHCH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CHCH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (- o C(CH3).CHCH3), — 3-metil-2-butil! (-CH(CH3)CH(CH3))), — 3-metil-1-butil / (- CHCHCH(CH3)) — 2-metil-1-butil (-CHCH(CH3)CHCH3), — 1-hexil! (- CHICHCHCHCH2C0H3), — 2-hexil! (-CH(CH3)JCH.CH.CH2CH3), 3-hexil (- CH(CHICH;(CHCH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3).CHCHxCH3), 3-metil-2- pentil (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil -CH(CH3)CHxCH(CH3)2), 3- metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), — 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3). CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil -CH(CH3)C(CH3)3, 1- heptil, 1-octil, e similares.
O termo "alquenila" referese a radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramíificada de dois a oito átomos de carbono
(C2-Cg) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação dupla carbono-carbono, sp?, em que o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos, e inclui radicais com orientações "cis" e "trans" ou, alternativamente, orientações "E" e"Z", Exemplos incluem, mas sem limitações, etilenila ou vinil (-CH=CH>), alila -CHxCH=CH>7) e similares.
O termo "alquinila" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado de dois a oito átomos de carbono (C2-Csg) oe com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, um ligação tripla carbono- carbono, sp, em que o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
Exemplos incluem, mas sem limitações, etinil -C=CH), propinil (propargil, -CHXC=CH), e | similares. | Os termos "carbociclo", "carbocíclico", "anel carbocíclico” e "cicloalquila" referem-se a um anel monovalente não aromático saturado ou parcialmente não saturado com 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como um anel bicíclico. | Carbociclos bicíclicos com 7 a 12 átomos podem ser arranjados, por exemplo, o como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], e carbociclos bicíclicos com 90u10 átomos no anel podem ser arranjados como um sistema biciclo [5,6] ou [6,8] ou como sistemas ligados tais como biciclo[(2.2.1)heptano, biciclo[2.2.2Joctano e biciclo[3.2.2Jnonano.
Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem, mas sem limitações, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, cicloexila, 1-cicloex- 1-enila, 1-cicloex-2-enila, 1-cicloex-3-enila, cicloexadienila, cicloeptila, ciclo- octila, ciclononila, ciclodecila, cicloundecila, ciclododecila e similares. "Arila" significa um radical hidrocarboneto aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (Cs-Ca0) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono simples de um sistema de anel aromático pai. Alguns grupos arila estão representados nas estruturas exemplificativos como "Ar". Arila inclui radicais bicíclicos compreendendo um anel aromático ligado a um anel saturado, parcialmente insaturado ou anel carbocíclico — aromático. Grupos arila típicos incluem, mas sem limitações, radicais derivados de benzeno (fenila), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, indanila, 1,2-diidronaftaleno, 1,2,3,4-tetraidronaftla e similares. Grupos arila são opcionalmente substituídos de forma independente com um oe ou mais substituintes aqui descritos.
Os termos "heterociclo," "hetercíclico" e "anel heterocíclico" são aqui usados indiferentemente e referem-se a um radical carboxílico saturado ou um parcialmente insaturado (isto é, com uma ou mais ligações duplas e/ou | triplas no anel) de 3 a 20 átomos no anel, no qual pelo menos um átomo do | anel é um heteroátomo selecionado de nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, | 15 —osátomos do anel remanescente sendo C, onde um ou mais átomos do anel é opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos a seguir. Um heterociclo pode ser um monociclo com 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos o selecionados de N, O, P, e S) ou um biciclo com 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 6 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterociclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente capítulos 1, 3, 4,6,7,e9, "The Chemistry of Heterociclic Compound, A series of Monographs" (John Wilkey&Sons, New York, 1950 até hoje), em particular, Volumes 13, 14, 16, 19, e 28, e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterocíclico" também inclui radicais onde radicais heterociclo são ligados com um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel aromático, carbocíclico ou heterocíclico.
Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas sem limitações, pirrolidinila, tetraidrofuranila, diidrofuranila, tetraidrotienila, tetraidropiranila, diidropiranila, tetraidrotiopiranila, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanila, piperazinila, homopiperazinila, azetidinila, oxetanila, tietanila, homopiperidinila, oxepanila, tiepanila, oxazepinila, diazepinila, tiazepinila, 2-pirrolinila, 3-pirrolinila, indolinila, 2H-piranila, 4H-piranila, dioxanila, 1,3-dioxolanila, pirazolinila, ditianila, ditiolanila, diidropiranila, diidrotienila, diidrofuranila, pirazolidinilimidazolinila, imidazolidinila, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanila, 3-azabiciclo[4.1.O]heptanila, oe azabiciclo[2.2.2]hexanila, 3H-indolila quinolizinila e uréia N-piridila.
Frações | 10 espiro também estão incluídas no escopo desta definição.
Exemplos de um grupo heterocíclico em que 2 átomos do anel de carbono são substituídos por frações oxo (=O) são pirimidinonila e 1,1-dioxo-tiomorfolinila.
Os grupos heterociclo são aqui opcionalmente substituídos de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
O termo "heteroarila" refere-se a um radical aromático monovalente de anéis de 5, 6 ou 7membros, e inclui sistemas de anéis ligados (pelo menos um dos quais é aromático) de 5-20 átomos, contendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e e enxofre.
Exemplos de grupos heteroarila são piridinila (incluindo, por exemplo, —2-hidroxipiridinila), imidazolila, imidazopiridinila, pirimidinila (incluindo, por exemplo, 4-hidroxipirimidinila), pirazolila, triazolila, pirazinila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, oxazolila, isotiazolila, pirrolila, quinolinila, isoquinolinila, indolila, benzimidazolila, benzofuranila, cinnolinila, indazolila, indolizinila, ftalazinila, piridazinila, triazinila, isoindolila, pteridinila, purinila, —oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, tiadiazolila, furazanila, benzofurazanila, benzotiofenila, = benzotiazolila, benzoxazolila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila e furopiridinila.
Grupos heteroarila são opcionalmente substituídos de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
Da a PE o EA ooo A A A A A A A AREA EEE A EEE | | 120 Os grupos heterociclo ou heteroarila podem ser carbono (carbono-ligado) ou nitrogênio (nitrogênio-ligado) ligado onde é possível. Como exemplo e sem limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados ao carbono estão ligados na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma —piridazina, posição 2, 4,5 ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furan, tetraidrofuran, tiofuran, tiofeno, pirro! ou tetraidropirrol, posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, o posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma —quinolina ou posição 1,3, 4,5,6,7 ou 8 de uma isoquinolina.
Como exemplo e sem limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados ao nitrogênio estão ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolinay 2-pirazolinay 3-pirazolina, piperidina, —piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou B-carbolina.
"Alquileno” refere-se a um radical hidrocarboneto saturado, de cadeia reta ou ramíificada, cíclico de 1-18 átomos de carbono, e com dois centros o de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de diferentes átomos de carbono de um alcano pai. Radicais alquilenos típicos incluem, mas sem limitações: metileno (-CH2-) 1,2-etil (-CH2CH>-), 1,3-propil -CHCH2CHa-), 1,4-butil -CHCH2CH2CH7-) e similares.
Um “alquileno C1-C19" é um grupo hidrocarboneto de cadeia reta, saturado da fórmula -(CH2),.-1o-. Exemplos de um alquileno Cy-Cio incluem —metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno e decaleno.
“Alquenileno” refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de cadeia reta ou ramificada ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e com dois o | 121 centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois diferentes átomos de carbono de um aiceno pais. Radicais alquenileno típicos incluem, mas sem limitações: 1,2-etileno (-CH=CH-). “Alquinileno” refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de — cadeia reta ou ramiíificada ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e com dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois diferentes átomos de carbono de um alcino pai. Radicais alquinileno típicos incluem, mas sem limitações: acetileno (-C=C-), e propargil (-CH2C=C-), e 4-pentinil -CHCH2CH2C=C-).
Um “arileno” é um grupo arila que tem duas ligações covalentes e pode estar na configuração orto, meta, ou para da maneira mostrada nas seguintes estruturas: Pa s Ot FO FO na qual o grupo fenila pode ser insubstituído ou substituído com até quatro grupos incluindo, mas sem limitação, -alguila C1-Cg, -O-( alquil C1-Cs), -arila, - C(O)R, -OC(OJR', -C(O0)OU', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', - oe S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogênio, -N3 , -NHa, -NH(R'), -N(R')) e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado de H, - alquil C1-Cs e aril.
"Arilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou spº, é substituído por um radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, mas sem limitações, benzila, 2-feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1- ila e similares. O grupo arilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquila, incluindo grupos alcanila, alguenila ou alquinila, dos grupos arilalquila tem 1 a 6 átomos de carbono e a fração arila tem 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou spº, é substituído por um radical heteroarila.
Grupos heteroarilalquila típicos incluem, mas sem limitações, 2- benzimidazolilmetila, 2-furiletila e similares. O grupo heteroarilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquila, incluindo grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo tem 1 a 6 átomos de carbono e o a fração heteroarila tem 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos : 10 selecionados de N, O, P, e S. A fração heteroarila do grupo heteroarilalquil pode ser um monociclo com 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo com 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. O termo "profármaco" da maneira usada neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de um composto da invenção que pode ser menos tóxico para as células comparado ao composto ou fármaco pai e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente ativado ou convertido na & forma pai mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al., " Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Medicamento Delivery, Borchardt et a/., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os profármacos desta invenção incluem, mas sem limitações, profármacos contendo fosfato, profármacos contendo fosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo peptídeo, profármacos — modificados por D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos contendo B-lactâmico, profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída, profármacos contendo fenilacetamida
| 123 opcionalmente substituída, profármacos de 5-fluorcitosina e outra 5-fluoruridina que podem ser convertidos no medicamento livre citotóxico mais ativo.
Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de promedicamento para uso nesta invenção incluem, mas sem limitações, compostos da invenção e agentes quimioterápicos tais como anteriormente descritos.
Um "metabólito" é um produto fabricado por meio do metabolismo no corpo de um composto ou sal especificado deste.
Metabólitos de um o composto podem ser identificados usando técnicas de rotina conhecidas na i 10 técnica e suas atividades determinadas usando testes tais como aqueles aqui descritos.
Tais produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática e similares do compostoadministrado.
Dessa maneira, a presente invenção inclui metabólitos de compostos da invenção, incluindo compostos produzidos por um processo que compreende colocar um composto desta invenção em contato com um mamífero por um período de tempo suficiente para render um produto metabólico deste.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de múltiplos e tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou agente tensoativo que é usado para distribuição de um medicamento a um mamífero.
Os componentes do lipossoma estão comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas. "Ligante" refere-se a uma fração química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que anexa covalentemente um anticorpo a uma fração de medicamento.
Em várias modalidades, ligantes incluem um radical bivalente tais como uma alquildiilla, uma arildiila, uma heteroarildiila, frações tal como: -(CR2>),O(CR2))-, unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenóxi, PEG, polimetileneóxi) e alquilamino (por exemplo, polietileneamino, Jeffamine"”); e diácido éster e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. A palavra "quiral" refere-se a moléculas que têm a propriedade de não sobreponibilidade da imagem especular parceira, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são sobreponíveis na sua imagem especular parceira. A palavra "estereoisômeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com relação ao arranjo dos átomos e OU grupos no espaço.
"Diastereômero" refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra. Diastereômeros têm diferentes propriedades físicas, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. Misturas de diastereômeros podem separadas em procedimentos analíticos de alta — resolução tais como eletroforese e cromatografia.
"Enantiômeros" refere-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens especulares não sobreponívies um do outro. Em geral, definições e convenções estereoquímicas aqui seguem o S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw- Hill Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compound (1994) John Wiley & Sons, Inc, New York. Muitos | compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, isto é, eles têm a | capacidade de girar o plano da luz polarizada no plano. Descrevendo um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou Re S, são usado para simbolizar a configuração absoluta da molécula com relação a seu(s) centro(s) quiral(s). Os prefixos d e | ou (+) e (-) são empregados para indicar o sinal de rotação da luz polarizada no plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levorotatório. Um composto prefixo com (+) ou d é dextrorotatório. Para uma dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos com a exceção de que eles são imagens especulares um do outro. Um estereoisômero específico também pode ser referido como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é geralmente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura de enantiômeros 50:50 é referida como uma mistura racêmica ou um racemato que pode ocorrer onde não existe nenhuma estereoseleção ou estereoespecifiidade em uma reação ou processo químico. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a e uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, destituídas de atividade ótica.
O termo "tautômero" ou "forma tautomeróica" refere-se a isômeros estruturais de energias diferentes que são interconvertíveis por meio de uma barreira de baixa energia. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos como tautômeros prototrópicos) incluem interconversões por meio de migração de um próton, tais como isomerizações ceto-enol e imina- enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões por reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
O termo "sal farmaceuticamente aceitável", da maneira aqui o usada, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto da invenção. Sais exemplificativos incluem, mas sem limitação, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, saccarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato “mesilato”, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis(2- hidroxi-3-naftoato)).. Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula tal como um íon acetato, um íon succinato ou
| ' | ' | | | outro contra-íon.
O contra-íon pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica | que estabiliza a carga no composto pai.
Além do mais, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais que um átomo carregado em sua estrutura.
Exemplos onde múltiplos átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplos contra-íons.
Consequentemente, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomo carregados e/ou um ou mais contraíons.
Se o composto da invenção for uma base, o sal | e farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer | 10 método adequado disponível na técnica, por exemplo, tratamento da base livre | com um ácido inorgânico, tais como ácido hidroclorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico e similares, ou com um ácido orgânico, tais como ácido acético, ácido trifluoracético, ácido maléico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, —ácidomalônico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido piranosidílico, tal como ácido glucurônico ou ácido galacturônico, um ácido alfa hidríxi, tal como ácido citrico ou ácido tartárico, um aminoácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, um ácido aromático, tal como ácido o benzóico ou ácido cinâmico, um ácido sulfônico, tal como ácido p- —toluenossulfônico ou ácido etanossulfônico ou similares.
Se o composto da invenção for um ácido, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer método adequado, por exemplo, tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou orgânica, tal como uma amina (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de metal alcalino terroso ou similares.
Exemplos ilustrativos de sais adequados incluem, mas sem limitações, sais orgânicos derivados de aminoácidos, tais como glicina e arginina, amônia, aminas primárias, secundárias e terciárias, e aminas cíclicas,
tais como piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cáicio, potássio, magnésio, mangânes, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio.
O termo "farmaceuticamente aceitável" indica que a substância ou composição tem que ser compatível quimicamente e/ou toxicologicamente com os outros ingredientes que compreendem uma formulação, e/ou o mamífero que está sendo tratado com isso.
Um "solvato" refere-se a uma associação ou complexo de uma ou e mais moléculas solventes e um composto da invenção.
Exemplos de solventes que formam solvatos incluem, mas sem limitações, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etila, ácido acético e etanolamina.
O termo "hidrato" refere-se ao complexo onde a molécula solvente é água.
O termo "grupo protetor" refere-se a um substituinte que é comumente empregado para bloquear ou proteger uma funcionalidade particular reagindo ao mesmo tempo outros grupos funcionais no composto.
Por exemplo, um "grupo protetor de amino" é um substituinte anexado a um grupo amino que bloqueia ou protege a funcionalidade amino no composto.
Grupos protetores de amino adequados incluem acetila, trifluoracetila, t- o butoxicarbonila (BOC), benziloxicarbonila (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonila (Fmoc). Similarmente, um "grupo protetor de hidróxi" refere-se a um substituinte de um grupo hidróxi que bloqueia ou protege a funcionalidade hidróxi.
Grupos protetores adequados incluem acetila e silla.
Um "grupo protetor de carbóxi" refere-se a um substituinte do grupo carbóxi que bloqueia ou protege a funcionalidade carbóxi.
Grupos protetores de carbóxi comuns incluem fenilsulfoniletila, cianoetila, 2-(trimetilsili)Jetila, 2-(trimetilsilil)etoximetila, 2-(p-toluenesulfonil)etila, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etila, 2-(difenilfosfino)-etila, nitroetila e similares.
Para uma descrição geral de grupos protetores e seu uso, ver T.
W.
Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons,
New York, 1991.
“Grupo abandonador” refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por um outro grupo funcional. Certos grupos abandonadores são bem conhecidos na técnica e exemplos incluem, mas sem limitações, um —haleto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metanossulfonila (mesila), p- toluenossulfonila (tossila), trifluormetilsulfonila (triflato) e trifluormetilsulfonato.
ABREVIAÇÕES
COMPONENTES LIGANTES e MC = 6-maleimidocaproila 0 Val-Cit ou “vc” = valina-citrulina (um dipeptídeo exemplar em um ligante clivável por protease) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanóico PAB = p-aminobenziloxicarbonila (um exemplo de um componente ligante “auto emulativo”) Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (em que o peptídeo ligante ligado foi modificado para prevenir sua clivagem por catepsem B) MC(PEG)6-O0H = maleimidocaproil- polietileno glicol (pode ser anexado ao anticorpo cisteína).
o MEDICAMENTOS CITOTÓXICOS MMAE = mono-metil auristatin E (MW 718) MMAF = variante de auristatin E (MMAE) com uma fenilalanina nos terminais C do medicamento (MW 731.5) MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) em uma ligação amida no terminal C fenilalanina (MW 801.5) | 25 MMAF-TEG = MMAF com tetraetileno glicol esterificado com a fenilalanina | MMAF-NtBu = N-t-butila, anexada como uma amida nos terminais C de MMAF
RE A EEE E Ô ED A A EEE A | | | 129 | DM1 = N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina DM3 = N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentil)-mnaitansina DM4 = N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- maitansina Abreviações adicionais são como se segue: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonil), cit é citrulihna, dap é dolaproina, DCC é 1,3- dicicloexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é e diisopropilazodicarboxilato, “DIEA é NN-diisopropiletlaminay dil é s 10 dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é etileneglico! dimetil éter (ou 1,2-dimetoxietano), DMF é N, N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é ácido 5,5"-ditiobis(2-nitrobenzóico), DTPA é ácido dietilenetriaminepentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etóxi-l-etoxicarbonil-1,2- diidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa por eletroaspersão, EtOAc é | acetato de etil, Fmoc é N-(9-fluorenilmetóxicarbonil), gli é glicina, HATU é hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, Nº, N'-tetrametilurônio, HOBt | e é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia líquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrila, MeOH é metanol, Mtr é 4- anisildifenilmetila (ou 4-metoxitritila), nor é (1S, 2R)-(+)-norefedrina, PBS é salina tamponada com fosfato (pH 7,4), PEG é polietileno glicol, Ph é fenila, Pnp é p-nitrofenila, MC é 6-maleimidocaproila, phe é L-fenilalanina, PyBrop é hexafluorfosfato de bromo tris-pirrolidino fosfônio, SEC é cromatografia por exclusão de tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoracético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e val é valina.
Um “aminoácido sem cisteína” refere-se a um resíduo de aminoácido cisteína que foi modificado por engenharia em um anticorpo parental, tem um tiol grupo funcional tiol (-SH), e não está emparelhado como uma ponte de dissulfeto intramolecular ou intermolecular.
O termo “valor de reatividade de tiol” é uma caracterização quantitativa da reatividade dos aminoácidos sem cisteína. O valor de — reatividade de tiol é o percentual de um aminoácido sem cisteina em um anticorpo modificado por engenharia com cisteína que reage com um reagente reativo de tiol, e convertido a um valor máximo de 1. Por exemplo, um aminoácido sem cisteína em um anticorpo modificado por engenharia com oe cisteína que reage em 100 % de rendimento com um reagente reativo de tiol, tal como um reagente de biotina-maleimida, para formar um anticorpo marcado com biotina tem um valor de reatividade de tiol de 1,0. Outro aminoácido modificado por engenharia com citeíina no mesmo ou em diferente anticorpo parental que reage em 80 % de rendimento com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0,8. Outro aminoácido modificado por engenharia com citeína no mesmo ou em diferente anticorpo parental que falha totalmente em reagir com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de O. A determinação do valor de reatividade de tiol de uma cisteína particular pode ser conduzida por ensaio de ELISA, espectroscopia de o massa, cromatografia líquida, autorradiografia, ou outros testes analíticos quantitativos.
Um "anticorpo parental" é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos da qual um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por um ou mais resíduos de cisteína. O anticorpo parental pode compreender uma sequência tipo selvagem ou nativa. O anticorpo parental pode ter sequência de modificação de aminoácidos pré-existente (tais como adições, deleções e/ou substituições) com relação a outro tipo selvagem ou nativo, ou formas modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo — biologicamente importante.
Anticorpos direcionados contra antígenos não polipeptídeos (tais como antígenos de glicolipídeos associados a tumor; ver U.S. 5091178) são também considerados.
TABELA 1
Pr * C-C increased from 12 to15 *Zis average of EQ oe * Bis average of ND * match with stopis M; stop-stop = O; J (joker) match = O * tdefine MM 8 1* value of a match with a stop */ int —day(26)26)=( Fr ABCDEFGHISKLMNOPQRSTUVWXYZ* A*/ (2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1, 0,-1,-2-1, 0, M, 1, 0,-2, 1,1, 0, 0,-6, 0,-3, O), rB*/ ([0,3,-4,3,2,-5, O, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2, M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5, 0,-3, 1), FC*/ (-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4, M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, O, 0,-5),
e D*/ (0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2, O, 0,-4,-3, 2, M,-1,2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2), /PE*/ (0,2,-5,3,4,-5, O, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1, M,-1,2,-1,0, O, 0,-2,-7, 0,-4, 3), 1 F*/ (-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4, M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5), FG* ([1,0,-3,1,0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, O, M,-1,-1,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, O), FH* (1,1,-3,1,1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2, M, O, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, O, 2), MIO (1,2,-2,-2,-2,1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2, M,-2,-2,-2,-1, O, O, 4,-5, 0,-1,-2), *J*/ 40,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, 0), FK*/ €1,0,-5,0,0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1, M,-1, 1,3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, O), FL*/ (-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3, M,-3,-2,-3,-3,-1, O, 2,-2, 0,-1,-2), FM*/ (1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, O, O, 4, 6,-2, M,-2,-1, 0,-2,-1, O, 2,-4, 0,-2,-1),
AN*/ (0,2,4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2, 2, M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4, 0,-2, 1), FO UCM.M, MM, MM, M, M, M, M, M, MM, M, O, MM, MM, M, M, M, M, M, M, My, FP* f1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3,-2,-1, M, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, O), rat (0,1,-5,2,2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2-1, 1, M, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3), PR*/ (2,0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, O, M, O, 1,6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, O), rS*/ [1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1, O, 0,-3,-2, 1, M, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0), MT* (1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0, M, 0,-1,-1, 1, 3, O, 0,-5, 0,-3, O), oe FU*/ (0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0), AV*/ [0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2, M,-1,-2,-2,-1, 0, O, 4,-6, 0,-2,-2), AW*/ (-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4, M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, O, 0,-6), F*X*/ £0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0), AY (3,3,0,-4,-4,7,-5, 0,-1, 0,-4,-1,-2,-2, M,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, O, 0,10,-4), 1rZ*/ (0,1,-5,2,3,-5, O, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1, M, 0,3,0,0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4)
Y Fr * e Hinclude <stdio.h> Hinclude <ctype.h> tdefine MAXJMP 16 /*maxjumpsinadiag*/ tdefine MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps larger than this* | tdefine JMPS 1024 /* max jmps in an path */ | fdefine MX 4 /* save if there's at least MX-1 bases since last imp */
fdefine DMAT 3 /* value of matching bases */ tdefine DMIS o 1* penalty for mismatched bases */ tdefine DINSO 8 1* penalty for a gap */ tdefine DINS1 1 /* penalty per base */ tHdefine PINSO 8 /* penalty for a gap */ Hdefine PINS1 4 /* penalty per residue */ struct jmp ( [ short NIMAXJMP]; /* size of jmp (neg for dely) */ | unsigned short — x[IMAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x */ Y /* limits seg to 2916 -1 */ struct diag ( int Score; 1* score at last jmp */ long offset; /1* offset of prev block */ short iimp; /* current jmp index */ structjmp jp; /* list of jmps */ e” struct path ( int spc; 1* number of leading spaces */ short n[JMPS]; — /* size of jmp (gap) | int x[JMPS], 1* loc of jmp (last elem before gap) */
Y char *ofile; 1* output file name */ char *namex(2]; /* seq names: getseqs() */ char *prog; /* prog name for err msgs */
| char *segx[2]; /* segs: getseas() */ int dmax; /* best diag: nw() */ int dmaxo; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx, gapy; /* total gaps in seqs */
int leno, leni; 1* seq lens */
int nNgapx, ngapy; /* total size of gaps */
| oe int smax; /* max score: nw() */
| int *xbm; 1* bitmap for matching */
long offset; /* current offset in jmp file */
structdiag “dx; 1* holds diagonals */ structpath pp[2]; /* holds path for segs */ char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy(); char *getsea(), *g. calloc();
e /* Needleman-Wunsch alignment program
* usage: progs file1 file2 * wherefile1 and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Anylines beginning with '!, '>' or '<' are ignored * Maxfile length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Outputisinthe file "align.out" * The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
NS NS Da PE no EAD ooo A DA A o 135 * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 * Hinclude "nw.h" Hinclude "day.h" static: dbval[26] = ( 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
Y . static pbval[26) = ( 1, 2l1<<('D"A'YI(1<<('N''A'Y), 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OXFFFFFFF, 1<<10, 1<<11, 1<<12, 1<<13, 1<<14, 1<<15, 1<<16, 1<<17, 1<<18, 1<<19, 1<<20, 1<<21, 1<<22, 1<<23, 1<<24, 1<<25|(1<<(E-'AM(1<<(QA))
Y main(ac, av) main int ac o char *avl]; ( : - - prog=av(o]; - o o if(acl=3)( | | fprintf(stderr, "usage: %s file1 file2Wn", prog); fprintf(stderr,"where file1t and file2 are two dna or two protein sequences.n"); fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-caseWn'"); fprintf(stderr, "Any lines beginning with '; or '<' are ignoredwn"); fprintf(stderr,"Output is in the file Valign.outv'Wn");
RR exit(1); ) namex[0] = av[1]; namex[1] = av[2]; seqgx[0] = getseg(namex[0], &lenoO); seqgx[1] = getseg(namex[1], &leni); xbm = (dna)? dbval: pbval; ( endgaps = O; 1* 1 to penalize endgaps */ ofile = "align.out"; 1* output file / nw(); [* fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ | print(); /1* print stats, alignment */ | | cleanup(O0); /* unlink any tmp files */) | | /* do the alignment, return best score: main() | | e * dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 values | 7 * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer : | * a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx | *toagapinsegqy. | y | nw() nw ( char *px, *py; 1/* seqs and ptrs */ int *ndely, *dely;/* keep track of dely */ Ce o int ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; 1* for swapping row0, row1 */ int mis; /* score for each type */ int ins0, ins1; /*insertion penalties */ register id; /* diagonal index */ register UM 1* jmp index */ register *col0, *col1; /* score for curr, last row */ register xXx, YY; /* index into segs */ º dx = (struct diag *)g calloc("to get diags”, len0+len1+1, sizeof(struct diag)); ndely = (int *)g calloc("to get ndely", len1+1, sizeof(int)); dely = (int *)g calloc("to get dely", leni+1, sizeof(int)); | colo = (int *)g calloc("to get colo", len1+1, sizeof(int)); col1 = (int *)g calloc("to get col1", len1+1, sizeof(int)); | ins0 = (dna)? DINSO : PINSO; | ins1 = (dna)? DINS1 : PINS1; | smax = -10000; o if (endgaps) ( for (colO0[0] = deiy[0] = -insO, yy = 1; yy <= len1t; yy++)( EA colo[yy] = dely[yy] = colo[yy-1] - ins1; : : ndely[yy] = yy; ) colo[fo] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ ) else for (yy =1; yy <= len1; yy++) dely[yy] = -insO; RR "
138 ' /* fill in match matrix * for (px = segx[0], xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) ( /* initialize first entry in col * if (endgaps) ( iIf(xx==1) col1[0] = delx = -(insO+ins1); oe else col1[0] = delx = colo[0] - ins1; ndelx = xx; ) else ( col1fo] = O; delx = -insO; ndelx = O; + o nw for (py = segx[1], yy = 1; yy <= len1; py++, yy++) ( ã : mis = colO[yy-1]; : Ee if (dna) mis += (xXbm[“px-'A'J&xbm[“py-'A'])? DMAT : DMIS; else mis += day[“px-'A'][“py-'A']; /* update penalty for del in x seg; * favor new del over ongong del
* ignore MAXGARP if weighting endgaps * if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) ( if (colO[yy] - ins0 >= dely[yy]) ( dely[yy] = colo[yy] - (insO0+ins1); ndely[lyy] = 1; leisef dely[yy] -= ins1; o ndely[yy]++; ) else ( | if (colo[yy] - (insO0+ins1) >= dely[yy]) ( dely[yy] = colo[yy] - (ins0+ins1); ndelylyy] =1; | else | ndely[yyl++; + o /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del if (endgaps || ndelx < MAXGAP) ( if (col1[yy-1] - ins0 >= del) ( delx = col1[yy-1] - (ins0+tins1); ndelx = 1; else ( delx -= ins1; ndelx++; | | S0.sss..5s————— 2222222 7 A
+ telse( if (col1[yy-1] - (ins0+ins1) >= delx) ( delx = col1[yy-1] - (ins0+ins1); ndelx = 1; else ndelx++; ) e /* pick the maximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely * nw id = xx-yy+len1i -1; if (mis >= delx && mis >= dely[yy]) coli[yy] = mis; e else if (delx >= dely[yy]) ( col1[yy] = delx; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (I!dna || (ndeix >= MAXJMP && xx > dxlidipx[iHMX) || mis > dx[id].score+DINSO)) ( dx[id].jjmp++; if (++) >= MAXJMP) ( writejmpsí(id); ij = dxfid].ijmp = O;
CCC dx[id] offset = offset; offset += sizeofístruct jmp) + sizeof(offset); + ) dx[id].jp.n[i]] = ndeb; dxfid].jp.x[i]] = xx; dxfid].score = delx; oe ) else ( col1[yy] = dely[yy]; ij = dxlidL.ijmp; if (dxfid].jp.n[0] && (dna || (ndely[yy] >= MAXJMP && xx > dxlidlipxliHMX) || mis > dx[id].score+DINSO)) ( dx[id].jjmp++; if (H+i) >= MAXJMP) ( | writejmps(id); e ij = dxflid).ijmp = O; dx[id].offset = offset; e... offset += sizeofístruct jmp) + | sizeof(offset); ) ) dxTid].jp.n[i]] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[i]] = xx; dx[id].score = dely[yy]; +
RR EE
142 | if (xx == lenO && yy < len1) ( /* last col * if (endgaps) coli [yy] -= ins0+ins1*(len1-yy); if (col1[yy] > smax) ( smax = col1[yy]; dmax = id; e , > + if (endgaps && xx < lenO) col1[yy-1] -= ins0+ins1*(lenO-xx); if (col1[yy-1] > smax) ( smax = col1[yy-1]; dmax = id; | ) tmp = colO; colo = col1; coli = tmp; + LL (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); - (void) free((char *)col0); (void) free((char *)col1); ) r * print() -- only routine visible outside this module * static:
143 | * getmat() -- trace back best path, count matches: print() * pr align() -- print alignment of described in array p[]: print() * dumpblock() -- dump a block of lines with numbers, stars: pr align() * nums() -- put out a number line: dumpblock() * putline() -- put out a line (name, [num], seg, [num]): dumpblock() * stars() - -put a line of stars: dumpblock() * stripname() -- strip any path and prefix from a segqname * tHinclude "nw.h" tdefine SPC3 tdefine P LINE 256 /* maximum output line */ fdefineP SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern day[26][26]; int olen; /* set output line length */ o FILE *fx; 1* output file */ print() print do o int =, ly, firstgap, lastgap; 1* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w)) == 0) ( fprintf(stderr,"%s: can't write %swn", prog, ofile); cleanup(1); + fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)Wn", namex([0], leno);
E A EA RE A DI E E | | 144 | | | fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)Wn", namex(1], leni); | olen = 60; x = lenoO; | ly = lent; firstgap = lastgap = O; if (dmax < len1 - 1) ( /* leading gap in x */ PPIO].spc = firstgap = len1 - dmax - 1; ly -= ppl[ol.spc; : else if (dmax > len1 - 1) ( /* leading gap in y */ pp[1].spc = firstgap = dmax - (len1 - 1); | lx -= pp[1].spc; | ) | if (dmaxO < lenO - 1) ( /* trailing gap in x */ | lastgap = lenO - dmax0O -1; x -= lastgap; ) | else if (dmaxO > lenO - 1) ( /*trailing gap in y */ | o lastgap = dmaxO - (lenO0 - 1); | ly -= lastgap; ) | getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr align(); Pr * trace back the best path, count matches * static
O
DO o DP DM | | 145 | getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) getmat int ly 1* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap */ ft int nm, iO, il, sizO, siz1; char outx[32]; double pet; register no, n1; e register char *po, *p1; 1* get total matches, score * iO=i1=sizo=siz1=O0; po = seqgx[0] + pp[1].spc; p1 = segx[1] + pp[0].spc; nO = pp[1].spc + 1; n1 = pp[0].spc + 1; nm=0; while (*po && *p1 ) 4 o if (sizO) ( p1++; ni++; ' sizO--; ) else if (siz1) ( po++; nO++; siz1--; )
RMS else ( if (xbm[*po-'AJ&xbm[*p1-'A']) nMm++; if (n0++ == pp[0].x[i0]) SizO = pp[0].n[i0++]; if (n1++ == pp[1].x[i1]) siz1 = pp[1].n[il ++]; po++; oe pi++; + ) 1* pet homology: *if penalizing endgaps, base is the shorter seg * else, knock off overhangs and take shorter core if (endgaps) x = (lenO < len1)? lenO : leni; e else k=(Ix<y)?:ly; pet = 100.*(double)nm/(double)Ix; fprintí(fx, "n"); fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarityn", nm, (nm == 1)? "" :; "es", lx, pct); fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ...getmat if (gapx) ( (void) sprintf(outx, " (%d Y%s%s)",
ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf(fx, ", gaps in second sequence: %d", gapy); if (gapy) ( | (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", | ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? "":"s"); | fprintf(fx,"%s", outx); | + e if (dna) fprintf(fx, "n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)Wn", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); else fprintf(fx, "In<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)Wn", smax, PINSO, PINS1); e if (endgaps) fprintf(fx, "<endgaps penalized. left endgap: %d %s%s, right endgap: %d Y%s%sin", firstgap, (dna)? "base" : "residue", (firstgap == 1)? "":"s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap == 1)? "":"s"); else fprintí(fx, "<endgaps not penalizedwn"); ) static nm; 1* matches in core -- for checking */ CR a A static Imax; /* lengths of stripped file names */ static il2); /* jmp index for a path */ static nc[2]; /* number at start of current line */ static ni[2]; 1* current elem number -- for gapping */ static siz[2]; static char *ps(2]; /* ptr to current element */ static char *po[2]; /* ptr to next output char slot */ static char out[2][P LINE]; 1* output line */ e static char star[P LINE]; /* set by stars() */ | Fr * print alignment of described in struct path ppl] * static pr align() pr align ( int nn; /*charcount*/ int more; e register ; for(i= 0, Imax=0;i <2; i++) ( nh = stripname(namex([i]); W if (nn > Imax) Imax = nn; nefi] = 1; nifil = 1; siz[i] = ijli| = O; psi] = segx[il; poli] = out[i]; )
for (nn = nm = O, more = 1; more; ) ( ...pr align for (i = more = 0; i < 2; i++) (
Pr
* do we have more of this sequence?
*
if (pslil) continue;
oe more++;
if (pp[il.spc) ( /* leading space */ *polilt+=""; Pplil.spe--;
)
else if (siz[i]) ( /*in a gap */ *polil++ ="-"; siz[il--;
> else ( /* we're putting a seq element o * *poli] = *ps[il; if (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(“pslil); polil++; ps[il++; Pr * are we at next gap for this seg? * if (nifi] == pp[i].x[ilil]) AN om— cia eee il 1 N IN IN IG OO OSÓÚ PBR bi ioOÓ O O ii
Fr * we need to merge all gaps * at this location * siz[i] = pp[il.nfilil++]; while (nili] == ppli].x[ij[i]]) Siz[i] += pp[il.n[iilil++]; + oe nifilt+ + ) if (++nn == olen || !more && nn) ( dumpblock(); for (i=0;i<2; i++) poli] = outfi]; nn=0; + ) o ) Fr * dump a block of lines, including numbers, stars: pr align() * static dumpblock() dumpblock ( register [ for(i=0;i<2; i++) *polil-- = nO";
NR
...dumpblock (void) pute('Ww', fx); for (i=0;i<2;i++)f if (“outfi] && (“outfi] 1=*' || *(polil) 1=')) if(i==0) nums(i); if(i == O && *out[1]) oe stars(); putline(i); if (i == O && *out[1]) fprintf(fx, star); if(i==1) nums(i); ) ) + Fr o * put out a number line: dumpblock() * static : nums(ix) nums int /* index in out[] holding seq line */ t char nline[P LINE]; register ii register char *pn, *px, “py; for (pn = nline, i = 0; i < Imax+P.
SPC; i++, pn++)
“*pn=""; for (i = ncfix], py = outlix]; *py; py++, pn++) ( if(py==2"'|[*py==") *pn=""; else ( if (1910 == O || ((==1 && nclix] 1= 1))( je(isopici for (px = pn; j; j/= 10, px--) o *px =j%10+'0; if(i<o) “px=""; ) else *pn=""; i++; ) ) *pn = 10; o nelfix] =i; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx); (void) putc('n', fx); > Fr * put out a line (name, [num], seg, [num]): dumpblock() * static putline(ix) putline int x ( ...putline int Í; register char *px; for (px = namex[ix], i = O; *px && *px I='; px++, i++) (void) putc(*px, fx); o for (si <Imax+P SPC; i++) (void) putec('', fx); /* these count from 1: * nifJ is current element (from 1) * nc] is number at start of current line ; for (px = out[ix]; “px; px++) (void) putc(*px&Ox7F, fx); (void) putc(n', fx); o ) Fr * put a line of stars (segs always in out[0], out[1]): dumpblock() * static stars() stars í int ;
register char *pO, *p1, ox, *px; if (out[0] || (“out[o] =="' && *(po[0]) =="") || 1out[1] || (fout[1] =="" && *(pol1]) =="")) return; px = star; for (i = Imax+P.
SPC; i; i--) *pxt++a="" o for (po = out[0], p1 = out[1]; *po && *p1; po++, p1++) ( if (isalpha(*po) && isalpha(*p1)) ( if (xbm[*po-'A'J&xbm[p1-'A1) ( ex=" nm++; ) else if ('dna && day[*po-AI[p1-A'] > O) cx=""; o else ex=" ) else ex="" *pxt+ = Cx; + *px++ ="; *px="0"; +
Fr * strip path or prefix from pn, return len: pr align() 7 static stripname(pn) stripname char *pn; /*filename (may be path) */ ( oe register char *px, “py; py=0; for (px = pn; “px; px++) if(*px=="/) py=px+1; if (py) (void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn)); o ) 1” : " : * cleanup() -- cleanup any tmp file * getseq() -- read in seg, set dna, len, maxlen * g calloc() -- calloc() with error checkin * readjmps() -- get the good jmps, from tmp file if necessary * writejmps() -- write a filled array of jmps to a tmp file: nw() * fHinclude "nw.h"
| Ns o DM o | 156 fHinclude <sys/file.h> | char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; 1* tmp file for jmps */ | FILE *fj; | int cleanup(); /* cleanup tmp file */ | long Iseek(); * remove any tmp file if we blow .. cleanup(i) cleanup int í if (f) (void) unlink(jname); exit(i); ) Pr * read, return ptr to seg, set dna, len, maxlen o * skip lines starting with ';', '<', or > * seqgin upper or lower case SH o UN : o char * getseaí(file, len) getseq char “file; /*filename*/ int *leni /*segqlen*/ í char line[1024], *pseq; register char *px, *py;
int natgc, tlen; FILE *fp; if ((fp = fopenífile,"r)) == 0) ( fprintf(stderr,"%s: can't read %swn", prog, file); exit(1); ) tlen = natgc = O; while (fgets(line, 1024, fp)) ( oe if (line =="; || line =="<' || Xline ==>») continue; for (px = line; *px 1=n'; px++) if (isupper(*px) || islower(*px)) tlent++; ) ; if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) ( | fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %swn", prog, tlen+6, file); ' exit(1); o ) psea(o] = pseg[1] = pseg[2] = pseg[3] = nO"; ...getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); while (fgets(line, 1024, fp)) ( if (line =="; || line =="<' |[ line ==">') continue;
for (px = line; *px |= Wn'; px++) ( | if (isupper(*px)) | *pyt+ =*px; | else if (islower(*px)) *py+t+ = toupper(*px); ' if (index("ATGCU",*(py-1))) natgc++; ) 'S ) “pyt+t = NO; *py=n0; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); return(pseg+4); + char * g. calioc(msg, nx, sz) g.calloc char *msg; 1* program, calling routine */ o int nxSsz, 1* number and size of elements */ t char — *px, *calloc(); " if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) ( if (*msg) ( fprintf(stderr, "%s: g calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)Wn", Prog, Msg, Nx, SZ); exit(1); ) )
o . | | 159 return(px); | ! r | * get final jmps from dx[] or tmp file, set ppl], reset dmax: main() ” | readjmps() readjmps | í | oe int fd=-1; int Siz, 10, i1; register 1, j, OG UAU)EI (void) fclose(fj); if ((fd = open(jname, O RDONLY,0)) < 0) ( fprintf(stderr, "%s: can't open() %swn", prog, jname); cleanup(1); ) + o for (i=i0=i1=0,dmax0 = dmax, xx = lenO; ; i++) ( while (1) ( for (j| = dxfdmax].ijmp; j >= O && dx[dmax].jp.x[]] >= xx; j--) ...readjmps if (| < 0 && dx[dmax].offset && fi) ( (void) Iseek(fd, dx[dmax] offset, O); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jimp));
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax] offset, sizeof(dx[dmax].offset)); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1; ) else break; ) if(i >= MPS) ( fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignmentwn", prog); cleanup(1); N. ! if>=0)( siz = dx[dmax].jp.n[j]; | xx = dx[dmax].jp.x[]l; | dmax += siz; if(siz <0)( /* gap in second seq */ PP[1].n[i1] = -siz; xXx += Siz; Fidexx-yyt+lenit-1 * PP[1].x[i1] = xx - dmax + len1 - 1; o gapy++; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; 1 ++. ) elseif(siz>0)( / gapinfirstsegq”*/ Pp[O].nfio] = siz; Pp[O].x[i0] = xx; gapx+t;
E A O E
| 161 ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; Io++; > ) else break; o : /* reverse the order of jmps * for (j = 0,10; j <iO0; j++, i0--) ( | = pp[o].n[i]; pplo].ni] = pplo].nfio]; pp[o].nfio] = ; i = pp[o].x[]; pp[o].x[j] = pp[o].x[io]; pp[o].xfio] = i; + for (j=0, il; j<il; jr il) 1 = pp[1].n[i]; ppl1].nf] = ppl11.nf1]); ppl.) =; i = pp[1].x[]; pp[11.x[]] = pp[1].x[1]; ppl1].x[1] =; ) o if(fd >= O) (void) close(fd); ' Ff) : (void) unlink(jname); fji=O0; offset = O; ) > Fr
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw() * writejmps(ix) writejmps int ix ( char *mktemp(); if (fi) oe if (mktemp(jname) < 0) ( fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %swn", prog, jname); cleanup(1); ) if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) ( fprintf(stderr, "%s: can't write %swn", prog, jname); exit(1); + ) (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fi); o (void) fwrite((char *)&dx[ix] offset, sizeof(dxfix].offset), 1, fi); +
1. — ComPosições E MÉTODOS DA INVENÇÃO Ú A presente invenção fornece anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais destes, e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
Em um aspecto, presente a invenção fornece um anticorpo que se liga, preferivelmente de maneira específica, a quaisquer dos polipeptídeos descritos anteriormente ou a seguir. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclional, fragmento de anticorpo, incluindo fragmento Fab, Fab', F(ab'), e
Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo anti-polipeptíideo CD79b a seu respectivo epítopo antigênico. Anticorpos da presente invenção podem — opcionalmente estar conjugados com um agente inibitório de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um auristatina, um maitansinoide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares. Os e anticorpos da presente invenção podem opcionalmente ser produzidos em células CHO ou células abcterianas e, preferivelmente, induzir morte de uma célula na qual ele se liga. Com propósitos de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser marcados detectavelmente, anexados a um suporte sólido ou similares.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é substancialmente a mesma como a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um oe fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é menor, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor que a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo oe humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior que a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). | o Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é substancialmente a mesma como a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é menor, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14,15,16,17,18,19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor, como a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma 1!gG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG com CD79b) em sua forma oe bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior que a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG com CD79b) em o sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma —bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com
CD79b) é 0,4 nM +/- 0,04.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b)é0,3nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,32 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um e anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,36 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,44 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua o forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,48 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,3 nM e 0,5 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,32 nM e 0,48 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,36 nM e 0,44 nM.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo oe humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma —bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM +/- 0.02.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,1 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,12 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um o anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,14 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,16 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,18 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua pa MM Pa NM DE Do | 168 | forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,22 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,24 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece oe um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,26 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,28 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,380 nM ou maior.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua oe forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,1 nM e 0,3 nM.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,12 nM e 0,28 nM.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,14 nM e 0,26 nM.
Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, iii or 2 £€,i,bS, OÔOOO afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,16 nM e 0,24 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti- CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 018nNMe0,22nM.
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CC CD79b) é 0,5 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM +/- 0,1.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma —bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com e CD79b) é 0,5 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com Ú CD79b) é 0,6 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com —CD79b)é0,7nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,3 nM e 0,7 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,4 nM e 0,6 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo emsua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,5 nM e 0,55 nM. Em um aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo murina com CD79b é substancialmente a mesma como a afinidade de ligação de um CL fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outro aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo murina com CD79b é substancialmente a mesma da afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variáveis de um anticorpo gerado a partir de hibridoma depositado com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 ou anticorpo — quimérico compreendendo os domínios variáveis de anticorpo gerado a partir de hibridomas depositado com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de
1993.
Como está bem estabelecido na técnica, afinidade de ligação de Le um elemento de ligação com seu receptor pode ser determinada usando qualquer de uma variedade de ensaios, e expressa em função de uma variedade de valores quantitativos. Dessa maneira, em uma modalidade, a afinidade de ligação é expressa como valores Kd e reflete afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com menores efeitos de ansiosidade). Em geral e preferivelmente, afinidade de ligação é medida in vitro, quer em ambiente sem célula ou associado a célula. Da maneira aqui descrita com maiores detalhes, diferença multiplicatória na afinidade de ligação pode ser quantificada em função da razão da valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (por exemplo, na forma Fab) e o valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparador (por exemplo, na forma Fab) (por exemplo, um anticorpo murina com sequências hipervariáveis de região doadora), em que os valores da afinidade de ligação são determinados em condições de ensaio similar. Assim, em uma modalidade, a diferença multiplicatória na afinidade de ligação é determinada como a razão dos valores Kd do anticorpo humanizado na forma Fab e o dito anticorpo Fab de referência/comparador. Por exemplo, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (A) tiver uma afinidade que é “3 vezes menor” que a afinidade de oe um anticorpo referência (M), então se o valor Kd para A for 3x, o valor Kd de M seria lx, earazão de Kd de A até Kd de M seria 3:1. Ao contrário, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (C) tiver uma afinidade que é “3 vezes maior" que a afinidade de um anticorpo referência (R), então se o valor Kd para C for 1x, o valor Kd de R seria 3x, e a razão de Kd de C até Kd de R seria 1:3. Quaisquer dos inúmeros ensaios conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos, podem ser usados para obter medições de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA. Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, em que o anticorpo compreende: o (a) pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs — selecionados do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (ii) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134)
MM
(v) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da presente invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:
132. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a e sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção que compreende estas sequências (em combinação damaneira aqui descrita) é humanizado ou humano. Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, em que o anticorpo compreende: (a) pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs o selecionados do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (li) HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é — QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1-E18
| 173 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); e (b) pelo menos uma variante HVR em que a sequência variante HVR compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136. Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção oe compreende a sequência de SEQ ID NO: 132. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção que compreende estas sequências (em combinação da maneira aqui descrita) é humanizado ou humano.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que e compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135, e 136, e em que SEQ ID NO: 131 corresponde a um HVR-L1, SEQ ID NO: 132 corresponde a HVR-L2, SEQ ID NO: 133 corresponde a um HVR-L3, SEQ ID NO: 134 corresponde a um HVR-H1, SEQ ID NO: 135 corresponde a um HVR- H2,eSEQID NO: 136 corresponde a um HVR-H3. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR- H2, e HVR-H3, em que cada um, em ordem, compreende SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 e 136.
HVRs variantes em um anticorpo da presente invenção podem ter modificações de um ou mais resíduos no HVR.
Em uma modalidade, um HVR- | L1 variante compreende uma substituição nas seguintes posições: A4 (K), A9 | (E ou S) e A1ÍO (A ou S). Em uma modalidade, um HVR-L2 variante | 5 compreende 1-5 substituições (1, 2, 3, 4 ou 5) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: B2 (S ou G), B3 (R ou G), B4(K,R, Y, |, H ou Q), B5 (R), B6 (G, K, UM, R, S ou L) e B7 (R, N, T ou G). Em uma modalidade, um HVR-L3 variante compreende 1-4 substituições (1, 2, 3 ou 4) oe em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: C1 (N ou D), C2 (N ouP),C3(DouR), C5(S,K,A,Q,D,LouG), C6 (UM, E ou N), C7 (A), C8 (R) e C9 (N) Em uma modalidade, um HVR-H1 variante compreende 1-7 substituições (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: D1 (P), D2 (F), D3(P, S, Y, G ou N), D4 (Lou V), DS(T, R, N, K, C, G ou P), D6 (R, T, Kou G), D8 (F), D9 (V OU L) e DI0(S, Q, Nou D). Em uma modalidade, um HVR-H3 variante compreende 1-3 substituições (1, 2 ou 3) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: F4 (R ou |), F6 (1 ou F), F7 (K, C, R, Vou F), F8 (L), e F9 (S). Letra(s) nos parênteses após cada posição indica um aminoácido de substituição ilustrativo (isto é, o substituição); evidente aos versados na técnica, adequação de outros aminoácidos como aminoácidos de substituição no contexto aqui descrito pode ser rotineiramente determinada usando técnicas conhecidas e/ou aqui descritas.
Em uma modalidade, A9 em uma variante HVR-L1 é E.
Em uma = modalidade, F6 em uma variante HVR-H3 é |. Em uma modalidade, F7 em uma variante HVR-H3 é R.
Em uma modalidade, F8 em uma variante HVR-H3 é L.
Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é |, FT é Re F8 é L.
Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A9 é E e uma variante HVR-H3 em que F6 é |, FF é Re FB é L.
Em uma modalidade, A9 em uma variante HVR-L1 é S. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A9 é S e uma variante HVR-H3 em que F6 é |, Té ReF8éL.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A4 é K. Em algumas modalidades, a dita variante HVR-L1 compreende HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito e anticorpo HVR-L1 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9é E ou S$ e/ou A10 é um ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L1 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é a. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição T1 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente um sequência consenso de o arcabouço de cadeia leve kl humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «l humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «kl! humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do — subgrupo Ill humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana) 48 é |, 6/7 É A, 69 é F, T1 É A, 713 É6 T, 715 É S, TB É A e ou BO É M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana.
Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kl humana compreende substituição na posição 4 e/ou47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é R, B4 é K BE é Ge B7 é R. e Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é R B4é Y, BE éKeB7éR Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é RB4 é K e B6 é G.
Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 | compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 | em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO:131,133, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é um ou S.
Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 o é E ou N e/ou C7 é A.
Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana.
Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição T1é A 73 éTeou78éA Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «kl humana.
Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas
| 177 | modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «l humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes | anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75,78 e/ou8o0 Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da | sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Il! humana) | 48 é |, 67 É A, 69 é F, T1 É A, 73 É T, 75 É S, 78 É A € ou BO É M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente | o uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana. Em uma | 10 modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana compreende substituição na posição 4 | elou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência | consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção | 15 compreende uma variante HVR-L3 em que C5 é K. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L3 em que C5 é S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada o um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que AP é E ou S E e/ou A10 é um ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem — adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é Te/lou 78 é
| | 178
A.
Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «I humana.
Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana compreende substituição na — posição 4 e/ou47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Il! humana compreende substituição na posição oe 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana) 48 é |, 67 é A, 69 É F, 71 É A, 73 6 T,. 715 É S, TB É AG OU BO É M.
Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve xl humana.
Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência — consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana) 4 é L e/ou 47 é
F. o Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-H1 em que D3 é P, DS5 é T, DE é Re DID é N.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H1 em que D3 é P, DS é N, DE é Re D1I0 é N.
Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR- L2, HVR-L3, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou AI0 É A ou S.
Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades | destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade | destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma | sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «kl humana. Em alguma | oe modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de | 10 arcabouço de cadeia leve kl humana compreende substituição na posição 4 | e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «! humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71,73, 75,78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Il humana) 48 é | 67 é A 69 é F, 71 É A, 73 é T,. 75 é S, TB é AG OU BOéÉéM. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem o adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «xl humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana compreende substituição na i posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «Il humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é l e F8 é L. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é l, Té ReF8éL. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-
H3 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada | | em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134 e 135. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H3 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante emqueA9ZéEousSeouAI0NéAousS.
Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H3 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A.
Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de o cadeia pesada do subgrupo Ill humana.
Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana) 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A.
Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Il! humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana) 48 é |, 67 é A, 699 É F, 71 é A, 73 é T e/ou 78 É À.
Em uma o modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana.
Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «|! humana) 4 é L e/ou 47 é F.
Em uma —modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill humana compreende substituição na posição 48, 67, | 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, | posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo | | | |
181 | Ill humana) 48 é |, 67 é A, 698 é F, 11 É A, 713 6 T, 756 S, TBé AG OU BO É M.
Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «xl humana.
Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência — consenso de arcabouço de cadeia leve x! humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve «| humana) 4 é L e/ou 47 é F. o Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as sequências HVR representadas na figura 9 (SEQ ID NO: 17-21) e/ou figura 10 (SEQ ID NO: 22- 106). Um agente terapêutico para uso em um sujeito hospedeiro elicita preferivelmente pouca a nenhuma resposta imunogênica contra o agente no dito sujeito.
Em uma modalidade, a invenção fornece um agente como este.
Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado que elicita e/ou espera-se que elicite uma resposta de anticorpo p anti-camundongo humano (HAMA) em um nível substancialmente reduzido e comparado a um anticorpo que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 e 14 em um sujeito hospedeiro.
Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo humanizado que elicita e/ou espera-se que elicite mínima ou nenhuna resposta de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA). Em um exemplo, um anticorpo da invenção elicita resposta de anticorpo anti- camundongo que está em um nível clinicamente aceitável ou menos.
Um anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender uma ou mais sequências hipervariáveis (por exemplo, arcabouço) | de região de consenso humana e/ou não humana em seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve.
Em algumas modalidades, uma ou mais modificações | | adicionais estão presentes nas sequências hipervariáveis de região de consenso humana e/ou não humana.
Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço humana, que em uma modalidade é a sequência — consenso de arcabouço do subgrupo Ill.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido.
Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo Ill o variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71,73 elou78. Em uma modalidade, a dita substituição é R71A, N73T e/ou L78A, em qualquer combinação desta.
Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill variante compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em uma modalidade, a dita substituição é V481, F67A, I69F, R71A, N73T e/ou L78A.
Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo Ill variante compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em uma modalidade, a dita substituição é VA48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K758S, L78A e/ou L80M.
Em uma modalidade, o e domínio variável de cadeia leve de um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço humana, que em uma modalidade é a sequência consenso de arcabouço Kl.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço «Il variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido.
Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço «Il variante pode compreender uma substituição na posição 4. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L.
Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço «Il variante pode compreender uma substituição na posição 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L e/ou L47F.
