CN114532460A - 混合菌在海带、马尾藻微生物发酵饲料中的应用及其制备方法 - Google Patents

混合菌在海带、马尾藻微生物发酵饲料中的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

混合菌在海带、马尾藻微生物发酵饲料中的应用及其制备方法，本发明涉及海参养殖技术领域，特别涉及生物海参配合饲料。本发明以植物乳杆菌、西姆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母菌和黑曲霉作为发酵菌株，筛选获得最适于发酵海带、马尾藻的菌株，并进行混菌发酵优化实验，建立发酵工艺，为海参养殖中海藻可替代资源的应用奠定了实验基础。

Description

混合菌在海带、马尾藻微生物发酵饲料中的应用及其制备 方法
技术领域
本发明涉及海参养殖技术领域，特别涉及生物海参配合饲料。
背景技术
随着海参养殖业迅猛发展，海参饵料单一和匮乏问题逐渐的暴露出来。大型海藻马尾藻、鼠尾藻等是海参养殖常用的天然饵料，而随着我国沿海海参养殖产业的快速发展，海参天然饵料由于其产量低、成本较高以及受其养殖环境和条件限制等因素已无法满足海参养殖业快速发展的需求。因此，急需寻找海藻可替代资源，开发新型高营养低成本的海参配合饲料。
微生物发酵饲料(Microbial fermented feed)是一种营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料。在可控制的条件下，利用微生物代谢降解基质中复杂的的大分子物质，生成有机酸、可溶性肽等简单化合物。发酵技术通常有2种：固态发酵(SSF)和深层液体发酵(SMF)。固态发酵是指微生物在缺乏自由流动液体或少量自由水的情况下，生长于固体基质上生物反应过程。例如，谷物、大米、米糠和麦麸等固体原料的发酵。与SMF相比，SSF具有工艺简单、投资少、能耗低、利于微生物生长的自然环境等优点。因此，固体发酵在我国被广泛应用于饲料生产中。由于固态发酵含水量较低，因此只有有限数量的微生物进行，通常发酵微生物常用菌株菌包括霉菌、酵母菌及细菌的一些类群，例如乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。作为一种安全、环保的饲料，生物发酵饲料具有适口性好、营养丰富、易于消化吸收等特点，主要利用微生物的代谢将基质中复杂大分子降解成小肽、氨基酸和其他小分子化合物。此外，生物饲料可为动物提供一个合适的生活环境，能调节肠道内菌群的平衡，并增强动物自身的免疫和抗病能力等。与畜牧业相比，生物活性饲料在水产养殖中的应用较少，此外，在海参养殖中也鲜有报道。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供以海带、马尾藻为主原料，以豆粕粉、海虹干粉等为辅料，采用固态发酵法发酵海带和马尾藻，以期有效降低海带中褐藻胶的含量，提高饲料利用率，开发新型生物海参配合饲料。
本发明首要目的是请求保护混合菌在大型海藻生物发酵饲料上的应用，特别是海带、马尾藻微生物发酵饲料上的应用，即，以枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母作为混合发酵种子液对含有海带或马尾藻的饲料进行固态发酵，在海参配合饲料上的应用。
本发明同时请求保护海带和/或马尾藻微生物发酵饲料固态发酵工艺：
S1.制备发酵种子液，发酵种子液为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母中一种或多种进行制备；
S2.用步骤S1的发酵种子液对海带和/或马尾藻饲料固态发酵，发酵条件为：发酵温度30～35℃，时间48～72h、接种量9～11％、料水比1:1～1:1.5。
进一步的，所述发酵种子液优选为枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母。所述步骤S2中，将含有10-90％海带粉和/或马尾藻粉的饲料制备固态发酵原料，灭菌，将制备好的菌种发酵种子液按照接种配比接种到发酵原料培养基中发酵培养，发酵培养后烘干、粉碎、过筛即得海带或马尾藻微生物发酵饲料。进一步的，步骤S2所述固态发酵原料含有10-30％海带粉和10-90％马尾藻粉。更进一步，含有海带粉或马尾藻粉的饲料组成为：海带粉或马尾藻粉占饲料总量的47.5％、豆粕粉2％、海虹干粉2％、牡壳粉1％。优选的，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母接种比例为3:2:1。
作为优选，海带饲料的发酵条件为：发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2g/m进行发酵，每24h翻动一次。马尾藻饲料的发酵条件为：发酵温度30.3℃，发酵时间60h、接种量9.7％、料水比1:1g/mL进行发酵，每24h翻动一次。
