CN116535509B - 抗CD79b抗体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗CD79b抗体、其制备方法及其应用。揭示了一组具有独特的抗原结合部分的抗体，其能与CD79b特异性结合并有效抑制表达CD79b的肿瘤细胞。本发明的抗体可以应用于抑制与CD79b表达相关或者是受到CD79b功能影响的疾病，例如肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和药学领域，更具体地，本发明涉及抗CD79b抗体、其制备方法及其应用。
背景技术
CD79b是B细胞受体的组成部分，与CD79a形成异二聚体介导抗原与BCR结合所产生的信号。CD79b含有一个胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和一个胞内信号结构域。CD79b和CD79a均可以诱导BCR的内吞，但CD79b占主导地位。
目前全球已有的靶向CD79b的免疫治疗药物有：2019年获FDA批准上市的Polatuzumab vedotin是首款CD79b靶向抗体偶联药物(ADC)，用于治疗复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤；另一款靶向CD79b的ADC药物iladatuzumab vedotin，用于治疗非霍奇金淋巴瘤，目前正开展I期试验。
淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，是全世界最常见的血液肿瘤。非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)发病率高，且占淋巴瘤的80%以上。CD79b几乎在超过90%的NHL中表达；在化疗治疗后复发的病人中，87%的滤泡型淋巴瘤和77%弥漫性大B细胞淋巴瘤表达CD79b。而且CD79b只在正常的前B细胞和成熟B细胞中表达，而不在造血干细胞中表达。跟其它高度表达B细胞表面抗原不一样的是，CD79b与抗体结合后被迅速内吞并递送至溶酶体内。基于这些独特的功能，CD79b成为靶向递送细胞毒性剂的潜在靶点。所以在非霍奇金淋巴瘤例如弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤等领域开发针对CD79b的靶向药物具有特别重要的意义。
基于CD79b的表达和市场上仍未被满足的医疗需求，开发靶向CD79b的抗体靶向药物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供抗CD79b抗体、其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供抗CD79b抗体或其抗原结合片段，所述抗CD79b抗体具有轻链可变区和重链可变区，其中，重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:22所示；轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、SEQID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23所示，CDR2的氨基酸序列如“LV”，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:6所示。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段选自：
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、“LV”、SEQ ID NO:5所示 (如A8-3m26、A8-3m18或A8-3)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、“LV”、SEQ ID NO:20所示 (如A8)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、“LV”、SEQ ID NO:14所示 (如A1)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQ ID NO:18所示 (如A5)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23、“LV”、SEQ ID NO:24所示 (如A18)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQ ID NO:6所示 (如hmC3-3、mC3或101C5E9)；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQ ID NO:6所示 (如mC1或99H10D7)。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、scFv。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体包括：人源化抗体、嵌合抗体或鼠源抗体。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为人源化抗体，其具有人源化或全人的重链FR区和轻链FR区。较佳地，其具有人源化或全人的恒定区。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体的FR区(包括重链FR区和轻链FR区)与人源抗体胚系基因的FR区高度同源性、相同或相近。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为嵌合抗体，其具有人源化或全人的恒定区，包括重链恒定区和轻链恒定区。
在一种或多种优选实施方式中，所述嵌合抗体或人源化抗体具有人抗体IgG1重链恒定区，人kappa轻链恒定区。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为人源化抗体，包括重链FR区和轻链FR区。
在一种或多种优选实施方式中，所述重链FR区包括重链FR1、FR2、FR3、FR4，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:13中第1-25位所示的FR1，如SEQ IDNO:13中第34-50位所示的FR2，如SEQ ID NO:13中第59-96位所示的FR3，如SEQ ID NO:13中第103-113位所示的FR4。
在一种或多种优选实施方式中，所述轻链FR区包括轻链FR1、FR2、FR3、FR4，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:12中第1-26位所示的FR1，如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:25中第38-54位所示的FR2，如SEQ ID NO:12中第57-93位所示的FR3，如SEQ ID NO:12中第103-113位所示的FR4。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为人源化抗体，其重链可变区具有SEQID NO:28所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:27所示氨基酸序列。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为人源化抗体，其重链可变区具有SEQID NO:26所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:25所示氨基酸序列