Como é conhecido na técnica, e da maneira aqui descrita em mais detalhes a seguir, a posição do aminoácido/limite que delineia uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica (da maneira descrita a seguir). | 5 — Algumas posições em um domínio variável podem ser vistas como posições | hipervariáveis híbridas em que considera-se que estas posições estejam em | uma região hipervariável em um conjunto de critérios considerando-se ao | mesmo tempo estarem fora de uma região hipervariável em um conjunto o diferente de de critérios. Uma ou mais destes posições também pode ser observadas em regiões hipervariáveis extendidas (da maneira descrita adicionalmente a seguir). A invenção fornece anticorpos que compreendem | modificações nestas posições hipervariáveis híbridas. Em uma modalidade, estas posições hipervariáveis incluem uma ou mais posições 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 e 101-102 em um domínio variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 24-29, 35-36, 46-49, 56 e 97 em um domínio variável de cadeia leve. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço de subgrupo humano variante humana e modificada em uma ou mais posições hipervariáveis híbridas.
Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo Ill variante humana modificada em uma ou mais das posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição G26P. Em uma “modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F27Y. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T28P, S, Y, G ou N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F29L ou F29V. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S30T, R N, K, C,
G ou P.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A3B3W ou AS3F.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição M34!, V ou L.
Em uma modalidade S35E, Q, N ou D.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição V481. Em uma modalidade, o anticorpo | compreende uma substituição S49G.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição YS58N.
Em uma modalidade, o anticorpo ! compreende uma substituição AGON.
Em uma modalidade, o anticorpo | compreende uma substituição D61E.
Em uma modalidade, o anticorpo o compreende uma substituição S62l.
Em uma modalidade, o anticorpo o compreende uma substituição V63F.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A93T.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição D101S.
Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo | kappa humano variante modificada em uma ou mais das posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição R24K.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição Q27K.
Em uma modalidade, o anticorpo | o compreende uma substituição S28D ou E.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição 129G, A ou S.
Em uma modalidade, o anticorpo . compreende uma substituição S56R, N, T ou G.
Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T97N.
Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo Ill variante humana modificada em 1, 2,3, 4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16 ou todas as posições 26-30, 33-35, 48- 49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, a modificação é selecionada do grupo que consiste em G26P, F27Y, T28P (S, Y, G ou N), F29L (V), S30T (R,
| 185 N, K, C, G ou P), AS3W (F), M34I (V ou L), S35E (Q, N ou D), V481, S49G, | Y58N, AG6ON, D61E, S621, V63F, A93T e D101S. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo Ill variante modificada na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75,78 elou8o0 Em uma modalidade, a dita substituição é V481, F67A, I169F, R71A, N73T, K758S, L78A e/ou L80M. Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência consenso o de arcabouço do subgrupo | kappa humano variante modificada em 1, 2, 3, 4,5 “o ou todas as posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, a modificação é selecionada do grupo que consiste em R24K, Q27K, S28D (E), I|29G (A ou S), S56R (N, T ou G) e T97N. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço KI variante modificada na posição 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é MA4L e/ouL47F. Um anticorpo da presente invenção pode compreender quaisquer sequências humanas ou sequências consenso de arcabouço de cadeia leve humanas adequadas, contanto que o anticorpo exiba as características e biológicas adequadas (por exemplo, uma afinidade de ligação desejada). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma - -porção (ou toda) da sequência de arcabouço humano de cadeia leve x. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) de sequência consenso de arcabouço de subgrupo | K« humano. Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve que compreende sequência de arcabouço representada em SEQ ID NO: 9 (Figuras 7A-B) e/ou 13 (Figuras 8A-B).
CR EEE A O O
Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo humanizado anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico. Em um aspecto, o anticorpo humanizado anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico inibe a progressão do tumor em xenoenxertos.
Em um aspecto, tanto o anticorpo humanizado quanto anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, tanto o anticorpo humanizado quanto quimérico compreendem uma região Fab única ligada a uma região Fc. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico de referência e compreende sequências de domínio variável descritas nas figuras 7A-B (SEQ o ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) ligadas a uma região Fc humana.
Em uma modalidade, a região Fc humana é aquela de uma IgG (por exemplo, I9G1,2,3 ou 4).
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVRI-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 164-166). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 160-163). Em uma modalidade, o anticorpo compreende o sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168).
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio : - variável de cadeia pesada que compreende o sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência FR1-HC, FR2- HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de —cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende NNVNRNRNsNNNFRssssssssrs..q uESsSÇCCCÇ&EES&k E ——
a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164- 166), e a sequência FR1I-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163), e a CH1 e/ou Fc (Figura 15, SEQ ID NO: 167 e/ou 168). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 156-158). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 15 (SEQ ID NO: oe 152-155). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 : o representada na figura 15 (SEQ ID NO: 159). Em uma modalidade, o anticorpo | da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende | a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158) e a | sequência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155) representadas na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção | compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO:156-158), e a sequência CL1 | (SEQ ID NO: 159) representadas na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que | o compreende a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: | 20 156-158), e a sequência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: | 152-155).representada na figura 15, e a sequência CL1 representada na figura 15 (SEQ ID NO: 159). | Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVRI-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 16 | (SEQ ID NO: 183-185). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 179-182) Em uma modalidade, o anticorpo compreende NVNNNNNNNNCCCCNCNSNSNSV-—-ÇÕ NNE et e a OS sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência FR1-HC, FR2- HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência CH1 e/ou Fc representada o na figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183- 185), e a sequência FR1I-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182), e a CH1 e/ou Fc (Figura 16, SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 175-177). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência B FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 16 (SEQ ID NO: o 171-174). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 16 (SEQ ID NO: 178). Em uma modalidade, o anticorpo * —dainvenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177) e a sequência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representadas na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência CL1 (SEQ ID NO: 178) representadas na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que
CCC compreende a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representada na figura 16, e a sequência CL1 representada na figura 16 (SEQ ID NO: 178). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que | | compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a | sequência HVR1I-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 202-204). Em uma modalidade, o domínio variável compreende e sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 198-201) Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência FR1-HC, FR2- | 15 HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201). Em uma | modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de ! | cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- | . HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência CH1 e/ou Fc representada o na figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende ”— a sequência HVR1I-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202- 204), e a sequência FR1I-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201), e a CH1 e/ou Fc (Figura 17, SEQ ID NO: 205 e/ou 206). Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 194-196). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 17 (SEQ ID NO: RN Na
190-193). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 17 (SEQ ID NO: 197). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a — sequência FRI-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) representadas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência CL1 e (SEQ ID NO: 197) representadas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a segyência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) representada na figura 17, e a sequência CL1 representada na figura | 17 (SEQ ID NO: 197). | Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1I-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 18 P (SEQ ID NO: 221-223). Em uma modalidade, o domínio variável compreende e sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 217-220) Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência FR1-HC, FR2- HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 217-220). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência CH1 e/ou Fc representada Re na figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221- 223), e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ 1IDNO:217-220), ea CH1 e/ou Fc (Figura 18, SEQ ID NO: 224 e/ou 225).
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 18 (SEQ ID NO: e 213-215). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FRI1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 209-212) Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 18 (SEQ ID NO: 216). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215) e a sequência FRI-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representadas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência CL1 o (SEQ ID NO: 216) representadas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1I-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência FRI-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representada na figura 18, e a sequência CL1 representada na figura 18 (SEQ ID NO: 216).
Em um aspecto, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos modificados por engenharia com cisteíina onde um ou mais | aminoácidos de um anticorpo parental são substituídos por um aminoácido sem | cisteína da maneira revelada em WOZ2006/034488; U.S. 2007/0092940 (aqui
RR incorporada pela referência na sua íntegra). Qualquer forma de anticorpo anti- CD79b pode ser assim modificada por engenharia, isto é, mutada.
Por exemplo, um fragmento Fab de anticorpo parental pode ser modificado por engenharia para formar um Fab modificado por engenharia com cisteína, aqui referido como “TioFab.” Similarmente, um anticorpo monoclional pai pode ser modificado por engenharia para formar um “TioMab.” Nota-se que uma mutação de sítio único produz um resíduo de cisteína modificado por engenharia único em um TioFab, enquanto uma mutação de sítio único produz oe dois resíduos de cisteína modificados por engenharia em um TioMab, em virtude da natureza dimérica do anticorpo IgG.
Os anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção incluem anticorpos monoclonais, humanizados ou anticorpos monoclonais quiméricos, e | fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, polipeptídeos de fusão e análogos que se ligam preferivelmente a polipeptídeos CD79b associados a célula Um anticorpo modificado por engenharia com cisteina pode compreender alternativamente um anticorpo que compreende uma cisteina em uma posição aqui revelada no anticorpo ou Fab, que resulta do desenho da sequência e/ou seleção do anticorpo, sem alterar necessariamente um | o anticorpo parental, tal como por desenho e seleção de anticorpo de exibição de | fago ou por meio de novo desenho de sequências de arcabouço de cadeia leve | e/ou cadeia pesada e regiões constantes.
U anticorpo modificado por | engenharia com cisteína compreende um ou mais aminoácidos sem cisteina | com um valor de reatividade de tiol nas faixas de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0o0u 0,8 a | 1.0. Um aminoácido sem cisteina é um resíduo de cisteína que foi modificado | 25 — por engenharia no anticorpo parental e não é parte de uma ponte de dissulfeto.
Anticorpos modificados por engenharia com cisteina são usados para ' anexação de compostos citotóxicos e/ou de imageamento no sítio da cisteina modificada por engenharia por meio de, por exemplo, uma maleimida ou the haloacetila.
A reatividade nucleofílica da funcionalidade do tiol de um resíduo Cis em um grupo maleimida é cerca de 1.000 vezes maior comparada a qualquer outra funcionalidade de aminoácido em uma proteína, tais como resíduos de grupo amino de lisina ou o grupo amino N-terminal.
A funcionalidade específica do tiol em reagentes iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas pH maior (>9.0) e tempos de reação mais longos são exigidos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical
Approach, Academic Press, London). oe Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína da presente invenção compreende uma cisteína modificada por engenharia em qualquer uma das seguintes posições, onde o posição é numerada de acordo com Kabat et al. na cadeia leve (ver Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e de acordo com a numeração EU na cadeia pesada (incluindo a região Fc) (ver Kabat et al. (1991), supra) , em que a região constante de cadeia leve representada por sublinhado na figura 24A, 25A, 26A, 27A, 28, 48A e 49A está na posição 109 (numeração Kabat) e a região constante de cadeia pesada representada por o sublinhado nas figuras 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 48B e 49B está na posição 118 (numeração EU). A posição também pode ser referida por sua posição na numeração sequencial dos aminoácidos de cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento total mostrada nas figuras 24-28, 48 e 49. De acordo com uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteina modificada por engenharia em LC-V205C (número Kabat: Val 205; número sequencial 209 na figura 27A e 49A modificado por engenharia para ser Cis nesta posição). A cisteina modificada por engenharia na cadeia leve é mostrada em Bold, texto duplo sublinhado nas figuras 27A e 49A.
De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteina modificada por engenharia em HC-A118C (número EU: Ala 118; número Kabat 114; número sequencial 118 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado por engenharia para ser Cis nesta posição). A cisteíina modificada por engenharia na cadeia pesada é mostrada em Bold, texto duplo sublinhado na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B.
De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína modificada por engenharia em Fc-S400C (número EU: Ser 400; número Kabat 396; número sequencial 400 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado por engenharia para ser Cis o nesta posição). Em outras modalidades, a cisteína modificada por engenharia da cadeia pesada (incluindo a região Fc) está em qualquer uma das seguintes posições (de acordo com a numeração Kabat com numeração EU em parênteses): 5, 23, 84, 112, 114 (numeração EU 118), 116 (numeração EU 120), 278 (numeração EU 282), 371 (numeração EU 375) ou 396 (numeração EU 400). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo humanizado anti-CD79b pai da invenção são: V5C, A23C, A8A4C, S112C, A114C (numeração EU A118C), TI16C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por e um anticorpo quimérico anti-CD79b pai da invenção são: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), TI16C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo anti-cinoCD79b pai da invenção são: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), TI16C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C) S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Em outras modalidades, a cisteína modificada por engenharia de cadeia leve está em qualquer uma das seguintes posições (de acordo com a numeração Kabat): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Assim,
mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo humanizado anti- CD79b pai da invenção são: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C, ou V205C.
Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo quimérico anti-CD79b pai da invenção são: LI15C, V110C, S114C, S121C, —S127C,S168C ou V205C.
Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo anti-cinoCD79b pai da invenção são: L15C, V110C, S114C,
S121C, S127C, S168C ou V205C.
Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti- e CD79b modificado por engenharia com cisteína que compreende um ou mais o aminoácidos sem cisteína em que o anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína liga-se a um polipeptídeo CD79b e é preparado por um processo que compreende substituir um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo parental anti-CD79b por cisteína em que o anticorpo parental compreende pelo menos uma sequência HVR selecionada de:
(a) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1- A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137);
(b) —“HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 e é AASNLES (SEQ ID NO: 132)
(c) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQOSNEDPLT (SEQ ID NO: 133)
(d) —HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1- D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (e) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1-
E18é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e
(f) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1- F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138). Em um certo aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína, compreendendo | uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96% 97 %, 98% 99 % ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos, com um anticorpo modificado por engenharia com cisteína tendo | uma sequência de aminoácidos de comprimento total da maneira aqui revelada, ou uma sequência de aminoácidos de anticorpo modificado por e engenharia com cisteína que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui | | 10 revelada.
Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado que compreende uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza o complemento de uma molécula de DNA que codifica (a) um anticorpo modificado por engenharia com cisteína com uma sequência de aminoácidos de comprimento total da maneira aqui revelada, (b) uma sequência de aminoácidos de anticorpo modificado por engenharia com cisteína que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui o revelada, (c) um domínio extracelular de um anticorpo transmembrana modificado por engenharia com proteína cisteína, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada, (d) uma sequência de aminoácidos codificada por quaisquer das sequências de ácido nucleico aqui reveladas ou (e) qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de aminoácidos de comprimento total de anticorpo modificado por engenharia com cisteína da maneira aquirevelada. Em um aspecto específico, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado sem a sequência sinal N-terminal e/ou sem a metionina de iniciação e é codificado por uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos como esta da maneira aqui descrita. Processos para produzir o mesmo | também são aqui descritos, em que aqueles processos compreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a | — codificação apropriada da molécula de ácido nucleico em condições adequadas para expressão do anticorpo modificado por engenharia com cisteina e recuperar o anticorpo modificado por engenharia com cisteína a partir da cultura de célula.
o Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo o anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado que está tanto no domínio transmembrana deletado quanto no domínio transmembrana inativado. Processos para produzir o mesmo são também aqui descritos, em que aqueles processos compreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a codificação apropriadas da molécula de ácido nucleico em condições adequadas para expressão do anticorpo modificado por engenharia com cisteíina e recuperar o anticorpo modificado por engenharia com cisteína a partir da cultura de célula.
Em outros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos e quiméricos anti-CD79b isolado modificados por engenharia com cisteina compreendendo quaisquer dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína aqui descritos ligados a um polipeptídeo heterólogo (não-CD79b). Exemplos de tais moléculas quiméricas compreendem quaisquer dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína aqui descritos ligados a um polipeptídeo heterólogo tal como, por exemplo, uma sequência tag de —epítopoou uma região Fc de uma imunoglobulina. O anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteina pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico.
Anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibitório de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, uma —maitansinoide, um derivado de dolostatem ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, um enzima nucleolítica ou similares.
Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e, preferivelmente, inibem o crescimento | o ou proliferação de ou induzem a morte de uma célula na qual eles se ligam. | Com propósitos de diagnóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser | marcados detectavelmente, anexados a um suporte sólido ou similares.
Em outros aspectos da presente invenção, a invenção fornece | vetores compreendendo DNA que codifica quaisquer dos anticorpos anti- CD79b e anticorpos anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína aqui | 15 descritos.
São também fornecidas célula hospedeiras que compreendem qualquer vetor como este.
A título de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura.
Um processo para , produzir quaisquer dos polipeptídeos aqui descritos é fornecido adicionalmente o e compreende cultivar células hospedeiras em condições adequadas para expressão do polipeptídeo desejado e recuperar o polipeptídeo desejado da cultura de célula. o Anticorpos modificados por engenharia com cisteína pode ser usado no tratamento de câncer e inclui anticorpos específicos para superfície celular e receptores transmembrana, e antígenos associado a tumor (TAA). Tais anticorpos podem ser usados como anticorpos nus (não conjugado com um medicamento ou fração de marcador) ou como conjugados de anticorpo- medicamento (ADC). Anticorpos modificados por engenharia com cisteína da invenção podem ser acoplados especifica e eficientemente ao sítio com um reagente reativo de tiol. O reagente reativo de tiol pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente de marcador de captura, um reagente fluórforo ou um intermediário medicamento-ligante. O anticorpo modificado por engenharia com cisteína pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado em um suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma fração de medicamento. À reatividade de tiol pode ser generalizada para qualquer anticorpo onde a substituição de aminoácidos com aminoácidos cisteína reativos pode ser realizada em faixas na cadeia leve selecionadas de faixas de aminoácidos: | o L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200- L210;e em faixas na cadeia pesada selecionadas de faixas de aminoácidos: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, e na região Fc em faixas selecionadas de H270-H280, H366-H376, H391-401, onde a numeração de posições aminoácido começa na posição 1 do sistema Kabat de numeração (Kabat et a/. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e continua sequencialmente depois da maneira revelada em WO2006034488; U.S. 2007/0092940. Reatividade de tiol também podem ser generalizada em certos domínios de um anticorpo, tais como o domínio o constante de cadeia leve (CL) e domínio constante de cadeia pesada, CH1, CH2eCH3. Substituições de cisteína que resultam em valor de reatividade de tióis de 0,6 e maior podem ser realizadas no domínio constante de cadeia pesada a, 5, £e, y, e py de anticorpos intactos: 1gA, IgD, IgE, IgG, e IloM, respectivamente, incluindo as subclasses IgG: I9G1, IgG2, IgG3, I9G4, IgA, e IgA2. Tais anticorpos e seus usos são revelados em WO2006/034488; U.S.
—2007/0092940. Anticorpos modificados por engenharia com cisteína da invenção mantêm preferivelmente a capacidade de ligação de antígeno de suas contrapartes de anticorpo parental tipo selvagem. Assim, anticorpos modificados por engenharia com cisteina são capazes de se ligar, preferivelmente de maneira específica, a antígenos. Tais antígenos incluem, | por exemplo, antígenos associados a tumor (TAA), proteínas de receptor de | superfície celular e outras moléculas celulares de superfície, proteínas | 5 transmembrana, proteínas de sinalização, fatores regulatórios de sobrevivência | celular, fatores regulatórios de proliferação celular, moléculas associadas (por | exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente com) ao | desenvolvimento ou diferenciação do tecido, linfocinas, citocinas, moléculas | o envolvidas na regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas na —vasculogênese e moléculas associadas (por exemplo, conhecidas ou suspeitas | de contribuir funcionalmente com) a angiogênese. O antígeno associado a tumor pode ser um fator de diferenciação de agrupamento (isto é, uma proteina CD incluindo, mas sem limitação, CD79b). Anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção mantêm a capacidade de ligação de antígeno de suas contrapartes de anticorpo anti-CD79b pai. Assim, anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção são capazes de se ligar, preferiveimente de maneira específica, a antígenos CD79b S incluindo isoformas beta e/ou alfa anti-CD79b humanas, incluindo quando tais antígenos são expressos na superfície de células, incluindo, sem limitação, | 20 célulasB.
Em um aspecto, anticorpos da presente invenção podem ser ' conjugados com qualquer fração de marcador que pode ser covalentemente anexada ao anticorpo por meio uma fração reativa, uma fração ativada ou um grupo tiol de cisteína reativa (Singh et a/ (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad RL.
(1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). o marcador anexada pode funcionar em: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com uma segundo marcador para modificar o sinal | detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, para dar FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou maior afinidade de ligação, com antígeno ou elemento de ligação; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, por carga, hidrofobicidade, forma, ou outros parâmetros físicos, ou (v) fornecer uma fração de captura para modular elemento de afinidade de ligação, ligação anticorpo/antígeno ou complexação iônica.
e Anticorpos modificados por engenharia com cisteína marcados podem ser usados em ensaios de diagnósticos, por exemplo, para detectar a expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos ou soro específicos. Para aplicações de diagnósticos, o anticorpo será tipicamente marcado com uma fração detectável. Marcas numerosas são disponíveis as quais podem estar em geral agrupadas nas seguintes categorias: Radioisótopos (radionuclídeos), tais como ?*H, *'C, *ºc, *?F, *P, SS, E oT Ga, sv. Tc, TA 123 12 1251, 4, Xe, Vu, 2VAt ou 213Bj Anticorpos marcados com radioisótopo são usados em experimentos de imageamento de receptor alvejado. O anticorpo pode ser marcado com e reagentes de elemento de ligação que ligam, quelam ou complexam de outra forma um metal radioisótipo onde o reagente é reativo com o tiol de cisteina modificado por engenharia do anticorpo, usando as técnicas descritas em . l Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et a/, Ed. Wiley- Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Elementos de ligação de quelação que podem complexar um íon metálico incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA eTETA (Macrocíclicos, Dallas, TX). Radionuclídeos podem ser alvejados por meio de complexação com os conjugados de anticorpo-medicamento da invenção (Wu et a/ (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146). Reagentes — ligantes tal como DOTA-maleimida (4
: 202 maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados pela reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) ativado com com isopropilcloroformato (Aldrich), após o procedimento de Axworthy et a/ (2000) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 97(4):1802-1807). Reagentes de DOTA-maleimida reagem com os aminoácidos sem cisteína dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína e fornecem um elemento de ligação de complexação metálica no anticorpo (Lewis et al (1998) Bioconj.
Chem. 9:72-86). Reagentes de marcação de ligante de quelação tal como DOTA-NHS ácido (1,4,7,10-tetra- oe azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético mono (N-hidroxisuccinimida éster) são comercialmente disponíveis (Macrocíclicos, Dallas, TX). Imageamento do receptor alvo com anticorpos marcados com radionuclídeo pode promover um marcador de ativação de caminho por detecção e quantificação de acúmulo progressivo de anticorpos em tecido de tumor (Albert et a/ (1998) Bioorg.
Med.
Chem.
Lett. 8:1207-1210). O conjugado rádio-metais pode permanecer intracelular após degradação lipossomal.
Complexos metal-quelado adequado como marcas de anticorpo para experimentos de imageamento são revelados: U.S 5342606; U.S 5428155; U.S 5316757; U.S 5480990; U.S 5462725; U.S 5428139; US o 5385893; U.S 5739294; U.S 5750660; U.S 5834456; Hnatowich et al (1983) J. —Immunol.
Metods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal.
Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et a/ (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al (1990) J.
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| 203 | | | 10:103-111; Miederer et al (2004) J.
Nucl.
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Biol. 20:65-74; Roselli et a/ (1999) Câncer Biotherapy & | Radiopharmaceuticals, 14:209-20. Marcas fluorescentes tais como quelados terrosos raros (quelados | de európio), tipos fluorescentes incluindo FITC, 5-carboxifluoresceina, 6-carboxi e fluoresceina; tipos rodamina incluindo TAMRA; dansil; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; vermelho Texas; e análogos destes.
As marcas fluorescentes podem ser conjugadas com anticorpos usando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo.
Corantes fluorescentes e reagentes de marcador fluorescente incluem aqueles que são comercialmente disponíveis pela Invitrogen/Molecular Sondas (Eugene, OU) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL). Várias marcas de enzima-substrato são disponíveis ou reveladas (U.S. 4275149). Em geral, a enzima em geral catalisa uma alteração química de um substrato cromogênico que pode ser medida usando várias técnicas.
Por o exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medido espectrofotometricamente.
Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato.
Técnicas para quantificar uma mudança na fluorescência são descritas anteriormente.
O substrato quimioluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (usando um —quimuioluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um aceptor fluorescente.
Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; U.S. 4737456), luciferina, 2,3-diidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase do rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), f- galactosidase, glucoamilase, lisozima, saccarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), heterocíclico oxidases (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares.
Técnicas para conjugar enzimas nos anticorpos são descritos em O'Sullivan et a/ (1981) “Metods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, em Metods in Enzym. (ed J.
Langone & H.
Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166. eo Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo:
(i) peroxidase de rábano silvestre (HRP) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB));
(ii) fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) “B-D-galactosidase —(B-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-B-D-galactosidase) ou substrato | o fluorgênico 4-metilumbelliferil-B-D-galactosidase.
Inúmeras outras combinações enzima-substrato são disponíveis aos versados na técnica.
Para uma revisão geral, ver U.S. 4275149 e US. -— 4318980. . . SN | o Um marcador pode ser indiretamente conjugada com uma cadeia lateral de aminoácido, uma cadeia lateral de aminoácido ativado, um anticorpo —modificado por engenharia com cisteina e similares.
Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e quaisquer das três amplas categorias de marcas anteriormente mencionadas podem ser conjugadas com avidina ou estreptavidina ou vice versa.
Biotina liga-se seletivamente à estreptavidina e assim, o marcador pode ser conjugada com o anticorpo nesta maneira indireta.
Alternativamente, para atingir conjugação indireta da marcador com o polipeptídeo variante, o polipeptídeo variante é conjugado com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos tipos diferentes de marcas — mencionados anteriormente é conjugado com um polipeptídeo variante anti- hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Assim, conjugação indireta da marcador com o polipeptídeo variante pode ser atingida (Hermanson, G. (1996)
em Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego). e O anticorpo da presente invenção pode ser empregado em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ELISA, ensaios de ligação competitivos, ensaios do sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal antibodies: A Manual of
Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.). Um marcador de detecção pode ser usada para localizar, visualizar e quantificar uma ligação ou evento de reconhecimento.
Os anticorpos marcados da invenção podem detectar receptores de superfície celular.
Um outro uso para anticorpos detectavelmente marcados é um método ã de imunocaptura a base de microesferas compreendendo conjugar uma e microesfera com um anticorpo marcado fluorescente e detectar um sinal de fluorescência mediante ligação de um elemento de ligação.
Metodologias de detecção de ligação similar utilizam o efeito da ressonância de plásmon de - superfície (SPR) para medir e detectar interações anticorpo-antígeno.
Ú " Marcas de detecção tais como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et al (1997) "Synthesis of Funcionalised —fluorescents Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J.
Chem.
Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) fornecem um sinal detectável e são em geral aplicáveis para marcar anticorpos, preferivemente com as seguintes propriedades: (i) o anticorpo marcado pode produzir um sinal muito alto com | fundo baixo de maneira tal que pequenas quantidades de anticorpos podem ser sensivelmente detectados tanto em ensaios sem célula quanto a base de célula; e (ii) o anticorpo marcado pode ser fotoestável de maneira tal que o sinal fluorescente pode ser observado, monitorado e gravado sem — fotodegradação significativa. Para aplicações que envolvem ligação de superfície celular de anticorpo marcado em membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, as marcas preferivelmente (iii) apresentam boa solubilidade em água para atingir concentração de conjugado oe e sensibilidade de detecção efetivos e (iv) são não tóxicos para células vivas de maneira a não interromper os processos metabólicos normais das células ou causar morte celular prematura.
A quantificação direta de intensidade de fluorescência celular e enumeração de eventos fluorescentemente marcados, por exemplo, ligação de superfície celular de conjugados peptídeo-corante, pode ser conduzida em um sistema (FMATO 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster Citi, Calif.) que automatiza ensaios de mistura e leitura não radioativos com células vivas ou microesferas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluormetric microvolume assay technology", (1999) o J. de Biomolecular Screening 4:193-204). Os usos de anticorpos marcados também incluem ensaios de ligação de receptor de superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios imunoabsorventes ligados à fluorescência (FLISA), clivagem por caspase (Zheng, "Caspase-3 controls both citoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; U.S. 6372907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow citometric detection of fosfatidilserine expression on early apoptotic cell using fluorescein labelled Anexina V" (1995) J. Immunol. Métodos 184:39-51) e ensaios de citotoxicidade. Tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico pode ser usada para identificar a supra ou infrarregulação de uma molécula que é alvejada na superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high- throughput screening using fluormetric microvolume assay technology", (1999)
Anal.
Biochem. 271:143-51). Anticorpos “marcados da invenção são usados como | biomarcadores e sondas de imageamento pelos múltiplos métodos e técnicas de imageamento biomédico e molecular tais como: (i) MRI (imageamento de | ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computadorizada); (iii) oe SPECT (tomografia computada por emissão de fóton único); (iv) PET | 10 (tomografia de emissão de pósitron) Chen et al/ (2004) Bioconjugate Chem. | 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultrassom.
Imunoscintigrafia é um procedimento de imageamento no qual anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados a um animal ou paciente humano e uma ilustração é tirada de sítios no corpos onde se localiza o anticorpo (US. 6528624). Biomarcadores de imageamento podem ser medidos e avaliados objetivamente como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas em uma intervenção terapêutica.
Biomarcadores podem ser de múltiplos tipos: Tipo O o são marcadores de histórico natural de uma doença e correlaciona-se —longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo, determinação de MRI de inflamação sinovial em artrite reumatóide; marcadores Tipo | capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de ação, ainda por meio do mecanismo, podem não estar associados ao resultado clínico; marcadores Tipo Il funcionam como pontos finais substitutos onde na —mudança ou sinal, o biomarcador prediz um benefício clínico para “validar” a resposta alvejada, tal como erosão óssea medida em artrite reumatóide por CT.
Biomarcadores de imageamento podem assim fornecer informação terapêutica farmacodinâmica (PD) com relação a: (i) expressão de uma proteína alvo, (ii)
ligação de um agente terapêutico na proteína alvo, isto é, seletividade, e (iii) dados de liberação e farmacocinética de meia vida. Vantagens de biomarcadores de imageamento in vivo com relação biomarcadores de laboratório incluem: tratamento não invasivo, determinação quantificavel de todoo corpo, determinação e dosagem repetitiva, isto é, pontos de tempo múltiplos, e efeitos potencialmente transferíveis a partir de resultado pré-clínico (animal pequeno) a clínico (humano) Para algumas aplicações, bioimageamento substitui ou diminui o número de experimentos com animal em oe estudos pré-clínicos.
Métodos de marcação de peptídeo são bem conhecidos. Ver Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratotyy Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work e E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. e Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. | e Il, CRC Press, New York; o Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Metods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin e New York; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Peptídeos e proteínas marcados com duas frações, um repórter fluorescente e inibidor em proximidade suficiente, submetem-se a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Grupos repórteres são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados por luz em certo comprimento de onda e energia de transferência em um grupo aceptor ou inibidor com o deslocamento Stokes apropriado para emissão em brilho máximo. Corantes fluorescentes incluem moléculas com maior aromaticidade, tais como fluoresceína e rodamina e seus derivados. O repórter fluorescente pode ser parcial ou significativamente inibido pela fração inibidora em um peptídeo intacto. Mediante clivagem do peptídeo por uma peptidase ou protease, um aumento detectável na fluorescência pode ser medido (Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzyms”, Metods in Enzymology, o Academic Press, 248:18-34).
Os anticorpos marcados da invenção também podem ser usados como um agente de purificação de afinidade. Neste processo, o anticorpo marcado é imobilizado em uma fase sólida como uma resina Sephadex ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado está conectado com uma amostra que contém o antígeno a ser purificado e, consequentemente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto o antígeno a ser purificado, que está ligado à variante do polipeptídeo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal o como tampão glicina, pH 5,0, que liberará o antígeno do variante de polipeptídeo.
Reagentes de marcação carregam tipicamente funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com uma cisteína tiol de um anticorpo modificado por engenharia com cisteína para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente ligante para formar um intermediário ligante-marcador, ou (iii) com um anticorpo ligante para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reativa de reagentes de marcação incluem: maleimida, haloacetila, iodoacetamida succinimidil éster (por exemplo, NHS, N-hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6-diclorotriazinila, pentafluorfenil éster, e fosforamidita, embora outros grupos funcionais também possam ser usados. Um grupo funcional reativo exemplar é N-hidroxisuccinimidil éster (NHS) de um grupo carboxila substituinte de um marcador detectável, por exemplo, biotina ou um corante fluorescente. O NHS éster do marcador pode ser realizado, isolado, purificado, e/ou caracterizado, ou pode ser formado in situ e reagido com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxila do marcador é ativada reagindo com alguma combinação de um reagente carbodiimida, por exemplo, dicicloexilcarbodiimida, oe diisopropilcarbodiimida, ou um reagente urônio, por exemplo, TSTU tetrafluorborato de (O-(N-Succinimidil)-N,N,N' N'-tetrametilurônio, HBTU (O- benzotriazol-1-il)- N,N,N' N'-tetrametilurônio hexafluorfosfato), ou HATU (O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N' N'-tetrametilurônio hexafluorfosfato), um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), e N-hidroxisuccinimida para dar o NHS éster da marcador. Em alguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados in situ por ativação do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado marcador-anticorpo em uma etapa. Outros reagentes de ativação e acoplamento incluem TBTU (2-(1H-benzotriazo-1-11)-1-1,3,3- tetrametilurônio hexafluorfosfato), TFFH (N,N',Nº, N”-tetrametilurônio 2-flúor- o hexafluorfosfato), = hexafluorfosfato de PyBOP (benzotriazol-1-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfônio, EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-diidro-quinolina), DCC (dicicloexilcarbodiimida); — DIPCDI — (diisopropilcarbodiimida) MSNT — (1- (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol, e haletos de aril sulfonila, por exemplo, cloreto de triisopropilbenzenossulfonila.
ComPosTOS FAB DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA DA INVENÇÃO: Em um aspecto, o anticorpo da invenção está ligado a uma proteína de ligação de albumina. A ligação plasma-proteína pode ser de uma maneira eficiente de melhorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. Albumina é a proteína mais abundante no plasma. Peptídeos de ligação de albumina sérica (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínio ativo fundidas, incluindo alteração, absorção, penetração e difusão de tecido.
Estes parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados por seleção específica da sequência de peptídeo de ligação de albumina sérica apropriada (U.S. 20040001827). Uma série de peptídeos de ligação de albumina foram identificados triando a exibição de fago (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As a General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteínas” J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Compostos da ) invenção incluem preceitos de sequências ABP por: (i) Dennis et a/ (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 nas tabelas |ll e IV, página 35038; (ii) US. 20040001827 em [0076] SEQ ID NO: 9-22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12- 13, todos os quais são aqui incorporados pela referência.
Fabs de ligação de albumina (ABP) são modificados por engenharia fundindo um peptídeo de ligação de albumina ao terminal C de Fab de cadeia pesada em razão — estequiométrica 1:1 (1 ABP / 1 Fab). Observa-se que a associação destes ABP-Fabs com albumina aumenta a meia vida do anticorpo em mais que 25 vezes em coelhos e camundongos.
Os resíduos Cis reativos anteriormente descritos podem portanto ser introduzidos nestes ABP-Fabs e usados para o conjugação de sítio específico com medicamentos citotóxicos seguido por — estudos em animal in vivo.
Sequências de peptídeos de ligação de albumina exemplificativos incluem, mas sem limitações, as sequências de aminoácidos listadas em SEQ ID NO: 246-250: CDKTHTGGGSQARLMEDICLPRWGCLWEDDF — SEQ ID NO: 246 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 247 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 248 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 249 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 250
CONJUGADOS DE ANTICORPO-MEDICAMENTO Em um outro aspecto, a invenção fornece imunoconjugados, ou conjugados de anticorpo-medicamento (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, um — medicamento, um agente inibitório de crescimento, um toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Em um outro aspecto, a invenção fornece adicionalmente oe métodos de usar os imunoconjugados. Em um aspecto, um imunoconjugado compreende quaisquer dos anteriores anticorpos anti-CD79b anexados covalentemente a um agente citotóxico ou um agente detectável.
Em um aspecto, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b. Em uma outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado pelo fragmento Fab de um anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, um anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) ou um o anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de cada anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413 depositado com a ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de I9GG1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b (isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog 555678; San Jose, CA), AT1I105-1 (ADD Serotec Catalog tMCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (ALD Serotec Catalog HXMCAZ2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog 84557592; San Jose, CA)).
| | |
Em outro aspecto, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epitopo em CD79b distinto de um epítopo ligado por um outro anticorpo CD79b.
Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epítopo em CD79b distinto de um epítopo ligado pelo fragmento Fab de anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados com a ATCC em 20 de julho de 1993, anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de oe cada anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413depositados com a ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de I9G1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epítopo em CD79b distinto de um epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b (isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog %X555678; San Jose, CA), AT1I05-1 (ADD Serotec Catalog t%MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (ADD Serotec Catalog tMCAZ2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog X557592; San Jose, CA)). o Em outro aspecto, um anticorpo CD79b da invenção é distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab do anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, o anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de anticorpo gerado a partir de hibridomas — depositados com à ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de IgG1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que | compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: | 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção é | | | | E SSÇ.— , | distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab de um outro anticorpo CD79b ((isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog 4555678; San Jose, CA), AT105-1 (ADD Serotec Catalog XMCA2208; Raleigh, NO), AT107-2 (ADD Serotec Catalog tMCA2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog 4557592; — SanJose,CA)).
Em um aspecto, um anticorpo da invenção liga-se especificamente a CD79b de uma primeira espécie animal, e não se liga especificamente a CD79b de uma segunda espécie animal. Em uma oe modalidade, a primeira espécie animal é humana e/ou primata (por exemplo, macaco cinomolgo), e a segunda espécie animal é murina (por exemplo, camundongo) e/ou canina. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é humana. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é primata, por exemplo, macaco cinomolgo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é murina, por exemplo, camundongo. Em uma modalidade, a segunda espécie animalé canina.
Em um aspecto, a invenção fornece composições que compreendem um ou mais anticorpos da invenção e um veículo. Em uma modalidade, o veículo é farmaceuticamente aceitável.
o Em um aspecto, a invenção fornece ácido nucleicos que codificam um anticorpo CD79b da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece vetores que compreendem um ácido nucleico da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico ou um vetor da invenção. Um vetor pode ser de qualquer tipo, por exemplo um vetor recombinante tal como um vetor de expressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode ser usada. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula procariótica, por exemplo, E. coli. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula A '
eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero tal como célula de ovário do hamster chinês(CHO). Em um aspecto, a invenção fornece métodos para produzir um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo CD79b (que, da maneira aqui definida inclui comprimento total e fragmentos deste), o dito método compreendendo expressar em uma célula hospedeira adequada um vetor recombinante da invenção que codifica o dito anticorpo (ou fragmento deste), e recuperar o dito oe anticorpo.
Em um aspecto, a invenção fornece um artigo de fabricação que compreende um recipiente; e uma composição contida no recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos CD79b da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, uma composição que compreende um anticorpo compreende adicionalmente um veículo, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um artigo de fabricação da invenção compreende adicionalmente instruções para administrar a composição (por exemplo, o anticorpo) a um sujeito.
o Em um aspecto, a invenção fornece um estojo que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição compreendendo um ou mais anticorpos CD79b da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Em uma modalidade, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, uma composição que compreende um anticorpo antagonista compreende adicionalmente um veículo, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um estojo compreende adicionalmente instruções para administrar a composição (por exemplo, o anticorpo) a um sujeito.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo CD79b
RR
| 216 | da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ! | e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um ' distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou | | distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins | (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, ' | NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), | linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), | | leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto. | oe Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ácido nucleico dainvenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico | e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um | distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins | (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um vetor de o expressão da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou ! distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de uma célula hospedeira da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento RED,
terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um artigo de o fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um estojo da , invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico o e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa.
Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibir o crescimento de uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com um anticorpo da invenção causando por meio disso uma inibição de crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um mamífero com um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo da oe invenção, tratando efetivamente por meio disso o dito mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento. Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio de célula proliferativa associado a maior expressão de CD79b, o dito método compreendendo administrar a um sujeito que necessita de tal tratamento uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, tratando ou prevenindo efetivamente por meio disso o dito distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, o dito distúrbio proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma o modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento. Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir o crescimento de uma célula, em que crescimento da dita célula depende pelo menos em parte de um efeito de potenciação de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, inibindo por meio disso o crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar
| 219 terapeuticamente um tumor em um mamífero, em que o crescimento do dito | tumor depende pelo menos em parte de um efeito de potenciação de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, tratando — efetivamente por meio disso o dito tumor.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar câncer oe que compreende administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado aqui descrito, diluente, veículo ou excipiente aceitável.
Em uma modalidade, o câncer é selecionado do linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de | 15 célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do | manto.
Em uma modalidade, ao paciente é administrado um agente citotóxico em combinação com o conjugado do composto anticorpo-medicamento. | Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibir e proliferação de célula B compreendendo expor uma célula a um —imunoconjugado que compreende um anticorpo da invenção em condições permissivas para ligação do imunoconjugado no CD79b.
Em uma modalidade, a proliferação de célula B é selecionada de linfoma, linfoma não Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Em uma modalidade, a célula B é um xenoenxerto.
Em uma modalidade, a exposição ocorre in vitro.
Em uma modalidade, a exposição ocorre in vivo.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de determinar o presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, o dito método compreendendo expor a dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinar a ligação do dito anticorpo no CD79b na dita amostra, em que a ligação do dito anticorpo no CD79b na dita amostra é indicativa da presença da dita proteina na dita amostra. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra biológica. In um modalidade adicional, a amostra biológica compreende células B. Em uma modalidade, a amostra biológica é de um mamífero experimentando ou ) suspeito de experimentar um distúrbio de célula B e/ou um distúrbio proliferativo de célula B incluindo, mas sem limitação, linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
Em um aspecto, um método de diagnosticar um distúrbio de célula proliferativa associado a um aumento nas células, tal como células B, que expressam CD79b é fornecido, o método compreende colocar uma células teste em uma amostra biológica em contato com quaisquer dos anticorpos e anteriores; determinar o nível de anticorpo ligado à células testes na amostra —detectando a ligação do anticorpo no CD79b; e comparar o nível de anticorpo ligado nas células em uma amostra controle, em que o nível de anticorpo ligado é normalizado com o número de célula que expressa CD79bs nas amostras | teste e controle, e em que um nível maior de anticorpo ligado na amostra teste comparado à amostra controle indica a presença de um distúrbio de célula —proliferativa associado a células que expressam CD79b.
Em um aspecto, um método de detectar CD79b solúvel em sangue ou soro é fornecido, o método compreendendo colocar uma amostra teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de experimentar um distúrbio de célula B proliferativo em contato com um anticorpo anti-CD79b da invenção e detectar um aumento em CD79b solúvel na amostra teste com relação a uma amostra controle de sangue ou soro de um mamífero normal. | Em uma modalidade, o método de detectar é usado como um método de — diagnosticar um distúrbio proliferativo de célula B associado a um aumento em | CD79b solúvel em sangue ou soro de um mamífero. | Em um aspecto, um método de ligar um anticorpo da invenção a uma célula que expressa CD79b é fornecido, o dito método compreendendo | oe colocar a dita célula em contato com um anticorpo da invenção.
Em uma | 10 modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico.
Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
Métodos da invenção podem ser usados para afetar qualquer estado patológico adequado, por exemplo, células e/ou tecidos associados a expressão de CD79b.
Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula hematopoiética.
Por exemplo, uma célula hematopoiética pode ser uma selecionada do grupo que consiste em um linfócito, leucócito, plaqueta, eritrócito e célula de exterminação natural.
Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma o célula B ou célula T.
Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula cancerígena.
Por exemplo, uma célula cancerígena pode ser uma selecionada do grupo que consiste em uma célula de linfoma, célula de leucemia ou célula de mieloma.
Métodos da invenção podem compreendem adicionalmente etapas de tratamento adicionais.
Por exemplo, em uma modalidade, um —método compreende adicionalmente uma etapa em que uma célula e/ou tecido alvejado (por exemplo, uma célula cancerígena) é exposto ao tratamento de radiação ou um agente quimioterápico.
Da maneira aqui descrita, CD79b é um componente de
| 222 ! | sinalização do receptor de célula B.
Dessa maneira, em uma modalidade de | métodos da invenção, uma célula que é alvejada (por exemplo, uma célula cancerígena) é uma na qual CD79b é expresso comparado a uma célula que não expressa CD79b.
Em um modalidade adicional, a célula alvejada é uma —célulacancerígena na qual a expressão de CD79b é maior comparada à uma célula não normal de câncer do mesmo tipo de tecido.
Em uma modalidade, um método da invenção causa a morte de uma célula alvejada.
Em outros aspectos da presente invenção, a invenção fornece oe vetores compreendendo DNA que codifica quaisquer dos anticorpos aqui descritos.
Célula hospedeira que compreende qualquer vetor como este também são fornecidas.
A título de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura.
Um processo para produzir quaisquer dos anticorpos aqui descritos é fornecido adicionalmente e compreende cultivar células hospedeiras em condições adequadas para expressão do anticorpo desejado e recuperar o anticorpo desejado da cultura de célula.
Ainda em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição de material compreendendo um anticorpo anti-CD79b da maneira o aqui descrita, em combinação com um veículo.
Opcionalmente, o veículo é um — veículo farmaceuticamente aceitável.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b da maneira aqui descrita, para a preparação de um medicamento usado no tratamento de uma condição que é responsiva ao anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b.
Um outro aspecto da invenção é uma composição que compreende uma mistura de compostos anticorpo-medicamento da fórmula | onde o carregamento médio de medicamento por anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5 ou cerca de 3 a cerca de 4.
Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica incluindo um composto da fórmula | ADC, uma mistura de compostos da fórmula | ADC, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Um outro aspecto fornece uma combinação farmacêutica que compreende um composto da fórmula | ADC e um segundo composto com propriedades anticâncer ou outros efeitos terapêuticos.
Um outro aspecto é um método para matar ou inibir a proliferação e de células de tumor ou células de câncer que compreende tratar as células com uma quantidade de um conjugado de anticorpo-medicamento da fórmula |, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, que é efetivo para matar ou inibir a proliferação das células de tumor ou células de câncer.
Um outro aspecto é um método de tratar câncer que compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica incluindo uma fórmula | ADC.
Um outro aspecto inclui artigos de fabricação, isto é, estojos, compreendendo um conjugado de anticorpo-medicamento, um recipiente, e uma instrução para uso ou marcador indicando um tratamento.
o Um aspecto da invenção é um método para preparar um conjugado de medicamento da fórmula | de anticorpo composto que compreende as etapas de: (a) reagir um grupo de cisteina modificada por engenharia do anticorpo modificado por engenharia com cisteina com um reagente ligante para formar intermediário anticorpo-ligante Ab-L; e (b) reagir Ab-L com uma fração ativada de medicamento D; por meio do que o conjugado de anticorpo-medicamento é formado; ou que compreende as etapas de: (c) reagir um grupo nucleofílico de uma fração de medicamento com um reagente ligante para formar intermediário medicamento-ligante D-L; e (d) reagir D-L com um grupo de cisteína modificada por engenharia do anticorpo modificado por engenharia com cisteína; por meio do que o conjugado de anticorpo- medicamento é formado. Um aspecto da invenção é um ensaio para detectar células de câncer que compreende: (a) expor células a um conjugado anticorpo anti- | 5 —CD79b modificado por engenharia com cisteina-medicamento; e (b) determinar a extensão da ligação do conjugado anticorpo anti-CD79b modificado por | engenharia com cisteína-medicamento composto nas células. A. ANTICORPOS ANTI-CD79B e Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos anti- CD79b que podem ser aqui usados como agentes terapêuticos. Anticorpos exemplificativos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
1. ANTICORPOS POLICLONAIS Anticorpos policlonais são preferivelmente aumentados em animais por injeções subcutâneas múltiplas (sc) ou intraperitoneal (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Podem ser usados para conjugar o antígeno relevante (especialmente quando peptídeos sintéticos são usados) em uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, o o antígeno pode ser conjugado com a hemocianina do caramujo(KLH), — albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugação por meio de resíduos de cisteína), Nº hidroxisuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido suceínico, SOCk2, ou RIN=C=NR, onde R e R' são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados combinando, por exemplo, 100 ug ou 5 ug da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em sítios múltiplos. Sete a 14 dias depois, é coletado sangue dos animais e o soro é ensaiado para titulação de anticorpo. Os animais são estimulados até a titulação platô. Os conjugados também podem ser preparados em cultura de célula recombinantes como fusões protéicas. Além disso, agentes de agregação tal como alume são usados adequadamente para melhorar a resposta imune. e 2. ANTICORPOS MONOCLONAIS Anticorpos monoclonais pode ser preparados usando o método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et a/., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser preparado por métodos de DNA recombinante (patente U.S. 4,816,567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado da maneira descrita — anteriormente para elicitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente na proteína usada para imunização.
Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e a seguir ligados com uma linhagem celular de mieloma o usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas em um meio de cultura adequado, no qual o meio contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou — sobrevivência das células de mieloma não fundidas pai (também referidas como fusão). Por exemplo, se as células de mieloma pai precisam da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas incluirão tipicamente hipoxantina,
| 226 aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes HGPRT. | | Células de mieloma de fusão preferidas são aquelas que fundem | | eficientemente, suportam produção estável de alto nível de anticorpo pelas | 5 células que produzem o anticorpo selecionado, e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas.
Linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma em murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 oe disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e SP-2 e derivados, por exemplo, células X63-Ag8-653 disponíveis pela | American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA.
Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J.
Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Meio de cultura no qual células de hibridoma são crescidas é ensaiado para produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. o Preferivelmente, a especificidade da ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou ' : — porum ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA). | A afinidade de ligação do anticorpo monocional, por exemplo, pode ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal.
Biochem., 107:220 (1980). Uma vez que células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas são identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e crescidos
E DE RR SO DE Ri oi âíó ET o AO Et A E TIIA;I;Iº;íII EECOc,O)o>ocoocõcõcÔcõeõcvrvóúêcóe oa a A o | 227 por métodos padrões (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles e Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma pode ser crescidas in vivo como tumores de ascite em um | animal, por exemplo, por injeção intraperitoneal das células em camundongos. | Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são | separados adequadamente do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por | | procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tal como, por | oe exemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando proteína A ou | 10 proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia de | hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise, etc.
DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeia pesadas e leves de anticorpos murina). As células de hibridoma funcionam como uma fonte preferida de tal DNA.
Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são a seguir transfectados em célula hospedeiras, tais como células E. coli, células COS de o símios, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que —não produzem de outra maneira proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
Artigos de revisão na expressão recombinante em DNA de bactérias que codificam o " anticorpo incluem Skerra et al., Curr.
Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol.
Revs. 130:151-188 (1992). Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou . fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando as técnicas descritas em McCafferti et a/., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et a/., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al/.,
J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) misturando as cadeias (Marks et a/., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito amplas (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo oe monoclonal tradicional para isolamento de anticorpos monocionais.
O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir polipeptídeos de anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, substituindo sequências de domínio constante de cadeia pesada e cadeia leve humanas (Cu e C1) pelas sequências homólogas de murino (patente U.S. 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou fundindo a | 15 sequência de codificação de imunoglobulina com toda ou parte da sequência de codificação com um polipeptíideo não imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As sequências de polipeptídeos não imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou elas pode ser o substituídas pelos domínios variáveis de um sítio de cominação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno diferente.
3. ANTICORPOS HUMANOS E HUMANIZADOS Os anticorpos anti-CD79b da presente invenção podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (murinos, por exemplo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos
(tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')) ou outras subsequências de anticorpos de ligação a antígenos)) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulihna não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que os resíduos de uma região determinadora de complementaridade (CDR) do recebedor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tais como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da estrutura [À de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram nem nas sequências do anticorpo recebedor nem nas da CDR importada nem nas da estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis em que todas ou substancialmente todas asregiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de o imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana [Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et a/l., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Refere-se a estes resíduos de aminoácidos não humanos como resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”, A humanização pode ser essencialmente conduzida seguindo-se o método de Winter e colaboradores [Jones et a/., Nature, 321:522-525 (1986);
Riechmann et a/., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo-se as sequências correspondentes de um anticorpo humano por CDRs ou sequências de CDRs de roedores. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (patente US. No. 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente proveniente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de o CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos provenientes de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade e resposta HAMA (anticorpo humano anti-murino) quando o anticorpo é destinado a ser usado para a terapêutica humana. A redução ou a eliminação de uma resposta HAMA constitui um aspecto significativo do desenvolvimento clínico de agentes terapêuticos adequados. Veja, por exemplo, Khaxzaeli et a/., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al, J.
o Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miler eta, Blood (1983), 62:988; Hakimi ef al/., J. Immunol. (1991), 147:1352; — Reichmann et a/., Nature (1988), 332:323; Junghans et a/., Cancer Res. (1990), ' 50:1495. Conforme descrito no presente documento, a invenção propõe anticorpos que são humanizados de tal modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ser ainda obtidas usando-se métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais serão descritos com mais detalhes abaixo. De acordo com o método denominado “do melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é testada contra a biblioteca integral de sequências conhecidas de domínios variáveis humanos. A sequência do domínio V humano que estiver mais próxima à do roedor é identificada e a região de estrutura (FR) humana em seu interior aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Um outro método usa uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et O a immuno 151:2623 (1993).
Uma sequência de aminoácidos, por exemplo, proveniente de um anticorpo conforme descrito no presente documento pode servir como uma sequência de partida (genitora) para diversificação da(s) sequência(s) de estrutura e/ou hipervariáveis. Refere-se a uma sequência de estrutura selecionada à qual uma sequência hipervariável de partida se liga como uma estrutura humana aceitadora. Embora as estruturas humanas aceitadoras possam ser provenientes ou derivadas de uma imunoglobulina humana (as | regiões VL e/ou VH suas), é preferível que as estruturas humanas aceitadoras | sejam provenientes ou derivadas de uma sequência de estrutura de consenso o humana, uma vez que tais estruturas demonstraram ter uma imunogenicidade mínima ou nenhuma em pacientes humanos.
Nos casos em que a aceitadora é derivado de uma imunoglobulina humana, pode-se selecionar opcionalmente uma sequência de estrutura humana que é selecionada com base na sua homologia à sequência de estrutura doadora por alinhamento da sequência de estrutura doadora com diversas sequências de estrutura humanas em uma coleção de sequências de estrutura humanas e selecionar a sequência de estrutura com uma maior homologia como o aceitador.
Em uma modalidade, as estruturas de consenso humanas do presente invenção são provenientes ou derivadas de sequências de estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH e/ou do subgrupo | capa de VL.
Assim, a estrutura humana aceitadora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas as sequências de estrutura abaixo: FR1 compreendendo EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo FR3 compreende oe RFTISX,DX2SKNTX3Y LQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 147), em que X, é AouR XéTouN,eX;éAouL, FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146). Exemplos de estruturas de consenso de VH incluem: Estrutura de consenso do subgrupo | de VH humano subtraída de CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 108); estrutura de consenso do subgrupo | de VH humano subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 109-111); estrutura de consenso do subgrupo |l de VH humano subtraída de CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 112); o estrutura de consenso do subgrupo |l de VH humana subtraída dasregiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 113-115); estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 116); estrutura de consenso do subgrupo Ill de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 117-119); estrutura aceitadora de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 120); estrutura aceitadora de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 121-122);
estrutura aceitadora 2 de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 123); ou estrutura aceitadora 2 de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 124-126). Em uma modalidade, a estrutura aceitadora de VH humana compreende uma, duas, três ou todas as seguintes sequências de estrutura: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), oe FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 148), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 150), ou RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 151) FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146). A estrutura humana aceitadora VL pode compreender, uma, duas, três ou todas as sequências de estruturas: o FR1 compreendendo DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:139), FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140), FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142). Exemplos de estruturas de consenso VL incluem: Estrutura de consenso do subgrupo | kapa humano VL (SEQ ID NO: 127); estrutura de consenso do subgrupo Il kapa humano VL (SEQ ID
NO: 128); estrutura de consenso do subgrupo Il! kapa humano VL (SEQ ID NO: 129); ou estrutura de consenso do subgrupo IV kapa humano VL (SEQ ID NO:130) Embora a aceitadora possa ser idêntica em sequência à sequência de estrutura humana selecionada, quer seja proveniente de uma imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, a presente oe invenção propõe que a sequência aceitadora possa compreender substituições de aminoácidos pré-existentes relativas à sequência de imunoglobulina humana ou sequência de estrutura de consenso humana. Estas substituições pré-existentes são, de preferência, mínimas; geralmente quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácido somente relativa à sequência de imunoglobulina humana ou à sequência de estrutura de consenso.
Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados às estruturas humanas aceitadoras VL e/ou VH. Pode-se incorporar, por exemplo, resíduos que correspondem aos resíduos de CDR de Kabat, aos resíduos de alça hipervariável de Chothia, aos resíduos Abm, e/ou o resíduos de contato. Opcionalmente, são incorporados os resíduos de região —hipervariável prolongada seguintes: 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3). o Embora seja discutida no presente documento a “incorporação” de resíduo de região hipervariável, deve se observar que isso pode ser produzido de diversos modos, ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desejada pode ser gerado, por exemplo, por mutação do ácido nucleico que codifica a sequência do domínio variável murino de modo que os seus resíduos de estrutura sejam alterados nos resíduos de estrutura humana aceitadora, ou por mutação do ácido nucleico que codifica a sequência de domínio variável humana de modo que o resíduos do domínio hipervariável são alterados em resíduos não humanos, ou por síntese de ácido nucleico que codifica a sequência desejada etc.
Nos exemplo do presente documento, as variantes enxertadas com região hipervariável foram geradas por mutagênese de Kunkel de ácido nucleico que codifica as sequências aceitadoras humanas, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Kunkel et al, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Alterações adequadas podem ser e introduzidas na estrutura e/ou na região hipervariável, usando-se técnicas de rotina, para corrigir e restabelecer as interações adequadas entre a região hipervariável e o antígeno.
A exibição de fagos (fagemídeos) (a que se refere também aqui como exibição de fagos em alguns contextos) pode ser usada como um método conveniente e rápido para a geração e teste de muitos anticorpos | variantes potenciais diferentes em uma biblioteca gerada pela aleatorização de | sequências. No entanto, outros métodos para a preparação e teste de anticorpos alterados estão disponíveis aos versados na técnica.
A tecnologia de exibição de fagos (fagemídeos) proporcionou uma o ferramenta poderosa para a geração e seleção de proteínas inéditas que se ligam a um ligante, tal como um antígeno. Usando-se as técnicas de exibição de fagos (fagemídeos) permite a geração de grandes bibliotecas de variantes de proteinas que podem ser rapidamente selecionadas para aquelas sequências que se ligam a uma molécula alvo com alto grau de afinidade. Os ácidos nucleicos que codificam peptídeos variantes são geralmente ligados a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de revestimento viral, tal como a proteína do gene Ill ou a proteína do gene VIIl. Foram desenvolvidos sistemas de exibição de fagemídeos monovalentes em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína ou o polipeptídeo está fundida a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma porção da proteína do gene Ill (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). Em um sistema de exibição de fagemídeo monovalente, o gene de fusão é expresso a níveis baixos e as proteinas do gene Ill do tipo selvagem são também expressas de modo tal, que é conservada a ineficácia das partículas. Métodos de geração de bibliotecas de peptídeos e a seleção destas bibliotecas já foram divulgados em muitas patentes (tais como, por exemplo, patente U.S. No.
oe 5.723.286, patente U.S. No. 5.432.018, patente U.S. No. 5.580.717, patente US. No. 5.427.908 e patente U.S. No. 5.498.530).
Foram preparadas bibliotecas de anticorpos ou de polipeptídeos que se ligam a antígeno em uma série de modos incluindo por alteração de um único gene por inserção de sequências aleatórias de DNA ou por clonagem de uma família de genes aparentados. Os métodos para a exibição de anticorpos ou de fragmentos que se ligam a antígeno usando-se exibição de fagos (fagemídeos) foram descritos nas patentes U.S. Nos. 5.750.373, 5.733.743,
5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717, e 5.658.727. A biblioteca é então testada para expressão de anticorpos ou de proteínas que se ligam a antígeno o com as características desejadas. Métodos de substituição de um aminoácido de escolha em um * "ácido nucleico gabarito são bem estabelecidos na técnica, sendo alguns deles descritos no presente documento. Os resíduos de região hipervariável, por exemplo, podem ser substituídos usando-se o método de Kunkel. Veja, por exemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
A sequência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntos de códons projetados para os resíduos de região hipervariável a serem alterados. Um conjunto de códons é um conjunto de sequências de tripletos de nucleotídeos diferentes usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Os conjuntos de códons podem ser representados usando-se símbolos para designar nucleotídeos específicos ou misturas equimolares de nucleotídeos conforme mostrado abaixo de acordo com o código IUB. CópiGos IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina e R(A ou G) YíCouT) M(A ou C) K(G ouT) S(CouG) W (A ou T) H(A ou C ou T) B(C ou G ou T) V(AouCouG) D(AouGouT)H e N(AouCouGouT) No conjunto de códons DVK, por exemplo, D pode consistir nos nucleotídeos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de códons pode apresentar 18 códons diferentes e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys.
Os conjuntos de oligonucleotídeos ou iniciadores podem ser sintetizados usando-se métodos padrão. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fase sólida, contendo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto de códons que codificará o grupo desejado de aminoácidos. A síntese de oligonucleotideos com uma “degeneração” de nucleotídeos selecionada em determinadas posições é conhecida nesta técnica. Tais conjuntos de nucleotídeos que têm determinados conjuntos de códons podem ser sintetizados usando-se sintetizadores comerciais de ácidos nucleicos (disponíveis de Applied Biosystems, Foster City, CA, por exemplo) ou podem ser obtidos no comércio (de Life Technologies, Rockville, MDF, por exemplo). Portanto, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados que tem um conjunto de códons específico e tipicamente incluirá uma multiplicidade de oligonucleotídeos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códons no interior da sequência como um todo. Os oligonucleotídeos, conforme usados de acordo com a presente invenção, têm sequências que permitem a hibridização a um gabarito de ácido nucleico de domínio variável e podem também incluir sítios de enzima de restrição para fins de clonagem.
Em um método, as sequências de ácidos nucleicos que codificam ácidos nucleicos variantes podem ser criadas por mutagênese mediada por oligonucleotídeo. Esta técnica é conhecida na técnica conforme descrita por ; Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987). Resumindo, as o sequências de ácidos nucleicos que codificam aminoácidos variantes são criadas hibridizando-se um conjunto de oligonucleotídeos que codifica os conjuntos de códons desejados em um gabarito de DNA, em que o gabarito consiste na forma de um único filamento do plasmídeo que contém uma sequência de gabarito de ácido nucleico de região variável. Depois da hibridização, usa-se polimerase de DNA para sintetizar um filamento segundo complementar integral do gabarito que assim incorporará o iniciador de oligonucleotídeo e conterá os conjuntos de códons conforme fornecidos pelo conjunto de oligonucleotídeos.
Geralmente, os oligonucleotídeos de pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento são usados.
Um oligonucleotídeo ótimo terá de 12 a 15 nucleotídeos que são totalmente complementares ao gabarito dos dois lados do(s) nucleotídeo(s) que codifica(m) a mutação(ões). Isto assegura que o oligonucleotídeo hibridizará adequadamente com a molécula de gabarito de DNA de um filamento único.
Os oligonucleotídeos são facilmente sintetizados usando-se técnicas conhecidas na técnica tais como as descritas por Crea et al., Proc.
Nat'l.
Acad.
Sci.
USA, 75:5765 (1978). O gabarito de DNA é gerado por aqueles vetores ou que são e derivados dos vetores M13 de bacteriófagos (os vetores M13mp18 e M13mp19 disponíveis no mercado são adequados) ou aqueles vetores que contêm uma origem de replicação de fago de um único filamento conforme descrito por Viera et al.
Meth.
Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que deve ser submetido a mutação pode ser inserido em um destes vetores para gerar | gabarito de um único filamento.
A produção do gabarito de um único filamento | 15 é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et al., acima.
Para se alterar a sequência de DNA nativo, o oligonucleotídeo é | hibridizado com o gabarito de um único filamento em condições de hibridização adequadas.
Uma enzima de polimerização de DNA, geralmente a T7 DNA o polimerase ou o fragmento Klenow de DNA polimerase |, é então acrescentada parasintetizar o filamento complementar do gabarito usando o oligonucleotídeo como um iniciador para a síntese.
Uma molécula heteroduplex é então formada de tal-modo que um filamento de DNA codifica a forma que sofreu mutação do ' gene 1, e o outro filamento (o gabarito original) codifica a sequência nativa inalterada do gene 1. A molécula heteroduplex é então transformada em uma —célulahospedeira adequada, geralmente um procarionte, tal como JM101 de E. coli, Depois de se ter cultivado as células elas são dispostas sobre placas de agarose e testadas usando-se o iniciador de oligonucleotídeo rádio-rotulado com um 32-Fosfato para identificar as colônias bacterianas que contêm o DNA que sofreu mutação. O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo tal, que é criada uma molécula homoduplex em que os dois filamentos do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões). AS modificações são as seguintes. O —oligonucleotídeo de um único filamento é desnaturado no gabarito de um único filamento — conforme — descrito — acima. Uma mistira de três desoxirribonucleotídeos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxiriboguanosina í (AGTP) e desoxirribotimidina (ATT), é combinada com uma e tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que pode ser obtida de Amersham). Esta mistura é acrescentada ao complexo gabarito oligonucleotídeo. Depois da adição da DNA polimerase a esta mistura, é gerado um filamento de DNA idêntico ao gabarito exceto pelas bases que sofreram mutação. Além disso, este novo filamento de DNA conterá dCTP-(aS) em de dCTP, que serve para protegê-lo da digestão por endonuclease de restrição. Depois do filamento do gabarito do heteroduplex de dois filamentos ter levado um pique com uma enzima de restrição adequada, o filamento do | gabarito pode ser digerido com Exolll nuclease ou com uma outra nuclease | adequada além da região que contém o(s) sítio(s) a serfem) submetidos a o mutagênese. A reação é então interrompida, para deixar uma molécula que é | 20 somente parcialmente constituída por um único filamento. Um homoduplex de DNA de dois filamentos completo é então formado usando-se DNA polimerase | : na presença de todos os quatro desóxi-ribonucleotídeos trifosfatos, ATP e DNA | ligase. Esta molécula de homoduplex pode então ser transformada em uma célula hospedeira adequada.
Conforme já indicado anteriormente, a sequência do conjunto de oligonucleotídeos tem um comprimento suficiente para se hibridizar com o ácido nucleico do gabarito e pode também, mas não necessariamente, conter sítios de restrição. O gabarito de DNA pode ser gerado por aqueles vetores que ou são derivados dos vetores M13 de bacteriófagos ou de vetores que contêm uma origem de replicação de fagos de um único filamento conforme descrito por Viera et al.
Meth.
Enzymol., 153:3 (1987). Portanto, o DNA que é submetido a mutação deve ser inserido me um destes vetores para gerar gabarito de um sófilamento.
A produção do gabarito de um só filamento é descrita nas seções 4,21-4,41 de Sambrook et al. acima.
De acordo com um outro método, a ligação a antígeno pode ser restaurada durante a humanização dos anticorpos por meio da seleção das e regiões hipervariáveis reparadas (Pedido No. 11/061,841, depositado em 18 de fevereiro de 2005). O método inclui a incorporação de regiões hipervariáveis não humanas sobre uma estrutura aceitadora e a introdução ainda de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma ou mais regiões hipervariáveis sem modificação da sequência de estrutura aceitadora.
Alternativamente, a introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos pode ser acompanhada por modificações na sequência de estrutura aceitadora.
De acordo com um outro método, pode ser gerada uma biblioteca provendo-se a montante e a jusante conjuntos de oligonucleotídeos, tendo Ú cada conjunto uma multiplicidade de oligonucleotideos com diferentes o sequências, estabelecidas as sequências diferentes pelos conjuntos de códons providos dentro da sequência dos oligonucleotídeos.
Os conjuntos de oligonucleotídeos a montante e a jusante, juntamente com uma sequência de | ácidos nucleicos de gabarito do domínio variável podem ser usadas em uma reação em cadeia de polimerase para gerar uma “biblioteca” de produtos de PCR.
Pode-se referir aos produtos de PCR como sendo “cassetes de ácido —nucleico”, uma vez que eles podem ser ligados com outras sequências de ácidos nucleicos correlatas ou não correlatas, tal como proteínas do invólucro viral, por exemplo, e domínios de dimerização, usando técnicas de biologia molecular estabelecidas.
A sequência dos iniciadores de PCR inclui uma ou mais dos conjuntos de códons projetados para serem acessíveis a solvente e posições extremamente diversas em uma região hipervariável. Conforme foi descrito acima, um conjunto de códons é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleotídeos usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Os seletores de anticorpos que satisfazem os critérios desejados, conforme selecionados por etapas de teste/seleção adequadas podem ser e isolados e clonados usando-se técnicas recombinantes padrão.
É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados conservando-se o seu alto grau de afinidade de ligação para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esta meta, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências de origem e diversos produtos humanizados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências de origem e das humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina são habitualmente disponíveis e os versados na técnica estão familiarizados com eles. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem o estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata; isto é, a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos de RF podem ser selecionados e combinados com as sequências —recebedoras e importadas, de modo que é atingida a característica desejada do anticorpo, tal como uma afinidade maior para o(s) antígeno(s) alvo(s). Em | geral, os resíduos de região hipervariável são diretamente e extremamente substancialmente envolvidos na influência da ligação a antígeno.
| Diversas formas de um anticorpo anti-CD79b humanizado são reivindicadas. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode consistir em um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgG1 intacto. Como uma alternativa à humanização podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível, por exemplo, se produzir animais 6 transgênicos (camundongos, por exemplo) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório total de anticorpos humanos na ausência da produção endógena de imunoglobulina. Foi descrito, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação (Ja) de cadeia pesada de anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinal humana para tais camundongos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos depois de serem desafiados com antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et a/., o Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et a/., Year in Immuno. 7:33 (1993); patentes U.S. Nos. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm);
5.545.807; e WO 97/17852.
- Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) pode ser usada para a produção de anticorpos humanos e de fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de —genes do domínio variável (V) de imunoglobulina provenientes de doadores não imnizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpos são clonados no quadro ou a um gene de proteína de invólucro importante ou insignificante de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpos na superfície da partícula de fago. Como a proteína filamentosa contém uma cópia de DNA de um único filamento do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codificao anticorpo que apresenta estas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula b. A exibição de fago pode ser conduzida em uma variedade de formatos, resenhados em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993), por exemplo. e Diversas fontes de segmentos de genes V podem ser usadas para exibição de fagos. Clackson et a/., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatorial aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V proveniente de doadores humanos não imunizados pode ser construído e podem ser isolados anticorpos a um arranjo diverso de antígenos incluindo auto-antígenos) essencialmente seguindo-se as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Veja, também, patentes U.S. Nos. 5.565.332 e
5.573.905. o Conforme discutido acima, os anticorpos humanos podem ser gerados também por células B ativadas in vitro (veja patentes U.S. No.
5.567.610 e 5.229.275).
4. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS Em determinadas circunstâncias existem vantagens de se usar fragmentos de anticorpos de preferência a anticorpos integrais. O tamanho menor dos fragmentos permite uma rápida eliminação e pode levar a um acesso melhor aos tumores sólidos. Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica dos anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et a/., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et a/., Science, 229:81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras —recombinantes.
Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em E. coli e ser secretados a partir dela, permitindo assim a produção pronta de grandes quantidades destes fragmentos.
Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos o discutidas acima.
Alternativamente, os fragmentos Fab-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e ser quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab'), (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) De acordo com uma outra abordagem, os fragmentos F(ab'), podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes.
Os fragmentos Fab e F(ab'), com uma meia vida in vivo aumentada compreendendo resíduos de epítopo de ligação a receptor de recuperação são descritos na patente U.S.
No. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos se tornarão aparentes aos versados na técnica.
Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de uma única cadeia (scFv). Veja WO 6 93/16185; patente U.S.
No. 5.571.894; e patente U.S.
No. 5.587.458. Fv e sFv sãoas únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes; portanto, eles são adequados para ligação não específica reduzida durante uso in vivo.
As proteínas de fusão sfv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora ou no terminal amino ou no terminal carbóxi de um sFv.
Veja Antibody Engineering, ed. —Borrebaeck, acima.
O fragmento de anticorpo pode também ser um “anticorpo linear”, por exemplo, conforme descrito na patente U.S.
No. 5.641.870, por exemplo.
Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
5. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS | Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes.
Anticorpos biespecíficos | exemplificativos podem se ligar a dois epítopos diferentes de uma proteína —CD79b, conforme descrita no presente documento.
Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação a CD79b com um sítio de ligação para ' uma outra proteína.
Alternativamente um braço de anti-CD79b pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeantes sobre | oe um leucócito tal como uma molécula de receptor de célula T (CD3, por | exemplo) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FeyRI (CD64), FeyRII | (CD32) e FeyRill (CD16), de modo a concentrar e localizar mecanismos de defesa celular à célula que expressa CD79b.
Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam CD79b.
Estes anticorpos possuem um braço de ligação a CD79b e um braço que se liga ao agente citotóxico (saporina, anti-interferon-a, alcalóide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo, por exemplo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados em forma de , anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (anticorpos 6 biespecíficos de F(ab'),, por exemplo). O documento WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIll e a patente U.S.
No. 5.837.234 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRI.
Um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fca é apresentado no documento WOS98/02463. A patente U.S.
No. 5.821.337 instrui sobre um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3. Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica.
A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada- cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et a/., Nature 305:537-539 (1983)). Devido à associação aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpos, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta.
À purificação da molécula correta, que é geralmente conduzida por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos do produto são baixos.
Procedimentos análogos são descritos no documento WO
93/08829, e em Traunecker et a/., EMBO J. 10:3655-3659 (1991). oe De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos tendo especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são ligados a sequências de domínio constante de imunoglobulina.
É preferível que a fusão se produza comum domínio constante de cadeia pesada de lg, compreendendo pelo menos parte da dobradiça, regiões Ch2, e Ch3. É preferível se ter a primeira região constante de cadeia pesada (Ch1) contendo o sítio necessário para a ligação a cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões.
Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, de cadeia leve de ' imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co- 6 transfectados em uma célula hospedeira adequada.
Isto proporciona uma | 20 maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de | polipeptídeos nas modalidades quando relações desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção dão o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado.
No entanto, é possível se inserir as sequências de codificação para duas das três cadeias polipeptídicas ou para todas as três em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em relações iguais resulta em grandes rendimentos ou quando as relações não têm nenhum efeito significativo sobre o rendimento da combinação desejada de cadeias.
248 | Em uma modalidade preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi descoberto que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeias indesejáveis de imunoglobulina, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente uma metade da oe molécula biespecífica permite um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, veja, por exemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acordo com outra abordagem descrita no patente U.S. No.
5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser construída para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3. Neste método, uma ou o mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos provenientes da interface da o primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (com tirosina ou triptofano, por exemplo). São criadas “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição das cadeias laterais de aminoácidos grandes por outras menores (por alanina ou treonina, por exemplo). Isto proporciona um mecanismo para se aumentar o —rendimento do heterodímero em relação aos produtos finais indesejáveis tais como homodímeros. Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. Um dos anticorpos no heteroconjugado, por exemplo,
| 249 | pode ser acoplado a avidina, o outro à biotina. Tais ácidos nucleicos têm sido propostos, por exemplo, para direcionas células do sistema imune para células indesejáveis (patente U.S. No. 4.676.980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089) Os anticorpos —heteroconjugados podem ser preparados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Agentes reticuladores adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na patente U.S. No. 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação. oe Foram também descritas na literatura técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, usando-se ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab'). Estes fragmentos são reduzidos na presença de agentes complexadores de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos o derivados de Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com o mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. O progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico totalmente humanizado F(ab'),. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o
E A
| 250 | anticorpo biespecífico.
O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se | ligar a células que sobre-expressavam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, assim como desencadear a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos em tumores mamários humanos.
Diversas técnicas para a produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir da cultura de células recombinantes já foram descritas.
Foram produzidos anticorpos biespecíficos, por exemplo, usando-se zíperes de leucina.
Kostelhy et al., J.
Immunol. e 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos zíperes de leucina provenientes de proteínas Fos e Jun foram ligados a porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes.
Os homodímeros dos anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros, sendo então reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo.
Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo.
A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger et al/., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecíficos.
Os fragmentos compreendem uma Vx conectada a uma V, por um ligante que é demasiado o curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. —Consequentemente, os domínios Vx e V, de um fragmento são forçados a se parear com os domínios V, e V4 complementares de um outro fragmento, formando assim, dois sítios de ligação a antígeno.
Uma outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos com o uso de dímeros de Fv (sFv) de uma única cadeia foi também relatada.
Veja Gruber et al., J. —Immunol., 152:5368 (1994). Anticorpos tendo mais de duas valências são também reivindicados.
Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos.
Tutt et al., J.
Immunol. 147:60 (1991).
251 | | | 6. ANTICORPOS HETEROCONJUGADOS Anticorpos heteroconjugados também incidem no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados por covalência. Tais anticorpos foram, por exemplo, — propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejáveis [patente U.S. No. 4.676.980], e para o tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Reivindica-se que os anticorpos possam ser preparados in vitro usando-se métodos conhecidos na química de síntese e de proteínas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticuladores. Podem ser construídas imunotoxinas, por exemplo, usando-se uma reação de permuta de dissulfetos ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os que são divulgados, por exemplo, na patente U.S. No. 4.676.980.
7. ANTICORPOS MULTIVALENTES Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) com uma maior rapidez do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são distintos e dos da classe de IgM) contendo três ou mais sítios de ligação a antígeno (anticorpos tetravalente, por exemplo), que podem ser facilmente produzidos pela expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação a antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região dobradiça. Neste contexto, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação a antígeno no terminal amino à região Fc. O anticorpo multivalente preferido na presente invenção compreende (ou consiste em) três a aproximadamente oito, mas, de preferência, quatro, sítios de ligação
RR a antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e, de preferência, duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) | cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) | cadeia(s) polipeptídica(s), por exemplo, pode(m) compreender VD1-(X1),-VD2- (X2))-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 | representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) | polipeptídica(s), por exemplo, pode compreender: VH-CH1-ligante flexível-VH- | oe CH1-cadeia de região de Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia de região de Fc. O | 10 anticorpo multivalente da presente invenção compreende, de preferência, ainda | pelo menos dois (e, de preferência, quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender de aproximadamente dois a aproximadamente oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve propostos pela presente invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda um domínio CL.
8. CONSTRUÇÃO DA FUNÇÃO EFETORA o Pode ser desejável se modificar o anticorpo da presente invenção —no tocante à função efetora, por exemplo, de modo a aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser atingido introduzindo-se um ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente, ou adicionalmente, pode(m) ser introduzido(s) —resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação nesta região de ligação dissulfeto entre cadeias. O anticorpo homodimérico deste modo gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou capacidade aumentada de destruição de células mediada por complemento e uma RD,"
citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentada. Veja Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918- 2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com uma atividade aumentada antitumoral podem também ser preparados usando-se reticuladores —heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e possa assim ter capacidades melhoradas de lise de complemento e de ADCC. Veja Stevenson et a/l., Anti-Cancer Drug Design o 3:219-230 (1989). Para se aumentar a meia vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor de recuperação ao anticorpo (especialmente a um fragmento de anticorpo), conforme descrito na patente U.S. No. 5.739.277, por exemplo. Conforme empregado no presente documento, o termo “epítopo de ligação a receptor de recuperação" se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (IgG, I9G2, 1963, ou 19Ga, por exemplo) que é responsável pelo aumento da meia vida sérica in vivo da molécula de IgG.
9. IMUNOCONJUGADOS A presente invenção também se refere a imunoconjugados (a que o se refere indiferentemente como "conjugados anticorpo-medicamento”, ou “ADCsS”) compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento, uma toxina (uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um rádio-conjugado).
Em determinadas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterápico ou outra toxina. Os agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser
RR usados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos.
Uma variedade de rádio núclídeos é disponível para a produção de anticorpos rádio-conjugados.
Os exemplos incluem ?"ºBi, o 191, Mm, ºY, e Re.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais dos imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), | aldeídos (tais como o aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p- | —azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p- diazônio-benzoil)-etileno diamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitro | 4 benzeno). Uma imunotoxina de ricina, por exemplo, pode ser preparada o conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). O ácido 1- —isotioccanatobenzil??-3-metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) rotulado com carbono 14 é um agente quelante exemplar para a conjugação de rádio- nucleotídeo ao anticorpo.
Veja WO94/1 1026. Os conjugados de um anticorpo e de um ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, peptídeos de auristatina, tais como monometilauristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina), maitansinóides, tais como DM1, um tricoteno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, são também ligados a gabaritos de acordo com a presente invenção.
| 255 | | | IMUNOCONJUGADOS EXEMPLIFICATIVOS — CONJUGADOS ANTICORPO -FÁRMACO Um imunoconjugado (ou “conjugado anticorpo-fármaco” (“ADC”)) da presente invenção pode ser da Fórmula |, abaixo, em que o anticorpo é conjugado (isto é, ligado por covalência) a uma ou mais frações fármaco (D) —pormeio de um ligante opcional (1). Os ADCs podem incluir conjugados tioMAb de fármacos (“TDC”). Ab—(L-D), I Consequentemente, o anticorpo pode ser conjugado ao | eo medicamento ou diretamente ou por meio de um ligante.
Na Fórmula |, pé o número médio de frações medicamentosas por anticorpo, que pode variar, por exemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 frações medicamentosas por anticorpo, e em determinadas modalidades, de 1 a aproximadamente 8 frações fármaco por anticorpo.
A invenção inclui uma composição que compreende uma mistura de compostos anticorpo-fármaco da Fórmula | em que a carga média de fármaco por anticorpo é de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 ou de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. A.
LIGANTES EXEMPLIFICATIVOS o Um ligante pode compreender um ou mais componentes de ligante.
Componentes de ligante exemplificativos incluem 6-maleimido caproíla (“MC”), maleimido propanoíla (“MP”), valina-citrulina (“val-cit" ou “vc”), alanina- fenilalanina (“ala-phe”), p-amino benzilóxi carbonila (um “PAB”), e aqueles que resultam da conjugação com reagentes de ligante: N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato — (“SPP”), “N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (“SMCC”, a que se refere também como “MCC”), N-succinimidil (4- —iodo-acetil) aminobenzoato (“SIAB”). Diversos componentes de ligantes são conhecidos na técnica, sendo alguns deles descritos abaixo.
Um ligante pode ser um “ligante clivável”, facilitando a liberação de um fármaco na célula. Pode ser usado, por exemplo, um ligante instável em ácido (hidrazona, por exemplo), ligante sensível a protease (sensível a peptidase, por exemplo), ligante instável à luz, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente US. No 5.208.020). Em determinadas modalidades, um ligante é conforme mostrado na Fórmula ll abaixo: Ag MW Yy " oe em que A é uma unidade prolongadora e a é um número inteiro | de O a 1; W é uma unidade aminoácido, e w é um número inteiro de 0 a 12; Y é uma unidade espaçadoraeyéb0O,10u2;eAb, Dep são definidos como acima para a Fórmula |. Modalidades exemplificativas de tais ligantes são descritas no documento US 2005-0238649 A1, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência. Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma “unidade prolongadora” que liga um anticorpo a um outro componente de ligante ou a uma fração fármaco. Unidades prolongadoras . exemplificativos são apresentadas abaixo (em que a linha ondulada indica os o sítios de ligação por covalência a um anticorpo):
O ! AAA NS Oo [ MC o o : A o - MP
Pp o
AA
H O Oo MPEG Oo
É A o Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma unidade aminoácido. Em uma tal modalidade, a unidade o aminoácido permite a clivagem do ligante por uma protease, facilitando assim a liberação do fármaco do imunoconjugado por exposição a proteases —intracelulares, tais como enzimas lisossômicas. Veja, por exemplo, Doronina et | al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784. Unidades aminoácidos exemplificativos | incluem, sem limitação, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo e um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplificativos incluem: valina-citrulina (vc ou val- | cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); ou N- | metil-valina-citrulina (Me-val-cit. Os tripeptídeos exemplificativos incluem: | glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly)) Uma | unidade aminoácido pode compreender resíduos de aminoácidos que ocorrem | o naturalmente, assim como aminoácidos de menor importância e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente tais como citrulina. As unidades aminoácidos podem ser projetadas e otimizadas em sua seletividade para | clivagem enzimática por uma enzima específica, tal como uma protease | associada a tumor, por exemplo, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.
Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma unidade “espaçadora” que liga o anticorpo a uma fração fármaco, quer diretamente ou por meio de uma unidade prolongadora e/ou uma unidade aminoácido. Uma unidade espaçadora pode ser “auto-imoladora” ou
E
| 258 | uma “não auto-imoladora”. Uma unidade espaçadora não “auto-imoladora” é uma em que parte ou a totalidade da unidade espaçadora continua ligada à fração fármaco depois da clivagem enzimática (proteolítica, por exemplo) de ADC. Exemplos de unidades espaçadoras não auto-imoladoras incluem, sem limitação, uma unidade espaçadora de glicina e uma unidade espaçadora de glicina-glicina. Outras combinações de espaçadores peptídicos passíveis de clivagem enzimática específica a sequência são também reivindicadas. A clivagem enzimática de um ADC contendo uma unidade espaçadora glicina- Ss glicina, por exemplo, por uma protease associada a uma célula tumoral | 10 resultaria na liberação da fração glicina-glicina-fármaco do restante de ADC. Em uma tal modalidade, a porção glicina-glicina-fármaco é então submetida a | uma etapa separada de hidrólise na célula tumoral, clivando assim a unidade espaçadora glicina-glicina da fração fármaco. | Uma unidade espaçadora “auto-imoladora" permite a liberação da | 15 fração fármaco sem uma etapa separada de hidrólise. Em determinadas | modalidades, uma unidade espaçadora de um ligante compreende uma unidade p-amino benzila. Em uma tal modalidade, um álcool p-amino benzílico | está ligado a uma unidade amino por meio de uma ligação amida, e um | o carbamato, metilcarbamato ou carbonato é produzido entre o álcool benzílico e um agente citotóxico. Veja, por exemplo, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. Em uma modalidade, a unidade espaçadora é p-amino benzilóxi carbonila (PAB) Em determinadas modalidades, a porção fenileno de uma unidade p-amino benzila é substituída com Qm, em que Q é -alquila C1-Cg, -O-(alquila C1-Cg), -halogênio,- nitro ou - ciano; emé um número inteiro variando de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras auto-imoladoras incluem ainda, mas sem limitação, compostos aromáticos que são eletronicamente análogos ao álcool p-aminobenzílico (veja, por exemplo, o documento US 2005/0256030 A1), tal como derivados de 2-
SS aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e acetais orto- ou para-aminobenzílicos. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização depois da hidrólise da ligação amida, tais como as amidas do ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al, Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas de anéis biciclo [2.2.1] e sistemas de anéis biciclo[2.2.2] adequadamente substituídos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815); e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). A eliminação de fármacos so contendo aminas e que são substituídos na posição a de glicina (Kingsbury, et | 10 al, J Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também exemplos de unidades espaçadoras auto-imoladoras úteis em ADCs.
Em uma modalidade, uma unidade espaçadora é uma unidade de bis(hidroximetil) estireno ramificado (BHMS), conforme ilustrado abaixo e que pode ser usado para incorporar e liberar uma multiplicidade de fármacos.
" Qm CHAOC))— D | o Ab Laudo oe p Clivagem enzimática 2 fármacos emque Q é —alquila Cr-Cg, -O-(alquila C1-Cg), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a aproximadamente 20.
Em uma outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma fração fármaco por meio de uma ramificação, fração ligante multifuncional a um anticorpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Os ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar de fármaco para anticorpo, isto é, a carga, que é relacionada à potência de ADC. Assim, no caso em que um anticorpo cisteíina submetido à engenharia contém somente um grupo cisteína tiol reativo, pode ser ligada uma multiplicidade de frações fármaco por meio de um ligante dendrítico.
o Os componentes de ligantes exemplificativos e suas combinações são apresentados abaixo dentro do contexto de ADCs da Fórmula |l: nH o aca, xo) H Oo sf p
HN o Val-Cit ou VC o o Y o Ab IA Es o HH o SS, Ss o “ o NH MC-val-cit o o 0º»
AKI ARO fg AÇÃO, O H O Sf KH p
PD O NH? MC-val-cit-PAB Os componentes de ligantes, incluindo unidades prolongadoras, espaçadoras e aminoácidos, podem ser sintetizados por métodos conhecido na técnica, tais como os descritos no documento US 2005-0238649 A1.
e
NO O | | 261 B. FRAÇÕES FÁRMACO EXEMPLIFICATIVOS (1) MAITANSINA E MAITANSINÓIDES Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas maitansinóides. Os — maitansinóides são inibidores mitóticos que atuam por inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez do arbusto da África orienta Maytenus serrata (patente U.S. No. 3.896.111). Subsequentemente, foi descoberto que determinados micróbios também oe produziam maitansinóides, tais como maitansino! e ésteres de C-3 maitansino! i 10 (patente US. No. 4.151.042). O maitansinol sintético e seus derivados e análogos são divulgados, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 4.137.230;
4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268;
4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598;
4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533. so As frações de fármacos maitansinóides são frações fármaco atraentes em conjugados de anticorpo-fármaco, pois elas são: (i) relativamente accessíveis para a preparação por fermentação ou por modificação química ou o por derivação de produtos de fermentação, (ii) passível de derivação com o grupos funcionais adequados para conjugação por meio de ligantes dissulfeto e não dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis no plasma e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais. Os compostos de maitansina adequados para uso como frações fármaco maitansinóides são conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos usando-se técnicas de engenharia genética e de fermentação (US. 6790952; US. 2005/0170475; Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973). Maitansinol e análogos de maitansinol podem também ser preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos. As frações fármaco maitansinóides exemplificativos incluem o o a aquelas que têm um anel aromático modificado, tais como: C-19-descloro (patente U.S. No. 4.256.746) (preparado por redução de ansamitocina P2 com hidreto de alumínio lítio); C-20-hidróxi (ou C-20-desmetila) +/-C-19-descloro (patentes US. Nos. 4.361.650 e 4.307.016) (preparados por desmetilação — usando-se Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando-se LAH); e C- 20-desmetóxi, C-20-acilóxi -OCOR), +/-descloro (patente U.S. No. 4.294.757) (preparado por acilação usando-se cloretos de acila) e aqueles que têm | modificações em outras posições. | [O As frações fármaco maitansinóides exemplificativos também | incluem aquelas que têm modificações tais como: C-9-SH (patente U.S. No.
4.424.219) (preparada pela reação de maitansinol com H2S ou P2Ss); C-14- alcoximetila (desmetóxi/CH, OR)(patente US. No. 4.331.598); C-14-hidróxi metila ou acilóxi metila (CHOH ou CH2OAc) (patente US 4.450.254) (preparada a partir de Nocardia); C-15-hidróxi/acilóxi (patente US 4.364.866) (preparada pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metóxi (patentes US 4.313.946 e 4.315.929) (isolada de Trewia nudiflora); C-18-N- desmetila (patentes US 4.362.663 e 4.322.348) (preparada pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces);, e 4,5-desóxi (patente US 4371533) o (preparada por redução do maitansinol por tetracloreto de titânio/LAH). Muitas posições nos compostos de maitansina são conhecidas como sendo úteis como posição de ligação, dependendo do tipo de ligação. Para a formação de uma ligação éster, por exemplo, a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e a posição C-20 tendo um grupo hidroxila — são todas adequadas (patente U.S. No. 5.208.020; US RE39151; patente U.S. No. 6.913.748; patente US 7.368.565; US 2006/0167245; US 2007/0037972). As frações fármaco maitansinóides incluem aquelas que têm a | Cn estrutura: HC (CR)ITS 8 : K O. 2 A ” Cc A, Po CHz3O- o AAAÃo HO | CcHO Hà em que a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo de enxofre da fração fármaco maitansinóide a um ligante de um ADC. R pode ser o independentemente H ou um alquila C1-Cs. A cadeia que liga o grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanila, etanila, ou propila, isto é, m é 1, 2, ou 3 (patente US 6.334.10; patente US patente US 5.208.020; patente US | 7.276.497; Chari et al (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623). Todos os estereoisômeros da fração fármaco maitansinóide são reivindicadas para os compostos da presente invenção, isto é, qualquer combinação de configurações R e S nos carbonos quirais de D. Em uma modalidade, a fração fármaco maitansinóide terá a seguinte estrutura oe estereoquímica: HG — (CRI) S—S
O NA PN º He o o Cl N z o os CH3O
O PFAúÚÔÚSO não 2HO | CH3O0 H Modalidades — exemplificativas —de frações fármaco de —maitansinóides incluem: DM1; DM3; e DMA, que têm as estruturas: O " O SS
NS NO NS | 264 | Hs CHCHAS— 8 q NA JA o He o o cl W No :
SS CH. " DM1 o PÔ não iHOo | | CH3O H | To He enero ns — 3 o O, < H JA o ne o O Cc! N zoo o CH;O " DM3 o ANAAAo Ho |
CHO À H To HG — CHCHCS—$ N | 4% CH He o O á Cc MW No oe o DMA CH3O o o PF AúÔSA Não 2HO | CHO —H em que a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo de enxofre do fármaco a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco. (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1). Outros conjugados anticorpo-fármaco maitansinóides exemplificativos têm as seguintes estrutura e abreviaturas, (em que Ab é anticorpo e p varia de 1 a aproximadamente 8):
| | | 265 o | IT
H S— Ss: Pp HáC He oC e IA NR CHO. "
À DD fa PÓ gen o cHo n Ab -SPP-DM1 o | A oe s—s Ho, H3C
N 3x o o o ot, Fo
RS CH;O
À HF” > É now o CcHO H Ab-SPDB-DM4 o | o ps Ho,
N
S oe HC q Nº, o HC O Pá e, AR
E CH30O:
À PAO
ET CcH;o H Ab-SMCC-DM1 Conjugados anticorpo-fármaco exemplificativos em que DM1 está ligado através de um ligante BMPEO a um grupo tiol do anticorpo têm a estrutura e abreviatura:
O, | Eaa o H3C, CH.CH,S 9 í 94% e, a
A o OO ano cH;o H e em que Ab é anticorpo; n é 0, 1, ou 2; e pé 1, 2,3, ou 4. Imunoconjugados que contêm maitansinóides, métodos da sua preparação e seu uso terapêutico são divulgados, por exemplo, em Erickson, et | al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; nas patentes US 5.208.020, 5.416.064, | —US2005/0276812 A1,e na patente européia EP O 425 235 B1, cujo conteúdo é | expressamente incorporado ao presente documento a título de referência. | Conjugados de anticorpo-maitansinóide são preparados por ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem | diminuir significativamente a atividade biológica ou do anticorpo ou da molécula de maitansinóide. Veja, por exemplo, a patente U.S. No. 5.208.020 (cujo e conteúdo é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência). Os maitansinóides podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na patente U.S. No. 5.208.020 e nas outras patentes e publicações não de patentes a que se refere acima, tais como maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol. Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica de preparação de conjugados de anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, osdescritosna patente U.S. No. 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1; em
Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); e em US 2005/016993 A1, sendo o conteúdo de todos estes documentos expressamente incorporados ao presente documento a título de referência. Os conjugados anticorpo- maitansinóide que compreendem o componente de ligante SMCC podem ser preparados conforme divulgado em US 2005/0276812 A1, “Antibody-drug conjugates and Methods.” Os ligantes compreendem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos instáveis a ácido, grupos instáveis a luz, grupos instáveis a peptidase, ou grupos instáveis a esterase, conforme divulgado nas patentes oe identificadas acima. Ligantes adicionais são descritos e exemplificados no presente documento.
Conjugados de anticorpo com maitansinóide podem ser preparados usando-se uma variedades de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato succinimidil-4-(N-maleimidometil) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- o diazônio-benzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno)) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflior-2,4- dinitrobenzeno). Em determinadas modalidades, o agente de acoplamento é propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) ou pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para produzir uma ligação dissulfeto.
O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo de ligação. Uma ligação éster, por exemplo, pode ser formada por reação com um grupo hidroxila usando,-se técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 o E O MN O DN 268 | tendo um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na | posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 tendo um grupo hidroxila.
Em uma modalidade, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou d um análogo de maitansinol. (2) AURISTATINAS E DOLASTATINAS | Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a dolastatina ou a um análogo ou derivado peptídico de dolastatina, uma auristatina, por exemplo (patentes U.S.
Nos. 5.635.483; | oe 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraram que interferem na dinâmica | 10 de microtúbulos, na hidrólise de GTP na divisão nuclear e celular, (Woyke et al (2001) Antimicrob.
Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm uma atividade anticancerígena (Patente U.S.
No. 5663149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob.
Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração fármaco dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxila) da fração fármaco peptídica (WO 02/088172). Modalidades exemplificativas de auristatina incluem as frações fármaco monometil auristatina ligadas ao terminal N DE e DF (US o 2005/0238649, divulgadas em Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentada em 28 de março de 2004, cujo conteúdo é expressamente incorporado integralmente ao presente documento a título de referência). Uma fração fármaco peptídica pode ser selecionada das Fórmulas De e Dr abaixo: Rº " o R CHz - MOS Nes R o RRR R O RO Dr
Rô o R CcH;3 RÁ o
MOSCA O R o RR R R O RO Rº Dr em que a linha ondulada de De e de Dr indica o sítio de ligação por covalência a um anticorpo ou a um anticorpo-componente de ligante, e independentemente em cada localização: | R? é selecionado de H e alquila C1-Csg; | e 5 Rº é selecionado de H, alquila C1-Cg, carbociclo C3-Csg, arila, | (alquil C,-Cg)-arila, (alquil C;-Cg)-(carbociclo C3-Cg), heterociclo C3-Cg e alquil C1-Cg -(heterociclo C3-Cg); Rº é selecionado de H, alquila C;1-Cg, carbociclo C3-Czg, arila, (alquil C1-Cs)-arila, (alquil C;-Cg)-(carbociclo C3-Cg), heterociclo C3-Cg e (alquil Cr-Csg)-(heterociclo C3-Cg); Ró é selecionado de H e metila; Ou então Rº e Rº formam, em conjunto, um anel carbocíclico e têm a fórmula -(CRºRº),- em que Rº e Rº são independentemente selecionados de H, alquila C;-Cg e carbociclo C3-Cg e n é selecionado de 2, 3,4, 5€e6; Oo; R$ é selecionado de H e alquila C1-Cg; R” é selecionado de H, alquila C1-Cg, carbociclo C3-Cs, arila, alquil (C1-Cg)-arila, alquil C,-Cg -(carbociclo C3-Cg), heterociclo C3-Cg e alquil (C1-Cg)- (heterociclo C3-Cs); Cada Rº é independentemente selecionado de H, OH, alquila C1- Cs, carbociclo C3-Cg e O-(alquila C1-Cg); Rº é selecionado de H e alquila C1-Cg; R"º é selecionado de arila ou heterociclo C3-Cg; Zé O, S, NH, ou NR”?, em que R"? é alquila c1-cs R* é selecionado de H, alquila C1-Ca6, arila, heterociclo C3-Cs, -
(RPO)m-R*, ou -(RPO)n-CH(R**)2; m é um número inteiro que varia de 1-1000; R"? é C>-Cg alquila; | R'*éH ou C1-C; alquila; A cada ocorrência, R'* é independentemente H, COOH, -(CH>),- N(R)2, -(CH2))-SO3H, ou -(CH2)-SOsz-(alquila C1-Cg); A cada ocorrência, R'* é independentemente H, alquila C1-Cg, ou AÁCH2))-COOH; e R* é selecionado de -C(R)-C(Rº),-arila, | 10 -C(Rô)-C(Rô).-(heterociclo C3-Cg), e —C(R$).-C(Rô).—(carbociclo C3-Cg); e n é um número inteiro que varia de 0 a 6.
Em uma modalidade, Rà, Rº e R” são independentemente isopropila ou sec-butila e Rº é -H ou metila. Em uma modalidade exemplar, cada um de R? e Rº é isopropila, Rº é -H, e R é sec-butila.
Em uma outra modalidade ainda, cada um de R? e RÔ é metila, e Rºé-H. Em uma outra modalidade ainda, a cada ocorrência, Rº é -OCHsz. Em uma modalidade exemplar, cada um de Rº e Rº é isopropila, e cada um de R? e Rô é metila, Rº é -H, R? é sec-butila, a cada ocorrência, Rº é - OCHyeRé-H Em uma modalidade, Z é -O- ou -NH-.
Em uma modalidade, R"º é arila.
Em uma modalidade exemplar, R"º é -fenita.
Em uma modalidade exemplar, quando Z é -O-, R*º é -H, metila —outbutila.
Em uma modalidade, quando Z é -NH, R** é -CH(R'Ó),, em que R** é -(CHo))-N(R 2, e R'* é alquila -C1-Cg ou -(CH2))-COOH.
Em uma outra modalidade, quando Z é -NH, R'º é -CH(R'5), em que R** é -(CH2)-SOsH.
Uma modalidade exemplar de auristatina da fórmula De é MMAE, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado de anticorpo-fármaco: Ô N DO 2 AS N ú N E. e Pl óo NO O. Uma modalidade exemplar de auristatina da fórmula Dr é MMAF, e em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (veja US 2005/0238649 e Doronina et a/. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124): o H ' Edir CEO MS. ! O O 9 O A on O...
Outras modalidades exemplificativas incluem compostos de monometil valina tendo modificações carbóxi de fenilalanina no terminal C da porção fármaco pentapeptídica auristatina (WO 2007/008848) e o compostos de monometil valina tendo modificações de cadeia lateral de fenilalanina no terminal C da fração fármaco pentapeptídica auristatina. (WO 2007/008603).
Outras frações fármaco incluem os seguintes derivados de MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
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PERTO o O O & o LO . 2 Em um aspecto, grupos hidrófilos, incluindo, mas sem limitação, ésteres de trietileno glicol (TEG), conforme mostrado acima, podem ser ligados à fração fármaco em R''. Sem e querer ser cerceado por qualquer teoria específica, supõe-se que os grupos hidrófilos auxiliam na internalização e na —não aglomeração da fração fármaco. Modalidades — exemplificativxas de ADCs da Fórmula | compreendendo uma auristatina/dolastatina ou derivado seu, são descritos em US 2005-0238649 e em Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114- o 124, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência. Modalidades exemplificativas de ADCs da Fórmula i compreendem MMAE ou MMAF e diversos componentes de ligante têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que “Ab” é um anticorpo; p é de 1 a aproximadamente 8, “Val-Cit" ou “vc” é um dipeptídeo valina-citrulina; e “S” é um átomo de enxofre). Deve-se observar que em determinadas descrições estruturais de ADC ligado a enxofre no presente documento, o anticorpo é representado como “Ab-S” simplesmente para indicar a característica de ligação a enxofre e não para indicar que um átomo de enxofre específico porta uma multiplicidade de frações ligante-fármaco. O parênteses à esquerda das estruturas abaixo pode também ser colocado à esquerda do átomo de enxofre, entre Ab e S, o que seria uma descrição equivalente do ADC da presente invenção descrito em todo o documento. Ab-S. Q H Oo o X A A A o ON N N N Ea a. Doo O O Ro ) Oo Pp Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab-S. 9 HO OH o ARA A À No Vakoit-N 6 oo 8o! OQ ) O [3 o Ab-MC-vc-PAB-MMAE “ Ab-S. o o H O
H OH o A, ELA A O o Ao do Pp Ab-MC-MMAE Ab-S. o o H O H No AN “Ox LA A ) º É 9 Ooo p ALb-MC-MMAF Modalidades — exemplificativas de ADCs da Fórmula | oe compreendendo MMAF e diversos componentes de ligante incluem ainda Ab- MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. O que é interessante é que foi mostrado que os imunoconjugados que compreendem MMAF ligado a um anticorpo por um ligante que não é proteoliticamente clivável possuem uma atividade comparável aos imunoconjugados que compreendem MMAF ligado a um anticorpo por um ligante proteoliticamente clivável. Veja, Doronina et a/. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Em tais casos, acredita-se que a liberação do fármaco é efetuada pela degradação do anticorpo na célula. Id. Tipicamente, as frações fármaco baseadas em peptídeo podem ser preparadas pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (veja E. Schróder e K. Lubke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. As frações fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos: US 2005-0238649 A1; patente U.S. No. 5.635.483; patente U.S. No. 5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al | (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, o 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; e | 10 Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
Mais especificamente, as frações fármaco auristatina/dolastatina da fórmula Dr, tais como MMAF e seus derivados, podem ser preparadas, usando-se métodos descritos na patente U.S. No. 2005-0238649 A1 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. As frações fármaco auristatina/dolastatina da fórmula De, tais como MMAE e seus derivados, podem ser preparadas usando-se métodos descritos em Doronina et a/. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. As frações fármaco-ligante MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, e MC-vc-PAB-MMAE podem ser convenientemente o sintetizadas por métodos de rotina, tais como os descritos, por exemplo, em —Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, e publicação de pedido de patente No. US 2005/0238649 A1, sendo então conjugadas a um anticorpo de interesse.
(3) CALIQUEAMICINA Em outras modalidades, o imunoconjugado compreende um — anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras de DNA de dois filamentos a concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, veja as patentes U.S. Nos. 5.712.374, 5.714.586,
5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas concedidas à American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, sem limitação, y1', a2', a3i, N- acetil-y', PSAG e 81, (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lodeetal, Cancer Research 58:2925-2928 (1998), e as patentes U.S. citadas acima concedidas a American Cyanamid). Um outro fármaco antitumoral ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifoliato.
Tanto a caliqueamicina como QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessam oe facilmente a membrana plasmática.
Portanto, a absorção celular destes | 10 agentes através de internalização mediada por anticorpo aumenta muito os seus efeitos citotóxicos.
C.
OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados a um anticorpo incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracila, a família de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288, descritos nas patentes U.S.
Nos. 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamícinas (patente U.S.
No. 5.877.296). Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem | o ser usados incluem a cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantes da | 20 toxina diftérica, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, —enomicina e os tricotecenos.
Veja, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. A presente invenção reivindica ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto que tenha atividade nucleolítica (tal como, por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desóxi-ribonuclease; DNase). Em determinadas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um átomo extremamente radioativo.
Uma variedade de isótopos radioativos são disponíveis para a produção de anticorpos rádio-conjugados.
Exemplos incluem At21, 1121, (125, yºº, Ret, Re! sm'!*, Bje!?, pº, pp? ? e isótopos radioativos de Lu.
Quando o imunoconjugado é usado para a detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos oe cintilográficos, tais como, por exemplo, te” ou 11º3, ou um rótulo de spin para o imageamento por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como imageamento por ressonância magnética, IRM), tais como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
Os rádio-rótulos ou outros rótulos podem ser incorporados ao —imunoconjugado de modos conhecidos.
O peptídeo, por exemplo, pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando-se precursores adequados de aminoácidos envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez do hidrogênio.
Rótulos tais como tcº*” ou 13, Re", Re" e 1! o podem ser ligados por meio de um resíduo de cisteina no peptídeo.
O ítrio-90 — pode ser ligado por meio de um resíduo de lisina.
O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. “Monoclional Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, NS CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
Em determinadas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo conjugado a uma enzima ativadora de profármaco que converte um profármaco (um agente quimioterápico de peptidila, por exemplo, veja WO 81/01145) em um fármaco ativo, tal como um fármaco anticancerígeno.
Tais imunoconjugados são úteis na terapia por profármaco mediado por enzima dependente de anticorpo (“ADEPT”). As enzimas que podem ser conjugadas a um anticorpo incluem, mas sem limitação, fosfatases alcalinas, que são úteis para a conversão de profármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatases que são úteis para a conversão de profármacos — contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase, que é útil para a conversão de S5-flúor-citosina não tóxica no fármaco anticancerígeno 5- fluoruracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L) que são úteis para oe a conversão de profármacos contendo peptídeos nos fármacos livres; D- —alanilcarbóxi peptidases, que são úteis para a conversão de profármacos que contêm substituintes de D-aminoácido; enzimas clivadoras de carboidrato tais como B-galactosidase e neuraminidase, que são úteis para a conversão de profármacos glicosilados em fármacos livres; B-lactamase, que é útil para a conversão de fármacos derivados com B-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase e penicilina G amidase, que são úteis para a conversão de fármacos derivados nos seus nitrogênios de amina com grupos fenóxi-acetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres.
As enzimas podem ser covalentemente ligadas a anticorpos por técnicas o de DNA recombinante bem conhecidas na técnica.
Veja, por exemplo, —Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984). D.
CARGA DE FÁRMACO
- A carga de fármaco é representada por p, o número médio de frações de fármaco por anticorpo em uma molécula da Fórmula |. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 frações de fármaco (D) por anticorpo.
Os ADCs | da Fórmula | incluem coleções de anticorpos conjugados com uma série de frações fármaco, de 1 a 20. O número médio de frações fármaco por anticorpo nas preparações de ADC a partir de reações de conjugação pode ser | caracterizada por meios convencionais tais como espectroscopia de massa,
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ensaio ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de ADC homogêneo em que p consiste em um valor determinado podem ser obtidas a partir de ADC com outras cargas de fármaco —pormeiostaiscomo HPLC de fase reversa ou por eletroforese. As formulações farmacêuticas dos conjugados anticorpo-fármaco da Fórmula | podem assim constituir uma mistura heterogênea de tais conjugados com anticorpos ligados a 1,2,3,4, ou mais frações fármaco. oe Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Nos casos em que a ligação é um cisteína tiol, por exemplo, como nas modalidades exemplificativas acima, um anticorpo pode ter somente um ou diversos grupos tiol de cisteína ou pode ter somente um ou diversos grupos tiol suficientemente reativos através dos quais o ligante pode ser ligado. Em determinadas modalidades, uma carga de fármaco maior, da ordem de p>5, por exemplo, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade de determinados conjugados anticorpo-fármaco. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC da presente invenção varia de 1 a aproximadamente 8; o de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; ou de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Na verdade, foi demonstrado que para determinados ADCSs, a relação ótima de frações fármaco para anticorpo pode ser inferior a 8 e pode ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Veja US 2005- 0238649 A1.
Em determinadas modalidades, um número menor do que o máximo teórico de frações fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário fármaco-ligante ou com o reagente de ligante, conforme será discutido abaixo. Geralmente anticorpos não contêm
| muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que possam ser ligados a uma | fração fármaco; na verdade a maioria de resíduos tiol de cisteína em anticorpos | existem em forma de pontes dissulfeto.
Em determinadas modalidades, um | anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como o ditiotreitol (DTT) outricarbonil etilfosfina (TCEP), em condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol reativos de cisteíina.
Em determinadas modalidades, um anticorpo é submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteína. oe A carga (relação fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes modos, por, por exemplo: (i) limitação do excesso molar do intermediário fármaco-ligante ou reagente de ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (ili) condições parciais ou limitantes redutoras para a modificação de tiol de cisteina. | 15 Deve ficar subentendido que nos casos em que um grupo nucleofílico reage com um intermediário fármaco-ligante ou com um regente de | ligante seguido por reagente de fração fármaco, então o produto resultante | consiste em uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma o ou mais frações fármaco ligadas a um anticorpo.
O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um ensaio de anticorpo ELISA duplo, que é específico para o anticorpo e específico para o fármaco.
Moléculas individuais de ADC podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por cromatografia de interação hidrófoba, por exemplo, (veja, por exemplo, McDonagh et al (2006) Prot Engr.
Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et a/ (2004) Clin.
Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004
Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004) Em determinadas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado a partir da mistura de conjugação por eletroforese ou por cromatografia.
oe E. DETERMINADOS MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS Um ADC da Fórmula | pode ser preparado por diversas vias empregando reações, condições e reagentes da química orgânica conhecidos dos versados na técnica, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente de ligante bivalente para formar Ab-L por meio | de uma ligação covalente, fazendo-se em seguida reagir com uma fração ' 15 fármaco D; e (2) a reação de um grupo nucleofílico de uma fração fármaco com um reagente bivalente de ligante, para formar D-L, por meio de uma ligação covalente, fazendo-se, em seguida, reagir com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos exemplificativos para a preparação de um ADC da Fórmula o | por meio desta última via são descritos em US 2005-0238649 A1, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência. Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas sem limitação: (1) grupos amina de terminal N, (ii) grupos amina de cadeia lateral, lisina, por exemplo, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, de cisteína, por exemplo, e (iv) grupos hidroxila ou amino de glicídios, nos casos em que o anticorpo é —glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre frações ligantes e reagentes de ligantes, incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos, e haletos de ácidos; (ii) haletos de alquila e de benzila tais como halo-acetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxila, e maleimida. Determinados anticorpos têm dissulfetos reduzíveis entre cadeias, isto é, pontes de cisteína. Pode-se tornar os anticorpos reativos para ' conjugação com reagentes de ligante por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) ou com tricarbonil etilfosfina (TCEP), de modo tal que o anticorpo seja total ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína formará assim, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos | adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por modificação de resíduos | oe de lisina, fazendo-se os resíduos de lisina reagir, por exemplo, com 2- iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina em um tiol. Os grupos tiol reativos podem ser introduzidos em um anticorpo por introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por preparação de anticorpos variantes, por exemplo, que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteina não nativa).