本发明同时请求保护采用上述方法制备的海带或马尾藻微生物发酵饲料。海带和/或马尾藻粉占10-50％，面粉、豆粕粉、海虹干粉、牡壳粉和海泥占50-90％发酵制备微生物发酵饲料，发酵条件为：发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2g/mL、每24h翻动一次。优选的，海带粉15％、马尾藻粉25％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。马尾藻粉40％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。
本发明具有以下有益效果：
本发明以植物乳杆菌、西姆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母菌和黑曲霉作为发酵菌株，并获得最适于发酵海带、马尾藻的菌株，并进行混菌发酵优化实验，建立发酵工艺。通过微生物发酵有效降解海带中褐藻胶含量，同时保证活菌数量，提高饲料利用率，开发新型生物活性海参饵料，同时进行营养评价。海带饲料和马尾藻饲料的最优混合优异菌均为枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母；通过对混合菌的不同添加比例筛选实验，确定了当比例为3:2:1时，两种海藻饲料的发酵效果最佳。在优化的工艺条件下，海带和马尾藻发酵饲料的基本营养如下：粗蛋白含量(13.04％和13.52％)，粗脂肪含量(0.33％和3.27％)，灰分(16.21％和45.56％)，总糖(3.30g/kg和3.10g/kg)。其中，海带和马尾藻饲料的褐藻胶为20.38％和9.84％，与未发酵比降低了52.75％和35.16％。另外，还原糖(5.86％和6.23％)，纤维素酶活(15.88U/g和17.28U/g)，酸性蛋白酶活(315.79U/g和345.46U/g)，3者含量均显著高于未发酵组。2种发酵饲料中共测得17种游离氨基酸。这17种氨基酸中必需氨基酸和非必需氨基酸种类较为齐全，且在海带和马尾藻饲料中，混合发酵饲料的必需氨基酸含量显著高于3种单菌发酵。
附图说明
图1不同单菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中对粗蛋白含量的影响；
图2不同单菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中对可溶性蛋白含量的影响；
图3不同单菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中褐藻胶含量的影响；
其中，图1-3图例含义为：0-未发酵；1-解淀粉芽孢杆菌；2-地衣芽孢杆菌；3-枯草芽孢杆菌；西姆芽孢杆菌；5-植物乳杆菌；6-酿酒酵母；7-黑曲霉；
图4不同混菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中粗蛋白含量的影响；
图5不同混菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中可溶性蛋白含量的影响；
图6不同混菌固态发酵对海带和马尾藻饲料中褐藻胶含量的影响；
其中，图4-6图例含义为：0-未发酵；1-枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌+酿酒酵母；2-枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌+植物乳杆菌；3-枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母；
图7不同菌种比例固态发酵对海带和马尾藻饲料中粗蛋白含量的影响；
图8不同菌种比例固态发酵对海带和马尾藻饲料中可溶性蛋白含量的影响；
图9不同菌种比例固态发酵对海带和马尾藻饲料中褐藻胶含量的影响；
图10发酵温度对海带饲料中各成分含量的影响；
图11发酵时间对海带饲料中各成分含量的影响；
图12接种量对海带饲料中各成分含量的影响；
图13料水比对海带饲料中各成分含量的影响；
图14发酵温度对马尾藻饲料中各成分含量的影响；
图15发酵时间对马尾藻饲料中各成分含量的影响；
图16接种量对马尾藻饲料中各成分含量的影响；
图17料水比对马尾藻饲料中各成分含量的影响；
其中，图10-17图例含义为：(a)、粗蛋白，(b)、可溶性蛋白，(c)、褐藻胶；
图18各因素交互影响的3D图和等高线图；
图19各因素交互影响的3D图和等高线图；
图20各因素交互影响的3D图和等高线图；
图21各因素交互影响的3D图和等高线图；
图22不同饲料发酵前后还原糖含量的变化；
图23不同饲料发酵前后纤维素酶活力的变化；
图24不同饲料发酵前后酸性蛋白酶活力的变化。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。本发明涉及的枯草芽孢杆菌Bacillus subtitlisYP1501，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，西姆芽孢杆菌Bacillussiamensis，黑曲霉Aspergillusniger，均可从商业途径获得，本实施例中上述菌种由大连民族大学海洋微生物研究所保存。干海带、马尾菜、豆粕粉、海虹干粉、牡壳粉均市售可得。本发明中涉及的发酵饲料配制如下：干海带清洗、烘干，粉碎并过60目筛。马尾藻烘干、粉碎并过60目筛。
(1)未发酵组(干重％)：马尾藻粉47.5％、豆粕粉2％、海虹干粉2％、牡壳粉1％；