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体为人源化抗体，其重链可变区具有SEQID NO:13所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体还包括氨基酸序列与SEQ ID NO:28、SEQID NO:26、SEQ ID NO:13所示序列具有80%以上(如85%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性的重链可变区。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体还包括氨基酸序列与SEQ ID NO:27、SEQID NO:25、SEQ ID NO:12所示序列具有80%以上(如85%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性的轻链可变区。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码权前面任一所述的抗CD79b抗体或其抗原结合片段。
在一种或多种优选实施方式中，所述的构建体为表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种抗体或其抗原结合片段的表达系统，所述表达系统含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
在一种或多种优选实施方式中，所述的表达系统为细胞(表达系统)。
在一种或多种优选实施方式中，所述细胞(宿主细胞)为哺乳动物细胞。
在一种或多种优选实施方式中，所述哺乳动物细胞包括(但不限于)：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如ExpiCHO)，Vero细胞，HEK-293细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，BHK细胞，PER-C6细胞；较佳地，为CHO细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合表达所述抗体或其抗原结合部分的条件下，利用所述的表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体或其抗原结合片段。
在一种或多种实施方式中，所述方法还包括纯化分离出所述抗体或其抗原结合片段。
在本发明的另一方面，提供所述的抗体或其抗原结合片段的用途，用于：制备特异性靶向和抑制表达CD79b的肿瘤细胞的抗肿瘤药物。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗肿瘤药物包括(但不限于)：免疫缀合物(抗体或其抗原结合部分-药物偶联物)；双功能(双特异性)或多功能(多特异性)抗体(融合蛋白)；嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
在一种或多种优选实施方式中，所述肿瘤包括：非实体瘤或实体瘤。
在一种或多种优选实施方式中，所述肿瘤包括：淋巴瘤，B淋巴细胞白血病。
在一种或多种优选实施方式中，所述淋巴瘤包括：非霍奇金淋巴瘤。
在一种或多种实施方式中，所述非霍奇金淋巴瘤包括：弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤。
在本发明的另一方面，提供融合蛋白或免疫缀合物，其包括所述的抗体或其抗原结合片段，以及与之操作性连接的功能性分子。
在一种或多种优选实施方式中，所述功能性分子包括：抑制肿瘤的分子，靶向肿瘤表面标志物的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，细胞毒素，放射性同位素，融合伴侣，嵌合抗原受体的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
在一种或多种优选实施方式中，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤毒素或抗肿瘤细胞因子。
在一种或多种优选实施方式中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。
在一种或多种优选实施方式中，所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体。
在一种或多种优选实施方式中，所述的融合伴侣包括(但不限于)：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗肿瘤毒素包括(但不限于)：美登素，奥利司他汀，单甲基澳瑞他汀，美登木素生物碱，多拉司他汀，卡奇霉素，氨甲蝶呤，长春地辛，紫杉烷如多烯紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇、特西紫杉醇或欧塔紫杉醇，单端孢霉毒素，CC1065，DXd，Duocarmycin，Calicheamicin，Pyrrolobenzodiazepines或SN-38。
在一种或多种优选实施方式中，所述的抗肿瘤细胞因子包括(但不限于)：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。
在一种或多种优选实施方式中，所述结合肿瘤表面标志物的抗体是识别免疫调节分子B7-H3以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括(但不限于)：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，CD47，ASGPR1或CDH16。
在一种或多种优选实施方式中，所述结合免疫细胞表面标志物的抗体结合的抗原包括(但不限于)：CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、 LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79b、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2。
在一种或多种优选实施方式中，所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括(但不限于)：免疫球蛋白Fc区、优选人免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白(如人源的HSA)或其片段。
在一种或多种优选实施方式中，所述免疫球蛋白为选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。
在一种或多种优选实施方式中，所述抗体以及与之操作性连接的功能性分子之间设有连接肽；所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，包括所述的抗体或其抗原结合片段、所述的融合蛋白或免疫缀合物。
在一种或多种实施方式中，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供所述的抗体或其抗原结合片段、所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物在制备特异性靶向和抑制表达CD79b的肿瘤细胞的抗肿瘤药物的制剂、试剂盒或药盒中的用途。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，包括：容器或包装；以及置于所述容器或包装中的所述的抗体、所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒或药盒中还可含有：免疫刺激性抗体、化疗剂或抗感染药物等。
在一种或多种实施方式中，所述免疫刺激性抗体包括(但不限于)：抗 PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体和抗CTLA-4抗体。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒或药盒中还含有使用说明书(包装插页)，说明所述抗体或其抗原结合部分、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物的使用/服用方法。
