CN104650231A - 一种具备高效中和活性的人源化抗人cd146单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体包括轻链可变区，包括轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。所述具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。本发明在保持或增强抗体分子与人CD146受体分子结合活性的前提下，制备出人源化程度尽量高的单克隆抗体，以避免该抗体作为治疗性抗体进入人体后导致的人抗鼠免疫反应。

Description

一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体。
背景技术
CD146是一种具有跨膜结构的黏附分子,是由646个氨基酸残基组成的I型膜蛋白，属于免疫球蛋白Ig超家族成员。研究表明CD146是血管内皮细胞生长因子受体VEGFR-2的共受体，能调节VEGF诱导的VEGFR-2的活化及下游信号的传递，进而促进肿瘤血管生成MicroRNA329Suppresses Angiogenesis by Targeting CD146.Molecular and Cellular Biology,2013；33(18):3689-99.。另外，CD146分子是促进炎性肠病转化为结直肠肿瘤的重要因素，促炎性细胞因子TNFα及IL1β能够激活CD146的转录，使其在血管内皮细胞膜上高表达，进而通过促进炎性细胞侵润及血管新生导致慢性炎症的持续进展，演变为结直肠癌。通过一系列溃疡性结肠炎相关的肿瘤模型，研究人员发现特异性敲除血管内皮细胞的CD146，使炎症性肠病小鼠的症状明显的减轻，炎性细胞的侵润和新生血管明显减少；在血管内皮细胞特异性敲除CD146的肿瘤模型中，肿瘤的数量和体积也会明显下降Targeting endothelialCD146attenuates neuroinflammation by limiting lymphocyte extravasation to the CNS.Scientific Reports,2013；3:1687.。CD146分子在上皮性质的乳腺癌细胞中过表达使原本恶性程度较低的肿瘤细胞获得极高的细胞侵袭迁移能力，以及呈现出乳腺癌干细胞的特征。研究表明CD146通过EMT的机制促进乳腺癌进展，因此CD146可能作为治疗乳腺癌的一个新靶标CD146,an epithelial-mesenchyaml transition inducer,is associated withtriple-negative breast cancer.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2012；109(4)1127-32.。
以CD146为靶点的抗体因其结构特征不同，导致其与CD146分子的亲和力而不同。P1H12能够与大多数不同类型的血管内皮组织结合Identification of the S-Endo 1endothelial-associated antigen.Biochem Biophys Res Commun.1996；218(1):210-6.；有些anti-CD146抗体只结合肿瘤组织中处于生长活跃状态的血管，不结合正常组织中的血管。研究表明这些抗体识别不同的抗原表位，P1H12识别一个位于N端结构域的线性表位，而一些anti-CD146抗体识别基于二硫键的空间构象表位，因此造成对不同内皮组织结合活性的差异。此外，上述两种抗体均是鼠源性单克隆抗体，与人补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱；并且鼠源抗体在人血循环中的半衰期短，具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起排斥反应等诸多不足。
目前，缺乏一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体包括
轻链可变区，包括轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
进一步地，所述具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
进一步地，具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋白的疾病的用途。
进一步地，其中所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。
进一步地，其中所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。
更进一步地，其中所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病或溃疡性结肠炎。
进一步地，其中所述新生血管类疾病选自老年黄斑、多发性硬化症、黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。
本发明的一种编码所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体的核酸。
本发明的一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含的抗人CD146抗体和药用载体。
有益效果：本发明的人源化抗人CD146单克隆抗体具备高效中和活性，在保持或增强抗体分子与人CD146受体分子结合活性的前提下，制备出人源化程度尽量高的单克隆抗体，以避免该抗体作为治疗性抗体进入人体后导致的人抗鼠免疫反应。
