KR20140036274A - 항-cd52 인간화 항체 - Google Patents

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로버트 조지 에드워드 홀게이트
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안티토페 리미티드
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Abstract

본 발명은 인간 CD52에 대한 신규한 인간화 항체 및 인간 질병의 치료 또는 예방 방법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

항-CD52 인간화 항체{humanised anti-CD52 antibodies}
본 발명은 인간 CD52에 대한 신규 인간화(humanised) 항체 및 인간 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로의 이들의 용도에 관한 것이다.
CD52는 특히 B 및 T 세포와 같은 다양한 정상 및 악성( malignant)의 림프계 세포(lymphoid cells)을 풍부(abundance)하게 찾는 당화된, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-닻형 세포 표면 단백질(glycosylphosphatidylinositol-anchored cell surface protein)이다(Gilleece et al, Blood 82 807-812(1993); Hale et al, J Biol Regul Homeost Agents, 15 p386- 391(2001); Rodig et al, Clin Cancer Res 12, p7174-7179(2006)). CD52는 성숙한 자연살해 세포(natural killer cells; NK cells), 호중구(neutrophils) 및 혈액 줄기세포(hematological stem cells)에서 발현이 거의 없고, 단아구(monocytes), 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cells; DC)와 같은 골수 세포(myeloid cells)에서 낮은 수준으로 발현된다. CD52는 또한 부고환(epididymis) 및 정관(duct deferens)에서 상피세포(epithelial cells)에 의해 생산되어, 생식기(genital tract)를 통하는 관(passage) 동안에 정자에 의해 획득된다(Hale et al, ibid,; Domagala et al, Med Sci Monit 7 p325-331(2001)). CD52의 정확한 생물학적 기능은 완전히 밝혀지지 않은 채 남아있으나 T 세포의 이동(migration) 및 동시 자극(co-stimulation)에 관여할 수 있음을 주장하는 몇몇 증거가 제시되었다(Masuyama et al, J Exp Med 189 979-989(1999); Watanabe et al, Clin Immunol 120 247-259(2006)).
캠패스-1H(Campath-1H; 알렘투주맙(alemtuzumab), 캠패스®(Campath®), 맵캠패스®(MabCampath®)는 시험관 내(in vitro)에서 항체-의존적인 세포 관여 독성(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체-의존적인 독성(complement-dependant cytotoxicity, CDC)을 강하게 나타내는 인간화 항-인간 CD52 단일 클론 항체이다. CD52는 적어도 모든 인간의 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes) 및 단핵백혈구(monocytes)/대식세포(macrophages)의 95%에서 나타난다(Hale G. et al., The CAMPATH-1 antigen(CD52). Tissue Antigens 1990,35:118-127). 캠패스-1H는 성숙한 CD52 단백질의 카르복시 말단 네 개의 아미노산 구성 및 음전하는 가지는(negatively charged ) GPI 닻(GPI anchor) 부분(portion)의 항원결정부위(epitope)를 인식한다. 이들의 유의적인 세포 독성 효과로 인하여, 캠패스-1H는 생체 내(in vivo)에서 CD52 양성 세포를 감소시킬 수 있으며 이는 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL)의 제 1 치료(front line treatment) 및 제 3 치료(third line treatment)에서 승인되었다. 캠패스-1H는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관염(vasculitis), 근염, 베게너 병(Wegener's disease) 및 당뇨병(diabetes)을 포함하는 다양한 자가면역 질환(autoimmune diseases)의 치료법에 이것의 사용이 평가되었다. 캠패스-1H의 가장 발전된 연구는 재발성이 감퇴된(relapsing remitting) 다발성 경화증(multiple sclerosis)의 치료에서이다. 상기 연구는 인간 인터페론 베타-1a(interferon beta-1a)(Rebif®(예를 들면, 인터페론 베타-Ia)와 비교한 재발에서 시간 별로 유의적인 발전을 나타내었다.
캠패스-1H의 주요 제한점은 항체가 환자의 70% 까지에서만 유도된다는 면역원성(immunogenicity)이다(Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, ed. Zhiqiang An(2009) ISBN: 978-0-470-11791-0). 항-CD52 항체의 의약적 사용을 개선하기 위해서, 환자에서 유의적인 면역원성을 나타내지 않는 개선된 항-CD52 항체에 대해 주되게 요구된다.
도면 범례와 함께, 2E8 또는 ANT01 명명법(nomenclature)은 2E8 마우스 단일클론 항체로부터 유래된 마우스, 키메라(chimeric) 또는 인간화 항체에 대하여 교환적으로(interchangeably) 사용되었다.
도 1은 중쇄에 대한 pANT17 및 경쇄에 대한 pANT13을 포함하는 포유류 세포에서 키메라 및 인간화 항체의 발현을 위한 플라스미드 벡터를 나타낸다.
도 2는 NS0 CD52에 결합하는 것과 비교하여 인간 CD52로 형질감염된 NS0 세포로 2E8 마우스 단일클론 항체의 결합을 유세포 분석(flow cytometry analysis)으로 나타낸다. 염색은 Y 축의 PE로부터 얻은 신호를 나타내는 항-마우스 IgG-PE가 결합된 항체로 하였다.
도 3은 캠패스-1H와 비교하여 키메라 2E8 희석액과 Hut78 세포의 결합의 유세포 분석을 나타낸다. 염색은 항-인간 IgG-PE가 결합된 항체로 하였다.
도 4는 Hut78 세포로 결합하는 키메라 2E8 및 캠패스-1H의 경쟁에서 캠패스-1H-PE를 사용한 경쟁적 유세포 분석을 나타낸다.
도 5는 키메라 2E8 및 캠패스-1를 REH 표적 세포와 함께 ADCC 분석에서 주효 세포(effector cells)로서 사용되는 5 개의 인간 PBMC 시료 유래의 평균 독성을 나타낸다.
도 6―키메라 2E8 및 캠패스-1H의 희석액과 고발현 REH 표적 세포를 처리한 2 개의 개별적인 PBMS를 도 5에서 제외한 것으로 나타낸다.
도 7―키메라 2E8 및 캠패스-1H의 희석액과 고발현 REH 표적 세포를 처리한 CDC 분석에 대하여 인간 보체 사용을 도 6에서 제외한 것으로 나타낸다.
도 8은 바이오티닐 키메라 2E8과 경쟁하는 인간화 2E8 변이체의 결합에 대한 CD52 펩티드 ELISA 경쟁을 나타낸다.
도 9는 인간화된 변이체 및 캠패스-1H의 희석액과 REH 세포의 결합에 대한 유세포 분석을 나타낸다.
도 10은 인간화 2E8 변이체 및 캠패스-1H를 REH 표적 세포와 함께 ADCC 분석에서 주효 세포로서 사용되는 4 개의 인간 PBMC 시료 유래의 평균 독성을 나타낸다.
도 11은 CD52를 고발현하는 REH 표적 세포 및 인간 보체(complement)와 함께 인간화 2E8 변이체 및 캠패스-1H에 대한 CDC를 나타낸다.
도 12는 REH 세포에 결합되는 키메라 2E8, 캠패스-1H 및 선택된 변이체의 경쟁에서 캠패스-1H-PE를 이용하는 경쟁 유세포 분석을 나타낸다.
도 13은 세포자살(poptosis) 및 과사(necrosis)에 의한 측정으로써 REH 세포에서 항-인간 CD52 항체의 직접적인 독성 효과를 나타낸다.
도 14는 라지(Raji) 인간 버킷 림프종 세포(Burkitt lymphoma cell)를 이식 한 후 캠패스-1H 및 연결된 인간화 2E8 변이체 VH3/VK4(V 영역 서열번호 22 및 28)로 치료한 SCID 마우스에 대한 카플란―마이어 곡선(Kaplan―Meier plot)을 나타낸다.
본 발명의 요약( Summary of the invention )
본 발명은 인간 CD52(huCD52)에 결합 특이성을 가지는 인간화(humannised) 면역글로블린(immunoglobulins)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 10-8M 평형해리상수(equilibrium dissociation constant;KD)를 가지며 인간 CD52에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 어느 하나의 항체 중쇄를 가지거나, 또는 특별히 항체-의존적인 세포 독성(antibody-dependant cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체-의존적인 독성(complement-dependant cytotoxicity, CDC)를 증가시키는 불변영역(constant region)인 변이된 IgG 불변영역를 가지는 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체들을 제공한다. 본 발명은 또한 항체 경쇄가 카파(kappa)경쇄인 인간화 항체들을 제공한다. 상기 인간화 항체들은 서열번호(SEQ ID NO) 20 내지 서열번호:28로 기재된 가변영역(variable region) 단백질 서열을 암호화하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
또한 본 발명은 항체 가변영역이 하나 또는 그 이상의 인간 CD4+ T 세포 항원결정기(epitope)를 배제하기 위해서 선택되어지거나 수정되어진 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체들을 제공한다. 본 발명은 또한 항체 가변영역가 기존 인간항체 가변영역 서열로부터 전체적으로 유래된 서열의 융합부분(fusing segment)에 의해서 기본적으로 이루어진 항체 가변영역가 있는 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체들을 제공한다.
