CN117343187A - 对muc18特异性的抗体 - Google Patents

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张少飞
王娜
刘淑惠
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Abstract

本发明涉及对MUC18特异性的抗体。对MUC18(又称为MCAM或CD146)特异性的抗体和包含其的抗体药物缀合物(ADC)。本文还提供了抗MUC18抗体或ADC用于治疗和诊断目的的用途。

Description

对MUC18特异性的抗体
本申请是基于申请日为2019年12月19日，优先权日为2018年12月21日，申请号为201980092138.X，发明名称为“对MUC18特异性的抗体”的专利申请的分案申请。
背景技术
MUC18，也称为CD146或黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)，是一种跨膜糖蛋白，主要在细胞粘附中起作用。它在血管组织(包括血管平滑肌)内的内皮细胞中以可检测的水平表达。值得注意的是，MUC18在人类恶性黑色素瘤中过度表达，特别是在转移性病变和晚期原发性肿瘤中。因此，开发用于癌症治疗和诊断两者中的有效的MUC18拮抗剂，如抗MUC18抗体具有重要意义。
发明内容
本公开至少部分基于对MUC18特异性的多种抗体的开发。此类抗体显示出对靶MUC18抗原的高结合亲和力和/或对MUC18+细胞的高抑制活性。
因此，本公开的一个方面的特征在于与MUC18结合的分离的抗体(抗MUC18抗体)，其中该抗体与参考抗体结合相同的人MUC18的表位，所述参考抗体为CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370或J253，本文提供了其中每一个的结构特征。
在一些实施方案中，抗MUC18抗体可以包含重链可变区(VH)，其中重链互补决定区1(HC CDR 1)、重链互补决定区2(HC CDR 2)和重链互补决定区3(HC CDR 3)共同地与参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或更多)相同。在一些例子中，该抗体可以包含VH，其包括与上述参考抗体之一相同的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。在其他实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体可以包含VH，其包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，相对于参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，它们共同地含有多达5、4、3、2或1个突变。
替代地或另外，本文描述的MUC18抗体可以包含轻链可变区(VL)，其中轻链互补决定区1(LC CDR 1)、轻链互补决定区2(LC CDR 2)和轻链互补决定区3(LC CDR 3)共同地与参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3至少85％(例如，至少90％、至少95％、至少98％或更多)相同。在一些例子中，该抗体可以包含与上述参考抗体之一相同的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在其他实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体可以包含LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，相对于参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，它们共同地含有多达5、4、3、2或1个突变。
在一些实例中，本文描述的抗MUC18抗体包含与上述参考抗体之一相同的重链和/或轻链CDR。在一些例子中，此类抗MUC18抗体可以包含与参考抗体相同的VH和/或VL。
本文所述的任何抗MUC18抗体均可以与人MUC18特异性结合。在一些例子中，抗MUC18抗体可以与人MUC18和非人MUC18，例如灵长类MUC18交叉反应。抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一些实例中，它可以是嵌合抗体。
在一些实施方案中，抗MUC18抗体可以是全长抗体(例如，IgG分子)或其抗原结合片段。替代地，其可以是单链抗体。
在另一方面，本公开的特征在于核酸或核酸组(例如，两种核酸)和载体或载体组(例如，两种载体)，该核酸或核酸组共同地编码本文描述的任何抗MUC18抗体，并且该载体或载体组包含编码抗MUC18抗体的核酸。在一些例子中，该载体或载体组可以是表达载体。本文还提供了包含该核酸或载体的宿主细胞。进一步地，本公开提供了用于制备本文描述的抗MUC18抗体的方法，该方法包含：培养包含载体或载体组的宿主细胞，该载体或载体组包含该抗体的编码序列，其中该编码序列可操作地连接至合适的启动子；以及收获因此产生的抗体，例如从该宿主细胞或培养基。
此外，本公开提供了抗体药物缀合物(ADC)，其包含：本文描述的任何抗MUC18抗体；以及至少一种治疗剂，其共价缀合至该抗体。在一些实例中，该治疗剂可以是细胞毒性剂，例如，一甲基瑞奥西汀E(monomethyl auristatin E)。
在一些实施方案中，该抗体和该治疗剂可以通过接头缀合。在一些实例中，该接头可以是可切割的接头，例如，蛋白酶敏感性接头、pH敏感性接头或谷胱甘肽敏感性接头。在一些例子中，该接头可以是蛋白酶敏感性接头，其可以包含具有2-5个氨基酸的肽。该肽可以包含天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基或其组合。在一个实例中，该肽可以包含缬氨酸-瓜氨酸。在其它实例中，该接头可以是不可切割的接头。此种不可切割的接头可以包含任选取代的烷烃或硫醚。
在一些实施方案中，该接头可以包含功能基团，其形成该抗体与该接头之间的共价键。示例性功能基团包括但不限于马来酰亚胺基团、碘乙酰胺基团、乙烯基砜基团、丙烯酸酯基团、丙烯酰胺基团、丙烯腈基团和甲基丙烯酸酯基团。在一个实例中，该接头可以进一步是式I的分子间隔物：
其中
R1为任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C2-6亚炔基或任选取代的三唑；并且X是O、S或N。
在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(i)本文描述的抗MUC18抗体、编码该抗体的核酸或核酸组、或如本文所述的抗体药物缀合物中的一种或多种；以及(ii)药学上可接受的载体。
此外，本公开的特征在于一种减少MUC18+细胞数量的方法，该方法包含将有效量的本文描述的药物组合物中的任何一种施用到需要其的受试者。在一些实施方案中，该受试者可以是患有或被怀疑患有癌症，例如上皮癌的人患者。同样在本公开的范围内的是如本文描述的药物组合物，其用于治疗本文也描述的靶标疾病(例如，癌症，如上皮癌)中的任何一种，或用于制造用于治疗该靶标疾病的药物。
另外，本公开的特征在于一种检测MUC18+细胞的存在的方法，该方法包括：(i)使怀疑具有MUC18+细胞的样品与本文描述的任何抗MUC18抗体接触，该抗体与标记剂缀合；以及(ii)基于抗体与样品中细胞的结合来检测样品中MUC18+细胞的存在。在一些例子中，样品衍生自有风险患有或怀疑患有癌症(如上皮癌)的人类患者。
下文的描述阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据以下附图以及若干实施方案的详细描述，并且根据所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将是明显的。
本发明进一步涉及以下实施方案：
1.与人MUC18结合的分离的抗体，其中所述抗体与参考抗体结合相同的人MUC18的表位，所述表位选自下组：CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370和J253。
2.实施方案1或实施方案2的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，以及
(b)轻链可变区(VL)，其包含轻链CDR1(LC CDR1)、轻链CDR2(LC CDR2)和轻链CDR3(LC CDR3)，
其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3共同地与所述参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3至少85％相同；和/或其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3共同地与所述参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3至少85％相同。
3.实施方案2的分离的抗体，其中所述VH包含与所述参考抗体相同的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3；和/或其中所述VL包含与所述参考抗体相同的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
4.实施方案2的分离的抗体，其中所述VH包含所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其相对于所述参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，共同地含有多达5个氨基酸残基变化；和/或其中所述VL包含所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其相对于所述参考抗体的LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，共同地含有多达5个氨基酸残基变化。
5.实施方案1-4中任一项的分离的抗体，其中所述VH与所述参考抗体的VH至少85％相同；和/或其中所述VL与所述参考抗体的VL至少85％相同。
6.实施方案5的分离的抗体，其中所述分离的抗体包含与所述参考抗体相同的VH和/或与所述参考抗体相同的VL。
7.实施方案1-6中任一项的抗体，其中所述抗体与人MUC18特异性结合。
8.实施方案1-6中任一项的抗体，其中所述抗体与人MUC18和非人MUC18交叉反应。
9.实施方案8的抗体，其中所述非人MUC18是灵长类MUC18。
10.实施方案1-9中任一项的抗体，其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
11.实施方案10任一项的抗体，其中所述抗体是IgG分子。
12.实施方案1-11中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
13.实施方案12的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:1-3所示的VH和/或如SEQID NO:4-6所示的VL。
14.实施方案1-9或12-13中任一项的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
15.核酸或核酸组，其共同地编码实施方案1-14中任一项的抗MUC18抗体。
16.载体或载体组，其包含实施方案15的核酸。
17.实施方案16的载体或载体组，其中所述载体是表达载体。
18.宿主细胞，其包含实施方案16或17的载体或载体组。
19.抗体药物缀合物(ADC)，其包含：
i.实施方案1-14中任一项的抗体；以及
ii.至少一种治疗剂；
其中所述抗体共价缀合至所述至少一种治疗剂。
20.实施方案19的抗体药物缀合物，其中所述抗体和所述治疗剂通过接头缀合。
21.实施方案19的抗体药物缀合物，其中所述接头是可切割或不可切割的接头。
22.实施方案21的抗体药物缀合物，其中所述接头是不可切割的接头，其包含蛋白酶敏感性接头、pH敏感性接头或谷胱甘肽敏感性接头。
23.实施方案22的抗体药物缀合物，其中所述可切割的接头是蛋白酶敏感性接头，其包含2-5个氨基酸的肽序列。
24.实施方案23的抗体药物缀合物，其中所述2-5个氨基酸包含天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基或其组合。
25.实施方案23的抗体药物缀合物，其中所述肽序列包含缬氨酸-瓜氨酸。
26.实施方案21的抗体药物缀合物，其中所述接头是不可切割的接头，其包含任选取代的烷烃或硫醚。
27.实施方案21-26中任一项的抗体药物缀合物，其中所述接头包含功能基团，其与所述抗体和所述接头形成共价键。
28.实施方案27的抗体药物缀合物，其中所述功能基团包含马来酰亚胺基团、碘乙酰胺基团、乙烯基砜基团、丙烯酸酯基团、丙烯酰胺基团、丙烯腈基团或甲基丙烯酸酯基团。
29.实施方案22-28中任一项的抗体药物缀合物，其中所述接头进一步包含式I的分子间隔物：
其中
R1为任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C2-6亚炔基或任选取代的三唑；并且
X是O、S或N。
30.实施方案19-29中任一项的抗体药物缀合物，其中所述至少一种治疗剂是细胞毒性剂。
31.实施方案30的抗体药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是一甲基瑞奥西汀E。
32.药物组合物，其包含(i)实施方案1-14中任一项的抗体、实施方案15-17或39-40中任一项的核酸或核酸组，或实施方案19-31中任一项的抗体药物缀合物。
33.减少MUC18+细胞数量的方法，所述方法包括将有效量的实施方案32的药物组合物施用于有此需要的受试者。
34.实施方案33的方法，其中所述受试者患有或怀疑患有癌症。
35.检测MUC18+细胞的存在的方法，所述方法包括：
i.使怀疑具有MUC18+细胞的样品与实施方案1-14中任一项的抗体接触，其中所述抗体与标记剂缀合；以及
ii.基于所述抗体与所述样品中细胞的结合来检测所述样品中MUC18+细胞的存在。
附图说明
图1是显示在流式细胞术实验中A375中MUC18的siRNA敲低导致抗MUC18抗体与A375细胞结合降低的图。与用不靶向MUC18的对照siRNA(对照)处理的细胞相比，抗MUC18抗体(J253)与用靶向MUC18的siRNA(MUC18.si)处理的细胞结合的水平更低。