本发明具有如下优点：
(1)本发明采用实验与计算相结合的办法在单抗体表面进行定点突变。选用人IgG的framework，在不改变原抗体CDR结构基础上，对IgG的framework区进行定点突变。
(2)本发明的特异性结合细胞黏附分子CD146受体的抗原结合蛋白。本发明制备的抗体结构包含人IGHV3-33的重链可变区及轻链可变区的框架FR区，在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，对框架区进行点突变，以提高抗体与人CD146受体的结合活性。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
本发明的一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体包括
轻链可变区，包括轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
所述具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋白的疾病的用途。
其中所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。
其中所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。
其中所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病或溃疡性结肠炎。
其中所述新生血管类疾病选自老年黄斑、多发性硬化症、黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。
本发明的一种编码所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体的核酸。
本发明的一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含的抗人CD146抗体和药用载体。
本发明是具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体。采用实验与计算相结合的办法在单抗体表面进行定点突变。选用人IgG的framework，在不改变原抗体CDR结构基础上，进一步对IgG的framework区进行定点突变。
本发明具有如下优点：
(1)在保持或增强抗体分子与人CD146受体分子结合活性的前提下，制备出人源化程度尽量高的单克隆抗体，以避免该抗体作为治疗性抗体进入人体后导致的人抗鼠免疫反应。
(2)本发明的特异性结合细胞黏附分子CD146受体的抗原结合蛋白。本发明制备的抗体结构包含人IGHV3-33的重链可变区及轻链可变区的框架FR区，在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，对框架区进行点突变，以提高抗体与人CD146受体的结合活性。
实施例1
抗人CD146人鼠嵌合抗体的人源化策略
采用best-fit CDR构建技术对抗人CD146人鼠嵌合抗体进行人源化改造。鼠源的CDR被移植到到与嵌合抗体框架区具有高度序列同源性的适合人体可接受的框架中。在人种系序列数据库中搜索到最匹配的可移植CDR的FR框架。利用抗体的一级结构序列和3D结构数据来确定维持鼠源CDR正确构象从而保持结合亲和力和结合特异性所需的关键构架残基。为保持抗体的亲和力而在不同的人源化分子框架中进行回复突变，最后得到高度人源化的单克隆抗体。
通过BLAST分析人的V区基因的数据库，人IGHV3-33和抗人CD146人鼠嵌合抗体重链可变区序列具有41％的相似度，包括CDRs，其框架区优选为抗人CD146人鼠嵌合抗体人源化设计改造的框架区。基于JH3minigene，Kabat Vol.II的序列相似性，种系V区域通过计算机模拟与FR4结合。JH3minigene残基的WGQG落在抗人CD146人鼠嵌合抗体的CDR3区域中。基于序列比对和考虑了对抗体功能的影响，采用IGHV3-33框架设计了14条人源化重链突变体。H0是将抗人CD146人鼠嵌合抗体的CDRs直接移植到人抗体的框架区。H1-H11是在H0基础上的改造，分别在71,69,66,30,27,28,73,78,24,48，38的位置上进行突变。H12在H0基础上在66,69和71位点进行回复突变。H13是在H0基础上在以上7个27,28,30,66,69,71，73位点进行回复突变。H14是在H0基础上在71,69,66,30,27,28,73,78,24,48，38的位点进行回复突变。回复突变指的是将人源的突变成抗人CD146人鼠嵌合抗体的序列。
通过BLAST对人V区基因数据库进行分析，选择与抗人CD146人鼠嵌合抗体轻链可变区有64％的相似性，包括CDRs的人IGKV1-39作为FR区的替代。基于序列相似性分析，J-regionkappa 2minigene Kabat Vol.II的FR4框架最合适。JK-2minigene的前两个残基落在抗人CD146人鼠嵌合抗体CDR3区内。通过序列比对和考虑到对抗体功能可能产生的影响，得到含有IGKV1-39框架区的6个轻链突变体。结构L0是将抗人CD146人鼠嵌合抗体的CDR直接移植到人IGKV1-39框架区。L1-44结构与L0的不同在于，他们分别在2，1，3和60位点进行突变。L5在4个位点同时突变。
实施例2
如图1所示为抗CD146鼠源抗体与CD146结合的ELISA结果。通过ELISA确定人源化设计的抗体与人CD146受体结合的特异性
