CN103649122A

CN103649122A - 人源化cd52抗体

Info

Publication number: CN103649122A
Application number: CN201280033384.6A
Authority: CN
Inventors: T·D·琼斯; R·G·E·霍尔盖特; F·J·凯尔
Original assignee: Antitope Ltd
Current assignee: Abezena Cambridge Ltd; Genmab BV
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: US20140127236A1; US9321841B2; CN103649122B; IL229713A0; CA2837965A1; RU2013158454A; MX342676B; IL229713A; AU2012264643B2; KR20140036274A; MY163257A; EP2714739A1; BR112013030875A2; MX2013014083A; JP6254522B2; JP2014518630A; WO2012164063A1; RU2605307C2; GB201109238D0; AU2012264643A1

Abstract

本发明涉及抗人CD52的新型人源化抗体，以及其在治疗或预防人疾病的方法中的用途。

Description

人源化CD52抗体

本发明涉及抗人CD52的新人源化抗体，以及其在治疗或预防人疾病的方法中的用途。

背景技术

CD52是一种糖基化的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面蛋白，丰富存在于多种正常和恶性的淋巴样细胞上，特别是B细胞和T细胞（Gilleece et al,Blood82807-812(1993)；Hale et al,J Biol RegulHomeost Agents,15p386-391(2001)；Rodig et al,Clin Cancer Res12,p7174-7179(2006)）。CD52在髓样细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）上以较低的水平表达，在成熟的自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞和血液干细胞上几乎不表达。CD52还由附睾和输精管中的上皮细胞产生，被精子在通过生殖道的过程中获得（Hale et al,ibid,;Domagala et al,Med Sci Monit7p325-331(2001)）。CD52的确切生物学功能尚不清楚，但一些证据表明，其可能涉及T细胞迁移和共刺激（Masuyama et al,J Exp Med189979-989(1999);Watanabe et al,ClinImmunol120247-259(2006)）。

Campath-1H（阿仑珠单抗、

）是人源化的人CD52单克隆抗体，其表现出强的体外抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）。CD52存在于至少95%的全部人外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞上（Hale G.et al.,The CAMPATH-1antigen(CD52).Tissue Antigens1990,35:118-127）。Campath-1H识别由成熟CD52蛋白的羧基端四个氨基酸和带负电荷的GPI锚的一部分组成的表位。由于其显著的细胞毒性效应，Campath-1H能够在体内耗尽CD52阳性细胞，并且经批准用于慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的一线和三线治疗。已经评估了Campath-1H在治疗一些自身免疫性疾病中的效用，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、血管炎、肌炎、韦格纳氏病和糖尿病。对Campath-1H的最前沿的研究是在治疗复发缓解型多发性硬化（MS）方面。这些研究显示，与人干扰素β-1a相比，复发的时间显著改善（

（即β干扰素-Ia））。

Campath-1H的主要限制是免疫原性，所述免疫原性在高达70%的患者中诱导了抗体（Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Benchto Clinic,ed.Zhiqiang An(2009)ISBN:978-0-470-11791-0）。为了改善CD52抗体的临床效用，非常需要在患者中与显著的免疫原性没有关联的改良CD52抗体。

发明内容

本发明涉及对人CD52（huCD52）有结合特异性的人源化免疫球蛋白。本发明还提供了以至少10^-8M的平衡解离常数（Kd）结合人CD52的人源化抗体。本发明还提供了特异性结合人CD52的人源化抗体，所述人源化抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗体重链或使用突变的IgG恒定区，特别是增强ADCC（抗体依赖细胞介导的细胞毒性）或CDC（补体依赖细胞毒性）的恒定区。本发明还提供了其中抗体轻链是κ轻链的人源化抗体。所述人源化抗体可由人IgG重链和人κ轻链核酸编码，所述人IgG重链和人κ轻链核酸编码如SEQ IDNO:20-SEQ ID NO:28列出的其可变区中的蛋白质序列。

本发明还提供了特异性结合人CD52的人源化抗体，其中已经对所述抗体可变区进行了选择或修饰以排除一个或多个人CD4+T细胞表位。本发明还提供了特异性结合人CD52的人源化抗体，其中已经主要通过融合完全来自现有的人抗体可变区序列的序列片段形成所述抗体可变区。

本发明还提供了如下的本发明人源化CD52抗体，其包含重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列（分别为“RYGMS’”（SEQ ID NO.5）,“MMKTKGGRTYYPDSVKG’”（SEQ ID NO.6）和“DGYY”（SEQ ID NO.7））以及轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列（分别为“KSSQSLLHSDGKTYLN’”（SEQ ID NO.8），“LVSKLDS’”（SEQ ID NO.9）和“WQGTHLWT’”（SEQ ID NO.10））。本发明还提供了如下的本发明人源化CD52抗体，其包含对应SEQ ID NO:20-24的重链可变区用于重链，和SEQ ID NO:25-28用于轻链。在本发明的优选实施方案中，提供了如下的本发明人源化CD52抗体，其包含对应SEQ ID NO:22的重链可变区氨基酸序列用于重链和SEQ ID NO:28。

本发明的人源化抗体可以由任何上述CDR序列SEQ ID No.5至SEQID No.10和这些CDR序列中改变一个或多个氨基酸不显著减少与人CD52的结合的小变体（minor variant）组成。人源化抗体可通过将所述CDR序列与来自人可变区框架的序列连接在一起来产生，其中这种框架序列来源于单个或多个其他人抗体可变区框架序列。通常，这种人可变区框架序列会包括造成所述人源化抗体与CD52的最佳结合或改善结合的一个或多个突变。在本发明的优选实施方案中，所述人源化抗体中的这种人可变区框架序列完全来源于其他人抗体可变区中的序列，如EP1844074所述。这些序列包含来自其他人抗体可变区的序列的联结片段，以及人恒定区。特别地，这种人源化抗体还含有完全来源于其他人抗体可变区CDR序列的CDR序列，包括来源于其他人CDR的CDR序列的联结片段，以及人恒定区，从而产生其中可变区序列完全来源于其他人抗体可变区的序列与人恒定区的人源化抗体，这产生“全人”抗体。