在本发明的另一方面，提供一种在受试者中刺激免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者上面任一所述的抗体或其抗原结合部分，从而刺激该受试者的免疫反应；较佳地，所述刺激免疫反应包括特异性靶向表达CD79b的肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞。
在一种或多种实施方式中，所述受试者为携带肿瘤的受试者，并且给予该受试者所述的抗体刺激了针对该肿瘤的免疫反应。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A-C为本发明嵌合抗体对人和猴CD79b的ELISA检测结果和FACS检测结果。
图2为本发明嵌合抗体偶联药物对于肿瘤的杀伤功能。
图3为本发明人源化抗体FACS的检测结果。
图4A-B为本发明亲和力成熟抗体的FACS检测结果。
图5为本发明亲和力成熟抗体的Octet检测结果。
图6A-B为本发明候选分子A8-3m18和A8-3m26对人和猴CD79b的ELISA的检测结果。
图7A-B为本发明候选分子A8-3m18和A8-3m26的FACS检测结果。
图8为本发明候选分子A8-3m18和A8-3m26对人CD79b的Octet检测结果。
图9为本发明候选分子A8-3m18和polatuzumab结合表位的Octet检测结果。
图10A-B为本发明候选分子A8-3m18和polatuzumab结合表位的FACS检测结果。
图11A-D为本发明候选分子A8-3m18和A8-3m26偶联药物对于肿瘤的杀伤功能。
图12A-B为本发明偶联MMAE抗体偶联药物对于Ramos荷瘤小鼠体内抗肿瘤效果。
图13为本发明偶联DXd抗体偶联药物对于Ramos荷瘤小鼠体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示了一组具有独特的抗原结合部分(CDR区)的抗体，其能与CD79b特异性结合并有效抑制表达CD79b的肿瘤细胞。本发明的抗体可以应用于抑制与CD79b表达相关或者是受到CD79b功能影响的疾病，例如肿瘤。
现有的抗CD79b抗体在对于抗原的亲和性、对表达CD79b的细胞的最大结合量以及对于肿瘤的抑制效果等方面还有进一步改进的空间。本发明人基于此进行了筛选和优化改造，从而得到了本发明的具有独特的抗原结合部分的抗体，所述抗体在抗原最大结合量、亲和性方面具有显著优势，并且对肿瘤的抑制效果优异。
术语
如本文所用，“抗体”在本文中用作一般术语，包括全长抗体、单链抗体以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
如本文所用，“单克隆抗体”或“单抗”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。
如本文所用，“嵌合抗体”是一种抗体，其来自一种物种(如小鼠)，但其抗体恒定区换成另一个物种(如人)的。所述“嵌合抗体”包括“人源化抗体”。
如本文所用，“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
如本文所用，“可检测标记物”是指可连接于抗体上的，用于确定待待测对象中特定靶标的存在与否以及存在的量的标志物。所述“可检测标记物”可以是，但不限于：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。更具体地例如可选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物( 例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类( 例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物( 例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
本发明中，所述肿瘤为表达CD79b的肿瘤。
抗体
本发明提供一种抗CD79b抗体，所述抗CD79b抗体具有前面所述的CDR区。
抗体的重链和轻链的抗原结合特性通常由位于重链可变区和轻链可变区的各3个互补决定区(CDR)来决定，所述的CDR区与框架区(FR)有序排列，FR区不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列，本发明的抗体包括了针对CDR区以及框架区的序列改造。
在更具体的方案中，本发明中也指定了其重链可变区及轻链可变区。本发明也包括重链可变区和/或轻链可变区与所指定的序列具有85%以上(如88%、90%、93%、95%、97%或99%以上)序列相同性的抗体，且其具有本发明实施例所述抗体相同功能。较佳地，本发明的抗体为人源化抗体。
本发明所提供的抗CD79b的抗体，可以高效地与人CD79b特异性结合，可以高效地阻断CD79b的作用，可以高效地将与之偶联的另一物质携带到目标细胞。
本发明也包括一种抗CD79b抗体的融合蛋白，包括如本发明所述的抗体的第一结构域和用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二结构域。所述融合蛋白可以是一种结合分子，所述结合分子能够与表达CD79b的细胞特异性结合。
所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体等。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性的突变。
本发明所提供的抗CD79b抗体的融合蛋白中，所述第一结构域和第二结构域之间可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个，在本发明另一具体实施方式中，连接肽的长度可以为8个或15个。
本发明也提供了一种分离的多核苷酸，编码本发明的抗体、或编码所述的融合蛋白，所述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
构建体及抗体表达系统
本发明也提供了一种构建体，所述构建体含有本发明所述的分离的多核苷酸。所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。所述载体还可以包括与这所述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可以包括合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列还可以包括合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本发明也提供了一种抗体的表达系统，所述表达系统含有本发明所述的构建体或基因组中整合有外源的本发明所述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。
免疫缀合物
本发明也提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括本发明所述的抗体(包括其抗原结合部分/片段)、或所述的融合蛋白。所述免疫缀合物通常还包括与所述抗体活融合蛋白连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子，所述功能性分子可以是包括但不限于可检测标记物、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子等，或它们的组合。
制备所述免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将所述抗体和/或融合蛋白与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫缀合物。
为了治疗目的，与治疗效应物基团例如放射性基团可能是合适的，这些放射性基团即由放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、33P、35S、90Y、99Tc、111ln、123l、125l、131l、201TI、213Bi)、毒素或细胞毒性基团例如细胞生长抑制剂组成或包括其的基团。
