CN115651881B - 一种益生菌复合菌液、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌复合菌液、制备方法及其应用，属于微生物组合物技术领域。本发明的益生菌复合菌液包括如下组分：培养基、益生菌原液。其中所述培养基包括如下组分：蛋白胨、牛肉粉、酵母提取物、氯化钠、醋酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、尿嘧啶、氯化钙、改性琼脂、果糖、麦芽糖、丙酮酸钠、吐温80、水。与现有技术相比，本发明制备的益生菌复合菌液增殖速率快，菌量多，活性强，能够有效促进动物采食量和免疫水平的提高，改善了营养成份结构。

Description

一种益生菌复合菌液、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物组合物技术领域，尤其涉及一种益生菌复合菌液、制备方法及其应用。

背景技术

益生菌的最大特点是活菌，益生菌具有维持肠道微生态平衡、为机体提供多种营养物质，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，提高机体免疫力等作用，益生菌运用十分广泛。某些菌类是良好的免疫激活剂，机体免疫系统受到刺激后，产生干扰素，提高血液中免疫球蛋白的浓度，增强巨噬细胞的活力，提高动物的体液免疫和细胞免疫水平。例如枯草芽孢杆菌能提高饲料利用率与畜禽生产性能和抗病能力，改善养殖环境，乳酸菌具有维持与改善机体正常生理功能、促进营养成分吸收、延长食品保存期等功能。但是现有技术中存在益生菌繁殖速度慢、活性差的缺点。

发明专利CN110063407B公开了一种复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发酵饲料，该复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液8~10份、约氏乳杆菌菌剂8~15份、保加利亚乳杆菌菌剂25~30份、双歧杆菌菌剂15~20份、伯顿毕赤酵母菌剂5~8份；所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂分别由发酵液与相应菌制备而成；所述养料液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液；所述发酵液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液；该发明中双孢蘑菇罐藏加工废水能够被充分利用，节约了双孢蘑菇罐藏加工废水的处理成本。但是该发明制备的复合益生菌菌液存在菌种复杂、活性低的缺点。

发明专利CN103497901A公开了一种新型发酵床养猪复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂包括如下各组分：枯草芽孢杆菌、厌氧性拟杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、酵母菌、果寡糖、异麦芽寡糖、DL-蛋胺酸、L-赖胺酸、复合维生素、大豆粉。该发明用于生态养猪制作发酵床的益生菌种，适合在秸秆、稻壳等有机质中扩繁生长，能增强猪粪便、尿液的分解效率，饲养期菌落数量稳定，有效提高发酵床的使用寿命，同时有利于调节猪肠道微生态平衡，增加生态养猪免疫机能及生产性能，显著提高养殖的经济效益。但是该复合益生菌制剂菌种的繁殖速度差、活性低，对采食量和免疫机能调节有限。

发明内容

有鉴于现有技术中益生菌复合菌液生产过程复杂、繁殖速度低、活性差的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、繁殖速度快、活性高的益生菌复合菌液、制备方法及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种益生菌复合菌液，包括如下组分：培养基、益生菌原液。

所述培养基包括如下组分：蛋白胨、牛肉粉、酵母提取物、氯化钠、醋酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、尿嘧啶、氯化钙、改性琼脂、果糖、麦芽糖、丙酮酸钠、吐温80、水。

优选的，所述培养基，以重量份计，包括以下组分：10~20份蛋白胨、5~15份牛肉粉、3~8份酵母提取物、3~8份氯化钠、1~5份醋酸钠、1~3份磷酸氢二钾、0.1~0.3份七水硫酸镁、0.05~0.2份尿嘧啶、0.1~0.4份氯化钙、3~8份改性琼脂、1~5份果糖、4~8份麦芽糖、1~3份丙酮酸钠、0.5~2份吐温80、900~1000份水。

本发明还公开了一种益生菌复合菌液的制备方法。

一种益生菌复合菌液的制备方法如下：

Z1、称取各原料，将蛋白胨、牛肉粉、酵母提取物、氯化钠、醋酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、尿嘧啶、氯化钙、改性琼脂、果糖、麦芽糖、丙酮酸钠和吐温80加水配置成混合物；搅拌30~50min，搅拌速度为100~300rpm；在120~130℃灭菌20~50min，得到培养基；