本发明还提供了特异性结合人CD52的人源化抗体，其中所述人源化抗体由原核或真核细胞产生，尤其是来自于哺乳动物细胞系的真核细胞，尤其是CHO或NS0细胞。本发明还提供了特异性结合人CD52的人源化抗体，其为Fab片段或单链Fv（scFv）。本发明还提供了多特异性蛋白，其包括至少一种来自序列SEQ ID NO:20至24（用于重链）和SEQ ID NO:25至28（用于轻链）的人源化抗体，其中所述多特异性蛋白特异性结合人CD52，此外还与一个或多个其他分子结合或相互作用。可以包括在每种多特异性抗体内的不同抗体或蛋白可以彼此共价或非共价连接。

本发明提供了一种药物组合物，其包含特异性结合人CD52的人源化抗体（为蛋白质性抗体或编码所述抗体的基因）和可药用载体。所述药物组合物还可包含与所述人源化抗体连接或非连接的一种或多种化学治疗剂。

本发明提供了一种用于治疗CLL和其他白血病；一些自身免疫性疾病——包括多发性硬化、类风湿性关节炎、血管炎、肌炎、韦格纳氏病和糖尿病；以及器官移植排斥和移植物抗宿主病的方法，在每种情况中所述方法包括给予所述患者有效剂量的可也特异性结合人CD52的人源化抗体（作为蛋白质性抗体或编码所述抗体的基因），其中所述抗体可引起CD52+靶细胞例如B细胞和T细胞的破坏或凋亡。另外，本发明还提供了一种诊断上述疾病的方法，例如通过给予连接可检测标签上的人源化抗体和确定所述人源化抗体的体内结合，以提供检测例如在局部肿瘤块或炎性病变中的CD52+细胞的基础。或者，本发明的人源化抗体可作为检测疾病的工具用于CD52+细胞的体外测试，其还可用于抗体的体外试验，所述抗体可结合在治疗上使用的所述人源化抗体。因此，本发明的这种人源化抗体可在体内和体外用作诊断剂或治疗剂。

本发明的人源化抗体可包括多种抗体同种型或其混合物，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE或这些IgG的突变形式例如可增强与Fc受体（例如，Horton et al.,Blood116(2010)p3004-3012）或补体（例如，Natsume et al.,Cancer Res68(2008)p3863-3872）的结合的突变。通常，人源化抗体包括IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区。所述人源化抗体可以是全长（例如IgG1/κ抗体）或可以仅包括抗原结合部分（例如，Fab、F(ab')2、Fv或scFv片段）。

本发明的一些人源化CD52抗体可以通过一个或多个以下特性来表征：a)对人CD52的特异性（特异性结合人CD52）；b)对人CD52的结合亲和力具有至少10^-8M的平衡解离常数（Kd）。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的人源化抗体或抗原结合部分的核酸分子。因此，本发明还涵盖了包含本发明的编码抗体的核酸的重组表达载体和用这种载体转染的宿主细胞，以及通过培养这些宿主细胞制备本发明的抗体的方法。

可将本发明的人CD52的人源化单克隆抗体或其抗原结合部分（例如Fab）衍生化或连接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白质（例如Fab'片段）。例如，可将本发明的人源化抗体的抗体或抗原结合部分功能化地连接（例如，通过化学偶联、基因融合、非共价连接或以其他方式）至一个或多个其他分子实体。例如，可将所述人源化CD52抗体或其抗原结合片段缀合至治疗部分，例如细胞毒类药、有酶活性的毒素或其片段、放射性同位素、治疗性核酸或小分子抗癌药。还可将本发明的抗体缀合至细胞毒性药物，例如用细胞毒性试剂（例如131I）进行放射性标记，或者可以将其偶联至核糖体失活蛋白例如假单胞菌（Pseudomonas）外毒素（PE38片段、植物或细菌毒素例如蓖麻毒素、蓖麻毒素的α链、皂草素、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素或假单胞菌外毒素A（Kreitman and Pastan(1998)Adv.Drug Delivery Rev.31:53）。

在另一方面，本发明提供了组合物例如药物组合物和诊断组合物，其包含可药用载体和特异性结合人CD52的至少一种本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合部分。一些组合物还可包含本发明的人源化抗体或抗原结合部分的结合物。这类组合物还可包含与作为单独分子的一种或多种其他生物活性分子的结合物，例如至少一种本发明的人源化单克隆抗体与另一生物活性分子的结合物，或者可结合在同一分子内与一个或多个其他生物活性分子的结合物，例如为双特异性或多特异性分子，为两个或多个本发明的人源化抗体的结合物或为与一个或多个其他生物活性分子的结合物。

对于体内方法，可向人受试者给予所述人源化抗体或其抗原结合部分（或本发明的双特异性或多特异性分子），所述人受试者患有CD52+细胞相关的疾病或患有可通过使用本发明的人源化抗体的治疗而改善或预防的疾病。

还可与其他已知疗法（例如抗癌疗法、自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎的疗法、多发性硬化症的疗法）结合给予本发明的人源化单克隆抗体组合物。因此，本发明提供了一种用于治疗受试者中的癌症或炎性疾病的方法，其包括向所述受试者给予治疗有效量的人源化抗体的药物组合物以及药物载体。

在另一方面，本发明提供了一种使用本发明的抗体在体外或体内检测样品中人CD52抗原的存在的方法，例如用于诊断人CD52相关疾病。在一些方法中，这通过在允许形成本发明的人源化多克隆抗体和人CD52的复合物的条件下，使待测样品和对照样品一起，与所述人源化单克隆抗体或其抗原结合部分（或双特异性或多特异性分子）接触来实现。然后，检测测试样品中的复合物形成（例如使用ELISA)，所述测试样品和对照样品之间复合物形成的任何统计学显著的增加都指示所述测试样品中人CD52抗原的存在。