所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物、蛋白标签；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本发明的抗体或融合蛋白可以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基团(例如荧光蛋白例如GFP、RFP等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如FITC、花青染料)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(Fe2O3)的核心)、预定的多肽基团等。
所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及靶向免疫细胞的表面标志物的分子。所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子可识别免疫细胞，其携带本发明的抗体达到免疫细胞，同时本发明的抗体可将免疫细胞靶向于肿瘤细胞，从而在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还引发免疫细胞特异性地杀伤肿瘤。
所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及至少一种靶向肿瘤表面标志物的分子或抑制肿瘤的分子。所述的抑制肿瘤的分子可以是抗肿瘤的细胞因子，或抗肿瘤的毒素。例如，所述的细胞因子可以是但不限于：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha等。所述的靶向肿瘤表面标志物的分子例如可以与本发明的抗体协同作用，更精准地靶向肿瘤细胞。
所述免疫缀合物还可以是嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，所述嵌合抗原受体可表达于免疫细胞。所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，其包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞等，优选的，为NK细胞和T淋巴细胞。所述的嵌合抗原受体一般包含顺序连接的：胞外结合区、跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含本发明的抗体或融合蛋白。基于CAR技术的跨膜区和胞内信号区的设计是本领域公知的：例如跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序 (ITAM)CD3ζ链或FcεRIγ酪氨酸激活继续及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134、MyD88、CD40等的胞内信号区。更具体地，针对T淋巴细胞，胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM，可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应；第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28 -ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM；胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果；第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。
根据上述，应用本发明的抗体或融合蛋白制备的嵌合抗原受体可以是包括如下的顺序连接的胞外结合区、跨膜区和胞内信号区：本发明的抗体或融合蛋白、CD8和CD3ζ；本发明的抗体或融合蛋白、CD8、CD137和CD3ζ；本发明的抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区(CD28a)、CD28分子的胞内信号区(CD28b)和CD3ζ；或本发明的抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
将该嵌合抗原受体表达于免疫效应细胞的表面，在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还可使得免疫效应细胞对表达CD79b的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。
作为本发明的优选方式，可将本发明的抗体与抑制肿瘤的分子相连接，较佳地所述抑制肿瘤的分子为抗肿瘤的毒素，包括作用于微管蛋白的毒素，如单甲基澳瑞他汀(Monomethyl auristatin)相关化合物及其衍生物，美登木素生物碱(maytansinoid)相关化合物及其衍生物；作用于DNA的毒素，如duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines(PBDs)，SN-38，Dxd等相关化合物及其衍生物；以及作用于细胞内如代谢，转录，翻译，信号转导等其它功能的相关化合物及其衍生物。本发明也包括这些作为毒素的小分子化合物的类似物、异构体、前体等。
药物组合物及试剂盒
本发明也提供了一种药物组合物，包括本发明的抗CD79b抗体、或本发明的抗CD79b抗体的融合蛋白、或本发明的免疫缀合物。
所述药物组合物中还可以包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEE®、PLURONICS®或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻干剂等各种剂型。
所述药物组合物中，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量通常是有效量的，所述有效量所对应的活性成分的含量可以根据所治疗的对象和特定给药方式来确定。例如，以药物组合物的总质量计，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量范围可以是大约0.01～99%、0.1～70%、1～30%、0.01～0.05%、0.05～0.1%、0.1～0.3%、0.3～0.5%、0.5～1%、1～3%、3～5%、5～10%、10～20%、20～30%、30～50%、50～70%、或70～99%。
本发明的融合蛋白、免疫缀合物和药物组合物可以作为单一有效成分施用，也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物联合其他至少一种抗肿瘤药物。再例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。
本发明也提供了一种检测试剂盒，包括本发明所述的抗体、融合蛋白或免疫缀合物。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。所述试剂盒中也可包括使用说明书，以便于本领域技术人员操作。
本发明还进一步提供利用所述的抗体检测CD79b蛋白的检测方法，包括但不限于定性检测、定量检测和定位检测。具体地，所述检测方法包括但不限于免疫荧光测定、免疫组化和放射免疫测定等。
一种检测样品中是否存在CD79b蛋白的方法可以包括：将样品与本发明的抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CD79b蛋白。所述的样品可以是细胞和/或组织样品；可以将样品固定或溶解在介质中；检测在所述固定或溶解的样品中CD79b蛋白的水平。在一些实施方式中，检测对象可以是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。在另一些实施方式中，所述抗体还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
用途