Z2、将益生菌原液加入到Z1制备的培养基中在30~45°C培养48~96h；然后用生理盐水冲洗2~5次，制成益生菌复合菌液。

优选的，所述培养益生菌原液加入到Z1制备的培养基中在30~45°C培养48~96h。

优选的，所述益生菌原液与Z1制备的培养基质量比为1:80~120。

优选的，所述益生菌原液中益生菌含量为150~300亿/g。

优选的，所述益生菌原液由枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌按照数量比为1：0.6~1：0.4~0.8组合而成。

所述改性琼脂制备方法如下：

S1、将琼脂和高碘酸钠加入水中，在室温下避光中搅拌反应3~8h；加入乙二醇，反应0.5~2h；加入盐酸多巴胺，室温反应5~20h；透析1~5d，透析膜截留分子量为600~1000；冷冻干燥，得到预处理琼脂；

S2、将预处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；滴加丙烯酸甲酯乙醇溶液，持续搅拌反应20~50min；调整溶液pH值为8.0~8.5；继续搅拌反应0.3~1h；过滤后分别用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到后处理琼脂；

S3、后处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；加入辛烯基琥珀酸酐、异丙醇的混合水溶液；调整溶液pH值为7.0~9.0，搅拌反应1.5~5h；过滤后用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到改性琼脂。

优选的，所述改性琼脂制备方法如下，以重量份计：

S1、将3~8份琼脂和1~5份高碘酸钠加入400~600份水中，在室温下避光中搅拌反应3~8h，搅拌速度为100~300rpm，然后加入3~8份乙二醇，反应0.5~2h后，加入3~8份盐酸多巴胺，室温反应5~20h，然后透析1~5d，透析膜截留分子量为600~1000，冷冻干燥5~20h，冷冻干燥温度为-30~-10℃，得到预处理琼脂；

S2、将S1制备的预处理琼脂加入80~120份水中，在45~60℃下持续搅拌1~5h，搅拌速度为100~500rpm，然后滴加2~6份10~25wt%丙烯酸甲酯乙醇溶液，滴加速度为0.5~2mL/min，滴加完以300~800rpm持续搅拌20~50min，然后采用1~5wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值为8.0~8.5，继续反应0.3~1h，反应结束后，先用水洗涤2~5次，再用70~80wt%乙醇水溶液洗涤1~3次，然后在45~60℃下干燥1~5h，粉碎，通过60~120目筛，得到后处理琼脂；

S3、将步骤S2制备的后处理琼脂加入100~150份水中，在35~50℃搅拌1~3h，搅拌速度为100~500rpm，加入200~300份混合水溶液，混合水溶液为0.5~2份辛烯基琥珀酸酐和2~8份异丙醇加200~300份水配置而成，然后加入2~5wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值7.0~9.0，反应时间为1.5~5h，反应结束后，混合物用65~80wt%乙醇水溶液和水分别洗涤1~3次，在45~60℃的烤箱中干燥1~5h，然后通过80~100目尼龙筛，得到改性琼脂。

所述的益生菌复合菌液在发酵饲料中的应用。所述益生菌复合菌液在发酵饲料中的添加量为0.2~0.4wt%。

所述发酵饲料，以重量份计，包括如下组分：1~3份乙基纤维素、0.5~1份甘蔗渣、0.5~1份氨基酸原粉、0.5~1份腐质酸钾、1~3份玉米秸秆糠、0.4~1份纳米磷酸钙、2~3份稻壳、2~6份大豆胚芽粉、4~8份膨化玉米粉、6~10份水和益生菌复合菌液。

所述发酵饲料制备方法如下：

按重量份和重量百分比称取各原料，将乙基纤维素、甘蔗渣、氨基酸原粉、腐质酸钾、玉米秸秆糠、纳米磷酸钙、稻壳洗净之后，晒干或者晾干，然后一同放入到饲料粉碎机中打成颗粒，加入大豆胚芽粉、膨化玉米粉和水混合搅拌1~5h，搅拌速度为30~80rpm，然后倒入高压灭菌锅中，高压蒸汽灭菌10~30min，压强为0.15~0.3MPa，冷却至室温后，加入到发酵罐中，添加益生菌复合菌液；发酵温度控制在28~35℃，发酵时间为1~5d，然后将经发酵混合物转运至烘干室中烘干10~20h，保持通风，烘干室温度控制在30~40℃，即得发酵饲料。