本领域的技术人员会理解，在其中所述人源化抗体结合人CD52抗原的所有情况中，本发明的人源化抗体，除了本文描述的那些之外，会具有另外的用途或组合物，因此这种用途和组合物应被认为在本发明的范围之内。本领域的技术人员会理解，可对本发明的人源化抗体的可变区序列（SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:28）或本发明的人源化抗体的CDR（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:10）作出改变，所述改变不会显著改变本发明人源化抗体的特性，因此应认为这种变体在本发明的范围之内。此外，在所述人源化抗体的可变区或CDR序列内的这种改变应被认为是在本发明的范围之内，只要这种改变与本发明的所述人源化序列有显著同源性。例如，可确定变体核酸在本发明的范围内，只要其包括含有SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:19的序列或含有通过其在严格条件下与本发明核酸杂交的能力而确定为与SEQ IDNO:11至SEQ ID NO:19基本相同的序列。在一个实施方案中，可通过核酸序列在严格条件下与本发明范围内核酸（例如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:19）杂交的能力确定其在本发明的范围内（例如与SEQID NO:11至SEQ ID NO:19基本相同）。术语“杂交”是指当具体核苷酸序列存在于复杂混合物（例如总细胞或文库DNA或RNA）中时，分子与该序列在严格杂交条件下的结合、形成双链体或杂交，其中至少以约10倍背景检测到所述具体核苷酸序列。严格杂交条件被选择为例如比具体序列在确定离子强度pH下的热解链点（Tm）低5-10℃。还应理解，为了增强ADCC和CDC，可在重链恒定区对本发明的人源化抗体作出修改。为了增强ADCC，可通过在一些哺乳动物细胞中表达所述人源化抗体来生成所述抗体的岩藻糖耗尽形式，所述哺乳动物细胞包括变异型CHO细胞系、Lec13（Shields et al.,J Biol Chem277（2002）p26733–26740）、大鼠杂交瘤细胞系、YB2/0（Shinkawa et al.,J BiolChem278（2003）p3466–3473）和敲除FUT8（a-1,6-岩藻糖基转移酶）的CHO细胞系（Yamane-Ohnuki et al.,Biotechnol Bioeng87（2004）p614-622）。可选择地，可使用在重链恒定区中的突变以增强ADCC，例如Shields et al.,J Biol Chem276(2001)p6591-6604和Lazar et al,.Proc Natl Acad Sci U S A2006;103(2006)p4005–4010所描述的。可选择地，可使用在重链恒定区中的突变以增强CDC，例如使用混合的人IgG1/IgG3同种型的抗体（Natsume et al.,同上）。

根据别处的先例特别是根据对Campath-1H的临床研究（ZhiqiangAn，同上），本领域技术人员应理解，与人CD52抗原结合的抗体在患者中从根本上来说是免疫原性的，可能由于CD52抗体所固有的细胞毒性，所述CD52抗体作为针对来自所述抗体的CD4+T细胞表位的共刺激信号起作用，从而导致CD4+T辅助细胞应答和免疫原性。因此，本领域技术人员应理解，如通过对人血液的体外研究（参考实施例9）所确定的，本发明的抗体出人意料地没有这种CD4+T辅助细胞应答，并且具有低CD4+T细胞应答（在人T细胞测定中，<=4%T细胞应答）的这种CD52抗体是新的。

附图说明

在附图说明中，术语2E8或ANT01可互换地用于来源于2E8小鼠单克隆抗体的小鼠嵌合的或人源化的抗体。

图1显示用于在哺乳动物细胞中表达嵌合的和人源化的抗体的质粒载体，所述嵌合的和人源化的抗体包含pANT17（用于重链）和pANT13（用于轻链）。

图2显示与结合NS0CD52-相比，2E8小鼠单克隆抗体结合用人CD52转染的NS0细胞的流式细胞分析。用抗-小鼠IgG-PE缀合抗体染色，Y轴表示来自PE的信号。

图3显示与Campath-1H相比，嵌合2E8的稀释物结合Hut78细胞的流式细胞分析。用抗-人IgG-PE缀合抗体染色。

图4显示，在嵌合2E8和Campath-1H竞争结合Hut78细胞中，使用Campath-1H-PE的竞争流式细胞分析。

图5显示，在使用REH靶细胞进行的嵌合2E8和Campath-1H的ADCC测定中，用作效应细胞的5份人PBMC样品的平均细胞毒性。

图6——除了2份单独的PBMC用嵌合2E8和Campath-1H的稀释物和高表达REH靶细胞之外，同图5。

图7——除了在使用嵌合2E8和Campath-1H的稀释物以及高表达REH靶细胞的CDC测定中使用人补体之外，同图6。

图8显示，在用生物素化的嵌合2E8竞争中，结合人源化2E8变体的竞争性CD52肽ELISA。

图9显示人源化变体和Campath-1H的稀释物结合REH细胞的流式细胞分析。

图10显示在使用REH靶细胞进行的人源化2E8变体和Campath-1H的ADCC测定中，用作效应细胞的4份人PBMC样品的平均细胞毒性。

图11显示使用高CD52表达的REH靶细胞和人补体时，人源化2E8变体和Campath-1H的CDC。

图12显示，在嵌合2E8、Campath-1H和选择的变体竞争性结合REH细胞中，使用Campath-1H-PE的竞争性流式细胞分析。

图13显示通过细胞凋亡和坏死测量的人CD52抗体对REH细胞的直接细胞毒性效应

图14显示移植了Raji人伯基特淋巴瘤细胞、然后用Campath-1H和一线（lead）人源化2E8变体VH3/VK4（V区SEQ ID NO.22和28）处理的SCID小鼠的Kaplan–Meier曲线图。

实施例

除非另有说明，根据制造商的说明书使用实施例中提到的可商购试剂。在实施例和整个说明书中通过ECACC登录号识别的细胞的来源是英国索尔兹伯里的欧洲细胞培养物保藏中心（European Collection of CellCultures，ECACC）。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员之一所通常理解的含义相同。下文描述了示例性的方法和材料，然而与本文描述的那些类似或等价的方法和材料也可用于实施或测试本发明。所述材料、方法和实施例仅是示例性的，不意欲对范围进行限制。