图2是显示抗MUC18抗体(J253)能够结合灵长类MUC18和人类MUC18的图。
图3A-3E包括显示抗MUC18抗体药物缀合物(使用Val-Cit接头缀合至MMAE的J253(J253-vc-MMAE))能够靶向MUC18+黑色素瘤细胞系的图。图3A：显示J253-vc-MMAE内化到A375细胞中的图(T1/2为2.5小时)。图3B-3D：显示J253-vc-MMAE分别对MUC18+细胞系HMV-II、SK-MEL-2和GAK细胞的抑制作用的图。图3E：显示缺乏J253-vc-MMAE对MUC18-细胞系(NCI-N87)的抑制作用的图。
图4是显示J253-vc-MMAE在A375异种移植小鼠模型中有效减少肿瘤体积的图。
图5包括显示抗MUC18 CAR慢病毒进入CD3+T细胞的转导效率的图。
图6A-6E包括显示抗MUC18 CAR+T细胞在诱导针对各种MUC18+细胞系的抗原依赖性细胞毒性中的作用的图。图6A-6D：显示抗MUC18 CAR+T细胞分别有效诱导针对MUC18+细胞系A375、SK-MEL-2、GAK和HMV-II细胞的抗原依赖性细胞毒性的图。图6E：显示抗MUC18 CAR+T细胞在MUC18-细胞(SKOV-3)中不诱导抗原依赖性细胞毒性的图。
图7A-7E包括显示当与各种MUC18+细胞系共培养时MUC18CAR+T细胞在诱导IFNγ分泌中的作用的图。图7A-7D：显示抗MUC18 CAR+T细胞分别与MUC18+细胞系A375、SK-MEL-2、GAK和HMV-II细胞共培养时有效诱导IFNγ分泌的图。图7E：显示当与MUC18-细胞(SKOV-3)共培养时抗MUC18 CAR+T细胞不诱导IFNγ分泌的图。
具体实施方式
本文公开了多种抗MUC18抗体，其表现出优异的特性，包括对靶MUC18抗原的高结合亲和力和/或对MUC18+细胞的高抑制活性。
因此，本文提供了能够与MUC18结合的抗体、编码该抗体的核酸、包含抗MUC18抗体的抗体-药物缀合物(ADC)和嵌合抗原受体(CAR)及其用于治疗和诊断目的二者的用途。本文还提供了用于该抗体和/或包含该抗体的ADC和CAR的治疗和/或诊断用途的试剂盒、以及用于产生抗MUC18抗体的方法。
与MUC18结合的抗体
本公开提供结合MUC18的抗体，MUC18也称为CD146或黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)。在人类中，MUC18由MCAM基因(NCBI Gene ID:4162)编码。MUC18在人类恶性黑色素瘤中过度表达，特别是在转移性病变和晚期原发性肿瘤中。由于其细胞粘附功能，MUC18可以作用为黑色素瘤细胞和血管系统细胞成分之间的接触点。这种接触可以允许黑色素瘤病变和肿瘤渗透到脉管系统，并在炎症期间用于白细胞的迁移(transmigration)。另外，MUC18认为会触发FYN和PTK2/FAK1的酪氨酸磷酸化。此外，黑色素瘤患者中升高的MUC18表达水平也已被证明是不良预后和生存的标志物。因此，该受体可以作为治疗和诊断靶癌症的靶标和/或生物标志物。
因此，本文公开的抗MUC18抗体可以用于通过其自身、或通过缀合至其他部分(例如，缀合至治疗剂)以形成抗体-药物缀合物、或通过作为嵌合抗原受体中的细胞外抗原结合域来治疗和/或诊断如本文所描述的靶标癌症。靶向MUC18+细胞的细胞疗法也在本公开内，以用于消除表达细胞表面MUC18的疾病细胞(例如，MUC18+癌细胞)。
抗体(可互换地以复数形式使用)是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整(即，全长)多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、纳米抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构造，其包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体、以及经共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其子类别)，并且该抗体不必是任何特定类别。取决于其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以划分为不同的类别。免疫球蛋白有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干可以进一步分为子类别(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区，其也被称为“互补决定区”(“CDR”)，其间散布有更为保守的被称为“构架区”(“FR”)的区域。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，它们按以下顺序从氨基末端至羧基末端布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以使用本领域已知的方法来精确地鉴定框架区和CDR的程度，例如，通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义(contact definition)，所有这些都是本领域众所周知的。参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242,Chothia等人，(1989)Nature 342:877；Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。
在一些实施方案中，如本文所描述的抗MUC18抗体可以结合并抑制MUC18的活性至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高)。表观抑制常数(Kiapp或Ki,app)提供了抑制剂效力的测量，与降低酶活性所需的抑制剂的浓度有关，并且不依赖于酶浓度。可以通过本领域已知的常规方法来确定本文描述的抗MUC18抗体的抑制活性。
抗体的Ki,app值可以通过测量不同浓度的抗体对反应程度(例如，酶活性)的抑制效果来确定；将伪一级速率常数(v)的变化作为抑制剂浓度的函数拟合至经修改的Morrison方程(方程1)，得到表观Ki值的估计值。对于竞争性抑制剂，Kiapp可以从y截距获得，该截距是从Ki app对底物浓度的曲线的线性回归分析中提取的。
其中，A相当于vo/E，即，在不存在抑制剂(I)的情况下，酶促反应的初始速度(vo)除以总酶浓度(E)。
在一些实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体对于MUC18抗原或其抗原表位的Kiapp值可以为1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5pM或更小。在一些实施方案中，相对于第二靶标，抗MUC18抗体对于第一靶标的Kiapp可能更低。Kiapp的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105倍。
本文描述的抗体可以是小鼠、大鼠、人或任何其他来源的抗体(包括嵌合或人源化抗体)。此类抗体是非天然存在的，即，在没有人行为(例如，用期望抗原或其片段来免疫动物)的情况下，将不会在此类动物体内产生。
本文描述的任何抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同质性抗体群，并且“多克隆抗体”是指异质性抗体群。这两个术语并不限制抗体的来源或制备方式。
在一个实例中，本文描述的方法中所使用的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如，鼠)抗体的形式，其为含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基由来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种如小鼠、大鼠或兔的CDR(供者抗体)的残基替代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含残基，该残基既不存在于受者抗体中也不存在于所导入的CDR或框架序列中，但被包括以进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且通常是两个基本上整个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域)的至少一部分。抗体可以具有如在WO 99/58572中所描述的经修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个和/或六个)，其相对于原始抗体发生改变，也被称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体还可能涉及亲和力成熟。
在另一实例中，本文描述的抗体可以是嵌合抗体，其可以包括来自人抗体的重链恒定区和轻链恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分以及来自第二物种的恒定区的抗体。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链二者的可变区模拟衍生自哺乳动物的一个物种(例如，非人哺乳动物，如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一哺乳动物(如人)的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体特异性结合至相应的靶抗原或其表位。“特异性结合”至抗原或表位的抗体是本领域众所周知的术语。如果分子与特定的靶抗原的反应比其与替代靶标的反应更频繁、更快速、具有更长的持续时间和/或具有更大的亲和力，则该分子被认为是表现出“特异性结合”。如果抗体以比其结合至其他物质的更大的亲和力、亲合性、更容易地和/或以更长的持续时间结合，则该抗体“特异性结合”至靶抗原或表位。例如，特异性(或优先地)结合至MUC18抗原或其中的抗原表位的抗体是以比其结合至其他抗原或相同抗原中的其他表位的更大的亲和力、亲合性、更容易地和/或以更长的持续时间结合该靶抗原的抗体。通过该定义还应当理解的是，例如，特异性结合至第一靶抗原的抗体可以或者可以不特异性或优先地结合至第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”并不一定要求(尽管其可以包括)排他性结合。在一些实例中，“特异性结合”至靶抗原或其表位的抗体可以不结合至其他抗原或相同抗原中的其他表位。在一些实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体特异性结合人MUC18。在一些实例中，其与非人MUC18抗原的结合活性在常规测定中检测不到或非常低，使得如本领域技术人员所知的，其将不具有显著的生物学意义。在其他实例中，本文描述的抗MUC18抗体可以与来自不同物种的MUC18交叉反应，例如，在人MUC18与非人MUC18(例如，来自实验动物如非人灵长类动物、小鼠或大鼠的MUC18)之间。
如本文所用，术语“MUC18”、“MCAM”、“CD146”或“黑色素瘤细胞粘附分子”是指任何合适的物种，例如，人、非人哺乳动物如非人灵长类动物或啮齿动物(例如，小鼠或大鼠))的MUC18。MUC18是跨膜糖蛋白，其主要在细胞粘附中发挥作用。下文提供了示例性人MUC18的氨基酸序列(另参见NCBI登录号NP_006491)：
来自其他物种的MUC18分子是本领域众所周知的，并且其氨基酸序列可以从公开可用的数据库(例如，GenBank或NCBI)中检索。
在一些实施方案中，如本文所描述的抗MUC18抗体对靶抗原(例如，人MUC18)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文描述的抗MUC188抗体对靶抗原或抗原表位的结合亲和力(KD)可以为至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低。结合亲和力增加对应于KD降低。相对于第二抗原，抗体对第一抗原的亲和力结合更高，这可以由相比于用于结合第二抗原的KA(或数值KD)的更高的用于结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来指示。在此类情况下，相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同第一蛋白质；或者第二蛋白质)，抗体对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。在一些实施方案中，与对不同物种的MUC18的结合亲和力相比，本文描述的抗MUC18抗体对人MUC18具有更高的结合亲和力(更高KA或更小KD)。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105倍。在一些实施方案中，任何抗MUC18抗体可以进一步亲和力成熟，以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法来确定，这些方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或分光术(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于以靶蛋白浓度的函数测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白([结合的])的浓度通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离])的浓度相关：
[结合的]＝[游离的]/(Kd+[游离的])
然而，并不总是需要精确地测定KA，因为有时获得亲和力的定量测量(例如，使用如ELISA或FACS分析等方法来确定)就足够了，该定量测量与KA成比例，并且因此可以用于比较，如确定较高的亲和力是否是例如高出2倍，以获得亲和力的定性测量，或以推断亲和力，例如通过功能性测定(例如，体外或体内测定)中的活性。