本发明通过琼脂与高碘酸钠反应，然后进行盐酸多巴胺接枝制备成预处理琼脂，再经过丙烯酸甲酯乙醇溶液的处理得到后处理琼脂，后处理琼脂与辛烯基琥珀酸酐和异丙醇进行反应得到改性琼脂；通过改性琼脂配置的培养基培育枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和植物乳杆菌制备成益生菌复合菌液；益生菌复合菌液对饲料进行发酵制备成发酵饲料。

由于盐酸多巴胺中的羟基，接枝琼脂后得到的预处理琼脂结构易于渗透，能促进益生菌的生长和物质交换。而且由于盐酸多巴胺中的儿茶酚结构能增强益生菌的湿性粘附，并且具有良好的细胞相容性；盐酸多巴胺的接枝也为下一步在碱性环境下采用丙烯酸甲酯乙醇溶液处理提供了反应位点；碱性环境可以促进羟基的亲和性，使预处理琼脂膨胀，增加丙烯酸甲酯向预处理琼脂的扩散，从而提高酯化速率。丙烯酸甲酯的羧基结合在预处理琼脂上，显著提高了预处理琼脂的稳定性，并影响培养基的表面张力，能在培养基界面形成稳定膜，以稳定营养组分。辛烯基琥珀酸酐的环结构被打开，形成两个高活性羧酸基团。其中一个羧基与后处理琼脂的羟基反应生成酯，另一个羧基被氢氧化钠中和。经辛烯基琥珀酸酐改性后，辛烯基琥珀酸酐水解产生的酰基通过氢键连接到后处理琼脂分子中。酰基的引入会阻碍了后处理琼脂链之间双螺旋的形成，导致三维网络结构变得松散，孔径变大。改性琼脂链表面的羧基基团增加了改性琼脂的亲水性，从而产生了良好的保水性。此外，在后处理琼脂链中插入酰基降低了琼脂颗粒之间的静电相互作用，使更多的水渗透到琼脂颗粒中。辛烯基琥珀酸酐通过其中的酰基和羧基保护改性琼脂不收缩和保水。由于培养基中营养成分稳定，保水性能优异，为益生菌的生长提供了良好的环境，所以益生菌的增殖速率变大，活性增强，提高了益生菌复合菌液中菌种的数量，因此对饲料的发酵作用更强，促进了动物采食量和免疫水平的提高，改善了营养成份结构。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1）通过将对琼脂进行改性，制备得到改性琼脂；再复配得到培养基，采用培养基培育枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和植物乳杆菌制备成益生菌复合菌液；由于培养基中营养成分稳定，保水性能优异，易于渗透，为益生菌的生长提供了良好的环境，进而益生菌的增殖速率变大，活性增强，提高了益生菌复合菌液中菌种的数量。

2）益生菌复合菌液应用在饲料中，进行发酵制备成发酵饲料，具有较好的发酵作用，能有效促进动物采食量和免疫水平的提高，改善营养成份结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中未注明的具体技术或条件，均按照本领域内常规的技术或条件或按照产品说明书进行。未注明生产厂商的试剂或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品。

主要物质来源：

枯草芽孢杆菌：Bacillus Subtilis，CICC 25064，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

屎肠球菌，Enterococcus faecium，CICC 20089，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

植物乳杆菌：Lactobacillus plantarum，CICC 23941，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