本发明也提供了本发明的抗体、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防与表达(或过表达)CD79b的细胞相关的疾病的用途。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括：非实体瘤或实体瘤；前提是所述肿瘤表达CD79b。
在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤包括(但不限于)原位或转移的：血液系统肿瘤如淋巴瘤，白血病，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌；前提是所述肿瘤表达CD79b。
作为一种具体的实施例中，所述肿瘤为B细胞淋巴瘤。在所述B细胞淋巴瘤中，高于85%(更佳地高于90%)的肿瘤细胞表达CD79b，从而本发明的抗体可靶向富集于此类肿瘤细胞、发挥杀伤作用。
本领域中，抗体polatuzumab已经被应用，本发明人的研究结果显示，本发明的一些抗体对表达CD79b的肿瘤细胞(如Daudi和Ramos)的最大结合量更高，在偶联小分子后结合到低表达CD79b的肿瘤细胞Daudi细胞上的药物更多，引起了更好的细胞杀伤作用。
本发明的抗体偶联MMAE后(如A8-3m18-MMAE)，在CD79b表达相对较低的肿瘤细胞(如Daudi)上表现出更好的杀伤作用，在体内可能有更好的药效。
本发明的抗体偶联DXd (如形成低剂量的A8-3m26-DXd)，在荷瘤动物(如Ramos荷瘤小鼠)体内表现出显著的肿瘤抑制效果，可以预见使用该偶联制剂治疗对polatuzumab-MMAE产生耐药的病人具有较大的潜力。
本发明所提供的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于CD79b相关肿瘤的治疗(包括如淋巴瘤等)，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约30%，更优选至少约40%，更优选至少约50%，更优选至少约60%，更优选至少约70%，更优选至少约80%。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物通常能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因素等。预防有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此“预防有效量”通常低于“治疗有效量”。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、筛选高亲和力的抗体
使用带有mouse Fc标签的人CD79b融合蛋白作为免疫原，通过腹腔注射免疫10只SJL小鼠，刺激小鼠体内产生抗人CD79b的抗体。
选取血清效价最高的的两只小鼠，采用电融合方法，将小鼠的脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，来获得能分泌特异性抗人CD79b的抗体且能无限增殖的杂交瘤细胞。
通过ELISA和FACS方法对杂交瘤的亚克隆进行筛选。ELISA的检测方法为：先将人的CD79b-His蛋白吸附在酶标板上，加入杂交瘤细胞的培养上清，室温孵育1 h后洗酶标板；然后加入带HRP标记的兔抗鼠全长二抗(Thermo Fisher)，室温孵育1 h后洗酶标板；最后用TMB显色，用酶标仪记录450 nm处的吸收值。FACS的检测方法为：取Daudi细胞(表达CD79b抗原)离心收集，加入PBS重悬细胞后计数，加入96孔板中离心去上清，再加入杂交瘤细胞的培养上清，室温孵育30 min后清洗细胞两次，加入带PE标记的羊抗鼠全长二抗(Jackson)，避光孵育30 min后清洗细胞一次，用PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测。
经过反复实验比较，最终筛选得到2个高亲和力的抗体，分别由亚克隆99H10D7和101C5E9产生，ELISA检测和FACS检测的结果见表1。
表 1
从结果可以看出，由亚克隆99H10D7和101C5E9产生的单克隆抗体不仅在蛋白水平能结合人CD79b抗原，而且在细胞水平能和表达CD79b抗原的Daudi细胞结合。
实施例2、抗体的序列分析
将实施例1中得到的2个杂交瘤单克隆细胞提取mRNA(Omega)，反转录为cDNA(TAKARA)。利用PCR从反转录的cDNA中扩增抗体基因的重链和轻链可变区，连接到pMDTM18-T载体(TAKARA)上，并转化到感受态细胞DH5α，测序得到单克隆抗体重链和轻链可变区。表2和表3分别为小鼠单克隆抗体抗人CD79b的可变区氨基酸序列和按照IMGT划分的CDR氨基酸序列。
表 2
表 3
分析序列发现，99H10D7轻链可变区与101C5E9轻链可变区的氨基酸序列相同；重链可变区的氨基酸序列存在不同，其HCDR2区氨基酸序列不同。
实施例3、嵌合抗体的制备
通过使用PrimeSTAR@ Max DNA Polymerase(TAKARA)，PCR克隆实施例2中得到的抗体重链和轻链可变区核酸基因、人抗体IgG1重链恒定区(其氨基酸序列的GenBank登录号：AXN93653.1)和人kappa轻链恒定区(其氨基酸序列的GenBank登录号：AWK57456.1)的编码核酸基因，组合成重链和轻链的全长基因。
通过琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，使用胶回收试剂盒(Omega)得到目的基因，最后通过ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)连接至表达载体。测序验证表达载体正确后，转染到ExpiCHO细胞中表达，并通过Protein A纯化，获得嵌合抗体。
本发明人将嵌合抗体分别命名为mC1(对应99H10D7)和mC3(相应于101C5E9)。
实施例4、嵌合抗体mC1和mC3的活性测定
首先，利用ELISA技术检测嵌合抗体mC1和mC3对人和猴CD79b胞外区蛋白的结合能力。分别将人CD79b-ECD-His蛋白和猴CD79b-ECD-His(Sino bio)吸附在酶标板上，加入5%的脱脂奶粉室温孵育1 h后洗酶标板，加入梯度稀释的抗体，室温孵育1 h后洗酶标板；然后加入带HRP标记的羊抗人Fc二抗(Jackson)，室温孵育1 h后洗酶标板；最后用TMB显色，用酶标仪记录450 nm处的吸收值。结果如图1A所示，嵌合抗体mC1和mC3结合人CD79b蛋白的亲和力相似。如图1B所示，mC3结合猴CD79b蛋白的亲和力高于mC1。
随后，利用FACS技术检测嵌合抗体mC1和mC3在细胞水平对人CD79b的结合能力。将表达人CD79b的肿瘤细胞Daudi离心，加入PBS重悬细胞后计数，加入96孔板中离心去上清，加入梯度稀释的抗体，4oC孵育30 min后清洗细胞两次，加入带PE标记的羊抗人IgG Fc标签的二抗(Jackson)，4oC避光孵育30 min后清洗细胞一次，用PBS重悬细胞后使用流式细胞仪进行检测。结果如图1C所示，嵌合抗体mC1和mC3均能结合细胞表面的CD79b抗原，且亲和力接近。
实施例5、嵌合抗体偶联药物的制备及其杀伤效果测试
将嵌合抗体mC1和mC3与小分子药物单甲基澳瑞他汀(Monomethyl auristatin,MMAE)制备成抗体偶联药物，检测它们对表达人CD79b的肿瘤细胞Daudi的杀伤效果。将嵌合抗体先与TCEP(Sigma)孵育，打开链间的二硫键，然后加入mc-vc-PAB-MMAE(medchemexpress)进行偶联，最后用脱盐柱进行纯化，去除多余的小分子药物，将得到的抗体偶联药物分别命名为mC1-MMAE和mC3-MMAE，阴性对照是IgG-MMAE。通过疏水相互作用色谱分析，mC1抗体和MMAE的比例是1:3.7，mC3抗体和MMAE的比例是1:4.9，阴性对照的IgG和MMAE的比例是1:4.0。
将表达人CD79b的肿瘤细胞Daudi按5000个每孔接种到96孔细胞板中，将抗体偶联药物mC1-MMAE和mC3-MMAE以及阴性对照IgG-MMAE进行梯度稀释，加入到含有Daudi细胞的96孔细胞板中，37oC培养5天。用CellTiter-Glo(Promega)检测细胞活率，从而得到抗体偶联药物对细胞的杀伤效果。