在一些实施方案中，本文描述的抗MUC18抗体与本文所提供的参考抗体中的一种结合至MUC18抗原(例如，人MUC18)中的相同表位，或与参考抗体竞争而结合至MUC18抗原。本文提供的参考抗体包括CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370或J253，其每个结构特征提供在本文中。与本文描述的参考抗体结合相同的表位的抗体可以与参考抗体结合至完全相同的表位或基本重叠的表位(例如，含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基、或仅1个非重叠氨基酸残基)。可以通过本领域众所周知的竞争测定来确定两个抗体是否彼此竞争与关联抗原的结合。可以如本领域技术人员已知的那样鉴定此类抗体，例如，具有基本相似的结构特征(例如，互补决定区)的那些和/或通过本领域已知的测定所鉴定的那些。例如，可以使用参考抗体中的一种来进行竞争测定，以确定候选抗体是否与该参考抗体结合至相同的表位，或与该参考抗体竞争与MUC18抗原的结合。
本文描述的抗MUC18抗体可以包含重链可变区(VH)，其可以包含(a)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的重链互补决定区1(HC CDR 1)；(b)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的重链互补决定区2(HC CDR2)；(c)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的重链互补决定区3(HC CDR3)；或(d)(a)-(c)中的任一项所述的组合。在一些例子中，抗体可以包含(a)的HC CDR1、(b)的HC CDR2和(c)的HCCDR3。
表1提供了示例性抗MUC18抗体的重链CDR(通过IMGT定义)的氨基酸序列。与那些示例性抗MUC18抗体具有相同的重链CDR1、CDR2和CDR3区的抗体在本公开的范围内。
表1：参考抗MUC18抗体的重链CDR序列
替代地或另外，本文描述的抗MUC18抗体可以包含轻链可变区(VL)，其可以包含(a)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的轻链互补决定区1(LC CDR 1)；(b)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的轻链互补决定区2(LC CDR2)；(c)如CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370、J253中的轻链互补决定区3(LC CDR3)；或(d)(a)-(c)中的任一项所述的组合。
表2提供了示例性抗MUC18抗体的轻链CDR的氨基酸序列。与那些示例性抗MUC18抗体具有相同的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的抗体在本公开的范围内。
表2：参考抗MUC18抗体的轻链CDR序列
基于本领域众所周知的IMGT方案来确定本文提供的参考抗体的重链和轻链CDR。在一些例子中，本文公开的抗MUC18抗体可以包含本文公开的任何参考抗体的相同的重链和/或轻链CDR。具有相同VH和/或VL CDR的两个抗体意味着，当通过相同方案(例如，本文描述的和/或本领域已知的那些)确定时，它们的CDR是相同的。
在一些实例中，本文公开的抗MUC18抗体可以与参考抗体之一包含相同的VH和/或VL序列，这些序列提供在下文中(CDR以粗体字表示)：
如本文所公开的任何参考抗MUC18抗体的功能变体(例如，上述表1和表2中列出的那些)也在本文公开的范围内。功能变体可以在参考抗体的一个或多个重链和轻链CDR区中包含多达5(例如，4、3、2或1)个氨基酸残基变化，并且以基本相似的亲和力(例如，具有相同等级的KD值)结合MUC18抗原的相同表位。在一些例子中，相对于参考抗体中的对应物CDR，功能变体中的每个重链和/或轻链CDR含有不超过2个氨基酸残基变化。在一些实例中，相对于参考抗体中的对应物CDR，功能变体中的每个重链和/或轻链CDR含有不超过1个氨基酸残基变化。
在一个实例中，氨基酸残基变化是保守性氨基酸残基替换。如本文所用，“保守性氨基酸替换”是指不改变在其中进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸替换。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，这些方法如可以在汇编此类方法的例如以下参考文献中找到：Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook等人编,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989；或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,等人编,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守性替换包括在以下组内的氨基酸之间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
在一些实施方案中，抗MUC18抗体包含重链CDR和/或轻链CDR，该重链CDR共同地与参考抗体的重链CDR至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同，并且该轻链CDR共同地与参考抗体的轻链CDR至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同。在一些实施方案中，抗MUC18抗体包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，该重链可变区与任何参考抗体的重链可变区至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同，并且该轻链可变区与参考抗体的轻链可变区至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)相同。
使用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990的算法来确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”,该算法如在Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993中进行了修改。此类算法并入至Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分数＝50，字长＝3)来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与感兴趣的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以如在Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所描述的那样采用Gapped BLAST。当采用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本公开还提供了本文公开的任何参考抗MUC18抗体种系变体。种系变体相对于其朝向相应种系序列的亲本抗体，在框架区中含有一个或多个突变。为了产生种系变体，可以将亲本抗体或其一部分的重链或轻链可变区序列(例如，框架序列)用作针对抗体种系序列数据库的查询(例如，bioinfo.org.uk/abs/,vbase2.org或imgt.org)，以鉴定亲本抗体所使用的相应种系序列以及种系序列与亲本抗体之间的一个或多个框架区中的氨基酸残基变化。然后，可以基于种系序列来将一个或多个氨基酸替换引入至亲本抗体中，以产生种系变体。
在一些例子中，本文公开的参考抗体的功能变体是参考抗体的人源化抗体。实例包括：
人源化CL070324
人源化hJ253-03-1
人源化hJ253-03-7
在一些实施方案中，如本文所描述的任何抗MUC18抗体的重链可以进一步包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可以属于任何合适的来源，例如，人、小鼠、大鼠或兔。在一个特定实例中，重链恒定区来自人IgG(γ重链)。当需要时，如本文所描述的抗MUC18抗体可以包含经修饰的恒定区。例如，其可以包含经修饰的恒定区，该经修饰的恒定区是免疫学上惰性的，例如，不触发补体介导的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。可以使用美国专利号5,500,362中所公开的方法来评估ADCC活性。在其他实施方案中，如在Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请号9809951.8中所描述的，对恒定区进行修饰。
本文描述的任何抗MUC18抗体可以进一步包含轻链，其包括轻链可变区和任选的轻链恒定区，该轻链可以为本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在其他实例中，CL是λ轻链。抗体重链和轻链恒定区是本领域众所周知的，例如，IMGT数据库(imgt.org)中或vbase2.org/vbstat.php.处所提供的那些，这二者都通过引用并入本文。
抗MUC18抗体的制备
可以通过本领域已知的任何方法来制备如本文所描述的能够结合MUC18的抗体。参见例如，Harlow和Lane，(1998)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。
在一些实施方案中，可以通过常规杂交瘤技术来制备对靶MUC18抗原(例如，人MUC18)具有特异性的抗体。可以使用任选地偶联至载体蛋白(如KLH)的全长靶抗原或其片段来免疫宿主动物，以生成结合至该抗原的抗体。宿主动物的免疫路线和时间表通常与已建立且常规的抗体刺激和产生技术一致，如本文进一步所描述的。用于产生小鼠抗体、人源化抗体和人抗体的一般技术是本领域已知的，并且在本文中进行了描述。可预期的是，可以操纵包括人的任何哺乳动物受试者或其产抗体细胞，以充当哺乳动物(包括人杂交瘤细胞系)生产的基础。通常，用一定量的免疫原(包括如本文所描述的)对宿主动物进行腹腔内、肌内、口服、皮下、足底内和/或皮内接种。
可以使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的通用体细胞杂交技术或者如通过Buck,D.W.等人，In Vitro,18:377-381(1982)所改进，从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系可以用于杂交，包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的骨髓瘤系。通常，该技术涉及使用融合原(如聚乙二醇)或通过本领域技术人员众所周知的电手段来融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞从融合培养基中分离出来，并且使其在选择性生长培养基(如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中生长，以消除未杂交的亲本细胞。补充有血清或不含血清的本文描述的任何培养基可以用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一替代方案，EBV永生化B细胞可以用于产生本文描述的抗MUC18单克隆抗体。如果需要，扩展并亚克隆杂交瘤，并且通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)来测定上清液的抗免疫原活性。
可以用作抗体来源的杂交瘤涵盖所有衍生物，即，产生能够干扰MUC18活性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的后代细胞。可以使用已知的程序来使产生此类抗体的杂交瘤体外或体内生长。如果需要，可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤)从培养基或体液中分离出单克隆抗体。如果存在不希望有的活性，可以例如通过以下方式将其去除：在由附接至固相的免疫原制成的吸附剂上运行制备物，并且从免疫原中将期望的抗体洗脱或释放出来。用靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物，可以产生抗体群(例如，单克隆抗体)，该靶抗原或片段缀合至要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质，例如，匙孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，所述缀合使用双功能试剂或衍生化试剂例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。
如果需要，可以对感兴趣的抗体(单克隆或多克隆的)(例如，由杂交瘤产生的)进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆至用于表达或繁殖的载体中。可以将编码感兴趣的抗体的序列保持在宿主细胞中的载体内，并且然后可以扩展宿主细胞并将其冷冻以供将来使用。在替代方案中，多核苷酸序列可以用于遗传操纵，以“人源化”抗体或者改进抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特征。例如，如果抗体用于对人进行临床试验和治疗，则恒定区可以工程化改造成更类似于人的恒定区以避免免疫反应。可能期望遗传地操纵抗体序列，以获得对靶抗原的更大亲和力以及在抑制MUC18活性方面的更大功效。对本领域技术人员将显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个多核苷酸改变，并且仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
在其他实施方案中，可以通过使用已被工程化改造成表达特定的人免疫球蛋白的市售小鼠来获得全人抗体。被设计成产生更理想(例如，全人抗体)或更强健的免疫反应的转基因动物也可以用于生成人源化抗体或人抗体。此类技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM以及来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM和TC MouseTM。在另一替代方案中，可以通过噬菌体展示或酵母技术来重组地制备抗体。参见，例如，美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；以及Winter等人，(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。替代地，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-553)来在体外从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全集中产生人抗体和抗体片段。