实施例1：小鼠单克隆抗体生成

定制合成了CD52肽（GQNDTSQTSSPSC)），并将其经马来酰亚胺基己酰基-N羟基琥珀酰亚胺接头（Mimotopes,Wirral,Cheshire UK）缀合至KLH或BSA，使所述肽N末端处于游离状态。Raji和HuT78获自ECACC。如下产生表达CD52的NSO细胞系：PCR扩增编码人CD52的DNA（NCBI参考序列：NM_001803.2）（全长序列——包括N-末端信号肽、C-末端取代的GPI-锚信号肽和成熟的GPI-锚定的表面肽），将其经BglII和EagI位点亚克隆到pANT抗体表达载体（图1a）中。所述CD52基因的转录在CMV I/E启动子（US5168062和US5385839，爱荷华大学（University of Iowa））的控制下。所述pANT表达质粒包含在SV40启动子控制下的突变型dhfr小基因（Simonsen&Levinson1983,PNAS80:2495-2499）、用于在真核细胞中进行选择的polyA序列以及用于原核细胞选择的β-内酰胺酶（Ap^R）基因和用于在原核细胞中增殖的pMB1复制起点。所述表达质粒在大肠杆菌（E.coli）XL1-blue中增殖（Stratagene Cat.No.200130）。通过电穿孔转染NS0细胞和将细胞置于使用200nM氨甲喋呤进行的选择下来获得稳定的CD52表达细胞系。培养细胞并扩大培养，然后用流式细胞术测试CD52表达。将高CD52表达的细胞系冷冻并按如下所述用于免疫小鼠。

雌性Balb/c小鼠通过腹腔内（intraperoneal）（腹腔内）注射完全弗氏佐剂（CFA）中50ug CD52肽-KLH缀合物来初次免疫，或者用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中1×10⁶个表达CD52的RAJI细胞来初次免疫。四周后，通过腹腔内注射PBS中10⁶个HUT-78细胞对所有小鼠进行加强免疫，两周后再加强注射。四周后，所有小鼠接受了第三次加强免疫，用腹腔内注射PBS中3×10⁶个表达CD52的NS0细胞进行。随后以两周的间隔腹腔内注射PBS中10⁷个表达CD52的NS0细胞进行两次加强免疫，一些小鼠还被给予5ug CD52肽-KLH的进一步加强免疫。

骨髓瘤融合的前三天，给予显示出最高抗体滴度的两只小鼠腹腔内加强免疫（PBS中10⁷个表达CD52的NS0细胞）。融合当天，处死所述两只小鼠，取出脾，将来自每个完整脾的细胞收集起来，在无血清培养基中洗涤，然后分成两等份样品。通过PEG介导的融合，将一半的所述脾细胞与F0骨髓瘤细胞融合，另一半与P3X63Ag8U.1骨髓瘤细胞融合。板1-4含有所述F0融合细胞，板5-8含有所述P3X63Ag8U.1细胞。完全融合培养基包含DMEM、2%L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清、5%BriClone杂交瘤克隆培养基（National Institute forCellular Biotechnology,Dublin,Ireland）和次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷（HAT）。将得到的融合物接种至96孔板，每孔200uL。将剩余的未铺板的融合细胞在培养物中稳定长达3天，然后将其冷冻并保存在液氮中。将铺板的融合细胞在37℃、5%CO₂下培养2周，转移到96孔板，并如下所述使用CD52肽-KLH ELISA测试分泌的CD52抗体的存在。将来自于24个免疫阳性孔的细胞扩大培养，然后用CD52肽ELISA、基于NS0-CD52细胞的ELISA和流式细胞术测试CD52特异性抗体。

对于所述CD52肽ELISA，ELISA板(VWR,Lutterworth,UK)在4℃下用PBS中100μL/孔的0.5μg/mL的CD52肽-KLH、CD52肽-BSA、仅KLH或仅BSA包被过夜。洗涤板，并将其用150μL/孔的含2%BSA的PBS封闭。将细胞培养物上清液或纯化的抗体在PBS/2%BSA中稀释，向每个板加入100μL，然后在室温下孵育1小时。将板用PBS-吐温（0.05%）洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠Ig（Fab-特异性）（Sigma-Aldrich）孵育1小时。将板用PBS-吐温洗涤三次，然后加入SigmaFast OPD底物（Sigma-Aldrich）并在室温下在黑暗中孵育以显色。通过加入50μL的3M HCl终止反应。使用Dynex酶标仪（Dynex,Worthing,UK）在490nm下读板。CD52肽特异的杂交瘤细胞是结合CD52肽-KLH和CD52肽-BSA而不结合仅KLH或仅BSA的那些。

对于所述基于NS0-CD52细胞的ELISA，将3×10⁵个细胞/孔（NS0野生型或表达CD52的NS0细胞）铺开（plated out）在V型底96孔板中。将板离心，弃上清，将板在吸水纸上吸干。将杂交瘤细胞样品以1:2的比例稀释在FACS缓冲液（含有1%BSA和0.05%叠氮化钠的D-PBS）中，然后将100μL转移至各自含有NS0（板1）或NS0-CD52（板2）的两个板中。在室温下孵育1小时后，通过离心所述板和在两次离心之间将所述细胞重悬在200μL FACS缓冲液中来洗涤板2次。离心后，将细胞在100μL含有以1:500稀释的抗-小鼠IgG（Fab特异性）（Sigma）的FACS缓冲液中重悬。在室温下孵育1小时后，通过离心和在PBS中重悬所述细胞来将板洗涤两次。离心后，将细胞在50μLPBS中重悬，然后转移至ELISA板。加入100μL TMB底物（Invitrogen），在室温下在黑暗中孵育以显色。通过加入50μL3M HCl终止反应。用Dynex酶标仪在450nm下读板。与NS0野生型细胞比较，CD52特异性克隆是那些特异性结合NS0-CD52细胞的克隆。

对于流式细胞术，使用1:2稀释的CD52杂交瘤细胞抗体以及1:100稀释的抗-小鼠IgG-PE缀合抗体（Sigma），将3×10⁵个NS0-CD52细胞或野生型NS0细胞染色。小鼠IgG（Sigma）作为杂交瘤细胞内存在的不同鼠同种型的单独对照也被包含在内。将细胞在4℃下染色1小时。还包含仅有抗-小鼠IgG-PE缀合抗体的对照。将细胞用FACS缓冲液洗涤2次，最后在FACS缓冲液中重悬，并使用Beckton DickinsonFACSCalibur（Becton Dickinson,Oxford,UK）进行流式细胞术。通过分析相关同种型对照抗体确定仪器设置。