根据计算机模拟人源化设计结果合成VH结构域和VL结构域，将合成的VH结构域和VL结构域克隆至哺乳动物表达载体中，该表达载体使相应的结构域能够在完整的人IgG骨架中表达。将重链构建体与轻链构建体共转染至哺乳动物细胞中，进行人源化抗体的小批量制备。将瞬时转染的上清液进行ELISA检测。通过蛋白A或G树脂，纯化IgG至均一，用于在以细胞为基础的测定中进行检测。
为确定人源化抗体与CD146结合的特异性，针对CD146和对照蛋白进行了ELISA。将上述的瞬时转染的上清液稀释20倍、200倍、2000倍、20000倍用于接下来的ELISA检测。用包被缓冲液将已知CD146稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜进行包被。次日洗涤3次。上述上清液中加一定稀释的人源化抗体表达产物样品，0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，温度为37℃下，反应10～30分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD450值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD450值，若大于规定的阴性对照OD450值的2.1倍，即为阳性。上清稀释20倍ELISA检测结果如表1所示。
表1
抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450
H0L0 2.512 H2L4 2.506 H5L2 2.401 H8L0 2.537 H10L4 2.614 H13L2 2.599
H0L1 2.451 H2L5 2.483 H5L3 2.421 H8L1 2.473 H10L5 2.446 H13L3 2.446
H0L2 2.385 H3L0 2.381 H5L4 2.338 H8L2 2.467 H11L0 2.377 H13L4 2.411
H0L3 2.521 H3L1 2.428 H5L5 2.379 H8L3 2.483 H11L1 2.472 H13L5 2.488
H0L4 2.485 H3L2 2.363 H6L0 2.324 H8L4 2.456 H11L2 2.363 H14L0 2.411
H0L5 2.374 H3L3 2.256 H6L1 2.167 H8L5 2.384 H11L3 2.313 H14L1 2.344
H1L0 2.469 H3L4 2.399 H6L2 2.34 H9L0 2.505 H11L4 2.391 H14L2 2.469
H1L1 2.537 H3L5 2.501 H6L3 2.487 H9L1 2.521 H11L5 2.547 H14L3 2.564
H1L2 2.435 H4L0 2.506 H6L4 2.5 H9L2 2.543 H12L0 2.435 H14L14 2.461
H1L3 2.385 H4L1 2.374 H6L5 2.385 H9L3 2.464 H12L1 2.321 H14L15 2.451
H1L4 2.394 H4L2 2.385 H7L0 2.299 H9L4 2.385 H12L2 2.213 Blank 0.066
H1L5 2.317 H4L3 2.452 H7L1 2.423 H9L5 2.467 H12L3 2.244 Blank 0.071
H2L0 2.387 H4L4 2.383 H7L2 2.387 H10L0 2.387 H12L4 2.284 blank89 0.051
H2L1 2.227 H4L5 2.344 H7L3 2.288 H10L1 2.326 H12L5 2.17 Blank90 0.057
H2L2 2.426 H5L0 2.404 H7L4 2.43 H10L2 2.408 H13L0 2.464 blank0 0.055
H2L3 2.511 H5L1 2.511 H7L5 2.501 H10L3 2.547 H13L1 2.542 blank0 0.07
上清稀释200倍ELISA检测结果如表2所示：
表2
抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450
H0L0 2.466 H2L4 2.35 H5L2 2.367 H8L0 2.241 H10L4 2.376 H13L2 2.399
H0L1 2.37 H2L5 2.307 H5L3 2.275 H8L1 2.026 H10L5 2.3 H13L3 2.435
H0L2 2.476 H3L0 2.292 H5L4 2.285 H8L2 2.094 H11L0 2.199 H13L4 2.327
H0L3 2.467 H3L1 2.306 H5L5 2.249 H8L3 2.066 H11L1 2.336 H13L5 2.329
H0L4 2.45 H3L2 2.264 H6L0 2.229 H8L4 2.168 H11L2 2.313 H14L0 2.32
H0L5 2.363 H3L3 2.126 H6L1 2.23 H8L5 1.997 H11L3 2.234 H14L1 2.223
H1L0 2.162 H3L4 2.329 H6L2 2.3 H9L0 2.393 H11L4 2.352 H14L2 2.29
H1L1 1.843 H3L5 2.414 H6L3 2.41 H9L1 2.457 H11L5 2.49 H14L3 2.457
H1L2 2.185 H4L0 2.513 H6L4 2.317 H9L2 2.429 H12L0 1.435 H14L14 2.317
H1L3 2.168 H4L1 2.313 H6L5 2.224 H9L3 2.269 H12L1 1.056 H14L15 2.285