在一些实施方案中，可以从抗体文库(例如，噬菌体展示抗体文库或酵母展示抗体文库)中分离出能够结合至MUC18抗原的抗体。在一个实例中，可以例如按照US2015/0153356(其相关公开内容通过引用并入本文，以用于本文引用的目的或主题)中所公开的方法来从单克隆抗体文库中分离出本文描述的抗MUC18抗体。
可以通过常规方法来制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生F(ab')2片段，并且可以通过还原F(ab')2片段的二硫键来生成Fab片段。
可以通过例如常规重组技术来产生经遗传工程化改造的抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体。在一个实例中，可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来容易地分离编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA并对其进行测序。杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA放置在一个或多个表达载体中，然后将该一个或多个表达载体转染至宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不以其他方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见，例如，PCT公布号WO 87/04462。然后，可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源的小鼠序列(Morrison等人，(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851)，或者通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列，对DNA进行修饰。以该方式，可以制备具有对靶抗原具有结合特异性的经遗传工程化改造的抗体，如“嵌合”或“杂交”抗体。
为产生“嵌合抗体”而开发的技术是本领域众所周知的。参见，例如，Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6851；Neuberger等人，(1984)Nature 312,604；以及Takeda等人，(1984)Nature 314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域众所周知的。参见，例如，Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法，亲本非人抗体的VH和VL的可变区经受三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定预测对正确的CDR结构的形成重要的框架氨基酸残基。同时，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询，从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL受体基因。
所选人受体基因内的CDR区可以由来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代。必要时，可以使用预测在与CDR区相互作用中重要的亲本链的框架区内的残基(参见上文描述)来替换人受体基因中的相应残基。
可以通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列与编码轻链可变区的核苷酸序列来制备单链抗体。优选地，将柔性接头并入在两个可变区之间。替代地，描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)可以适应于产生对MUC18具有特异性的噬菌体或酵母scFv文库和scFv克隆，可以按照常规程序从该文库中鉴定出来。阳性克隆可以经受进一步的筛选，以确定那些抑制MUC18活性的克隆。
可以使用本领域众所周知的方法来表征按照本领域已知的方法获得的并在本文中进行了描述的抗体。例如，一种方法是鉴定抗原所结合的表位，或“表位定位”。本领域中有许多已知的方法用于定位和表征蛋白质上表位的位置，包括求解抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定以及基于合成肽的测定，如例如在Chapter 11ofHarlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999中所描述的。在额外的实例中，表位定位可以用于确定抗体所结合的序列。表位可以是线性表位，即，含在单段氨基酸中，或者是通过氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，其不一定含在单段(一级结构线性序列)中。可以分离或合成(例如，重组地)不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽，并且其可以用于与抗体的结合测定。在另一实例中，可以通过使用衍生自靶抗原序列的重叠肽并确定抗体的结合，在系统筛选中确定抗体所结合的表位。根据基因片段表达测定，将编码靶抗原的开放阅读框随机地或通过特定的遗传构建体进行片段化，并且确定表达的抗原片段与要测试的抗体的反应性。例如，可以通过PCR来产生基因片段，然后在放射性氨基酸的存在下在体外将其转录并翻译成蛋白质。然后，通过免疫沉淀和凝胶电泳来确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可以通过使用展示在噬菌体颗粒表面上的大量随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定某些表位。替代地，可以在简单的结合测定中测试重叠肽片段的定义文库与测试抗体的结合。在额外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变，以鉴定表位结合所需的、足够的和/或必要的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体来进行结构域交换实验，其中MUC18多肽的各个片段已由来自密切相关但抗原性不同的蛋白质的序列替代(交换)。通过评估抗体与突变体MUC18的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者，可以使用已知结合至相同抗原的其他抗体来进行竞争测定，以确定抗体是否结合至与其他抗体相同的表位。竞争测定是本领域普通技术人员众所周知的。
在一些实例中，通过如下文所例示的重组技术来制备抗MUC18抗体。
可以将编码如本文所描述的抗MUC18抗体的重链和轻链的核酸克隆至一个表达载体中，每个核苷酸序列可操作地连接至合适的启动子。在一个实例中，编码重链和轻链的每个核苷酸序列可操作地连接至不同的启动子。替代地，编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链二者均由相同的启动子表达。必要时，可以在重链与轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将编码抗体的两条链的核苷酸序列克隆至两个载体中，该两个载体可以被引入至相同或不同的细胞中。当该两条链在不同的细胞中表达时，它们中的每一条都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并且可以将分离出来的重链和轻链在合适的条件下进行混合和温育，从而允许形成抗体。
通常，可以使用本领域已知的方法，将编码抗体的一条或所有链的核酸序列克隆至与合适启动子可操作地连接的合适表达载体中。例如，可以在合适的条件下，使核苷酸序列和载体与限制性内切酶接触，以在每个分子上产生互补末端，这些互补末端可以彼此配对并通过连接酶接合在一起。替代地，可以将合成的核酸接头连接至基因的末端。这些合成的接头含有对应于载体中特定限制位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
多种启动子可以用于表达本文描述的抗体，包括但不限于巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)中间体早期启动子、病毒性LTR(如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。
还可以使用可调控的启动子。此类可调控的启动子包括使用来自大肠杆菌的阻遏物作为转录调节剂以调控从携带lac操作子的哺乳动物细胞启动子的转录的启动子[Brown等人，Cell,49:603-612(1987)]、使用四环素(tetracycline)阻遏物(tetR)的启动子[Gossen,M.和Bujard,H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551(1992)；Yao,F.等人，Human Gene Therapy,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)]。其他系统包括FK506二聚体、使用雌二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、双酚、或雷帕霉素(rapamycin)。可诱导的系统可从Invitrogen、Clontech和Ariad获得。
可以使用包括具有操纵子的阻遏物的可调控启动子。在一个实施方案中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以充当转录调节剂，以调控从携带lac操作子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等人，Cell,49:603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)]，这通过以下方式实现：将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合，以产生tetR哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR VP16)；利用衍生自人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hCMV)主要立即早期启动子的携带tetO的最小启动子来建立tetR-tet操作子系统，以控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施方案中，使用四环素可诱导的开关。当四环素操作子适合地定位在CMVIE启动子的TATA元件下游时，四环素阻遏物(tetR)单独地而不是tetR哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以充当强有力的反式调节剂，以调控哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人，HumanGene Therapy)。该四环素可诱导的开关的一个特别优点是，其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调控的效果，在一些例子中，该融合蛋白可能对细胞具有毒性(Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995))。
另外，载体可以含有例如以下的一些或全部：选择性标记基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素(neomycin)基因；用于高水平转录的来自人CMV立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA处理信号；用于适合的游离型复制的SV40多瘤复制来源和ColE1；内核糖体结合位点(IRESes)、多样化多克隆位点；以及用于体外转录正义和反义RNA的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适载体和方法是本领域众所周知的并且是可得到的。
可用于实践本文描述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于人胶原蛋白I聚腺苷酸化信号、人胶原蛋白II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。
可以将包含编码任何抗体的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入至合适的宿主细胞中，以用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞，以表达抗体或其任何多肽链。可以通过传统方法(例如，亲和纯化)回收由培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)产生的此类抗体或多肽链。如有必要，可以将抗体的多肽链在合适的条件下进行温育达合适的时间段，从而允许产生抗体。
在一些实施方案中，用于制备本文描述的抗体的方法涉及编码抗MUC18抗体的重链和轻链二者的重组表达载体，也如本文所描述的。可以通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)将重组表达载体引入至合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可以在合适的条件下选择并培养阳性转化宿主细胞，从而允许形成抗体的两条多肽链的表达，该两条多肽链可以从细胞或培养基中回收。必要时，可以将从宿主细胞中回收的两条链在适当的条件下进行温育，从而允许形成抗体。