牛肉粉：西安雅图生物科技有限公司，产品目数：80目，货号：YT-2022072101。

酵母提取物：上海耐今实业有限公司，含量：99％，货号：NY01。

尿嘧啶：上海诺泰化工有限公司，CAS：66-22-8。

琼脂：货号：101，CAS：9002-18-0，广州华熙生物工程有限公司。

纳米磷酸钙：陕西藤迈生物科技有限责任公司，包装规格：羟基磷灰石60nm，CAS：1306-06-5。

大豆胚芽粉：郓城扬盈生物科技有限公司，货号：k1。

膨化玉米粉：山东宏伟生物科技有限公司，货号：010。

氨基酸原粉：山东大凯生物科技有限公司，货号：1，含量≥99％。

实施例1

一种益生菌复合菌液，制备方法如下：

Z1、将15g蛋白胨、10g牛肉粉、5g酵母提取物、5g氯化钠、3g醋酸钠、2g磷酸氢二钾、0.2g七水硫酸镁、0.1g尿嘧啶、0.25g氯化钙、5g改性琼脂、2.5g果糖、6g麦芽糖、1.5g丙酮酸钠和1g吐温80加入943.45g水配置成混合物，然后加入搅拌锅中搅拌40min，搅拌速度为200rpm，在125℃灭菌30min，得到培养基；

Z2、将10g益生菌原液加入到1kg Z1制备的培养基中在44℃孵育72小时，用无菌生理盐水冲洗3次，制成益生菌复合菌液。

所述益生菌原液中益生菌含量为200亿/g，益生菌原液由枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌按照数量比为1：0.8：0.6组合而成。

所述改性琼脂制备方法如下：

S1、将5g琼脂和2.5g高碘酸钠加入500g水中，在室温下避光中搅拌反应5h，搅拌速度为200rpm，然后加入5g乙二醇，反应1h后，加入5g盐酸多巴胺，室温反应12h，然后透析2d，透析膜截留分子量为800，冷冻干燥10h，冷冻干燥温度为-20℃，得到预处理琼脂；

S2、将S1制备的预处理琼脂加入100g水中，在50℃下持续搅拌3h，搅拌速度为300rpm，然后滴加4g 20wt%丙烯酸甲酯乙醇溶液，滴加速度为1mL/min，滴加完以500rpm持续搅拌30min，然后采用3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值为8.2，继续反应0.5h，反应结束后，先用水洗涤4次，再用75wt%乙醇水溶液分别洗涤2次，然后在55℃下干燥3h，粉碎，通过80目筛，得到后处理琼脂；

S3、将步骤S2制备的后处理琼脂加入120g水中，在40℃搅拌2h，搅拌速度为300rpm，加入250g混合水溶液，混合水溶液为1g辛烯基琥珀酸酐和4g异丙醇加245g水配置而成，然后加入3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值8.0，反应时间为3h，反应结束后，混合物用70wt%乙醇水溶液和水分别洗涤2次，在50℃的烤箱中干燥3h，然后通过100目尼龙筛，得到改性琼脂。

所述发酵饲料，制备方法如下：

将1.5kg乙基纤维素、0.8kg甘蔗渣、0.8kg氨基酸原粉、0.8kg腐质酸钾、1.5kg玉米秸秆糠、0.6kg纳米磷酸钙、2.5kg稻壳洗净之后，晒干或者晾干，然后一同放入到饲料粉碎机中打成颗粒，加入4kg大豆胚芽粉、6kg膨化玉米粉和8kg水混合搅拌3h，搅拌速度为50rpm，然后倒入高压灭菌锅中，高压蒸汽灭菌20min，压强为0.2MPa，冷却至室温后，加入到发酵罐中，添加0.08kg益生菌复合菌液；发酵温度控制在30℃，发酵时间为3d，然后将经发酵混合物转运至烘干室中烘干12h，保持通风，烘干室温度控制在35℃，即得发酵饲料。

实施例2

一种益生菌复合菌液的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性琼脂的制备方法不一致。

所述改性琼脂的制备方法如下：

S1、将5g琼脂加入100g水中，在50℃下持续搅拌3h，搅拌速度为300rpm，然后滴加4g 20wt%丙烯酸甲酯乙醇溶液，滴加速度为1mL/min，滴加完以500rpm持续搅拌30min，然后采用3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值为8.2，继续反应0.5h，反应结束后，先用水洗涤4次，再用75wt%乙醇水溶液洗涤2次，然后在55℃下干燥3h，粉碎，通过80目筛，得到前处理琼脂；