结果如图2所示，在表达人CD79b的Daudi细胞上，mC1-MMAE和mC3-MMAE均有显著的杀伤效果，且mC3-MMAE杀伤效果强于mC1-MMAE。
实施例6、嵌合抗体的人源化
将嵌合抗体mC3进行人源化。利用IMGT数据库对mC3抗体轻重链序列的可变区进行分析，其中与抗原结合起决定作用的CDR1，CDR2和CDR3区域如表3所示。将其进行人源化的时候，保留CDR区域，鼠源的FR区域替换为与人源抗体胚系基因的FR区域同源性最近的，最终得到人源化抗体，将其命名为hmC3-3，其轻链和重链的可变区如表4所示。
表 4
将hmC3-3抗体的可变区氨基酸序列转变为核苷酸序列，通过密码子优化后进行基因合成。然后分别与人IgG1重链和轻链的恒定区基因连接，构建至表达载体中，测序结果正确后，抽提质粒转染到ExpiCHO细胞中表达。通过Protein A纯化，获得人源化抗体hmC3-3。
实施例7、人源化抗体答复亲和力以及结合量分析
利用FACS技术检测人源化抗体hmC3-3相比嵌合抗体mC3对表达人CD79b的细胞亲和力。方法同实施例4，其中polatuzumab为阳性对照抗体，序列来自专利US8088378。
结果如图3所示，相比嵌合抗体mC3，人源化抗体hmC3-3在细胞水平结合CD79b的亲和力降低了2.6倍。虽然mC3和hmC3-3在EC50上不如对照抗体polatuzumab，但mC3和hmC3-3在细胞上的最大结合量均大于polatuzumab。
实施例8、人源化抗体hmC3-3的亲和力优化
为了提高人源化抗体hmC3-3的亲和力，利用噬菌体展示技术对hmC3-3进行亲和力成熟，经过两轮筛选对其加以改造。首先对hmC3-3轻链的CDR1、CDR3和重链的CDR3进行点突变，然后建立噬菌体展示文库，通过噬菌体表达抗CD79b的Fab抗体，利用磁珠淘选抗CD79b的高亲和力Fab抗体，总共筛选到6个亲和力提高的分子，分别为A1、A3、A5、A8、A9、A18，它们的轻链的CDR1、CDR3和重链的CDR3氨基酸序列如表5。
进一步将这6个Fab抗体的重链和轻链可变区基因分别连接人抗体IgG1重链恒定区和人kappa轻链恒定区的基因，构建成表达质粒，通过ExpiCHO细胞中表达，并用ProteinA纯化得到相应抗体。利用FACS技术检测对表达人CD79b的Ramos细胞亲和力是否提高，方法同实施例4。结果如图4A，相比hmC3-3，抗体A1、A5、A8和A18结合人CD79b的亲和力均得到了提高。从EC50来看，A8与人CD79b的结合能力最强，相比于hmC3-3，提高了大约7倍；hmC3-3结合细胞膜上的CD79b最大结合量高于A8。
再以A8分子为基础，进行第二轮筛选改造，获得亲和力提高的A8-3分子，其轻链的CDR1、CDR3和重链的CDR3氨基酸序列如表5。
表 5
将Fab抗体A8-3的重链和轻链可变区基因分别连接人抗体IgG1重链恒定区和人kappa轻链恒定区的基因，构建成表达质粒，通过ExpiCHO细胞中表达，并用Protein A纯化得到A8-3全长抗体。
利用FACS技术检测对表达人CD79b的Ramos细胞亲和力是否提高，方法同实施例4。结果如图4B，A8-3结合CD79b的亲和力与嵌合抗体mC3相近，而且A8-3在细胞上的最大结合量相比polatuzumab提高了56.3%。
实施例9、优化的抗体的亲和力测试
利用Octet检测抗体A8和A8-3与human CD79b-ECD-His蛋白的亲和力，结果如图5和表6所示。
表 6
从KD值看，人源化抗体hmC3-3与human CD79b-ECD-His蛋白亲和力相比嵌合抗体mC3，降低了大约6倍，但是经过改造后，A8-3与human CD79b-ECD-His蛋白的亲和力和嵌合抗体mC3非常接近，同时也要优于polatuzumab。
结合常数Ka值越高表明抗体结合抗原速度越快，A8相比mC3能更快地结合到抗原上，A8-3和嵌合抗体mC3相似，快于hmC3-3。
从解离常数Kd值看，mC3和A8-3最优，与抗原结合后，不易于从抗原上解离下来，解离常数相比polatuzumab高了大约6倍。
实施例10、优化的抗体的热稳定性分析
利用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)的方法来检测A8-3及mC3的热稳定性。DLS(wyatt)仪器是检测抗体从25oC加热到85oC时的光散射，从而得到抗体的聚合温度Tagg值。结果如表7。
表 7
根据表7，相比mC3，A8-3的聚合温度Tagg值降低了6.3oC。
实施例11、优化的抗体的热稳定性的改进
为了提高A8-3的热稳定性，进一步分析了mC3和A8-3的差异氨基酸，以期找到影响聚合温度Tagg值的氨基酸。通过分析，对A8-3可变区进行突变筛选，获得抗体A8-3m18和A8-3m26，其轻链和重链可变区的氨基酸序列如表8。采用ExpiCHO表达该抗体，使用Protein A纯化获得A8-3m18和A8-3m26抗体。
表 8
实施例12、动态光散射分析热稳定性
利用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)的方法检测A8-3m18和A8-3m26分子的热稳定性。方法如实施例10。结果如表9所示。
表 9
相比A8-3，A8-3m18和A8-3m26的聚合温度Tagg值分别提高至65.48℃和65.29℃。
实施例13、对人CD79b和猴CD79b的亲和力测定
利用ELISA技术检测A8-3m18、A8-3m26、mC3和polatuzumab对人CD79b和猴CD79b的亲和力变化。方法如实施例4。
结果如图6A所示，A8-3m18、A8-3m26和mC3抗体与人CD79b的结合能力一致，但polatuzumab抗体与人CD79b的结合能力强于A8-3m18、A8-3m26以及mC3抗体。如图6B所示，A8-3m18、A8-3m26和mC3抗体与猴CD79b均有结合能力，polatuzumab与猴CD79b无结合能力。
实施例14、FACS方法检测抗体亲和力
利用FACS方法检测A8-3m18、A8-3m26、mC3和polatuzumab与细胞表面表达人CD79b的Ramos和Daudi细胞亲和力，方法同实施例4，结果如图7A-B所示。
从EC50值来看，A8-3m18、A8-3m26和mC3在表达人CD79b的肿瘤细胞Ramos和Daudi上，A8-3m18和A8-3m26在结合CD79b时和mC3的结合相近。A8-3m18和A8-3m26结合Daudi细胞和Ramos细胞上的CD79b时，EC50比polatuzumab低6倍左右，但A8-3m18和A8-3m26结合细胞上的CD79b的最大结合量比polatuzumab强1.3～1.9倍。
实施例15、Octet法检测抗体的亲和力
利用Octet检测A8-3m18、A8-3m26和polatuzumab与人 CD79b-ECD-His蛋白的亲和力，结果如图8和表10所示。
表10
从Ka值可以看出，polatuzumab结合CD79b的速率比A8-3m18和A8-3m26快2~5倍；从Kd值可以看出，A8-3m18和A8-3m26与CD79b结合后再解离的速率比polatuzumab更慢。综合分析KD值，A8-3m18和A8-3m26与人 CD79b-ECD-His蛋白的亲和力均显著优于polatuzumab。
实施例16、抗体结合表位分析(In-Tandem法)
利用Octet仪器，采用In-Tandem法分析A8-3m18和polatuzumab结合人 CD79b的表位。先使用AMC传感器结合10 µg/mL 带有mouse Fc标签的人CD79b-ECD蛋白，然后结合第一个抗体直至信号达到饱和，最后结合第二个抗体观察信号值是否增加。如果信号值增加，说明第一个抗体和第二个抗体结合人CD79b是不同表位；如果信号值不变化，说明第一个抗体和第二个抗体结合人CD79b是同一个表位。
通过该方法检测得到结果如图9所示，当第一个抗体polatuzumab结合CD79b-ECD-mFc信号达到饱和后，第二个抗体A8-3m18结合时没有信号增加；相反当第一个抗体是A8-3m18结合CD79b-ECD-mFc信号达到饱和后，第二个抗体polatuzumab结合时也没有信号增加，说明A8-3m18和polatuzumab竞争结合CD79b，也就是A8-3m18和polatuzumab在人CD79b上结合位点相同。