在一个实例中，提供了两个重组表达载体，一个编码抗MUC18抗体的重链，并且另一个编码抗MUC18抗体的轻链。可以通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)将该两个重组表达载体二者均引入至合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。替代地，可以将每个表达载体引入至合适的宿主细胞中。可以在合适的条件下选择并培养阳性转化子，从而允许抗体的多肽链的表达。当将两个表达载体引入至相同的宿主细胞中时，其中产生的抗体可以从宿主细胞或培养基中回收。必要时，可以从宿主细胞或培养基中回收多肽链，然后将其在合适的条件下进行温育，从而允许形成抗体。当将两个表达载体引入至不同的宿主细胞中时，该两个表达载体中的每一个可以从相应的宿主细胞或相应的培养基中回收。然后，可以将该两条多肽链在合适的条件下进行温育，以形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞、以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白质A或蛋白质G偶联基质，通过亲和层析来分离一些抗体。
编码如本文所描述的抗MUC18抗体的重链、轻链或二者的任何核酸，含有该核酸的载体(例如，表达载体)；以及包含该载体的宿主细胞都在本发明的范围内。
抗体-药物缀合物
本公开还提供了抗体-药物缀合物，其包含本文描述的任何抗MUC18抗体，该抗体共价连接至治疗剂。本文使用的术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指其中的本文描述的抗MUC18抗体与治疗剂共价连接的缀合物。通常，该抗体-药物缀合物可以包括抗MUC18抗体、治疗剂、以及任选地介于该抗体与该治疗剂之间的接头。ADC可以通过将治疗剂递送至抗体所靶向的MUC18+细胞、尤其是MUC18+癌细胞来提供治疗效果。可以通过本领域已知的制备抗体-药物缀合物的各种方法来制备抗体-药物缀合物。
本文描述的ADC中的治疗剂可以是毒素、化疗剂、抗生素、ADP核糖基转移酶、放射性同位素或溶核酶。在一些例子中，治疗剂是细胞毒性剂。实例包括但不限于蒽环类、瑞奥西汀(auristatin)(例如，瑞奥西汀E或一甲基瑞奥西汀E(MMAE))、喜树碱(camptothecin)、康普瑞汀(combretastain)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔、格尔德霉素(geldanamycin)、吲哚-苯并二杂氮卓二聚体、美登素(maytansine)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯苯并二杂氮卓二聚体、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、微管溶素、半星霉素(hemiasterlin)、剪接抑素(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)和加利车霉素(calicheamicin)。
在一些实施方案中，抗MUC18抗体和治疗剂通过接头连接。此类接头可以是可切割的接头，例如，可在某种pH条件下切割的(pH敏感性接头)、可被蛋白酶切割的(蛋白酶敏感性接头)、或可在谷胱甘肽存在的情况下切割的(谷胱甘肽敏感性接头)。在一些实例中，接头包含蛋白酶切割位点，其可以含有可被合适蛋白酶识别和/或切割的2-5个氨基酸残基。此类肽可以包含天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基或其组合。在一个实例中，肽接头可以是二肽接头。实例包括缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头、或马来酰亚胺基己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(vc)接头。替代地，接头可以是不可切割的接头，例如，包含任选取代的烷烃或硫醚的接头。
在一些实例中，接头可以包含功能基团，其可以与抗体形成共价键。示例性功能基团包括但不限于马来酰亚胺基团、碘乙酰胺基团、乙烯基砜基团、丙烯酸酯基团、丙烯酰胺基团、丙烯腈基团或甲基丙烯酸酯基团。在一些例子中，接头可以含有一种或多种活性胺，其包括但不限于乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(AcLys-VC-PABC)或氨基PEG6-丙酰基。参见，例如，WO2012/059882。其他示例性接头包括磺基琥珀酰亚胺基-4-[N马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸盐(smcc)。磺基-smcc缀合通过马来酰亚胺基团来进行，该基团与巯基(硫醇，--SH)反应，而其磺基-NHS酯则对伯胺具有反应性(如在赖氨酸和蛋白质或肽N末端中所发现的)。
在一些实例中，接头可以包含分子间隔物，例如，具有式I的部分:其中R1可以为任选取代的C1-6烷基(例如，C1-3烷基)、任选取代的苯基、任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基、任选取代的C2-6亚炔基、或任选取代的三唑；和/或X可以是O、S或N。
用于将细胞毒性剂或其他治疗剂缀合至抗体的方法是本领域已知的，并且已在各种出版物中进行了描述。例如，可以通过赖氨酸侧链胺或通过激活的半胱氨酸巯基基团来对抗体进行化学修饰，以发生缀合反应，该激活通过还原链间二硫键来实现。参见，例如，Tanaka等人，FEBS Letters 579:2092-2096,(2005)；以及Gentle等人，Bioconjug.Chem.15:658-663,(2004)。还描述了在抗体的特定位点处被工程化改造的反应性半胱氨酸残基，其用于以定义的化学计量进行特异性药物缀合。参见，例如，Junutula等人，Nature Biotechnology,26:925-932,(2008)。WO2012/059882，Strop等人，Chem.Biol.20(2):161-167(2013)；以及Farias等人，Bioconjug.Chem.25(2):245-250(2014)中还描述了使用含有酰基供者谷氨酰胺的标签和/或内源性谷氨酰胺进行的缀合，其是在转谷氨酰胺酶和胺(例如，用活性胺修饰的细胞毒性剂)存在的情况下，通过多肽工程化而进行的反应性缀合。此类出版物的相关公开内容通过引用并入本文，以用于本文引用的目的和主题。
嵌合抗原受体(CAR)和表达该受体的免疫细胞
本公开的特征还在于靶向MUC18的嵌合抗原受体和表达该受体的免疫细胞。如本文所公开的嵌合抗原受体(CAR)是人工细胞表面受体，其将表达该受体的免疫细胞(例如，T细胞)的结合特异性重定向至MUC18+细胞，如上皮源性癌细胞，从而通过例如免疫细胞的效应子活性来消除靶标疾病细胞。CAR构建体通常包含至少融合至细胞内信号传导结构域的细胞外抗原结合结构域。Cartellieri等人，J Biomed Biotechnol 2010:956304,2010。细胞外抗原结合结构域可以是单链抗体片段(scFv)，对MUC18抗原具有特异性，并且细胞内信号传导结构域可以介导导致免疫细胞活化的细胞信号传导。因此，表达对MUC18具有特异性的CAR构建体的免疫细胞可以结合至表达MUC18的患病细胞(例如，肿瘤细胞)，从而导致免疫细胞的活化以及患病细胞的消除。
本文描述的任何抗MUC18抗体可以用于产生本文还描述的CAR构建体。例如，可以使用常规重组技术，将抗MUC18抗体的VH和VL结构域融合至细胞内信号传导结构域，以产生CAR构建体。在一些实例中，抗MUC18的VH和VL结构域通过肽接头连接，以形成scFv片段。
本文公开的CAR构建体可以包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实例中，CAR包含细胞内信号传导结构域，其包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。此类细胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ。另外，CAR构建可以进一步包含一个或多个共刺激信号传导结构域，其可以来自共刺激受体，例如来自4-1BB(CD137)、CD7、CD27、CD28、CD40、OX40、ICOS、GITR、HVEM、TIM1或LFA-1。
本文公开的CAR构建体可以进一步包含跨膜铰链结构域，其可以从合适的细胞表面受体(例如，CD28或CD8)获得。
还提供了编码如本文所公开的任何抗MUC18 CAR的分离的核酸分子和载体、以及包含该核酸分子或载体的宿主细胞，如宿主免疫细胞(例如，T细胞和天然杀伤细胞)。表达包含MUC18特异性抗体结合片段的抗MUC18CAR的免疫细胞可以用于治疗表达MUC18的癌症。因此，本文还提供了通过选择患有表达MUC18的癌症的受试者并将治疗有效量的表达靶向MUC18的CAR的免疫细胞施用于该受试者来治疗患有MUC18+癌症的受试者的方法。
药物组合物
可以将如本文所描述的抗MUC18抗体、编码核酸或核酸组、包含该核酸的载体或包含该载体的宿主细胞以及包含抗MUC18抗体的ADC和/或表达靶向MUC18的CAR的免疫细胞与药学上可接受的载体(赋形剂)进行混合，以形成药物组合物，以用于治疗靶标疾病。“可接受的”意味着，载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)，并且对要治疗的对象无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包括本领域众所周知的缓冲液。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
用于本方法的药物组合物可以包含呈冻干配制剂或水性溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下是对受者无毒性的，并且可以包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，其包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，其包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等；形成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文描述的药物组合物包含含有抗体(或编码核酸、或ADC))的脂质体，该抗体可以通过本领域已知的方法来制备，如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所描述的。美国专利号5,013,556公开了具有增强的循环时间的脂质体。可以用脂质组合物，通过逆相蒸发方法来生成特别有用的脂质体，该脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇、以及PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。将脂质体通过具有定义孔径的过滤器挤出，以得到具有期望直径的脂质体。
也可以将抗体、编码核酸或ADC包埋在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包埋在粗乳剂中。此类技术是本领域已知的，参见，例如，Remington,The Science andPractice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在其他实例中，本文描述的药物组合物可以以缓释形式配制。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈成形制品(例如，膜或微胶囊)的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与7-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))、蔗糖醋酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如使用无菌过滤膜的过滤来实现。通常将治疗性抗体组合物放置在具有无菌进入孔的容器(例如，具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉输液袋或小瓶)中。
本文描述的药物组合物可以是单位剂型(如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或悬浮液剂、或栓剂)，以用于口服、胃肠外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
为了制备诸如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体(例如，常规的压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其他药物稀释剂(例如，水)进行混合，以形成含有本发明化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均质时，意味着活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得该组合物可以容易地被细分为同等有效的单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预配制组合物细分为上述类型的单位剂型，其含有0.1mg至约500mg的本发明活性成分。该新组合物的片剂或丸剂可以被包覆或以其他方式复合，以提供具有长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量组分和外部剂量组分，后者呈封套的形式覆盖前者。两种组分可以通过肠溶层来分离，该肠溶层用于在胃中抵抗崩解，并且允许内部组分完整地进入至十二指肠中或延缓释放。多种材料可以用于此类肠溶层或涂层，此类材料包括大量聚合酸以及聚合酸与紫胶、十六醇和醋酸纤维素等材料的混合物。
合适的表面活性剂尤其包括非离子型试剂，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如，SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05％至5％的表面活性剂，并且可以在0.1％至2.5％之间。将理解，如有必要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
可以使用市售的脂肪乳剂(例如IntralipidTM、LiposynTM,InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM)来制备合适的乳剂。可以将活性成分溶解在预混合的乳剂组合物中，或者替代地可以将活性成分溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中、以及溶解在与磷脂(例如，蛋黄卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳剂中。将理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂将通常含有高达20％的油，例如，在5％至20％之间。