Os conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção podem também ser produzidos por reação entre um grupo eletrofílico sobre um anticorpo, tal como um grupo carbonila de aldeído ou de cetona, com um grupo nucleofílico em um reagente de ligante ou fármaco. Grupos nucleofílicos úteis e em um reagente de ligante incluem, sem limitação, hidrazida, oxima, amino, —hidrazina, tio-semicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida. Em uma modalidade, um anticorpo é modificado para introduzir frações eletrofílicas que são capazes de reagir com substituintes nucleofílicos no reagente de ligante ou fármaco. Em uma outra modalidade, os glicosídeos de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, com reagentes oxidantes de periodato, por exemplo, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina dos reagentes de ligante ou com frações fármaco. Os grupos de base de Shiff de imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos por reagentes de boridreto, por exemplo, para formar ligações amina estáveis.
Em uma modalidade, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado ou com galactose oxidase ou com metaperiodato de sódio podem | resultar em grupos carbonila (aldeído e cetona) no anticorpo que podem | reagir com grupos adequados no fármaco (Hermanson, Bioconjugate | Techniques) Em uma outra modalidade, anticorpos contendo resíduos | serina ou treonina no terminal N podem reagir com metaperiodato de sódio, | resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente U.S. oe No. 5.362.852). Pode-se fazer um tal aldeído reagir com uma fração fármaco oucom um nucleófilo de ligante.
Grupos nucleofílicos sobre uma fração fármaco incluem, mas sem limitação: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tio- semicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas frações ligante e reagentes de ligante que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos, e haletos de ácidos; (ii) haletos de alquila e de benzila tais como haloacetamidas; (ili) aldeídos, cetonas, grupos carboxila e maleimida. o Os compostos da presente invenção expressamente reivindicam, mas sem limitação, ADC preparado com os seguintes reagentes reticuladores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (benzoato de succinimidil-(4- vinilsulfona)) que são disponíveis no comércio (de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, US.A, por exemplo; veja páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.) Imunoconjugados que compreendem um anticorpo e um | agente citotóxico podem também ser preparados, usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como | propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclohexano-1- carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimido-metila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis- (p-diazônio-benzoil)-etileno diamina), diisocianatos (tais como 2,6- oe diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5- diflior-2,4-dinitrobenzeno). Uma imunotoxina de rícino, por exemplo, pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentacético (MX-DTPA) rotulado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para a conjugação de rádio-nucleotídeo ao anticorpo. Veja WO94/11026.
Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico pode ser produzida, por exemplo, por técnicas recombinantes ou por síntese de peptídeo. Uma molécula de DNA recombinante pode compreender regiões que codificam as porções anticorpo e o citotóxica do conjugado adjacentes entre si ou separados por uma região que codifica um peptídeo ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
Em uma outra modalidade, um anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento a tumor em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, —removendo-se em seguida o conjugado que não se ligou da circulação usando- se um agente de eliminação e administrando-se, em seguida, um “ligante” (avidina, por exemplo) que é conjugado a um agente citotóxico (um rádio- nucleotídeo, por exemplo).
IMUNOCONJUGADOS EXEMPLIFICATIVOS-CONJUGADOS TIO-ANTICORPO-FÁRMACO A. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B CISTEÍNA-SUBMETIDO À
ENGENHARIA O DNA que codifica uma variante de sequência de aminoácido de anticorpos anti-CD79b cisteína submetidos à engenharia e anticorpos originais anti-CD79b da presente invenção é preparado por uma variedade de modos que incluem, mas sem limitação, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos que ocorrem naturalmente), oe preparação por mutagênese direcionada a sítio (ou mediada por —oligonucleotídeo) (Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et a/ (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260), PCR mutagênese (Higuchi, (1990) em PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et a/ (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; e Vallette ef al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), e mutagênese de cassete (Wells et a/ (1985) Gene 34:315-323) de um DNA preparado anteriormente que codíficas o polipeptídeo. Os protocolos kits e reagentes de mutagênese, são disponíveis no comércio, tais como, por exemplo, o kit QuikChange6 Multi Site- e Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutações singulares são também geradas por mutagênese direcionada a oligonucleotídeo usando-se DNA de plasmídeo de dois filamentos como gabarito por mutagênese a base de PCR (Sambrook e Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. edição; Zoller et a/ (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. e Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Variantes de anticorpos —recombinantes podem ser construídos também por manipulação do fragmento de restrição ou por PCR de prolongamento por sobreposição com oligonucleotídeos sintéticos. Iniciadores mutagênicos codificam as substituição (ões) de códons de cisteína. Podem ser empregadas técnicas padrão de o
| | mutagênese para gerar DNA que codifica tais anticorpos mutantes cisteina | submetidos à engenharia (Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory | Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; e Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and — Wilkey-Interscience, Nova York, N.Y., 1993). A tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et a/ (1990) Nature | 348:552-553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti-CD79b e | fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio | oe variável (V) de imunoglobulina provenientes de doadores não imunizados. De | 10 acordo com esta técnica, são clonados genes de domínio V de anticorpo no quadro ou em um gene de proteína importante ou não importante do revestimento de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpos na superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de um único filamento do genoma do fago, também resultam seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo na seleção do gene que codifica o anticorpo que apresenta essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B (Johnson et a/ (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564- o 571; Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et a/ (1993) EMBO J. 12:725-734; patente U.S. No.
5.565.332; patente U.S. No. 5.573.905; patente U.S. No. 5.567.610; patente U.S. -No. 5.229.275). Os anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizados usando-se metodologia de síntese de oligopeptídeos conhecida ou podem ser preparados e purificados usando-se a tecnologia recombinante. A sequência de aminoácidos adequada ou porção dela, podem ser produzidas por síntese direta de peptídeos usando-se técnicas em fase sólida (Stewart et al., Solid- Phase Peptide Synthesis, (19689) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA;
Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). Pode ser conduzida a síntese da proteína in vitro usando-se técnicas manuais ou por automatização. A síntese em fase sólida atomatizada pode ser efetuada, por exemplo, | empregando-se aminoácidos protegidos por t-BOC ou por Fmoc e usando-se um sintetizador de peptídeos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), usando-se as instruções do fabricante. Diversas porções do anticorpo anti-CD79B podem ser sintetizadas quimicamente separadamente e combinadas usando-se métodos químicos e enzimáticos para produzir o oe anticorpo anti-CD79b desejado ou polipeptídeo CD79b. Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (Morimoto et a/ (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; e Brennan et al | (1985) Science, 229:81), ou produzidos diretamente por células hospedeiras | —recombinantes. Fragmentos Fab, Fv e ScFv do anticorpo anti-CD79b podem | ser todos expressos em E. coli e secretados a partir dela, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de | anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos | o discutidas no presente documento. Alternativamente, os fragmentos Fab”-SH | podem ser diretamente recuperados de E. coli e ser quimicamente acoplados | para formar fragmentos F(ab'), (Carter et al (1992) Bio/Technology 10:163- | 167), ou isolados diretamente da cultura de células hospedeira recombinantes. | O anticorpo anti-CD79b pode ser um fragmento Fv de uma única cadeia (scFv) | (WO 93/16185; patente US 5.571.894; patente US 5.587.458). O fragmento do | — anticorpo anti-CD79b pode também constituir um “anticorpo linear” (patente US |
5.641.870). Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou | biespecíficos. | A descrição abaixo se refere principalmente à produção de | '
anticorpos anti-CD79b por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico que codifica anticorpo anti-CD79b.
O DNA que codifica anticorpos anti-CD79b pode ser obtido de uma biblioteca de DNAc preparada a partir de tecido que se acredita que possua o RNAm de | anticorpo anti-CD79b e que se acredita que o expresse a um nível detectável.
Consequentemente, o DNA de anticorpo anti-CD79b humano ou de | polipeptídeo de CD79b pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de | DNAc preparada a partir de tecido humano.
O gene que codifica o anticorpo | oe anti-CD79b pode também ser obtido de uma biblioteca genômica ou por | procedimentos sintéticos conhecidos (tais, por exemplo, como síntese | automatizada de ácido nucleico). O projeto, os métodos de seleção e preparação da presente invenção permitem anticorpos anti-CD79b cisteina submetidos à engenharia | que são reativos com a funcionalidade eletrofílica.
Estes métodos permitem ainda compostos conjugados de anticorpos tais como compostos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) com moléculas de fármaco em sítios designados, projetados seletivos.
Os resíduos de cisteína reativos na superfície do anticorpo permitem que se conjugue especificamente a fração fármaco o através de um grupo reativo tiol tal como maleimida ou haloacetila.
A reatividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo de Cys a um grupo maleimida é de aproximadamente 1000 vezes maior em comparação com qualquer outra funcionalidade aminoácido em uma proteína, tal como grupo amino de resíduos de lisina ou o grupo amino no terminal N.
A funcionalidade tiol específica em reagentes de iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas são necessários valores pH maiores (> 9,0) e tempos de reação mais prolongados (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres). A quantidade de til livre em uma proteína pode ser estimado pelo ensaio padrão de Ellman.
A imunoglobulina M é um exemplo de pentâmero ligado por dissulfeto, ao passo que a imunoglobulina G é um exemplo de uma proteína com pontes dissulfeto internas que ligam entre si subunidades.
Nas proteínas como estas, a redução das ligações dissulfeto com um reagente tal como ditiotreito! (DTT) ou selenol (Singh et a/ (2002) Anal. —Biochem. 304:147-156) é necessária para gerar o tiol livre reativo.
Esta abordagem pode resultar na perda da estrutura terciária do anticorpo e da especificidade de ligação a antígeno.
O ensaio PHESELECTOR (ELISA de fagos para Seleção de Tióis oe Reativos, em inglês Phage ELISA for Selection of Reactive Tiols) permite a detecção de grupos cisteína reativos em anticorpos em um formato de fago de ELISA, auxiliando assim, no projeto de anticorpos cisteina submetidos à engenharia (Junutula, J.R. et al. (2008) J.
Immunol.
Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). O anticorpo cisteína submetido à engenharia é disposto nas superfícies dos poços, incubando-se, em seguida, com partículas de fagos, adicionando-se anticorpo secundário rotulado com HRP, e detectando-se a absorbância.
As proteínas mutantes exibidas no fato podem ser testadas de um modo rápido, robusto e com alto rendimento.
As bibliotecas de anticorpos cisteina submetidos à engenharia podem ser produzidas e o submetidas a seleção de ligação, usando-se a mesma abordagem para identificar adequadamente sítios reativos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas aleatórias de fagos de proteínas de anticorpos ou de outras proteínas.
Esta técnica inclui fazer-se reagir as proteinas mutantes de cisteína exibidas no fago com um reagente de afinidade ou com um grupo repórter que é também reativo a tiol.
O ensaio PHESELECTOR permite que se teste os grupos tiol reativos em anticorpos.
A identificação da variante A121C por este método é exemplar.
A molécula Fab integral pode ser efetivamente examinada para a identificação de mais variantes TioFab com grupos tiol reativos.
Foi empregado | um parâmetro, a acessibilidade à superfície fracionária para a identificação e quantificação da acessibilidade do solvente aos resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo.
A acessibilidade à superfície pode ser expressa como a área superficial (A?) que se pode colocar em contato com uma molécula de solvente, com água, por exemplo.
O espaço ocupado de água é de aproximadamente uma esfera de raio 1,4 À.
O software é livremente disponível e pode se obter sua licença livremente (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825, ou por Internet: oe WwwW.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) em forma de programas CCP4 Suite de cristalografa que emprega algoritmos para calcular a acessibilidade à superfície de cada aminoácido de uma proteína com coordenadas conhecidas derivadas de uma cristalografia de raios X (“The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta.
Cryst.
D50:760-763). Dois módulos de software exemplificativos que efetuam os cálculos de acessibilidade a superfície são “AREAIMOL” e “SURFACE”, baseados nos algoritmos de B.
Lee e F.
M.
Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400. AREAIMOL define a superfície de uma proteína acessível a solvente como o lócus do centro de uma esfera de sondagem (representando uma molécula de solvente) à medida que ela rola e sobre a superfície de Van der Waals da proteína.
AREAIMOL calcula a área superficial acessível a solvente gerando pontos na superfície de uma esfera estendida ao redor de cada átomo (a uma distância do centro do átomo igual à soma dos raios do átomo e da sonda), e eliminando aqueles que se encontram dentro de esferas equivalentes associadas com átomos vizinhos.
AREAIMOL encontra a área de átomos acessível a solvente em um arquivo de —coordenadas de PDB, e resume a área acessível por resíduo, por cadeia e para a totalidade da molécula.
As áreas acessíveis (ou diferenças de áreas) para átomos individuais podem ser inscritas em um arquivo de saída pseudo- PDR.
AREAIMOL pressupõe um único raio para cada elemento, e somente
| reconhece um número limitado de elementos diferentes. | AREAIMOL e SURFACE relatam acessibilidades absolutas, isto é, o número de Angstroms (À) ao quadrado. A acessibilidade à superfície fracionária é calculada por referência a um estado padrão relevante para um — aminoácido no interior do polipeptídeo. O estado de referência é o tripeptídeo Gly-X-Gly, em que X é o aminoácido de interesse, e o estado de referência | deve ser uma conformação “prolongada”, isto é, como aquelas em filamentos beta. A conformação prolongada maximiza a acessibilidade de X. Uma área oe acessível calculada é dividida pela área acessível em um estado de referência de tripeptíideo GIy-X-Gly e relata o quociente, que é uma acessibilidade fracionária. A porcentagem de acessibilidade é uma acessibilidade fracionária multiplicada por 100. Um outro algoritmo exemplar para se calcular a acessibilidade à superfície é baseada no módulo SOLV do programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel) que calcula a acessibilidade fracionária de um resíduo de aminoácido a uma esfera de água baseada nas coordenadas de raios X do polipeptídeo. A acessibilidade fracionária à superfície para cada aminoácido em um anticorpo pode ser calculada usando- se informações disponíveis sobre a estrutura cristalina (Eigenbrot et a/. (1993) J o Mo! Biol. 229:969-995).
O DNA que codifica os anticorpos cisteina submetidos à engenharia é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (usando-se sondas de oligonucleotídeo, por exemplo, que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte de umtal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símios, células Ovarianas de Hamster | Chinês (CHO), ou outras células hospedeiras de mamíferos, tais como células
Da E E E a | | 292 | | de mieloma, (patente U.S.
No. 5.807.715; U.S. 2005/0048572; UJS. | 2004/0229310) que em outras circunstâncias não produzem a proteína de | anticorpo, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células | hospedeiras recombinantes. | 5 Depois de projetados e selecionados, os anticorpos cisteína | submetidos à engenharia, TioFabs, por exemplo, juntamente com os resíduos | de Cys submetidos à engenharia, “aminoácidos de cisteína livre" podem ser produzidos por: (i) expressão em um sistema bacteriano, de E. coli, por oe exemplo (Skerra et al (1993) Curr.
Opinion in Immunol. 5:256-262; Pluckthun (1992) Immunol.
Revs. 130:151-188) ou em um sistema de cultura de células de mamíferos (WO 01/00245), em células ovarianas de Hamster Chinês (CHO), por exemplo; e (ii) purificação usando-se técnicas de purificação habituais de proteínas (Lowman et a/ (1991) J.
Biol.
Chem. 266(17):10982- 10988). Os grupos tiol de Cys engenherada reagem com reagentes eletrofílicos de ligante e com intermediários fármaco-ligante para formar os conjugados de fármaco e anticorpo cisteina submetido à engenharia e outros anticorpos cisteina submetidos à engenharia rotulados.
Os resíduos Cys de o anticorpos cisteina submetidos à engenharia, e presentes nos anticorpos originais, que são emparelhados para formar ligações dissulfeto entre cadeias e no interior de cadeias não têm nenhum grupo tiol reativo (a não ser que sejam tratados com um agente redutor) e não reagem com reagentes eletrofílicos de ligante ou com intermediários fármaco-ligante.
O resíduo Cys recém construído, pode permanecer sem parear e é capaz de reagir, isto é, de se conjugar com um reagente eletrofílico de ligante ou com um intermediário fármaco-ligante, tal como um fármaco-maleimida.
Os intermediários fármaco- ligante exemplificativos incluem: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE, e MC-vc-PAB-MMAF.
As posições na estrutura dos resíduos Cys submetidos à mo R SEE engenharia das cadeias pesadas e leves são numeradas de acordo com um sistema de numeração de sequência.
Este sistema de numeração de sequência é correlacionado com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a.
Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) começando no terminal N, difere do esquema de numeração de Kabat (carreira inferior) por inserções indicadas com a, b, c.
Usando-se o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real pode conter um número menor de oe aminoácidos ou um número adicional de aminoácidos correspondendo a um encurtamento de uma FR ou de uma CDR do domínio variável ou a inserções delas.
Os sítios de variante de cadeia pesada cisteina engenherada são identificados pelos esquemas de numeração de sequência e de numeração de Kabat.
Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD79b cisteina submetido à engenharia é preparado por um processo que compreende: (a) a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo anti-CD79b originário por cisteina; e (b) a determinação da reatividade a tiol do anticorpo anti- o CD79b cisteína submetido à engenharia fazendo-se reagir o anticorpo cisteína —submetido à engenharia com um reagente reativo a tiol.
O anticorpo cisteína submetido à engenharia pode ser mais reativo do que o anticorpo originário com o reagente reativo a tiol.
Os resíduos de aminoácido cisteíina livres podem estar localizados nas cadeias pesadas ou leves, ou nos domínios constantes ou variáveis.
Os fragmentos de anticorpos, Fab, por exemplo, podem também ser submetidos à engenharia com um ou mais aminoácido cisteína substituindo os aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpos cisteina submetidos à engenharia. o AAA EA CC ——————
Uma outra modalidade da presente invenção propõe um método de preparação (construção) de um anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia, compreendendo: (a) a introdução de um ou mais aminoácidos cisteína em um anticorpo anti-CD79b originário para gerar o anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia; e (b) a determinação da reatividade a tiol do anticorpo cisteína submetido à engenharia de um reagente reativo a tiol; em que o anticorpo ) cisteína submetido à engenharia é mais reativo do que o anticorpo originário como reagente reativo a tiol.
A etapa (a) do método de preparação de um anticorpo cisteina submetido à engenharia pode compreender: () a mutagênese de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo cisteina submetido à engenharia; (ii) a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia; e (ii) o isolamento e a purificação do anticorpo cisteina submetido à engenharia.
A etapa (b) do método de preparação de anticorpo cisteina o submetido à engenharia pode compreender a expressão do anticorpo cisteina submetido à engenharia em uma partícula viral selecionada de um fago ou de uma partícula de fagemídeo.
A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo cisteína submetido à engenharia pode também compreender: () fazer-se reagir o anticorpo cisteina submetido à engenharia com um reagente de afinidade reativo a tiol para gerar um anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade; e (ii) —medir-se a ligação do anticorpo cisteina submetido à engenharia rotulado para afinidade a um meio de captura.
Uma outra modalidade da presente invenção consiste em um método de teste de anticorpos cisteína submetidos à engenharia com aminoácidos cisteina não emparelhados extremamente reativos para reatividade a tiol, compreendendo: (a) introduzir-se um ou mais aminoácidos cisteina em um anticorpo originário para gerar um anticorpo cisteina submetido à engenharia; (b) fazer-se reagir o anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente de afinidade para reativo a tiol para gerar um anticorpo oe cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade; e (c) —medir-se a ligação do anticorpo cisteina submetido à engenharia rotulado para afinidade a um meio de captura; (d) determinar-se a reatividade a tiol do anticorpo cisteína submetido à engenharia com o reagente reativo a tiol.
A etapa (a) do método de teste de anticorpos cisteína submetidos à engenharia pode compreender: () a mutagênese de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo cisteina submetido à engenharia; rs (ii) a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia; e (ii) o isolamento e a purificação do anticorpo cisteíina submetido à engenharia.
A etapa (b) do método de se testar os anticorpos cisteina submetidos à engenharia pode compreender a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia em uma partícula viral selecionada de uma partícula —defagooude um fagemídeo.
A etapa (b) do método de seleção dos anticorpos cisteína sumetido à engenharias também pode compreender: (i) reagir o anticorpo cisteina sumetido à engenharia com um reagente com afinidade para tiol-reativo a fim de gerar um anticorpo cisteina sumetido à engenharia rotulado por afinidade; e (ii) medir a ligação do anticorpo cisteína sumetido à engenharia rotulado por afinidade para um meio de captura. B. ENGENHARIA DE CISTEÍNA DAS VARIANTES IGG DE ANTI-CD79B Introduziu-se cisteína ao sítio da cadeia pesada 118 (numeração EU) (equivalente à posição 118 da cadeia pesada, numeração sequencial) aos anticorpos anti-CD79b monocionais de origem, quiméricos de comprimento oe total ou na cadeia leve 205 (numeração Kabat) (equivalente à numeração sequencial da posição de cadeia leve 209) aos anticorpos anti-CD79b monoclonais de origem, quiméricos pelos métodos de engenharia de cisteina aqui descritos.
Os anticorpos cisteína sumetido à engenharias com cisteina na cadeia pesada 118 (numeração EU) foram: (a) thio-MA79b.v17-HC(A118C) coma sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 229), Figure 24; (b) thio-MA79b.v18-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) e sequência de cadeia leve | (SEQ ID NO: 231), Figure 25; (c) thio-MA79b.v28-HC(A118C), com a | o sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) e sequência de cadeia leve | 20 (SEQID NO: 233), Figure 26; (d) thio-MA79b-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: | | 237), Figure 28; e (e) thio-anticcynoCD79b-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: | 245), Figure 48.
Anticorpos cisteina sumetido à engenharias com cisteina na cadeia leve 205 (numeração Kabat) gerados foram: (a) thio-MA79b-LC(V205C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 235), Figura 27 e (b) thio-anticeynoCD79b(ch10D10)- | | | |
LC(V205C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 300), Figura 49. Esses anticorpos monoclonais cisteína sumetido à engenharias foram expressados em células CHO (Ovário de Hamster chinês) por | fermentação passageira em meio contendo cisteína 1mM. | De acordo com uma modalidade, os anticorpos anti-CD79b | cisteína sumetido à engenharias de MA79b humanizados, compreende um ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína oe livre (SEQ ID Nº 251-259, Tabela 2). —TABELA2:COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD798B CISTEINA SUMETIDO À ENGENHARIAS MA79B8 HUMANIZADOS SEQUENCIAL | KABAT EU |evatessess | vse = | vse | >| 2ss | |LRLSceasaYT [aaso = ae | las | mmnsLReEDTAv asse = =jasso = | ==> ass | É Tess so sm bass De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteína sumetido à engenharias MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 260-268, Tabela 3).
TABELA 3: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD798 CISTEINA SUMETIDO À ENGENHARIA CHMA79B
EEE SEQUENCIAL | KABAT EU |Evateassas fase Ja Paso |veIsceaTrt ese ese | =>dass |Lssteensav esse esse las O Tsvvesasm emo = [emo | ——=—=>1a6s | De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteína — sumetido à engenharias anti-cynoCD79b(ch10D10) compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína oe livre (SEQ ID NO: 269-277 Tabela 4) TABELA 4: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUMETIDO À ENGENHARIA ANTI-CYNOCD79B(CH10D10)
EEE SEQUENCIAL | KABAT EU [evareesere fase —úÚfose | "úwúÚjlass | lLstreevrers [1a | | "úlan | LLNsvreEDTAT |sssc = soc = | = ba Imuvesaste [ste fsnmae Pag
Err E SEQUENCIAL | KABAT EU same De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteina LL sumetido à engenharias MA79b humanizados compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 278-284, Tabela 5) — TABELAS: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE E KABAT PARA VARIANTES DO ANTICORPO ANTI-CD798 CISTEÍNA SUMETIDO À ENGENHARIA MAZ79B8 HUMANIZADAS cEEET SEQUENCIAL | KABAT e : De acordo com uma modalidade, os anticorpos anti-CD79b cisteína sumetido à engenharias de MA79b quiméricos compreende uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 285-291, Tabela 6)
TABELA 6: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE E KABAT PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUMETIDO À ENGENHARIAS MA7Z9B6 QuUIMÉRICO es [meme ler o SEQUENCIAL | KABAT o De acordo com uma modalidade anticorpos anti-CD79b cisteina — sumetido à engenharias anticcynoCD79b(ch10D10) compreende uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 292-298, Tabela 7) TABELA 7: COMPARAÇÃO DA NUMERAÇÃO KABAT E SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE e PARA VARIANTES DO ANTICORPO ANTI-CD798B SUBMETIDO À ENGENHARIA DE CISTEÍNA (CH10D10) a fa o : SEQUENCIAL |) KABAT
C.
ANTICORPOS ANTI-CD798 CISTEINA SUMETIDO À ENGENHARIAS ROTULADOS | Os anticorpos anti-CD79b cisteína sumetido à engenharia podem | ser acoplados especificamente e eficientemente ao sítio com um reagente tiol- | reativo.
O reagente tiol-reativo pode ser um reagente ligante multifuncional, um elemento de apreensão, ou seja reagente com rótulo de afinidade (por exemplo, um reagente biotina-ligado), um rótulo de detecção (por exemplo, um reagente fluoróforo) um reagente de imobilização de fase sólida (por exemplo, SEPHAROSETY, poliestireno, ou vidro), ou um intermediário fármaco-ligante. ) Um exemplo de um reagente tiol-reativo é N-etil maleimida (NEM). Numa “modalidade exemplar, a reação de um ThioFab com um reagente biotina-ligado propicia um ThioFab com um ligante funcionalizado que pode ser adicionalmente reagido com uma reagente da fração do fármaco ou outro rótulo.
A reação de um ThioFab com um intermediário fármaco-ligante obtém um conjunto fármaco-ThioFab.
Métodos exemplificativos aqui descritos podem ser aplicados em geral, à identificação e produção de anticorpos e, em geral, a outras proteínas aplicando-se as etapas de planejamento e análise aqui descritos.
Uma tal abordagem pode ser aplicada a conjugação de outros o reagentes tiol-reativos, em que o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, um iodoacetamida, um dissulfeto de piridila ou outro par de conjugação tiol- reativo (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes e Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate = Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, | Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, Gin Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). O reagente tiol-reativo pode ser uma fração de fármaco, um fluoróforo, tal como um corante fluorescente como fluoresceína ou rodamina, um agente quelante para um imageamento ou metal radioterapêutico, um rótulo | peptidila ou não peptídila ou marcador de detecção, ou um agente modificador da depuração, tal como múltiplos isômeros de polietileno glicol, um peptídeo que se liga a um terceiro componente, ou um outro carboidrato ou agente | lipofílico. | 5 D.
Uso Dos ANTICORPOS ANTI-CD79B CISTEÍNA SUMETIDOS À ENGENHARIA Os anticorpos anti-CD79b cisteína sumetido à engenharias e seus conjugados podem encontrar uso como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico.
A presente invenção propicia ainda métodos de prevenção, oe manejo, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados com um | 10 distúrbio relacionado a célula B.
Em particular, a presente invenção propicia métodos de prevenção, manejo, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados com um distúrbio proliferativo celular, como câncer por exemplo, linfoma, linfoma de não-Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHI indolente recidivo, NHL contumaz, NHL indolente | 15 contumaz, leucemia linfocítica crônica (CÉLULAS), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula de revestimento.
A presente invenção propicia ainda métodos | e para o diagnóstico de um distúrbio relacionado a CD79b ou predisposição a | desenvolver esse distúrbio, bem como a métodos para identificação de | anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, que de | preferência, ligam polipeptídeo CD79B associados a célula B. | Uma outra modalidade da presente invenção dirige-se ao uso de | um anticorpo anti-CD79b cisteína sumetido à engenharia para preparação de | um medicamento de utilidade no tratamento de uma condição responsável por | umdistúrbio relacionado a célula B.
E.
CONJUGADOS FÁRMACO-ANTICORPO CISTEÍNA SUMETIDO À ENGENHARIAS (CONJUGADOS TIO-FARMACO-ANTICORPO (TDCsS)) Um outro aspecto da invenção se trata de um composto
| 303 | conjugado anticorpo-fámaco — compreendendo um anticorpo anti-CD79b cisteína sumetido à engenharia (Ab) e uma fração de fármaco auristatina (D) em que o anticorpo cisteína sumetido à engenharia é ligado por meio de um ou mais aminoácidos cisteína livres por uma fração do ligante (L) a D; tendo o | 5 composto a seguinte Fórmula |: Ab—(L-D), U | em que p é 1, 2, 3, ou 4; e em que o anticorpo cisteína sumetido à | engenharia é preparado por um processo compreendendo a substituição de um o ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b original por um | ou mais aminoácidos cistina livres. Um outro aspecto da invenção é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula | em que a introdução de fármaco médio pro anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5, ou cerca de 3 a cerca de 4. : As figuras 24 a 28 e 48 a 49 mostram modalidades dos conjugados anticorpo anti-CD79b-fármaco cisteina sumetido à engenharias (ADC) em que uma fração do fármaco auristatina é ligada a um grupo cisteína oe sumetido à engenharia em: cadeia leve (LC-ADC) ou cadeia pesada (HC-ADC). Vantagens potenciais dos conjugados de anticorpo anti-CD79b- fármaco cisteína sumetido à engenharias incluem melhor segurança (índice terapêutico maior)melhores parâmetros PK, pontes dissulfeto inter-cadeia do anticorpo, ficam retidas o que pode estabilizar o conjugado e reter sua conformação de ligação ativa, os sítios de conjugação do fármaco são definidos, e a preparação dos conjugados anticorpo-fármaco cisteína sumetido à engenharias da conjugação dos anticorpos cisteína sumetido à engenharias —paraosreagentes fármaco-ligante resulta em um produto mais homogêneo.
LIGANTES "Ligante" Unidade Ligante" ou "ligação" significa uma fração química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma fração de fármaco. Em várias modalidades um ligante é especificado como L. Um "ligante" (L) é uma fração bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais frações de Fármaco (D) e uma unidade do anticorpo (Ab) formando conjugados anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula 1). Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) podem ser preparados, convenientemente usando-se um Ligante com funcionalidade reativa para ligação ao Fármaco e ao Anticorpo. Um cisteína oe tiol de um anticorpo cisteina sumetido à engenharia (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de um reagente ligante, uma fração de fármaco ou intermediário fármaco-ligante.
Num aspecto, um Ligante possui um sítio reativo que possui um grupo eletrofílico que é reativo para uma cisteína nucleofílica presente em um anticorpo. A cisteína tiol do anticorpo é reativa com um grupo eletrofílico em um Ligante e forma uma ponte covalente para um Ligante. Grupos eletrofílicos úteis incluem, sem limitação, grupos maleimida e haloacetamida.
Ligantes incluem um radical bivalente tal como um alquildiila, um arileno um heteroarileno, frações tais como : : -(CR2),O(CR2)n-, unidades de o repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenóxi, PEG, polimetileneóxi) e —alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine"”) e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
Anticorpos cisteina sumetido à engenharias reagem com reagentes ligantes ou intermediários fármaco-ligante com grupos funcionais eletrofílicos tais como maleimida ou um a-halo carbonila de acordo com o —método de conjugação na página 766 de Klussman et a/, (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, e de acordo com o protocolo do Exemplo 6.
O ligante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplificativos incluem 6-maleimidocaproíla
("MC"), maleimidopropanoila ("MP), valina-citrulina (val-cit) ou vc), alanina- fenilalanina (ala-phe ou af), para-aminobenziloxicarbonila (PAB), N- succinimidila — 4-(2-priidiltio — pentanoato — (SPP), — N-succinimidil — 4-(N- maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato (SMCC), N-succinimidil (4-iodo- acetilaminobenzoato (SIAB), etileneóxi -CHXCH20- como uma ou mais unidades de repetição (EO ou PEO). Componentes ligantes adicionais são do conhecimento da técnica e alguns estão aqui descritos. Numa modalidade, o ligante L de um ADC possui a fórmula: oe Ag WyYy em que: -A- é uma unidade Tensora covalentemente ligada a uma cisteina tiol do anticorpo (Ab); aebou; cada —W- é independentemente uma unidade Aminoácido; w é independentemente um inteiro variando de O a 12; -Y- é uma unidade espaçadora covalentemente ligada à fração do fármaco; e e yé0o,1ou2.
UNIDADE TENSORA A unidade Tensora (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-). Neste sentido, um anticorpo (Ab) tem o grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de um Tensor. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes em um anticorpo, seja naturalmente ou via manipulação química, incluem, sem limitação, a sulfidrila (-SH), amino, hidroxila, carboxila, o grupo —hidroxil anomérico de um carboidrato e carboxila. Em um aspecto, os grupos funcionais de anticorpo são sulfidrila ou amino. Grupos sulfidrila podem ser geados por redução de uma ponte dissulfeto intramolecular de um anticorpo.
Alternativamente, grupos sulfidrila podem ser gerados por reação de um grupo amino de uma fração lisina de um anticorpo usando 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou um outro reagente gerador de sulfidrla. Numa modalidade, um anticorpo (Ab) tem um grupo cisteína tiol livre que pode formar uma ponte com um grupo funcional eletrofílico de uma Unidade Tensora. Unidades tensoras exemplificativos de conjugados de Fórmula | estão ilustrados nas Fórmulas li e Il, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são como indicados supra, e R é um radical bivalente selecionado de: (CH2),, C3-Cg carbociclila, O-(CH2),, arileno, oe (CH2)--arileno, — -—arileno(CH2))-, — (CH2)-(C3-Cg — carbociclila),) — (C3a-Cs —carbociclila)>—(CH2),, C3-Cg heterociclila, (CH2)-(C3-Cg heterociclila), -(Ca-Cs heterociclila)>=-(CH2).-, (CH2).C(O)NRº(CH2)-, -(CH2CH2O)--, (CH2CH20),-CH7-, ACH2).C(O)NRº(CHICH2O)--, (CH2).C(O)NRº(CHICH2O),-CHa-, (CH2CH2O0),C(O)NRº(CH2CH2O)--, (CH2CH2O),C(O)NRº(CH2CH2O0)-CH2-, e (CHCH2O).C(O)NRº(CH3)- ; em que Ré H, CrCs alquila, fenila, ou benzila; e r é independentemente um inteiro que varia de 1-10. Arileno inclui radicais hidrocarboneto bivalentes aromáticos de 6 a e 20 átomo de carbono derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do sistema de anel aromático. Grupos arileno típicos incluem, sem limitação a radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similares.
Grupos heterociclila incluem, um sistema de anel em que um ou mais átomos no anel é um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, e enxofre. O radical heterociclo compreende 1 a 20 átomo de carbono, e 1 a 3 —heteroátomos selecionado de N, O, P e S. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomo de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S), por exemplo, um sistema biciclo [4,5], [5,5], 5,6], ou [6,6]. Heterociclos estão descritos em Paquette Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A.
Benjamin, New York, 1968), particularmente os capítulos 1, 3, 4, 6, 7, and 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, À series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), particularmente os Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; e J.
Am.
Chem.
Soc. | (1960) 82:5566. | Exemplos de heterociclos incluem à guisa de exemplo e não de | oe limitação: piridila, — diidropridila, tetraidropiridila — (piperiídila), tiazolla, ' 10 tetraidrotiofenila, tetraidrotiofenila oxidado com enxofre, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, ' indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4- piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetraidrofuranila, bis- | tetraidrofuranila, tetraidropiranila, — bis-tetraidropiranila, = tetraidroquinolinila, — tetrahidroisoquinolinila, decahidroquinolinila, octahidroisoquinolinila, azocinila, | triazinila, = 6H-1,2,5-tiadiazinila, =“ 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, o 1H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, —quinazolinila, cinnolinila, pteridinila, 4Ah-carbazolila, carbazolila, B-carbolinila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morflinila, oxazolidinila, benzotriazolila, benzisoxazolila, oxindolila, — benzoxazolinila, e isatinoila. | Grupos carbociclila incluem um anel saturado ou insaturado com 3 a 7 átomo de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono com um biciclo.
Carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais
| 308 tipicamente, 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], 5,6], ou [6,6]. ou 9 a 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplo de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, —1-ciclopent-1-enila, — 1-ciclopent-2-enila, — 1-ciclopent-3-enila, cicloexila, 1-cicloex-1-enila, 1-cicloex-2-enila, 1-cicloex-3-enila, cicloeptila, e ciclooctila. Deve ficar entendido que, de todas as modalidades | e exemplificativas de Fórmula |, ADC como 1I-VI que, mesmo onde não indicado expressamente, de 1 a 4 frações de fármaco são ligadas a um anticorpo ( p = 1 a 4), dependendo do número de resíduos de cisteína sumetido à engenharias.
O EE even & p u Ars fon-eomerao nero) Pm e Uma unidade Tensora de Fórmula |l ilustrativa é derivada de maleimido-caproíla (MC) em que R* é -(CHo)s-:
O : AA | i O Oo MC Uma unidade Tensora ilustrativa de Formula Il, sendo derivada de maleimidopropanoila 9MP) em que R"? é -(CH)2-: o o so Oo MP
Uma outra unidade Tensora ilustrativa de Fórmula 1l em que R”º é -(CHCH20),--CH; — e r é 2:
O O OO ão
NS O Uma outra unidade Tensora de Formula Il em que RU é (CH2)C(O)NRº(CH2CH2O0)-CHa- em que Rº é H e cada ré 2: Pp o e RA A
H O ( MPEG Uma unidade Tensora ilustrativa de Formula Ill em que R é - (CH2)s-: Oo
H O Numa outra modalidade, a unidade Tensora está ligada ao anticorpo anti-CD79b cisteína sumetido à engenharia via uma ponte dissufeto entre o átomo de enxofre cisteina sumetido à engenharia do anticorpo e um (À átomo de enxofre da unidade Tensora. Uma unidade Tensora representativa desta modalidade está ilustrada pela Fórmula IV, em que R”, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são como acima indicado. AS SR do yo ) Pv Numa outra modalidade ainda, o grupo reativo da unidade | Tensora contém um grupo funcional tiol-reativo que pode formar uma ponte com unmtiol cisteína livre de um anticorpo. Exemplos de grupos funcionais tiol- reativos incluem, sem limitação, a maleimida, a-haloacetila, ésteres ativados tals como ésteres de succinimida, ésteres d4-nitrofenílicos, ésteres pentafluorfenílicos, ésteres tetrafluorfenílicos, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos.
Unidades Tensoras representativas desta modalidade estão ilustradas nas Fórmulas Va e Vb, em que -R'”-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são como supracitados; AS ( CoNI=RT CO MY p ) p Va tos fon RT ao D ) oe Pp vb Numa outra modalidade, o ligante pode ser um ligante tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma fração de fármaco, por meio de uma fração de ligante multifuncional ramificada a um anticorpo. (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar do fármaco para anticorpo, ou seja, por meio de carga, relacionada à potencia do ADC. Portanto, sempre que em um anticorpo cisteina sumetido à engenharia constar apenas um grupo cisteína tiol reativo, e, uma plêiade de frações de fármaco podem ser ligadas através de um ligante dendrítico.
UNIDADE DE AMINOÁCIDO O ligante pode compreender resíduos de aminoácido. A unidade de aminoácido (W,-) quando presente, liga o anticorpo (Ab) à fração do fármaco (D) do conjugado anticorpo-fármaco cisteína sumetido à engenharia (ADC) da invenção.
-Ww é uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Resíduos de aminoácido
À compreendendo a unidade de Aminoácido incluem os de ocorrência natural, bem como os aminoácidos secundários e análogos de aminoácido de ocorrência natural, tais como citrulina. Cada unidade -W- independentemente, possui a fórmula citada abaixo entre colchetes, e w é um número inteiro que variadeO0a12: o
H
TT w oe em que R'** é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butia, benzila, para-hidroxibenzila, -CHOH, -CH(OH)CH3, — -CHCH;SCH3, - CH;CONH>, -CH;COOH, -CHCHxCONH,, -CH2CH2COOH, - (CH2);NHC(=NH)NH,, -(CH2);NH2, -(CH2)NHCOCH3, -(CH2);NHCHO, - (CHI9ANHC(=NH)NH,, — -(CH2)NH2, -(CH)9NHCOCH3, -(CH2)INHCHO, - (CH2);NHCONH2, -(CH2)ANHCONH>7, - CHXCH2CH(OH)CHANH,, 2-piridilmetila-, 3-piridilmetila-, 4-piridilmetila-, fenila, cicloexila,
OL LIS %& CX 2 O ; N ou $. O Fon) & sem É NO. / .
H ' N
H Quando R** é diferente de hidrogênio, o átomo de carbono — ao qual R”* está preso é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R'* está ligado, está, independentemente na configuração (S) ou (R) ou em uma mistura racêmica. Unidades de aminoácido podem assim, ser enantiomericamente
312 | puros, racêmicos ou diastereoméricos.
Unidades de Aminoácido —W,- exemplificativos incluem um dipeptideo, um tripeptídeo, um tetrapeptideo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplificativos incluem valina-citrulina (Vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplificativos incluem glicina-valina- citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly.. Resíduos de aminoácido compreendendo um componente ligante de aminoácido incluem os que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos secundários e análogos de oe aminoácido de ocorrência não natural, tais como citrulina.
A unidade de aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, a fim de liberar a fração de fármaco (-D), que, numa modalidade, é protonada in vivo com a liberação fornecendo um Fármaco (D). Componentes ligantes de aminoácido podem ser planejados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma determina enzima, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D ou uma plasmina protease.
UNIDADE ESPAÇADORA A unidade espaçadora (-Y,-) quando presente (y = 1 ou 2) liga o uma unidade de aminoácido (Wy,-) 1º fração de fármaco (D) quando está presente uma unidade de aminoácido (w = 1 a 12). Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade de estiramento à fração de Fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora liga a fração de fármaco à unidade de anticorpo quando ambas as unidades, de aminoácido e unidade de estiramento estão ausentes, (w, y = 0). As unidades espaçadoras pertencem a dois tipos genéricos: auto-imolador e não auto- imolador. Uma unidade espaçadora que não é auto-imoladora é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à fração de Fármaco após clivagem, particularmente, enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco ou da fração-ligante do Fármaco.
Quando uma unidade espaçadora glicina-glicina contendo ADC ou uma unidade espaçadora glicina passa por clivagem enzimática via uma protease associada a célula de tumor, uma protease associada a célula de câncer ou uma protease associada | a linfócit, uma fração de glicina-glicina-Fármaco ou uma fração glicina- | Fármaco é clivada de Ab-A;-Ww-. Numa modalidade, uma reação de hidrolise | independente ocorre dentro da célula alvo, clivando a ligação da fração | glicina-Fármaco liberando o Fármaco. oe Numa outra modalidade, -Y- é uma unidade para- aminobenzilcarbamoila (PAB) cuja porção fenileno é substituída com Qm , caso em que Q é C;.6 alquila, -O-(C1-Cag-alquila), -halogênio, nitro ou ciano e m é um nº inteiro que varia de 0 a 4. Modalidades exemplificativas de uma unidade espaçadora auto- imoladora (-Y-) são Gly-Gly-; Gly-, -Ala-Phe-, Val-Cit-. Numa modalidade, uma fração-ligante de Fármaco ou um ADC é proporcionado no caso em que a unidade espaçadora está ausente (y = O) ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável deste.
Alternativamente, um ADC contendo uma unidade espaçadora o auto-imoladora pode liberar -D.
Numa modalidade, -Y- é um grupo PAB que estáligado a -W,- via o átomo de nitrogênio do amino do grupo PAB, e ligado diretamente a -D via um grupo carbonato, carbamato ou éter, onde o ADC possui a estrutura exemplificativa: Qu efrinO, 9 Pp em que Q é C1.g alguila ou -O-(C1.6 alquila), halogênio, nitro ou ciano, m é um nº inteiro variando de O a 4 e pvaria de 1 a 4. Ouros exemplos de espaçadores auto-imoladores incluem, sem | |
O O Doi EE oo o ti o »ES Ass CC pr NO | | 314 limitação a compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PAB tais como derivados 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), análogos de PAB heterocíclicos (US 2005/0256030), beta-glucuronídeos (WO 2007/011968), e orto ou para- — aminobenzilacetaisó. Espaçadores que sofrem ciclização podem ser usados, por meio de hidrólise da ligação amida, tal como, amidas de ácido 4- aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et a/ (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente oe substituídos (Storm et a/ (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). À eliminação de fármacos contendo amina os quais são substituídos em glicina (Kingsbury et a/ (1984) J. Med. Chem. 27:1447) são também exemplos de espaçadores auto-imoladores úteis em ADCs. Unidades Espaçadoras exemplificativos (-Y,-) são representadas pelasFórmulas X-— XI:
O LS ! o é —HN—CH,—CO— À ” | NHCH3C(O0)-NHCH2C(0)- : x LiIGANTES DENDRÍTICOS Numa outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente a mais de uma fração de fármaco através de uma fração de ramificação do ligante multifuncional para um anticorpo (Sun et —al(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003 (Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar do fármaco para anticorpo, ou seja, por meio | de introdução, que está relacionado com a potencia ADC. Assim, onde um | anticorpo cisteina sumetido à engenharia portar apenas um grupo tiol cisteína | reativo, frações múltiplas do fármaco pode ser ligadas através de um ligante dendrítico. Modalidades exemplificativas de ligantes dendríticos ramificados, incluem, unidades dendriméricas 2,6-bis(hidroximetil)-para-cresol e 2,4,6- tris(hidroximetil)-fenol WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499). oe Numa modalidade. a unidade Espaçadora é um bis(hidroximetil)estireno ramificado (B HMS), que pode ser empregada para incorporar e liberar múltiplos fármacos com a estrutura: Oo OQ CHLOC),—D Ab 4 -w aAelDA, 1 ) a —, CHAÃOC),—D Pp compreendendo “uma unidade de dendrimero 2-(4- aminobenzilideno)propano-1,3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al (2003) Angews, Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), em que Q é um C.6 alquila, -O-(C1-8) e, alquila), -halogênio, nitro ou ciano; m é um nº inteiro variando de 0 a 4 né O ou 1epvariade 1 ad.
Modalidades — exemplificativas de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula | incluem XIIA (MC), XIllb (val-cit), Xlllc (MC- val-cit) e XIlld (MC-al-cit-PAB);
H O o” si a xo) o o H O S Pp (GA D j X o p É NH, XIMa XIIb
SS o Oo H Oo Ss No NA Y,D O H o, Ss
À O NH XIIc o o STD
XII ADS No x O O H r o bi Ê Nº xd Outras modalidades exemplificativas de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula la incluem XIVa — e o | o ' NX-C-D Ab—-S o Pp XIVa 1 Ab— SA CHC—Y—C— D Pp XIVb o 9 Ab— S+-CHC—D Pp XIV Oo
Q NcH< Xen Ab—S
O Pp XIVd Oo Rn 1 Ab—S—TCH,C—N CAD Pp XIVe em que X é:
CSS me 2 OH , (CHCHZON A o — en NE | ASI | |
R Í (CH2) q | ASI ” ; ou ago R ; VYVé A a e NAS ou N(CH2)" e R é independentemente H ou C;.; alguila e né 1 a 12. Numa outra modalidade, um ligante possui um grupo funcional reativo dotado de um grupo nucleofílico reativo para um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo, incluem, sem limitação, grupos carbonila aldeído e cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente para uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um Ligante, incluem, sem limitação hidrazida, oxima, amino, hidrazima, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e aril- o hidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo propicia um sítio conveniente para ligação a um Ligante. Tipicamente, Ligantes do tipo peptídeo podem ser preparados formando-se uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Essas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese na fase líquida (E. Schrôder and K. Lubke (1965) “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press) bem conhecido no campo da química de peptídeos. Intermediários de ligantes podem ser conjugados com qualquer combinação ou sequência de reações incluindo unidades Espaçadoras, Tensoras e Aminoácido. As unidades
SS
Espaçadores, Tensoras, e Aminoácido podem empregar grupos funcionais reativos que são eletrofílicos, nucleofílicos ou radical livre por natureza. Grupos funcionais reativos incluem, sem limitação a carboxilas, hidroxilas, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato e grupos de partida, tais como O-mesila, —O-tosila,-Cl,-Br,-l- ou maleimida.
Por exemplo, um substituinte carregado como sulfonato (-SO3), ou amônio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a fração de fármaco, oe ou ainda, facilitar a reação de acoplamento de Ab-L (intermediário anticorpo- ligante) com D, ou D-L (intermediário fármaco-ligante) com AB, dependendo da vi sintética empregada na preparação de ADC.
REAGENTES LIGANTES Conjugados de anticorpo e auristatina podem ser produzidos por emprego de uma série de reagentes ligantes bifuncionais tais como —N- — succinimidil-3-(2-piridil-ditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato (HC!) ésteres ativos = (tais como di-succinimidil suberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), o compostos bis-ácido (tais como bis (para-azidobenzoil)nexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-benzoil diazônio)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos flúor bis-ativos (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno).
Os conjugados anticorpo-fármaco podem ainda ser preparados com reagentes ligantes: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, | 25 MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), incluindo os reagentes bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietileneglico! O iiããôêiç e 2 APAAbÉRAÀX)ó). ÂÓ Q?PÂÉ“PQ]qQUO””,
(BM(PEO)2), e 1,11-bis-maleimidotrietilenoglicol! (BM(PEO)3), os quais são comercialmente disponíveis de Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, e outros fornecedores de reagentes. Reagentes bis-maleimida permitem a ligação do grupo tiol de um anticorpo cisteina sumetido à engenharia a uma fração de fármaco contendo tiol, rótulo ou intermediário ligante num modo sequencial ou concorrente. Outros grupos funcionais, além de maleimida, reativos com um grupo tiol de um anticorpo cisteína sumetido à engenharia, fração de fármaco, rótulo ou intermediário ligante incluem o iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, dissulfeto, piridil dissulfeto, isocianato e isotiocianato. O, O XY o O
A OLNRA O N AVONRDD ON N O N o N NX O Ny / O o O BM(PEO), BM(PEO); Reagentes ligantes úteis também podem ser obtidos por outras fontes comerciais, como em Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et a/ (1996) e Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; and WO 04/032828.
Tensores de Fórmula (llla) podem ser introduzidos em um Ligante reagindo-se os seguintes reagentes ligantes com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido: em que n é um nº inteiro variando de 1 a 10 e T é H ou -SOzNa; Oo O
T | N(CH2))-C(0)-O-N Oo OÕ em que n é um nº inteiro que varia de 0 a 3
| NS 320
O o o EE O Por ; NX o S
O O Q OTA ;
H RW Oo O Oo O O. / Oo NA IA ie O o o o
O o A ou XY :
O Unidades tensoras podem ser introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes bifuncionais com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido. o Q fo) o 9 o Q Oo AEDI MED Toa on)
O
O O O R R 3 À 3
NH e na ToN) Os on)
O O em que Xé Broul.
Unidades tensoras da fórmula também podem ser introduzidas em um Ligante reagindo-se os seguintes reagentes bifuncionais com o N- terminal de uma unidade de aminoácido:
OD “N ss Non)
O Qu A É N ss Au o :
O O
[o] O O set Dos) BocNHNH TN o) ó 9 Um Reagente ligante dipeptídico valina-citrulina (val-cit ou vc) com uma unidade Tensora maleimida e uma unidade Espaçadora para- aminobenzilcarbamoíla (PAB) auto-imoladora tem a estrutura: es o OS 4 “O AO O: e FmocN s A
RM uno Um reagente ligante dipeptídico phe-lys (Mtr, mono-4-metoxitritila) com uma unidade Tensora maleimida e uma unidade Espaçadora auto- imoladora PAB pode ser preparado de acordo com Dubowchik et a/., (1997) Tetrahedron Letters, 38-5257-60 , tendo a estrutura: o” Ph o a e mos od x HN— Mtr PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-CD798B CISTEÍNA
Ú SUMETIDO À ENGENHARIAS O ADC da Fórmula | pode ser preparado por várias vias empregando-se reações de química orgânica, condições e reagentes do conhecimento dos versados na técnica, incluindo : (1) reação de um grupo cisteina de um anticorpo cisteína sumetido à engenharia com um reagente ligante para formar o intermediário anticorpo-ligante Ab-l, via uma ligação —covalente, seguido por reação com uma fração D de fármaco ativada e (2)
reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fármaco com um reagente ligante, Opara formar o intermediário fármaco-ligante D-L, via uma ligação covalente, seguido por reação com um grupo cisteina de um anticorpo cisteína sumetido à engenharia. Métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma série de anticorpos cisteína sumetido à engenharias, frações de fármaco, e ligantes para preparar os conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula |.
Grupos tiol de anticorpo cisteína são nucleofílicos e capazes de oe reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em reagentes ligantes e intermediários fármaco-ligante incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos e halogenetos de ácido; (ii) halogenetos de alquila e benzila, tais como haloacetamidas, (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida e (iv) dissulfetos, incluindo piridil dissulfetos, via troca de sulfeto. Grupos nucleofílicos em uma fração de fármaco incluem, sem limitação a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e grupos aril-hidrazida capazes de reagir formando ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes. o Anticorpos cisteína sumetido à engenharias podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou cloridrato de (tris(2-carboxietiYfosfina TCEP; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol. 273; 73- 80; Soltec Ventures, Beverly, MA) seguido por nova oxidação para reformar pontes dissulfeto inter-cadeia e intra-cadeia (Exemplo 5). Por exemplo, — anticorpos monoclonais cisteina sumetido à engenharias de comprimento total (ThioMabs) expressados em células CHO são reduzidos com cerca de um excesso 50 vezes molar de TCEP por 3 horas a 37ºC para reduzir pontes dissulfeto em adutos cisteina que podem formar-se entre os resíduos de cisteína recentemente introduzidos e a cisteína presente no meio de cultura. O ThioMab reduzido é diluído e introduzido em uma coluna HiTrap em acetato de sódio 10 mM pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 03, M. Pontes dissulfeto foram re-estabelecidas entre resíduos cisteina presentes no Mab original com sulfato de cobre aquoso (200 nM) diluído (CUSO,4) a temperatura ambiente, durante a noite. Alternativamente, ácido deidroascórbico (DHAA) é um oxidante eficaz para re-estabelecer os grupos dissulfeto intra-cadeia do anticorpo cisteína sumetido à engenharia após clivagem redutiva dos adutos de e cisteína. Outros oxidantes, ou seja, agentes de oxidação e condições | 10 oxidantes que são do conhecimento da técnica podem ser empregados, A oxidação ao ar ambiente também é eficaz. Esta etapa de reoxidação branda, parcial forma dissulfetos de intra-cadeia eficientemente com grande fidelidade preservando os grupos tiol dos resíduos de cisteína recentemente introduzidos. Um excesso aproximado de 10 X do intermediário fármaco-ligante por exemplo, MC-vc-PAB-MMAE, foi adicionado, misturado e deixado em repouso por cerca de uma hora a temperatura ambiente para realizar a conjugação e formar o conjugado anticorpo-fármaco anti-CD79b. A mistura de conjugação foi filtrada À em gel e introduzida e purificada por uma coluna HiTrap S removendo-se o o excesso do intermediário fármaco-ligante e outras impurezas.
A figura 23 mostra o processo genérico para preparar um anticorpo cisteína sumetido à engenharia expressado de cultura celular par conjugação. Quando o meio de cultura de célula contém cisteína, os adutos dissulfeto podem formar-se entre o aminoácido cisteina recentemente introduzido e a cisteína do meio de cultura. Esses adutos cisteína, ilustrados como u círculo no ThioMab exemplar (esquerda) da Figura 23, devem ser reduzidos para gerar anticorpos cisteina sumetido à engenharias reativados para conjugação. Adutos de cisteina presumivelmente, junto com várias pontes dissulfeto de cadeia intermediária são clivados redutivamente para conferir uma forma reduzida do anticorpo com agentes redutores tais como TCEP. AS pontes dissulfeto de cadeia intermediária entre resíduos cisteina emparelhados são reformadas sob oxidação parcial com sulfato de cobre, DHAA, ou exposição ao oxigênio ambiente. Os resíduos de cisteína sumetido à engenharias recentemente introduzidos e não pareados permanecem disponíveis para reação com reagentes ligantes ou intermediários fármaco- ligantes formando os conjugados de anticorpo da invenção. O ThoMabs expressado em linhagem de célula de mamífero resulta em duto Cys e externamente conjugado a um Cys sumetido à engenharia através da formação de ponte —S-S-. Portanto, os ThoMabs purificados são tratados com procedimentos de redução e reoxidação conforme descrito no Exemplo 5 para produzir Thio Mabs reativos. Esses ThioMabs são empregados para conjugação com fármacos citotóxicos contendo maleimida, fluoróforos e outros rótulos.