H1L4 2.216 H4L2 2.285 H7L0 1.363 H9L4 2.24 H12L2 1.409 Blank 0.067
H1L5 1.912 H4L3 2.395 H7L1 2.285 H9L5 2.272 H12L3 1.247 Blank 0.063
H2L0 2.32 H4L4 2.331 H7L2 2.271 H10L0 2.264 H12L4 1.346 blank89 0.061
H2L1 2.223 H4L5 2.212 H7L3 2.162 H10L1 2.195 H12L5 1.097 blank90 0.054
H2L2 2.388 H5L0 2.41 H7L4 2.227 H10L2 2.34 H13L0 2.276 blank0 0.048
H2L3 2.48 H5L1 2.439 H7L5 2.406 H10L3 2.485 H13L1 2.39 blank0 0.051
上清稀释2000倍ELISA检测结果如表3所示：
表3
抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450
H0L0 1.568 H2L4 1.767 H5L2 1.730 H8L0 1.072 H10L4 1.618 H13L2 1.566
H0L1 1.535 H2L5 1.658 H5L3 1.572 H8L1 0.916 H10L5 1.516 H13L3 1.762
H0L2 1.863 H3L0 1.591 H5L4 1.534 H8L2 0.943 H11L0 1.267 H13L4 1.572
H0L3 1.601 H3L1 1.601 H5L5 1.374 H8L3 1.022 H11L1 1.664 H13L5 1.568
H0L4 1.767 H3L2 1.516 H6L0 1.319 H8L4 1.063 H11L2 1.611 H14L0 1.434
H0L5 1.733 H3L3 1.418 H6L1 1.336 H8L5 0.945 H11L3 1.647 H14L1 1.493
H1L0 0.897 H3L4 1.567 H6L2 1.441 H9L0 1.667 H11L4 1.709 H14L2 1.29
H1L1 0.554 H3L5 1.635 H6L3 1.468 H9L1 1.635 H11L5 1.792 H14L3 1.67
H1L2 0.916 H4L0 1.983 H6L4 1.317 H9L2 1.760 H12L0 0.429 H14L14 1.517
H1L3 1.01 H4L1 1.496 H6L5 1.394 H9L3 1.553 H12L1 0.289 H14L15 1.568
H1L4 1.177 H4L2 1.412 H7L0 0.37 H9L4 1.479 H12L2 0.425 Blank 0.066
H1L5 0.686 H4L3 1.589 H7L1 1.432 H9L5 1.411 H12L3 0.379 Blank 0.076
H2L0 1.524 H4L4 1.653 H7L2 1.616 H10L0 1.451 H12L4 0.41 blank89 0.048
H2L1 1.504 H4L5 1.302 H7L3 1.636 H10L1 1.507 H12L5 0.306 blank90 0.053
H2L2 1.61 H5L0 1.551 H7L4 1.261 H10L2 1.587 H13L0 1.543 blank0 0.047
H2L3 1.756 H5L1 1.487 H7L5 1.608 H10L3 1.639 H13L1 1.452 blank0 0.05
上清稀释20000倍ELISA检测结果如表4所示：
表4
抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450 抗体 OD450
H0L0 0.278 H2L4 0.334 H5L2 0.277 H8L0 0.179 H10L4 0.279 H13L2 0.262
H0L1 0.335 H2L5 0.339 H5L3 0.291 H8L1 0.146 H10L5 0.263 H13L3 0.347
H0L2 0.378 H3L0 0.326 H5L4 0.301 H8L2 0.152 H11L0 0.203 H13L4 0.212
H0L3 0.291 H3L1 0.323 H5L5 0.262 H8L3 0.17 H11L1 0.289 H13L5 0.328
H0L4 0.334 H3L2 0.297 H6L0 0.18 H8L4 0.196 H11L2 0.395 H14L0 0.485
H0L5 0.371 H3L3 0.246 H6L1 0.254 H8L5 0.153 H11L3 0.353 H14L1 0.326
H1L0 0.159 H3L4 0.273 H6L2 0.241 H9L0 0.285 H11L4 0.404 H14L2 0.269
H1L1 0.128 H3L5 0.305 H6L3 0.257 H9L1 0.279 H11L5 0.364 H14L3 0.324
H1L2 0.166 H4L0 0.415 H6L4 0.226 H9L2 0.331 H12L0 0.091 H14L14 0.315
H1L3 0.189 H4L1 0.294 H6L5 0.261 H9L3 0.245 H12L1 0.085 H14L15 0.308
H1L4 0.204 H4L2 0.317 H7L0 0.094 H9L4 0.278 H12L2 0.099 Blank 0.065