乳剂组合物可以通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、蛋黄卵磷脂、丙三醇和水)进行混合来制备。
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂中的溶液和悬浮液或其混合物、以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，通过口服或途径呼吸途径来施用组合物，以产生局部或全身效应。
可以通过使用气体来对优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物进行雾化。可以直接从雾化装置吸入雾化的溶液，或可以将雾化装置附接至面罩、帐篷或间歇式正压呼吸机。可以从以适当方式递送配制剂的装置施用溶液、悬浮液或粉末组合物，优选口服地或经鼻腔施用。
治疗和诊断方法
如本文所描述的抗MUC18抗体、编码核酸或核酸组、包含该核酸的载体、包含抗MUC18抗体的ADC、以及表达靶向MUC18的CAR的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的任何一种可以用于抑制和/或消除MUC18+疾病细胞(如MUC18+癌细胞)，从而有益于治疗与MUC18+疾病细胞相关联的疾病或病症。
为了实践本文公开的方法，可以通过以下合适的途径将有效量的本文描述的药物组合物施用于需要治疗的受试者(例如，人)：如静脉内施用，例如，作为推注或通过一段时间的连续输注，通过肌内、腹膜内，脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体配制剂的市售雾化器，包括喷射式雾化器和超声雾化器，可用于施用。液体配制剂可以直接雾化，并且冻干粉可以在复溶后雾化。替代地，如本文所描述的抗体可以使用氟碳化合物配制剂和定量雾化吸入器来雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
通过本文描述的方法治疗的对象可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是患有、有风险患有或被怀疑患有与MUC18+疾病细胞相关联的靶标疾病/病症的人类受试者。在一些实施方案中，MUC18+疾病细胞是癌细胞，例如，上皮癌细胞(即衍生自上皮细胞)。实例包括但不限于卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞和脑癌细胞。可以通过常规医学检查(例如，实验室测试、器官功能检查、CT扫描或超声)来鉴定患有靶标疾病或病症的受试者。被怀疑患有任何此类靶标疾病/病症的受试者可能会示出该疾病/病症的一个或多个症状。有风险患有该疾病/病症风险的受试者可以是具有该疾病/病症的一个或多个风险因素的受试者。
如本文所用，“有效量”是指单独地或与一种或多种其他活性剂组合地对受试者赋予治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方案中，治疗效果是降低MUC18活性或降低MUC18+细胞的活性。对本领域技术人员来说，确定抗体或包含该抗体的其他治疗剂(例如，ADC或CAR-T细胞)的量是否实现治疗效果将是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的特定病况、病况的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、同时疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径、以及卫生执业医师的知识和专长内的类似因素而变化。这些因素对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以仅通过常规实验来解释。通常优选的是，使用单个组分或其组合的最大用量，即，根据合理医学判断的最高安全用量。
经验方面的考虑(如半衰期)通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体(如人源化抗体或全人抗体)可以用于延长抗体的半衰期并防止抗体受到宿主免疫系统的攻击。可以在治疗过程中确定和调整施用频率，并且该施用频率通常但不一定基于靶标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓。替代地，抗体的持续连续释放配制剂可能是适当的。用于实现缓释的各种配制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中，可以在已给予一次或多次抗体施用的个体中根据经验来确定如本文所描述的抗体的剂量。给予个体递增剂量的拮抗剂。为了评估拮抗剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
通常，对于施用如本文所描述的任何抗MUC18抗体或包含该抗体的ADC，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，取决于上文提及的因素，典型的日剂量可以在从约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或更大的任何范围内。对于若干天或更长时间内的重复施用，取决于病况，维持治疗直至出现期望的症状抑制，或者直至实现足够的治疗水平以减轻靶标疾病或病症或其症状。示例性的给药方案包含施用约2mg/kg的初始用量，随后每周维持用量为约1mg/kg的抗体，或随后每隔一周施用约1mg/kg的维持用量。然而，其他给药方案可能是有用的，这取决于执业医师希望实现的药物代谢动力学衰减的模式。例如，预期一周给药一至四次。在一些实施方案中，给药范围可以为约3μg/mg至约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施方案中，给药频率为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或者每月、每2个月或每3个月或更长时间一次。通过常规的技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的抗体)可以随时间而变化。
出于本公开的目的，如本文所描述的抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、是否出于预防或治疗目的而施用抗体、先前的疗法、患者的临床病史和对拮抗剂的反应、以及主治医生的判定。通常，临床医生将施用抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施方案中，期望的结果是减少血栓形成。对于本领域技术人员来说，确定剂量是否产生期望结果的方法将是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及熟练执业医师已知的其他因素。抗体的施用可以在预选的时间段内基本上连续地进行，或者可以以一系列间隔用量进行，例如，在靶标疾病或病症发展之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”是指将包括一种或多种活性剂的组合物应用于或施用于受试者，其目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救，改善、改进或影响病症、疾病的症状或患上疾病或病症的倾向，该受试者患有靶标疾病或病症、该疾病/病症的症状，或者具有患上该疾病/病症的倾向。
减轻靶标疾病/病症包括延缓疾病的发展或进展，或者降低疾病的严重程度。减轻疾病不一定要求有疗效的结果。如本文所用，“延缓”靶标疾病或病症的发展意指延迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或展缓疾病的进展。该延缓的时间长度可能不同，这取决于疾病史和/或接受治疗的个体。“延缓”或减轻疾病发展或者延缓疾病发作的方法是一种降低在给定时间范围内发展一种或多种疾病症状的可能性和/或在给定时间范围内降低症状程度的方法，其与不使用该方法的情况进行比较。此类比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著性结果的大量受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后进展。可以使用本领域众所周知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。然而，发展也是指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，靶标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
在一些实施方案中，以足以在体内将一个或两个靶抗原的活性抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量，将本文描述的抗体施用于需要治疗的受试者。在其他实施方案中，以有效地将靶抗原的活性水平降低至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用抗体。
根据要治疗疾病的类型或疾病的部位，可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法来将药物组合物施用于受试者。该组合物还可以通过其他常规途径施用，例如，口服地、胃肠外地、通过吸入气雾剂、局部地、经直肠、经鼻腔、经口腔、经阴道施用，或通过植入的贮器施用。如本文所用，术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径(如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法)将该组合物施用于受试者。在一些实例中，药物组合物经眼内或玻璃体内施用。
可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乳酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉注射，可以通过滴注法施用水溶性抗体，由此注入含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物配制剂。生理上可接受的赋形剂可以包括例如5％右旋糖、0.9％生理盐水、Ringer氏溶液或其他合适的赋形剂。可以将肌内制剂(例如，抗体的合适可溶性盐形式的无菌配制剂)溶解于并施用于药物赋形剂(如注射用水、0.9％生理盐水或5％葡萄糖溶液)中。
在一个实施方案中，通过位点特异性或靶向性局部递送技术施用抗体。位点特异性或靶向性局部递送技术的实例包括抗体的各种可植入贮库源或局部递送导管(如输注导管、留置导管或针导管)、合成移植物、外膜包裹物、分流器、支架或其他可植入装置、部位特异性载体、直接注射或直接应用。参见，例如，PCT公布号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
还可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或子基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术描述在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11:202；Chiou等人，Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu等人.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266:338中。
在基因疗法方案中，含有多核苷酸(例如，编码本文描述的抗体的那些)的治疗组合物在约100ng至约200mg的DNA的范围内施用，以进行局部施用。在一些实施方案中，也可以在基因疗法方案期间使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg、以及约20μg至约100μg的DNA或更多的浓度范围。
可以使用基因递送载体来递送本文描述的治疗性多核苷酸和多肽。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源(通常参见，Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5:845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185；以及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。可以使用内源性哺乳动物或异源性启动子和/或增强子来诱导此类编码序列的表达。可以构成或调控编码序列的表达。
用于递送期望的多核苷酸以及在期望的细胞中表达的基于病毒的载体本领域众所周知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公布号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；英国专利号2,200,651；以及欧洲专利号0345 242)、基于甲病毒的载体(例如，辛德比斯(Sindbis)病毒载体、塞姆利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis)病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))/以及腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公布号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以采用连接至如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中所描述的灭活腺病毒的DNA的施用。