IMUNOLIPOSSOMAS Os anticorpos anti-CD79b aqui apresentados também podem ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de múltiplos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos úteis na o distribuição de um fármaco para um mamífero. Os componentes do lipossoma são normalmente dispostos em uma formação em bicamada similar à disposição de lipídios das membranas biológicas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparados pro métodos do conhecimento da técnica, como os descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl/ Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes. Nos. U.S.
4.485.045 e 4,544.545; e WO97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Os lipossomas com tempo de circulação intensificado estão descritos na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido produzindo lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos —Fab'do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados em lipossomas conforme descrito em Martin et a/., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via reação de troca de dissulfeto intermediária. Um agente quimioterapeutico está contido, opcionalmente dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National oe Cancer Inst. 81(19):1484 (1989). B. ALGuns MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
1. SELEÇÃO PARA ANTICORPOS ANTI-CD79B8 COM AS DESEJADAS PROPRIEDADES Técnicas para gerar anticorpos que se ligam a polipeptídeos CD79b foram descritas acima. Pode-se selecionar ainda anticorpos com algumas características biológicas, conforme desejado.
Os efeitos inibidores do crescimento de um anticorpo anti-CD79b da invenção podem ser avaliados por métodos do conhecimento da técnica, por exemplo, usando-se células que expressam um polipeptídeo CD79b seja, endógeno ou seguindo a transfecção com o gene CD79b. Por exemplo, linhas e de célula de tumor apropriadas e células transfectadas com cD79b podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-CD79b da invenção em concentrações variadas por uns poucos dias (por exemplo, 2 a 7) dias e manchadas com cristal violeta ou MTT ou, ainda, analisadas por outro ensaio colorimétrico. Um outro método de se medir a proliferação seria por comparação da absorção de H*-timidina por células tratadas na presença ou ausência de um anticorpo anti-CD79b da invenção. Após o tratamento, as células são colhidas e a quantidade de radioatividade incorporada ao DNA quantificada em um contador de cintilação. Controles positivos adequados incluem o tratamento de uma linha de célula selecionada com um anticorpo
Í | inibidor do crescimento conhecido por inibir o crescimento daquela linha de | célula. A inibição do crescimento de células tumorais in Vivo pode ser | determinada de múltiplos modos conhecidos da técnica. A célula de tumor | pode ser uma que superexpressa um polipeptídeo CD79b. O anticorpo anti- | —CD79b irá inibir a proliferação celular de uma célula de tumor expressando | CD79b in vitro ou in vivo em cerca de 25 a 100% em comparação com a célula de tumor não tratada, mais preferivelmente em cerca de 30 a 100%, e mesmo mais preferivelmente em cerca de 50 a 100% ou 70 a 100% numa modalidade, e a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 03 ug/ml. A inibição do i 10 crescimento pode ser medida a uma concentração do anticorpo de cerca de 0,5 a 30 ug/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição do crescimento é determina de 1 a 10 dias após exposição das células | tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso a administração do anticorpo anti-CD79b a cerca de 1 ug/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo resulte na redução do tamanho do tumor ou redução da proliferação de célula de tumor dentro de cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias. e Para selecionar um anticorpo anti-CD79b que induz morte celular, a perda da integridade de membrana conforme indicado, por exemplo, por iodeto de propídio (PI), azul tripano ou absorção de 7AAD pode ser avaliada em relação ao controle. Um ensaio de absorção de PI pode ser realizado na ausência de complemento de células efetoras imune. Células tumorais expressando polipeptídeo Cd79b são incubada com meio apenas ou meio contendo o apropriado anticorpo anti-CD79b (por exemplo, cerca de 10 ug/ml). As células são incubadas por um período de temp de 3 dias. Seguinte a cada tratamento as células sal lavada fazendo-se alíquotas em tubos de 12 x 75 firmemente tampados de 35 mm (1ml por tubo, 3 tubos pó grupo de tratamento)
CS E A A O O
J | 327 | | para remoção dos grumos de célula. Os tubos então recebem PI (10 ug/ml). As amostras podem ser analisadas usando-se citometria de fluxo FACSCANO | e software FACSCONVERTO CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos anti-CD79b que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular como determinado pro absorção de PI podem ser selecionados como anticorpos anti-CD79b indutores de morte celular. Para selecionar com critério os anticorpos que se ligam a um epítopo e um polipeptídeos Cd79b ligado por um anticorpo de interesse, pode- e se realizar um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro tal como o descrito em —Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensaio pode ser usado para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo sítio ou epítopo como um anticorpo anti- CD79b conhecido. Alternativamente, ou além disso, o mapeamento do epítopo pode ser realizado pelo método conhecido na técnica. Por exemplo, a sequência de anticorpo pode ser mutagenizada como por varredura de alanina para identificar resíduos de contato. O anticorpo mutante é inicialmente testado para ligação com o anticorpo policlonal para garantir dobra apropriada. Num método diferente, peptídeos correspondendo a diferentes regiõêês de um e polipeptíideos CD79b podem ser usados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epítopo caracterizado ou conhecido. | l 2. ALGUNS MéTtODOS DE SELEÇÃO DE BIBLIOTECA Os anticorpos anti-CD79b da invenção podem ser produzidos por uso de bibliotecas combinatórias para selecionar os anticorpos com a desejada atividade ou atividades. Por exemplo, uma série de métodos são conhecidos na técnica para geração de bibliotecas de visualização de fato e seleção dessas bibliotecas para os anticorpos “dotados das desejadas características de ligação. Tais métodos são descritos, geralmente em
Hoogenboom et al., (2001) Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), e, em determinadas modalidades, em Lee et al. (2004) J.
Mol.
Biol. 340:1073-1093. A princípio, os clones de anticorpo sintéticos são selecionados por seleção de bibliotecas de fago contendo o fago que apresenta múltiplos fragmentos da região variável do anticorpo (FV) fundida à proteína capeada com fago.
Tais bibliotecas de fago resultam por cromatografia de afinidade contra o desejado antígeno.
Os clones expressando fragmentos Fv capazes e de ligar-se ao desejado antígeno são adsorvidos ao antígeno, sendo assim Ú 10 separados dos clones de não ligação na biblioteca.
Os clones de ligação são então purificados do antígeno e podem ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/purificação do antígeno.
Quaisquer anticorpos anti-Cd79b da invenção podem ser obtidos por planejamento de um procedimento de seleção do antígeno adequado a fim de escolher o clone do fago de interesse seguido por construção de um anticorpo anti-CD79b de comprimento total usando as sequências FV do clone de fago de interesse e sequências da região constante adequadas (Fc) descritas em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication o 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é formado de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, cada um das cadeias leve (VL) e pesada (VH), que apresentam, ambas, três circuitos hipervariáveis (HVRs) ou regiões de determinação de complementaridade — (CDRs). Domínios variáveis podem ser visualizados — funcionalmente no fago, seja como fragmentos de cadeia simples (scFV), em que VH e VL são ligadas covalentemente por meio de um peptídeo curto, | flexível ou como fragmentos de Fab, em que são cada qual ligados a um domínio constante e interagem não covalentemente, conforme descrito em
| |
Winter et al, Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). — Conforme aqui empregado,, clones de fago codificando scFv e clones de fago codificando Fab são coletivamente referidos como "clones de fago Fv" ou "clones Fv". Repertórios de genes VH e VL podem ser clonados em separado porreação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago que podem então ser pesquisados para clones de ligação ao antígeno como descrito em Winter et a/., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (19994). Bibliotecas de fontes imunizadas propiciam anticorpos de alta ) afinidade ao imunógeno sem requerer hibridomas de construção. —Alternativamente, o repertório natural pode ser clonado para dar uma única fonte de anticorpos humanos a uma ampla faixa de auto-antígeno e também de antígenos não autógenos sem qualquer imunização conforme descrito por Griffith set al., EMBO J, 12:7725-734 (1993). Finalmente bibliotecas naturais também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem de segmentos de geneV não rearranjados de células tronco e pelo uso de iniciadores da PCR contendo uma sequência aleatória para codificar as regiõêês CDR3 altamente variáveis e realizar o rearrranjo in vitro , conforme descrito por Hoogenboom e . Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992).
e Em algumas modalidades, o fago filamentoso é empregado para visualizar fragmentos de anticorpo por fusão à proteína pll de revestimento secundário. Os fragmentos de anticorpo podem ser visualizados como fragmentos Fv de cadeia simples, em que os domínios VH e VL são ligados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador polipeptídico flexível, por exemplo, como descrito por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) ou —como fragmentos Fab em que uma cadeia é fundida a plll e a outra é secretada no periplasma de célula hospedeira bacteriana, onde o conjunto de uma estrutura protéica revestida de Fab que torna-se visualizada na superfície do fago por deslocamento de algumas proteínas de revestimento do tipo selvagem por exemplo, como descrito em Hoogenboom et a/., Nucl.
Acids.
Res. 19: 4133- 4137 (1991). Em geral, ácido nucleico codificando fragmentos de gene de anticorpo são obtidos de células imune coletadas de humanos ou de animais.
Caso se deseje uma biblioteca inclinada a favorecer clones anti-CD79b, o indivíduo é imunizado com CD79b para gerar uma resposta de anticorpo e células do baço e/ou células B circulantes diferentes de linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperados para construção de biblioteca.
Numa | o modalidade preferida, é obtida uma biblioteca de fragmento genético de anticorpo humano inclinada a favorecer os clones anti-CD79b gerando-se uma resposta de anticorpo anti-CD79b em camundongos transgênicos portando uma arranjo genético de imunoglobulina humana funcional (e carecendo de um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional) , de modo que a imunização com CD79b dá origem a anticorpos humanos produtores de células BB contra CD79b.
A geração de camundongos transgênicos produtores de anticorpo humano está descrita a seguir.
O enriquecimento adicional para populações de célula reativas a anti-CD79b pode ser obtido usando-se um procedimento de seleção criteriosa o adequado para isolar células B expressando anticorpo ligado à membrana específica para CD79b, por exemplo, por separação da célula usando-se cromatografia de afinidade a CD79b ou adsorção de células para CD79b rotulado com fluorocromo seguido por classificação de célula ativada por fluxo (FACS). Alternativamente, o uso de células de baço e/ou células B ou outros PBLs de um doador não imunizado propicia uma melhor representação do possível repertório de anticorpo como também permite a construção de uma biblioteca de anticorpo usando qualquer espécie animal (humano ou não) em que CD79b não é antigênico.
Para bibliotecas que incorporam construção de gene de anticorpo in vitro, são coletadas células tronco do indivíduo para obter- se ácidos nucleicos codificando segmentos genéticos do anticorpo não rearranjado.
As células imune de interesse pode ser obtidas de uma série de | espécies animais, tais como humano, camundongo, rato, lagomorfa, lupino, | canino, felino, porcino, bovino, equino e espécies avícolas, etc.
Segmentos genéticos variáveis o anticorpo codificando ácido nucleico (incluindo segmentos VH e VL) ao recuperados das células de interesse e amplificados.
No caso de bibliotecas de gene Vh e VI rearranjados o o desejado DNA pode ser obtido por isolamento de DNA ou mRNA genômico de linfócitos seguido por reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores combinando-se com as extremidades 5'e 3'dos genes Vh e VL rearranjados conforme descrito em Orlandi et a/., Proc.
Natl. acad.
Sci (USA), 86: 3833-3837 (1989), fazendo desse modo, diversos repertórios de gene V para expressão.
Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico, com iniciadores traseiros na extremidade 5'0 éxon codificando o domínio V maduro e iniciadores dianteiros baseados em um segmento uJ, conforme descrito em Orlandi et a/., (1989) e em Ward et al., Nature, 341:544- o 546 (1989). Entretanto, para amplificação de cDNA, os iniciadores traseiros o também podem ser baseados no éxon líder conforme descrito em Jones et al., —Biotechnol, 9: 88-89 (1991) e iniciadores dianteiros inseridos na região constante conforme descrito em Sastry et al., Proc.
Natl. acad.
Sci (USA), 86: 5728-5732 (1989) A fim de maximizar a complementaridade, pode-se incorporar degeneração nos iniciadores conforme descrito em Orlandi et al., (1989) ou Sastry et al., (1978). Em algumas modalidades, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo emprego de iniciadores da PCR visados para cada família do gene V de modo a amplificar todos os arranjos VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico de célula imune, por exemplo, como descrito no método de Marrks et a/., J.
Mol.
Biol, 222: 581-597
(1991) ou como descrito no método de Orum, et a/., Nucleic Acids Res, 1:4491- 4498 (1993). Para clonagem do Dna amplificado em vetores de expressão pode-ser introduzir sítios de restrição raros dentro do iniciador da PCR como | um identificador em uma extremidade como descrito em Orlandi et a/., (1989) | ou por amplificação da PCR adicional com um iniciador marcado, conforme descrito em Clackson et a/, Nature, 32:624-628 (1991).
Os repertórios de genes V sinteticamente rearranjados podem ser derivados in vitro de segmentos de gene V. A maior parte dos segmentos de ' o gene VH humanos foram clonados e sequenciados (descrito em Tomlinson et al,J. Mol> Bio. 227: 776-798 (1991) e mapeados (descrito em Matsuda et a/., Nature Genet, 3: 88-94 (1993); esses segmentos clonados (incluindo todas as conformações principais do laço H1 e H2) podem ser usados para gerar diversos repertórios genéticos VH com iniciadores da PCR codificando laços H3 de sequência e comprimentos diversos como descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Repertórios Vh também podem ser feitos com toda a diversidade da sequência focada em um laço H3 longo de um único comprimento conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci 2 USA, 89: 4457-4461 (1992) Segmentos humanos VK e VA foram clonados e é sequenciados (descrito e Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993) e podem ser empregados para produzir repertórios de cadeia leve sintética. Repertórios de gene V sintéticos com base em uma faixa de dobras Vh e VL , com comprimentos L3 e H3 irão codificar anticorpos de considerável diversidade estrutural. Seguinte à amplificação do gene V codificando DNAs, segmentos de gene V de linha germinativa podem ser rearranjado in vitro de — acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos por combinação de repertórios de gene VH e VL juntos de múltiplos modos.
Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetores recombinados in vitro por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et al., Gene 128: 119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatorial por exemplo, o sistema loxP descrito em Waterhouse et al., Nucl. acids. Res. 21: 2265-2266 (1993). A abordagem da recombinação in vivo explora a natureza de cadeia dupla dos fragmentos Fab para superar o limite no tamanho da biblioteca imposto por eficiência de transformação de E. coli —" Repertórios VH e VL naturais são clonados em separado, um em um fagemídeo e o outro em um oe vetor de fago. As duas bibliotecas são então combinadas por infecção do fago de bactérias contendo o fagemídeo de modo que cada célula contenha uma diferente combinação e o tamanho da biblioteca seja apenas limitado pelo número de células presentes (cerca de 10"? clones). Ambos os vetores contém sinais de recombinação in vivo de modo que os genes VH e VL são recombinados em um único replicon e são enrolados juntos em virions de fago. Essas vastas bibliotecas propiciam grandes números de diversos anticorpos de boa afinidade (KJ de cerca de 10ºM) Alternativamente, os repertórios podem ser clonados , sequencialmente ao mesmo vetor, por exemplo, como descrito em Barbas et o al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou reunidos juntos pro PCR sendo a seguir clonados, por exemplo, como descrito em Clakson et al. Nature, 352:624-618 (1991). O conjunto de PCR também pode ser usado para unir DNAs de VH e VL com DNA codificando um espaçador peptídico flexível formando repertórios de uma única cadeia Fv (scFv). Em uma outra técnica ainda, "conjunto da PCR na célula" é empregado para combinar os genes VH eVL dentro de linfócitos por PCR e a seguir os repertórios de clone dos genes ligados, como descrito em Embleton et a/., Nucl. Acids Res. 20:3831-3837 (1992).
Os anticorpos produzidos por bibliotecas simples (ou natural ou sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kg de cerca de 10º a 10º M?), porém a maturação da afinidade também pode ser imitada in vitro por construção e nova seleção de bibliotecas secundárias conforme descrito em Winter et al., (1994) supra.
Por exemplo, a mutação pode ser introduzida — aleatoriamente in vitro mediante uso de polimerase sujeita a erro (descrito em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) no método de Hawkins et a/., J.
Mol.
Biol. 226:889-896 (1992) ou no método de Gram e al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci | USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação por afinidade pode | e ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, | usando-se PCR com iniciadores portando sequência aleatória medindo a CDR de interesse, em clones Fv individuais selecionados e exame criterioso para clones de maior afinidade.
O WO 9607754 (publicado em 14 de marco de 1996) descreveu um método para induzir metagênese em uma região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeia leve.
Uma outra tentativa eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados por apresentação de fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrência natural obtidos de doadores não imunizados e análise criteriosa para maior afinidade em múltiplos o turnos de rearranjo de cadeia, conforme descrito em Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades de cerca de 10º M ou menos ainda.
O exame criterioso de bibliotecas pode ser realizado por várias técnicas conhecidas na técnica.
Por exemplo, CD79b pode ser usado para revestir os poços de placas de adsorção, expressados em células hospedeiras fixadas às placas de adsorção ou usados para classificar e célula, ou conjugados à biotina para captura com microesferas revestidas de estreptavidina ou usados em qualquer outro método para dimensão de bibliotecas de apresentação de fago.
As amostras da biblioteca de fago são contatadas com CD79b imobilizado sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma parte das partícula de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo o pH, resistência iônica, temperatura e similares, são selecionados para imitar — ascondições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e a seguir purificados por ácido por exemplo, conforme descrito em Barbas et al., Proc.
natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991) ou por álcali, por exemplo, conforme descrito em Marks et a/, J. Mol. Biol. 222: 582-597 (1991) ou por competição ao oe antígeno de CD79b, por exemplo, num procedimento semelhante ao método de competição do antígeno de Clakson et a/., Nature, 352: 624-628 (1991). os fagos podem ser enriquecidos 20- 1000 vezes em um único turno de seleção. | Além disso, os fagos enriquecidos podem desenvolver-se em cultura bacteriana e ser submetidos a outros turnos de seleção. | A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos de anticorpo em um único fago podem combinar-se simultaneamente com o antígeno. Os anticorpos com cinética de dissociação rápida (e afinidades fracas de ligação) podem ser retidos mediante emprego de curtas lavagens, o apresentação multivalente de fago e alta densidade de revestimento do antígeno na fase sólida. A alta densidade não apenas estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas também favorece a religação do fago que se dissociou. A seleção de anticorpos com lenta cinética de dissociação (e boas afinidades de ligação) pode ser promovida mediante emprego de longas lavagens e apresentação monovalente de fago conforme descrito em Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990) e em WO 92/09690 e uma lenta densidade de revestimento do antígeno conforme descrito em Marks et a/., Biotechnol, 10:779-783 (1992). É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que se diferenciam ligeiramente, para CD79b.
Contudo, a mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo, conforme realizado em algumas técnicas de maturação por afinidade) tem probabilidade de originar muitos mutantes, a maioria deles de ligação ao antígeno, e uns poucos, com maior afinidade.
Com CD79b limitante, raros fagos de alta afinidade poderiam ter competido.
A fim de reter todos os mutantes de maior afinidade, os fagos podem ser incubados com excesso de CD79b biotinilado, porém com CD79b bionitilado a uma concentração de oe molaridade mais baixa do que a afinidade molar alvo constante para CD79b.
Os fagos de ligação de alta afinidade podem então ser capturados por microesferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina.
Uma "captura equilibrada" como essa permite aos anticorpos serem selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permita o isolamento dos clones mutantes com afinidade, no mínimo duas vezes mais alta do que um grande excesso de fagos com menor afinidade.
As condições empregadas na lavagem de fagos ligados a uma fase sólida também podem ser manipuladas para discriminação com base na cinética de dissociação.
Clones anti-CD79b podem ser selecionados com base na o atividade.
Em algumas modalidades, a invenção propicia anticorpos anti- CD79b que se ligam a células vivas que expressam CD79b naturalmente.
Numa modalidade, a invenção propicia anticorpos anti-CD79b que bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e CD79b, porém não bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e uma segunda proteína.
Clones Fv correspondentes a esses anticorpos anti-CD79b podem ser selecionados por (1) isolamento de clones anti-Cd79b de uma biblioteca de fago, conforme descrito acima, e, opcionalmente amplificação da população isolada de clones de fago pelo desenvolvimento da população em um hospedeiro bacteriano adequado; (2) selecionar CD79b e uma segunda proteína contra os quais se deseja atividade de bloqueio e de não bloqueio, respectivamente; (3) adsorver os clones de fago anti-CD79b para CD79b imobilizado; (4) usar um excesso da segunda proteína para purificar quaisquer clones indesejados que reconhecem determinantes de ligação a CD79b, que sobrepõe-se ou são divididos com determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) purificar os clones que | permanecem adsorvidos seguinte a etapa 94). Opcionalmente, os clones com | as desejadas propriedades de bloqueio e não bloqueio podem ser ainda | enriquecidos por repetição dos procedimentos de seleção aqui descritos, uma | oe ou mais vezes. | DNA codificando anticorpos monoclonais derivados de hibridoma | ou clones Fv apresentando fago da invenção é prontamente isolado e | sequenciado usando procedimentos convencionais, (por exemplo, pelo uso de iniciadores de oligonucleotídeo planejados a amplificar de modo específico as | regiões de codificação de cadeia pesada e leve de interesse de matriz de DNA | 15 do hibridoma ou fago ). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como | células de E. coli, células COS de símio, ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem, de outro modo, proteina o imunoglobulina, para obter a síntese dos desejados anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
Artigos publicados sobre expressão recombinante em bactérias de DNA codificando anticorpo incluem Skerra et al., Curr.
Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol.
Revs, 130: 151 (1992). DNA codificando os clones Fv da invenção podem ser combinados com sequências de DNA conhecidas codificando regiões constantes de cadeia pesada e/ou cadeia leve (por exemplo, as sequências de DNA apropriadas podem ser obtidas de Kabat et a/., supra) para formar clones codificando cadeias pesadas e/ou leves de comprimento total ou parcial.
Será considerado que as regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para este fim, incluindo regiões constantes IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE e que essas regiões constantes podem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal.
Um clone Fv derivado de DNA de domínio variável de um animal (como um humano) ea seguir ligado ao DNA de região constante de uma outra espécie animal para formar sequências de codificação para cadeia pesada e/ou leve de comprimento total "híbrida" está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" conforme aqui empregado.
Em algumas modalidades, oe um clone Fv derivado de DNA humano variável é ligado ao DNA de região constante humano formando sequências de codificação para cadeias pesada e/ou leve humanas de comprimento total ou parcial.
DNA codificando o anticorpo anti-CD79b derivado de um hibridoma também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humana, no lugar de sequências de murino homólogas derivadas de clone do hibridoma (por exemplo, como no método de Morrison et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci USA, 81: 6851-6855 (1984). DNA codificando anticorpo ou fragmento derivado de hibridoma ou clone Fv pode ser adicionalmente modificado por o ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeos não-imunoglobulina.
Deste modo, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" tendo a especificidade de ligação dos anticorpos derivados de clone Fv ou clone de hibridoma da invenção.
C.
TERAPIA DE PROFÁRMACO MEDIADA POR ENZIMA DEPENDENTE DE ANTICORPO (ADEPT) Os anticorpos da presente invenção também podem ser empregados em ADEPT por conjugação do anticorpo a uma enzima ativadora de profármaco que converte um profármaco (por exemplo, um agente peptidil quimioterapeutico, ver WO 81/01145) a um fármaco anti-câncer ativo. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente nº U.S. 4.975.278.
O componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um profármaco de modo tal que o convertaem sua forma citotóxica mais ativa.
As enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, sem limitação a fosfatase alcalina útil para converter profármaco contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase úteis na conversão de profármaco e contendo sulfato em fármacos livres; desaminase citosina úteis para converter S-fluorocitosina não tóxica no fármaco anti-câncer, 5-fluoruracil; proteases tais como protease serratia, termoisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), de utilidade na conversão de profármacos contendo peptídeo nos fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis na conversão de profármaco que contenham substituintes D-aminoácido; enzimas de clivagem de carboidrato, tais como B-galactosidase e neuraminidase úteis na conversão de fármacos glicosilados nos fármacos livres; B-lactamase úteis na conversão de fármacos derivatizados com B-lactamas nos fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis na o conversão de fármacos derivatizados em seus nitrogênios amina com fenoxiacetil ou grupo fenilacetila, respectivamente, nos fármacos livres.
Alternativamente, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas" podem ser empregados na conversão dos profármaco da invenção nos fármacos ativos livres (ver, por exemplo, Massy Nature, 328: 457-458 (987). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados conforme aqui descrito para distribuição da abzima a uma população de célula de tumor.
As enzimas desta invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-CD79b por técnicas conhecidas na arte técnica como o uso dos reagentes de reticulação hetero-bifuncionais descritos supra. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção ligados a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídos usando técnicas de DNA recombinante do conhecimento na técnica (ver por exemplo, Neuberger et a/., Nature 312:604-608 (1984). D. ANTICORPO ANTI-CD79B8 Além dos anticorpos anti-CD79b aqui descritos, considera-se a oe preparação de variantes do anticorpo anti-CD79b Vartiantes de anticorpo anti- CD79b podem ser preparadas por introdução de alterações nucleotídicas apropriadas ao DNA de codificação, e/ou por síntese do desejado anticorpo ou | polipeptídeo. — Os versados na técnica apreciarão, que alterações de | aminoácido podem alterar os processos pós-traducionais do anticorpo anti- CD79b tais como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação ou alteração das características de ancoragem da membrana.
Variações nos anticorpos anti-CD79b aqui descritas podem ser feitas, por exemplo, usando quaisquer técnicas e linhas de referencia para mutações conservadoras e não conservadores descritas, por exemplo, na o Patente nº U.S. 5.364.934. As variações podem ser uma substituição, deleção —ouinserçãode um ou mais códons codificando o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em uma mudança na sequência de aminoácido quando se compara com o anticorpo ou polipeptídeo da sequência nativa. Opcionalmente, a variação se dá por substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais domínios do anticorpo anti-CD79b . A orientação na determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a desejada atividade pode ser vista por comparação da sequência do anticorpo anti-CD79b com aquela das moléculas de proteína conhecidas homólogas e minimizando o número de iii AS Ap O“ O.
alterações na sequência de aminoácido feitas nas regiões de alta homologia.
Substituições de aminoácido podem ser o resultado de substituições de um aminoácido com um outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas similares tais como a substituição de uma leucina com uma serina, ou seja, substituições de aminoácido conservadoras.
Inserções ou deleções podem, ser, opcionalmente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos.
A variação | permitida pode ser determinada por produção sistemática de inserções, | deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e teste das variantes | e resultantes para atividade apresentada pela sequência nativa de comprimento total ou madura.
São, por esse intermédio fornecidos fragmentos de anticorpo anti- CD79b.
Esses fragmentos podem ser truncados no N-terminal ou C-terminal ou | podem carecer de resíduos internos, por exemplo, quando comparado com um | anticorpo ou proteína nativa de comprimento total.
Alguns fragmentos carecem de resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma desejada atividade biológica do anticorpo anti-CD79b.
Fragmentos do anticorpo anti-CD79b podem ser preparados por qualquer série de técnicas convencionais.
Os desejados fragmentos de o peptídeo podem ser quimicamente sintetizados.
Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de anticorpo ou polipeptídeo por digestão enzimática, por exemplo, por tratamento da proteína com uma enzima conhecida por clivar as proteína nos sítios indicados pelos resíduos de aminoácido particulares, ou por digestão do DNA com enzimas de restrição adequadas, e isolamento do desejado fragmento.
Uma outra técnica adequada ainda, envolve isolamento e amplificação de um fragmento de DNA codificando um desejado fragmento de anticorpo ou polipeptídeo, por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os oligonucleotídeos que definem os terminais desejados do fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5'e O iv
3' na PCR.
Preferivelmente, fragmentos do anticorpo anti-CD79b dividem pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com o anticorpo anti-CD79b nativo aqui apresentado.
Em modalidades particulares, substituições conservadoras de interesse são mostradas na Tabela 8 sob o título de substituições preferidas.
Caso essas substituições resultem em uma alteração na atividade biológica, então “mais alterações substanciais, denominadas — substituições exemplificativos na Tabela 8 ou como descrito mais abaixo na referencia às oe classes de aminoácido são introduzidas sendo os produtos examinados.
TABELA 8 Resíduo Substituições Substituições original exemplificativos Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) Ilys; gln; asn lys Asn(N) dgln; his; Iys; arg glh Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser GlIn (Q) asn asn o Glu (E) asp asp GIy(G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg le (1) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; glh; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Cn
NES Pa A E A A | 343 | | | Pro (P) ala ala | | Ser (S) thr thr | Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu Modificações substanciais na função ou identidade imunológica oe do anticorpo anti-CD79b são realizadas por substituições seletivas que diferem significativamente em seu efeito de manutenção (a) da estrutura da estrutura central do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral comum. (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cis, ser, thr, (3) ácidos: asp,glu; (4) básicos: asn, gln, his Iys, arg; o (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro, e (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Substituições não conservadoras terão como consequência, a substituição de um membro doe uma dessas classes por uma outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição ou, mais preferivelmente, aos sítios remanescentes (não — conservados). As variações podem ser feitas utiizando métodos do conhecimento da técnica como metagênese mediada a oligonucleotídeo (direcionada ao sítio) escaneamento de alanina e metagênese por PCR. A
SS
NE DD AD A | | 344 | | | metagênese direcionada o sítio [Carter et a/., Nucl.
Acids Res., 13:4331 (1986); | Zoller et al., Nucl.
Acids Res., 10:6487 (1987)], metagênese de cassete [Wells | et al., Gene, 34:315 (1985)], metagênese de seleção de restrição [Wells et al., | Philos.
Trans.
R.
Soc.
London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas | 5 — conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA da | variante anticorpo anti-CD79b. | A análise de exploração de aminoácido “também pode ser | empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma | ) sequência adjacente.
Dentre os aminoácidos explorados preferidos estão | 10 aminoácidos relativamente pequenos, neutros.
Esses aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteina.
Alanina é tipicamente um aminoácido de exploração preferido dentre este grupo porque ele elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável de alterar a conformação da cadeia principal da variante (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Alanina também é tipicamente preferida porque ele é o aminoácido mais comum.
Além disso, ele é frequentemente encontrado em posições tanto recobertas, quanto expostas [Creighton, The Proteins, (W.H.
Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J.
Mol.
Biol., 150:1 (1976)]. Caso substituições de alanina não o produzam quantidades adequadas da variante pode-se usar um aminoácido isotérico.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da adequada conformação do anticorpo anti-CD79b também pode ser substituído em geral com serina, a fim de incrementar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticulação aberrante.
De modo inverso, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo anti-CD79b para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv). Um tipo particularmente preferido de variante substituída envolve Ce a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo de origem (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para mais desenvolvimento terão propriedades biológicas incrementadas em relação ao anticorpo original do qual elas foram geradas, Um modo conveniente para geração dessas variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando apresentação de fago. Em resumo múltiplos sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) sofrem mutação para gerar todas as possíveis substituições amino em oe cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas em um modo monovalente das partículas de fago filamentoso como fusões ao produto Il! genético de M13 envolvido em cada partícula. As variantes vistas pelo fago são então examinadas quanto a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como aqui descrito. De modo a identificar sítios da região hipervariável candidatos para modificação, pode-se realizar metagênese de exploração de alanina a fim de identificar resíduos da região hipervariável que contribui significativamente para ligação ao antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o o anticorpo e o polipeptídeo CD79b. Esses resíduos de contato e resíduos adjacentes são candidatos para substituições de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez que essas variantes sejam geradas, o quadro de variantes é submetido ao exame criterioso conforme aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para mais descobertas.
Moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácido do anticorpo anti-CD79b são preparadas por uma série de métodos do conhecimento da técnica. Esses métodos incluem, sem limitação a: isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de o O —
aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por metagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada o sítio), metagênese de PCR e metagênese do cassete de uma variante preparada de antemão ou uma versão não-variante do anticorpo anti-CD79b. E. MODIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B Modificações covalentes dos anticorpos anti-CD79b estão incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir resíduos de aminoácido alvejados de um anticorpo anti-CD79b oe com um agente de derivatização orgânico capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos N- ou C- terminais do anticorpo anti-CD79b. A derivatização com agentes bifuncionais é de utilidade, por exemplo, para reticulação do anticorpo anti-CD79b a uma matriz de suporte hidrossolúvel ou superfície para uso no método de purificação dos anticorpos anti-CD79b e vice-versa. Agentes de reticulação de emprego comum, incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azido-salicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dissuccinimidilicos, tais como propionato de 3,3'-ditiobis succinimidila, maleimidas bifuncionais como bis-N-maleimidido- o 1,8-octano e agentes tais como 3-(para-azidofenil(ditio]propioimidato de metila. Outras modificações incluem a desamidação de resíduos de glutaminila e asparaginila nos correspondentes resíduos glutamila e aspartila, respectivamente, a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, a metilação dos grupos com cadeias laterais de a-amino de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: — Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], a acetilação do N-terminal amina e a amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal. , Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-CD79b
SS incluído no escopo desta invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do ant ou polipeptídeos. "alterar o padrão de glicosilação nativo" pretende para os fins a que se destinam deletar uma ou mais frações carboidrato encontradas na sequência nativa de anticorpo anti-CD79b (seja por — remoção do sítio de glicosilação subjacente ou por deletar a glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo anti-CD79b de sequência nativa. Além disso, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das oe proteínas nativas, envolvendo uma mudança na natureza e proporções de váriasfrações de carboidrato presentes.
A glicosilação dos anticorpos e de outros polipeptídeos se dá tipicamente, ou em ligação a N ou em ligação a O e refere-se à ligação da fração carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da fração carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de, ou essas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligado refere-se à ligação de o um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido —hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora possa ser também empregados 5-hidroxipropila ou 5-hidroxilisina.
- A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo anti-CD79b é realizada, de modo conveniente por alteração da sequência de aminoácido de modo que esta contenha uma ou mais sequências de tripeptídeo supracitadas (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feita por adição de, ou substituição por um ou mais resíduo serina ou treonina para a sequência do anticorpo anti-CD79b original (para sítios de glicosilação O- ligados). A sequência de aminoácido de anticorpo anti-CD79b pode ser,
opcionalmente alterada por meio de alterações a nível do DNA, particularmente por mutação do DNA codificando o anticorpo anti-CD79b em bases pré- selecionadas tal que os códons sejam gerados, os quais se traduzirão nos desejados aminoácidos.
Um outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato no anticorpo anti-CD79b é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo. Esses métodos estão descritos na técnica, por exemplo, em WO 87/05330 published 11 September 1987, e em Aplin and | oe Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
A remoção das frações carboidrato presentes no anticorpo anti- CD79b pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou por substituição mutacional dos códons que codificam para resíduos de aminoácido | que se prestam como alvos para a glicosilação. As técnicas de desglicosilação | químicas são conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et a/., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al, Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de frações de carboidrato nos polipeptídeos pode ser realizada mediante emprego de uma série de endo- e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura et a/., Meth.
o Enzymol., 138:350 (1987). Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-CD79b compreende a ligação do anticorpo a um de uma série de polímeros não - proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, do modo descrito nas. Patentes Nos. U.S 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. O anticorpo também — pode ser encerrado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou “microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- metilmetacrilato respectivamente) em sistemas de fornecimento de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesfera e albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são apresntadas em Remington's Pharmaceutica Sciences 16º. edição, Oslo, A., Ed. (1980).
O anticorpo anti-CD79b da presente invenção também pode ser modificado num modo a formar moléculas quiméricas compreendendo um anticorpo anti-CD79b ligado a um outro polipeptídeos heterológo ou sequência de aminoácido.
oe Numa modalidade, uma molécula quimérica como essa compreende uma fusão do anticorpo anti-CD79b com um polipeptídeo marcador que propicia um epítopo ao qual pode ser seletivamente ligado um anticorpo anti-marcador. O epítopo marcador é em geral colocado no terminal amino- ou carboxila do anticorpo anti-CD79b. A presença dessas formas de epítopo marcadas do anticorpo anti-CD79b pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo marcador. Ainda, a provisão do epítopo marcador permite ao anticorpo anti-CD79b ser prontamente purificado por purificação de afinidade usando-se um anticorpo anti-marcador ou um outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao epítopo marcador. Múltiplos o polipeptídeos marcadores e seus respectivos anticorpos são do conhecimento da técnicaa Exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli- histidina-glicina (poli-his-gli); o polipeptídeos marcador flu HA e seu anticorpo 12 CAS5 12CAS5 [Field et a/., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os anticorpos dos mesmos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador da —glicoproteína D do vírus Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos marcadores incluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o peptídeo epítopo KT3 [Martin et a/., Science, 255:192-194 (1992)]; um peptídeo epítopo de a-tubulina [Skinner et a/., J.
Biol.
Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína 10 do gene T7 [Lutz-Freyermuth et al.,
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 87:6393-6397 (1990)]. Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do anticorpo anti-CD79b com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina.
Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina" (tal como uma fusão poderia ser para a região Fc da molécula IgG.
As fusões IG oe preferivelmente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio de transmembrana deletada ou inativada) de um anticorpo anti-CD79b no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula Ig.
Numa modalidade particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui a articulação CH; e CH; ou a articulação de regiões CH,, CH, e CH3 de uma molécula IgG1. Para a produção da fusão de imunoglobulina ver também Patente Nº U.S. 5.428.130 concedida em junho de 1995. F.
PREPARAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B
A descrição a seguir refere-se principalmente à produção dos anticorpos anti-cD79b por cultura de células transformadas ou transfectadas o com um vetor contendo ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b.
Naturalmente que, considera-se que os métodos alternativos que se enquadrem no conhecimento da técnica podem ser empregados para preparar - anticorpos anti-CD79B.
Por exêmplo, a sequência de aminoácido apropriada, ou partes deste, pode ser produzida por síntese peptídica direta usando técnicas de fase sólida (ver por exemplo, [Stewart et a/., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J.
Am.
Chem.
Soc., 85:2149-2154 (1963)). A síntese protéica in vitro pode ser realizada usando-se técnicas manuais ou automatizadas.
A síntese automatizada pode ser realizada , por exemplo, usando-se um Applied
Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) com instruções do fabricante. Varias partes do anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizadas em separado e combinadas usando-se métodos enzimáticos químicos para produzir o desejado anticorpo anti-CD79b.
1. ISOLAMENTO DE DNA CODIFICANDO ANTICORPO ANTI-CD79B DNA codificando anticorpo anti-CD79b pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido tido por ser dotado de mRNA de anticorpo anti-CD79b e expressá-lo ap um nível detectável. Portanto, DNA de oe anticorpo anti-CD79b humano pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido humano. o gene codificando o | anticorpo anti-CD79b pode também ser obtido de uma biblioteca genômico ou por procedimentos sintéticos conhecidos, (por exemplo, síntese de ácido nucleico automatizada). As bibliotecas podem ser examinadas com sondas genéticas (como oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20 a 80 bases) planejadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. A seleção do cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser realizada usando-se procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al, o Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Uma alternativa para se isolar o gene codificando o anticorpo anti-CD79b seria o uso de metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]. As técnicas para exame de uma biblioteca de cDNA são do conhecimento da técnica. As sequências de oligonucleotídeo selecionados como sondas genéticas devem ser de comprimento suficiente e com credibilidade suficiente para que, os falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferivelmente rotulado de modo que ele possa ser detectado com a hibridização ao DNA na biblioteca sendo examinada com rigor. Métodos de rotulação são do conhecimento da técnica, e incluem o uso de radio-rótulos como ATP. P*?rrotulado, biotinilação ou rotulação enzimática. Condições de hibridização, incluindo rigidez moderada e alta rigidez são — proporcionados em Sambrook et al., supra.
As sequências identificadas nesses métodos de análise meticulosa podem ser comparada e alinhadas a outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicos como em GenBank ou oe outras bases de dados de sequência privada. A identidade da sequência (a nível, tanto de aminoácido como de nucleotídeo) dentro das regiões definidas da molécula ou pela sequência de comprimento total pode ser determinada usando-se métodos do conhecimento da técnica e como aqui descrito.
O acido nucleico tendo a sequência de codificação pode ser obtido por análise meticulosa de bibliotecas de cDNA ou genômica selecionadas usando-se a sequência de aminoácido deduzida aqui apresentada pela primeira vez, e, caso necessário usando-se procedimentos de extensão de iniciador convencional como descrito em Sambrook et al, Supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de mMRNA o que podem não ter sido elaborados por transcrição reversa ao cDNA.
2. SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem aqui descritos para produção de anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme | apropriado para induzir promotores, selecionar transformante, ou amplificar os genes codificando as desejadas sequências. As condições de cultura, tais | como meio, temperatura, pH e similar, podem ser selecionadas pelo versado | na técnica, sem experimentação indevida. Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células pode ser vistas em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra. Os métodos de transfecção de célula eucarionte e transformação de célula procarionte significando introdução do DNA ao hospedeiro de modo queo DNA seja replicável, seja como um extracromossoma ou por integrante cromossomal, são do conhecimento da técnica, por exemplo, CaCla, CaPOa,, mediado por lipossoma, polietileno glico/DMSO e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando-se técnicas ) padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito me Sambrook et al, supra, ou eletroporação é em geral usado para procariontes. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de algumas células de planta, conforme descrito por Shaw et al. Gene, 23:315 (1983) e WO 89/08859, publicado em 29 de junho de 1980. Para células de mamífero, sem essas paredes celulares, o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham and van der Eb Virology, 52: 456-467 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de transfecções de sistema hospedeiro de célula de mamífero foram descritos na Patente U.S. nº 4.399.316. A transformação em levedura é o tipicamente realizada de acordo com o método de Van Solingen et a/., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para introdução do dNA às células como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriana, com células intatas, ou poli-cátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, também podem ser empregados. Para varias técnicas de transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) and Mansour et a/l., Nature, 336:348-352 (1988).
Células hospedeira adequadas para clonagem ou expressão do DNA aos vetores presentes incluem células procariontes, levedura ou
| 354 eucariontes superiores.
A.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES Procariontes adequados incluem, sem limitação às arquebactérias | e eubactérias tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por | exemplo, Enterobacteriaceas, como E. coli.
Várias cepas de E. coli são | publicamente disponíveis, como E. coli cepa K12 MM294 (ATCC 31,446); E. | coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procariontes adequadas incluem, oe Enterobacteriaceae tais como: Escherichia, por exemplo., E. coli, Enterobacter, Enwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P revelada em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces. —* Esses exemplos são ilustrativos sem ser limitantes.
A cepa W3110 é um hospedeiro particularmente preferido, ou hospedeiro original, porque ela é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante.
Preferivelmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas o proteolíticas, Por exemplo, a cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposito No. 27,325) pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo exemplos de tais hospedeiros, inclusive: E. coli W3110 cepa 1A2, que tem o genótipo completo fonA ; E. coli W3110 cepa 9E4, que tem o — genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55,244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 f(argF-lac)169 degP ompT kan'; E. coli W3110 cepa 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; E. coli W3110 cepa 40B4, que se trata da cepa 37D6 com uma mutação de deleção degP não resistente a canamicina; E. coli W3110 cepa 33D3 com o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanº (U.S.
Pat.
No. 5,639,635) e uma cepa de E. coli com protease periplásmática mutante revelada na Patente No.
US.4.946.783 concedida em 7 de agosto de 1990. Outras cepas e seus derivados tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli, 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308(ATCC 31,608) também são adequadas.
Esses exemplos são ilustrativos e não limitantes da invenção. “Métodos para oe construção de derivados de quaisquer dessas bactérias supracitadas com | genótipos definidos são do conhecimento da técnica estando descritos, por exemplo, em Bass et a/., Proteins, 8:309-314 (1990). - Faz-se geralmente necessário selecionar a bactéria apropriada levando-se em conta a capacidade de replicação do replicon nas células de uma bactéria.
Por exemplo, E. coli, espécies Serratia ou Salmonella podem ser adequadamente empregadas como o hospedeiro, quando plasmídeos bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para fornecer o replicon.
Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease adicionais podem ser o incorporados convenientemente, na cultura celular.
Alternativamente, métodos in vitro de clonagem, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico são adequados. " Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpo e proteinas de fusão ao anticorpo podem ser produzidos nas bactérias, particularmente, quando não são necessários a glicosilação e função efetora —Fc,como quando o anticorpo terapêutico é conjugado em um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por ele próprio mostra eficácia na destruição de célula de tumor.
Anticorpos de comprimento total têm meia- vida maior em circulação.
A produção de E. coli é mais rápida e menos onerosa. Para expressão dos fragmentos de anticorpo e polipeptídeos nas bactérias, ver, por exemplo, U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), e U.S. 5,840,523 (Simmons et al.), que descrevem a região de iniciação de tradução (TIR) e sequências sinalizadoras para expressão otimizada e secreção, sendo essas patentes ora incorporadas por referencia. Após a expressão o anticorpo é isolado da pasta de célula de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado por meio de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G, dependendo do isotipo. A purificação final pode ser feita similarmente o ao processo para purificação de anticorpo expressado por exemplo, em células deCHO.
B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIONTES Além dos procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação do anticorpo — anti-CD79b. — Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucarionte inferior comumente empregado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicado em 2 de maio de SS 1985); hospedeiro Kluyveromyces (U.S. Patent No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como por exemplo, K. lactis (MW98-8C, —CBS683, CBS4574; Louvencourt et a/., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltil (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et a/., J. Basic —Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces como por exemplo, Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos, tal como por exemplo, Neurospora, Peníicíllium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como: A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289
[1983]; Tilburn et a/., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475- 479 [1985]). Leveduras metilotrópicas são aqui adequadas incluindo, sem limitação: a, levedura capaz de crescer em metanol selecionadas do gênero consistindo de: Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, o Torulopsis, e Rhodotorula. Uma relação de espécies específicas exemplificativos desta classe de leveduras pode ser vista em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para expressão do anticorpo anti- CD79b glicosilados são derivada de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de inseto, como drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, como culturas de célula de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco. Numerosas cepas baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivos ES correspondentes de hospedeiros foram identificadas, tais como: Spodoptera | frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), | 20 —Drosophila melanogaster (mosca das frutas ), and Bombyx mori. Uma série de cepas virais para transfecção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a | variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV e vírus tais podem ser empregados como os vírus presentes de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de —Spodoptera frugiperda. Contudo, o maior interesse consistiu em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por V40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster recém-nascido (BHK, —ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TMA, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco African green (VERO- | e 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC | CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34);células de fígado de | rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de puimão humano (W138, | ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário | de murino (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et a/., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma | linhagem de hepatoma humano (Hep G2). As células hospedeiras são transformada com os vetores de expressão ou clonagem supracitados para produção do anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme adequado, oe para induzir promotores, seleção de transformantes, ou amplificação de genes codificando as desejadas sequências.
3. SELEÇÃO E Uso DE Um VETOR DE REPLICAÇÃO Ú Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, o | ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou Dna genômico) codificando o mesmo e isolado e inserido em um vetor de replicação para ulterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificando o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo capazes de ligar-se especificamente aos genes codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo).
Muitos vetores estão disponíveis.
A escolha do vetor depende em parte, da célula hospedeira usada.
Em geral, células hospedeiras preferidas são de origem, ou procarionte ou eucarionte (geralmente de mamífero). O vetor, pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, — cosmídeo, partícula viral ou fago.
A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida ao vetor por uma série de procedimentos.
Em geral o DNA é inserido em um adequado sítio de endonuclease de restrição usando técnicas conhecidas nesse campo.
Componentes de vetor incluem em geral, sem e limitação, a um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.
A construção dos vetores adequados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas aos versados na técnica.
O CD79b pode ser produzido de modo recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeos de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo.
Em geral, a sequência de sinal pode ser um o componente do vetor, ou ele pode ser uma parte do DNA codificando anticorpo ant-CD79b o qual é inserido ao vetor.
A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo de fosfatases alcalinas, penicilinase, Ipp, ou sequência líder de enterotoxina || si termoestável.
Para secreção de levedura a sequência de sinal pode ser por exemplo, a líder levedura invertase, líder fator alfa (incluindo sequências líderes fator2 de Saccharomyces e Kluyveromyces, sendo a última descrita na Patente No.
U.S 5,010,182), ou líder fosfatase ácida, a líder glicoamilase de C. albicans (EP 362,179 publicada em 4 de abril de 1990), ou a sequência de sinal descrita em WO 90/13646, publicada em 15 de novembro de 1990. Na expressão de célula de mamífero, s sequências de sinal de mamífero podem ser usadas para direcionar secrecao da proteína, tal como sequência de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou de espécie relacionada, bem como sequência líderes secretoras virais. A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES Sequências de polinucleotídeo codificando componentes de polipeptídeo do anticorpo da invenção podem ser obtidas usando-se técnicas recombinantes padrão. As sequências de polinucleotídeo desejadas podem e ser isoladas e sequenciadas de células produtoras de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleotideos podem ser sintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas da PCR. Uma vez obtidas, as sequências codificando os polipeptídeos são inseridas ao vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procariontes. Muitos vetores disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para as finalidades da presente invenção. A selecao de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos que irão ser inseridos ao vetor e da célula hospedeira particular que irá ser transformada com o vetor. Cada vetor contém múltiplos componentes, o dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo —heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que ele reside.
Em geral, vetores de plasmídeo contendo o replicon e sequências " de controle derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados juntamente com esses hospedeiros. Ambos os vetores de expressão e de clonagem contém uma sequência de ácido nucleico que permite ao vetor replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas, bem como sequências marcadoras que são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Essas sequências são do conhecimento para uma gama de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322, o qual contém genes codificando resistência a ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) fornecendo assim meios fáceis para identificar células transformadas, é adequado para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2u é adequada para levedura e várias origens virais (SVA40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamífero, pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago também podem conter ou ser modificados para oe conter, promotores os quais podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 usados para expressão de anticorpos particulares estão descritos em detalhes em Carter et al., na Patente nº U.S. 5.648.237. Além disso, vetores de fago contendo replicon e sequências de controle compatíveis com os microorganismos hospedeiros podem ser usados como vetores transformantes em conexão com esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal como AGEM.TM-11 podem ser usado para produzir um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.
o O vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares promotor-cistron codificando cada um dos componentes de polipeptídeo. — Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a jusante 5' de um cistron que modula sua expressão. Promotores procariontes — tipicamente, enquadram-se em duas classes, indutivas e constitutivas. O promotor indutível é um promotor que inicia os níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle, em respostas a alterações nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Um grande número de promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode ser ligado operavelmente ao DNA cistron codificando a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor do DNA de origem via digestão com enzima de restrição e inserção da sequência de promotor isolada ao vetor da invenção. Tanto a sequência do promotor nativa e muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a amplificacao e/ou expressão dos genes alvos. Em algumas modalidades, os promotores heterólogos são utilizados como eles, em geral, permitem maior transcrição e maiores | 6 rendimentos do gene alvo expressão, quando se compara com o promotor de | 10 —polipeptídeo alvo nativo.
| Promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são do conhecimento da técnica. Promotores adequados para uso com hospedeiros procariontes incluem o promotor PhoA, o B-galactamase e sistemas de promotor de lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al, Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] e promotores híbridos tais como, o tac [deBoer et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)) ou o promotor trc. Promotores para uso em 6 sistemas bacterianos também conterão uma sequência Shine Dalgarno (S.D.) —operavelmente ligada ao DNA codificando o anticorpo anti-CD79b. Contudo, outros promotores que são funcionais em bactérias ( como outros promotores bacterianos ou de fato conhecidos) são adequados também. Suas sequências de nucleotídeo foram publicadas, permitindo, portanto, a um operador versado ligá-los operavelmente ao cistron codificando as cadeias alvo leve e pesada —(Siebenlist et a/., (1980) Cell 20:269) usando ligantes ou adaptadores para suprir quaisquer sítios de restrição exigidos. Em um aspecto da invenção cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente da sequência de sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressados por toda a membrana.
Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou ela pode ser uma parte do DNA de polipeptídeo alvo, que é inserido ao vetor.
A sequência de sinal selecionada para fins desta invenção, deve ser uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira.
Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma oe sequência de sinal procarionte selecionada por exemplo, do grupo — que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou lideres enterotoxina |l termoestáveis (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP.
Numa modalidade, da invenção, as sequências de sinal empregadas em ambos os cistrons do sistema de expressão são sequências de sinal STII ou suas variantes.
Num outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo coma invenção podem ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não necessitam da presença de sequências de sinal de secrecao dentro de | cada cistron.
Neste aspecto, cadeias leve e pesada de imunoglobulina são ! ss expressadas, dobradas e combinadas para formar imunoglobulinas funcionais o dentro do citoplasma.
Algumas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas de E colitxB) propiciam condições citoplasmáticas favoráveis para formação de ponte dissulfeto, permitindo assim adequado dobramento e montagem das subunidades de proteína expressadas.
Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995). A presente invenção obtém um sistema de expressão em que a relação quantitativa dos componentes do polipeptídeo expressados pode ser modulada de modo a maximizar o rendimento dos anticorpos adequadamente secretados e combinados da invenção.
Uma tal modulação é realizada pelo menos em parte, por intensidades traducionais na modulação simultânea para 77 PP” mm” nt O RA A AA AAA os componentes de polipeptídeo.
Uma técnica para modular a intensidade traducional está apresentada em Simmons et al., na Patente nº U.S. 5.840.523. Ela utiliza variantes da região de iniciação traducional (TIR) dentro de um cistron. Para uma dada TIR, uma série de variantes de sequência de aminoácido ou ácido nucleico — pode ser criada com uma faixa de intensidades traducionais, propiciando assim um meio conveniente pelo qual, se ajusta este fator para o desejado nível de expressão da cadeia específica. Variantes TIR podem ser oe geradas pro técnicas de metagênese convencionais que resultam em alterações do códon que podem alterar a sequência de aminoácido, embora alterações silenciosas na sequência de nucleotídeo sejam preferidas. Alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento de sequências Shine-Delgarno juntamente com alterações na sequência de sinal. Um método para gerar sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de códon'" no início de uma sequência de codificação que não altera a sequência de aminoácido da sequência de sinal, (ou seja, a s alterações são mudas). Pode-se realizar isto por aliteração da terceira posição . do nucleotídeo de cada códon; adicionalmente alguns aminoácidos tais como o leucina, serina, e arginina, têm múltiplas primeira e segunda posições, que podem adicionar complexidade na composição do banco. Este método de metagênese está descrito em detalhe em Yansura et a/., (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol 4: 151-158.
Preferivelmente, um conjunto de vetores é gerado com uma faixa de intensidades TIR para cada cistron. Este conjunto limitado propicia uma — comparação dos níveis de expressão de cada cadeia, bem como o rendimento dos desejados produtos de anticorpo sob várias combinações de intensidade TIR. Intensidades TIR podem ser determinadas quantificando-se o nível de expressão de um gene repórter conforme descrito em detalhes em Simmons et
CCC al., Patente nº U.S. 5.840.523. Com base na comparação da intensidade traducional, as desejadas TIRs individuais são selecionadas para combinação nos construtores do vetor de expressão da invenção. B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIONTES Os componentes de vetor em geral, incluem, sem limitação a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. oe (1) CoMPONENTE DA SEQUÊNCIA DE SINAL Um vetor para emprego em uma célula hospedeira eucarionte também pode conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada preferivelmente, é uma que é reconhecida e processada (ou seja clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeiraa Em expressão de célula de mamífero, as sequências de sinal de mamífero, bem como as sequências líderes secretoras virais, por exemplo, a de sinal gD herpes simples, estão disponíveis. O DNA para essa região precursora está ligado em quadro de o leitura ao DNA codificando o anticorpo. (2) ORIGEM DE REPLICAÇÃO Em geral, um componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem SV40 pode ser usada, tipicamente apenas porque contém o promotor primário. (3) CoMPONENTE DO GENE DE SELEÇÃO Vetores de expressão e clonagem conterão, tipicamente um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável... Genes de seleção típicos codificam proteína que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou
CC tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis do meio complexo, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli. Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. AS células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e por isso, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante usam os fármacos neomicina, oe ácido micofenólico e higromicina.
Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para absorção do ácido nucleico codificando anticorpo anti- CD79b, tal como DHFR ou timidina quinase, metalotionein-1 e —Il, preferivelmente genes metalotioneina de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc. Uma célula hospedeira apropriada quando se emprega DHFR tipo selvagem é a linhagem de célula CHO em atividade dHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096) preparado e propagado conforme descrito por . Urlaub et a/., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 (1989). por exemplo, células o transformadas com o gene de seleção DHFR são primeiramente identificadas por cultura de todos os transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx) um antagonista competitivo de DHFR. Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem contendo DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA codificando um anticorpo, proteína DHFR tipo selvagem, e um outro marcador —selecionável com aminoglicosídeo 3"-fosfotransferase (APH) podem ser selecionados por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico por exemplo, kanamicina, neomicina, ou G418, ver a Patente nº U.S. 4.965.199.
Um gene de seleção adequado para emprego em leveduras é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et a/l., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al!., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et a/l., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trp1 propicia um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura carecendo da capacidade de desenvolver-se em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977). (4) COMPONENTE PROMOTOR oe Vetores de expressão e clonagem contém normalmente um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b para dirigir a síntese de mRNA.
Os promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos.
Genes virtualmente aleucarióticos, tem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde é iniciada a transcrição.
Uma outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo.
Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes o está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da extremidade poli A para a extremidade 3'da sequência de codificação.
Todas essas sequências são adequadamente inseridas aos vetores de expressão eucariontes.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para emprego com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato —quinase [Hitzeman et al., J.
Biol.
Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al, J.
Adv.
Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase,
glicose-6-fosfato — isomerae, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.
Outros promotores de levedura que são promotores indutivos com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de | 5 crescimento são as regiões do promotor para desidrogenase alcoólica , isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.
o Vetores e promotores adequados para emprego na expressão de levedura então descritos ainda em EP 73.657.
A transcrição do anticorpo anti-CD79b de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada,m por exemplo, pro promotores obtidos dos genomas de vírus tais como vírus polioma, vírus de bexiga das aves (UK
2.211.204, publicado em 5 de julho de 1989) adenovírus (ta; como Adenovirus 2), vírusde papiloma de bovino, vírus de sarcoma avícola, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e vírus de símio (SV40) de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que, esses o promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
Os promotores primitivos e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor primário imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus de papiloma bovino como um vetor, está apresentado na Patente nº U.S. 4.419.446. Uma modificado desta sistema está descrita na Patente nº U.S. 4.601.978. Ver também Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) na expressão de cDNA de B-interferon humano em células de murídeo sob o controle do promotor timidina quinase de vírus de herpes simples.
Alternativamente a repetição terminal longa do Vírus de Sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. (5) COMPONENTE DO ELEMENTO INTENSIFICADOR A transcrição de um DNA codificando o anticorpo anti-CD79b pro eucariontes superiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência intensificadora ao vetor.
Intensificadores são elementos de atuação -cis do DNA., normalmente de cerca de 10 a 300 pb (pares de base) que atuam em 6 um promotor, para aumentar sua transcrição.
Muitas sequências intensificadores são conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, pode-se empregar um intensificador de um vírus de célula eucarionte.
Exemplos incluem o intensificador SV40 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270) o intensificador de promotor primitivo de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus.
Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) em elementos intensificadores para ativação de promotores eucariontes.
O intensificador . pode ser dividido no vetor a uma posição 5'ou 3' para a sequência de e codificação do anticorpo anti-CD79b, porém está de preferência localizado no sítio 5S'do promotor. (6) COMPONENTE DE TERMINAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucariontes (levedura, fungos, inseto, plantas animais, humanos ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão ainda, sequências necessárias para —aterminação da transcrição e para estabilização do MRNA.
Essas sequências estão normalmente disponíveis de regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3' de DNAs ou cDNAs eucariontes ou virais.
Essas regiões contém segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos de poliadenilação na parte não | traduzida do MRNA codificando o anticorpo anti-CD79b.
Um componente útil de terminação da transcrição é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino.
Ver WOS94/11026 e o vetor de expressão aí apresentado.
Outros métodos, vetores e células hospedeiras adicionais — adequados para adaptação à síntese do anticorpo anti-CD79b em cultura de célula de vertebrado recombinante estão descritos em Gething et a/., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et a/., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058. o 4. CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS As células hospedeiras usadas na produção do anticorpo anti- CD79b desta invenção podem ser cultivadas em uma série de meios.
A.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES As células procariontes usadas na produção dos polipeptídeos da invenção são cultivadas em meio conhecido na técnica adequado para cultura das células hospedeiras selecionadas.
Exemplos de meio adequado inclui caldo luria (LB) mais suplementos nutrientes necessários.
Em algumas modalidades, o meio contém ainda um agente de seleção, escolhido com base à na construção do vetor de expressão, a fim de permitir, seletivamente, o € crescimento de células procariontes contendo o vetor de expressão.
Por exemplo, é adicionado ampicilihna ao meio para crescimento de células expressando o gene resistente par ampicilina. | Quaisquer suplementos necessários, além de carbono, nitrogênio e fontes de fosfato inorgânico podem ser incluídos também, a concentrações adequadas introduzidos separadamente, ou como uma mistura com um outro suplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa.
Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados do grupo consistindo de glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreito!.
As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em temperaturas apropriadas.
Para cultura de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida está na faixa de cerca de 20ºC a cerca de 39ºC, mais de preferência de cerca de 25ºC a cerca de 37ºC, mais ainda de preferência a cerca de 30ºC. opHdo meio pode ser qualquer pH na faixa de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro.
Para E. coli, o pH é de preferência de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, e mais de preferência cerca de 7,0. Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão da e invenção, a expressão de proteína é induzida sob condições apropriadas para a ativação do promotor.
Em um aspecto da invenção, os promotores PhoA são usados para controlar a transcrição de polipeptídeos.
Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio limitante de fosfato para indução.. De preferência, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P (ver, por exemplo, Simmons et al, J.
Immunol.
Métodos (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregado, como é conhecido na técnica.
Em uma modalidade, os polipeptídeos expressados da presente so invenção são secretados dentro e recuperados do periplasma de células e hospedeiras.
A recuperação de proteína tipicamente envolve romper o microorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação Ou lise.
Uma vez que as células são rompidas, resíduos de células ou células totais podem ser removidas por centrifugação ou filtração.
As proteínas podem ser ainda purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina de afinidade.
Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas em um meio de cultura e isoladas no mesmo.
As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante de cultura sendo filtrado e concentrado para outra purificação das proteínas produzidas.
Os polipeptídeos expressados podem ser ainda isolados e identificados usando métodos comumente conhecidos tal como
372 | eletroforese de gel poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.
Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpos é conduzida em uma grande quantidade por um processo de fermentação.
Múltiplos procedimentos de fermentação em bateladas alimentadas em grande escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes.
Fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, de preferência cerca de 1.000 to 100.000 litros de capacidade.
Estes fermentadores usam impelidores agitadores para distribuir o oxigênio e os o nutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono/energia preferida). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que é não mais do que aproximadamente 100 litros em capacidade volumétrica, e pode estar na faixa de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
Em um processo de fermentação, a indução de expressão de proteína é tipicamente iniciada após as células serem cultivadas nas condições apropriadas em uma densidade desejada, por exemplo, um ODs5o de cerca de 180-220, estágio em que as células estão na fase estacionária inicial.
Uma , variedade de indutores pode ser usada, de acordo com a construção de vetor e empregada, como é conhecido na técnica e descrito acima.
As células podem ser cultivadas durante períodos mais curtos antes da indução.
As células são geralmente induzidas durante cerca de 12 a 50 horas, embora tempos de indução mais longos ou mais curtos possam ser usados.
Para aperfeiçoar o rendimento de produção e qualidade dos polipeptídeos da invenção, várias condições de fermentação podem ser “modificadas.
Por exemplo, para aperfeiçoar a montagem e duplicação apropriadas dos polipeptídeos de anticorpos secretados, proteínas protetoras superexpressando vetores adicionais, tal como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FKpA (uma pebptidilprolil cis,trans-isomerase com | atividade protetora) podem ser usadas para co-transformar as células procarióticas hospedeiras. As proteínas protetoras são demonstradas para facilitar a duplicação solubilidade apropriadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et a/. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et a/., patente U.S. Nº. 6.083.715; Georgiou et al., patente U.S. Nº. 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. o Para minimizar proteólise de proteínas heterólogas de expressão (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas cepas hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, cepas de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes codificando proteases bacterianas conhecidas tal como Protease Ill, OmpT, DegP, Tsp, | 15 —Protease |, Protease Mi, Protease V, Protease Vl e combinações das mesmas. Algumas cepas deficientes de protease em E. coli estão disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et a/. (1998), supra; Georgiou et al., patente U.S. Nº. 5.264.365; Georgiou et a/., patente U.S. Nº. 5.508.192; Hara et al, o Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
Em uma modalidade, cepas de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos superexpressando uma ou mais proteínas protetoras são usadas como células hospedeiras em um sistema de expressão da invenção.
B. CÉLULAS EUCARIÓTICAS HOSPEDEIRAS Meios comercialmente disponíveis tal como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential meio ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio Eagle Modificado com Dulbecco ((DVMEM), Sigma) são apropriados para cultivar células hospedeiras. Além disso, quaisquer meios descritos em Ham et al,
Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et a/., Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes U.S. Nºs. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. 30.985 podem ser usados como ' meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tal como adenosina e timidina), o antibióticos (tal como droga GENTAMYCIN'Y), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais em uma faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente.
Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que poderão ser conhecidas dos versados na técnica. As condições de cultura, tal como temperatura, pH, e outros, são as previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente a um versado na técnica.
5. AMPLIFICAÇÃO/EXPRESSÃO DO GENE DE DETECÇÃO A amplificação e/ou expressão de gene pode ser medida em uma o amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, — Northern blotting para quantificar a transcrição de MRNA [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada, baseada nas sequências aqui fornecidas. Alternativamente, os anticorpos podem ser empregados que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de DNA, duplexes de RNA e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser rotulados e o ensaio pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de modo que na formação do duplex sobre a superfície, a presença de anticorpo ligado a um duplex pode ser detectada. Alternativamente, a expressão de gene pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imuno-histoquímica de células ou | seções de tecidos e ensaio de cultura de célula de fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto de gene. Anticorpos úteis para | coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser tanto monoclonais como policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um | e polipeptídeo de CD79b de sequência nativa ou contra um peptídeo sintético | baseado nas sequências de DNA presentemente fornecidas ou contra sequência exógena fundida a DNA de CD79b e codificando um epítopo de anticorpo específico | 6. PURIFICAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-CD79B | As formas do anticorpo anti-CD79b podem ser recuperadas do | 15 —meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se ligado à membrana, e pode ser liberado de uma membrana usando a solução detergente apropriada (por exemplo Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. Células empregadas na expressão do anticorpo anti-CD79b podem ser rompidas por múltiplos meios o físicos ou químicos, tal como ciclos de congelamento-descongelamento, —sonicação, rompimento mecânico, ou agentes de lise de células.
Pode ser desejado purificar o anticorpo anti-CD79b de proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação apropriados por fracionamento ou uma coluna de troca iônica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; — cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromato focalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; filtração de gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de Sepharose proteína A para remover contaminantes tal como IgG; e colunas quelantes de metal para ligar formar marcadas de epítopos do anticorpo anti-CD79b.
Múltiplos métodos de purificação de proteina podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos por exemplo in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionadas dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do anticorpo anti-CD79b particular produzido.
Quando se usa técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser o produzido intracelularmente, em um espaço periplásmico ou diretamente secretado em um meio.
Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, o resíduo particulado, tanto células hospedeiras como fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração.
Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretado para um espaço — periplásmico de E. coli.
Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min.
O resíduo de células pode ser removido por o centrifugação.
Quando o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiramente concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafitração Amicon ou Millipore Pellicon' Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes casuais
A composição do anticorpo preparada das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese de gel, diálise, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade sendo uma técnica de purificação.
A adequabilidade da proteína A como um ligante de afinidade depende de espécies e isotipos de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas de y1, y2 ou cadeias leves de y4 humanas (Lindmark et a/., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)) A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para y3 humano (Guss et a/., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é fixado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tal como vidro de e poro controlado ou poli(festirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que podem ser obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio C43, a resina Bakerbond ABX'Y (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tal como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, cromatografia HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE Ty cromatografia sobre uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como a coluna de ácido poliaspártico), cromato focalização, SDS-PAGE, e precipitação e com sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado. Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo e contaminantes de interesse pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo usando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizada em concentrações com baixo teor de sal, (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sa) G. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS Os conjugados anticorpo-droga (ADC) da invenção podem ser administrados por qualquer via apropriada em uma condição a ser tratada. O
RR
ADC será tipicamente administrado parenteralmente, isto é infusão, subcutâneo, intramuscular, intravenosa, intradérmica intratecal e epidural.
Para tratar estes cânceres, em uma modalidade, o conjugado anticorpo-droga é administrado por infusão intravenosa. A dosagem — administrada por infusão está em uma faixa de cerca de 1 ug/m? a cerca de
10.000 ug/m? por dose, geralmente uma dose por semana para um total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, a faixa de dosagem é cerca de 1 ug/m? a cerca de 1000 ug/m?, cerca de 1 ug/m? ao cerca de 800 pg/m?, o cerca de 1 ug/m? a cerca de 600 pg/m?, cerca de 1 ug/m? a cerca de 400 pom?, cerca de 10 ug/m? a cerca de 500 uogim?, cerca de 10 uoim? a cerca de 300 pg/m?, cerca de 10 ug/m? a cerca de 200 ug/m?, e cerca de 1 ugim? a cerca de 200 ug/m?. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, tempos múltiplos por semana, mas menos do que uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para suavizar ou aliviar os sintomas da doença. A administração por continuar em qualquer um dos intervalos descritos até a remissão do tumor ou sintomas do linfoma, leucemia senso tratados. À administração pode continuar até remissão ou mitigação dos sintomas ser e obtida onde tal remissão ou mitigação é prolongado por tal administração continuada.
A invenção também fornece um método de aliviar uma doença autoimune, compreendendo administrar a um paciente sofrendo de uma doença autoimune, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado anticorpo MA79b-droga humanizado de qualquer uma das modalidades precedentes. Nas modalidades preferidas, o anticorpo é administrado intravenosamene ou subcutaneamente. O conjugado anticorpo-droga é administrado intravenosamente em uma dosagem na faixa de cerca de 1 ug/m? ao cerca de 100 mg/ m? por dose e em uma modalidade específica, a dosagem é 1 ug/m? a cerca de 500 ug/m?. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, templos múltiplos por semana, mas menos do que uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos de uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez — pormês ou intermitentemente para suavizar ou aliviar os sintomas da doença.
A administração pode continuar em qualquer um dos intervalos descritos até mitigação ou alívio de sintomas de doença autoimune sendo tratada. A administração pode continuar após mitigação de ou alívio de sintomas ser oe obtida, onde tal alívio ou mitigação é prolongada por tal administração continuada.
A invenção também fornece um método de tratar um distúrbio de células B compreendendo administrar a um paciente sofrendo de um distúrbio de células B, tal como um distúrbio proliferativo de células B (incluindo sem limitação linfoma e leucemia) ou uma doença autoimune, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo MA79b humanizado de qualquer uma das modalidades precedentes, cujo anticorpo não é conjugado a uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente é administrado em uma faixa de dosagem de cerca de 1 ug/m? ao cerca de 1000 mg/m?.
Em um aspecto, a invenção fornece ainda formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção e/ou pelo menos um imunoconjugado do mesmo e/ou pelo menos um anticorpo conjugado anti-CD79b-droga da invenção. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um —imunoconjugado do mesmo, e (2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo e, opcionalmente, (2) pelo menos um agente terapêutico adicional. Os agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não estão limitados a, os descritos abaixo.
O ADC tipicamente será administrado parenteralmente, isto é infusão, subcutâneo,
intramuscular, intravenoso, intradérmico, intratecal e epidural.
Formulações terapêuticas compreendendo um anticorpo anti- —CD79bouimunoconjugado CD79b usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem misturando o anticorpo Ou imunoconjugado, tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's eo Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A.
Ed. (1980)), em uma forma de formulações liofiizadas ou soluções aquosas.
Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tal como acetato, Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzotônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de é peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como —polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, mannose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; tonificantes tal como trehalose e cloreto de sódio; açúcares tal como sacarose, mannitol, trehalose ou sorbitol; tensoativo tal como —polissorbate; contraíons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína complexes); e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEENG, PLURONICSO ou polietileno glicol (PEG). Formulações farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis.
Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
As presentes formulações também podem conter mais do que um composto ativo, como necessário, para uma indicação particular sendo tratada, de preferência as com atividades complementares que não afetam adversamente um à outra.
Por exemplo, além de um anticorpo anti-CD79b, pode ser desejável incluir em uma formulação um anticorpo adicional, por exemplo, um segundo anticorpo anti-CD79b que liga um epítopo diferente o sobre o polipeptídeo de CF79b., ou um anticorpo em alguma outra marcação tal como um fator de crescimento que afeta o crescimento do câncer particular.
Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode ainda compreender um agente quimioterápico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor de crescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotetor.
Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes paraofim pretendido.
Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por o polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas | de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões.
Tais técnicas são descritas in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º edição, Osol, A.
Ed. (1980). Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas.
Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas.
Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou álcool! poli (vinílico))), polilactídeos (Pat. U.S.. Nº. 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON —DEPOTO (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico- ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Polímeros brancos tal como acetato de etileno-vinila e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas durante 100 dias, certos o hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo durante um longo período, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37ºC, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis trocas em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo e agregação é a formação S-S intermolecular através da troca de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida modificando- se os resíduos de sulfidrila obtidos, liofilizando soluções acídicas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições o de matriz polimérica específicas.
Um anticorpo pode ser formulado em qualquer forma apropriada para liberar a um célula/tecido de marcação. Por exemplo, os anticorpos podem ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composto de múltiplos tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para liberação de uma droga a um mamífero. Os — componentes do lipossoma são comumente dispostos em uma formação em bicamada, similar a uma disposição de lipídeos de membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688
(1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patentes U.S. Nºs. 4.485.045 e 4.544.545; e WOS97/38731 publicado em 23 de outubro de1997. Lipossomas com tempo de circulação melhorado são descritos na patente US Nº. 5.013.556.
Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por um método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho o de poro definido para dar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab'do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados a um lipossoma como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por uma reação de troca de dissulfeto.Um agente quimioterápico está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989). As formulações a serem usadas para administração in vivo | precisam ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através das membranas de filtração estéril. | o H. TRATAMENTO COM ANTICORPO ANTI-CD79BS | Para determinar a expressão de CD79b em um câncer, múltiplos | 20 ensaios de detecção estão disponíveis. Em uma modalidade, a superexpressão do polipeptídeo de CD79b pode ser analisada por imuno- | “histoquímica (IHC). Seções de tecido de uma biopsia de tumor embutidas em parafina podem ser submetidas ao ensaio IHC e concederam um critério de intensidade de coloração da proteína CD79b como a seguir: ' 25 Classificação 0 — nenhuma coloração é observada ou a coloração | da membrana é observada em menos do que 10% das células de tumor. | Classificação 1+ - uma coloração de membrana pálida/claramente perceptível é detectada em mais do que 10% das células de tumor. As células são somente coloridas em parte de suas membranas.
Classificação 2+ - uma coloração de membrana completa fraca a moderada é observada em mais do que 10% das células de tumor.
Classificação 3+ - uma coloração complete forte a moderada é — observada em mais do que 10% das células de tumor.
Os tumores com classificações O ou 1+ para expressão do polipeptídeo CD79b podem ser caracterizados como não superexpressando CD79b, enquanto os tumores com classificações 2+ ou 3+ podem ser o caracterizados como superexpressando CD79b.
Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios FISH tal como o INFORMO (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISIONO (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido de tumor embutido em parafina, fixado com formalina para determinar a extensão (se qualquer) da superexpressão de CD79b em um tumor.
A superexpressão ou amplificação de CD79b pode ser avaliada usando ensaio de detecção in vivo, por exemplo, administrando uma molécula (tal como um anticorpo) que liga a molécula a ser detectada e é etiquetada com oe um rótulo detectável (por exemplo, um isótopo radioativo ou um rótulo fluorescente) e escaneando o paciente externamente para localização do rótulo.
Como descrito acima, o anticorpo anti-CD79bs da invenção tem várias aplicações não-terapêuticas. O anticorpo anti-CD79bs da presente invenção pode ser útil para escalação de cânceres expressando o polipeptídeo de CD79b (por exemplo, em radio formação de imagem). Os anticorpos são também úteis para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células, para detecção e quantificação de polipeptídeo de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot, para exterminar ou eliminar células expressando CD79b da população de células misturadas como uma etapa em uma purificação de outras células.
Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento de câncer envolve a ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remover um tecido canceroso, terapia de radiação, e quimioterapia. Terapia como anticorpo anti-CD79b pode ser especialmente desejável em pacientes idosos que não toleram bem a toxicidade e efeitos colaterais de quimioterapia na doença metastática onde a terapia de radiação tem utilidade limitada. O anticorpos anti-CD79bs marcando o tumor da invenção são úteis para aliviar se cânceres expressando CD79b no diagnóstico inicial da doença ou durante recaída. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-CD79b pode ser usado sozinho ou em terapia de combinação com, por exemplo, hormônios, antiangiogenes, ou compostos rotulados, ou com cirurgia, crioterapia, e/ou radioterapia. Tratamento com o anticorpo anti-CD79b pode ser administrado em conjunção com outras formas de terapia convencional, tanto consecutivamente com terapia pré- ou pós-convencional. Drogas quimioterapêuticas tal como TAXOTEREGO (docetaxel), TAXOLO (palictaxel), estramustine e mitoxantrone são usadas no tratamento de câncer, em oe particular, em pacientes em risco satisfatório. No presente método da invenção para tratar ou aliviar câncer, pode ser administrado ao paciente com câncer o anticorpo anti-cCD79b em conjunção com o tratamento com o um ou mais dos agentes quimioterápicos precedentes. Em particular, terapia de combinação com palictaxel e derivados modificados (ver, por exemplo, EPO600517) é contemplada. O anticorpo anti-CD79b será administrado com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterápico. Em outra modalidade, o anticorpo anti-cCD79b é administrado em conjunção com quimioterapia para melhorar a atividade e eficácia do agente quimioterápico, por exemplo, paclitaxel. O Physicians' Desk Reference (PDR) descreve dosagens dos agentes que são usados no tratamento de múltiplos cânceres. O regime de dosagem e as dosagens das drogas quimioterapêuticas acima mencionadas que são terapeuticamente eficazes dependerão de um câncer particular sendo tratado, da avidez da doença e de outros fatores familiares a um clínico versado na técnica e podem ser determinados por um clínico. Em uma modalidade particular, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b conjugado com o agente citotóxico é administrado a um paciente. De preferência, o imunoconjugado ligado à proteína CD79b é internalizado por uma célula, resultando em uma eficácia terapêutica oe aumentada do imunoconjugado em exterminar a célula de câncer à qual ele se liga. Em uma modalidade preferida, o agente citotóxico marca ou interfere com o ácido nucleico na célula de câncer. Exemplos de tais agentes citotóxicos são descritos acima e incluem include maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e endonucleases de DNA O anticorpo anti-CD79bs ou conjugados de toxina do mesmo são administrados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo,, como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por administração intramuscular, e intraperitoneal, intracerobroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou vias de inalação. A administração intravenosa ou — subcutânea do anticorpo é preferida.
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo anti-CD79b. A administração combinada inclui a co- administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, sendo que, de preferência, existe um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas De preferência, tal terapia de combinação resulta em um efeito terapêutico sinesgístico.
Também pode ser desejável combinar a administração do anticorpo anti-CD79b ou anticorpos, com administração de um anticorpo dirigido contra outro antígeno de tumor associado com o câncer particular. Em outra modalidade, os métodos de tratamento terapêutico da — presente invenção envolve a administração combinada de um anticorpo anti- CD79b (ou anticorpos), e um ou mais agentes quimioterápicos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo a co-administração de coquetéis de | agentes quimioterápicos diferentes, ou outro(s) agente(s) citotóxico(s) ou oe outro(s) agente(s) terapêutico(s) que também inibem o crescimento do tumor. Agentes quimioterápicos incluem fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, —S-fluorouracila, “melphalan, ciclo-fosfamida, hidroxiuréia e hidroxiureiataxanos (tal como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. Os programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo praticante da técnica. Os programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia também são também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, a Baltimore, MD (1992). O anticorpo pode ser combinado com um composto anti- e hormonal; por exemplo, um composto anti-estrogênio tal como tamoxifen; uma —anti-progesterona tal como onapristone (ver, EP 616 812); ou um anti- androgênio tal como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Quando o câncer a ser tratado é câncer independente de androgênio, o paciente pode previamente ter sido submetido a terapia com anti-androgênio e, após o câncer tornar-se independente de androgênio, o anticorpo anti-CD79b (e opcionalmente outros agentes como descritos acima) pode ser administrado ao paciente.
Algumas vezes, pode ser benéfico também co-administrar um cardioprotetor (para prevenir ou reduzir a disfunção miocardíaca associada com a terapia) ou uma ou mais citoquinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células de câncer e/ou terapia de radiação (por exemplo, terapia ou irradiação de feixe externo com agente rotulado radioativo, tal como um anticorpo), antes, simultaneamente com, ou pós-terapia com anticorpo. As dosagens apropriadas para qualquer um dos agentes co-administrados acima são as presentemente usadas e podem ser diminuídas devido a uma ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-CD79b.
oe A composição do anticorpo da invenção será formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos da invenção é presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores | discutidos acima. Estes são geralmente usados em uma mesma dosagem e com as vias de administração usadas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora. ' Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem e o modo | de administração serão escolhidos por um clínico de acordo com os critérios conhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, antes da terapia, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e da discrição do clínico atendente. O anticorpo é apropriadamente administrado a um paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. De preferência, o anticorpo é administrado intravenosamente por infusão intravenosa ou por injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 upg/kg a cerca de 50 mg/kg do peso corporal (por exemplo, cerca de 0,1- 15mg/kg/dose) do anticorpo podem ser uma dosagem candidata inicial para administração a um paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Um regime de dosagem pode compreender administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, o seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-CD79b. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais longas, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. O progresso desta terapia pode ser prontamente monitorado por métodos e ensaios convencionais e baseado em critérios conhecidos de um clínico ou outras pessoas versadas na técnica. e À parte a administração da proteína do anticorpo a um paciente, a presente aplicação contempla a administração do anticorpo por uma terapia de genes. Tal administração de ácido nucleico codificando o anticorpo é englobada pela expressão “administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo”. Ver, por exemplo, WO96/07321 publicado em 14 de março de 1996 com referência ao uso de uma terapia de genes para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens maiores para levar o ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para liberação in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no paciente, geralmente em um lado onde o anticorpo é requerido. Para tratamento ex vivo,
as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente tanto diretamente, como, por exemplo, encapsuladas nas membranas porosas que são implantadas em um paciente (ver, por exemplo, patentes U.S. Nºs.
4.892.538 e 5.283.187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido em células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas apropriadas para a transferência de o ácido nucleico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas, —eletroporação, microinjeção, fusão de células de, DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumente usado para liberação ex vivo do gene é um vetor retroviral.
As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo preferidas incluem transfecção com vetores virais (tal como adenovírus, vírus de Herpes —simplex|, ou vírus adeno associado) e sistemas baseados em lipídeo (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeos do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Para estudo dos protocolos de marcação de gene e CS terapia de gene atualmente conhecidos, ver Anderson et a/., Science 256:808- 813 (1992). Ver também WO 93/25673 e as referências citadas no mesmo.
O anticorpo anti-CD79bs da invenção pode estar em formas diferentes englobadas pela definição de “anticorpo” aqui. Assim, os anticorpos incluem anticorpo de comprimento completo ou intacto, fragmentos de anticorpo, anticorpo de sequência nativa ou variante aminoácidos, anticorpos | humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados, e fragmentos funcionais dos mesmos. Nos anticorpos de fusão, uma sequência de anticorpo é fundida a uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer funções efetoras desejadas. Como discutido em mais detalhe nas presentes seções, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu ligado sobre uma superfície de célula pode induzir pode induzir citotoxicidade, por exemplo, por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou recrutar complemento em citotoxicidade dependente de complemento.
Ou algum outro mecanismo.
Alternativamente, quando é — desejável eliminar ou reduzir a função efetora, assim como minimizar os efeitos colaterais ou complicações terapêuticas, algumas outras regiões Fc podem ser usadas.
Em uma modalidade, o anticorpo compete para ligação ou ligar-se oe substancialmente ao mesmo epítopo como os anticorpos da invenção.
Anticorpos tendo características biológicas dos presentes anticorpos anti- CD79bs da invenção também são também contemplados, especificamente incluindo a marcação de tumor in vivo e qualquer inibição de proliferação de células ou características citotóxicas.
Métodos de produzir os anticorpos acima são descritos em detalhe aqui.
Os presentes anticorpos anti-CD79bs são úteis para tratar um câncer expressando CD79b ou aliviar um ou mais sintomas de câncer em um SS mamífero.
Tal câncer inclui, mas não está limitado a, cânceres hematopoiéticos ou cânceres relacionados ao sangue, tal como linfoma, leucemia, mieloma ou —malignidades linfóides, mas, também, cânceres de baço e cânceres de nodos linfáticos.
Exemplos mais particulares de tais cânceres associados a células B, incluindo, por exemplo,linfomas de grau alto, intermediário e baixo (incluindo linfomas de células B, tal como, por exemplo, linfoma de células B de tecido linfóide associado à mucosa, e linfoma não-Hodgkin, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular, e linfoma de Hodgkin e linfomas de células T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica, tal como leucemia de células B (linfócitos CD5+ B),
leucemia mielóide, tal como leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide, tal como leucemia linfoblástica aguda), e outros cânceres hematológicos e/ou associados a células B ou células T.
Os cânceres englobam cânceres metastáticos de qualquer um os anticorpos precedentes.
O anticorpo é capaz de ligar-se a pelo menos uma porção de células de câncer que expressam polipeptídeo de CD79b no mamífero.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo é eficaz para destruir ou exterminar células de tumor expressando CD79b ou inibem o crescimento de tais células de tumor, in vitro oe ou in vivo, na ligação ao polipeptídeo de CD79b em uma célula.
Tal anticorpo inclui um anticorpo anti-CD79b nu (não conjugado a qualquer agente). Anticorpos nus que têm propriedades de inibição de crescimento de célula ou citotóxicas podem ser ainda atrelados com um agente citotóxico para tornar os mesmos ainda mais potentes na destruição de células de tumor.
As propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo anti-CD79b, por exemplo, conjugando o anticorpo com um agente citotóxico, para formar um imunoconjugado como descrito aqui.
O agente citotóxico ou o agente inibidor de crescimento é de preferência uma molécula pequena.
Toxinas tais como | caliqueamicina ou um maitansinóide e análogos ou derivados dos mesmos, são | o preferíveis.
A invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD79b da invenção, e um veículo.
Para os fins de tratar composições de câncer, as composições podem ser administradas a um paciente em necessidade de tal tratamento, sendo que a composição pode compreender um ou mais anticorpo anti-CD79bs presente como um —imunoconjugado ou como o anticorpo nu.
Em uma outra modalidade, as composições podem compreender estes anticorpos em combinação com outros agentes terapêuticos tal como agentes inibidores de crescimento ou citotóxicos.
A invenção também fornece formulações compreendendo um anticorpo anti-CD79b da invenção, e um veículo.
Em uma modalidade, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto da invenção são ácidos nucleicos isolados —codificando o anticorpo anti-CD79bs.
Ácidos nucleicos codificando ambas as cadeias H e L e especialmente os resíduos da região hipervariável, as cadeias que codificam um anticorpo de sequência nativa bem como variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo, são englobados. [ A invenção também fornece métodos úteis para tratar um câncer expressando polipeptídeo de CD79b ou aliviar um ou mais sintomas de câncer em um mamífero, compreendendo administtar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD79b a um mamífero.
As composições terapêuticas de anticorpo podem ser administradas a curto prazo (aguda) ou crônica, ou intermitente como dirigido pelo clínico.
Também fornecidos são métodos de inibir o crescimento de, e exterminar uma célula expressando polipeptídeo de CD79b.
A invenção também fornece kits e artigos de fabricação compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b.
Kits contendo o o anticorpo anti-CD79bs procura usar, por exemplo, ensaios de extermínio de células de CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células.
Por exemplo, para isolamento e purificação de CD79b, o kit pode conter um anticorpo anti-CD79b copulado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Os kits podem ser fornecidos os quais contêm os anticorpos para a detecção e quantificação de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ouum Western blot.
Tal anticorpo útil for detecção pode ser fornecido com um rótulo tal como um rótulo de rádio ou fluorescente.
TRATAMENTOS COM CONJUGADO ANTICORPO-DROGA É contemplado que os conjugados anticorpo-droga (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças ou distúrbios, por exemplo caracterizados pela superexpressão de um antígeno de tumor. As condições exemplificativos ou distúrbios hiperproliferativos incluem tumores benignos ou malignos; leucemia e malignidades linfóides. Outras incluem distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais, blastocoélicos, inflamatórios, angiogênicos e imunológicos, incluindo autoimunes.
Os compostos ADC que são identificados em modelos de animal o e ensaios baseados em células podem ainda ser testados em primadas carregando tumor e experiências clínicas humanas. As experiências clínicas humanas podem ser projetadas para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-CD79b ou imunoconjugado da invenção em pacientes experimentando um distúrbio de células B incluindo sem limitação linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto. A experiência clínica pode ser projetada para avaliar a eficácia de um ADC em combinações e com regimes terapêuticos conhecidos, tal como radiação e/ou quimioterapia — envolvendo quimioterapia e/ou agente citotóxicos conhecidos Geralmente, a doença ou distúrbio a ser tratado é uma doença hiperproliferativa tal como um distúrbio proliferativo de células B e/ou um câncer de células B. Exemplos de câncer a ser tratado aqui incluem, mas não estão limitados a, distúrbio proliferativo de células B é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkins (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente NHL, NHL refratário, NHL refratário indolente, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula
| 395 manto.
O câncer pode compreender células expressando CD79b, de tal modo que os ADC da presente invenção são capazes de ligar-se a células de câncer. Para determinar a expressão de CD79b no câncer, múltiplos ensaios de diagnóstico/prognóstico estão disponíveis. Em uma modalidade, a superexpressão de CD79b pode ser analisada por IHC. Seções de tecido de uma biopsia de tumor embutidas em parafina podem ser submetidas ao ensaio de IHC e concederam um critério de intensidade de coloração de proteína oe CD79b com respeito ao grau de coloração e em qual proporção de células de | 10 tumor examinadas.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um ADC dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se a molécula é administrada | para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e da discrição do clínico atendente. À molécula é apropriadamente administrada ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 15 mg/kg (por exemplo 0.1-20 mg/kg) da molécula é uma o dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, se, por exemplo, poruma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está na faixa de cerca de 0.1 a cerca de 10 mg/kg do peso do paciente.
Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão dos sintomas da doença desejada ocorrer. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg,
seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-ErbB2. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. J. TERAPIA DE COMBINAÇÃO Um conjugado anticorpo-droga (ADC) da invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto tendo oe propriedades anti-câncer.O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem tem, de preferência, atividades complementares ao ADC da combinação de tal modo que elas não afetam adversamente uma a outra.
O segundo composto pode ser um agente quimioterápico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor de crescimento, agente anti-hormonal, e/ou —cardioprotetor. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em | combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.Uma composição farmacêutica contendo um ADC da invenção também pode ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico tal como o um inibidor de formação de tubulina, um inibidor de topoisomerase, ou um —aglutinante de DNA.
Em um aspecto, o primeiro composto é um anti-CD79b ADC da invenção e o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 (tanto um anticorpo nu como um ADC). Em uma modalidade o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 rituximab (Rituxan&) ou 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Outros anticorpos úteis para imunoterapia combinada com anti-CD79b ADCs da invenção incluem sem limitação, anti-VEGF (por exemplo, AvastinO).
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de um agente anticâncer identificado de acordo com esta invenção, incluindo sem limitação terapia de radiação e/ou transplantes de medula óssea e do sangue periférico, e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterápico, ou um agente inibidor de crescimento.
Em uma de tais modalidades, um agente quimioterápico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hudroxudaunorubicina, adriamicinan, doxorubincina, vincristina (OncovinTY), prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêuticos tal como anti-CD20 (por exemplo, RituxanO) ou anti-VEGF (por exemplo, AvastinO). oe A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultineo ou sequencial.
Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações.
À administração combinada incluis a coadministração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, sendo que, de preferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.
Em uma modalidade, tratamento com um ADC envolve a administração combinada de um agente anticâncer identificado aqui, e um ou o mais agentes quimioterápicos ou agentes inibidores de crescimento, incluindo a coadministração de coquetéis de agentes quimioterápicos diferentes.
Os agentes quimioterápicos incluem taxanos (tal como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina.
Os programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como empiricamente determinado por um praticante.
Os programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia também são descritos em “Chemotherapy Service”, (1992) Ed., M.C.
Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Dosagens apropriadas para qualguer um dos agentes coadministrados acima são as presentemente usadas e podem ser diminuídas devido a uma ação combinada (sinergia) do agente recentemente identificado e outros agentes quimioterápicos ou tratamentos.
A terapia de combinação pode fornecer “sinergia' e prova “sinergística”, isto é, o efeito obtido quando os ingredientes ativos usados juntos é maior do que a soma de efeitos que resulta de usar os compostos separadamente.
Um efeito sinergístico pode ser obtido quando os ingredientes ativos são: (1) co-formulados e administrados ou liberados simultaneamente o em um formulação de dosagem única, combinada; (2) liberados por alternação ouem paralelo como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime.
Quando liberado em terapia de alternação, um efeito sinergístico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou liberados sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas.
Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, enquanto em terapia de combinação as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntas. e K.
ARTIGOS E KITS DE FABRICAÇÃO
Outra modalidade da invenção é um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de câncer expressando CD79b.
O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de acondicionamento em ou associados com o recipiente.
Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc.
Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico.
O recipiente retém uma composição que é eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição do câncer e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-CD79b da invenção.
O rótulo ou inserto de acondicionamento indica que a composição é usada para tratar câncer.
O rótulo ou inserto de acondicionamento — compreenderá ainda instruções para administrar a composição do anticorpo a um paciente com câncer.
Adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e oe solução de dextrose.
Ele ainda pode incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, | filtros, agulhas e seringas. | Kits também são fornecidos que são úteis para múltiplos fins, por | exemplo, para ensaios de extermínio de células expressando CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células.
Para isolamento e purificação de polipeptídeo de CD79b, o kit pode conter um | anticorpo anti-CD79b copulado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Os kits podem ser fornecidos os quais contêm os anticorpos para detecção e o quantificação de polipeptídeo de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot.
Como com o artigo de fabricação, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de acondicionamento em ou associado com o recipiente.
O recipiente retém uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção.
Recipientes adicionais podem ser incluídos que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle.
O rótulo ou inserto de acondicionamento pode fornecer uma descrição —da composição como instruções para o uso de detecção ou in vitro pretendido.
L.
Usos PARA POLIPEPTÍDEO DE CD79B8 Esta invenção engloba métodos de triagem de compostos para identificar os que imitam o polipeptídeo de CD79b (agonistas) ou previnem o
| 400 | efeito do polipeptídeo de CD79b (antagonistas). Ensaios de triagem para candidatos a droga antagonista são projetados para identificar os compostos que se ligam ou complexam com o polipeptídeo de CD79bs codificado pelos genes aqui identificados, ou de outro modo interferem com a interação de —polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares, incluindo, por exemplo, inibir a expressão de polipeptídeo de CD79b de células. Tais ensaios de triagem incluirão ensaios receptivos a triagem de alta produção de bibliotecas de produtos químicos, tornando os mesmos particularmente o apropriados para identificar candidatos à droga de molécula pequena.
Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteina-proteína, ensaios de triagem bioquímicos, imunoensaios, e ensaios baseados em célula, que são bem caracterizados na técnica.
Todos os ensaios para antagonistas são comuns em que eles chamam para contatar o candidato a droga com o polipeptídeo de CD79b codificado por um ácido nucleico identificado aqui sob condições e durante um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.
Nos ensaios de ligação, a interação é ligação e o complexo o formado pode ser isolado ou detectado em uma mistura de reação. Em uma modalidade particular, o polipeptideo de CD79b codificado por um gene identificado aqui ou um candidato a droga, é imobilizada em uma fase sólida, por exemplo,em uma placa de microtítulo, por fixações covalentes ou não- covalentes. A fixação não-covalente geralmente é realizada revestindo a superfície sólida com a solução do polipeptídeo de CD79b e secando.
—Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo de CD79b a ser imobilizado pode ser usado para ancorar o mesmo em uma superfície sólida. O ensaio é realizado adicionando um componente não-imobilizado, que pode ser rotulado por um rótulo detectável, no componente imobilizado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado.
Quando a reação está completa, os componentes não reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados em uma superfície sólida são detectados.
Quando o componente originalmente não-imobilizado conduz um rótulo detectável, a detecção do rótulo imobilizado na superfície indica que ocorreu a complexação.
Quando o componente originalmente não-imobilizado não conduz um rótulo, a complexação pode ser detectada, por exemplo,usando um anticorpo rotulado o especificamente ligando o complexo imobilizado. | Se o composto candidato interage com, mas não se liga a um | polipeptídeo de CD79b particular codificado por um gene identificado aqui, sua interação com esse polipeptídeo pode ser ensaiada por métodos bem conhecidos para detectar interações proteina-proteína.
Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tal como, por exemplo, reticulação, co- imunoprecipitação, e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas.
Além disso, as interações proteina-proteina podem ser monitoradas usando um sistema genético baseado em levedura descrito por oe Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et a/., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 88:9578-9582 (1991)) como descrito por Chevray e Nathans, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores de transcrição, tal como levedura GALA, consistem de dois domínios modulares fisicamente discretos, um agindo como o domínio de ligação de DNA, o outro funcionando como o domínio de ativação de transcrição.
O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações acima (geralmente referidos como o "sistema de dois híbridos ") leva vantagem desta propriedade e empresa proteínas de dois híbridos, um em que a proteína de marcação é fundida a um domínio de ligação de GALA, e o outro, em proteínas de ativação candidatas são fundidas em um domínio de ativação..A expressão de um gene repórter GAL1-lacZ sob o controle de um promotor ativado com GALA4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 pela interação proteína-proteína.
Colônias contendo polipeptídeos interagindo são detectadas com um substrato quimérico para B-galactosidase.
Um kit completo (MATCHMAKERT”) para identificar interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando uma técnica de dois híbridos é comercialmente disponível de Clontech.
Este sistema também pode ser estendido para mapear domínios de proteína envolvidos em interações de proteína específicas bem oe como para apontar com precisão aminoácidos e resíduos que são cruciais para asinterações.
Compostos que interferem com a interação de um gene codificando um polipeptídeo de CD79b identificado aqui e outros componentes | intra- ou extracelulares podem ser testados como a seguir: geralmente uma | mistura de reação é preparada contendo o produto do gene e o componente | intra- ou extracelular sob condições e durante um tempo permitindo a interação | e ligação de dois produtos.
Para testar a capacidade de um composto | candidato para inibir ligação, a reação é realizada em uma ausência ou | presença do composto de teste.
Além disso, um placebo pode ser adicionado a o uma terceira mistura de reação, para servir como controle positivo.
A ligação entre (formação de complexo) o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente em uma mistura é monitorada como descrito acima.. À formação de um complexo em reação(ões) de controle, mas não em uma mistura de reação contendo o composto de teste, indica que o composto de teste interfere com o interação do composto de teste e seu parceiro de reação.
Para testar antagonistas, o polipeptíideo de CD79b pode ser adicionado a uma célula junto com o composto a ser triado para uma atividade particular e a capacidade do composto para inibir a atividade de interesse na presença do polipeptídeo de CD79b indica que o composto é um antagonista
| | 403 para um polipeptídeo de CD79b.
Alternativamente, os antagonistas podem ser detectados combinando o polipeptídeo de CD79b e um antagonista potencial com receptores de polipeptídeo de CD79b ligados à membrana em condições apropriadas para um ensaio de inibição competivivo.
O polipeptídeo de CD79b pode ser rotulado, tal como por radioatividade, de tal modo que o número de moléculas de polipeptídeo de CD79b ligadas a um receptor pode ser usado para determinar a eficácia antagonista do potencial.
O gene codificando o receptor pode ser identificado por numerosos métodos conhecidos dos oe versados na técnica, por exemplo, bateia de ligantes e classificação FACS.
Coligan et al, Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). De preferência, a clonagem de expressão é empregada sendo que o RNA poliadenilado RNA é preparado a partir de uma célula respondente a um polipeptídeo de CD79b e uma biblioteca de cDNA criada deste RNA é dividida em reservatórios e usada para transfectar células COS ou outras células que são cultivadas em lâminas de vidro que não são respondentes para um polipeptídeo de CD79b.
Células transfectadas que são cultivadas em lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo de CD79b rotulado.
O polipeptídeo de CD79b pode ser rotulado por uma variedade de meios incluindo iodação ou o inclusão de um sítio de reconhecimento para uma cinase de proteína específica do sítio.
Após fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise autorradiográfica.
Reservatórios positivos são identificados e sub-reservatórios | são preparados e re- transfectados usando um processo de re-triagem de sub- | reservatório interativo eventualmente rendendo um clone único que codifica o | receptor putativo. | Como uma abordagem alternativa para identificação de receptor, | o polipeptídeo de CD79b rotulado pode ser ligado por foto-afinidade com | membrana de células ou preparações de extratos que expressam a molécula receptora.
O material reticulado é decomposto por PAGE e exposto a um filme de.
O complexo rotulado contendo o receptor pode ser excisado, decomposto em fragmentos de peptídeo, e submetido a micro-sequenciamento de proteína.
A sequência de aminoácidos do micro-sequenciamento poderia ser para designar um conjunto de sondas de oligonucleotídeo degeneradas para triar uma bibliotecade cDNA para identificar o gene codificando o receptor putativo.
Em outro ensaio para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação de membrana expressando o receptor seriam incubadas com polipeptídeo de CD79b rotulado na presença do composto candidato.
À oe capacidade do composto melhorar ou bloquear sua interação pode não ser medida.
Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluem um oligonucleotídeo que se liga a fusões de imunoglobulina com polipeptídeo de CD79b, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonal e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia única, | anticorpos anti-idiotípicos, e versões humanizadas ou quiméricas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo.
Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma proteína | intimamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipeptídeo de | o CD79b que reconhece o receptor, mas não confere nenhum efeito, desse modo inibindo competitivamente a ação do polipeptídeo de CD79b.
Anticorpos ligando especificamente um polipeptídeo de CD79b identificado aqui, bem como outras moléculas identificas pelos ensaios de triagem descritos acima, podem ser administrados para um tratamento de | múltiplos distúrbios, incluindo câncer, na forma de composições farmacêuticas.
Se o polipeptídeo de CD79b é intracelular e anticorpos totais são usados como inibidores, anticorpos internalizantes são preferidos.
No entanto, lipofecções ou lipossomas também podem ser usadas para liberar o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, nas células.
Quando os fragmentos de anticorpo
| | | são usados, o menor fragmento inibitório que se liga especificamente a um | domínio de ligação da proteína de marcação é preferido.
Por exemplo, baseado em sequências de região variável de um anticorpo, moléculas de peptídeo podem ser projetadas, as quais retêm a capacidade de ligar a sequência de | 5 proteina de marcação.
Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente | e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante.
Ver, por exemplo, | Marasco et a/., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 90: 7889-7893 (1993). | A presente formulação também pode conter mais do que um oe composto ativo, como necessário, para uma indicação particular sendo tratada, de preferência os com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro.
Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente que melhora sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citoquina, agente quimioterápico, ou agente inibidor de crescimento.
Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
M.
DERIVADOS DE ANTICORPO Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na o técnica e prontamente disponíveis.
De preferência, as porções apropriadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água.
Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copoliímero de anidrido de etileno/maléico, —poliaminoácidos (tanto homopolimeros como copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopoliímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos MC Cp «qsqa——
mesmos.
Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água.
O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramiíificado.
O número de polímeros fixados a um anticorpo pode variar, e se mais do que um polímero é fixado, —elespodem ser moléculas iguais ou diferentes.
Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado baseado em considerações incluindo, mas não limitadas a, propriedades particulares ou funções do anticorpo a serem aperfeiçoadas, se o derivado de anticorpo será | oe usado em uma terapia sob condições definidas, etc. | 10 N.
MÉTODO DE TRIAGEM | Ainda outra modalidade da presente invenção é dirigida a um método de determinar a presença de um polipeptídeo de CD79b em uma | amostra suspeita de conter o polipeptíideo de CD79b, sendo que o método compreende expor a amostra a um conjugado anticorpo-droga do mesmo,que seligaa um polipeptíideo de CD79b e determinar a ligação do conjugado anticorpo-droga do mesmo, ao polipeptídeo de CD79b em uma amostra, sendo | que a presença de tal ligação é indicativa da presença do polipeptídeo de | CD79b na amostra.
Opcionalmente, a amostra pode conter células (que podem o ser células de câncer) suspeitas de expressar o polipeptídeo de CD79b.
O conjugado anticorpo-droga do mesmo, , empregado em um método pode | o opcionalmente ser rotulado detectavelmente, fixado a um suporte sólido, ou | outros. | Outra modalidade da presente invenção é dirigida a um método de diagnosticar a presença de um tumor em um mamífero, sendo que o método — compreende (a) contatar uma amostra de teste compreendendo células de tecido obtidas de um mamífero com um conjugado anticorpo-droga das mesmas, que se liga a um polipeptídeo de CD79b e (b) detectar a formação de um complexo entre o conjugado anticorpo-droga do mesmo, e o polipeptídeo de CD79b em uma amostra de teste, sendo que a formação de um complexo é indicativo da presença de um tumor em um mamífero. Opcionalmente, o conjugado anticorpo-droga do mesmo, é rotulado detectavelmente, fixado a um suporte sólido, ou outros, e/ou a amostra de teste de células de tecido é obtida deum indivíduo suspeito de ter um tumor canceroso. IV. — Outros Métodos De Usar Anticorpo Anti-Cd79b E Imunoconjugados A. Métodos De Diagnóstico E Métodos De Detecção Em um aspecto, o anticorpo anti-CD79bs e imunoconjugados da oe invenção são úteis para detectar a presença de CD79b em uma amostra biológica. O termo “detectar” como usado aqui engloba a detecção quantitativa e qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em certas modalidades, tais tecidos incluem tecidos normais e/ou canceroso que expressam CD79b em níveis mais altos com relação a outros tecidos, por exemplo, células B células e/ou tecidos associados a célulasB.
Em um aspecto, a invenção fornece a método de detectar a presença de CD79b em um amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende contatar a amostra biológica com um anticorpo anti- o CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a —CD79b, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de diagnosticar um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o método compreende contatar uma célula de teste com um — anticorpo anti-CD79b; determinar o nível de expressão (tanto quantitativamente como qualitativamente) de CD79b por uma célula de teste detectando a ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b; e comparar o nível de expressão de CD79b pela célula de teste com o nível de expressão de CD79b por uma célula de controle (por exemplo, uma célula normal da mesma origem de tecido como a célula de teste ou uma célula que expressa CD79b em níveis comparáveis a tal célula normal), sendo que um nível de expressão de CD79b mais alto pela célula de teste como comparado a uma célula de controle indica a presença de um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, a célula de teste é obtida de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo de células, tal como um e câncer ou um tumor.
Distúrbios proliferativos de células exemplificativos que podem ser diagnosticados usando um anticorpo da invenção incluem um distúrbio de células B e/ou a distúrbio proliferativo de células B incluindo, mas não limitados a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula manto.
Em certas modalidades, um método de diagnóstico ou de o detecção, tal como os descritos acima, compreende detectar a ligação de um — anticorpo anti-cCD79b a CD79b expressado sobre a superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida de uma célula expressando CD79b sobre sua superfície. Em certas modalidades, o método compreende contatar uma célula com um anticorpo anti-CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b sobre a superfície de célula.
Um ensaio exemplar para detectar a ligação de um anticorpo anti-CD79b a | CD79b expressado sobre a superfície de uma célula é o “ensaio FACS”.
Certos outros métodos podem ser usados para detectar a ligação |
EN do anticorpo anti-CD79bs a CD79b. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação de antígeno que são bem conhecidos na técnica, tal como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a ensaio), imunoensaios em “sanduíche”, ensaios de — imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes,imunoensaios de proteína A, e imuno-histoquímica (IHC). Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD79b são rotulados. Os rótulos incluem, mas não estão limitados a, rótulos ou porções que são e diretamente detectadas (tais como rótulos fluorescentes, cromofóricos, densos de elétron, quimioluminescentes, e radioativos), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são indiretamente detectados, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Rótulos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, radioisótopos *ºP, “c, 1281, 3H, e 9º, fluoróforos tais como quelatos de terra rata ou fluoresceína e seus derivados, —rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (Pat. U.S. Nº. 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de raiz forete (HRP), fosfatase alcalinay B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases de o sacarídeos, por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose, e glicose-6- fosfato deidrogenase, oxidases heterocíclicas tal como oxidase de uricase e xantina, copulados com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, rótulos giratórios, rótulos de bacteriofagos, radicais livres estáveis, e outros.
Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD79b são imobilizados em uma matriz insolúvel. A imobilização acarreta separar o anticorpo anti-CD79b de qualquer CD79b que permanece livre em solução. Isto é convencionalmente realizado tanto insolubizando o anticorpo anti-CD79b antes do procedimento do ensaio, como por adsorção em uma matriz insolúvel em água ou superfície (Bennich et al/.., U.S. 3.720.760), ou copulação covalente (por exemplo, usando reticulação de glutaraldeído), ou insolubilizando o anticorpo anti-CD79b após formação de um complexo entre o — anticorpo anti-CD79b e CD79b, por exemplo, por imunoprecipitação.
Qualquer uma das modalidades de diagnóstico ou detecção acima pode ser realizada usando um imunoconjugado da invenção em lugar de ou além da adição de um anticorpo anti-CD79b.
oe B. MÉTODOS TERAPÊUTICOS Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser usado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo, e in vivo. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento ou proliferação de células, tanto in vivo como in vitro, o método compreendendo expor uma célula a um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b. “Inibir o crescimento ou proliferação de células” significa diminuir um crescimento ou proliferação de células em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100%, e inclui induzir a morte de células.. Em certas o modalidades, a célula é uma célula de tumor. Em certas modalidades, a célula é uma célula B. Em certas modalidades, a célula é um xenoenxerto, por exemplo, como exemplificado aqui.
Em um aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é usado para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de células B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células é associado com a expressão e/ou atividade de CD79b aumentada. Por exemplo, em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células B é associado com a expressão de CD79b aumentada sobre a superfície de uma célula B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células B é um tumor ou um câncer. Exemplos de
" | 411 distúrbios proliferativos de células B a serem tratados pelos anticorpos ou imunoconjugados da invenção incluem, mas não estão limitados a, linfoma, | linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula manto. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar um o distúrbio proliferativo de células B compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo. Em certas modalidades, um método para tratar um distúrbio proliferativo de células B compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um | anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado anti-CD79b e, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os fornecidos abaixo. Em certas modalidades, um método para tratar um distúrbio proliferativo de células compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação — farmacêutica — compreendendo — 1) um imunoconjugado o compreendendo um anticorpo anti-CD79b e um agente citotóxico; e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os fornecidos abaixo. Em um aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ligar CD79b de outras espécies diferentes de humanos. Consequentemente, anticorpos ou imunoconjugados dainvenção podem ser usados para ligarCD79b, por exemplo, em uma cultura de células contendo CD79b, em humanos, ou em outros mamíferos tendo um CD79b com a qual um anticorpo ou imunoconjugado da invenção reticula (por exemplo, macacos chimpanzé, babuíno, sagui, cynomolgus e resus, porco ou
AAA camundongo) Em uma modalidade um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser usado para marcar CD79b em células B contatando o anticorpo ou imunoconjugado com CD79b para formar um anticorpo ou | complexo imunoconjugado-antígeno, de tal modo que uma citotoxina | conjugada do imunoconjugado acessa o interior da célula Em uma | modalidade, o CD79b é CD79b humano. | Em uma modalidade um anticorpo ant-CD79b ou | imunoconjugado pode ser usado em um método para ligar CD79b em um | oe individual sofrendo de um distúrbio associado com a expressão e/ou atividade de CD79b aumentada, o método compreendendo administrar ao indivíduo o anticorpo ou imunoconjugado tal que CD79b no indivíduo é ligado.