또한 본 발명은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이 각각 “RYGMS”(서열번호5), “MMKTKGGRTYYPDSVKG”(서열번호 6) 및 “DGYY”(서열번호 7)이고, 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이, 각각 “KSSQSLLHSDGKTYLN”(서열번호 8), “LVSKLDS”(서열번호 9), “WQGTHLWT”(서열번호10)을 포함하는 본 발명의 인간화 항-CD52 항체들을 제공한다. 또한 본 발명은 중쇄에 대하여 서열번호 20 내지 24이며 경쇄에 대하여 서열번호 25 내지 28에 상응하는 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 인간화 항-CD52 항체들을 제공한다.
본 발명의 인간화 항체들은 상기 CDR 서열이 서열번호 5 내지 서열번호10 중의 어느 서열이며 인간 CD52에 결합을 유의적으로 감소시키지 않는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 변형이 있는 상기 CDR 서열의 소량 변종들로 구성될 수 있다. 인간화 항체들은 인간 가변영역 뼈대(framework)로부터 서열을 갖는 CDR 서열들이 같이 연결됨으로써 제조되어 질 수 있는데, 상기 이러한 뼈대서열은 한 개 또는 다수의 다른 인간항체 가변영역 뼈대 서열들로부터 유래된다. 보통 이런 인간 가변영역 뼈대 서열은 인간화 항체들이 CD52에 최적 또는 개선된 결합에 기여하는 한 개 또는 그 이상의 변형을 포함할 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 인간화 항체들 내의 상기 인간 가변영역 뼈대서열은 EP1844074에서 기술된 것처럼 다른 인간항체 가변영역에 있는 서열로부터 전적으로 유래된다. 이러한 서열들은 인간 불변영역 함께, 다른 인간항체 가변영역 유래의 서열의 연결된 부분을 구성한다. 특히, 상기 인간화 항체들은 또한 사람 불변영역을 포함하여 다른 사람 CDR로부터 유래된 CDR 서열의 결합된 조각을 포함하는 다른 사람항체 가변영역의 CDR 서열로부터 전체적으로 유래된 CDR 서열을 포함하며, 따라서 다른 인간 항체 가변영역 서열로부터 전체적으로 유래된 가변영역 서열을 가지는 만들어진 인간화 항체는 사람 불변영역을 포함하여, 이는 만들어진 "완전 인간”(fully human) 항체이다.
또한 본 발명은 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체들을 제공하며, 상기 인간화 항체는 진핵(prokaryotic) 또는 원핵 세포(eukaryotic cell), 구체적으로 포유류 세포주 유래인, 구체적으로 CHO 또는 NS0 세포들에 의해 생산된다. 또한 본 발명은 한개 Fab 조각 또는 단일 사슬 Fv(scFv)인 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 중쇄의 서열번호 20 내지 24 및 경쇄의 서열번호 25 내지 28까지의 서열로부터 적어도 하나의 인간화 항체를 포함하는, 다가특이성(multispecific) 단백질을 제공하며 상기 다가특이성 단백질은 인간 CD52에 특이적으로 결합하고, 추가적으로, 하나 또는 그 이상의 다른 분자와 결합하거나 또는 반응한다. 각각의 다가특이성 항체들에 포함된 다른 항체 또는 단백질은 공유결합 또는 비-공유결합적 중 어느 하나로 서로 연결될 수 있다.
본 발명은 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(단백질성(proteinaceous antibody) 항체 또는 항체를 암호화하는 유전자 중 어느 하나로서) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 인간화 항체와 연결되거나 연결되지 않는 하나 또는 그 이상의 화학요법 제제(chemotherapeutic agents)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(단백질성 항체 또는 상기 항체를 암호화하는 유전자 중 어느 하나로서)의 유효한 양(effective dosage)을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 각각의 경우에서, CLL 및 다른 백혈병(leukemias); 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관염(vasculitis), 근염(myositis), 베게너 병(Wegener's disease) 및 당뇨병(diabetes)을 포함하는 다양한 자가면역 질환(autoimmune diseases); 및 기관 이식 거부반응(organ transplant rejection) 및 이식 편대 숙주 질병(graft-vs-host disease)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 항체는 B 및 T 세포와 같은 CD52+ 표적 세포의 파괴(destruction) 또는 세포 자살(or apoptosis)을 야기한다. 추가로, 본 발명은 또한, 예를 들면 국부적인 종양 대중(tumour masses) 또는 염증성 병변(inflammatory lesions)과 같은, CD+52 세포의 검출을 기본으로 제공하도록, 예를 들면 검출 가능한 표지(detectable label)를 부착한 인간화 항체의 투여 및 생체 내에서 인간화 항체의 결합 측정을 통해서, 상기 언급한 질병의 진단 방법을 제공한다. 대체적으로 본 제시된 발명의 인간화 항체는 질병의 검출(detection)의 수단으로서 CD52+ 세포에 대한 시험관 내 실험 및 또한 약학적으로 사용되는 인간화 항체가 결합할 수 있는 항체에 대한 시험관 내 실험에 사용될 수 있다. 추가로, 상기 본 발명의 인간화 항체는 생체 내 및 시험관 내에서 진단 또는 약학적 제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 인간화 항체들은 여러가지 항체 동형(isotypes), 또는 이의 혼합물들, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE 또는 Fc 수용체(receptor)(예를 들어, Horton et al. , Blood 116(2010) p3004-3012) 또는 보체(complement(예를 들면, Natsume et al. , Cancer Res 68(2008) p3863-3872)로의 결합을 증가시키는 변이체와 같은 상기 IgG의 변이 형태를 크게 포함(encompass) 할 수 있다. 전형적인 인간화 항체는 IgG1 중쇄 불변영역 및 카파(k) 경쇄 불변영역을 포함한다. 인간화 항체는 전체-길이(예를 들면, IgG1/k 항체) 일 수도 있거나 단지 항원-결합 부분(예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv 절편) 만을 포함할 수도 있다.
본 발명의 몇몇의 인간화 항-CD52 항체들은 하기의 하나 또는 그 이상의 성질들에 의해서 특징되어 질 수 있다: a) 인간 CD52에 대한 특이성(인간CD52에 대한 특이적인 결합); b) 적어도 10-8M 의 평형해리상수(equilibrium dissociation constant, Kd)를 갖는 인간 CD52에 대한 결합 친밀성(binding affinity).
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의, 인간화 항체를 암호화하는 핵산분자, 또는 항원-결합 부분을 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체를 암호화하는-핵산를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 상기 벡터로 형질감염(transfected) 된 숙주 세포들은, 상기 숙주세포 배양에 의해 본 발명의 항체들을 만드는 방법과 같이, 본 발명으로 또한 아우러진다.
본 발명의 항-인간CD52 인간화 단일클론 항체, 또는 이의 항원결합부분(예를 들면, Fab)은 다른 기능적 분자, 예를 들면 다른 펩티드 또는 부분(예를 들면, 하나의 Fab' 조각), 로 유도될 수 있거나 연결될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 본 발명의 인간화 항체의 항원-결합부분은 하나 또는 그 이상의 다른 분자 독립체(molecular entities)로 기능적으로 연결(예를 들면, 화학결합(chemical coupling), 유전적 융합(genetic fusion), 비공유결합 또는 그외) 될 수 있다. 예를 들면, 인간화 항-CD52 항체, 또는 이의 항원결합부분은, 예를 들면, 세포독성치료(cytotoxic drug), 효소활성화된 독소(enzymatically active toxin), 또는 이의 단편, 방사성동위원소(radioisotope), 치료적 핵산, 또는 소분자 항암제와 같은, 치료상의 일부분(moiety)에 활용될 수 있다. 본 발명의 항체들은, 예를 들면, 131I 같은, 세포 독성제를 갖는 방사성 동위원소와 같은, 세포독성 의약품으로 활용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin)(PE38조각, 리신(ricin), 리신의 알파-사슬, 사포린(saporin), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein), 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 식물 또는 미생물 독소, 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A) 같은, 리보좀 비활성화된 단백질로 병합될 수 있다(Kreitman and Pastan(1998) Adv. Drug Delivery Rev. 31:53. ).