也可以采用非病毒递送载体和方法，包括但不限于单独地连接至灭活腺病毒或未与其连接的聚阳离子缩合DNA(参见,例如，Curiel,Hum.Gene Ther.Gene Ther.(1992)3:147)；配体连接的DNA(参见,例如,Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞递送载体细胞(参见,例如，美国专利号5,814,482；PCT公布号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO 97/42338)；以及核电荷中或与细胞膜融合。也可以采用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法描述在PCT公布号WO 90/11092和美国专利号5,580,859中。可以充当基因递送载体的脂质体描述在美国专利号5,422,120；PCT公布号WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445；以及欧洲专利号0524968。额外的方案描述在Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411中,并且描述在Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581中。
本文描述的方法中所使用的特定给药方案(即，用量、定时和重复)将取决于特定的受试者和该受试者的病史。
当表达靶向MUC18的CAR的免疫细胞用于疾病治疗时，可以通过输注治疗有效用量的此类免疫细胞(如T淋巴细胞或NK细胞)来治疗患者，其用量范围为每千克体重(细胞/Kg)约105至1010个或更多个细胞。只要患者能够耐受，输注可以重复多次，直至实现期望的反应。适当的输注用量和时间表因患者而异，但可以由治疗医师针对特定患者来确定。通常，输注的初始用量将为大约106个细胞/Kg，逐渐增加至108个或更多个细胞/Kg。可以共同施用IL-2以扩展输注的细胞。IL-2的量可以为约每平方米体表1-5x106国际单位。
在一些实施方案中，可以将一种以上抗体或者抗体与另一合适治疗剂的组合施用于需要治疗的受试者。抗体、ADC和/或包含该抗体的CAR-T细胞也可以与用于增强和/或补充试剂效力的其他试剂结合使用。
可以通过本领域众所周知的方法来评估靶标疾病/病症的治疗效果。
本文描述的任何抗MUC18抗体还可以用于检测样品中MUC18+细胞的存在或水平。此类诊断测定可以在体外或体内进行。
对于诊断用途，可以将如本文所描述的抗MUC18抗体与用于体内或体外诊断目的可检测标记(例如，显像剂，如造影剂)缀合。如本文所用，“缀合”或“附接”意指两个实体优选地以足够的亲和力相关联，使得实现该两个实体之间的关联的治疗/诊断益处。两个实体之间的关联可以是直接的关联或者是通过接头(如聚合物接头)的关联。缀合或附接可以包括共价或非共价键合以及其他形式的关联，如包埋，例如，一个实体在另一实体之上或之内、或者一个或两个实体在第三实体之上或之内的包埋，如微胶粒。
在一个实例中，可以将如本文所描述的抗MUC18抗体附接至可检测标记，使得可以在体外或体内检测、测量和/或定性适体，该可检测标签是一种能够直接地或间接地释放可检测信号的化合物。此类“可检测标记”的实例旨在包括但不限于荧光标记、化学发光标记、比色标记、酶标志、放射性同位素和亲和标签(如生物素)。可以通过常规方法将此类标记直接地或间接地缀合至适体。
在一些实施方案中，可检测标记是适合于体内成像MUC18+细胞的试剂，其可以是放射性分子、放射性药物或氧化铁颗粒。适合于体内成像的放射性分子包括但不限于122I、123I、124I、125I、131I、18F、75Br、76Br、76Br、77Br、211At、225Ac、177Lu、153Sm、186Re、188Re、67Cu、213Bi、212Bi、212Pb和67Ga。适合于体内成像的示例性放射性药物包括111I羟基喹啉、131I碘化钠、99mTc甲溴菲宁(Mebrofenin)和99mTc红细胞、123I碘化钠、99mTc依沙美肟(Exametazime)、99mTc巨聚白蛋白(Macroaggregate Albumin)、99mTc亚甲基二膦酸盐(Medronate)、99mTc巯替肽(Mertiatide)、99mTc奥昔膦酸盐(Oxidronate)、99mTc喷替酸盐盐(Pentetate)、99mTc高锝酸盐(Pertechnetate)、99mTc司他比锝(Sestamibi)、99mTc硫溶胶、99mTc替曲膦(Tetrofosmin)、铊-201和氙-133。报告试剂也可以是染料，例如，荧光团，其可用于检测组织样品中由MUC18+细胞介导的疾病。
为了进行体外诊断测定，可以将抗MUC18抗体与被怀疑含有MUC18+细胞的样品进行接触。可以将抗体和样品在合适的条件下进行温育达合适的时间段，以允许抗体结合至MUC18抗原。然后，可以通过常规方法(例如，ELISA或FACS)来检测此类相互作用。为了进行体内诊断测定，可以将合适量的与标记缀合的抗MUC18抗体施用于需要检查的受试者。可以通过常规方法，基于从标记释放的信号来检测标记抗体的存在。
用于治疗和诊断的试剂盒
本发明还提供了用于抑制和/或消除MUC18+疾病细胞并因此减轻与此类疾病细胞相关联的疾病/病症的试剂盒。此类试剂盒可以包括：一个或多个包含抗MUC18抗体的容器、包含该抗体的ADC、或表达靶向MUC18的CAR多肽的免疫细胞，例如，本文描述的任何一种。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含根据本文描述的任何方法使用的使用说明。所包括的使用说明可以包含对抗MUC18抗体、ADC或免疫细胞的施用进行的描述，以治疗、延缓发作、或减轻如本文所描述的靶标疾病。试剂盒可以进一步包含对基于鉴定个体是否患有靶标疾病来选择适合于治疗的个体进行的描述。在另外其他实施方案中，使用说明包含对将抗体、ADC或免疫细胞施用于有风险患有靶标疾病的个体进行的描述。
与抗MUC18抗体、包含该抗体的ADC、或表达靶向MUC18的CAR的免疫细胞的使用相关的使用说明通常包括关于预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。容器可以是单位用量、散装包装(例如，多用量包装)或亚基用量。本发明的试剂盒中所提供的使用说明通常是标签和包装插页(例如，试剂盒中所包括的纸张)上的书面使用说明，但机器可读的使用说明(例如，磁盘或光盘上携带的使用说明)也是可接受的。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗、延缓发作和/或减轻与MUC18+细胞相关联的疾病或病症，如上皮癌。可以提供使用说明以用于实践本文描述的任何方法。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、软性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与特定装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器))或输注装置(如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉输液袋或小瓶)。容器可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉输液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗MUC18抗体、包含该抗体的ADC、或表达靶向MUC18的CAR多肽的免疫细胞，如本文所描述的那些。
试剂盒可以任选地提供附加组分，如缓冲液和解释信息。正常地，试剂盒包含容器以及在该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供包含上述试剂盒的内容物的制造物品。
本文还提供了用于检测样品中MUC18+细胞的试剂盒。此类试剂盒可以包含本文描述的任何抗MUC18抗体。在一些例子中，抗MUC18抗体可以与如本文所描述的可检测标记缀合。如本文所用，“缀合”或“附接”意指两个实体优选地以足够的亲和力相关联，使得实现该两个实体之间的关联的治疗/诊断益处。两个实体之间的关联可以是直接的关联或者是通过接头(如聚合物接头)的关联。缀合或附接可以包括共价或非共价键合以及其他形式的关联，如包埋，例如，一个实体在另一实体之上或之内、或者一个或两个实体在第三实体之上或之内的包埋，如微胶粒。
替代地或另外，试剂盒可以包含能够结合至抗MUC18抗体的第二抗体。试剂盒可以进一步包含使用抗MUC18抗体检测MUC18+的使用说明。
一般技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在如以下的文献中进行了详细的解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,1989)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather andP.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell编1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell编):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller andM.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编，1994)；Current Protocolsin Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra编Harwood Academic Publishers,1995)；DNA Cloning:Apractical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover编1985)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985》；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984》；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编(1986》；Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986》；以及B.Perbal,A practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)。
无需进一步详细阐述，据信本领域技术人员能够基于先前的描述来最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案将被解释为在任何情况下仅以任何方式说明而非限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物均通过引用并入，以用于本文引用的目的或主题。
实施例
实施例1：抗MUC18抗体的生成
试剂和一般方法
杂交瘤细胞培养基(PFHM-II无蛋白杂交瘤培养基；#12040077)购自ThermoFisher。
使用标准方案以及来自Thermo Fisher的TRIzol试剂(#15596018)分离RNA。使用来自Takara的cDNA合成试剂盒(PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒；#6210A)生成所得的cDNA分子。使用来自Takara的Premix Taq(#RR901A)进行抗体V区扩增。标准PCR引物组(Ig引物组#TB326)获得自Novagen。使用标准技术，包括使用EcoRI、HindIII、SalI和T4连接酶(均来自NEB)，将基因克隆至pET28a(Novagen；#69864)中。利用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAgen#20021)来纯化一些但不是全部寡核苷酸分子。
A375、SK-Mel-2、GAK、HMVII和SK-OV-3细胞培养物作为独立的单层培养物在37℃和5％ CO2的气氛下体外维持。根据需要，定期传代这些肿瘤细胞。
筛选抗体文库以鉴定抗MUC18抗体
如先前在US2015/0153356中所描述的，使用蛋白质组和肽抗原的混合物生成大的单克隆抗体(总数>100,000)文库。将该文库分割成一系列高密度抗体阵列，然后针对癌症肿瘤样品和FDA Normal Tissue Panel进行筛选。
发现从文库中分离出来的大量抗体(包括J253)区别地靶向A375细胞系(MUC18+黑色素瘤)。通过与抗体免疫沉淀以及随后的质谱分析将MUC18鉴定为靶抗原。随后使用标准siRNA技术敲低MUC18并过表达MUC18，证实了MUC18是抗体结合的靶抗原。
免疫以生成抗MUC18抗体
使用免疫方法生成另外的抗MUC18抗体，包括CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348和CL070370。简而言之，用肌肉内注射重组MUC18蛋白(购自ACRO BioSystems；氨基酸残基24-559)对Balc/c小鼠免疫六次。
抗体克隆的产生
将单独的杂交瘤克隆在T25烧瓶中用10mL杂交瘤细胞培养基(PFHM-II无蛋白杂交瘤培养基)进行培养。使细胞在37℃下生长直至80％融合。然后将培养基去除，并且将细胞用1xPBS洗涤两次。将TRIzol试剂(1mL体积)直接添加至烧瓶中，并且通过移液管混合将细胞裂解。然后从T25烧瓶中回收细胞裂解物，并且使用标准方法分离总RNA。随后用Nanodrop2000(Thermo Fisher)测量RNA浓度。然后，根据Takara PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒方案，从分离的RNA中生成链cDNA。然后按照Novagen用户方案TB326，对所得cDNA的杂交瘤V区进行扩增。将如下文表3中所示的引物对用于扩增：
表3.用于扩增编码抗MUC18抗体的核酸的引物
用1％琼脂糖凝胶检查PCR产物。使用QIAgen凝胶提取试剂盒回收阳性PCR产物，并且随后使用对应于引物序列的限制酶(来自NEB)将该产物克隆至pET28a载体中。将插入有PCR产物的pET28a载体转化到DH5α细菌细胞中，并且将其在氨苄西林(Ampicillin)阳性琼脂平板上进行培养。发送每个细菌克隆，以使用MuIgGVH3'-2、MuIgkVL3'-1或MuIglVL3'-1引物对其进行Sanger测序。将获得的序列进行一致性比较，以分别确认靶标VH和VL序列。然后在IGMT数据库(imgt.org/)上分析VH和VL序列，以提供VH和VL的V区、框架和CDR元件。