(2)海带组：海带粉47.5％、豆粕粉2％、海虹干粉2％、牡壳粉1％；
(3)马尾藻组：马尾藻粉47.5％、豆粕粉2％、海虹干粉2％、牡壳粉1％；
本发明中涉及的培养基配制如下：
(1)LB培养基(g/L)：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0-7.3，121℃灭菌20min。固体培养基加20g琼脂。
(2)YPD培养基(g/L)：葡萄糖20g，酵母提取物10g，蛋白胨20g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。固体培养基加20g琼脂。
(3)PDA培养基(g/L)：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸0.5h，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，pH自然，121℃灭菌20min。固体培养基加17-20g琼脂。
(4)发酵饲料培养基：按发酵饲料配方比例添加各组分并充分混合均匀，按适量料水比添加去离子水，一般固态发酵含水量约为基质的二分之一，其评判标准是使发酵饲料达到手握成团，落地松散的程度，pH自然，121℃灭菌20min。
实施例1 发酵种子液的制备
(1)菌种活化：分别从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌菌种斜面培养基上用接种针取少量菌种于各菌种的液体种子培养基(一级菌种)中进行恒温培养48h。芽孢杆菌置于36℃、180r/min摇床振荡培养；植物乳杆菌置于36℃静置培养；酿酒酵母菌置于28℃、180r/min摇床振荡培养。然后，将上述培养好的液体种子培养基(一级菌种)按1％的接种量接种到各菌种液体种子培养基中扩大培养24-48h，制成发酵种子液(二级菌种)，菌液浓度不低于109cfu/L。
(2)孢子菌悬液制备：将黑曲霉接种在固体PDA培养基上培养3-5d，直至黑曲霉孢子铺满整个培养皿，用20mL左右的灭菌水冲洗孢子，4层灭菌纱布过滤，采用血球计数板计算黑曲霉孢子悬液浓度，不低于109cfu/L，备用。
(3)活菌数测定：发酵液培养完成后，取样进行梯度稀释，测定OD600值，并测定相应菌种的活菌数，采用涂布稀释计数，菌液浓度不低于109cfu/L时，进行发酵实验。
(4)经过计数，确定菌液浓度：枯草芽孢杆菌2.1×109cfu/L、地衣芽孢杆菌2.4×109cfu/L、解淀粉芽孢杆菌1.9×109cfu/L、西姆芽孢杆菌2.2×109cfu/L、植物乳杆菌2.5×109cfu/L、酿酒酵母菌2.3×109cfu/L、黑曲霉2.2×109cfu/L。
实施例2 固态发酵方法
固态发酵方法为：将各组分充分混合均匀，按料水比添加去离子水，使发酵饲料达到手握成团，落地松散的程度，pH自然，121℃灭菌20min，得固态发酵原料；将固态发酵原料分装于锥形瓶中，去离子水按适量的料水比添加，121℃灭菌20min；冷却后，将制备好的菌种发酵种子液按照接种配比接种到发酵原料培养基中，30℃恒温静置发酵培养定量时间，发酵培养后于超净工作台搅拌透气；发酵结束后在50℃恒温箱中烘干，利用粉碎机机将其粉碎过60目筛，即为海带或马尾藻微生物饲料。
实施例3 固态发酵优异菌株的筛选
以7种益生菌：植物乳杆菌、西姆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母菌和黑曲霉作为发酵菌株。设定海带饲料基础发酵参数为：温度30℃、时间72h、接种量10％、料水比1:1.2。马尾藻饲料基础发酵参数为：温度30℃、时间72h、接种量10％、料水比1:1。发酵完成后，以粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量为衡量指标，筛选出优异单菌。
由图1-2可知，经不同菌发酵后，海带饲料处理组的粗蛋白含量变化不显著，其中枯草芽孢杆菌的发酵效果最好，酿酒酵母发酵效果次之；马尾藻饲料处理组中枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和黑曲霉的发酵效果最好。经不同菌发酵后，海带饲料处理组的可溶性蛋白含量均有一定变化，其中酿酒酵母发酵效果显著高于其他处理组，枯草和黑曲霉的发酵效果次之，略小于植物乳杆菌的发酵效果；马尾藻饲料处理组中酿酒酵母的发酵效果显著高于其他处理组，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌发酵效果次之，显著高于其余处理组。由图3可看出，通过不同微生物菌株发酵能有效降低海带组和马尾藻组中褐藻胶的含量。与未发酵组相比，经解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌、植物乳杆菌发酵处理的海带和马尾藻饲料，褐藻胶降解率差异显著。其中，在不同芽孢杆菌中，解淀粉芽孢杆菌对褐藻胶的降解效果最好，其次是植物乳杆菌。其余菌之间降解效果无明显差异。
综合考虑单菌发酵对海带和马尾藻中粗蛋白、可溶性蛋白以及褐藻胶的影响，确定枯草芽孢杆菌作为主发酵菌，其他组合菌选定酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌进行下一步的混菌实验。