H1L5 0.131 H4L3 0.324 H7L1 0.283 H9L5 0.312 H12L3 0.095 Blank 0.07
H2L0 0.294 H4L4 0.331 H7L2 0.297 H10L0 0.248 H12L4 0.09 blank89 0.052
H2L1 0.25 H4L5 0.242 H7L3 0.289 H10L1 0.278 H12L5 0.093 blank90 0.059
H2L2 0.335 H5L0 0.31 H7L4 0.21 H10L2 0.323 H13L0 0.384 blank0 0.051
H2L3 0.394 H5L1 0.279 H7L5 0.274 H10L3 0.286 H13L1 0.271 blank0 0.055
选择不同稀释度的上清中ELISA结果最好的10个组合如表5所示：
表5
综合表5中的结果，对上述实验中一些亲和力较高、表达量较好的轻重链组合表达抗体进行进一步的ELISA验证。分别将其上清稀释5000倍和20000倍进行ELISA检测。
优选的上清稀释5000倍后与CD146结合的ELISA结果如表6所示:
表6
抗体 OD450值 抗体 OD450值 抗体 OD450值
H0L2 0.553 H7L3 0.548 H13L0 1.027
H0L4 0.545 H9L0 0.514 H13L4 0.848
H0L5 0.587 H9L2 0.491 H14L0 0.739
H2L2 0.614 H10L2 0.47 H14L1 0.721
H2L3 0.707 H11L2 0.818 Blank 0.063
H2L4 0.436 H11L3 0.589 Blank 0.058
H4L0 0.489 H11L4 0.741 blank0 0.047
H5L0 0.494 H12L0 0.155 blank0 0.052
优选的上清稀释20000倍后与CD146结合的ELISA结果如表7所示：
表7
抗体 OD450值 抗体 OD450值 抗体 OD450值
H0L2 0.2 H7L3 0.207 H13L0 0.395
H0L4 0.189 H9L0 0.192 H13L4 0.333
H0L5 0.2 H9L2 0.178 H14L0 0.277
H2L2 0.208 H10L2 0.173 H14L1 0.269
H2L3 0.242 H11L2 0.3 Blank 0.056
H2L4 0.159 H11L3 0.213 Blank 0.059
H4L0 0.172 H11L4 0.278 blank0 0.051
H5L0 0.18 H12L0 0.083 blank0 0.055
实施例3
人源化抗体系列与CD146的结合进行BIACORE分析
本实施例的目的是用BIACORE分析人源化改造抗体与人CD146的结合亲和力。所述的人源化改造抗体是H5L0抗体，所述H5L0抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：24)；H10L2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：26；H14L0抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；H11L3抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：27；H11L4抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：28；H13L0抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24；H0L2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：26；H11L2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：26；H9L2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：26；H13L4抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：22和SEQID NO：28；H2L3抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：27；H0L4抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：28；H9L0抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：18和SEQID NO：24；H2L4抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：28；H2L2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：26；H7L3抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO：16和SEQID NO：27。