다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 적어도 한 개의 본 발명의 인간화 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부분을 포함하고, 인간 CD52에 특이적으로 결합하는 조성물들, 예를 들면, 약학적 및 진단용 조성물을 제공한다. 몇몇의 조성물들은 인간화 항체 또는 본 발명의 항원-결합부분의 조합을 포함할 수도 있다. 또한, 이러한 조성물들은 별개의 분자들로서 하나 또는 그 이상의 다른 생물학적으로 활성된 분자들, 예를 들면, 적어도 본 발명의 하나의 인간 적응된 단일클론 항체와 또 다른 생물학적으로 활성된 분자의 조합들을 구성할 수도 있거나, 또는 예를 들면 본 발명의 두 개 또는 그 이상의 인간화 항체이거나, 하나 또는 그 이상의 다른 생물학적으로 활성된 분자들의 조합중의 어느 것이든 이중특이적 또는 다가특이적 분자들같이 같은 분자 내에서 하나 또는 그 이상의 다른 생물학적으로 활성된 분자들을 갖는 조성물을 포함할 수도 있다.
생체 내(in vivo ) 방법에서, 상기 인간화 항체, 또는 이의 항원-결합부분(또는 발명의 이중특이적(bispecific) 또는 다가특이적 분자들)은 CD52+ 세포 관련 질환을 앓고 있는 인간 개체, 또는 본 발명의 인간화 항체를 사용하는 치료방법에 의해 개선 또는 예방될 수 있는 질병에 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 인간화 단일클론 항체 조성물은 예를 들면, 항암치료와 같은 다른 알려진 치료, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환의 치료, 또는 다발성 경화증의 치료에 조합물로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 개체에게 약학적 담체와 같이 인간화 항체의 약학적 조성물의 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 인간 CD52-관련된 질환을 진단하기 위한, 시료(sample)에서 인간의 CD52 항원의 존재를 시험관 내 또는 생체 내에서 검출을 위한 본 발명의 항체의 사용방법을 제공한다. 몇 가지 방법에서, 상기 항체 및 인간 CD52 사이의 복합체 형성이 가능하도록 하는 조건 하에서, 본 발명의 인간화 단일클론 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분(또는 이중 특이성 또는 다가특이성 분자)를, 대조군 시료와 함께, 실험하기 위한 시료에 접촉하여 수득하였다. 복합체 형성은 그런 다음 실험 시료에서 검출되어지고(예를 들면, ELISA를 사용해서), 대조군과 실험 시료 간의 복합체의 형성에서 어떠한 통계적으로 유의한 증가는 실험 시료에서 인간의 CD52 항원을 나타내는 존재를 나타낸다.
본 발명의 범위 내에서 간주되어야 하는 어떠한 용도 및 조성물에 의해서 인간화 항체가 인간 CD52 항원에 결합하는 모든 경우에서, 본 발명의 인간화 항체가 본 발명에서 기재된 것을 넘어 추가적인 용도 또는 조성물을 가질 것임은 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명의 인간화 항체의 가변영역 서열(서열번호 20 내지 서열번호 28) 또는 본 발명의 인간화 항체의 CDR(서열번호 5 내지 서열번호 10)은 어떠한 변종(variants)이 본 발명의 범위 내에서 어떠한 변종이 간주되어야 하고 본 발명의 인간화 항체의 특징이 유의적으로 변하지 않는 것임은 당업자에 의해 이해될 것이다. 나아가, 인간화 항체의 가변영역 또는 CDR 서열 내에서 이러한 변종들은 본 발명의 인간화 서열의 유의적인 상동성(homology)을 가지는 어떠한 변형인 본 발명의 범위에서 고려되어야 한다. 예를 들면, 변종 핵산은 본 발명의 핵산에 엄격한 조건 하에서 혼성화(hybridise) 할 수 있는 능력에 의해 결정되는 것 같이 서열번호 11 내지 서열번호 19를 포함하거나 매우 동일한 서열을 포함하는 본 발명의 범위 내에 있음이 판단될 수 있다. 하나의 실시예에서, 핵산서열은 발명의 범위(서열번호 11 내지 서열번호 19와 같이) 내에서 핵산에 엄격한 조건 하에서 혼성화(hybridise) 할 수 있는 기능에 의해 본 발명의 범위 내에서 결정될 수 있다(예를 들면, 서열번호 11 내지 서열번호 19와 실질적으로 동일). 상기 용어 “혼성화”는 결합, 양면 결합(duplexing), 또는 그 서열이 복합의 혼합물(예를 들어 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 내에 존재할 때 엄격한 혼성화 조건에서 특정한 뉴클레오티드(nucleotide) 서열로 분자의 혼성화를 의미하며, 상기 특정 뉴클레오티드 서열은 적어도 백그라운드(background)의 약 10 배에서 검출된다. 엄격한 혼성화 조건은, 예를 들면, 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대해 열 녹는 점(thermal melting point, Tm)보다 5 내지 10℃ 낮은 점에서 선택될 것이다. 이는 또한 본 발명의 인간화 항체가 ADCC 및 CDC를 증진시키기 위하여 중쇄 불변영역이 변경될 수 있음이 이해될 것이다. ADCC의 증가를 위해서, 인간화 항체의 푸코오즈(fucose)-결손된 형태는 변종 CHO 세포주인, Lec 13(Shields et al., J Biol Chem 277(2002) p26733-26740), 래트 하이브리도마(hybridoma) 세포주인, YB2/0(Shinkawa et al., J Biol Chem 278(2003) p3466-3473), 및 a-1,6-푸코실전달효소(a-1,6- fucosyltransferase, FUT8) 넉아웃 CHO 세포주(Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng 87(2004) p614-622)를 포함하는 어떠한 포유류 세포에서 항체의 발현을 통해 제작될 수 있다. 중쇄 불변영역의 대체적인 변이는 Shields et al., J Biol Chem 276(2001) p6591-6604 및 Lazar et al,. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(2006) p4005-4010에 기재된 바와 같이 ADCC를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 중쇄 불변영역의 대체적인 변이는 예를 들어 혼합된 인간 IgG1/IgG3 동종(isotype)의 항체의 사용과 같이, CDC의 향상을 위해 사용될 수 있다.
특히 캠패스-1H(Campath-1H; Zhiqiang An, ibid)의 임상적 연구와 같이 다른 곳의 선례(precedent)로부터, 인간 CD52 항원에 결합하는 항체는 환자 내에서 근본적으로 면역성이고, 바람직하게는 CD4+ T 세포 항원결정기로부터 항체로의 공동-촉진 신호로서, CD4+ T 헬퍼 세포의 반응 및 면역원성을 야기하도록 작용하는 항-CD52 항체의 내재 독성에 기인하여, 당업계의 숙련자에 의해 이해될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 항체는 혈액(실시예 9 참고)에서 시험관 내 연구를 통해 상기 CD4+ T 헬퍼 세포 반응이 매우 전혀 없고 낮은 CD4+ T 세포 반응(인간 T 세포 분석에서 T 세포 반응이 4% 이하)이 상기 항-CD52-항체에서 신규한 것으로 당업계의 숙련자에 의해 이해될 수 있다.
실시예( Examples )
실시예에서 언급되는 상업적으로 이용 가능한 시약은 달리 명시되지 않는 한 제조 업체의 지침에 따라 사용하였다. 실시예 및 명세서상에서 ECACC 기탁 번호(acession number)로서 지정된 세포의 근원은 유럽 세포주 은행(European Collection of Cell Culture; ECACC), 솔즈베리, 영국이다. 다르게 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되어지는 바와 동일한 의미를 가진다. 바람직한(Exemplary) 방법 및 재료를 하기 기술하였으나 여기 기술된 것은 동일 또는 유사한 방법 및 재료를 본 발명의 실시(practice) 및 실험(testing)에 또한 사용할 수 있다. 재료, 방법 및 실험예는 단지 설명만 하는 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 마우스 단일클론 항체의 발생( Generation )
CD52 펩타이드(GQNDTSQTSSPSC)는 주문제작하여 합성되었고 KLH 또는 BSA중 어느 하나와 펩티드 N-말단이 풀려나 떨어진 말레이미도카프로일-N-하이드록시숙시니마이드 링커(maleimidocaproyl-N-Hydroxysuccinimide linker)(Mimotopes, Wirral, Cheshire UK)를 통해와 결합하였다. 라지(Raji) 및 HuT78 세포는 ECACC에서 구입하였다. CD52를 발현하는 NSO 세포주는 하기와 같이 발생되었다: 인간 CD52를 암호화하는 DNA(NCBI 출처 서열: NM_001803.2)(N-말단 신호 펩타이드, C-말단에 나타난 GIP-닻 신호 펩타이드 및 성숙한 GPI-고정된 표면 펩타이드를 포함하는 전장(full length) 서열은 PCR을 증폭되었고 pANT 항체 발현 벡터 내로 BglII 및 EagI 위치를 통해 서브클로닝(subcloning)되었다(도 1a). CD52 유전자의 전사는 CMV I/E 프로모터(US5168062 및 US5385839, 아이오와 대학교)의 조절 하에서 이루어졌다. 변이체 dhfr 꼬마유전자(minigene)를 포함하는 pANT 발현 플라스미드(Simonsen & Levinson 1983, PNAS 80:2495-2499)는 SV40 프로모터 및 진핵 선별에 대한 β-락타마제(β-lactamase, ApR) 유전자와 마찬가지로 원핵세포 내에서 선별을 위한 polyA 서열 및 진핵세포 내에서 증식을 위한 복제의 pMB1 기원(origin)의 조절 하에서 이루어졌다. 발현 플라스미드는 E.coli XL1-blue(Stratagene Cat. No. 200130)에서 번식되었다(propagated). 안정적인 CD52 발현 세포주는 전기천공법(electroporation)을 통해 NS0 세포에 형질감염하여 200 mM 메토트렉세이드(methotrexate)의 선별 하에서 나타내는 세포로서 수득되었다. 세포는 성장되어 확장된 다음 CD52 발현에 대한 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 검사되었다. CD52 고발현 세포주는 정착되어 하기에 기재된 바에 따라 마우스에 면역을 위해 사용되었다.