从CD52肽ELISA、基于NS0-CD52细胞的ELISA和流式细胞术的结果，克隆了huCD52特异性杂交瘤细胞，在培养物中扩大，冷冻作为亲本原种（parental stock）并保存在液氮中。将每种选出的杂交瘤细胞在克隆培养基中稀释并以每3个孔1个细胞的细胞密度铺于96孔板中。克隆培养基包含DMEM、2%L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清、5%BriClone杂交瘤克隆培养基和次黄嘌呤-胸腺嘧啶脱氧核苷（HT）。将培养物在37℃下在5%CO₂中维持2周，其中在培养物中1周后所述克隆的细胞接受新鲜培养基。克隆后2周，将所有接种孔的上清液转移至新的96孔板，并使用如前所描述的CD52肽ELISA和流式细胞术测试CD52抗体的存在。将阳性孔在培养物中扩大并重新测试。将阳性孔进一步扩大并测试抗体同种型。将CD52抗体的阳性亚克隆冷冻，在液氮中保存，并用于生产单克隆抗体以进行后续研究。

使用快速ELISA小鼠抗体同种型鉴定试剂盒（Perbio,Cramlington,UK）对单克隆抗体进行同种型鉴定。在1mL蛋白A-琼脂糖柱（GEHealthcare,Little Chalfont,UK）上纯化抗体。将管道和蛋白A柱用0.4MNaOH去热原，然后进行纯化。将柱用20柱体积的pH7.4的PBS重新平衡。收获杂交瘤细胞培养物上清液，使用10×PBS将其调至1×PBS（pH7.4）并过滤除菌。将过滤的上清液以0.5mL/分钟泵送通过蛋白A-琼脂糖柱。用1×PBS（pH7.4）洗涤柱，使用无菌0.1M柠檬酸钠（pH3）洗脱IgG，收集了0.9mL级分并用0.1mL的无菌1M Tris-HCl（pH9）中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS（pH7.4）以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.4的消光系数Ec（0.1%）通过OD280nm对抗体进行定量。纯化的抗体使用Novex NuPAGE电泳系统用4-12%NuPage凝胶（Invitrogen,Paisley,UK）和MES电泳缓冲液通过SDS-PAGE来分析。用4×NuPAGE样品缓冲液和β-巯基乙醇制备1μg抗体并加热。将所述凝胶用InstantBlue染色液（Expedeon,Cambridge,UK）染色并通过比较染色的带与PageRuler^TMPlus Prestained ProteinLadder（Fermentas,York,UK）来估计分子大小。对每个抗体确定了两条带，不存在可检测到的污染物。使如上所述的CD52肽流式细胞术检测纯化的抗体。从流式细胞分析（图2），证明了被称为2E8的一线单克隆抗体选择性结合NS0-CD52细胞。

实施例2-可变区基因测序

使用RNAqueous-4PCR试剂盒（Ambion,Warrington,UK）从2E8杂交瘤细胞提取总RNA，并将其用于合成cDNA。使用如表1所示的简并小鼠前导序列引物（Sigma）和独特恒定区引物（Sigma）通过PCR扩增鼠免疫球蛋白重链和κ轻链可变（V）区片段。将所得的PCR片段亚克隆至pGEM-T Easy I载体系统（Promega,Southampton,UK）中，并使用载体特异性引物M13Forward（Sigma）对插入片段进行测序。所有DNA测序由Geneservice Ltd,Cambridge,UK）进行。所得的V区核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，相应的氨基酸序列为SEQID No.3和SEQ ID No.4，分别为重链和轻链V区。

表1

2E8高变区（CDR）的序列如下：

实施例3–生成嵌合抗体

将2E8单克隆抗体的重链和轻链V区序列进行PCR扩增并亚克隆至pANT抗体表达载体中（图1b），重链和轻链V区分别克隆至pANT17和pANT13中。将重链V区基因与人γ1重链基因（G1m3（G1m（f））同种异型）在阅读框内经MluI和HindIII位点克隆至pANT17中，将轻链V区基因与人κ轻链恒定区基因（Km3同种异型）在阅读框内经BssHII和BamHI位点克隆至pANT13中。重链和轻链基因的转录都在CMV I/E启动子的控制下（US5168062和US5385839，爱荷华大学），pANT17质粒含有在SV40启动子控制下的突变型dhfr小基因（Simonsen&Levinson1983,PNAS80:2495-2499）和用于在真核细胞中进行选择的polyA序列。pANT17和pANT13都含有用于原核选择的β-内酰胺酶（Ap^R）基因和用于在原核细胞中增殖的pMB1复制起点。所有质粒在大肠杆菌（E.coli）XL1-blue中增殖（Stratagene Cat.No.200130）。用于扩增所述可变区基因以克隆至pANT表达载体中的引物示于表2。

表2

然后，将所述重链和轻链表达构建体通过基于磷酸钙的转染瞬时地共转染至HEK293细胞中，或者通过电穿孔稳定地转染至NS0细胞中。分泌的抗体通过蛋白A色谱法从细胞培养物上清液纯化。如图3所示，使用如在实施例1中具体描述的流式细胞分析时，与Campath-1H相比，2E8抗体稀释物显示出与CD52+HuT78细胞的改善结合谱。如图4所示，通过流式细胞分析，当与Campath-1H竞争结合CD52+HuT78细胞时，所述2E8抗体显示出改善的竞争结合谱。

实施例4–抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）

如下所示用所述2E8单克隆抗体进行了ADCC测定。收获靶细胞（REH或Raji细胞），并用25μM（终浓度）钙黄绿素-AM(Sigma)预加载。与钙黄绿素在37℃下孵育1小时后，在培养基中洗涤细胞以去除未纳入的钙黄绿素。将1×10⁴个靶细胞加入到含有终浓度为50μg/mL的2E8或对照抗体的透明V型底板中，如图5或如图6中所描述的，并孵育1小时以预先使所述靶细胞易受调理素作用。根据Addenbrooke’s Hospital Local Research Ethics Committee的批准，从获自UK National Blood Transfusion Service（Addenbrooke’s Hospital,Cambridge,UK）的健康社会供体血沉棕黄层（来自24小时内抽取的血液）分离PBMC（效应细胞）。PBMC通过Lymphoprep（Axis-Shield,Dundee,UK）密度离心从血沉棕黄层分离。将5×10⁵个效应细胞加入到包含靶细胞和抗体的板的每个孔中，终体积为250μL（效应细胞与靶细胞的比率为50:1）。样品在37℃/5%CO₂下孵育4小时。4小时后，将Triton X-100加入到含有细胞（效应细胞和/或靶细胞）的对照孔中以确定最大裂解对照。在离心后，从每孔转移150μL培养基至96孔透明底黑壁的板中，并在520nm下测量板荧光。结果如下表示：