分析在BIACORE3000仪器上进行，该仪器在每个新芯片制备前进行并通过了系统测试。全部操作在25℃进行，以HBS-EP，GEHealthcareBR-1006-69/5mMHEPES,150mMNaCl,3.4mMEDTA,0.005％surfactantP20,pH7.4作为工作缓冲液。利用通过伯胺化学性能，其共振单位为4000RU’s；共价偶联在CM5芯片上的目标蛋白A在相似的共振单元100-200RU’s对抗CD146人鼠嵌合抗体和人源化抗体进行分析。每个芯片还制备了带有参照表面即未偶联捕获抗体的对照。获取使用不同分析物浓度进行的循环的感应曲线图Sensorgrams以便进行动力学分析。一个循环由单克隆抗体被捕获在表面上、用流动工作缓冲液进行的短暂稳定期，和随后的限定浓度分析物ECD或者亚结构域蛋白发生结合构成。注射与表面结合的分析物3-4分钟，得到曲线中的结合部分。然后是只有缓冲液的流过3-4分钟，从而记录解离数据。循环至此结束，注射捕获试剂盒提供的再生溶液，所述再生溶液为10Mm甘氨酸pH1.5以便除去捕获到的抗体/分析物，但不会显著影响捕获抗体在随后的循环中再进行单克隆抗体的捕获。
亲和力分析的一般方法如下：首先，制备芯片并测试它对不同的单克隆抗体浓度下捕获的共振单位(RU)。然后执行动力学循环，循环中将单克隆抗体捕获到大概100RU的水平，允许分析蛋白进行结合然后解离，将表面进行再生以除去除了共价偶联的全部蛋白。以6种不同的分析蛋白浓度，通常是200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM和6.25nM进行一系列这种循环。在分析蛋白之前进行多轮缓冲液循环以保证循环的一致性，在一些试验中，缓冲液循环被作为“双重参照”。使用的分析物是人CD146。在动力学试验循环过程中，模拟物偶联的表面提供参照，将该参照从正在运行的特异抗体-分析物RU数据中减去以去除缓冲液带来的假象。对动力学曲线组中的每个浓度，从含有分析物的循环的数据中减去只含缓冲液的循环的数据，从而给某些运行做双重参照。使用BIAEVALUATION软件(v.3.2)将这样得到的曲线数据全局拟合11朗格缪尔Langmuir模型。利用BIAEVALUATIONTM软件生成相互作用感应曲线图，用曲线图进行动力学评估。
抗CD146人鼠嵌合抗体及人源化抗体与人CD146受体亲和力分析结果如表8所示：
表8
抗体 分析物 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
H5L0 人CD146 7.98x104 6.48x10-3 8.11x10-8
H10L2 人CD146 2.76x105 1.42x10-2 5.15x10-8
H14L0 人CD146 1.62x105 3.30x10-3 2.03x10-8
H11L3 人CD146 3.31x105 8.88x10-3 2.68x10-8
H11L4 人CD146 9.65x104 7.83x10-3 8.11x10-8
H13L0 人CD146 7.22x104 5.57x10-3 7.71x10-8
H0L2 人CD146 1.13x105 1.06x10-2 9.39x10-8
H11L2 人CD146 1.20x105 8.65x10-3 7.21x10-8
H9L2 人CD146 1.60x105 9.05x10-3 5.65x10-8
H13L4 人CD146 1.59x105 5.52x10-3 3.48x10-8
H2L3 人CD146 1.51x105 9.70x10-3 6.41x10-8
H0L4 人CD146 2.95x105 1.10x10-2 3.72x10-8
H9L0 人CD146 1.50x105 8.92x10-3 5.95x10-8
H2L4 人CD146 1.55x105 1.03x10-2 6.61x10-8
H2L2 人CD146 1.58x105 1.00x10-2 6.37x10-8
H7L3 人CD146 1.10x105 9.51x10-3 8.67x10-8
抗CD146人鼠嵌合抗体 人CD146 8.34x104 3.28x10-3 3.94x10-8
如表8所示，显示了BIACORE获得的数据,从KD值可以看出，经过计算机模拟设计的人源化抗体H14L0和人源化抗体H11L3对人CD146的亲和力最好，结合活性高于鼠源抗体，是未来用于开发治疗性抗CD146单抗的优良候选抗体。在以上数据中，H13L4、H0L4、H10L2、H9L2、H9L0、H2L2、H2L3、H2L4的几个人源化设计后得到的单克隆抗体与CD146的亲和力与人鼠嵌合抗体相差无几。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，其特征在于：具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体包括
轻链可变区，包括轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，其特征在于：所述具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列中的任意一条氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体，其特征在于：所述具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋白的疾病的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病或溃疡性结肠炎。
8.根据权利要求5所述的用途，其中所述新生血管类疾病选自老年黄斑、多发性硬化症、黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。
9.一种编码权利要求1所述的具备高效中和活性的人源化抗人CD146单克隆抗体的核酸。
10.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1的抗人CD146抗体和药用载体。
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