Em uma modalidade, o anticorpo ou imunoconjugado ligado é internalizado em CD79b expressando células B.
Em uma modalidade, o CD79b é CD79b humano, e o indivíduo é um indivíduo humano.
Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero expressando CD79b ao qual um anti-CD79b se liga.
Ainda outro indivíduo pode ser um mamífero em cujo CD79b é introduzido (por exemplo, por administração de CD79b ou por expressão de um transgene codificando CD79b). o Um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um humano para fins terapêuticos.
Além disso, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um mamífero não humano expressando CD79b com o qual o anticorpo reticula (por exemplo, um primata, porco, rato, ou camundongo) para fins veterinários ou como um modelo de animal de doença humana.Com referência ao último, tais modelos de animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção (por exemplo, teste de dosagens e cursos de tempo de administração). Anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados
O DN o E DM a | 413 tanto sozinhos como em combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser co- | administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional é um agente citotóxico, um agente quimioterápico, ou um agente inibidor de crescimento. Em uma destas modalidades, um agente quimioterápico é um agente ou combinações de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubincina, vincristina (OncovinT“Y), oe prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêutico tais como anti-CD20 (por exemplo, RituxanO) ou anti-VEGF (por exemplo, AvastinO), sendo que a terapia de combinação é útil no tratamento de cânceres e/ou distúrbios de células B tais como distúrbios proliferativos de células B incluindo linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto. Tais terapias de combinação indicadas acima englobam o administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas formulações ou em separado), e a administração separada, caso em que, a administração do anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após administração do agente terapêutico adicional! e/ou adjuvante Os anticorpos Ou imunoconjugados da invenção também podem ser usados em combinação com terapiade radiação. Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional ou adjuvante) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e
CNN
DO EA Ro Pa DN | | na | intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem a administração intramuscular, intravenosa, | intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o anticorpo ou imunoconjugado é apropriadamente administrado por infusão de pulso, — particularmente com doses declinantes do anticorpo ou imunoconjugado. A dosagem pode ser por qualquer via apropriada, por exemplo por injeções, tal como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica. oe Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser formulados. Dosados e administrados de um modo consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, ou sítio de liberação do agente, o | método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. O anticorpo ou imunoconjugado não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo | | o ou imunoconjugado presentes em uma formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estas são geralmente usadas | nas mesmas dosagens e com vias de administração como descrito aqui, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que é empiricamente/clinicamente determinada ser apropriada. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais, tal como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo ou imunoconjugado, da gravidade e curso
CCC da doença, se o anticorpo ou imunoconjugado é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo ou imunoconjugado, e da discrição do clínico atendente.
O anticorpo ou imunoconjugado é apropriadamente administrado a um paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg (por exemplo 0.1mg/kg-20mg/kg) de anticorpo ou imunoconjugado podem ser uma dosagem candidata inicial para administração a um paciente, se, oe por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua.
Uma dosagem diária típica na faixa de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.
Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode geralmente ser sustentado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer Uma dosagem exemplar de anticorpo ou imunoconjugado pode estar em uma faixa de cerca de 0.05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.
Assim, uma ou mais doses de cerca de 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) de anticorpo ou imunoconjugado pode ser administrada a um o paciente.
Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo toda semana ou de três em três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo cerca de seis doses de anticorpo ou imunoconjugado). Uma dose de carga inicial mais alta, seguidas por uma ou mais doses mais baixas pode ser administrada.
Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo.
No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis.
O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
C. ENSAIOS DE ATIVIDADE Os anticorpos anti-CD79b e imunoconjugados da invenção podem ser caracterizados por suas propriedades físico/químicas e/ou atividades biológicas por múltiplos ensaios conhecidos em uma técnica.
1. ENSAIOS DE ATIVIDADE Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos anti-CD79b ou imunoconjugados dos mesmos tendo atividade biológica. À atividade biológica pode incluir, por exemplo, a capacidade de inibir o oe crescimento ou proliferação de células (por exemplo, atividade de “extermínio de células”), ou a capacidade de induzir a morte de células, incluindo morte de células programada (apoptose). Os anticorpos ou imunoconjugados tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro são também fornecidos. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado dôo mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação de células in vitro. Ensaios para inibição do crescimento e proliferação de células também são bem conhecidos em uma técnica. Certos ensaios para proliferação de células, exemplificados pelos ensaios de “extermínio de células” descritos aquil, medem a viabilidade o celular.. Um destes ensaios é o CeliTiter-Glo'"" Luminescent Cell Viability Ensaio, que está comercialmente disponível de Promega (Madison, WI). Esse ensaio determina o número de células viáveis em uma cultura baseada na quantificação de ATP presente, que é uma indicação de células metabolicamente ativas. Ver Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, pat. Pat. Nº. 6602677. O ensaio pode ser conduzido em formato de 96 ou 384 reservatórios, tornando o mesmo receptivo para triagem de alta produção automática (HTS). Ver Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. O procedimento de ensaio envolve adicionar um reagente único (CellTiter-Glo? Reagent) diretamente às células cultivadas. Este resultado em lise de células e a geração de um sinal luminescente produzido por uma reação de luciferase. O sinal luminescente é proporcional a uma quantidade de ATP presente, que é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes na cultura. Os dados podem ser registrados por câmera de luminômetro ou dispositivo de formação de imagem em câmera CCD. A produção de luminescência é expressada como unidades relativamente claras (RLU).
Outro ensaio para proliferação de células é o ensaio “MTT”, a ensaio colorimétrico que mede a oxidação de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazo|-2- o iI)-2,5-difeniltetrazóleo para formazan por redutase mitocondria. Como o ensaio CeliTiter-Glo"", este ensaio indica o número de células metabolicamente ativas presentes em uma cultura de célula. Ver, por exemplo, Mosmann (1983) J.
Immunol. Meth. 65:55-63, e Zhang et a/. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882. Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de induzir a morte de células in vitro. Ensaios para indução de morte de células são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, estes ensaios medem, por exemplo, a perda de integridade da membrana como indicado por absorção de iodeto de propídio (PI), trypan blue (ver, Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), ou 7AAD. Em um ensaio de absorção o de células PI exemplar, as células são cultivadas em meio Eagle modificado com Dubelcco (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) suplementado com 10% FBS inativado com calor (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Assim, o ensaio é realizado na ausência de complemento e células efetoras imunes. são semeadas em uma densidade de 3 x 10º por prato em pratos de 100 x 20 mm e deixadas fixar durante a noite. O meio é removido e substituído com meio novo sozinho ou meio contendo várias concentrações do anticorpo ou imunoconjugado. As células são incubadas durante um período de tempo de 3 dias. Após o tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a
4ºC, a pelota é recolocada em suspensão in 3 m de tampão de ligação de Ca?** frio e (10 MM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl7) e aliquotadas em tubos de 12 x 75 mm cobertos com coadores de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupos de tratamento) para remoção de grumos de células. Tubos recebem PI (10 ug/ml): As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN'Y e software FACSCONVERT'Y CellQuest (Becton Dickinson). Anticorpos ou imunoconjugados que incluem níveis estatisticamente significativos de morte de células, como determinado por absorção de PI, são ) assim identificados.
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado é testado para sua capacidade de induzir apoptose (morte de células programada) in vitro. Um ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é um ensaio de ligação a anexina. Em um ensaio de anexina exemplar, as células são cultivadas e semeadas em pratos, como discutido no parágrafo precedente. O meio é removido e substituído com meio novo sozinho ou meio contendo 0,001 to 10 ugml do anticorpo ou imunoconjugado. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As o células são então centrifugadas, recolocadas em suspensão em tampão de ligação de Ca”, e aliquotadas em tubos, como discutido no parágrafo precedente. Os tubos então recebem anexina rotulada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 ug/ml). As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN'Y e um software FACSCONVERT'!Y CellQuest (BD Biosciences). Anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são assim identificados. Outro ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é o ensaio colorimétrico de ELISA de DNA com histona para | detectar degradação internucleossomal de DNA genômico. Tal ensaio pode ser realizado usando, por exemplo, o kit ELISA de detecção de morte de células (Roche, Palo Alto, CA).
Células para uso em qualquer dos ensaios in vitro acima incluem células ou linhagens de células que expressam naturalmente CD79b ou que são engenheiradas para expressar CD79b. Tais células incluem células de tumor que superexpressam CD79b com relação a células normais da mesma origem de tecido. Tais células também incluem linhagens de células (incluindo linhagens de células de tumor) que expressam CD79b e linhagens de células o que não expressam normalmente CD79b, mas são transfectadas com ácido —nucleico codificando CD79b.
Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação dede células in vivo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento de tumor in vivo. Sistemas de modelo in vivo, tal como modelos de xenoenxertos, podem ser usados para tal teste em um sistema de xenoenxerto exemplar, células de tumor humanas são introduzidas em um animal não- humano apropriadamente imunocomprometido, por exemplo, um camundongo o SCID. Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é administrado a um animal. A capacidade do anticorpo ou imunoconjugado para inibir ou diminuir o crescimento de tumor é medida. Em certas modalidades do sistema de xenoenxerto acima, as células de tumor humanas são células de tumor de um paciente humano. Tais células úteis para preparar modelos de enxerto para preparar xenoenxertos incluem linhagens de células de leucemia humana e de linfoma, que incluem, sem limitação as células BJAB-luc (uma linhagem de células de linfoma de Burkitt negativas para EBV transfectada com o gene repórter de luciferase), células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923), células SuDHL-4 (DSMZ, Braunschweig, Germany, AAC 495), células DoHH2 mm A EE PEER RE EREREEE Etottto o âj>»E DO» EE E EE EE » >D» » » » x.;»BPIP DI IE E AE O O O O AE o DO A 420 (ver Kluin-Neilemans, H.C. et al, Leukemia 5:221-224 (1991), e Kluin- Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8:1385-1391 (1994)), células Granta-519 (ver Jadayel, D.M. et al, Leukemia 11(1):64-72 (1997)). Em certas modalidades, as | células de tumor humanas são introduzidas em um animal não humano apropriadamente imunocomprometido por injeção subcutânea ou por transplantação em um sítio apropriado, tal como uma almofada de gordura mamária.
2. LIGAÇÃO ENSAIOS E OUTROS ENSAIOS oe Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de ligação a antígeno. Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de ligar-se a CD79b expressado sobre a superfície de uma célula. Um ensaio FACS pode ser usado para tal testagem. Em um aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo monoclonal que compete com anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79b.vi7 humanizado e/ou anticorpo MAZ79b.vi8 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado para ligação a CD79b. Em certas modalidades, tal anticorpo de competição liga-se o ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional de murino) que é ligado pelo anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79bv.17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.vI8 humanizado e/ou MAZ79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado. Ensaios de competição exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de rotina tal como os fornecidos em Harlow e Lane (1988) Anticorpos: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epítopo Mapping Protocols," in Métodos in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dois anticorpos são RERR—
citados para ligar-se a um mesmo epítopo se cada um bloqueia a ligação ao outro por 50% ou mais.
Em um ensaio de competição exemplar, CD79b mobilizado é incubado em um solução compreendendo um primeiro anticorpo rotulado que se lgaa CD79b (por exemplo, anticorpo MAT9b de murino, anticorpo MA79b.vi7 humanizado e/ou anticorpo MA79b.vi8 humanizado e/ou MAZ79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado) e o segundo anticorpo não rotulado que está sendo testado para sua capacidade de competir com o oe primeiro anticorpo para ligação a CD79b.
Um segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma.
Como um controle, CD79b | imobilizado é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo | rotulado, mas não o segundo anticorpo rotulado.
Após incubação sob | condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a CD79b, excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de rótulo associado com —CD79b imobilizado é medida.
Se a quantidade de rótulo associada com CD79b imobilizado é substancialmente reduzida em uma amostra de teste com relação a uma amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação a CD79b.
Em certas o modalidades, CD79b humanizado está presente sobre a superfície de uma —célulaouem uma preparação de membrana obtida de uma célula expressando CD79b em sua superfície.
Em um aspecto, anticorpos anti-CD79b purificados podem ser ainda caracterizados por uma série de ensaios, incluindo mas não limitados a, sequenciamento N-terminal, análise e aminoácidos, cromatografia líquida de —altapressão por exclusão de tamanho desnaturante (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão de papaína.
Em uma modalidade, a invenção contempla um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas as funções, que tornam o mesmo um | | candidato desejável para muitas aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (tal como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais.
Em certas modalidades, as atividades de Fc do anticorpo são medidas para assegurar que somente as — propriedades desejadas são mantidas.
Ensaios citotóxicos in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/ depleção de atividades e | CDC e/ou de ADCC.
Por exemplo, ensaios de ligação do receptor de Fc (FcR) | podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo é desprovido de ligação | oe FcyR ligação (portanto, atividade provavelmente desprovida de ADCC), mas | retém capacidade de ligação a FcRn.
As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam Fc (RIll somente, enquanto os monócitos expressam FCc(RI, Fe(RII e Fc(RIl.
A expressão de FCcR células hematopoiéticas é resumida na tabela 3 na página 4640n de Ravetch e Kinet, Annu.
Rev.
Immunol. 9:457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro ensaio para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na patente U.S.
Nº. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e Natural células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a o atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo de animal tal como o descrito em Clynes et al.
PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1iq também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é capaz de ligar Ciq e, portanto, atividade sem CDC.
Para avaliar a ativação complementar, um ensaio de CDC, por exemplo como descrito in Gazzano-Santoro et al., J.
Inmunol.
Métodos 202:163 (1996), pode ser realizado.
A ligação a FCcRn e determinações de apuração in vivo /meia vida também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica.
Os seguintes exemplos são oferecidos para fins ilustrativos
' somente, e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de modo | algum. | Todas as referências de patentes e literatura citadas no presente | relatório descritivo são aqui incorporados por referência em sua totalidade. | EXEMPLOS ' Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado ao contrário.
Anticorpos usados nos exemplos incluem anticorpos oe comercialmente disponíveis, mas não estão limitados a, anti-CD79b (anticorpo adquirido de Biomeda (Foster City, CA) ou BDbioscience (San Diego, CA) ou Ancell (Bayport, MN)), anti-CD79b (gerado de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993), e anticorpo anti-CD79bs quimérico (compreendendo domínios variáveis de anticorpos gerados de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993). A fonte destas células identificadas nos seguintes exemplos, e por todo o relatório descritivo, por números de acesso de ATCC, é o American Type Cultura Collection, Manassas, VA.
EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B8 HUMANIZADO e Os números de resíduos estão de acordo com Kabat (Kabat et al., —Sequences of proteínas of immunological interest, Sth Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Abreviações de aminoácido de letra única são usadas.
Degenerações de DNA são representadas usando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= CIG/T, H= A/C/T, K= G/T, M= A/C, R= A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T). A.
ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD798 HUMANIZADO Múltiplos anticorpos anti-CD79b humanizados foram gerados.
Os domínios VL e VH de anticorpo MA79b (MA79b) de murino (Roswell Park Cancer Institute; Okazaki et al., Blood, 81:84-94 (1993)) foram alinhados
E ai MN O O MR | 424 | domínios | VL de kappa | de consenso humano (huKl) e VH de consenso de subgrupo Il! humano (hull!). Para fazer o enxerto de HVR, usou-se a estrutura de FH aceptora, que difere de um domínio VH de consenso de subgrupo |! humano em 3 posições: R71A, N73T, e L78A (Carter et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci USA 89:4285 (1992)). Regiões hipervariáveis de murino MA79b (MA79b) foram engenheiradas em uma estrutura de consenso humana aceptora para gerar um enxerto de HVR direto de MA79b (aqui referido como “enxerto de MA?79b” ou “enxerto de MA79b” ou “anticorpo “humanizado” enxertado com o MA?79b” ou “enxerto de huMA79b”). No domínio VL, as seguintes regiões foram enxertadas a um aceptora de consenso humano: posições 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) (figuras 7A-B). No domínio VH, posições 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas (figuras 8A-B). MacCallum et al. (MacCallum et al., J.
Mol.
Biol., 262: 732-745 (1996)) analisaram as estruturas de cristal do complexo anticorpo e antígeno e verificaram que as posições 49, 93 e 94 de cadeia pesada são parte da região de contato e são, assim, incluídas na definição de HVR-H2 e HVR-H3 quando humanizando anticorpos.
A variante enxerto direto (enxerto de huMA7Z9b) foi gerada por mutagênese de Kunkel, tanto como o Fab exibido em um fago e como um IgG, o usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável.
Os clones corretos foram avaliados por sequenciamento de DNA.
B.
VARIANTES DE ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD79B8 HUMANIZADO Variantes de enxerto de anticorpo anti-CD79b que incluíram diversidade mutacional nas regiões hipervariáveis do anticorpo “humanizado” MA?79b enxertado foram geradas usando bibliotecas de fagos.
As variantes de —enxertode anticorpo anti-CD79b incluíram tanto uma variação de posição única no HVRs (figura 9) como variações de posição múltiplas no HVRs (figura 10). C.
SELEÇÃO DE FAGOS Para seleção de fagos, o domínio extracelular de CD79b
(huCbD79bea) (2 upolml) foi imobilizado em PBS em placas de microtituloMaxiSorp (Nunc) durante a noite a 4ºC.
As placas foram bloqueadas durante pelo menos 1 h usando Casein Blocker (Pierce). Os fagos foram coletados do sobrenadante de cultura e colocados em suspensão em PBS — contendo 0,5% de BSA e 0,05% de Tween 20 (PBSBT). Após a adição da biblioteca de fagos e seleção de fagos durante 2 h, os reservatórios de microtítulo foram extensivamente lavados com PBS PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) para remover fagos não ligados e fagos ligados foram oe eluídos incubando os reservatórios com 100 mM HCl durante 30 min.
A estringência de seleção pode ser aumentada durante ciclos sucessivos de seleção aumentando o número de lavagens com PBST ou incubando com huCD79beca solúvel durante períodos de tempo crescentes antes da eluição.
Os fagos eluídos foram neutralizados com 1 M Tris, pH 8 e amplificados usando células XL1-Blue e fagos auxiliares M13/KO7 e cultivados durante a noite a 37 ºC in 2YT, 50 pg/ml carbenacilina.
Os títulos de fagos eluídos de um reservatório contendo a marcação foram comparados a títulos de fagos recuperados de um reservatório não contendo marcação para enriquecimento da avaliação. o D.
PRoDUÇÃO DE FAB E PRODUÇÃO DE IGG Para expressar proteína de Fab para medições de afinidade, um códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e 93 em um vetor de exibição de fagos.
Os clones foram transformados em células de E. coli 34B8 e cultivados em meios completos C.R.A.P. media a 30ºC (Presta et al.
Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). As células foram coletadas por centrifugação, — colocadas em suspensão em PBS, 100 uM PMSF, 100uM benzamidina, 2,4 mM EDTA e rompidas abertas usando um microfluidizador.
Fab foi purificado com cromatografia de afinidade de proteina G.
Para fins de triagem, variantes de IgG foram inicialmente
| 426 produzidas em 293 células. Vetores codificando VL e VH (25 ug) foram transfectados em 293 células usando o sistema FuGene. 500 ul de FuGene foram misturados com 4,5 ml de meio DMEM não contendo nenhum FBS e incubados em temperatura ambiente durante 5 min. Cada cadeia (25 ug) foi adicionada a esta mistura e incubada em temperatura ambiente durante 20 min e então transferidos para um frasco para transfecção durante a noite a 37ºC em 5% de CO. No dia seguinte, o meio contendo a mistura de transfecção mistura foi removido e substituído com 23 ml! de meio PS04 com 0,1 ml/L de ) elementos traço (A0934) e 10 mg/L de insulina (AO940). As células foram incubadas durante mais 5 dias após o que o meio foi coletado a 1000 rpm durante 5 min e filtrado estéril usando um filtro de ligação de proteína de 0.22 um As amostras podem ser armazenadas a 4ºC após a adição de 2,5 ml de PMSF a 0,1% PMSF para cada 125 ml de meio.
E. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE) Para determinação de afinidade de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b, o domínio extracelular de CD79b humano (huCD79beca) foi expressado em células CHO sozinhas ou como uma fusão de Fc (huCD79bec-Fc) e purificada por meios convencionais. Além disso, o um peptídeo de 16 aminoácidos (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16) contendo um epítopo para MAZ9b foi sintetizado por meios convencionais.
A caracterização do epítopo para o anticorpo MA79b (rotulado como “peptídeo de teste” na figura 19) foi previamente descrita no Pedido US Nº. 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006. O epítopo para MA79b estava localizado em na região de peptídeo extracelular peptídeo distal ao — domínio de transmembrana e estava presente em um comprimento completo e formas truncadas de CD79b humano (Cragg, Blood, 100(9): 3068-76 (2002)), que são descritas em células B normais e malignas (Hashimoto, S. et al., Mol. Immunol., 32(9): 651-9 (1995); Alfarano et al., Blood, 93(7): 2327-35 (1999)). À
| 427 forma truncada de CD79b é desprovida do domínio como Ig extracelular (o domínio como Ig extracelular que não está presente em uma truncada | emendada de CD79b é mostrada em caixas na figura 19). A ligação de variantes de Fab e IgG de MAZ79b, o anticorpo “humanizado” enxertado como MA79b ou as variantes do anticorpo | “humanizado” enxertado com MA79b em huCD79beda ou huCD79b-Fe | | imobilizado ou o peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo for MA79b foi | | medido por ressonância plasmática de superfície.
As determinações de | [À afinidade foram realizadas por ressonância de plasmon de superfície usando um BlAcore"Y-2000. O antígeno, huCD79becg ou huCD79b-Fc foi imobilizado (aproximadamente 50 — 200 RU) em 10 mM acetato de sódio pH 4,8 em um chip sensor CM5. Devido a um grande efeito de ânsia, as medições de afinidades foram sensíveis a uma quantidade de huCD79beca imobilizado.
Por esta razão, as afinidades, determinadas por amostras realizadas em dias diferentes, foram normalizadas em MA79b que foi realizado junto à lateral como um padrão.
Em experiências que mediram a ligação a um peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ e ID NO: 16), o peptídeo biotinilado foi capturado (aproximadamente 20 RU) em um chip sensor revestido com estreptavidina.
Variante anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b purificado (como Fab ou IgG) (um diluição de duas vezes em série de 0,5 a 1000 nM in PBST) foi injetada em uma taxa de fluxo de 30 ul/min.
Cada exemplo foi analisado com uma associação de 4 minutos e dissociação de 10 minutos.
Após cada injeção, o chip foi regenerado usando 10 mM glicina pH 1,7. A resposta de ligação foi corrigida subtraindo uma célula de fluxo de controle da variante anticorpo “humanizado” enxertado com fluxo de células de MA79b (como Fab ou IgG). Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de Kon E Korg foi usado para análises cinéticas.
F. ANÁLISE DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS) Para ainda determinar a ligação das variantes de Fab variantes de variantes de anticorpo ou anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b, a ligação de variantes de Fab e/ou IgG a células DoHH-2 foram analisadas usando análise FACS. Além disso, a ligação de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b a célula luciferase BJAB foi analisada usando análise FACS. Para análise FACS de variantes de Fab de variantes de anticorpo oe “humanizado” enxertado com MA79b (anticorpo “humanizado” enxertado com —MAZ79b (versão de IgG version usada como um controle)), células DoHH-2 (1 x 10º in 100 ul volume) foram primeiramente incubadas com ou sem 1 ug de anticorpo monoclonal anti-CD79b de camundongo original (MA79b) durante 30 minutes, antes de adicionar 1 ug da variante Fab individual (ou anticorpo de controle). Ig antic-humano de camundongo conjugado a PE, cadeia leve kappa (clone G20-193, BD Biosciences, San Diego, CA) foi usado como o anticorpo de detecção secundário, uma vez que todas as variantes de Fab carregam cadeia leve de kappa e células DoHH-2 não expressam a cadeia leve de kappa e sobre a superfície da célula. Para análise FACS adicional de variantes de IgG de variantes de — anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (versão IgG de chMA79b usado como um controle), 1,0 ug, 0,1 ug ou 0,01 ug de anticorpo foi titulado por milhão de células de células de luciferase BJAB. lg humano anti-camundongo conjugado a PE foi usado como o anticorpo de detecção secundário.
G. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD) Para ainda determinar a ligação de variantes de IgG tendo trocas em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), a ligação de variantes de IgG iodadas a células BJAB expressando CD79b humano e CD79b de cynomologous foi analisada e a análise Scatchard foi realizada.
Para análise Scatchard, 0,5 nM MA7Z9b rotulado com 1ºº* ou huMA?79b L2/H3 foi competido contra MA79b ou huMA79b L2/H3 não rotulado, respectivamente, na faixa de 50 a 0,.02 nM (diluição em série 1:2 etapa 12) na presença de uma linhagem de BJAB estavelmente transfectada expressando —CD79b de cynomolgus. Após uma incubação de quarto horas a 4ºC, as células foram lavadas e as contagens de pelotas de célula foram lidas por um contador gama (1470 WIZARD Automatic Gamma Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA). Todos os pontos foram feitos em triplicata e contados durante 10 minutos. O oe COM médio foi usado para cálculo de Kd usando o programa New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO A. RESULTADOS DA GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B8 HUMANIZADO A estrutura aceptora humana usada para a geração de anticorpo anti-CD79b humanizado compreendendo o domínio VL kappa | de consenso e uma variante do domínio VH de consenso do subgrupo Ill humano. A variante do domínio VH tem 3 trocas de consenso humano: R71A, N73T e L78A. o VL e os domínios VH MA79b foram alinhados com os domínios do subgrupo Ill e e kappa | humano; cada HVR foi identificado e então enxertado em uma estrutura aceptora humana para gerar um enxerto de HVR que pode ser exibido como Fabnofago (figuras7e8) O fago demonstrou o enxerto de MA79b como um Fab ligado a huCD79beca imobilizado (dados não mostrados). No entanto, quando a sequência do enxerto de huMA79b foi expressada como um IgG, análise FACS de sua afinidade para huCD79bew indicou que a afinidade de ligação foi — reduzida acima de 100 vez (dados não mostrados) e análise Biacore indicou uma perda acima de 50 vezes (figura 11).
1. REPARO DE CDR Variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b que foram capazes de ligar-se a huCD79bec imobilizado com as seguintes trocas de sequência foram identificadas. Somente trocas de sequência marcando HVRs em VL foram observadas em uma biblioteca contendo trocas de posição únicas e são —mostradas na figura 9 (para mutações de L1: mutação Q27K (SEQ ID NO: 17; SPL-2), (para mutações de L.1: LS4R (SEQ ID NO: 18), E5S5K (SEQ ID NO: 19)), e (para mutações mutação L,3: E93S (SEQ ID NO: 20; SPL-5), E93K (SEQ ID NO: 21)).
e Somente trocas de sequência marcando HVRs em L2, L3, H1 e H3 foram observadas em bibliotecas contendo múltiplas trocas de posição e são mostradas na figura 10 (para mutações L2: S52R, N53K, ES55G e S56R (SEQ ID NO: 22; mutação L2-2); N53R (SEQ ID NO: 23); S52R, N53K, E55G e S56N (SEQ ID NO: 24); S52R, N53K, ES5K e S56R (SEQ ID NO: 25); S52R, N53Y, ESSK e S56R (SEQ ID NO: 26; mutação L2-29); S52R, N53K e ES5K (SEQID NO: 27); S52R, N53K e ESSA (SEQ ID NO: 28); S52G, N53I, ESSA e S56R (SEQ ID NO: 29); S52R, N53K, ES5R (SEQ ID NO: 30); S52R, N53K e E55G (SEQ ID NO: 31; mutação 12-38); S52R, N53H, ESS5K e S56R (SEQ ID e NO: 32); ASIS, S52R, N53Y, ES5S e S56R (SEQ ID NO: 33); AS1G, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 34); L54R e ES5K (SEQ ID NO: 35); N53K e E55G (SEQID NO: 36); S52R, N53Y, ESS5R e S56R (SEQ ID NO: 37); S52R, N53R, ESSR e S56T (SEQ ID NO: 38); S52R, N53R, E55G e S56R (SEQ ID NO: 39); S52R, N53Q, L54R, ES5K e S56R (SEQ ID NO: 40); S52R, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 41); S52R, N53K, E55K e S56N (SEQ ID NO: 42); S52R, | N53K, ES5G e S56T (SEQ ID NO: 43); S52R, N53K, ES55G e S56G (SEQ ID | 25 NO:4);eS52R, N53K, ESSA e S56R (SEQ ID NO: 45)), (para mutações L.3: E93A (SEQ ID NO: 46); E93Q (SEQ ID NO: 47); nenhuma mutação (SEQ ID NO: 48); E93D (SEQ ID NO: 49); E93L (SEQ ID NO: 50); Q89N, Q90N, E93G e TO97N (SEQ ID NO: 51); Q90P, S91D, D94A e L96R (SEQ ID NO: 52); Q89D,
S91R e ES3A (SEQ ID NO: 53)), (para mutações H1: T28P, S30T, S31R e E35S (SEQ ID NO: 54); T28P, S30R e E35Q (SEQ ID NO: 55); T28P, S30T e mutação E35N (SEQ ID NO: 56); T28P, S30T, S31R e ES6N (SEQ ID NO: 57; H1-6)); S3ON, S31R e ESSN (SEQ ID NO: 58); T288S e S30K (SEQ ID NO: 59); —G26P,T28S,F29L,S30C,S31T, W33F e E3S5D (SEQ ID NO: 60); T28Y e S30T (SEQ ID NO: 61); T28P, S30G, S31R, 134V e E35N (SEQ ID NO: 62); S30K e S31K (SEQ ID NO: 63); T28P, S30T e E35Q (SEQ ID NO: 64); T28P, S30R e S31R (SEQ ID NO: 65); T28P, F29V, S30G, S31R e E35S (SEQ ID NO: 66); e T28P, S3ON, S31R e ESSN (SEQ ID NO: 67; mutação H1-1); T28G, S30T e E35S(SEQID NO: 68); S30T, I34L e E35S (SEQ ID NO: 69); S30T (SEQ ID NO: 70); S31G e ES5N (SEQ ID NO: 71); S30R, S31R e ES5N (SEQ ID NO: 72); T28S, S3O0R e ESSN (SEQ ID NO: 73); T28S, S30R, S31R e ESSN (SEQ ID NO: 74); T28S, S30R e S31R (SEQ ID NO: 75); T28S, S30P, I34L e E35Q (SEQ ID NO: 76); T28P, S30T e S31R (SEQ ID NO: 77); T28P e S31G (SEQ ID NO:78); T28P, S30R e E358S (SEQ ID NO: 79); T28P, S30R e ES5N (SEQ ID NO: 80); T28P, S30R e S31G (SEQ ID NO: 81); T28P, S30N e S31R (SEQ ID NO: 82); T28P, S30N, S31G e ESSN (SEQ ID NO: 83); T28N, F29V, 134L e oe E35S (SEQ ID NO: 84); Y27F, T28P, S30T e E35S (SEQ ID NO: 85); e Y27F, T28P, S30N, S31R e ESSN (SEQ ID NO: 86)) e (para mutações H3: V98I e —F100L(SEQ ID NO: 87; mutação H3-12); nenhuma mutação (SEQ ID NO: 88); Y99K e F1O0OL (SEQ ID NO: 89); F100L (SEQ ID NO: 90); V981 (SEQ ID NO: 91); V98F, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 92); F100L (SEQ ID NO: 93); V98l, Y99R e F100L (SEQ ID NO: 94; mutação H3-10); V981, Y99K e F100L (SEQ ID NO: 95); V981 e Y99R (SEQ ID NO: 96); V981 (SEQ ID NO: 97); D101S (SEQ 1IDNO: 98); Y99V e FIO0OL (SEQ ID NO: 99); Y99R e F100L (SEQ ID NO: 100); Y99R (SEQ ID NO: 101); Y99F e F100L (SEQ ID NO: 102); V98| e F100L (SEQ ID NO: 103); V981 (SEQ ID NO: 104); V96R, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 105);
e V96! (SEQ ID NO: 106)).
| | 432 | | | | Clones selecionados foram reformados como Fab para análise por FACS e como IgG para outras análises por Biacore e Scatchard.
A.
DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE) Como mostrado na figura 11, mostrando análise Biacore, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade para o anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b.
Os ensaios de ressonância de Plasmon de superfície mostraram que apesar de nenhuma das variantes testadas com trocas de HVR únicas e terem uma afinidade similar a MA79b, a combinação de trocas identificadas em HVR-L2 e HVR-H3 (variante L2/H3 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b; também referidas aqui como huMA79b L2/H3) leva a uma variante com afinidade similar (figura 11) como MA79b quando ligando a huCD79becg OU huCD79beca-Fc L2/H3 imobilizado ou o peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b como determinado por análise Biacore.
Análise de ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (I19G) de MA79b a antígeno (huCD79beca-Fc) (figura 11, fileira 1, compara Fab a colunas de IgG) sugere que um componente de avidez de 100 vezes presente emMA?79b pode estar desprovido de variantes de afinidade melhoradas. o Especificamente, na variante L2-2 de anticorpo “humanizado”! enxertado com MA79b (também referido aqui como L2-2 de huMA79b) que demonstra uma melhora de 5 vezes na ligação monomérica comparada a MA79b (figura 11, fileiras 1 e 3, compara colunas de Fab), afinidade não aparente é ganha em L2- 2 reformando huMA79b L2-2 como um IgG) (Figura 11, fileira 4, compara Fab a colunas de IgG). Além disso, o anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b HVR (enxerto de huMA79b) demonstra a perda deste componente de avidez na ligação (figure 11, fileira 2, compara Fab a colunas de IgG). A capacidade de melhorar a ligação através da avidez pode ser desejável na ligação a antígenos de superfície de células.
B. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD) | Como avaliado por análise Scatchard Análise, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequência individuais que melhoram a afinidade para o de anticorpo “humanizado” enxertado com | —MA7O9b. Especificamente, os ensaios de ligação de células mostraram que a | afinidade de MA79b e variante L2/H3 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b L2/H3 (huMA79b) (reformadas como IgG) para ligação de células BJAB expressando estavelmente CD79b de cynomologous e CD79b humano e endógeno foi com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 + 0,14 nM) e 0,52 nM (L2/H3 de huMA7ZO9b; Kd = 0,52 + 0,1 nM), respectivamente (dados não mostrados), como determinado por análise Scatchard. C. DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS) Como avaliado por análise FACS, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoraram a ligação de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (enxerto de huMAZ79b) a células DoHH-2 (dados não mostrados). Especificamente, a análise FACS de variantes de Fab (mutações L2-2, H3-10 e H1-1) identificas . de bibliotecas de SP e de 6 SR em células DoHH-2 mostrou ligação de e variantes de Fab e enxerto de huMA79b (formatado como um IgG) a DoHH-2 células (dados não mostrados). Além disso, análise FACS Análise de variantes de Fab mostraram que a ligação de variantes de Fab variantes a células DoHH- 2 foi bloqueada por pré-incubação com anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino (MA79b) (dados não mostrados).
2. REPARO DA ESTRUTURA As trocas de sequência HVR introduzidas em HVR-L2 da variante LE/H3 de huMA79b L2/H3 foram radicalmente diferentes das observadas em qualquer linhagem de células embrionárias. A variante L2/H3 de huMA?7O9b, quando conjugada a DM1, foi observada ser eficaz na inibição de crescimento de tumor em um modelo in vivo de xenoenxerto de camundongo (Tabela 9). Uma vez que a análise da ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) da variante L2/H3 de huMA79b a antígeno mostrou uma perda de avidez (Figura 11), o reparo da estrutura foi realizado como descrito abaixo.
Para explorar o papel de posições da estrutura em ligação a antígeno dimérica, uma variante de posições de “toda a estrutura foi construída em que posições da estrutura de murino potencialmente importantes foram incorporadas em um anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b HVR oe (enxerto de huMA79b). Esta variante (referida na figura 12 como “toda a estrutura”), desprovida de quaisquer trocas de HVR, possuía afinidade de ligação dimérica similar ao anticorpo MA79b quimérico (CchMA7Z9b) (Figure 12) como avaliado por análise Biacore e análise Scatchard. As variantes de IgG, incluindo resíduos de estrutura de murino nas posições 4 e/ou 47 (VL) e/ou posições 47, 48, 67, 69, 71, 73, 74, 78 e/ou 80 (VH) foram geradas para determinar o ajuste mínimo de posições de estrutura necessário para manter alta afinidade, ligação dimérica (figura 12). Resíduos de estrutura de murino são mostrados nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). Verificou-se que 47 posições de estrutura em VL, e 75 e e 80 em VH eram dispensáveis como evidenciado pelo de anticorpo “humanizado” —enxertado com MAZ79b e variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v17) (figura 12, fileira rotulada como 17). Variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (MA79b.v18; figura 12, fileira rotulada como 18), que inclui resíduos da estrutura de murino nas posições 4 in VL, e 48, 67, 69, 71, 713 e 78 em VH e — ainda inclui trocas em HVR-H3 (referido na figura 13 como “H3-H10” e descrito abaixo como mutação H3-10), incluindo V981I, Y99R e F100L, mostrou uma melhora adicional de 2 vezes (figura 12, fileira rotulada como 28) em ligação dimérica quando comparado à variante 17 (figura 12, fileira rotulada como 17).
Para evitar resultados de fabricação potenciais, um sítio de formação de ácido iso-aspártico potencial (Asp-Gly) em HVR-L1 das variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b foi eliminado convertendo D28 em Glu (ácido glutâmico) (D28E; ver variante 28; também referida aqui — como “huMA79b.v28"”; figura 12, fileira rotulada como 28). Outras substituições para estabilidade em VL de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ9b também foram toleradas incluindo D28 a Ser (serina) (D28E; ver variante 32; também referida aqui como “huMA79b.v32"; figura 12, fileira e rotulada como 32).
Variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (huMA?79b.v28; figura 12, fileira rotulada como 28), que inclui: (1) resíduos da estrutura de murino nas posições 4 em VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, (2) as trocas ainda incluem em HVR-H3 (referido na figura 12 como “H3-10" e descrito acima como mutação H3-10), incluindo V981, Y99R e F1OOL, e (3) — além disso as trocas ainda incluem em HVR-L1 (D28E, descritas acima) foram caracterizadas por análise Biacore.
Variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (MA79b.v32; figura 12, fileira rotulada como 32), que inclui: (1)resíduos de o murino da estrutura de murino nas posições 4 in VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VWVH,(2) outras trocas incluem em HVR-H3 (referido na figura 12 como “H3- 10" e descrito acima como mutação H3-10), incluindo V981, Y99R e F100L, e (3) além disso as trocas ainda incluem em HVR-L1 (D28S, descrito acima) foram caracterizadas por análise Biacore.
A. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE) Como mostrado na figura 12, mostrando análise Biacore, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para huCD79bew. Os ensaios de ressonância de plasmon de superfície mostraram que a variante 28 do anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b (huMA79b.v28; com posições da estrutura de murino nas posições 4 em VL, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR- H3 (V98I, Y99R e F100L (também descrito acima) e a mutação D28E em HVR- —L1 (para estabilidade, ver a descrição acima); a figura 12, fileira rotulada como 28) e a variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA?79b.v32; com a estrutura de murino nas posições 4 em VL, 47, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V981, Y99R e 6 F1O0OL (também descrito acima) e a mutação D28S em HVR-L1 (para estabilidade, ver descrição abaixo); figura 12, fileira rotulada como 32) tem afinidade equivalente a anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) quando da ligação a huCD79beca imobilizado como determinado análise Biacore.
B.
DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD) Como avaliado por análise As, similar a uma análise Biacore, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade do anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b (enxerto huMA79b). Os ensaios de ligação de células mostraram que a afinidade de MA79b, variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado o com MA79b (huMA79b.v28; ver figura 12, fileira rotulada como 28) (reformatada como IgG), e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z79b (huMA79b.v32; ver figura 12, fileira rotulada como 32) para ligar células BJAB expressando estavelmente CD79b de cynomolgous e CD79b endógeno humano com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 + 0,14 nM), 0,44 nM (huMA79b.v28; Kd = 0,44 + 0,04 NM), e 0,24 nM (huMA79b.v32; Kd = 0,24 +0,02 NM), respectivamente (dados não mostrados), como determinado por análise Scatchard.
C.
DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS) Como avaliado por análise FACS, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a ligação do anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z79b (enxerto de huMA79b) a células de luciferase BJAB (dados não mostrados). Especificamente, a análise FACS de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (variantes huMA79b.v28 e huMA79b.v32) para células de luciferase BJAB mostrou ligação a células de luciferase BJAB t | (dados não mostrados). | B.
Discussão DA GERAÇÃO ANTICORPOS ANTI-CD79B8 HUMANIZADOS oe Partindo de um enxerto do murino 6 MA79b HVRs (como definido como posições 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 93- 102 (H3)) em um VL Kappa | de consenso humano e VH do subgrupo Ill! VH (contendo A71, T73 e A78), o reparo de CDR foi usado para identificar trocas em HVRs 1-6 que melhora a afinidade de ligação.
Trocas das sequências de HVR identificadas nas figuras 10 e 11 ou combinações destas trocas levam a variantes de MA79b humanizadas com afinidades similares a MA79b.
Alternativamente, o reparo da estrutura foi usado para recapturar a avidez da ligação dimérica pela adição das posições 4 à estrutura em VL, e 48, 67, e 69 em VH no enxerto de huMA79b (que inclui resíduos da estrutura o de murino em 71, 73 e 78 de VH) (figura 12; variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.vi7)). A afinidade destas variantes de mutação de estrutura para o antígeno huCD79bew foi ainda melhorada pela adição de 3 trocas em HVR-H3: V981, Y99R e F100L (figura 12; variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v18)). Um sítio de formação de ácido iso-aspártico potencial em HVR-L1 foi eliminado com a mutação D28E mutação (figura 12; variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v28)). EXEMPLO 2: GERAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-CD798B8 DRuG (ADcs) Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b, as variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b foram conjugadas a drogas, tal como DM1. As variantes conjugadas a DMI incluíram as variantes tendo trocas em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3) huMA79b.vi7, huMA7Ob.vI8, —huMA79b.v28 e huMA?79b.v32. As drogas usadas para geração do conjugado anticorpo-drogas (ADCSs) para o anticorpo anti-CD79bs incluíram derivados de maitansinóide DM1 e dolastatina 10 monometilauristatina E (MMAE) e monometilauristatina F | e (MMAF). (US 2005/0276812; US 2005/0238649; Doronina et al., Bioconjug. | Chem, 17:114-123 (2006); Doronina et al.
Nat.
Biotechnol., 21: 778-784 (2003); Erickson et al., Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006), todos sendo | incorporados aqui por referência em sua totalidade). Ligantes úteis para a geração de ADCs são BMPEO, SPP ou SMCC (também referidos aqui como | “MCC”) para DM1 e MC ou MC-vc-PAB para MMAE e MMAF.
Para DM1, os anticorpos foram ligados a um grupo thio de DM1 e através de um grupo amino de lisina usando o reagente ligante SMCC.
Altemativamente, para DM1, os anticorpos foram ligados a DM1 através de um grupo e-amino de lisina usando o ligante SPP Pentanoato de N-succinimidil 4-(2'-piridilditio)) reage com o grupo o amino epsilon de lisinas para dar o ligante reativo dissulfeto de 2-piridila em uma proteína.
Com ligantes SPP, quando da reação com o sulfidral livre (por exemplo, DM1), o grupo piridila é substituído, deixando o DMI fixado por uma ligação dissulfeto reduzível.
DM1 fixado por um ligante SPP é liberado sob | condições de redução (isto é, por exemplo, dentro das células) enquanto DM1 fixado pelo ligante SMCC é resistente a clivagem em condições de redução. — Além disso, SMCC-DM1 ADCs induzem a toxicidade da célula se o ADC é internalizado e marcado em um lisossoma causando a liberação de lisina -Nº- DM1, que é um agente anti-mitótico eficaz dentro de uma célula, e quando liberada da célula, a lisina-Nº-DM1 é não-tóxica (Erickson et al., Cancer Res.,
66: 4426-4433 (2006)) Para MMAE e MMAF, os anticorpos estavam ligados a MMAE ou MMAF através de cisteína por maleimidocaproil-valina-citrulina (vc)- p-aminobenziloxicarbonila (MC-vc-PAB). Para MMAF, os anticorpos foram alternativamente ligados a MMAF através de cisteina por ligante de —maleimidocaproíila (MC). O ligante MC-vc-PAB é clivável por proteases intercelulares tal como catepsina B e quando clivado, libera droga livre (Doronina et al., Nat.
Biotechnol., 21: 778-784 (2003)) Enquanto o MC é resistente a clivagem por proteases intracelulares. oe Os conjugados anticorpo-drogas (ADCs) para anti-CD79b, usando o SMCC e DM1, foram gerados semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0276812. Anticorpos purificados anti-CD79b foram trocados com tampão em uma solução contendo 50 mM fosfato de potássio e 2mM EDTA, pH 7,0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) foi dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado a uma solução de anticorpo para produzir uma relação molar SMCC/Ab de 10:1. A reação foi deixada prosseguir durante três horas em temperatura ambiente com misturação.
O anticorpo modificado com SMCC foi subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em 35 mM citrato de sódio com 150 e mM NaCl e 2 mM EDTA, pH 6,0. DM1, dissolvido em DMA, foi adicionado a uma preparação de anticorpo SMCC para dar uma relação molar de DMI para anticorpo de 10:1. A reação foi deixada prosseguir durante 4-20 h em temperatura ambiente com misturação.
A solução de anticorpo modificado com DM1 foi diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover DM1 não reagido, filtrada estéril, e armazenada a 4 graus C.
Tipicamente, um rendimento de anticorpo de 40-60% foi obtido através deste processo.
A preparação foi geralmente >95% monomérica como avaliado por filtração de gel e varredura com luz de laser.
Uma vez que DM1 tem uma absorção máxima a 252 nm, a quantidade de droga ligada a um anticorpo pode ser determinada por medições
| de absorção diferenciais a 252 e 280 nm. Tipicamente, a relação de droga para anticorpo foi 3 para 4.
Os conjugados anticorpo-drogas (ADCs) para anticorpo anti- CD79bs descrito aqui usando ligantes SPP-DM1 podem ser gerados — semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0276812.Anticorpos aAnti-CD79b purificados são trocados com tampão em uma solução contendo 50 mM fosfato de potássio e 2 mM EDTA, pH 7,0. O SPP (Imunogene) foi dissolvido em DMA e adicionado a uma solução de anticorpo para produzir uma relação oe molar de SPP/Ab final de aproximadamente 10:1, a relação exata dependendo da carga de droga desejada do anticorpo. Uma relação de 10:1 geralmente resultará em um relação de droga para anticorpo de aproximadamente 3-4. O SPP é deixado reagir durante 3-4 horas em temperatura ambiente com misturação. O anticorpo modificado com SPP é subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em 35 mM citrato de sódio com 150 MM NaCl e 2 mM EDTA, pH 6,0 ou solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. DM1 é dissolvido em DMA e adicionado à preparação de anticorpo SPP para dar uma relação molar de DM1 para anticorpo de 10:1, que resulta em excesso molar de 3 -4 vezes sobre os ligantes e de SPP disponíveis em um o anticorpo. A reação com DM1 é deixada prosseguir durante 4-20 h em temperatura ambiente com misturação. A solução de anticorpo modificada com DM1 é diafilttada com 20 volumes de PBS para remover DMI não reagido, filtrada estéril e armazenada a4 graus C. Tipicamente, rendimentos do anticorpo de 40-60% ou mais são obtidos com este processo. O conjugado anticorpo-droga é geralmente >95% monomérico como avaliado por filtração de gel e varredura de luz laser. A quantidade de droga ligada é determinada pó medições de absorção diferenciais a 252 e 280 nm como descrito para a preparação de conjugados SMCC-DM1 (descrito abaixo). Conjugados anticorpo-drogas (ADC) para anticorpos anti-CD79b NON SS a o o AD a E o 441 descritos aqui usando os ligantes de droga MC-MMAF, MC-MMAE, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE ou MC-val-cit (vc)-PAB-MMAF também podem ser gerados semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0238649. Anticorpo anti-CD79b purificado é dissolvido em 500 mM borato de sódio e 500 mM cloreto de sódio em pH 8,0 e ainda tratado com um excesso de 100 MM ditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 graus C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS | com 1 mM DTPA.
O valor de tiol//Ab é verificado para determinar a | e concentração de anticorpo reduzido a partir de absorvência a 280 nm da solução e a concentração de tiol por reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvência a 412 nm.
O anticorpo reduzido dissolvido em PSS foi resfriado em gelo.
O ligante de droga, por exemplo, MC-val-cit (vc)- PAB-MMAE, em DMSO, é dissolvido em uma acetonitrila e água, e adicionado a um anticorpo resfriado em PBS.
Após incubação durante uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriamento e cobre quaisquer grupos tiol de anticorpo não reagido.
A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centríguga e o conjugado anticorpo-droga, é purificado e dessalinizado por eluição através da resina G25 em PBS, filtrada através de e filtros de 0,2 um em condições estéreis, e congeladas para armazenamento.
Os conjugados anticorpo-drogas (usando o anticorpo anti-CD79bs descrito aqui) foram diluídos a 2 x 10 ugml em um meio de ensaio.
Os conjugados foram ligados com reticuladores SMCC (ligante de dissulfero alternativo pode ser usado para SPP em toxina de maitansinóide DM1) (Ver US 2005/0276812 e US 2005/0238649). Além disso, os conjugados podem ser ligados com MC-valina-cittuliha (vc)PAB ou MC em derivados de dolastatina10, toxina “monometilauristatina E (MMAE) ou toxina monometilauristatina F (MMAF) (Ver Pedido US Nº. 11/141.344, depositado em 31 de maio de 2005 e Pedido US Nº. 10/983.340, depositado em 5 de C———t o novembro de 2004). Controles negativos incluíram conjugados baseados em HERCEPTINO (trastuzumab) (antic=HER2) (SMCC-DM1 ou SPP-DM1 ou MC- VC-MMAE ou MC-vc-MMAF). Os controles positivos podem incluir L-DMI livre equivalente à dose de carga de conjugado.
As amostras foram vortexadas para assegurar mistura homogênea antes da diluição.
O anticorpo anti-CD79b para conjugação de droga incluiu anticorpos MA79b quiméricos (ChMA79b) e variante de anticorpo huMA79b L2/H3 e huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA7Ob.v28 e huMA7O9b.v32 descritos e aqui Exemplo 1).Outros anticorpos para conjugação podem incluir quaisquer anticorpos descritos aqui Exemplo 1). EXEMPLO 3: ENSAIO DE EXTERMÍNIO DE CÉLULAS DE TUMOR IN VIVO A.
XENOENXERTOS
Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b tendo trocas em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), o a variante huMA79b L2/H3 foi conjugada a DM1 e o efeito da variante conjugada em tumores de camundongos foi analisado.
Especificamente, a capacidade dos anticorpos regredirem, tumores em múltiplosmodelos de xenoenxertos, incluindo células RAMOS, células BJAB, o (linhagem de células de linfoma de Burkitt que contêm a translocalização, —translocalização de (2;8)(p112;924) (IGK-MYC), um gene p53 mutado e são vírus Epstein-Barr (EBV) negativo) (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line | Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), células Granta 519 (linhagem de célula de linfoma de célula do manto) que contêm a t(11;14)(413;932) (BCL1-IGH) | translocação que resulta em uma superexpressão de ciclina D1 (BCL1), contém deleções PIGINK4B e PIGINK4IA e são EBV positivos) (Drexler, HG., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)). Células U698M (linhagem de células B de linfosarcoma linfloblástico (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press,
| 443 2001) e célula DoHH2 (linhagem de células de linfoma folicular que contém a característica de translocação de linfoma folicular t(14;18)(932:921) cujos resultados em uma superexpressão de Bcl-2 conduzida por uma cadeia pesada contêm a deleção P16INKA4A, contém a translocação t(8;14)(924;932) (IGH-MYC) esão negativos para EBV) (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), pode ser examinado.
Para análise da eficácia de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para análise da eficácia do mesmo, camundongos SCID | oe fêmeas (de 6 a 8 semanas de idade de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) | 10 foram inoculados subcutaneamente com 2 X 107 células de luciferase BAJB ou células Granta-519 por injeção nos flancos de camundongo em um flanco de camundongo SCID de CB17 ICR e os tumores de xenoenxerto foram deixados crescer em uma média de 200 mm?. O dia O refere-se ao dia que os tumores estavam na media de 200 mm? e quando a primeira/ ou única dose de tratamento foi administrada, a menos que especificamente indicado abaixo.
O volume do tumor foi calculado baseado em duas dimensões, medidas usando paquímetro, e foi expressado em mm? de acordo com a fórmula: V= 0,5a X b?, onde a e bsão os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente.
Dados coletados de cada e grupo experimental foram expressados como média + desvio padrão.
Grupos de 10 camundongos foram tratados com uma dose intravenosa (i.v.) única de 50 ug e 210 ug de droga ligada ao anticorpo camundongo/m? (correspondendo a 1-4 mg/kg de camundongo) com variantes de anticorpo humanizado” enxertado com MA?79b ou conjugado anticorpo-drogas de controle.
Os tumores foram medidos tanto uma vez como duas vezes por semana por toda a experiência.
Os pesos corporais dos camundongos foram medidos tanto uma vez como duas vezes por semana por toda a experiência.
Os camundongos foram eutanizados antes dos volumes do tumor alcançarem 3000 mm? ou quando os tumores mostraram sinais de ulceração iminente.
Todos os protocolos dos animais foram aprovados por um
Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC).
Os ligantes entre o anticorpo e a toxina que foram usados foram reticulador de SMCC de tioéter SMCC para DM1. Ligantes adicionais podem incluir ligados de dissulfero SPP ou reticulador SMCC de tioéter para DM1 ou MC ou MC-valina-citrulina(vc)-PAB ou (uma valina-citrulina (vc)) reagente ligante de dipeptídeo) tendo um componente de maleimida e componente de para-aminobenzlcarbamoíla (PAB) auto-imolante para monometilauristatina E (MMAE) ou monometilauristana F (MMAF). As toxinas usadas foram DM1.
o Toxinas adicionais podem incluir MME ou MMAF.
Anticorpos CD79b para esta experiência incluíram anticorpos quiméricos MA79b (chMA79b) como descrito no Pedido US Nº. 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006 bem como variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MAZ79b descritas aqui (ver Exemplo 1A). Anticorpos adicionais podem incluir anticorpos comercialmente disponíveis, incluindo anticorpo anti-CD79b, e anticorpos monoclonais MA79b gerados de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993.
Os controles negativos incluíram conjugados (SMCC-DM1) . baseados em anti-HER2 (HERCEPTINO (trastuzumab) e B. RESULTADOS
1. BJAB-XENOENXERTOS DE LUCIFERASE | Em um curso de tempo de 35 dias com conjugados de droga e doses como mostrado na tabela 9, a variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b L2/H3 (variante huMA79b L2/H3) (reformada como IgG) | e anticorpo quimérico anti-CD79b (chMA79b) conjugado a DM1 (huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1, respectivamente), “mostrou inibição de crescimento de tumor e,m camundongos SCID com tumores de luciferases = BJAB comparado ao controle negativo, HERCEPTINO (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (como indicado na tabela 9) no dia O para todos os ADCs e controles.
Especificamente, os anticorpos huMA79b L2/H3- SMCC-DM1 (reformados como IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significativamente o crescimento de tumor (figura 20). Além disso, na tabela 9, o número de camundongos fora do número total de camundongos testados mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer o tempo após a administração caiu para O mm?) são indicados.