암컷 Balb/c 마우스는 50 ㎍의 CD52 펩티드-KLH을 혼합한 완전 프로인트 항원보강제(Complete Freund? Adjuvant, CFA) 를 비복내(intraperoneal, i. p.) 주사를 통해 일차 면역되거나, 1 X106 CD52를 발현하는 RAJI 세포를 포함하는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 일차 면역되었다. 4 주 후, 모든 마우스는 PBS 내의 106 HUT-78 세포의 i. p. 주사를 통해 촉진되었고 2 주 후에 추가적으로 촉진제 주사하였다. 4 주 후, 모든 마우스는 CD52를 발현하는 3 X 106 NS0 세포를 포함하는 PBS를 사용해서 i. p.로 세 번째 유도를 받았다. CD52를 발현하는 107 NS0 세포를 포함하는 PBS의 이어진 두 번째 촉진은 2 주 간의 간격으로 i. p 주사되었고 몇몇의 마우스는 추가적으로 5 ㎍의 CD52 펩타이드-KLH로 추가적인 유도를 받았다.
골수종 융합(myeloma fusion)에 3 일 앞서, 가장 높은 항체가(antibody titre)를 나타내는 마우스 두 마리는 CD52를 나타내는 107 NS0 세포를 포함하는 PBS의 i.p. 유도를 받았다. 융합하는 날, 두 마우스는 희생되고, 비장(spleen)이 제거되어, 각각의 전체 비장으로부터 세포를 모아, 무혈청(serum-free) 배양 배지로 세척하여 두 개의 동일한 시료로 분리하였다. PEG 매개 융합을 통해 비장 세포의 절반은 F0 골수종 세포에 융합되었고 절반은 P3X63Ag8U.1 골수종 세포에 융합되었다. 1 내지 4 플레이트는 F0 융합 세포를 포함하고 P3X63Ag8U.1 세포를 포함하였다. 복합 융합 배지는 DMEM, 2% L-글루타민(L-glutamine), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 10% 소배아혈청(fetal bovine serum), 5% 브릭클론 하이브리도마 클로닝 배지(BriClone hybridoma cloning medium)(National Institute for Cellular Biotechnology, Dublin, 아일랜드) 및 히포크잔친-아미놉테린-티미딘(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine; HAT)으로 구성된다. 결과된 융합물은 웰 당 200 ㎕씩 96 웰 플레이트로 접종되었다. 접종되지 않은 남은 융합 세포는 최대 3 일까지 배양하여 안정화된 다음, 액체 질소에서 얼려 보관하였다. 접종된 융합 세포는 2 주 동안 37℃ 5% 이산화탄소에서 배양되고, 96 웰 플레이트로 옮겨져서, CD52 펩타이드-KLH ELISA를 사용하여 분비된 항-CD52 항체의 존재를 하기 기재된 바와 같이 확인하였다. 24 개의 면역양성(immunopositive) 웰의 세포는 배양 중에 증폭되어서 CD52 펩타이드 ELISA, NS0-CD52 세포 기반의 ELISA 및 유세포 분석기(flow cytometry)를 통해 CD52 특이적인 항체에 대하여 실험하였다.
CD52 펩타이드의 ELISA를 위하여, ELISA 플레이트(VWR, Lutterworth, UK)를 CD52 펩타이드-KLH, CD52 펩타이드-BSA, KLH 만(only) 또는 BSA 만 중 어느 하나를 0.5 ㎍/㎖로 포함하는 PBS를 100 ㎕/웰로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트는 2% BSA를 포함하는 PBS를 150㎕/웰로 세척 및 차단되었다. 세포 배양 상층액 또는 정제된 항체는 PBS/2% BSA에 희석되었고 100 ㎕가 각각의 플레이트에 추가된 후 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 PBS-트윈(Tween)(0.05%)로 3 회 세척하고1 시간 동안 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈(Horseradish Peroxidase)(Sigma-Aldrich)가 연결(conjugate)된 염소 항-마우스 Ig(Fab-특이적) 100 ㎕/웰과 함께 배양하였다. 플레이트는 PBS-트윈으로 3 회 세척한 다음 시그마패스트(SigmaFast) OPD 기질(Sigma-Aldrich)을 추가하여 색을 발색하기 위하여 암흑의 실온에서 배양되었다. 반응은 3M의 HCl 50 ㎕를 첨가함으로써 중지되었다. 플레이트는 디넥스(DYNEX) 플레이트 리더(reader)(DYNEX, Worthing, UK)를 사용하여 490 nm에서 읽혀겼다. CD52 펩타이드-특이적인 하이브리도마는 CD52 펩타이드-KLH 및 CD52 펩타이드-BSA에 결합하나 KLH 만 또는 BSA 만의 두 경우에서는 그렇지 않았다.
NS0-CD52 세포 기반의 ELISA를 위하여, 3×105 세포/웰(NS0 야생형 또는 CD52를 발현하는 NS0 세포)는 V-바닥 96 웰 플레이트(V-bottom 96 well plate)에 부착(plate out) 되었다. 플레이트는 원심분리 되어, 상층액을 제거하고 플레이트는 흡습지로 물기를 제거되었다. 하이브리도마 시료는 FACS 완충용액(1% BSA 및 0.5% 아지드화 나트륨(sodium azide)를 포함하는 D-PBS)에 2분의 1로 희석되어 각각 NS0(플레이트 1) 또는 NS0-CD52(플레이트 2) 세포를 포함하는 두 플레이트 중 어느 하나로 100 ㎕씩 옮겼다. 실온에서 1 시간 동안 배양한 후, 플레이트는 플레이트를 원심분리하고 원심분리 사이에 200 ㎕ FACS 완총용액으로 세포를 재현탁함으로써 2 회 세척되었다. 원심분리 후, 세포는 1:500 배 희석된 항-마우스 IgG(Fab 특이적)(sigma) 를 포함하는 FACS 완충용액에 재현탁되었다. 실온에서 1 시간 동안 배양한 후, 플레이트는 원심분리하고 세포를 PBS에 재현탁함으로써 2 회 세척하였다. 원심분리 후, 세포는 50 ㎕ PBS에 재현탁되어 ELISA 플레이트로 옮겨졌다. 100 ㎕ TMB 기질(Invitrogen)이 첨가되어 색을 발색하기 위하여 암흑의 실온에서 배양되었다. 반응은 3M의 HCl 50 ㎕를 첨가함으로써 중지되었다. 플레이트는 디넥스 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 읽혀겼다. CD52 특이적인 클론은 NS0 야생형 세포와 비교하였을 때 NS0-CD52 세포에 특이적으로 결합하였다.
분석을 위하여, 3×105 세포의 NS0-CD52 또는 야생형 NS0는 항-마우스 IgG-PE 결합된 항체(Sigma)의 100분의 1 희석액과 함께 항-CD52 하이브리도마 항체의 2 분의 1 희석액을 사용하여 염색되었다. 마우스 IgG(Sigma)는 또한 하이브리도마로서 나타나는 다른 쥣과의(murine) 동형에 대한 분리 대조군(separate control)로서 포함되었다. 세포는 1 시간 동안 4℃에서 염색되었다. 항-마우스 IgG-PE 결합된 항체 뿐인 대조군 또한 포함되었다. 세포는 FACS 완충용액으로 2 회 세척되었고 최종적으로 FASC 완충용액에 재현탁되어 벡톤 딕킨슨 FACS 캘리버(Beckton Dickinson FACSCalibur)(Becton Dickinson, Oxford, UK)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 기계 설정(setting)은 대조적인 동형 대조군 항체의 분석을 통해서 결정되었다.