实施例2：抗MUC18抗体的体外评估
与MUC18的结合活性
将靶向MUC18的siRNA添加到MUC18+A375细胞的两个样品之一(MUC18.si)。使用胰蛋白酶-EDTA部分消化，随后以1000rpm离心5分钟，来收获两种细胞样品。将细胞重新悬浮在冷PBS中并添加抗MUC18抗体J253。混合细胞溶液，在4℃下在黑暗中温育并用PBS洗涤，然后添加二抗缀合物(用于检测目的)。温育后，用PBS洗涤细胞，用固定剂固定，然后进行流式细胞术(FACS)分析。如图1中所示，抗MUC18抗体(J253)在不存在siRNA的情况下(对照)表现出与MUC18+A375细胞样品的饱和结合。在存在靶向MUC18的siRNA的情况下生长的细胞显示与抗MUC18抗体的结合降低。这些数据表明如本文所述的抗MUC18抗体靶向MUC18，包括细胞表面MUC18。
使用与上述相同的基于FACS的测定，还证明抗MUC18抗体(J253)表现出与表达人MUC18或灵长类MUC18的A375细胞的饱和结合(图2)。
为了进一步证明抗MUC18抗体与MUC18特异性结合，使用ELISA滴定实验在抗原结合测定中测试了抗体。抗体与不同浓度的重组MUC18蛋白(rProtein)一起温育。所有测试的抗体都以0.19-100nM的结合亲和力结合，如下表4中所示。
表4.抗MUC18抗体的结合亲和力
抗体名称 结合亲和力(nM)
CL070336 0.39
CL070335 0.39
CL070333 12.5
CL070319 >1000
CL070321 >1000
CL070320 >1000
CL070324 50
CL070341 50
CL070350 0.19
CL070349 1.56
CL070348 >1000
CL070370 3.12
J253 0.39
实施例3：抗MUC18抗体药物缀合物的制备和体外评估
生成了包含J253抗体和一甲基瑞奥西汀E的抗MUC18抗体-药物缀合物(ADC)(J253-vc-MMAE)。首先，使用酰胺偶联反应将接头分子(马来酰亚胺基己酰基-L-缬氨酸-L-瓜氨酸-对氨基苯甲醇-对硝基苯碳酸酯)偶联至MMAE。在将该第一化合物进行纯化之后，使用基于硫醇的反应将该化合物偶联至J253抗体。
将J253-vc-MMAE添加到A375细胞的样品中以确定抗MUC18ADC内化到MUC18+细胞中的能力。在将ADC添加到A375样品后0、0.5、1、2、3和4小时评估中值荧光强度(MFI)。如图3A中所示，J253-vc-MMAE以2.5小时的半衰期(T1/2)内化到A375细胞中。
在确定J253-vc-MMAE可以由MUC18+细胞内化后，测试了J253-vc-MMAE在MUC18+黑色素瘤细胞系(HMV-II、SK-MEL-2和GAK细胞)中诱导细胞毒性的有效性。利用具有低表达水平的MUC18的NCI-N87细胞作为阴性对照细胞系。每种黑色素瘤细胞系，HMV-II、SK-MEL-2和GAK，均用不同浓度的J253-vc-MMAE或对照ADC(IgG-vc-MMAE)给药。给药后，使用标准方法评估细胞存活力。在所有三种MUC18+细胞系中，J253-vc-MMAE导致细胞存活力下降至约20％的总存活力，IC50值为103.3pM(HMV-II)、115.1pM(SK-MEL-2)和297.3pM(GAK)，如图3B-3D中所示。在对照细胞系(NCI-N87)中，J253-vc-MMAE在高浓度的ADC下引起细胞存活力的最小降低；然而，IC50值>100,000pM。IgG对照抗体未导致细胞存活力的显著损失。
实施例4：抗MUC18抗体药物缀合物的体内评估
对小鼠皮下注射A375黑色素瘤细胞。在注射A375细胞后的第8天(平均肿瘤大小约100mm3)和第22天，向小鼠静脉内注射以下项之一：PBS；IgG-vc-MMAE；J253-vc-MMAE(3mg/kg)；或J253-vc-MMAE(6mg/kg)。从治疗开始之日起每周测量肿瘤体积两次。
值得注意的是，相对于用PBS处理的小鼠，用3mg/kg或6mg/kg的J253-vc-MMAE处理的小鼠的肿瘤生长显著降低(图4)。此外，相对于用PBS处理的小鼠，用IgG-vc-MMAE处理的小鼠的肿瘤减少最小。这些数据表明，J253-vc-MMAE有效减少A375异种移植小鼠模型中的肿瘤体积。
实施例5：抗MUC18 CAR+T细胞的制备和体外评估
将人源化CL070324、人源化J253-03-1和人源化J253-03-7抗MUC18抗体(VH和VL)插入嵌合抗原受体载体中，该载体以符合读框的方式具有CD8铰链区、CD8跨膜区、共刺激物4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。载体进一步包含EF1α启动子。使用慢病毒包装将编码抗MUC18 CAR+的核酸转染到293T细胞中。然后激活人CD3+T细胞并用慢病毒转导以产生抗MUC18 CAR+T细胞。在如上所述产生抗MUC18 CAR+T细胞之后，使用FACS确定每个CAR构建体的转导效率(图5)。用抗MUC18 CAR转导的T细胞群包含>50％ CAR+细胞。
测试了抗MUC18 CAR+T细胞在MUC18+黑色素瘤细胞系(A375、SK-MEL-2、GAK和HMV-II细胞)中诱导抗原依赖性细胞毒性和IFNγ分泌的能力。利用SKOV-3细胞(其具有低表达水平的MUC18)作为阴性对照细胞系。以不同的T细胞(效应细胞)与靶细胞的比率用抗MUC18CAR+T细胞或对照(CD3 T细胞)对每个黑色素瘤细胞系给药。
在将T细胞与靶细胞温育后，使用标准方法评估靶细胞的特异性裂解/细胞毒性(图6A-6E)。在所有MUC18+细胞系中，抗MUC18 CAR+T细胞的添加在1:1T细胞:靶细胞及以上的比率时诱导抗原依赖性细胞毒性。对照实验(在没有CAR的情况下与CD3 T细胞温育)没有导致特异性细胞毒性的显著诱导。
在相同的给药实验期间，使用标准方法评估了抗MUC18 CAR+T细胞诱导靶细胞分泌干扰素gamma(IFNγ)的能力(图7A-7E)。在所有MUC18+细胞系中，抗MUC18 CAR+T细胞的添加在1:1T细胞:靶细胞及以上的比率时诱导高水平的IFNγ。对照实验(在没有CAR的情况下与CD3 T细胞温育)没有导致IFNγ的显著分泌。
其他实施方案
本说明书中所公开的所有特征可以任意组合。本说明书中所公开的每个特征可以由用于相同、等效或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的一般系列的实例。
根据上文描述，本领域技术人员可以容易地查明本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在本权利要求内。
等效方案
虽然本文已经描述和说明了若干发明实施方案，但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为是在本文描述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定应用或使用本发明教导的应用。本领域技术人员将识别或将仅使用常规实验就能够查明本文描述的特定发明实施方案的许多等效物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求书及其等效物的范围内，发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践。本公开的发明实施方案涉及本文描述的每一单个的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本公开的发明范围内。
应当理解相对于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义，以如本文所定义和所使用的所有定义为准。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请就每篇被引用的主题而言通过引用并入本文，在某些情况下所述主题可以涵盖文件的全部。
除非明确地有相反的指示，否则如本文在说明书和权利要求书中所使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为是指“至少一个/种”。
如本文所用，在本说明书和权利要求书中，短语“和/或”应被理解为是指如此结合的元件中的“任一个或两者”，即，在某些情况下这些元件结合存在，并且在其他情况下分开存在的元件。以“和/或”列出的多个元件应以相同的方式来解释，即，如此连接的元件中的“一个或多个”。除了由“和/或”项特别鉴定的元件之外，其他元件可以任选地存在，无论其与那些特别鉴定的元件相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包含”结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A以外的元件)；在又另一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其他元件)；等等。
如本文在本说明书和权利要求书中所用，“或”应被理解为与上文所定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为是包括性的，即，包括元件数目或列表中的至少一个，而且包括超过一个，以及任选地，额外未列出的项目。只有明确相反指示的术语，如“只有一个”或“确切为一个”，或者在权利要求书中使用时，“由......组成”将指包括元件数目或列表中的确切一个元件。一般而言，当前面放有排他性术语(如“任一个”、“之一”、“仅之一”或“确切地之一”)时，如本文所用，术语“或”仅应被解释为表示排他性的替代品(即“一个或另一个，但不是二者”)。当“基本上由.....组成”用于权利要求书时，应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在本说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个元件的列表，短语“至少一个”应被理解为是指从元件列表中的任何一个或多个元件中选择出的至少一个，但不一定包括元件列表内具体列出的每一个元素中的至少一个，并且不排除元件列表中的元件的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的元件列表中特别鉴定的元件之外的元件，无论其与那些特别鉴定的元件相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者，等效地，“A或B中的至少一个”，或者，等价地“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)A，而不存在B(并且任选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，指至少一个(任选地包括超过一个)B，而不存在A(并且任选地包括除A以外的元件)；在又另一个实施方案中，指至少一个(任选地包括超过一个)A和至少一个(任选地包括超过一个)B(并且任选地包括其他元件)；等等。
还应当理解，除非明确有相反的指示，否则在本文要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所列举的该方法步骤或动作的顺序。

Claims (10)

1.与人MUC18结合的分离的抗体，其中所述抗体与参考抗体结合相同的人MUC18的表位，所述表位选自下组：CL070336、CL070335、CL070333、CL070319、CL070321、CL070320、CL070324、CL070341、CL070350、CL070349、CL070348、CL070370和J253。
2.权利要求1或权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，以及
(b)轻链可变区(VL)，其包含轻链CDR1(LC CDR1)、轻链CDR2(LC CDR2)和轻链CDR3(LCCDR3)，
其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3共同地与所述参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3至少85％相同；和/或其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3共同地与所述参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3至少85％相同。
3.权利要求2的分离的抗体，其中所述VH包含与所述参考抗体相同的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或其中所述VL包含与所述参考抗体相同的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
4.权利要求2的分离的抗体，其中所述VH包含所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其相对于所述参考抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，共同地含有多达5个氨基酸残基变化；和/或其中所述VL包含所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其相对于所述参考抗体的LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3，共同地含有多达5个氨基酸残基变化。
5.权利要求1-4中任一项的分离的抗体，其中所述VH与所述参考抗体的VH至少85％相同；和/或其中所述VL与所述参考抗体的VL至少85％相同。
6.权利要求5的分离的抗体，其中所述分离的抗体包含与所述参考抗体相同的VH和/或与所述参考抗体相同的VL。
7.权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述抗体与人MUC18特异性结合。
8.权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述抗体与人MUC18和非人MUC18交叉反应。
9.权利要求8的抗体，其中所述非人MUC18是灵长类MUC18。
10.权利要求1-9中任一项的抗体，其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
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