图5显示，嵌合2E8（“ANT01”）和Campath-1H的来自5个人供体的PBMC的平均ADCC，靶CD52+REH细胞显示了嵌合2E8的显著增强的ADCC。随后，通过FACS分离出高CD52表达的变异型REH细胞系，其表现出与亲本REH细胞相比约2倍Campath-1H的结合。图6显示，使用来自2个个体供体的PBMC，一系列稀释的嵌合2E8和Campath-1H对高CD52+REH细胞的ADCC。这还显示出与Campath-1H相比嵌合2E8的显著增强的ADCC谱。

实施例5-补体依赖性细胞毒性（CDC）

如下对所述2E8单克隆抗体进行了CDC测定。收获了靶细胞（REH或Raji细胞），将5×10⁴个细胞/孔加入至黑壁透明平底的96孔板中。将终浓度如图7所示的2E8或对照抗体与活性或热失活的（在60℃下30分钟）人血清（Pathway Diagnostics Ltd,Dorking,UK）一同加入每个孔（25%终血清浓度）。将样品在37℃/5%CO₂下孵育3小时。3小时后，将Triton X-100加入到含对照细胞的孔中，以建立最大裂解对照。用测定生长培养基将Prestoblue（10×）细胞活力试剂（Invitrogen）稀释，加入到每孔中，以获得最终1:10稀释度的PrestoBlue。在37℃/5%CO₂下孵育1小时后，在590nm下测定板荧光。结果表示如下：

图7显示与Campath-1H相比，嵌合2E8的显著增强的CDC谱。

实施例6-生成人源化抗体

使用EP1844074（Antitope Ltd）中描述的方法生成了人源化抗体。使用瑞士PDB产生小鼠2E8V区的结构模型并对其进行分析，以鉴定可能对所述抗体的CD52结合特性重要的重要氨基酸（“约束残基（constraining residues）”）。使用人V区序列的数据库来鉴定含有要用于设计所述人源化抗体的各个约束残基的人V区序列的区段。通常，使用两个或多个可选择的V区序列区段以提供各个约束残基，获得2E8的人源化抗CD52V区序列的大量可能序列。然后，通过如Fothergill et al.（WO9859244,受让人Eclagen Ltd）中所述的计算机分析来分析这些序列以预测非生殖细胞系MHC II类肽结合，还使用包括“The ImmuneEpitope Database and Analysis Resource”,http://www.immuneepitope.org/的数据库来分析已知CD4+T-细胞表位。去掉具有预测的非生殖细胞系MHC II类结合肽或具有与T细胞表位数据库显著匹配的序列的V区序列。这导致V区序列集变小。然后，将选择的V区序列区段组合结合以产生人源化重链和轻链可变区氨基酸序列。为2E8选择五条重链和四条轻链序列（分别命名为VH1-VH5，Vκ1-Vκ4，分别为SEQ ID No20-24和25-28）。

合成了编码人源化变体V区的DNA并将其亚克隆至如实施例3所述的表达载体pANT17和pANT13（图1）中。将人源化VH和Vκ链的所有组合（即，对于2E8总计有20种配对）瞬时转染至HEK293中，还转染至NS0细胞中，并如实施例3所述通过蛋白A色谱法从培养物上清液纯化抗体。

实施例7-分析人源化抗体

在针对亲本嵌合抗体的竞争ELISA中评估了来源于HEK和来源于NS0的2E8人源化变体与CD52肽的结合。使用Biotin Tag^TM微型生物素化试剂盒（Sigma–Aldrich）将亲本2E8嵌合抗体生物素化。将96孔MaxiSorp板（Nunc）用Dulbecco's PBS（PAA Laboratories,Yeovil,UK）中0.025μg/mL的CD52肽-KLH（终体积100μL）在4℃下包被过夜。将板用Dulbecco's PBS-2%BSA在室温下封闭1小时。将板用洗涤缓冲液（Dulbecco’s-PBS中0.05%吐温20）洗涤3次。将不同浓度的测试人源化抗体与生物素化的亲本嵌合抗体（终浓度0.035μg/mL）预混合，然后加入到所述CD52肽-KLH板中（终体积100μL）。所有样品进行两次重复测试。将板在室温下孵育1小时，并用洗涤缓冲液洗涤3次。加入100μL抗生物素蛋白链菌素HRP（Sigma-Aldrich）的1:1000稀释物，并在室温下孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，加入100μLTMB底物（Invitrogen）并在室温下在黑暗中孵育以显色。通过加入50μL的3MHCl终止反应。使用Dynex酶标仪在450nm下读板。

如图8所示，所有一线人源化2E8变体表现出与所述亲本嵌合抗体相似的竞争性结合谱。然后，如实施例1中所详细描述的，通过流式细胞术测试了人源化变体的结合，如实施例4所述测试人源化变体的ADCC，如实施例5所述测试人源化变体的CDC。如图9所示，对于结合REH细胞，通过流式细胞术，所述人源化变体表现出与Campath-1H相比改善的结合谱。如图10和11所示，对于ADCC，以50:1的靶细胞：效应细胞比率使用REH靶细胞时和对于CDC使用高CD52+REH细胞系（如实施例4中）时，所述人源化变体也表现出与Campath-1H相比改善的ADCC和CDC谱。