CD52 펩타이드 ELISA, NS0-CD52 세포-기반의 ELISA 및 유세포 분석의 결과로부터, huCD52 특이적인 하이브리도마가 클로닝되었고, 배양액에서 증폭되어, 모세포 저장액(parental socks)로서 냉동되어 액체 질소에서 보관하였다. 선택된 각각의 하이브리도마는 클로닝 배지에서 희석되어 세포 하나 당 3 웰의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 위치되었다. 클로닝 배지는 DMEM, 2% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 우태아혈청, 5% 브리클론 하이브리도마 클로닝 배지 및 히포크잔틴-티미딘(HT)으로 구성되었다. 배양은 배양 1 주일 후에 신선한 배지를 공급받으면서 클론된 세포와 함께 37℃의 5% 이산화탄소 내에서 2 주 동안 유지되었다. 클로닝 2 주 후에, 모든 접종된 웰 유래의 상층액은 새로운 96-웰 플레이트로 옮겨져 CD52 펩타이드 ELISA 및 유세포 분석기를 사용하여 항-CD52 항체의 존재를 이전에 기재된 바로서 확인하였다. 양성 웰은 배양 내에서 증폭되어 다시 확인되었다. 양성 세포는 추가로 증폭되어 항체 동형에 대하여 확인되었다. 항-CD52 양성 서브클론은 냉동되어, 액체 질소에서 보관되고 추가 연구를 위한 단클론 항체를 위하여 사용되었다.
단클론 항체는 급속 ELISA 마우스 항체 이소타이핑 키트(Rapid ELISA mouse antibody isotyping kit)(Perbio, Cramlington, UK)를 사용하여 동형확인(isotype)되었다. 항체는 1 ㎖ 단백질 A-세파로즈 컬럼(Protein A-sepharose column)(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에서 정제되었다. 정제하기 전에, 튜브 및 단백질 A 컬럼 모두를 0.4M NaOH를 사용하여 파이로젠(pyrogen)을 제거(depyrogenated)하였다. 컬럼은 pH 7.4 PBS의 20 컬럼 부피(column volumes)로 재평형(re-equilibrate)되었다. 하이브리도마 세포 배양 상층액이 수확되었고, 10×PBS 및 멸균된 필터를 사용하여 1×PBS pH 7.4로 조정했다. 여과된 상층액은 0.5 ㎖ / 분에서 단백질 A-세파로즈 컬럼을 통해서 내보내었다. 컬럼은 1X PBS PH 7.4로 세척되었고 IgG는 멸균된 0.1M 나트륨 구연산염 PH 3를 사용하여, 모아진 0.9 ㎖ 분획(fraction)과 같이, 용출되었고 멸균된 1M 트리스-염산 pH 9 의 0.1㎖를 사용하여 중화하였다. 멸균 조건 하에서, 산물은 모든 용출 버퍼를 제거하고 시료를 농축하기 위해서 PBS pH 7.4로 버퍼 교환되었다. 농축 한 후, 항체는 1.4 흡광 계수(EC, 0.1%)를 사용하여 OD 280 nm에서 정량화되었다. 정제된 항체는 4 내지 12%의 누페이지(NuPage) 젤(Invitrogen, Paisley, UK) 및 MES를 가지는 노벡스 누페이지(Novex NuPAGE) 전기 시스템을 사용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 1 ㎍의 항체는 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)을 더 첨가한 4×NuPAGE 시료 버퍼로 준비하고 가열하였다. 젤은 인스턴트블루(InstantBlue) 염색용액(Expedeon, Cambridge, UK)로 염색되었고 분자크기는 페이지룰러 플러스 프래스테인드 프로틴 래더(PageRuler ™ Plus Prestained Protein Ladder)(Fermentas, York, UK)에 염색된 밴드를 비교함으로써 측정되었다. 두 밴드는 오염 상태가 검출되지 않은 각 항체에 대해 확인되었다. 정제된 항체는 CD52 펩타이드 유세포 분석을 사용하여 상기 기재된 바에 따라 확인되었다. 유세포 분석으로부터(도 2), 2E8로 디자인된 우선적 단클론 항체는 NS0-CD52 세포로 선택적으로 결합하는 것을 나타내었다.
실험예 2 - 가변영역 유전자 서열
총 RNA는 RNAqueous-4PCR 키트(Ambion, Warrington, UK)를 사용하여 3 내지 10x106 하이브리도마 세포들로부터 추출되었고 cDNA 합성에 사용되었다. 쥣과의(murine) 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변(V) 영역 단편은 [표 1]에서 기재된 바와 같은 퇴화 마우스 리더 서열(leader sequence) 프라이머(Sigma) 및 유일한 불변 도메인 프라이머(constant domain primers)(sigma)를 사용하여 PCR에 의해 증폭 되었다. PCR 결과 단편은 pGEM-T Easy I 벡터 시스템에(Promega, Southampton, UK)으로 서브클로닝(subcloned) 되었고 삽입체(inserts)는 벡터-특이적 프라이머인, M13Forward(Sigma)를 사용해서 서열분석되었다. 모든 DNA 서열분석은 제네서비스사(Geneservice Ltd. Cambridge, UK)에 의해 실시되었다. 독특한 V-영역 염기 서열은 중쇄 및 경쇄 V 영역에 대하여 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 1 및 서열번호 2로서 나타내었다.
서열 서열 이름
ATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT MuIgVH5'-A
ATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT MuIgVH5'-B
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT MuIgVH5'-C
ATGGCTGTCYTRGBGCTGYTCYTCTG MuIgVH5'-C
ATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT MuIgVH5'-C
ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT MuIgVH5'-D
ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT MuIgVH5'-D
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT MuIgVH5'-D
ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT MuIgVH5'-E
ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT MuIgVH5'-E
ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT MuIgVH5'-E
ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT MuIgVH5'-F
ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT MuIgVH5'-F
ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG MuIgVH5'-F
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG MuIgVH5'-F
CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG MuIgGVH3'-2
ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT MuIgkVL5'-A
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT MuIgkVL5'-B
ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT MuIgkVL5'-C
ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT MuIgkVL5'-D
ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG MuIgkVL5'-D
ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT MuIgkVL5'-E
ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG MuIgkVL5'-E
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC MuIgkVL5'-E
ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG MuIgkVL5'-F
ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG MuIgkVL5'-F
ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG MuIgkVL5'-F
ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT MuIgkVL5'-F
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT MuIgkVL5'-G
ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT MuIgkVL5'-G
ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG MuIgkVL5'-G
ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG MuIgkVL5'-G
ACTGGATGGTGGGAAGATGGA MuIgkVL3'-1
2E8 초가변영역(hypervariable region)의 서열(CDR)은 하기와 같다;
서열번호 5 CDRH1 RYGMS
서열번호 6 CDRH2 MMKTKGGRTYYPDSVKG
서열번호 7 CDRH3 DGYY
서열번호 8 CDRL1 KSSQSLLHSDGKTYLN
서열번호 9 CDRL2 LVSKLDS
서열번호 10 CDRL3 WQGTHLWT
실시예 3 - 키메라 항체의 발생
2E8 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 V 영역 서열은 PCR 증폭 되었고 각각 pANT17 및 pANT13 내로 클로닝된 중쇄 및 경쇄 V 영역과 함께 pANT항체 발현 벡터(도 1b) 내로 서브클론 되었다. 중쇄 V 영역 유전자는 인간의 γ1 중쇄유전자(G1m3(G1M(F)) 동종이형) 과 함께 뼈대(frame)에 있는 mluI 및 HindIII 위치를 통해 pANT17내로 클로닝 되었고 경쇄 V 영역 유전자는 인간 카파 경쇄 불변영역 유전자(KM3 동종이형) 를 가지고 뼈대(frame)의 BssHII 과 BamHI 위치를 통해 pANT13에 클로닝되었다. 중쇄 및 경쇄 유전자 모두의 전사는 CMV I/E 프로모터(US5168062 및 US5385839, 아이오와 대학교)의 조절 하에 있으며 변이체 dhfr의 꼬마유전자를 포함하는 pANT17 플라스미드는 진핵세포에서 선별을 위해 SV40 프로모터 및 polyA 서열의 조절하에 있다. pANT17 및 pANT13 모두는 원핵세포 선택을 위한 베타-락타메즈(β-lactamase)(ApR) 유전자 및 원핵세포에서 증식을 위한 복제의 pMB1 기원(origin)을 포함한다. 모든 플라스미드는 대장균 XL1-블루(Stratagene Cat. No. 200130)에서 증식되었다. pANT 발현 벡터로 클로닝을 위한 가변영역 유전자를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머들은 [표 2]에 나타내었다.