实施例4 混菌接种比例对比
以枯草芽孢杆菌作为主发酵菌，分别与解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌进行3菌组合，按接种比例1:2:2进行混合发酵，分析不同混菌组合对海带和马尾藻饲料发酵效果的影响。设定海带饲料基础发酵参数为：温度30℃、时间72h、接种量10％、料水比1:1.2。马尾藻饲料基础发酵参数为：温度30℃、时间72h、接种量10％、料水比1:1。
由图4和5可看出，混合菌发酵均能可以有效提高海带和马尾藻饲料中的粗蛋白和可溶性蛋白含量，其中枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母组合发酵效果最好，海带和马尾藻饲料粗蛋白含量分别为12.46％和13.24％，分别提高了40.32％和32.80％；可溶性蛋白含量分别为0.95％和1.10％；同时粗蛋白和可溶性蛋白含量均显著高于其他发酵菌种组合和未发酵组。因此，确定枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母混合菌为最优异菌株组合。由实验结果可知，混菌混合菌株发酵比单菌发酵效果更好，多菌种混合发酵后具有协同性，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母间最大程度发挥了互惠共生作用。
由图6可看出，海带和马尾藻饲料组经过不同混合菌株发酵后，均可有效降低饲料褐藻胶含量。其中海带饲料组中，经不同混合菌株处理后，褐藻胶降解率差异显著。其中，以枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌+酿酒酵母发酵处理组的褐藻胶降解效果最好(褐藻胶降解率为42.32％)，其次是枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母混合菌株处理组(褐藻胶降解率为37.67％)，含量分别为21.88％和22.62％。而马尾藻饲料组中，不同混合菌株发酵后，马尾藻中褐藻胶含量变化差异不显著，马尾藻饲料经3组混合菌株发酵处理后，褐藻胶含量分别降低了25.83％，22.47％和23.95％。
综合考虑混菌发酵对海带和马尾藻中粗蛋白、可溶性蛋白以及褐藻胶的影响，确定枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母作为混合优异菌进行下一步实验。
实施例5 混菌接种比例对比
以最优异芽孢杆菌作为主发酵菌，与其余两种优异单菌三菌混合对饲料进行发酵，考察发酵过程中粗蛋白和可溶性蛋白等含量的变化，确定混合优异菌。
在确定混合优异菌基础上，考察不同菌种添加比例对发酵海带和马尾藻粗蛋白和可溶性蛋白含量等影响，确定优异菌的最佳配比。其中枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母各菌种间的添加比例设定为1:1:1，1:2:2，1:3:3，2:1:2，2:2:3，2:3:1，3:1:3，3:2:1，3:3:2。
由图7可知，海带处理组中不同比例混菌差异显著；而马尾藻组中，比例为1:2:2、1:3:3和3:1:3混菌处理组差异显著。当混菌比例为3:2:1时，海带饲料粗蛋白最高；比例为1:2:2时，马尾藻饲料粗蛋白最高，比例为3:2:1时，马尾藻饲料粗蛋白含量次之，但二者无明显差异。由图8可知，海带处理组中不同比例混菌差异不显著；而马尾藻组中，比例3:2:1与其他混菌处理组相比差异显著，当混菌比例为1:2:2时，海带饲料可溶性蛋白最高；比例为3:2:1时含量次之；比例为3:2:1时，马尾藻饲料可溶性蛋白最高，比例为1:2:2时，马尾藻饲料可溶性蛋白含量次之。由图9可知，由不同比例的混菌发酵后，海带和马尾藻饲料的褐藻胶均有不同程度降低，比例为2:1:2时，海带藻胶降解效果最好，其次是3:2:1；比例为2:3:1、3:1:3和3:2:1时，马尾藻藻胶降解效果较好，但组间差异不显著。
综合考虑不同比例的混菌发酵对海带和马尾藻中粗蛋白、可溶性蛋白以及褐藻胶的影响，海带饲料和马尾藻饲料的最优混合优异菌均为枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母；通过对混合菌的不同添加比例筛选实验，确定了当比例为枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：酿酒酵母＝3:2:1时，两种海藻饲料的发酵效果最佳。
实施例7 发酵饲料的感官评价
将固态发酵原料分装于250mL锥形瓶中，去离子水按适量的料水比添加(海带饲料料水比1:1.2。马尾藻饲料料水比1:1)，121℃灭菌20min。冷却后，将制备好的菌种发酵种子液按照实施例3设计的菌种接种配比接种到发酵原料培养基中，用灭菌竹签搅拌均匀，用八层纱布封口，30℃恒温静置发酵培养定量时间，发酵培养24h后于超净工作台搅拌透气。发酵结束后将饵料在50℃恒温箱中烘干，利用粉碎机机将其粉碎过60目筛，即为发酵饲料。
将制备的饲料从感官角度观察分析结果如下表所示。两种饲料经混菌发酵后，在颜色、气味和黏度上均有所改变。其中颜色属于正常饲料色泽，具有特殊的香味，无霉味以及氨味等异味，质地上更加柔软松散有黏性。