实施例17、结合表位分析(FACS法)
利用FACS方法检测A8-3m18和对照抗体polatuzumab在细胞上人 CD79b的结合表位。将表达人 CD79b的Daudi细胞离心，加入PBS重悬细胞后计数，加入96孔板中离心去上清。实验共分为四组，第一组和第二组分别加入100 nM A8-3m18和100 nM polatuzumab，第三组和第四组加入PBS，4℃孵育30 min后，第一组和第三组分别加入3 nM biotin-polatuzumab，第二组和第四组分别加入3 nM biotin-A8-3m18。4℃孵育30 min后清洗细胞两次，加入带PE标记的Streptavidin二抗(Biolegend)，4oC孵育30 min后清洗细胞一次，用PBS重悬细胞使用流式细胞仪进行检测。
结果如图10A所示，当100 nM A8-3m18抗体结合细胞表面的 CD79后，再加入3 nMbiotin-polatuzumab则不能结合到细胞上，而只加3 nM biotin-polatuzumab的对照组则能结合到细胞上。
如图10B所示，当polatuzumab先结合到细胞表面的CD79后，再加入3 nM biotin-A8-3m18时也不能结合到细胞表面的CD79b。
图10A和10B的实验结果共同说明，A8-3m18和对照抗体polatuzumab竞争结合细胞表面的CD79b的同一表位。
实施例18、抗体与毒素(MMAE)的偶联药物的制备及其杀伤效果测试
进一步检测抗体A8-3m18、A8-3m26和polatuzumab偶联药物对表达人CD79b的Daudi和Ramos肿瘤细胞的杀伤效果。抗体和小分子药物MMAE偶联的方法参考实施例5。
通过疏水相互作用色谱分析，图11A中的A8-3m18-MMAE、mC3-MMAE、polatuzumab-MMAE和阴性对照IgG-MMAE四个抗体偶联药物，抗体和小分子MMAE的比例分别为1:4.5、1:3.6、1:4.3和1:3.5。图11B图中的A8-3m26-MMAE、polatuzumab-MMAE和阴性对照IgG-MMAE三个抗体偶联药物，抗体和小分子MMAE的比例分别为1:4.1、1:4.7和1:3.9。
检测这些抗体偶联药物对表达人CD79b的Ramos细胞的杀伤效果，结果如图11A和11B所示，mC3、A8-3m18-MMAE、A8-3m26-MMAE和polatuzumab-MMAE均有显著的杀伤效果，而且杀伤效果接近。
在表达人CD79b相对较低的Daudi细胞的杀伤效果如图11C和图11D所示，mC3-MMAE，A8-3m18-MMAE和A8-3m26-MMAE均比polatuzumab-MMAE对Daudi细胞的杀伤好。
从EC50来看，mC3和A8-3m18-MMAE比polatuzumab-MMAE对Daudi细胞的杀伤高5倍；A8-3m26-MMAE比polatuzumab-MMAE对Daudi细胞的杀伤高1倍。
实施例19、抗体与毒素的偶联药物在动物体内的抗肿瘤作用
1、A8-3m26-MMAE在Ramos荷瘤小鼠体内的抗肿瘤药效。
选用SCID雌性小鼠，通过腋部皮下接种Ramos细胞，13天后随机分为4组，每组5只小鼠，平均分组体积为198 mm3。其中两组作为空白对照，一组注射生理盐水(PBS)，另一组注射6 mg/kg IgG-MMAE，两组实验组分别注射6 mg/kg A8-3m26-MMAE和6 mg/kgpolatuzumab-MMAE，总共给药一次，测量各组小鼠体重和肿瘤体积。抗体偶联药物IgG-MMAE、A8-3m26-MMAE和polatuzumab-MMAE的抗体和小分子比例分别为1:3.9、1:4.1和1:4.3。
图12A的结果说明，相比PBS和IgG-MMAE，A8-3m26-MMAE对Ramos的肿瘤生长均具有显著的抑制效果；且在约17天时肿瘤全部消退，说明A8-3m26-MMAE肿瘤生长抑制效果非常显著。
2、A8-3m18-MMAE在Ramos荷瘤小鼠体内的抗肿瘤药效
选用SCID雌性小鼠，通过腋部皮下接种Ramos细胞，12天后随机分为7组，每组5只小鼠，平均分组体积为211 mm3。其中三组作为空白对照，一组注射生理盐水(PBS)，另两组注射1 mg/kg IgG-MMAE和3 mg/kg IgG-MMAE，四组实验组分别注射低剂量的1 mg/kg A8-3m18-MMAE和1 mg/kg polatuzumab-MMAE，高剂量组的3 mg/kg A8-3m18-MMAE和3 mg/kgpolatuzumab-MMAE，总共给药一次，测量各组小鼠体重和肿瘤体积。偶联药物A8-3m18-MMAE、polatuzumab-MMAE和IgG-MMAE的抗体和小分子MMAE的比例分别为1:4.1、1:3.9和1:3.9。
图12B的结果说明，相比PBS和IgG-MMAE对照组，A8-3m18-MMAE对Ramos的肿瘤生长均具有显著的抑制效果；无论是给药剂量为1 mg/kg还是3 mg/kg，A8-3m18-MMAE的抑制效果均很优异；且3 mg/kg A8-3m18-MMAE中有2只老鼠肿瘤完全消除，说明A8-3m18-MMAE对Ramos的肿瘤生长抑制效果相当显著。
实施例20、抗体与小分子药物DXd的偶联药物的制备及其杀伤效果测试
将A8-3m26与小分子药物DXd偶联得到抗体偶联药物，具体操作步骤为先将A8-3m26与TCEP(sigma)孵育，打开链间的二硫键，然后加入maleimide-GGFG-DXd(MedChemExpress)进行偶联，最后用脱盐柱进行纯化，去除多余的小分子药物，将得到的抗体偶联药物分别命名为A8-3m26-DXd，阴性对照是IgG-DXd。通过疏水相互作用色谱分析，偶联药物IgG-DXd和A8-3m26-DXd的抗体和小分子比例均为1:8。
发明人探究了A8-3m26-DXd在Ramos荷瘤小鼠体内的抗肿瘤药效。选用SCID雌性小鼠，通过腋部皮下接种Ramos细胞，13天后随机分为4组，每组5只小鼠，平均分组体积为198mm3。其中三组作为阴性对照，一组注射生理盐水(PBS)，另两组注射分别0.3 mg/kg IgG-DXd和1.0 mg/kg IgG-DXd，两组实验组分别注射0.3 mg/kg A8-3m26-DXd和1.0 mg/kg A8-3m26-DXd，总共给药一次，测量各组小鼠体重和肿瘤体积。
图13的结果说明，相比PBS和IgG-DXd，给药1 mg/kg A8-3m26-DXd对Ramos的肿瘤生长具有明显的肿瘤抑制效果，说明A8-3m26偶联小分子DXd对肿瘤的生长起到显著抑制作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (33)
1.抗CD79b抗体，所述抗CD79b抗体具有轻链可变区和重链可变区，其中，
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、“LV”、SEQID NO:5所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、“LV”、SEQID NO:20所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:15所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、“LV”、SEQID NO:14所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQID NO:18所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:22所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23、“LV”、SEQID NO:24所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQID NO:6所示；
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9所示；轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、“LV”、SEQ IDNO:6所示。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、scFv；或