S2、将步骤S1制备的前处理琼脂加入120g水中，在40℃搅拌2h，搅拌速度为300rpm，加入250g混合水溶液，混合水溶液为1g辛烯基琥珀酸酐和4g异丙醇加245g水配置而成，然后加入3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值8.0，反应时间为3h，反应结束后，混合物用70wt%乙醇水溶液和水分别洗涤2次，在50℃的烤箱中干燥3h，然后通过100目尼龙筛，得到改性琼脂。

所述发酵饲料的制备方法与实施例1相同。

所述益生菌原液与实施例1相同。

实施例3

一种益生菌复合菌液的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性琼脂的制备方法不一致。

所述改性琼脂的制备方法如下：

S1、将5g琼脂和2.5g高碘酸钠加入500g水中，在室温下避光中搅拌反应5h，搅拌速度为200rpm，然后加入5g乙二醇，反应1h后，加入5g盐酸多巴胺，室温反应12h，然后透析2d，透析膜截留分子量为800，冷冻干燥10h，冷冻干燥温度为-20℃，得到预处理琼脂；

S2、将步骤S1制备的预处理琼脂加入120g水中，在40℃搅拌2h，搅拌速度为300rpm，加入250g混合水溶液，混合水溶液为1g辛烯基琥珀酸酐和4g异丙醇加245g水配置而成，然后加入3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值8.0，反应时间为3h，反应结束后，混合物用70wt%乙醇水溶液和水分别洗涤2次，在50℃的烤箱中干燥3h，然后通过100目尼龙筛，得到改性琼脂。

所述发酵饲料的制备方法与实施例1相同。

所述益生菌原液与实施例1相同。

实施例4

一种益生菌复合菌液的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述益生菌复合菌液的制备方法中将改性琼脂替换为等量的后处理琼脂。

所述后处理琼脂的制备方法如下：

S1、将5g琼脂和2.5g高碘酸钠加入500g水中，在室温下避光中搅拌反应5h，搅拌速度为200rpm，然后加入5g乙二醇，反应1h后，加入5g盐酸多巴胺，室温反应12h，然后透析2d，透析膜截留分子量为800，冷冻干燥10h，冷冻干燥温度为-20℃，得到预处理琼脂；

S2、将S1制备的预处理琼脂加入100g水中，在50℃下持续搅拌3h，搅拌速度为300rpm，然后滴加4g 20wt%丙烯酸甲酯乙醇溶液，滴加速度为1mL/min，滴加完以500rpm持续搅拌30min，然后采用3wt%NaOH水溶液调整溶液的pH值为8.2，继续反应0.5h，反应结束后，先用水洗涤4次，再用75wt%乙醇水溶液洗涤2次，然后在55℃下干燥3h，粉碎，通过80目筛，得到后处理琼脂；

所述发酵饲料的制备方法与实施例1相同。

所述益生菌原液与实施例1相同。

对比例1

一种益生菌复合菌液的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述益生菌复合菌液的制备方法中将改性琼脂替换为等量的琼脂。

所述发酵饲料的制备方法与实施例1相同。

所述益生菌原液与实施例1相同。

对比例2

一种益生菌复合菌液的制备方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述益生菌复合菌液的制备方法中不添加改性琼脂。

所述发酵饲料的制备方法与实施例1相同。

所述益生菌原液与实施例1相同。

测试例1

母猪采食量测定

采用单因子设计，试验选择相同胎次、体重和体况相近、健康无病，预产期相同或相近的长大二元母猪36头，平均分为6组，分别饲喂本发明实施例和对比例制备的发酵饲料。试验过程中分别记录6组母猪妊娠初期、中期、后期及泌乳期每天的采食量，计算出每个时期母猪的平均日采食量。试验结果取平均值，见表1。

表1、母猪采食量试验结果

测试例2

饲料粗蛋白测定

用洁净的玻璃纸称取实施例和对比例发酵饲料样品0.5g，加入0.4g硫酸铜，6g硫酸钾，并与试样混合均匀，继续加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，置于电炉上加热，开始用小火，待样品焦化后，再加强火力，直至呈透明的蓝绿色然后再继续加热，至少2h，试样消煮液冷却后，用半微量凯氏定氮仪进行测定。