서열 서열 이름
ctgttgctacgcgtgtccactccGAGGTGCACCTGATGGAG 2E8 VH 5’
ctgccccagaaagcttaccTGAGGAGACTGTGAGAGTG 2E8 VH 3’
ggctcccaggcgcgcgatgtGATGTTTTGATGACCCAGAC 2E8 VK 5’
gaattgcgggatccaactgaggaagcaaagtttaaattctactcacgTTTGATTTCCAGTTTGGTGCC 2E8 VK 3’
일시적으로 중쇄 및 경쇄 발현 구축체(construct)는 인산 칼슘(calcium phosphate)-기반의 형질 전환에 의해 HEK293 세포로 동시-형질감염 되거나 전기천공법(electroporation)을 통해 NS0 세포로 안정적인 형질감염되었다. 분비된 항체는 단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography)에 의해 세포배양 상층액으로부터 정제되었다. 실시예 1에서 자세하게 설명한바와 같은 유세포 분석을 사용하여 도 3에서 나타내는 바와 같이, 2E8 항체의 희석액은 캠패스-1H과 비교하여 CD52+HuT78 세포로의 결합이 개선되는 양상을 나타내었다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 2E8 항체는 CD52+HuY78 세포로 결합되기 위한 캠패스-1H과 비교했을 때 유세포 분석을 통해 경쟁적인 결합이 개선되는 양상을 나타내었다.
실시예 4 - 항체-의존적인 세포 유도의 독성( Antibody - Dependent Cell -MEDIATED Cytotoxicity , ADCC )
ADCC 분석은 2E8 단클론 항체을 사용하여 하기와 같이 수행되었다. 표적 세포(REH 또는 Raji 세포 중 어느 하나)는 수득되어 25 uM(최종) 칼세인-AM(Calcein-AM)(Sigma)로 전첨가(preload)되었다. 칼세인과 함께 1 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 세포를 칼세인이 첨가되지 않도록 제거하기 위하여 배지에서 세척하였다. 1x104 표적 세포는 2E8 또는 대조군 항체를 포함하는 깨끗한 V-바닥 플레이트에 도 5에서와 같이 또는 도 6에서 묘사된 바와 같이 50 ㎍/㎖ 최종 농도로 첨가되어, 표적세포가 전-옵소닌화(pre-opsonise)되도록 1 시간 동안 배양하였다. PBMC(주효 세포)는 UK 국립 수혈 센터(UK National Blood Transfusion Service; Addenbrooke′s Hospital, Cambridge, UK)로부터 수득된 건강한 군집(community) 공여체 연막(buffy coat)(채취 후 24시간 이내의 혈액으로부터)으로부터 애든부륵 병원 국지적 연구 윤리 위원회(Addenbrooke′s Hospital Local Research Ethics Committee)로부터 인정된 승인에 따라 분리되었다. PBMC는 림포프렙(Lymphoprep)(Axis-Shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리를 통해 연막으로부터 분리되었다. 5x105 주효 세포는 표적 세포 및 항체를 250 ㎕의 최종 부피(주효 세포에 대한 표적세포의 비율이 50:1)로 포함하는 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 시료는 4 시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양되었다. 4 시간 후, 트리톤 X-100(Triton X-100)이 최대 용해 대조군을 수립하기 위하여 세포(주효 세포 및/또는 표적 세포)를 포함하는 대조군 웰에 첨가되었다. 원심분리 후, 150 ㎕ 배지는 각 웰로부터 96 웰 깨끗한-검은 바닥 웰의(clear-bottom black-walled) 플레이트로 이동되어 플레이트 형광은 520 nm에서 측정되었다. 결과는 하기와 같이 나타낸다:
Figure pct00001
도 5는 키메라 2E8(‘ANT01’)에 대하여 유의적으로 증가된 ADCC를 나타내는 표적 CD52+ REH 세포에 대하여 키메라 2E8 및 캠패스-1H를 위한 5 명의 인간 공여자 유래의 PBMS에 대한 평균 ADCC를 나타낸다. 그 뒤에 CD52를 많이 발현하는 변이체 REH 세포주는 모 REH 세포와 비교해서 캠패스-1H의 결합력이 약 2×로 나타내는 FACS를 통해 분리되었다. 도 6은 두 명의 개별적인 공여자 유래의 PBMC를 사용하여 고 CD52+ REH 세포에서 ADCC를 위한 키메라 2E8 및 캠패스-1H의 순차적 희석(dilution series)를 나타낸다. 이는 또한 캠패스-1H와 비교하여 키메라 2E8에 대한 유의적으로 상승된 ADCC 내용(profile)을 나타낸다.
CDC 분석은 2E8 단클론 항체을 사용하여 하기와 같이 수행되었다. 표적 세포(REH 또는 Raji 세포 중 어느 하나)는 수득되어 5x104 세포/웰이 검은-웰의, 깨끗하고 평평한-바닥의 96 웰 플레이트에 첨가되었다. 도 7에서 나타낸 바와 같은 최종 농도에 대하여 2E8 또는 대조군 항체는 웰 당(최종 혈청 농도 25%) 활성화되거나 가열 불활성화(60℃에서 30분 동안)된 인간 혈청(Pathway Diagnostics Ltd, Dorking, UK) 중 어느 하나가 함께 첨가되었다. 시료는 3 시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양되었다. 4 시간 후, 트리톤 X-100이 최대 용해 대조군을 수립하기 위하여 세포를 포함하는 대조군 세포에 첨가되었다. 프레스토블루(Prestoblue)(10X) 세포 생존률 시약(cell viablity reagent)(Invitrogen)은 분석 생장 배지로 희석되어 최종 프레스토블루의 10 분의 1 희석됨을 얻도록 각 웰에 첨가되었다. 1 시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양된 후, 플레이트 형광은 520 nm에서 측정되었다. 결과는 하기와 같이 나타낸다:
Figure pct00002
도 7은 캠패스-1H과 비교해서 키메라 2E8에 대하여 유의적으로 증가된 CDC 내용을 나타낸다.
실시예 6 - 인간화 항체의 생성
인간화 항체는 EP1844074(Antitope Ltd)에 기재된 방법을 사용하여 발생되었다. 마우스 2E8 영역의 구조적 모델은 스위스 PDB(Swiss PDB)를 사용하여 제조되어 항체의 CD52 결합 성질에 대하여 중요할 것으로 예상되는 중요 아미노산(‘속박잔기(constraining residues)’)을 확인하기 위해 분석되었다. 인간 V 영역 서열의 데이터베이스는 인간화 항체의 디자인에서 사용된 각각의 속박잔기를 포함하는 인간 V 영역 서열의 절편을 확인하기 위해 사용되었다. 전형적으로 두 개 또는 그 이상의 대체적인 V 영역 서열 절편은 2E8에 대한 인간화 항-CD52 V 영역 서열의 가능한 절편의 큰 범주 내에서 결과된 각각의 속박 잔기를 제공하기 위해 사용되었다. 이러한 서열은 그런 다음 Fothergill 등(WO9859244, Eclagen Ltd 출원)에 기재된 바를 따르는 인실리코(in silico) 분석에 의해, 비-생식계역(non-germline) MHC 글래서 II 펩티드 결합의 예측에 대하고 또한 “면역 항원결정기 데이터베이스 및 분석 재료(Immune Epitope Database and Analysis Resource)”, http://www. immuneepitope. org / 를 포함하는 데이터베이스를 사용하여, 알려진 CD4+ T-세포 항원결정기에 대하여 분석되었다. 예상된 비-생식계역 MHC 클래스 II 결합 펨타이드, 또는 유의적으로 T 세포 항원결정기 데이터베이스에 대하여 공격하는(hit) V 영역 서열은 제거되었다. 이는 V 영역 서열의 감소된 조합을 결과하였다. 그런 다음 V 영역 서열 부분(segment)의 선택된 조합은 인간화 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 제조하기 위해 조합되었다. 5 개의 중쇄 및 4 개의 경괘 서열(각각 VH1 내지 VH5, 및 Vκ1 내지 Vκ4로 디자인됨)은 2E8(각각 서열번호 20 내지 24 및 25 내지 28)에 대하여 선택되었다.