表1海带饲料的感官评价
Figure BDA0003480950940000071
表2马尾藻饲料的感官评价
Figure BDA0003480950940000072
实施例8 混合菌株海带饲料固态发酵工艺
本实施例对比不同温度、时间、接种量及料水比下的发酵结果。
海带的发酵基础条件为：温度30℃，时间48h，接种量10％，料水比1:1.2。
(1)最适发酵温度
保持基础发酵的其他条件不变，考察当发酵温度分别25℃、30℃、35℃、40℃时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。
如图10所示，30℃时海带饲料发酵产物中蛋白质最高，此后，随着温度的逐渐升高，菌株的生长代谢速度会加快，会产生小分子物质和一些酶类；同时较高的温度会影响酶的分泌，影响蛋白质分解；也会促进微生物繁殖，快速消耗底物营养，导致蛋白含量下降。另外适宜的温度使得藻胶的降解效果增强。所以最适发酵温度为30℃。
(2)最适发酵时间
保持基础发酵的其他条件不变，考察当发酵时间分别24h、48h、72h、96h时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。
如图11a和图11b所示，海带饲料中发酵至48h时，粗蛋白含量最高；当发酵72h时达到最高值。从图11c可以看出，随着发酵时间的增加，海带中褐藻胶含量呈下降趋势，在48h时，褐藻胶含量达到最低。因此，综合考虑选择48h为最适发酵时间。
(3)最适接种量
保持基础发酵的其他条件不变，考察当接种量分别8％、10％、12％、14％时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。
发酵菌株的接种量对固体发酵有重要影响，属于发酵过程的关键因素之一。接种量可影响发酵时间的长短，适宜的接种量可有效缩短发酵时间，并加快微生物生长繁殖，充满在整个基质中，从而降低杂菌污染的风险。由图12(a)和(b)可知，接种量为10％时，粗蛋白含量最高；接种量为12％时，可溶性蛋白含量最高；接种量为10％时，褐藻胶含量最低。因此，选择10％为最适接种量。
(4)最适料水比
保持基础发酵的其他条件不变，考察当料水比分别8％、10％、12％、14％时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。
含水量是影响固态发酵的另一个重要因素。含水量过低，会导致基质膨胀度下降，阻碍微生物生长，从而导致发酵产物产量降低。含水量过高，会造成基质间的空隙减小，阻碍基质内气体的交换，导致通气、降温困难，也增加了杂菌污染的几率。从图13可看出，随着含水量的增加，粗蛋白和可溶性蛋白含量呈先上升后下降趋势；褐藻胶含量逐渐下降并趋于平稳。当料水比1:1.2时，粗蛋白和可溶性蛋白含量最高。料水比为1:1、1:1.2、1:1.4时，褐藻胶含量变化不显著。因此，选择1:1.2为最适料水比。
实施例8 混合菌株马尾藻饲料固态发酵
本实施例对比不同温度、时间、接种量及料水比下的发酵结果。
马尾藻的发酵基础条件为：温度30℃，时间48h，接种量10％，料水比1:1。
(1)最适发酵温度
保持基础发酵的其他条件不变，考察当发酵温度分别25℃、30℃、35℃、40℃时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。如图14所示，当温度为30℃时，马尾藻饲料发酵产物中粗蛋白和可溶性蛋白含量达到最高值；同时该温度下褐藻胶降解效果最好。因此，选择30℃为最适发酵温度。
(2)最适发酵时间
保持基础发酵的其他条件不变，考察当发酵时间分别24h、48h、72h、96h时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。如图15所示，马尾藻饲料发酵时间为48h时，粗蛋白最高值；发酵时间为72h时，可溶性蛋白含量最大值。由图15c可以看出，随着发酵时间的增加，褐藻胶含量呈下降趋势。发酵时间为48h时，褐藻胶含量最低。综合考虑选择48h为最适发酵时间。
(3)最适接种量
保持基础发酵的其他条件不变，考察当接种量分别8％、10％、12％、14％时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。由图16可知，接种量为10％时，粗蛋白含量最高，藻胶含量最低；接种量为12％时，可溶性蛋白含量最高。综合考虑选择10％为最适接种量。
(4)最适料水比
保持基础发酵的其他条件不变，考察当料水比分别8％、10％、12％、14％时，对饲料中粗蛋白、可溶性蛋白和褐藻胶含量的影响。实验设3次重复。当料水比1:1时，粗蛋白和可溶性蛋白含量最高。料水比为1:1、1:1.2、1:1.4时，褐藻胶含量变化不显著。因此，选择1:1为最适料水比。
实施例9 响应面法优化海带饲料混菌发酵条件