饲料粗脂肪测定

用玻璃纸准确称取实施例和对比例发酵饲料试样2g于滤纸中，记录重量。将其放入索氏提取腔内，由提取腔上口加入乙醚，浸泡过夜，然后在65℃的水浴上加热，并打开冷凝水，使乙醚回流，抽提完毕后，待乙醚挥发后，再进行烘箱中烘干，取出放在干燥器中约30min，冷却后称重。由记录重量计算出粗脂肪含量。饲料粗蛋白测定和饲料粗脂肪测定都测试三次，测试结果取平均值，如表2所示。

表2：粗蛋白、粗脂肪测试结果

测试例3

育肥猪血清免疫球蛋白水平测定

实验动物选用42头健康、体况相似的育肥猪，平均分成7组，设置一组空白对照组，饲喂等量的未发酵饲料，其余6组分别饲喂本发明实施例和对比例制备的发酵饲料，饲喂时间1个月。饲喂结束后，从每组随机选择3头进行前腔静脉采血3mL，血样放入无菌普通离心管中静置，准备分离血清。血清制备，将血样置室温lh，后置4℃冰箱内4h。于2500rpm离心10min，取上清分装，立即置-80℃冰箱中保存备用。采用酶联免疫吸附方法检测IgG、IgM和IgA的浓度。试验结果见表3。

表3：免疫球蛋白水平试验结果

从实施例1~3的试验结果可以看出，实施例1制备的发酵饲料粗蛋白含量最高，粗脂肪较低，而且对猪的采食量和免疫球蛋白水平的促进作用最明显，原因可能在于本发明通过琼脂与高碘酸钠反应，然后进行盐酸多巴胺接枝制备成预处理琼脂，再经过丙烯酸甲酯乙醇溶液的处理得到后处理琼脂，后处理琼脂与辛烯基琥珀酸酐和异丙醇进行反应得到改性琼脂；通过改性琼脂配置的培养基培育枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和植物乳杆菌制备成益生菌复合菌液；益生菌复合菌液对饲料进行发酵制备成发酵饲料。

母猪的采食量是检测饲料适口性的重要指标之一。本发明经益生菌复合菌液发酵后制备的发酵饲料，其适口性得到明显提高，有利于母猪采食。血清免疫球蛋白包括IgA、IgG和IgM等，是由B淋巴细胞产生的，是体液免疫主要的效应因子，具有预防和增强机体抗感染的能力。

由于盐酸多巴胺中的羟基，接枝琼脂后得到的预处理琼脂结构易于渗透，能促进益生菌的生长和物质交换。而且由于盐酸多巴胺中的儿茶酚结构能增强益生菌的湿性粘附，并且具有良好的细胞相容性；盐酸多巴胺的接枝也为下一步在碱性环境下采用丙烯酸甲酯乙醇溶液处理提供了反应位点；碱性环境可以促进羟基的亲和性，使预处理琼脂膨胀，增加丙烯酸甲酯向预处理琼脂的扩散，从而提高酯化速率。丙烯酸甲酯的羧基结合在预处理琼脂上，显著提高了预处理琼脂的稳定性，并影响培养基的表面张力，能在培养基界面形成稳定膜，以稳定营养组分。辛烯基琥珀酸酐的环结构被打开，形成两个高活性羧酸基团。其中一个羧基与后处理琼脂的羟基反应生成酯，另一个羧基被氢氧化钠中和。经辛烯基琥珀酸酐改性后，辛烯基琥珀酸酐水解产生的酰基通过氢键连接到后处理琼脂分子中。酰基的引入会阻碍了后处理琼脂链之间双螺旋的形成，导致三维网络结构变得松散，孔径变大。改性琼脂链表面的羧基基团增加了改性琼脂的亲水性，从而产生了良好的保水性。此外，在后处理琼脂链中插入酰基降低了琼脂颗粒之间的静电相互作用，使更多的水渗透到琼脂颗粒中。辛烯基琥珀酸酐通过其中的酰基和羧基保护改性琼脂不收缩和保水。由于培养基中营养成分稳定，保水性能优异，为益生菌的生长提供了良好的环境，进而益生菌的增殖速率变大，活性增强，提高了益生菌复合菌液中菌种的数量，因此对饲料的发酵作用更强，有效促进了动物采食量和免疫水平的提高，改善了营养成份结构。