实施例8-生成scFv’s和Fab’s

将来自实施例6的人源化2E8变体转变为scFv’s并使用pCANTAB5E载体RPAS表达模块（Amersham Pharmacia Biotech,LittleChalfont,UK）克隆至如Benhar I.and Reiter Y.,Current Protocols inImmunology,Unit10.19B,Wiley Online Library,May2002（http://www.currentprotocols.com/protocol/im1019b）所述的M13噬菌体展示载体中。使用引物扩增了人源化VH和VK基因，所述引物提供末端SfiI和NotI限制位点、内部Gly4Ser接头和C末端his6标签。将所述scFv构建体作为SfiI-NotI片段插入至所述pCANTAB5E载体并转化至大肠杆菌HB2151中，产生输出至周质并部分输出至生长培养基的scFv。通过镍螯合物亲和色谱法使用HIS-Select HF Cartridges（Sigma-Aldrich）从生长培养基纯化scFv’s。在如实施例7所详细描述的竞争测定中，测试了纯化的2E8scFv’s与CD52肽的结合，所有的人源化scFvs都显示出与CD52肽的竞争结合。还使用用于scFv’s的方法将实施例6的人源化2E8变体转变为Fab’s，另外将扩增的人源化VH和VK基因用CH1和Cκ恒定区基因进一步扩增以形成VH-CH1和VK-Cκ片段，并将其用引物进一步扩增以将这些片段与22个氨基酸的pelB前导序列（Lei S.P.et al.,JBacteriol.169(1987)p4379–4383）在上游VH-CH1和下游VK-Cκ基因片段之间连接起来，产生双顺反子Fab基因。生成了来自人源化2E8变体的Fab’s，按上文关于scFv’s的描述进行纯化，并在如实施例7所详细描述的CD52肽竞争测定中进行测试。所有的人源化Fab’s显示出与CD52的竞争结合。

实施例9–分析CD4+T细胞应答

根据Addenbrooke’s Hospital Local Research Ethics Committee的批准，从获自UK National Blood Transfusion Service（Addenbrooke’sHospital,Cambridge,UK）的健康社会供体血沉棕黄层（来自24小时内抽取的血液）分离PBMC。通过Lymphoprep（Axis-shield,Dundee,UK）密度离心从血沉棕黄层分离PBMC，并使用CD8⁺RosetteSep^TM（StemCell Technologies Inc,London,UK）耗尽CD8⁺T细胞。供体通过使用基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒（Biotest,Solihull,UK）鉴定HLA-DR单倍型来表征。还确定了包括回忆抗原破伤风毒素的对照抗原的T细胞应答（KLH Pierce,Cramlingtom,UK，以及来源于A型流感病毒和爱泼斯坦巴尔病毒（Epstein Barr virus）的肽）。然后，将PBMC冷冻并保存在液氮中待用。

为了制备单核细胞衍生的树突细胞（DC），选择了50份不同的供体PBMC以提供与全世界人群频率类似的HLA-DR和HLA-DQ同种异型的频率分布。将PBMC在

培养基中复苏，使用Miltenyi CD14微珠（Microbead）和LS柱（Miltenyi Biotech,Oxford,UK）分离了CD14⁺细胞。将单核细胞重悬于补充有1000U/mL IL-4和1000U/mL GM-CSF的

中（“DC培养基”）至4×10⁶-6×10⁶个PBMC/mL，然后分配到24孔板中（终培养物体积2ml）。在第2天，通过更换一半体积的DC培养基来给细胞补料。到第3天时，单核细胞已经分化为半成熟DC，将所述半成熟DC与40μg/mL的Campath-1H、嵌合2E8抗体、人源化2E8抗体、100μg/mL KLH或仅培养基预孵育。将半成熟DC与抗原孵育24小时，之后通过将所述细胞洗涤两次并重悬于补充有50ng/ml TNF-α（Peprotech,London,UK）的DC培养基除去过量的测试抗体。在第7天，通过更换一半体积的DC培养基（补充有50ng/mL TNFα）来为DC细胞补料，然后在第8天收集成熟DC。对收集的成熟DC进行计数并使用台盼蓝染色排除来评估活力。然后，将所述DC进行γ-照射（4000拉德）并以2×10⁵个细胞/mL重悬于AIM-V培养基，然后用于ELISpot和增殖测定。另外，在第8天，还制备了新鲜的CD4+T细胞。为了纯化CD4+T细胞，将PBMC在

培养基中复苏，使用Miltenyi CD4微珠和LS柱（Miltenyi Biotech,Oxford,UK）分离了CD4⁺细胞并将其以2×10⁶个细胞/ml重悬于

培养基中。

在第8天，建立了T细胞增殖测定，其中在96孔U型底板中，将1×10⁵个自体CD4⁺T细胞加入到1×10⁴个负载有人源化2E8或嵌合2E8抗体的DC（比例为10:1）中，加入

培养基至终体积为200μL/孔）。在第14天，将测定板用每孔25μL AIMV中的1uCi[3H]（PerkinElmer,Beaconsfield,UK）进行脉冲6小时，然后使用TomTec Mach III（Hamden CT,USA）细胞收集器在过滤垫（Perkin Elmer）上收集细胞。每孔的每分钟计数（cpm）通过Meltilex^TM（Perkin Elmer）闪烁计数法在1450Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter（Perkin Elmer）上在paralux低本底计数中确定。将每种抗体样品的每分钟计数相对仅所述培养基的对照进行归一化。

对于ELISpot测定，将ELISpot板（Millipore,Watford,UK）用100μl/孔的PBS中的IL-2捕获抗体（R&D Systems,Abingdon,UK）包被。然后，将板在PBS中洗涤两次，在封闭缓冲液（PBS中1%BSA（Sigma））孵育过夜并在培养基中洗涤。在第8天，在96孔ELISpot板中，将1×10⁵个自体CD4⁺T细胞加入到1×10⁴个负载有抗原的DC（比例为10:1）中。将所有制剂在一式六份的培养物中进行测试。对于每种供体PBMC，还包括阴性对照（仅AIM

培养基）、无细胞对照和PHA（10μg/mL）阳性对照。

在继续孵育7天之后，将ELISpot板在dH₂O和PBS中依次洗涤三次、然后加入100μL过滤的PBS/1%BSA中的生物素化检测抗体（R&DSystems,Abingdon,UK）进行显影。在37℃下孵育1.5小时后，将板再在PBS中洗涤三次，加入100μl过滤的PBS/1%BSA中的抗生物素蛋白链菌素-AP（R&D Systems），维持1小时（在室温下孵育）。弃去抗生物素蛋白链菌素-AP，并将板在PBS中洗涤四次。向每孔加入BCIP/NBT（R&D Systems），并在室温下孵育30分钟。通过用dH₂O洗涤孔和孔背面三次来终止斑点显影。将干燥的板在Immunoscan^TMAnalyser上扫描，使用Immunoscan^TM第4版软件确定每孔斑点数（spw）。