设计响应面实验，表3所示以粗蛋白含量为指标建立的回归模型为极显著，整体分析来看，回归模型的拟合程度良好。较好地反映了海带发酵后的粗蛋白含量与发酵时间、发酵温度、接种量和水料比之间的相互作用关系。影响顺序依次为B(时间)>C(接种量)>D(水料比)>A(温度)，其中B、C两项对结果影响极显著。交互项AB(温度和接种量)的影响显著，3个二次项的影响极显著。可看出，各因素对可溶性蛋白的影响不是一个简单的线性关系。二次回归方程的三维曲面图和等高线图，结果见图18。运用软件Optimization对回归模型进行分析，求得最佳发酵条件，以期达到海带饲料粗蛋白含量最大化。经过分析，在发酵温度30.5℃，时间62h，接种量9.4％，料水比1:1.2g/mL，搅动时间24h时达到最优发酵条件，理论上粗蛋白为13.18％。
表3粗蛋白含量为指标建立回归方程方差分析表
Figure BDA0003480950940000091
注：**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)；△表示不显著。
由表4可知，以可溶性蛋白含量为指标建立的回归模型为极显著，说明与实际情况拟合良好；影响顺序依次为B(时间)>C(接种量)>A(温度)>D(水料比)，其中B、C两项对结果影响极显著。D项对结果有显著影响。交互项AC(温度和接种量)的影响显著，3个二次项的影响极显著。根据拟合回归方程作响应面分析图，结果见图19。运用软件Optimization对回归模型进行分析，求得最佳发酵条件，经过分析，在发酵温度30℃，时间63h，接种量9.7％，料水比1:1.23g/mL，搅动时间24h时达到最优发酵条件，理论上可溶性蛋白为1.27％。为了检验海带发酵饲料工艺优化的可靠性，在结合实际生产的前提下，按照响应面法优化条件，将反应体系条件简化为发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2进行发酵，测定发酵饲料的粗蛋白和可溶性蛋白，并测定了褐藻胶含量，进行3次平行试验，所得海带饲料的褐藻胶、粗蛋白和可溶性蛋白含量为20.38％、13.04％和1.25％，相对于理论最大值，相对误差在2％以内，因此该模型能较好的拟合枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母(3:2:1)发酵海带饲料提高蛋白含量的发酵工艺。
表4以可溶性蛋白含量为指标建立回归方程方差分析表
Figure BDA0003480950940000101
Figure BDA0003480950940000111
注：**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)；△表示不显著。
实施例10
设计响应面实验，表5可知，以粗蛋白含量为指标建立的回归模型为极显著，整体分析来看，回归模型的拟合程度良好。影响顺序依次为B(时间)>C(接种量)>A(温度)>D(料水比)，其中B、C三项对结果影响极显著。交互项AB(温度和时间)的影响极显著。根据拟合回归方程作响应面分析图，结果见图20。运用软件Optimization对回归模型进行分析，求得最佳发酵条件。经过分析，在发酵温度30.34℃，时间54.33h，接种量9.56％，料水比1:1.01g/mL，搅动时间24h时达到最优发酵条件，理论上粗蛋白为13.69％。
表5以粗蛋白含量为指标建立回归方程方差分析表
Figure BDA0003480950940000112
注：**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)；△表示不显著。
由表6可知，以可溶性蛋白含量为指标建立的回归模型为极显著，说明与实际情况拟合良好；影响顺序依次为B(时间)>C(接种量)>D(料水比)>A(温度)，其中B、C、D三项对结果影响极显著。交互项AC(温度和接种量)、AD(温度和料水比)、BC(时间和接种量)的影响极显著，AB(温度和时间)的影响显著。根据拟合回归方程作响应面分析图，结果见图21。运用软件Optimization对回归模型进行分析，求得最佳发酵条件。经过分析，在发酵温度30.28℃、时间63.05h、接种量9.76％、料水比1:1.04g/mL时达到最优发酵条件，理论上可溶性蛋白为1.61％。为了检验马尾藻发酵饲料工艺优化的可靠性，在结合实际生产的前提下，按照响应面法优化条件，将反应体系条件简化为发酵温度30.3℃，发酵时间60h、接种量9.7％、料水比1:1g/mL进行发酵，测定发酵饲料的粗蛋白和可溶性蛋白，进行3次平行试验，所得马尾藻饲料的褐藻胶、粗蛋白和可溶性蛋白为9.85％、13.52％和1.55％，相对于理论最大值，相对误差在4％以内，因此该模型能较好的拟合枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母(3:2:1)发酵马尾藻饲料提高蛋白含量的发酵工艺。
表6以可溶性蛋白含量为指标建立回归方程方差分析表
Figure BDA0003480950940000121
注：**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)；△表示不显著。
实施例11 发酵饲料的营养分析
发酵饲料基础物质的测定依据
(1)GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白测定凯氏定氮法
(2)GB/T 6438-2007饲料中总灰分测定
(3)GB/T 6433-2006饲料中粗脂肪测定索氏抽提法
(4)DB12/T 847-2018总糖测定苯酚-硫酸法