인간화 변이체 V 영역을 암호화하는 DNA는 실시예 3에 기재된 바에 따라 합성되어 pANT17 및 pANT13 발현 벡터 내로 서브클로닝되었다(도 1). 인간화 VH 및 Vκ 사슬의 모든 조합(예를 들어 2E8에 대한 전체 20 쌍(pariring))은 일시적으로 HEK293 세포 내로 형질감염되거나 또는 또한 NS0 세포 내로 형질감염되었고, 항체는 실시예 3에 기재된 바에 따라 배양 상층액으로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의하여 정제되었다.
실시예 7 - 인간화 항체의 분석
CD52 펩타이드로 HEK-유래, NS0-유래 2E8 인간화 변이체의 결합은 모체 키메라 항체에 대한 경쟁 ELISA로 측정하였다. 모체 2E8 키메라 항체들은 바이오틴 TagTM 마이크로 바이오티닐레이션 키트(Biotin TagTM Micro Biotinylation kit; Sigma-Aldrich)를 사용하여 바이오틴화 되었다. 96 웰 멕시소프(MaxiSorp) 플래이트(NUNC)는 4℃ 하룻밤 동안에 듈베코(Dulbecco)의 PBS(100 ㎕ 최종 부피)에 0.025 ㎍/㎖ CD52 펩타이드-KLH로 코팅하였다. 플레이트는 듈베코의 PBS-2% BSA로 1 시간 동안 실온에서 차단되었다. 플레이트는 세척버퍼(Dulbecco's-PBS에 0.05% Tween20)로 3 회 세척하였다. 다양한 농도의 실험 인간화 항체를 바이오틴화된 모체 키메라 항체(0.035 ㎍/㎖ 최종농도)와 미리 혼합시킨 다음에 CD52 펩타이드-KLH 플레이트(100 ㎕ 최종부피)에 첨가했다. 모든 시료는 2 회 반복 실험되었다. 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 배양하였고 세척버퍼로 3 회 세척하였다. 스트렙타비딘(Streptavidin) HRP(Sigma-Aldrich)의 1000분의 1 희석액 100 ㎕를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트는 세척버퍼로 3 회 세척하고 TMB 기질(Invitrogen 사) 100 ㎕를 추가하여 색을 발색하기 위하여 암흑의 실온에서 배양되었다. 반응은 3M의 HCl 50 ㎕를 첨가함으로써 중지되었다. 플레이트는 디넥스 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 읽혀겼다.
도 8에서 나타난 바와 같이, 모든 리드 인간화 2E8 변이체는 모체 키메라 항체와 유사하게 경쟁적인 결합 형태를 나타낸다. 인간화 항체는 순차적으로 실시예 1에서 기재된 바와 같이 유세포 분석을 통해서, 실시예 4에서와 같이 ADCC을 통하고, 실시예 5에서와 같이 CDC를 통해서 확인되었다. 도 9에서 나타난 바와 같이, 인간화된 변이체는 유세포 분석을 통해 REH 세포에 결합하기 위한 캠패스-1H에 비해 개선된 결합 형태를 나타내었다. 도 10 및 11에서 나타난 바와 같이, 인간화된 변이체는 또한 캠패스-1H과 비교하여 표적:주효 세포의 비율이 50:1인 ADCC에 대한 REH 표적 세포 또는 CDC(실시예 4에서 나타난 바와 같음)에 대한 고(high) CD52+ REH 세포주를 사용하여 개선된 ADCC 및 CDC 형태를 나타내었다.
실시예 8 - scFv's 및 Fab's 의 생성
벤하(Benhar I.)와 라이터(Reiter Y.), 면역학 내의 현재 프로토콜(Current Protocols in Immunology), 유니트(Unit) 10.19B, 윌리온라인 라이브러리(Wiley Online Library), 2002 년 5월(http://www.currentprotocols.com/protocol/im1019 b)에서 pCANTAB5E 벡터 RPAS 발현 모듈(Module)(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 사용하여 기재된 바와 같이 실시예 6 유래의 인간화 2E8 항체는 scFv's로 변환되어 M13 파아지 디스플레이 벡터(phage display vector) 내로 클로닝하였다. 인간화 VH 및 VK 유전자는 SfiI 및 NotI 제한효소 위치, 내부 Gly4Ser 링커 및 C 말단 his6 태그가 제공되는 프라이머를 사용하여 증폭되었다.
scFv 구조체(construct)는 SfiI-NotI 절편으로 pCANTAB5E 벡터로 삽입되었고 대장균 HB2151로 형질전환(transformed)되어 세포질(periplasm) 및 부분적으로 생장 배지로 방출된 scFv가 결과되었다. scFv's는 HIS-선택 HF 카트리지(HIS-Select HF Cartridges)(Sigma-Aldrich)를 사용해서 니켈 킬레이트 친화성 크로마토그래피(nickel-chelate affinity chromatography)에 의해 생장 배지로부터 정제되었다. 정제된 scFv's는 실시예 7에 자세히 설명한 바로써 CD52 펩타이드에 대하여 경쟁 분석을 확인하였고 모든 인간화 scFV는 CD52 펩타이드로 경쟁적 결합을 나타내었다. 실시예 6 유래의 인간화 2E8 변이체는 또한 디시스트론(dicistronic) Fab 유전자를 야기하는 상류 VH-CH1 및 하류 VK-Cκ 유전자 절편 사이에 추가적으로 22 아미노산 pelB 리더 서열(leader sequence) (Lei S. P. et al., J Bacteriol. 169 (1987) p4379-4383)을 갖는 이런 절편과 결합하는 프라이머로 추가적으로 증폭된 VH- CH1 및 VK-Cκ 절편을 형성하기 위해 추가적으로 CH1 및 Cκ 불변영역 유전자로 증폭된, 증폭된 인간화 VH 및 VK dbwjswksms scFv`s 제외에 대하여 사용된 방법을 사하여 Fab`s로 전환되었다. 인간화 2E8 변이체 유래의 Fab's 가 생성되었고 scFv's에 대해 상기와 같이 정제하여 실험예 7에서 자세히 설명된 대로 CD52 펩타이드 경쟁에서 확인되었다. 모든 인간화된 Fab`s는 CD52 펩타이드에 경쟁적 결합을 나타내었다.
실시예 9 - CD4 + T 세포 반응의 분석
PBMC는 UK 국립 수혈 센터(UK National Blood Transfusion Service; Addenbrooke′s Hospital, Cambridge, UK)로부터 수득된 건강한 군집(community) 공여체 연막(buffy coat)(채취 후 24시간 이내의 혈액으로부터)으로부터 애든부륵 병원 국지적 연구 윤리 위원회(Addenbrooke′s Hospital Local Research Ethics Committee)로부터 인정된 승인에 따라 분리되었다. PBMC는 림포프렙(Lymphoprep)(Axis-Shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리를 통해 연막으로부터 분리되어 CD8+ 세포는 CD8+ 로데트셉™(RosetteSep™)(StemCell Technologies Inc, London, UK)을 사용하여 제거되었다.
단핵구 유래 수지상 세포(DC)를 준비하기 위해서, 50 명의 다른 기증자의 PBMC가 전체 세계 인구의 빈도와 유사한 HLA-PR 및 HLA-DQ의 동종이형의 빈도들의 분포를 제공하기 위해 선정되었다. PBMC는 AIM-V® 배양 배지에서 재생되어 CD4+ 세포는 밀테니 CD14 마이크로비드(Miltenyi CD14 Microbeads) 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotech, Oxford, UK)을 사용하여 분리하였다. 단핵구는 4 내지 6×106 PBMC/㎖로 1000 U/㎖ IL-4 및 1000 U/㎖ GM-CSF를 첨가한 AIM-V® 배양 배지(“DC 배양 배지”)에 재현탁한 다음에 24 웰 플레이트에 나누었다(2 ㎖ 최종 부피). 세포는 2 일째에 절반 부피의 DC 배양 배지 변화에 의해서 공급되었다. 3 일 째, 단핵구는 40 ㎍/㎖의 캠패스-1H, 키메라 2E8 항체, 인간화 2E8 항체, 100 ㎍/㎖ KCH 또는 배지만(only) 중 어느 하나와 전-배양된 반-성숙(semi-mature) DC로 분화되었다. 반-성숙 DC는 초과 실험군 항체는 세포를 2 회 세척하고 50 ng/㎖ TNF-α(Peprotech, London, UK)가 첨가된 DC 배양 배지으로 재현탁함으로써 제거된 후 24 시간 동안 항원과 배양되었다. DC는 8일째에 성숙한 DC를 수득하기 전에 반 볼륨 DC 배양 배지(50 ng/㎖ TNFα첨가됨) 변화로 7일째에 공급되었다. 수득된 성숙한 DC는 계수되었고 생존력은 트립판 블루 염색 제외(trypan blue dye exclusion)를 사용하여 평가하였다. DC는 γ-방사능(4000 rads) 처리하여 ELISpot 및 확산 분석에 사용하기 전에 AIM-V® 배지에서 ㎖ 당 2x105 세포에 재현탁했다. 추가로, 8 일 째에, 신선한 CD4+ T 세포 또한 준비되었다. CD4+ T 세포를 정제하기 위해, PBMC는 AIM-V® 배양 배지에서 재생되어 CD4+ 세포는 밀테니 CD14 마이크로비드(Miltenyi CD14 Microbeads) 및 LS 컬럼(Miltenyi Biotech, Oxford, UK)을 사용하여 분리하고 2×106 세포/㎖로 AIM-V®에 재현탁되었다.