对于增殖测定和IL-2ELISpot测定，结果表示为刺激指数（SI），其定义为测试抗体相对于仅培养基对照的cpm（增殖测定）或斑点（ELISpot测定）的比例，对于阳性T细胞应答使用等于或大于2的SI阙值（SI≥2.0）。数据显示，Campath-1H和嵌合2E8抗体在测试的50份供体PBMC中的10份或更多份中诱导了T细胞应答（>=20%）而所述人源化2E8抗体没有一种在50份供体中的多于2份供体中诱导T细胞应答（<=4%），表明人源化过程有效去除了V区的T细胞应答。

实施例10-直接细胞毒性测定

使用表面被膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/Propidium Iodide）共染色分别作为细胞凋亡和坏死的标记物，评估了人CD52抗体的直接细胞毒性效应。将1×10⁵个REH细胞在存在100μg/ml人CD52测试抗体或同种型匹配的对照抗体+/-100μg/ml F(ab’)²交联抗体(JacksonImmunoResearch,Cat no.109-006-008)下铺板（终体积600ul）。将细胞孵育72小时，然后将其在PBS/2%BSA中洗涤，之后根据制造商推荐的方案，用膜联蛋白V/碘化丙啶（Invitrogen,Cat no.V13245）共染色。使用FACS分析生成散点图，然后将其划分成三个区域，以定量活细胞（未染色）、凋亡细胞（FL1，膜联蛋白V阳性）和坏死细胞（FL1，膜联蛋白V阳性&FL3，碘化丙啶阳性）。如图13所示，与Campath-1H相比，人源化2E8表现出REH靶细胞的凋亡和坏死增加，与Campath-1H的坏死细胞百分比为19.9%相比，人源化抗体的坏死细胞百分比>40%。

实施例11-肿瘤动物模型

肿瘤动物模型被用于体内分析人CD52抗体对肿瘤生长的抑制。在该模型中，将Raji人伯基特淋巴瘤细胞移植至SCID小鼠中，并用人CD52抗体处理所述动物。经推注尾静脉（i.v.）注射，向7周龄的雌性Fox Chase SCID小鼠（Charles River,Morrisville,North Carolina,USA）注射1×10⁶个Raji细胞（美国典型培养物保藏中心（American TypeCulture Collection），0.2mL细胞悬液）。肿瘤细胞注射三天后开始，隔日每天一次腹膜内给予（i.p.）7剂量的人CD52测试抗体或同种型匹配的对照抗体。根据每只动物的体重（每周测定两次），按10mL/kg的给药体积（0.20mL/20g小鼠）调整剂量。图14显示的结果证明，与Campath1H相比，所述一线VH3/VK4CD52抗体（V区SEQ ID：22和28）在1和10mg/kg的剂量下提高存活率。

序列

Claims

1.一种CD52抗体，其包含至少1个、2个、3个、4个或5个选自以下的CDR序列：

(i)包含序列RYGMS（SEQ ID NO:5）的CDRH1

(ii)包含序列MMKTKGGRTYYPDSVKG（SEQ ID NO:6）的CDRH2

(iii)包含序列DGYY（SEQ ID NO:7）的CDRH3

(iv)包含序列KSSQSLLHSDGKTYLN（SEQ ID NO:8）的CDRL1；

(v)包含序列LVSKLDS（SEQ ID NO:9）的CDRL2；和

(vi)包含序列WQGTHLWT（SEQ ID NO:10）的CDRL3。

2.一种CD52抗体，其包含一个或多个选自SEQ ID NO:20-24的可变区序列用于重链可变区，以及一个或多个选自SEQ ID NO:25-28序列用于轻链可变区。

3.一种CD52抗体，其包含SEQ ID NO:22用于重链可变区以及SEQ ID NO:28用于轻链可变区。

4.权利要求1至3的CD52抗体，当在具有人群的HLA-DR同种异型分布的50份人血样中体外测试CD4+辅助T细胞应答的诱导时，所述抗体引起<=4%的T细胞应答。

5.权利要求1至4的抗体，其中所述可变区序列完全来源于人抗体可变区中的序列。

6.权利要求5的抗体，所述抗体包含可变区和人恒定区。

7.权利要求6的抗体，其中所述人重链恒定区是同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或者是突变的IgG恒定区，所述人轻链人恒定区是同种型κ。

8.权利要求6的抗体，其中所述人恒定区是IgG1和κ。

9.权利要求6的抗体，其中所述人恒定区是IgG4和κ。

10.权利要求1至5的抗体，其中所述抗体是scFv或Fab。

11.权利要求1至10的抗体，所述抗体是多特异性蛋白的组分，所述多特异性蛋白特异性结合人CD52，此外还结合一个或多个其他分子或与一个或多个其他分子相互作用。

12.一种编码权利要求1-10任一项的抗体的多核苷酸。

13.一种含权利要求12的多核苷酸的载体。

14.权利要求13的载体，其中所述载体是表达载体。

15.一种含有权利要求13或14的载体的宿主细胞。

16.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

17.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物。

19.一种包含权利要求1-11任一项的CD52抗体的组合物。

20.一种包含权利要求12的多核苷酸或权利要求13或14的载体的组合物。

21.一种治疗疾病的方法，所述疾病包括CLL和其他白血病；包括多发性硬化、类风湿性关节炎、血管炎、肌炎和糖尿病的自身免疫性疾病；以及器官移植排斥和移植物抗宿主病，所述方法包括给予需要此类治疗的受试者有效量的权利要求1至11任一项的抗体、权利要求12至14任一项的多核苷酸或权利要求19或20的组合物。

22.权利要求21的方法，其还包括共给予有效量的化学治疗剂。

23.权利要求21或22任一项的方法，其还包括共给予药物载体。

24.一种使用权利要求1至11任一项的抗体检测样品中人CD52抗原的存在用于诊断人CD52相关疾病的方法。

25.一种使用权利要求12至14的多核苷酸或载体检测样品中人CD52抗原的存在用于诊断人CD52相关疾病的方法。

26.一种CD52抗体，当在具有人群的HLA-DR同种异型分布的50份人血样中体外测试CD4+辅助T细胞应答的诱导时，所述抗体引起<=4%的T细胞应答。