基本营养成分分析
对未发酵海带、马尾藻及混合菌株发酵的海带、马尾藻饲料恒温干燥后，进行粗蛋白、粗脂肪、灰分、总糖含量的测定，结果见表7。未发酵海带、马尾藻的粗蛋白分别为8.72％、9.97％，经过优化后的混菌发酵，粗蛋白含量分别提高至13.04％、13.52％。且发酵饲料的脂肪和总糖含量均低于未发酵饲料。
表7饲料发酵前后基础成分变化
Figure BDA0003480950940000131
还原糖含量的变化
枯草芽孢杆菌和黑曲霉在发酵过程中均可产生纤维素酶，可降解基质中的纤维素，使还原糖升高；另外，菌株产生的淀粉酶可降解淀粉，从而使还原糖含量增加。如图22所示，饲料经过混菌固态发酵后，发酵产物中还原糖的含量均显著增加。其中，海带饲料经枯草芽孢杆菌+酿酒酵母+植物乳杆菌(3:2:1)混合菌株发酵后，还原糖含量由2.87％提高至5.86％，是未发酵组的2.04倍。经枯草芽孢杆菌+酿酒酵母+植物乳杆菌(3:2:1)发酵马尾藻饲料，其还原糖含量是未发酵组的2.03倍。
纤维素酶活力含量的变化
从图23可看出，饲料经过混菌固态发酵后，发酵产物中纤维素酶活的含量均显著增加，其中，海带组和马尾藻组未发酵时酶活分别为2.46U/g、2.92U/g，发酵后，酶活分别达到了15.88U/g和17.28U/g。
酸性蛋白酶活力含量的变化
从图24可看出，饲料经过混菌固态发酵后，发酵产物中酸性蛋白酶活的含量均显著增加。海带组和马尾藻组酶活分别由未发酵前的80U/g和77.19U/g提高到发酵后的315.79U/g和345.46U/g。不同的菌株产生的酶系会有所不同，当酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌之间进行混合发酵时，各菌株之间会形成良好的协同共生关系，对蛋白酶的合成有一定的帮助，从而使蛋白酶活性大大增加。
氨基酸含量的变化
不同混合菌株发酵的海带和马尾藻饲料中氨基酸的测定结果分别见表8和表9。
表8单菌和混菌发酵海带饲料中游离氨基酸的含量(mg/g)
Figure BDA0003480950940000132
Figure BDA0003480950940000141
注：*表示必需氨基酸；在同一行上，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，n＝3，下表同。
混合发酵菌为枯草芽孢杆菌:酿酒酵母:植物乳杆菌＝3:2:1。
表9单菌和混菌发酵马尾藻饲料中游离氨基酸的含量(mg/g)
Figure BDA0003480950940000142
Figure BDA0003480950940000151
注：混合发酵菌为枯草芽孢杆菌:酿酒酵母:植物乳杆菌＝3:2:1。
饲料中氨基酸的不均衡对动物的生长发育与营养物质的利用率有很大影响。表8至表9中数据表明，在5组未发酵和发酵饲料中发现了17种游离氨基酸，氨基酸含量随饲料的发酵有所变化。通过混合益生菌的固态发酵，饲料的风味氨基酸(包括Asp，Glu，Ala，Tyr和Phe等)的含量显著增加。另外，Ser，Ile，Lys，Arg和Pro 5种氨基酸显著高于未发酵饲料；且混合菌株发酵饲料的总游离氨基酸含量显着高于未发酵饲料。在测得的17种氨基酸中必需氨基酸和非必需氨基酸种类较为齐全。
在海带饲料中，混合发酵饲料的必需氨基酸含量(包括Thr，Val，Ile，Leu，Phe)显著大于3株单菌发酵的含量，且总氨基酸和总必需氨基酸含量显著高于单菌发酵和未发酵饲料中的含量。
在马尾藻饲料中，混合发酵饲料的必需氨基酸含量(包括Thr，Val，Ile，Met，Leu，Phe，Lys)显著大于3种单菌发酵饲料的氨基酸含量；总氨基酸和总必需氨基酸含量显著高于3株单菌发酵和未发酵饲料中的含量。
海参体壁中氨基酸含量较高的有Arg、Asp、Glu、Gly、Lys、Val等；其中，Glu含量最高，其次是Gly，含量最低的为Cys。因此，海带和马尾藻饲料发酵后能满足海参的氨基酸需求。
实施例12 发酵产物饲喂海参效果评价
1.发酵组Ⅰ原料：海带粉15％、马尾藻粉25％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。
发酵组Ⅱ原料：马尾藻粉40％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。
先将海带和马尾藻进行预处理后，烘干至水分含量小于12％，然后将其与配方中的其它原料混合粉碎至60目备用。
2.以优化的混菌：枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌+酿酒酵母(3:2:1)做为发酵菌剂，发酵原料Ⅰ按照最优发酵工艺条件进行发酵：发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2g/mL、每24h翻动一次。发酵原料Ⅱ按照最优发酵工艺条件进行发酵：发酵温度30.3℃，发酵时间60h，接种量9.7％、料水比1:1g/mL、每24h翻动一次。以获得的发酵原料进行海参饲喂，与不发酵原料对比，评价发酵原料的饲喂效果。
表10发酵组Ⅰ海参的消化性能和免疫性能评价
Figure BDA0003480950940000161
表11发酵组Ⅱ海参的消化性能和免疫性能评价