TABELA 9 Anticorpo administrado CR Dose Dose | Relação (Tratamento) Droga Ab | dadroga CT Eis (mam?) | o) Ab)
| [enmazensmecom — | ano | amo | oo | 24 | 29 |
|
| e 2, XENOENXERTOS GRANTA-519
Em um curso de tempo de 14 dias com conjugados de droga e doses como mostrado na tabela 10, variante 17, variante 18, variante 28 e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA7Z9b, (huMA79b.vi7, — huMA79b.vI8, huMA79b.v28 e huMA79b.v32, respectivamente) (reformadas como IgG) e anticorpo anti-CD79b quimérico (ChMA79b) conjugado a DM1 (huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC-DM1, huMA?79b.v28-SMCC-
DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1, respectivamente),
mostraram inibição de crescimento de tumor em camundongos SCID com tumores Granta-519 comparado ao controle negativo, HERCEPTINO a ao E o SS ooo o CNN
Di A ii | 446 (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (como indicado na tabela 10) no dia O para todos os ADCs e controles.
Especificamente, os anticorpos huMA79b.v28- SMCC-DM1, — huMA79b.v32-SMCC-DM1, — huMA79b.vI7-SMCC-DM1 e —huMAZ79b.vI8-SMCC-DM1 (reformados como IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significativamente o crescimento de tumor (figura 21A). Além disso, o tratamento com huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA7Z9b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA7Z9b.v18-SMCC- ) DM1 e chMA79b-SMCC-DM1 e controle HERCEPTINO (trastuzumab)-SMCC- DM1 (antrHER2-SMCC-DM1) não resultou em um decréscimo no peso corporal percentual dos camundongos (figura 21B). Além disso, na tabela 10, o número de camundongos fora do número total de dez camundongos testados mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido nodia0)ouCR=Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu para O mm?) são indicados.
TABELA 10 fo Anticorpo administrado CR Dose Dose Relação o (Tratamento) Droga- Ab da droga (ngm?) | uma7oo vis smecom — | amo Domo | ss | a | 35 | | | numaao vas smecomt — | ano [amo | 22 | a | 34 | | |
À luz da capacidade de ADCs de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para inibir significativamente a progressão de tumor em xenoenxertos, moléculas de CD79b podem ser excelentes marcações para terapia de tumores em mamífero incluindo cânceres associados a células B, tal | 5 como linfomas (isto é linfoma não- Hodgkin), leucemias (isto é leucemia | linfocítica crônica), e outros cânceres de células hematopoiéticas. Além disso, ADCs “humanizados"! enxertados em MA79b são úteis para reduzir o | crescimento de tumores in vivo, incluindo cânceres associados a células B, tal | o como linfomas(isto é linfoma não-Hodgkin), leucemias (isto é leucemia linfocítica crônica), e outros cânceres de células hematopoiéticas.
EXEMPLO 4: Co-LOCALIZAÇÃO DO AnNTICORPO CD79B Para determinar onde variantes de anticorpo e anticorpo “humanizados” enxertados com MA79b são liberados quando da internalização em uma célula, estudos de co-localização do anticorpo anti-CD79b internalizado em linhagens de células B pode ser avaliado em linhagens de células Ramos. LAMP-1 é um marcador para endossomas e lisossomas tardios (Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology, 139(3): 639-649 (1997); Hunziker et = al., Bioessays, 18:379-389 (1996); Mellman et al., Annu. Rev. Dev. Biology, e 12:575-625 (1996)), incluindo compartimentos de classe | de MHC (MIICs), que é um compartimento como endossoma/lisossoma tardio. HLA-DM é um marcador para MIICs.
Células de Ramos são incubadas durante 3 horas a 37ºC com 1 uvg/ml de variantes de anticorpo e anticorpo “humanizados” enxertados com MAT79b.MA79b, bloco (Miltenyi) e 25ug/ml Alexa647-Transferrina (Molecular —Probes) em meio livre de carbonato completo (Gibco) com a presença de 10ug/ml leupeptina (Roche) e 5SUM pepstatina (Roche) para inibir a degradação lisossomal. As células são então lavadas duas vezes, fixadas com 3% de paraformaldeído (Electron Microscopy Sciences) durante 20 minutos em a temperatura ambiente, resfriadas com 50 mM NHA4CI (Sigma), permeabilizadas com 0.4% de saponina/2% FBS/1% BSA durante 20 minutos, então incubadas com 1 ug/ml Cy3 anti-ccamundongo (Jackson Immunoresearch) durante 20 minutos. A reação é então bloqueada durante 20 minutos com IgG de — camundongo (Molecular Probes), seguido por uma incubação de 30 minutos com Image-iT FX Signal Enhancer (Molecular Probes). As células são finalmente incubadas com anti-LAMPq de camundongo rotulado com Zenon Alexa488 (BD Pharmingen), a marcador para ambos lisossomas e MIIC (um e compartimento como lisossoma que é parte da via de classe Il de MHC), durante 20 minutos, e pós-fixadas com 3% de PFA. As células são recolocadas em suspensão em 20yul de tampão de saponina e deixadas aderir a lâminas revestidas com poli-lisina (Sigma) antes de montar uma cobertura de vidro com VectaShield contendo DAPI (Vetor Laboratories). Para imunofluorescência do MIIC ou lisossomas, as células são fixadas, permeabilizadas e melhoradas como acima, então co-coloridas com Alexa555-HLA-DM (BD Pharmingen) rotulado com Zenon e Alexa488-Lamp1i na presença de excesso de camundongo IgG como pelas instruções do fabricante (Molecular Probes). a. Consequentemente, variantes de anticorpo e anticorpo o “humanizados” enxertados com MAZ79b.MA79b com MIIC ou lisossomas de linhagens de células B, como avaliado por imunofluorescência, pode indicar moléculas como excelentes agentes para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cânceres associados a células B, tal como linfomas (isto é linfoma não -Hodgkin), leucemias (isto é leucemia linfocítica crônica), e outros cânceres células hematopoiéticas. EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO OF ANTICORPOS ANTI-CD70B SUMETIDO À
ENGENHARIAS COM CISTEÍNA A preparação de anticorpos anti-CD79b sumetido à engenharias com cisteína foi realizada descrito aqui.
DR Po NO E Os O CNS a SS A MA | 449 | DNA codificando o anticorpo MA7Z79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 4, | figura 4; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 5, figura 5), foi mutagenizado por métodos descritos aqui. para modificar o DNA de cadeia leve e de cadeia pesada codificando o anticorpo anticorpo MA79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: | 5; figura 5) também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para | modificar a região FC de cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia pesada, SEQ | ID NO: 304, figura 15) foi mutagenizado por métodos descritos aqui para | oe modificar a cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia leve, SEQ ID NO: 303; figura 15; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 304; figura 15), | também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o cadeia leve ou a região FC do cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 306, figura 16) foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia leve, SEQ ID NO: 305; figura 16; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 306; figura 16), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o e cadeia leve ou a região Fc de cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, figura 17), foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificara cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia leve, SEQ ID NO: 307, figura 17; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, figura 17), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o cadeia leve ou a região Fc de cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo huMA79b.v32 (cadeia leve, SEQ ID NO: 310, figura 18; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 309, figura 18) pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar as cadeias leve e cadeia pesada.
DNA codificando o anticorpo anti-cyno CD79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 241; figura 45 e cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, figura 47), foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve e cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo anti-cyno CD79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figure 47), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a região FC de cadeia pesada. Na preparação dos anticorpos anti-CD79b sumetido à engenharias com cisteína, DNA codificando a cadeia leve foi mutagenizado para substituir e cisteína por valina na posição 205 de Kabat na cadeia leve (posição sequencial 209) como mostrado na figura 27 (cadeia leve SEQ ID NO: 235 de MA79b thioMAb) e Figure 49 (cadeia leve SEQ ID NO: 300 de thioMAb anti-cyno CD79b (ch10D10)). DNA codificando a cadeia pesada foi mutagenizado para substituir cisteína por alanina na posição 118 em uma cadeia pesada (posição sequencial posição 118; número de Kabat número 114) como mostrado na figura 48 (cadeia — pesada SEQ ID NO: 244 of thioMAb anticorpo anti-cyno CD79b (ch10D10)), figura 28 (cadeia pesada SEQ ID NO: 236 de MA7Z9b thioMAb), figura 24 (cadeia pesada SEQ ID NO: 228 de thioMAb huMA79b.v17), Figure 25 (cadeia pesada SEQ ID e NO: 230 de thioMAb huMA79b.v18) e na figura 26 (cadeia pesada SEQ ID NO: 232 de thioMAb huMA79b.v28). a região FC of anticorpo anti-CD79bs pode ser —“mutagenizada para substituir cisteína por serina na posição 400 EU em uma cadeia pesada de região Fc (posição sequencial 400; número 396 de Kabat) como mostrado nas Tabelas 2-4. A. PREPARAÇÃO ANTICORPOS-ANTICD79B8 SUMETIDO À ENGENHARIAS COM
CISTEÍNA PARA CONJUGAÇÃO POR REDUÇÃO E REOXIDAÇÃO Anticorpos monoclonais anti-CD79b sumetido à engenharias com cisteina, de comprimento completo (ThioMabs) expressados em células CHO e purificados em uma cromatografia de afinidade de proteína seguido por uma cromatografia de tamanho de exclusão. Os anticorpos purificados são
MM reconstituídos 500mM borato de sódio e 500 mM cloreto de sódio a cerca de | pH 8,.0 e reduzidos excesso molar de cerca de 50-100 vezes de 1 mM TCEP hidrocloreto de (tris(2-carboxietil)fosfiba; Getz et a/ (1999) Anal.
Biochem.
Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante cerca de 1-2 h a 37 ºC.
O — ThioMab reduzido é diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em 10 mM acetato de sódio, pH 5, e eluído com PBS contendo 0,3M cloreto de sódio.
O ThioMab reduzido eluído é tratado com 2 mM de ácido dehidroascórbico (dhAA) em pH 7 durante 3 horas, ou 2 mM sulfato de cobre aquoso (CuSO,) oe em temperatura ambiente durante a noite.
A oxidação do ar ambiente também pode ser eficaz.
O tampão é trocado por eleição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1ImM DTPA.
O valor de tio/Ab é estimado determinando a concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvência a 280 nm da solução e a concentração de tiol por reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvência a 412 nm.
EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA ANTICORPO ANTI-CD79B SUMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEINA POR CONJUGAÇÃO DE ANTICORPO ANTI- Cp79B SUMETIDO À ENGENHARIA COM CISTEINA E INTERMEDIÁRIOS LIGANTES DE ; DROGA SUMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEÍNA o Após os procedimentos de redução e reoxidação do exemplo 5, o anticorpo anti-CD79b sumetido à engenharia com cisteína é reconstituído em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e resfriado em gelo, em equivalentes de cerca de 1,5 molar com relação às cisteínas engenheiradas pelo anticorpo de um intermediário ligante de droga auristatin, tal como MC- MMAE (maleimidocaproil-monometil auristatina E), MC-MMAF, MC-val-cit-PAB- MMAE, ou MC-val-cit-PAB-MMAF, com o grupo funcional reativo com tiol tal como maleimida, é dissolvido em DMSO, diluído em acetoniítrila e água, e adicionados a um anticorpo reoxidado reduzido com resfriamento em PBS.
Após cerca de uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar
452 | e cobre quaisquer grupos tiol não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o conjugado droga anticorpo CD79b sumetido à engenharia com cisteína é purificado e dessalinizado por eluição através de uma resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 um em condições estéreis, e congelado para armazenamento A preparação de huMA79b.vI8-HC(A118C) thioMAb-BMPEO- DM1 foi realizada como a seguir. A cisteíina livre em huMA?79b.v18- HC(A118C) thioMAb foi modificada pelo reagente bis-maleimida BM(PEO)3 6 (Pierce Chemical), deixando um grupo maleimida não reagido sobre uma superfície do anticorpo. Isto foi realizado dissolvendo BM(PEO)3 em uma mistura de 50% de etanollágua em uma concentração de 10 mM e adicionando um excesso molar de dez vezes de BM(PEO)3 a uma solução contendo huMA79b.v18-HC(A118C) thioMAb em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 —micromolar) e deixando reagir durante 1 hora. O excesso de BM(PEO)3 foi removido por filtração com gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em 30 mM citrato, pH 6 com 150 mM tampão de NaCl. Um excesso molar de DM1 dissolvido 10 vezes aproximadamente em dimetil acetamida (DMA) foi adicionado ao o intermediário huMA79b.v18-HC(A118C) thioMAb-BMPEO. Dimetilformamida (DMF) também pode ser empregada para dissolver o reagente da porção de droga. A mistura de reação foi deixada reagir durante a noite antes de fitração com gel ou diálise em PBS para remover droga não reagida. A filtração com gel em colunas S200 em PBS foi usada para remover agregados de peso molecular alto e fornecer huMA79b.vI8-HC(A118C) thioMAb- —BMPEO-DM1 purificado.
Pelos mesmos protocolos, controle de thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, controle de thio hu-anticHER2-HC(A118C)-MC- MMAF, controle de thi hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e controle
453 | ' de thio anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF foram gerados. | Pelos procedimentos acima, os seguintes conjugados de droga | anticorpo anti-CD79b sumetido à engenharia com proteína (TDCs) foram | preparados e testados:
1. thio huMAZ79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de | A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-MMAF;
2. thio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação de A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e BMPEO-DM1; oe 3. thio —huMA79b.vI8-HC(AII8C)-MCvcPAB-MMAE .— por conjugação de A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE;
4. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de A118C thio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-MMAF; | 5. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação | de thio huMA79b.v28-HC(A118C) e BMPEO-DM1; | 15 6. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-val-cit-PAB-MMAE por | conjugação de thio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; | 7. thio anticcynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de A118C thio antisccoynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC-MMAF; o 8. thio anti-coynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação de A118C thio anti-ccynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e BMPEO- DM1;
9. thio anticcynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE por conjugação de A118C thio anti-ccynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC- val-cit-PAB-MMAE;
10. thio MA79b-HC(A118C)--MC-MMAF por conjugação de thio MA79b-HC(A118C) e MC-MMAF; e
11. thio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF por conjugação de thio MAT79b-LC(V205C) e MC-MMAF.
| DM o DN Da | 454 | | EXEMPLO 7: CARACTERIZAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE CONJUGADOS DROGA ' THIOMAB SUBMETIDOS À ENGENHARIA COM CISTEÍNA À ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE | | DE CÉLULA | A afinidade de ligação de conjugado de drogas thio huMA79b.vi8, — thio huiMA7O9b.v28 e thio MA79b em CD79b expressado em células de luciferase BJAB foi determinada por análise FACS. Além disso, a afinidade de ligação de | conjugados de droga thio anti-ccynoCD79b(ch10D10) a CD79b expressado em células BJAB expressando cynoCD79b foi determinada por análise FACS.
6 Resumidamente, aproximadamente 1x10º células em 100 ul foram contatadas com quantidades variadas (1,0 ug, 01. ug ou 0.01 ug de Ab por células Ab por milhão de células de luciferase BAJB ou células BJAB expressando cynoCD79b (para anticcynoCD79b thioMAbs)) de um dos seguintes conjugados droga anti-cD79 ou nus (Ab não conjugado como um controle): (1) thio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF ou (2) thio MA79b- HC(ANISC)-MC-MMAF (figuras 29A-B, respectivamente); (3) thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, (4) thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC- vCPAB-MMAE ou (5) thio huMA79b.vI8-HC(A118C)-BMPEO-DM1 (figuras : 30B-D, respectivamente); (6) thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, e (7) thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, ou (8) thio huMAZ79b.v28- —HC(A1I8C)-MC-MMAF (ver figuras 31B-31D, respectivamente); ou (9) thio anti- cynoCDb79(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, (10) thio anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)--BMPEO-DM1 ou (11) thio ant cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF (ver figuras 32B-32D, respectivamente). Ig anti-humanodecamundongo conjugado a PE foi usado comoo anticorpo de detecção secundária (BD Cattt555787).
O anticorpo anti-CD79 ligado à superfície da célula foi detectado usando o conjugado PE de lg de camundongo anti-humano. Os traços em gráfico das figuras 29-32 indicam que a ligação foi aproximadamente igual para todos os conjugados thioMAb-droga testados..
EXEMPLO 8: ENSAIO PARA REDUÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS IN VITRO POR CONJUGADOS ANTI-CD798B8 THIOMAB-DROGA. A potência in vitro de conjugados anti-CD79b ThioMAb-droga (incluindo thio huMA79b.vI8-HC(A118C)-MCMMAF, thio huMAZOb.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1), foi medida por um ensaio de proliferação de células (figura 41A, BJAB- luciferase; Figura 41B, Granta-519; Figura 41C, WSU-DLCL2). O Luminescent oe Cell Viability Assay, Promega Corp CellTiter-Glo& é um método de ensaio homogêneo comercialmente disponível de (Promega Corp., Madison, WI), na expressão recombinante de luciferase Coleoptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670). Este ensaio de proliferação de células determina o número de células viáveis em cultura baseada na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al., J. Immunol. Metho., 160: 81-88 (1993), US 6602677). O ensaio de CellTiter-Glo& foi conduzido no formato de 96 reservatórios, tornando o mesmo receptivo a triagem de alta produção automática (HTS) (Cree et al., AntiCancer Drogas, 6:398-404 (1995)). - O procedimento de ensaio homogêneo ensaio envolve a adição de reagente o único (The CellTiter-Glo& Reagent) diretamente a células cultivadas em meio —suplementado com soro.
O formato homogêneo “medida da mistura adicionada resulta em lise de células e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. O substrato, Besouro Luciferina, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume recombinante com a conversão — concomitante de ATP em AMP e geração de fótons. As células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativas (RLU). Os dados podem ser registrados por luminômetro ou dispositivo de formação de imagem de câmera CCD. A saída de luminescência é apresentada como RLU, medida no curso de tempo.. A % de RLU é a percentagem de RLU normalizada comparada a um controle de “conjugado de não-droga. Alternativamente os fótons de luminescência podem ser contados em um contador de cintilação na presença de um cintilante. As unidades claras podem ser representadas então como —CPS (contagens por segundo).
A eficácia dos conjugados thioMAb-droga foi medida por um ensaio de proliferação de células empregando o seguinte protocolo, adaptado de CeliTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, boletim técnico TB288; o Mendoza et al., Cancer Res., 62: 5485-5488 (2002)): '
1. Uma alíquota de 40 ul da cultura de células contendo cerca | ! de 3000 células BJAB, Granta-519 ou WSU-DLCL2 no meio foi depositada em cada reservatório de uma placa emparedada opaca de 384 reservatórios.
2. TDC (conjugado ThioMab-Droga (10 ul) foi adicionado a reservatórios experimentais quadruplicados na concentração final de 3333, 1111, 370, 123, 41,13,7, 4.6 ou 1,5 ng/mL, com reservatórios de controle de "conjugado não-droga " recebendo o meio sozinho, e incubado durante 3 dias.
3. As placas foram equilibradas em temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. e 4. Reagente CellTiter-Glo (50 ul) foi adicionado.
5. Os conteúdos foram misturados durante 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise de células.
6. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência.
7. A luminescência foi registrada e expostas gráficos como —%RLU (unidades de luminescência relativas). Os dados das células incubadas com o meio livre de conjugado-droga foram traçados em gráfico a 0,51 ng/ml.
Meios: Cultura de células BJAB, Granta-519 e WSU-DLCL2 em RPMIN640/10%FBS/2mM glutamina.
a NS CS CC A SS Md A DE MS SS NS O 457 EXEMPLO 9: ENSAIO PARA INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR /N VIVO PELOS CONJUGADOS ANTI-CD798B THIOMAB DROGA A.
GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA MENTLE HUMANA) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados thioMAb-droga em xenoenxertos de Granta-519 (linfoma de célula do manto humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses oe (administrados no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 11, abaixo.
O Ab de controle foi hu-anti-=HER2-MC-MMAF ou MA79b-MC- MMAF.
HC(A118C) thioMAb foi thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MMAF thioMAb.
Os resultados são mostrados na tabela 11 e figura 33. A figura 33A é uma troca de traços em gráfico no volume médio —dotumor no curso de tempo no enxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com A118C de cadeia pesada ou anti-CD79b TDCs V205C de cadeia leve, em doses como mostrado na tabela 11. Especificamente, a . administração de thio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF e thio chMA79b- o LC(V205C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (anti-hu-HER2-MC-MMAF e thio-hu-anti- HER2-HC(A118C)-MC-MMAF.
Outros controles incluíram MA79b-MC-MMAF.
Além disso, no mesmo estudo, a percentagem de troca de peso corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem.
Os resultados (figura 33B) indicaram que a administração destes conjugados —thioMAb droga não resulta em uma percentagem de peso de peso corporal ou perda de peso durante este período.
Além disso, ainda, na tabela 11, o número de camundongos fora do número total testado mostrou PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável.(DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 11 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO CHMAZ9B-HC(A118C) Ou THio CHMAZ9B- LC(V205C) MMAF.
oe EM ENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17 mem RR Poe MMAF Ab (Droga (ngm?) (mg/kg) 1Ab) | hu-antcHER2-MC-MMAF de controle | 08 | 08 | 413 | 68 | 40 | meme el e [e de controle thio | enma7en-MC-MMAF de controle — | vs | 08 | 100 | 23 | ao | | ehmATeD-MC-MMAF de controle — | sm | 19 | 300 | ss | ao | | ho chmATob-HC(A118C) MC-MMAF | 08 | 08 | 68 | 23 | 1º | | Tho cnmA7eD-HC(A118C) MC-MMAF | 49 | 09 | 180 | 68 | 19 | Qo noemaTantovasa mamar | oe [om | wo | 28 | 16 | ho chmATob-Lc(v20sc)-Me-mnaF | 599 | 49 | 180 | 68 | 18 | B. XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3 (acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados de droga adicionais foi testada em enxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17. Os conjugados de droga e as doses (administrados no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 12, abaixo.
O anticorpo de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-
DM1). HC (A118C) thioMAb de controle foi thio hu-anti-c=HER2-HC(A118C o anticorpo) anticorpo thioMab (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvCPAB-MMAE), thio huMAZ9b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio hu-anti- CD22(10F4v3)-HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Os resultados — são mostrados na tabela 12 e figura 34, abaixo.
A figura 34A é uma troca de traçados em gráfico no volume do tumor no curso de tempo nos xenoenxertos de BJAB-Luciferase em camundongos SCID CB17 tratados m os conjugados de droga huMA?79b.v28- oe HC(A118C) thioMAb, como mostrado na tabela 12. Especificamente, a administração conjugado de droga thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, thio-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF e thio huMA7ZO9b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thioMAb mostrou uma inibição de crescimento de tumor quando comparado ao conjugado de droga de anticorpo de controle negativo — (thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu-anti-HER2- HC(AINISC)-MC-MMAF e thio-hu-anticHER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). Outros controles foram thio-huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC- DM1 e thio-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF.
Além disso, no mesmo estudo, a percentagem de troca de peso 6 corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (figura 34B) indicaram que a administração destes conjugados ThioMab-droga não causou um decréscimo significativo na percentagem de peso de peso corporal ou perda de peso durante este período.
Além disso, ainda, na tabela 12, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo)
TABELA 12 ReDuçÃão DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAZ9B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF, E DM1 IN XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR | Dose MMAF, | Dose DAR MMAE ou Ab (Droga DM (mg/k 1Ab) e (ngm?) 9) DM1 de controle thio MMAF de controle thio MCvcPAB-MMAE Thio Control controle ee ms BMPEO-DM1 MC-MMAF o MCvcPAB-MMAE o controle thio MC-MMAF de controle thio C.
XENOENXERTOS DE C.
WSU-DLCLZ2 (LINFOMA DE CÉLULAS GRANDES DIFUSAS Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia de conjugados thioMab-droga em xenoenxertos de WSU-DLCL2 em linfoma folicular (Linfoma de Células Grandes Difusas) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses são mostradas na tabela 13, abaixo.
O anticorpo de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC- DM1). HC(A118C) thioMAb de controle foi anticorpo thioMab thio hu-anti- HER2-HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB- MMAE), thio huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio anti-CD22 10F4v3- HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados [ na tabela 13 abaixo. | A figura 35A é uma troca de traçado em gráfico em volume de tumor médio no curso de tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL?2 (Linfoma de | Células Grandes Difusas) em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs de anti-CD79b A118C de cadeia pesada, e, doses como mostrado na tabela 13. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, thio huMA79b.v28-HC(A1I8C)-MC-MMAF e thio huMA79b.v28- HC(A118C)--MCvcPAB-MMAE mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)- — BMPEO-DM1, thio-hu-anti-=HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio-hu-anti-HER2- o HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-huMA79b.v28-HC(A118C)). Outros controles incluíram thio-huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF.
O TDC de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE pareceu ser o mais eficaz dos agentes de teste neste estudo.
Além disso, em algum estudo, a troca de percentagem de peso | 25 corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem.
Os resultados (figura 35B) indicaram que a administração destes conjugados | thioMab-droga não causou um decréscimo significativo na percentagem do peso corporal ou perda de peso durante este período. |
Além disso, ainda, na figura 13, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumorem qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA | = não aplicável.-(DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 13 | REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, | o ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA7Z9B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF, | E DM1 | EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 Em CAMUNDONGOS SCID CB17 | Anticorpo administrado CR Dose MMAF, Dose DAR MMAE ou DM1 | Ab (Droga (pg/m?) (mg/k | Ab) 9) hu-anti-HER2-HC(A118C)- o | om 114 1,86 BMPEO-DM1 o hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- | 0/1 | 011 115 19 MMAF de controle thio o hu-anti-HER2-HC(A118C)- o | om 92 4 1,55 : MCvVCPAB-MMAE de controle | O o thio huMA79b.v28-SMCC-DM1 de | 1/1 | o41 202 4 34 controle o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 0/1 | o11 110 4 1,85 BMPEO-DM1 o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 3/1 | 11 115 1,95 MC-MMAF o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 4/1 | 31 108 4 1,87 MCvcPAB-MMAE o huMA79b.v28-HC(A118C) de|o1| o NA NA controle thio o 10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF | 1/1 | of1 118 4 de controle thio o huMA79b.v28-HC(A118C) del o01 | 01 NA 4 NA controle thio o
D.
XENOENXERTOS DE DOHH2 (LINFOMA FOLICULAR) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a capacidade dos conjugados thioMab-droga para reduziro volume do tumor de células B em modelos de xenoenxerto de DOHH2 em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 14, abaixo. oe O Ab de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). O | 10 HC(A1I1I8C) thioMAb de controle foi thio hu-antic=HER2-HC(A118C) thioMAb (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), thio huMA?79b.v28-HC(A118C) thioMab e thio hu-anti-CD22-HC(A118C) (conjugado | a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 14 e figura 36. | A figura 36A is uma troca em traçado de gráfico em volume de | 15 tumor médio no curso de tempo no enxerto de células DOHH2 em camundongos SCID CB17 com TDCs de A118C de cadeia pesada, em doses como mostrado na figura 14.nas doses mostradas na tabela 14. Especificamente, a administração dos conjugados de droga thio huMA79b.v28- o HC-(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA7O9b.v28-HC(AINI8C)-MC-MMAF e conjugados de droga thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thioMAb nas doses mostradas na tabela 14 mostrou uma inibição de crescimento de | tumor quando comparado aos conjugados de droga de controle negativo (hu- anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 de controle thio, hu-anti-HER2- | HC(A118C)-MC-MMAF de controle thio, hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- | —MMAE de controle thio.
Outros controles incluíram huMA79b.v28-HC(A118C) | de controle thio, anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF de controle thio e | huMA79b.v28-HC(A118C) e huMA79b.v28-SMCC-DM1 de controle. | Além disso, ainda, na tabela 14, o número de camundongos fora | | do número total mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não —aplicável(DAR = Droga para Relação de Anticorpo) | TABELA 14 REDUÇÃO DO VOLUME DE TUMOR /N VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAZ9B.V28-HC(A118C) DM1, MMAF E o MMAE XENOENXERTOS DE DOHH2 Em CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR Dose Dose DAR MMAF ou Ab (Droga DM (mg/kg) 1Ab) (ugim?) hu-anti-HER2-HC(A118C)- 09 | oa 114 4 1,86 BMPEO-DM1 de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- 09 | os 115 19 MMAF de controle thio u-anti-HER2-HC(A118C)- 0/9 | 0/9 92 4 1,55 MCvcPAB-MMAE de controle o thio huMA79b.v28-SMCC-DM1 “de |1/8 |1/8 202 4 34 controle Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 1/9 | 1/9 110 4 1,85 BMPEO-DM1 Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 5/8 | 4/9 115 4 1,95 MC-MMAF | Thio huMA?79b.v28- 108 4 1,87 HC(A118C)-MCvcPAB- 19 19 | MMAE | huMA?79b.v28-HC(A118C) NA 4 NA | de controle thio o) E) anti-CD22-HC(A118C)- 118 4 1,96 MC-MMAF de controle thio |/9 |/9 | | |
E.
XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3, variando os conjugados anticorpo droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados de droga em xenoenxertosde BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 15, abaixo.
O anticorpo de controle foi o veículo (tampão (para ADC) oe sozinho). HC (A118C) thioMAb de controle foi o anticorpo thioMab thio hu-anti- HER2-HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC- MMAF), thio huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio anti-CD22 10F4v3- HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Estes resultados são mostrados na tabela 15, abaixo.
A figura 37A é uma troca em traçado em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo e, xenoenxertos de BJAB-luciferase em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 15. Especificamente, a administração de thio huMA?79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA?79b.v28-HC(A118C)- o MCvCPAB-MMAE e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (thio-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). — Outros — controles — incluíam — thio huMA?79b.v28-HC(A118C) e thio-10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF.
Além disso, ainda, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável.(DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 15 REDUÇÃO DO VOLUME DE TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAT9B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF, EDM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR Dose MMAF, Dose DAR MMAE ou DM1 Ab (Droga oe (ugim?) — ma'ka)| Ab) BMPEO-DM1 de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)- 0/10 | 9/10 23 1 1,55 MCvVCPAB-MMAE de controle thio Emp es MMAF de controle thio (ame o St BMPEO-DM1 | o BMPEO-DM1 MCvcPAB-MMAE MC-MMAF controle thio de controle thio F.
XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFÓCITO DE CÉLULA DO MANTO HUMANA) Em um estudo similar, o mesmo protocolo de estudo de
E E E EA A ÕÃ kk AE E A PE A »S»l ||P55ES a E RCE Eíók;ee ok» » »DS»FF , ) ICS» :IGSSS *;): E E DSO o | 467 xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-droga em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 16, abaixo). O HC(A1I1I8C) thioMAb de controle foi thio hu-anti-HER2- HC(A118C) thioMAb (conjugado a BMPEO-DM1 ou MC-MMAF). Os resultados oe são mostrados na tabela 16 e figura 38. A figura 38A é uma troca de traçados em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no enxerto de Granta 519 em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, em doses como mostrado na tabela 16. Especificamente, a administração do conjugado thioMab-droga a thio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM1 e thio huMA7O9b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF nas doses mostradas na tabela 16 mostraram uma inibição de crescimento de tumor quando comparados aos conjugados de droga de controle.
Ps Além disso, no mesmo estudo, a percentagem da troca de peso e corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem.
Os resultados (figura 38B) indicaram que administração deste conjugado thioMab- droga não resultou em um decréscimo na percentagem do peso corporal ou causou perda de peso durante este período.
Na tabela 16, o número de camundongos para um número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em — qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável.(DAR = Droga para Relação de Anticorpo) RRRRNMSMSMMMMMMMMhMhMhM
TABELA 16 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR /N VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAZ9B.V28-HC(A118C) DM E MMAF XENOENXERTOS EM GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR Dose Dose DAR MMAF ou Ab (Droga DM (mg/kg) 1Ab) (pg/m?) 6 hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- 342 12 DM1 de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de controle thio Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- o/6 55 2 BMPEO-DM1 Tno — huMATObV28HC(AI1SC)- BMPEO-DM1 Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- 4/8 219 ; BMPEO-DM1 o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- 5/8 329 12 BMPEO-DM1 Thio — huMA79b.v28-HC(A118C)-MC- | 1/8 18 57 2 1,95
MMAF Thio — huMA79b.v28-HC(A118C)-MC- | 2/8 178 115 4 1,95
MMAF Thio — huMA79b.v28-HC(A118C)-MC- | 6/8 2/8 229 MMAF . Thio — huMA79b.v28-HC(A118C)-MC- | 4/8 E 344 12 1,95
MMAF G.
XENOENXERTOS DE WSU-DLCL?2 (LINFOMA DE CÉLULA GRANDE DIFUSA) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-droga em xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula Grande Difusa) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 17, abaixo. oe O anticorpo de controle foi veículo (tampão (para ADC) sozinho). Os thioMabs de controle foram anticorpo thioMabs thio hu-anti-HER2- HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 17 e figura 39. A figura 39 é uma troca de traçado em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no xenoenxerto de WSU-DLC12 em camundongos —SCIDCB17 tratados com o TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 17. Especificamente a administração de thio huMA?79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC- MMAF e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (na dose Ab de 0,5, o 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos (thio-hu-antic-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu- anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- MMAF e veículo A) de controles negativos.
Além disso, ainda, na tabela 17, o número de camundongos para um número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) |
TABELA 17 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAZ9B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF,
EDM EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 Em CAMUNDONGOS SCID CB17 | Anticorpo administrado CR Dose MMAF, Dose | DAR | MMAE ou Ab (Dro DM1 (mg/kg) | ga (ngm?) 1Ab) O fes O ex] uENNO de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- 0/9 0/9 92 4 1,55 MMAE de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF o/a o/9 115 [o Thio Control Thio — huMA7O9b.v28-HC(A118C)-MC- | 5/9 2/9 112 4
MMAF o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 4/9 0/9 110 BMPEO-DM1 Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 1/9 | o/a 14 0,5 19 MCVcPAB-MMAE Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 0/9 | o/a 27 10 19 MCVcPAB-MMAE Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 2/9 | 1/9 55 20 |19 MCvcPAB-MMAE Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 1/9 7/9 110 40 119 MCvcPAB-MMAE hehehe
H. XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA DO MANTO HUMANA) Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-droga em enxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 18, abaixo. o Os thio Mabs de controle foram thio hu-anti-HER2-HC(A118C) (conjugados a BMPEO-DM1) e anticorpo thioMabthio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thioMAbs.
A figura 40A é uma troca de traçados em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no enxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesaday em doses como mostrado na tabela 18. Especificamente a administração de thio huMAZ79b.v28-HC(A118C)- BMPEO-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (em oe doses de Ab de 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparada a (thio-anticHER2- HC(A1I8C)-BMPEO-DM1 e thio-antic=HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de controle negativo.
Além disso, ainda, na tabela 18, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável (DAR = Droga para Relação de Anticorpo)
TABELA 18 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMAZ9B.V28-HC(A118C) DM1 E MMAE EM XENOENXERTOS DE GRANTA-519 Em CAMUNDONGOS SCID CB17 | Anticorpo administrado CR Dose Dose DAR | MMAF, Ab (Droga | MMAE ou | (mg/kg) | /Ab) | DM1 o (ngm?) hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- 0/10 | 09/10 114 1,86 DM1 de controle thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- | 2/10 | 1/10 92 4 1,55 MMAE de controle thio Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 3/10 | 0/10 4 BMPEO-DM1 Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 0/10 | 1/10 13 0,5 1,87 MCvcPAB-MMAE o Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- 0/10 27 1,0 187 MCvcPAB-MMAE Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 1/10 | 7/10 54 20 1,87 MCvcPAB-MMAE Thio huMA79b.v28-HC(A118C)- | 0/10 | 10/10 108 4,0 1,87 MCvcPAB-MMAE l]. XENOENXERTOS DE BJAB-CYNOCD79B8 Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-
droga em células BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando xenoenxertos de cynoCD79b (BJAB-cynoCD79b) em camundongos SCID CB17 foi estudada.
Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia O para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 18, abaixo.
O Ab de controle foi veículo (tampão sozinho). Os thio Mabs de controle foram thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF e anticorpo de thioMabs thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)- MCvCPAB-MMAE.
Os resultados são mostrados na tabela 19 e figura 50. oe A figura 50 é um traçado em gráfico da inibição de crescimento de tumor no curso de tempo no xenoenxerto de BJAB-cynoCD79b em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de | cadeia pesada, nas doses como mostrado na tabela 19. Especificamente, a | administração de thio huMAZ79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio | huMA?79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio huMA?79b.v28- | HC(A1I8C)-MC-MMAF bem como thio-anti-cynoCD79b(ch10D10)- | HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-anti-ccoynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)- | MCvcPAB-MMAE e thio-anticcynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF e mostrou a inibição de crescimento de tumor quando comparada a (thio-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE e thio-antic=HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de controles negativos e veículo A). Além disso, ainda, na tabela 19, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável (DAR = Droga para Relação de Anticorpo)
TABELA 19 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO ANTI-CYNO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1, MMAF Ou MMAE Ou THio HumA79B.V28 DM1, MMAF Ou MMAE XENOENXERTOS EM BJAB-CYNocD798 Em CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR Dose MMAF, Dose DAR MMAE ou Ab (Droga DM1 (mg/kg) | /Ab) o (ugrm?) hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 0/9 o/9 57 2 1,86 de controle thio MMAE de controle thio controle thio HC(A118C)-BMPEO-DM1 Linea o o HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE Thio anti-ccynoCD79b(ch10D10)- | 0/9 1/9 28 1,9 [eee o [OS DM1 MCvcPAB-MMAE
MMAF J. XENOENXERTOS DE BJAB-CYNOCD798 Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-droga em células BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando xenoenxertos de cynoCD79b (BJAB-cynoCD79b) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia0O para todos os ADCs e controles) são: mostrados na tabela 19, abaixo.
O thioMab de controle foi thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- DM1, thio-huMA79b.v28-HC(A118C), e anticorpo thioMabs thio-anti- oe cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C). Os resultados são mostrados na tabela 20 efigura 51.
A figura 51 é um traçado em gráfico da inibição de crescimento de tumor no curso de tempo no enxerto de BJAB-cynoCD79b em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 20. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 bem como de thio-anticeynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparada (thio-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 de controles negativos. Outros controles o incluíram thio-hu-MA79b.v28-HC(A118C) e thio-anti-ccynoCD79b(ch10D10)- HC(A118C).
Os resultados são mostrados na tabela 20, abaixo. Na tabela 20, o número de camundongos para o número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a O mm?) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo)
TABELA 20 ReDuçÃo Do VoLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO ANTI-CYNO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1 Ou THo Huma798B.V28-HC(A118C) DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-CYyNOCD79B8 EM CAMUNDONGOS SCID CB17 Anticorpo administrado CR Dose MMAF, Dose DAR MMAE ou Ab (Droga (pgim?) . DM1 de controle tio tio HC(A118C) de controle tio oo eee jm ms Ds e | BMPEO-DM1 BMPEO-DM1 | o HC(A118C)-BMPEO-DM1 Thio anti-coynoCD79b(ch10D10)- | 0/10 110 53 2 1,8 [oem od o 1º | O relatório descritivo escrito acima é considerado o bastante para possibilitar que um versado na técnica pratique a invenção.
O escopo da presente invenção não se limita à construção depositada, uma vez que a modalidade depositada tem a finalidade única de ilustrar determinados aspectos da invenção e todas as interpretações que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção.
O depósito do presente material não constitui uma admissão de que a descrição escrita contida aqui é inadequada para capacitar a prática de qualquer aspecto da invenção,
NM ns | 477 incluindo o melhor modo da mesma, nem deve ser interpretada como limitadora do escopo das reivindicações nas ilustrações específicas que ela representa.
Naturalmente, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão evidentes aos versados na técnica a partir da — descrição acima e estão dentro do escopo das reivindicações em anexo. o | E aa

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. ANTICORPO ANTI-CD79b, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pelomenos uma sequência HVR selecionada a partir do grupo consistindo de: () sequência HVR-L1 compreendendo A1-A15, em que A1- A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) sequência HVR-L2 compreendendo B1-B7, em que B1-B7 oe é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) sequência HVR-L3 compreendendo C1-C9, em, que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) — sequência HVR-H1 compreendendo D1-D10, em que D1- D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) — sequência HVR-H2 compreendendo E1-E18, em que E1- E18é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) ' (vi) sequência HVR-H3 compreendendo F1-F10, em que F1- F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); e (b) pelomenos uma variante HVR, em que a variante HVR e compreende a modificação de pelo menos um resíduo da sequência descrita em SEQID NO: 131,132, 133, 134, 135 ou 136.
    2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que F6 em uma variante HVR-H3 é |, FT é ReFBéL.
    3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que A9 em uma variante HVR-L1 é E ou S.
    4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da sequência da estrutura é uma sequência de consenso humana.
    5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,
    caracterizado pelo fato de que dita modificação é substituição, inserção ou deleção.
    6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante HVR-L1 compreende uma — substituição em qualquer uma das seguintes posições: A4K), A9 (E ou S) e A10(AouS).
    7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante HVR-L2 compreende 1-5 (1, 2, 3, 40u oe 5) substituições em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: B2 (SouG)B3(RouG) B4(K,R,Y,1l,Hou Q), BS(R), B8E(G,K A,R, SouLl)e B7 (RN, TouG).
    8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante HVR-L3 compreende 1-4 (1, 2, 3 ou 4) substituições em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: C1 (NouD), C2(NouP),C3(D ou R), C5(S, K, A, Q, D, L ou G), C6(A, E ou N), C7 (A), C8 (R) e C9(N).
    9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante HVR-H1 compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, o 5, 6, ou 7) substituições em qualquer uma ou combinação das seguintes — posições: D1(P), D2(F), D3(P,S,Y,GounN), D4(LouV), DS(T. RN K,C, G ou P), D6 (R, T, Kou G), D8 (F), D9 (V ou L) e DIO (S, Q, Nou D).
    10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante HVR-H3 compreende 1-3 (1, 2, ou 3) substituições em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: F4 (R oul)F6(louF), F7(K C,R VourF), F8(L)e F9(S).
    11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a HVR-H2 tendo a sequência de SEQ ID NO: 135.
    12. ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b humano é substancialmente a mesma que a afinidade monovalente de um anticorpo de murino compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia levedaSEQIDNO:10eSEQID NO: 14.
    13. —ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade monovalente do anticorpo para CD79b humanos é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior do que a afinidade oe monovalente de um anticorpo de murino ou quimérico compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia leve da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14.
    14. — ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade monovalente do anticorpo CD79b para humanos é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30,35,40,45, 50,55 ou 60 vezes menor do que a afinidade monovalente de um anticorpo de murino ou quimérico compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia leve da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14. . 15. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 12- e 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de murino é produzido pela linhagem de células de hibridoma depositada com o ATCC como HBlI 1413 em 20 de julho de 1993.
    16. —ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é substancialmente a mesma que a afinidade de um anticorpo de —murino em sua forma bivalente e compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia leve da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14.
    17. —ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior do que a afinidade de um anticorpo de murino ou quimérico em sua forma bivalente e compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia leve SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14.
    18. — ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor do que a afinidade de um oe anticorpo de murino ou quimérico em sua forma bivalente compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada e cadeia leve SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14.
    19. — ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,4 nM.
    20. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,4 nM +/- 0,04. e 21. —"ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,2nM.
    22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,2 nM +/- 0,02.
    23. — ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado —pelofatode que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,5 nM.
    24. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b humano é 0,5 nM +/- 0,1.
    25. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 12 a 24, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é expressada como um valor Kd. 5 26. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 12 a 24, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é medida por Biacore radioimunoensaio.
    27. ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 1 a 3, oe caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de estrutura de consenso K humano do subgrupo 1.
    28. —ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de estrutura de consenso humano de cadeia pesada do subgrupo III.
    29. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28, | caracterizado pelo fato de que a sequência da estrutura compreende uma | substituição na posição 71, 73 e/ou 78. |
    30. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 29, | oe caracterizado pelo fato de que dita substituição é R71A, N73T e/ou L78A.
    31. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a sequência da estrutura compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78.
    32. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dita substituição é V481, F67A, I69F, R71A, N73T e/ou L78A.
    33. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a sequência da estrutura compreende uma substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80.
    34. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 33,
    caracterizado pelo fato de que dita substituição é V481, F67A, I69F, R71A, N73T, K758S, L78A, e/ou L8OM.
    35. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência da estrutura compreende uma —substituiçãona posição 4 e/ou posição 47.
    36. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que dita substituição é M4L e/ou L47F.
    37. —ANTICORPO ANTI-CD79b HUMANIZADO, caracterizado oe pelo fato de que o anticorpo humanizado quando conjugado a um agente —citotóxico inibe o crescimento de tumor celular.
    38. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que tanto o anticorpo humanizado como o anticorpo quimérico são monovalentes ou bivalentes.
    39. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que tanto o anticorpo humanizado como o anticorpo quimérico compreendem uma região Fab única ligada a uma região Fc. e 40. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC SEQ ID NO: 164-166.
    41. —"ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC SEQ ID NO: 160-163.
    42. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CH1 e/ou Fc SEQ ID NO: 167 e/ou 168.
    43. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC,
    HVR2-LC e/ou HVR3-LC SEQ ID NO: 156-158.
    44. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC SEQ ID NO: 1562-155.
    45. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CL1 SEQ ID NO: 159.
    46. “POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que oe compreende a sequência SEQ ID NO: 170 ou SEQ ID NO 169.
    47. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de: (a) cultivar uma célula expressando um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 40 a 42, e um domínio variável de cadeia leve, conforme descrito em uma das reivindicações 43 a 45; e (b) isolar o anticorpo de referida célula cultivada.
    48. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende e um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 40 a 42, e um domínio variável de cadeia leve, conforme descritoem uma das reivindicações 43 a 45.
    49. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monovalente e compreende uma região Fc.
    50. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, ' HVR2-HC e/ou HVR3-HC SEQ ID NO: 183-185.
    51. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência
    FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC SEQ ID NO: 179-182.
    52. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 50 ou 51, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CH1 e/ou Fc SEQ ID NO: 186 e/ou 187.
    53. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC SEQ ID NO:175-177.
    54. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 53, oe caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1I-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC SEQ ID NO: 171-174.
    55. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CL1 SEQ ID NO: 178.
    56. —“POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência SEQ ID NO: 189 ou SEQ ID NO 188.
    57. —"ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de: (a) cultivar uma célula expressando um anticorpo compreendendo ed um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 50 a 52, e um domínio variável de cadeia leve conforme descrito em uma das reivindicações 53-55; e (b) isolar o anticorpo de dita célula cultivada. : 58. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 50-52, e um domínio variável de cadeia leve, conforme descrito em uma das reivindicações 53-55.
    59. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monovalente e compreende uma região Fc.
    60. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC SEQ ID NO: 202-204.
    61. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC SEQ ID NO: 198-201.
    62. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 60 oe ou 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CH16e/ouFc(SEQID NO: 205 e/ou 206).
    63. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC SEQ ID NO: 194-196.
    64. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC SEQ ID NO: 190-193. | 65. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 63 o ou 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CL1 | SEQ ID NO: 197.
    66. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência SEQ ID NO: 208 ou SEQ ID NO 207.
    67. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de: (a) cultivar uma célula expressando um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 60 a 62, e um domínio variável de cadeia leve, conforme descrito em uma das reivindicações 63 a 65; e (b) isolar o anticorpo de referida célula cultivada.
    68. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 60 a 62, e um domínio variável de cadeia leve, conforme descrito em uma das reivindicações 63 a 65.
    69. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monovalente e compreende uma região Fc.
    70. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende o um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC SEQ ID NO: 221-223
    71. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC SEQ ID NO: 217-220.
    72. —ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 70 ou71,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc SEQ ID NO: 224 e/ou 225.
    73. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende . um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, o HVR2-LC e/ou HVR3-LC SEQ ID NO: 213-215.
    74. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o domínio variável compreende a sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC SEQ ID NO: 209-212.
    75. — ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência CL1 SEQIDNO:216.
    76. —POLIPEPTÍDEO, caracteriazado pelo fato que compreende a sequência SEQ ID NO: 227 ou SEQ ID NO: 226.
    77. —ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de: (a) cultivar uma célula expressando um anticorpo compreendendo | um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das reivindicações 70 a 72, e um domínio variável de cadeia leve, conforme | descrito em uma das reivindicações 73 a 75; e | (b) isolar o anticorpo de dita célula cultivada. '
    78. — ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que compreende | um domínio variável de cadeia pesada, conforme descrito em uma das o reivindicações 70 a 72, e um domínio variável de cadeia leve, conforme | descrito em uma das reivindicações 73 a 75.
    79. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 78, | caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monovalente e compreende uma região Fc.
    80. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 169.
    81. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, o caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO:
    170.
    82. “ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, | caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de | 25 —cadeialeve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido | com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 188.
    83. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de
    | cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO:
    189.
    84. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 207.
    85. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado oe pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 208.
    86. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido — comuma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 226.
    87. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada e tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 227.
    88. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos de estrutura selecionadas de SEQ ID NO: 143, 144, 145 e 146.
    89. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos de estrutura selecionadas de SEQ ID NO: 139, 140, 141 e 142.
    90. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,
    Í | caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de | cadeia pesada compreendendo uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos de estrutura tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 143, 144, 145 e14e.
    91. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma, duas, três ou quatro sequências de e aminoácidos de estrutura tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de: SEQ ID NO: 139, 140, 141 e 142.
    92. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO:
    170.
    93. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de e cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido —com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 169.
    94. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação &2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 189.
    95. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 188.
    96. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 208.
    | 5 97. —“ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 85, | caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 207.
    e 98. — ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de | cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 227.
    99. —ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 87, ' caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 226.
    100. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo o fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma — sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 170.
    101. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 169.
    102. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 170 e um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 169.
    103. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189.
    104. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo | | fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo | Q pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQIDNO: 188. |
    105. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo | fato de que o anticorpo compreende um domínio variável! de cadeia pesada | tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 189 e um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188.
    106. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo o fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQIDNO: 208.
    107. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207.
    108. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de
    16 | cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207.
    109. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 227.
    110. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo | fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo e pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 226. | 111. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD79B, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada | tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de | aminoácidos da SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia leve tendo | 15 pelomenos 90% de sequência de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 226.
    112. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que 6 codifica um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6-10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    113. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme descrito na reivindicação 112.
    114. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, conforme descrito na reivindicação 113.
    115. MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-CD79b, — caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira selecionada a partir do grupo compreendendo uma célula eucariótica e uma célula CHO nas condições apropriadas para expressão do polinucleotídeo codificando o anticorpo, e
    (b) isolar o anticorpo.
    116. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato que o anticorpo liga-se a um epítopo dentro de uma região de CD79b de aminoácido 29-39 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácido 1-11 da SEQ ID NO: 16. | 117. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicação 1,6 a | 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que o CD79b é expressado sobre a superfície de uma célula. oe 118. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula B. | 119. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a célula B é associada com um distúrbio | proliferativo de células B. | 120. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo de células B é um câncer.
    121. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo de células B é o selecionado a partir de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    122. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1, 6 a10,48,68,78,85,102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
    123. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')>. : 124. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 122, | caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.
    125. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1, 6 a10,48,68,78,85,102,105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo como um anticorpo selecionado de ATCC como HBI 1413, depositado em 20 de julho de 1993; um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 170 e oe um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:169; um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 189 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 188; um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 207; e um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 227 e | 15 um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 226.
    126. IMUNOCONJUGADO, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1,6 a o 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, covalentemente fixado a um agente citotóxico.
    127. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado de uma toxina, um agente quimioterápico, uma porção de droga, um antibiótico, um isótopo radioativo e uma enzima nucleofílica.
    128. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o imunoconjugado tem a fórmula Ab-(L-D)p, sendo que: (a) Ab é o anticorpo conforme descrito em uma das reivindicações 1,6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160;
    (b) L é um ligante; (c) D é uma porção de droga.
    129. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que L é selecionado de 6-maleimidocaproíla (MC), —maleimidopropanoíla (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala- phe), p-aminobenziloxicarbonila (PAB), pentanoato de N-succinimidil 4-(2- piriditio) (SPP), ciclo-hexano-1 carboxilato de N-succinimidil 4-(N- maleimidometila) (SMCC), e aminobenzoato de N-succinimidil (4-iodo-acetila) e (SIAB) e D é selecionado de uma auristatina e dolostatina.
    130. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado, conforme descrito na reivindicação 128 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    131. MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA CD79b, caracterizado pelo fato de que dito método | 15 compreende contatar dita célula com um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, desse modo causando uma inibição do crescimento de dita célula. oe 132. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente | 20 citotóxico.
    133. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
    134. MÉTODO TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO TENDO — CÂNCER, caracterizado pelo fato de que dito método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    135. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134,
    caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de linfoma, linfoma não- Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    136. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que referido anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento.
    oe 137. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO PROLIFERATIVO, em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que dito método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de anticorpo conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    138. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que que dito distúrbio proliferativo é câncer.
    139. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que que dito câncer é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin e (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    140. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento.
    141. MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA, em que o crescimento da dita célula é pelo menos em parte dependente de um efeito potencializador de CD79b, caracterizado pelo fato de que dito método compreende contatar dita células com uma quantidade eficaz
    | de um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, desse modo inibindo o crescimento de dita célula.
    142. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um conjugado a um agente inibidor de crescimento.
    143. MÉTODO DE TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE UM TUMOR EM UM MAMÍFERO, em que o crescimento de dito tumor é pelo e menos em parte dependente de um efeito potencializador de crescimento de CD79b, caracterizado pelo fato de dito método compreendendo contatar dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo, conforme descrita em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    144. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que dito tumor é associado com linfoma, linfoma —não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), e leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. Á 145. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento.
    146. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS B /N VITRO, caracterizado pelo fato de que compreende expor uma célula a um imunoconjugado, conforme descrito na reivindicação 129, em condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b.
    147. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que a proliferação de células B é selecionada de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL) NHL agressivo, NHL agressivo
    | | 22 | reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    148. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que a célula B é um xenoenxerto.
    149. MÉTODO DE DETERMINAR A PRESENÇA DE CD79B, em uma amostra biológica suspeita de conter CD79b, caracterizado pelo fato eo de que dito método compreendendo expor dita amostra a um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, e determinar a ligação de dito anticorpo a CD79b em dita amostra, sendo que a ligação de dito anticorpo a CD79b em dita amostra é indicativa da presença de dita proteína em dita amostra.
    150. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é de um paciente suspeito de ter um distúrbio proliferativo de células B.
    151. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 150, e caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo de células B é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    152. MÉTODO DE LIGAR UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das reivindicações 1,6 a 10,48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160 a uma célula que expressa CD79b, caracterizado pelo fato de que dito método compreende contatar dita célula com um anticorpo, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    153. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento.
    154. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo de ligação de albumina.
    155. ANTICORPO, que se liga a CD79b, caracterizado pelo fato e de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelomenos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 301.
    156. ANTICORPO, que se liga a CD79b, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos —selecionadada SEQ ID NO: 302.
    157. ANTICORPO que se liga a CD79b, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo o pelo menos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 301 e um domínio variável de cadeia leve tendo — pelomenos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 302.
    158. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1,6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160.
    159. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 158, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um veículo.
    160. ANTICORPO, que se liga a CD79b, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 14 e um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 10.
    161. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para tratar câncer..
    oe 162. USO, de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. | 15 163. USO, de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que referido anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a | um agente inibidor de crescimento. | 164. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das | e reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para para tratar um distúrbio proliferativo.
    165. USO, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que que dito distúrbio proliferativo é câncer.
    166. USO, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado —pelofatode que que dito câncer é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL),
    leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    167. USO, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento.
    168. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das reivindicações 1, 6 a 10, 48, 68, 78, 85, 102, 105, 108, 111, 157 ou 160, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para tratar um tumor. | eo 169. USO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado | —pelofatode que que dito câncer é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia !infocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    170. USO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é conjugado a um agente citotóxico e/ou a um agente inibidor de crescimento. e 171. USO DE UM IMUNOCONJUGADO, conforme descrito na ' reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para inibir a proliferação de células B.
    172. USO, de acordo com a reivindicação 171, caracterizado pelo fato de que a proliferação de células B é selecionada de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
    173. USO, de acordo com a reivindicação 171, caracterizado pelo fato de que a célula B é um xenoenxerto.
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B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/07/2008, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.

B09W Correction of the decision to grant [chapter 9.1.4 patent gazette]

Free format text: RETIFICA-SE O DEFERIMENTO NOTIFICADO NA RPI NO 2675 DE 12/04/2022.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A RPI 2685 DE 21/06/2022, QUANTO AO RELATORIO DESCRITIVO E QUADRO REIVINDICATORIO.