Claims (6)

1.一种益生菌复合菌液，由益生菌原液、培养基按质量比1:80~120混合而成；其特征在于，所述培养基由以下组分制备而成，以重量份计：10~20份蛋白胨、5~15份牛肉粉、3~8份酵母提取物、3~8份氯化钠、1~5份醋酸钠、1~3份磷酸氢二钾、0.1~0.3份七水硫酸镁、0.05~0.2份尿嘧啶、0.1~0.4份氯化钙、3~8份改性琼脂、1~5份果糖、4~8份麦芽糖、1~3份丙酮酸钠、0.5~2份吐温80、900~1000份水；

所述改性琼脂制备方法如下：

S1、将琼脂和高碘酸钠加入水中，在室温下避光中搅拌反应3~8h；加入乙二醇，反应0.5~2h；加入盐酸多巴胺，室温反应5~20h；透析1~5d，透析膜截留分子量为600~1000；冷冻干燥，得到预处理琼脂；

S2、将预处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；滴加丙烯酸甲酯乙醇溶液，持续搅拌反应20~50min；调整溶液pH值为8.0~8.5；继续搅拌反应0.3~1h；过滤后分别用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到后处理琼脂；

S3、后处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；加入辛烯基琥珀酸酐、异丙醇的混合水溶液；调整溶液pH值为7.0~9.0，搅拌反应1.5~5h；过滤后用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到改性琼脂；

所述益生菌原液由枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌按照数量比为1：0.6~1：0.4~0.8混合而成；所述益生菌原液中益生菌含量为200亿/g。

2.如权利要求1所述的益生菌复合菌液，其特征在于：步骤S3中所述辛烯基琥珀酸酐、异丙醇的混合水溶液为0.5~2份辛烯基琥珀酸酐和2~8份异丙醇加200~300份水混合均匀得到。

3.如权利要求1或2所述益生菌复合菌液的制备方法，其特征在于：

Z1、称取原料；将蛋白胨、牛肉粉、酵母提取物、氯化钠、醋酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、尿嘧啶、氯化钙、改性琼脂、果糖、麦芽糖、丙酮酸钠和吐温80加水配置成混合物；搅拌30~50min，搅拌速度为100~300rpm；在120~130℃灭菌20~50min，得到培养基；

Z2、将益生菌原液加入到Z1制备的培养基中在30~45°C培养48~96h；然后用生理盐水冲洗2~5次，制成益生菌复合菌液。

4.如权利要求1或2所述的益生菌复合菌液在发酵饲料中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述益生菌复合菌液在发酵饲料中的添加量为0.2~0.4wt%。

6.一种培养基，其特征在于，由以下组分制备而成，以重量份计：10~20份蛋白胨、5~15份牛肉粉、3~8份酵母提取物、3~8份氯化钠、1~5份醋酸钠、1~3份磷酸氢二钾、0.1~0.3份七水硫酸镁、0.05~0.2份尿嘧啶、0.1~0.4份氯化钙、3~8份改性琼脂、1~5份果糖、4~8份麦芽糖、1~3份丙酮酸钠、0.5~2份吐温80、900~1000份水；

所述改性琼脂制备方法如下：

S1、将琼脂和高碘酸钠加入水中，在室温下避光中搅拌反应3~8h；加入乙二醇，反应0.5~2h；加入盐酸多巴胺，室温反应5~20h；透析1~5d，透析膜截留分子量为600~1000；冷冻干燥，得到预处理琼脂；

S2、将预处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；滴加丙烯酸甲酯乙醇溶液，持续搅拌反应20~50min；调整溶液pH值为8.0~8.5；继续搅拌反应0.3~1h；过滤后分别用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到后处理琼脂；

S3、后处理琼脂加入水中，搅拌混合均匀；加入辛烯基琥珀酸酐、异丙醇的混合水溶液；调整溶液pH值为7.0~9.0，搅拌反应1.5~5h；过滤后用水、乙醇水溶液洗涤；干燥、粉碎、过筛，得到改性琼脂。