所述抗体包括：人源化抗体、嵌合抗体或鼠源抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体，包括重链FR区和轻链FR区；
所述重链FR区包括重链FR1、FR2、FR3、FR4，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:13中第1-25位所示的FR1，如SEQ ID NO:13中第34-50位所示的FR2，如SEQ ID NO:13中第59-96位所示的FR3，如SEQ ID NO:13中第103-113位所示的FR4；
所述轻链FR区包括轻链FR1、FR2、FR3、FR4，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:12中第1-26位所示的FR1，如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:25中第38-54位所示的FR2，如SEQ ID NO:12中第57-93位所示的FR3，如SEQ ID NO:12中第103-113位所示的FR4。
4.一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码权利要求1～3任一所述的抗CD79b抗体。
5.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有权利要求4中所述的构建体或基因组中整合有外源的权利要求4中所述的多核苷酸。
6.一种制备权利要求1～3任一所述的抗体的方法，包括：在适合表达所述抗体或其抗原结合部分的条件下，利用权利要求5所述的表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体。
7.权利要求1～3任一所述的抗体的用途，用于：制备特异性靶向和抑制表达CD79b的肿瘤细胞的抗肿瘤药物；所述肿瘤包括：淋巴瘤，B淋巴细胞白血病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括：
免疫缀合物；
双功能或多功能抗体；
嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
9.融合蛋白或免疫缀合物，其包括权利要求1～3任一所述的抗体，以及与之操作性连接的功能性分子。
10.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为抑制肿瘤的分子。
11.如权利要求10所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤毒素或抗肿瘤细胞因子。
12.如权利要求11所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述抗肿瘤毒素包括：美登素，奥利司他汀，单甲基澳瑞他汀，多拉司他汀，卡奇霉素，氨甲蝶呤，长春地辛，紫杉烷，单端孢霉毒素，CC1065，DXd，Duocarmycin，Pyrrolobenzodiazepines或SN-38。
13.如权利要求12所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所示紫杉烷选自：多烯紫杉醇、拉洛紫杉醇、特西紫杉醇或欧塔紫杉醇。
14.如权利要求12所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所示紫杉烷为紫杉醇。
15.如权利要求11所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述的抗肿瘤细胞因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta或TNF-alpha。
16.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为靶向肿瘤表面标志物的分子。
17.如权利要求16所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。
18. 如权利要求17所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述结合肿瘤表面标志物的抗体是识别免疫调节分子B7-H3以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括：EGFR，mesothelin，HER2，EphA2，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，CD47，ASGPR1或CDH16。
19.如权利要求18所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述EGFR为EGFRvIII。
20.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。
21.如权利要求20所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体。
22. 如权利要求21所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述结合免疫细胞表面标志物的抗体结合的抗原包括：CD3、CD20、FcRH5、HER2、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、 LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79b、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1或TenB2。
23.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为细胞毒素。
24.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为放射性同位素。
25.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为融合伴侣。
26.如权利要求25所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述的融合伴侣包括：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域。
27.如权利要求26所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括：免疫球蛋白Fc区、血清白蛋白。
28.如权利要求27所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区为人免疫球蛋白Fc区。
29.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为嵌合抗原受体的胞外铰链区。
30.如权利要求9所述的融合蛋白或免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子为跨膜区及胞内信号区。
31.一种药物组合物，包括权利要求1～3任一所述的抗体、权利要求9～30任一所述的融合蛋白或免疫缀合物。
32.权利要求1～3任一所述的抗体、权利要求9～30任一所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物在制备特异性靶向和抑制表达CD79b的肿瘤细胞的抗肿瘤药物的制剂、试剂盒或药盒中的用途；所述肿瘤包括：淋巴瘤，B淋巴细胞白血病。
33.一种试剂盒或药盒，包括：
容器或包装；以及，
置于所述容器或包装中的：权利要求1～3任一所述的抗体、权利要求9～30任一所述的融合蛋白或免疫缀合物、或含有它们的药物组合物。
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