Figure BDA0003480950940000162
净增长率：WG(％)＝[(WT-W0)/W0]×100
特殊生长率：SGR＝(InWT－InW0)/T×100％
式中:ln为自然对数，W0为试验开始平均体质量，WT为试验结束后平均体质量，T为试验时间(60天)
表12发酵组Ⅰ海参的生长性能评价
组别 初质量(g) 终质量(g) WG％ SGR(％/d)
未发酵组 7.40±0.08 11.79±0.23 78.24±0.33 0.78±0.29
发酵组 7.51±0.23 14.05±0.44 87.08±0.23 1.04±0.23
表13发酵组Ⅱ海参的生长性能评价
组别 初质量(g) 终质量(g) WG％ SGR(％/d)
未发酵组 7.29±0.35 13.15±0.38 80.38±0.33 0.98±0.29
发酵组 7.35±0.41 15.17±0.27 106.39±0.771 1.21±0.18
综上，采用本发明的发酵饲料饲喂海参具有显著优势。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.混合菌在大型海藻生物发酵饲料上的应用，其特征在于，所述混合菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母作为混合发酵种子液对大型海藻生物进行固态发酵，在海参配合饲料上应用；所述大型海藻为海带或马尾藻。
2.海带、马尾藻微生物发酵饲料固态发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备发酵种子液，发酵种子液为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母中一种或多种进行制备；
S2.用步骤S1的发酵种子液对海带和/或马尾藻饲料固态发酵，发酵条件为：发酵温度30～35℃，时间48～72h、接种量9～11％、料水比1:1～1:1.5。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，发酵种子液为枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母；步骤S1中，当发酵种子液为混合菌时，以枯草芽孢杆菌为主发酵菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:1:1，1:2:2，1:3:3，2:1:2，2:2:3，2:3:1，3:1:3，3:2:1，3:3:2中任一接种比例进行混合发酵。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述步骤S2，将含有10-90％海带粉和/或马尾藻粉的饲料制备固态发酵原料，灭菌，将制备好的菌种发酵种子液按照接种配比接种到发酵原料培养基中发酵培养，发酵培养后烘干、粉碎、过筛即得海带或马尾藻微生物发酵饲料。
5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，步骤S2所述固态发酵原料含有10-30％海带粉和10-90％马尾藻粉。
6.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，含有海带粉或马尾藻粉的饲料组成为：海带粉或马尾藻粉占饲料总量的47.5％、豆粕粉占2％、海虹干粉占2％、牡壳粉占1％；
将海带饲料或马尾藻饲料各组分充分混合均匀，按料水比添加去离子水，使发酵饲料达到手握成团，落地松散的程度，pH自然，121℃灭菌20min，得固态发酵原料；将固态发酵原料分装于锥形瓶中，去离子水按适量的料水比添加，121℃灭菌20min；冷却后，将制备好的菌种发酵种子液按照接种配比接种到发酵原料培养基中，恒温静置发酵培养定量时间，发酵培养后于超净工作台搅拌透气；发酵结束后在50℃恒温箱中烘干，利用粉碎机机将其粉碎过筛，即为海带或马尾藻微生物发酵饲料。
7.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母接种比例为3:2:1；海带饲料的发酵条件为：发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2g/m进行发酵，每24h翻动一次；马尾藻饲料的发酵条件为：发酵温度30.3℃，发酵时间60h、接种量9.7％、料水比1:1g/mL进行发酵，每24h翻动一次。
8.用于海参生长的微生物发酵饲料，其特征在于，海带和/或马尾藻粉占10-50％，面粉、豆粕粉、海虹干粉、牡壳粉和海泥占50-90％发酵制备微生物发酵饲料，发酵条件为：发酵温度30.5℃，发酵时间65h、接种量9.5％、料水比1:1.2g/mL、每24h翻动一次。
9.根据权利要求8所述的微生物发酵饲料，其特征在于，海带粉15％、马尾藻粉25％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。
10.根据权利要求8所述的微生物发酵饲料，其特征在于，马尾藻粉40％、面粉20％、豆粕粉14％、海虹干粉4％、牡壳粉2％、海泥20％。
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