8 일째에, T 세포 증식 분석이 수립되었으며 1×105 자가유래(autologous) CD4+ T 세포는 AIM-V® 배지가 최종 볼륨(200 ㎕/well)이 되도록 첨가된 상태에서, 96 웰-바닥(U-bottomed) 플레이트 내의 1×104 인간화 2E8 또는 키메라 2E8 항체(10:1 비율)로 첨가되었다. 14 일째에는, 분석 플레이트를 탐테크마하 마하 III(TomTec Mach III)(Hamden CT, USA) 세포수확기를 사용하는 필터 매트(Perkin Elmer)에서 수득하기 전에 25 ㎕ AIM-V에서 6 시간 동안 웰 당 1uCi [3H](Perkin Elmer, Beaconsfield, UK)로 펄스하였다.
각 웰에 대한 분당 카운트(Counts per minute; CPM)는 낮은 배경 계수를 가진, 파라룩스(paralux)에 있는 1450 마이크로베타 왈락 트리룩스(Microbeta Wallac Trilux) 액체 신틸레이션 계수기(Scintillation Counter)(Perkin Elmer)에서 멜티렉스(Meltilex ™) 섬광계수에 의하여 측정되었다. 각 항체시료에 대한 분당 횟수는 배지만 있는 대조군으로 표준화되었다.
엘리스팟(ELISpot) 분석을 위해, 엘리스팟 플레이트(Millipore, Watford, UK)는 PBS 내의 100 ㎖/well IL-2 캡처 항체(R&D Systems, Abingdon, UK)로 코팅되었다. 그런 다음, 플레이트는 PBS로 두번 세척하고, 차단 완충용액(PBS에 1 % BSA(Sigma))에서 하룻밤 배양하였고 AIM-V　배지로 세척하였다. 8 일째에, 1x105 자가유래 CD4+ T 세포는 96 웰 엘리스팟 플레이트 내의 DC가 가해진 1x104 항원(1:10 비율)에 첨가되었다. 모든 준비(preparations)는 섹스튜플렛 배양으로 수행되었다. 각각의 기증 PBMC에 대하여, 음성 대조군(AIM-V® 배지 단독), 세포가 없는 대조군 및 PHA(10 ㎍/㎖) 양성 대조군도 함께 포함되었다.
추가적인 7 일간의 배양기간 후, 엘리스팟 플레이트는 PBS/1% BSA 내의 100 ㎖ 여과된 바이오틴화된 검출 항체(R&D Systems, Abingdon, UK)의 첨가 동안에 dH2O 및 PBS로 3 회 연속 세척을 통해 전개되었다. 37℃에서 1.5 시간 동안 배양한 후, 플레이트는 추가로 PBS로 3 회 세척하였고 PBS / 1% BSA 내의 여과된 스트렙타비딘-AP(streptavidin-AP (R&D Systems) 100 ㎖이 1 시간 동안 첨가되었다(상온에서 배양). 스트렙타비딘-AP가 제거되고 플레이트는 PBS로 4 회 세척되었다. BCIP/NBT(R&D Systems)은 각 웰에 첨가되고 실온에서 30 분 동안 배양되었다. 스팟 전개는 웰 및 웰의 백(back)을 dH2O로 세 번 세척하여 중지되었다. 건조된 플레이트는 이뮤노스캔(Immunoscan ™) 분석기에 스캔 되어 웰당 스팟(spots per well; spw)은 이뮤노스캔 버전 4 소프트웨어를 사용하여 측정되었다.
증식 및 IL-2 엘리스팟 분석 모두에 대하여, 결과는 양성 T 세포 반응에 대하여 2 보다 같거나 큰(SI = 2.0) SI의 임계값을 사용하여 배지-단독 대조군(medium-only control)에 대한 실험 항체에 대하여 CPM(증식 분석) 또는 스팟(ELISPOT 분석)의 비율로서 정의된 자극 지수(stimulation Index; SI)로 표현되었다. 결과는 캠패스-1H 및 키메라 2E8 항체 모두가 V 영역으로부터 T 세포 반응을 제거하는 인간화 과정의 효율성을 나타내어, 실험된 50 명의 기증자 PBMC의 10 또는 그 이상의 T 세포 반응(>=20%)을 포함하는 반면 인간화 2E8 항체는 50 명의 기증자 중 2 명 이상에서 T 세포 반응을 포함하는 것이 없는(<=4%) 것을 나타낸다.
실시예 10 - 직접적인 독성 분석
항-인간 CD52 항체의 직접적인 독성 효과는 각각 세포 자살(apoptosis) 및 괴사(necrosis)의 마커로서 아넥신 V/프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide)의 공동 염색을 사용하여 수행되었다. 1×105 REH 세포는 100 ㎍/㎖ 항-인간 CD52 실험 항체 또는 동형의 일치하는 대조군 항체인 +/- 100 ㎍/㎖ F(ab′)2 공유결합된 항체(Jackson ImmunoResearch, Cat no. 109-006-008)(최종 부피 600 ㎕)의 존재에 위치되었다. 세포는 72 시간 동안 배양되어 먼저 PBS/2%BSA에서 세척되고 뒤이어 제조자의 추전하는 프로토콜((Invitrogen, Cat no. V13245)에 따라 아넥신 V/프로피디움 요오드화물로 공동-염색되었다. 스캐터플롯(Scatterplot)은 FACS 분석을 사용하여 만들어져 생세포(비염색된), 자살된 세포(FL1, 아넥신 V 양성) 및 괴사 세포(FL1, 아넥신 V 양성 & FL3, 프로피디움 요오드화물 양성)의 정량값에 대하여 세 영역으로 분리되었다. 도 13에서 나타난 바와 같이, 인간화 2E8 항체는 캠패스-1H에 대한 19.9%과 비교하여 인간화 항체로부터 >40%의 괴사 세포로서, REH 표적 세포의 캠패스-1H에 대하여 증가된 세포 자살 및 괴사를 나타내었다.
실시예 11 - 종양 동물 모델
종양동물 모델은 종양성장 억제에 대한 항-인간 CD52 항체의 생체 내 분석을 위해 사용되었다. 상기 모델에서, Raji 인간 벌키트 림프종 세포는 SCID 마우스 내로 위치하였고 동물은 항-인간 CD52 항체로 처리되었다. 7 주령의 암컷 폭스 체이스 SCID 마우스(Fox Chase SCID Mice)(Charles River, Morrisville, North Carolina, USA)는 볼루스 꼬리-정맥(bolus tail-vein; i.v.) 주사를 통해 1×106 Raji 세포(American Type Culture Collection, 0. 2 ㎖ 세포 혼탁액)으로 주입되었다. 항-인간 CD52 실험 항체 또는 동형의 일치하는 대조군 항체는 종양 세포 주입 이후 개시 3 일에, 복강내(intraperitoneally; i.p.)로 7 투여량(dose)에 대하여 격일로 하루 한 번씩 각각 투여되었다. 정해진 주 2회로, 10 ㎖/kg 투여 부피(0.20 ㎖/20 g 마우스)는 각각 동물의 체중으로 조정되었다. 도 14에서 나타난 결과는 캠패스 1H와 비교하여 리드 VH3/VK4 항-CD52 항체(V 영역 서열번호 22 및 28)을 통해 1 및 10 mg/kg 투여량 모두에서 개선된 생존률을 나타내었다.
서열( sequencing )
>SEQ ID No. 1
2E8 마우스 VH DNA
GAGGTGCACCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAATGATGAAAACTAAAGGTGGTAGGACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATCTATTTCTGTGCAAGTGATGGTTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
>SEQ ID No. 2
2E8 마우스 VK DNA
GATGTTTTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTAACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAA
>SEQ ID No. 3
2E8 마우스 VH 아미노산
EVHLMESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLKSEDTAIYFCASDGYYWGQGTTLTVSS
>SEQ ID No. 4
2E8 마우스 VK 아미노산
DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHLWTFGGGTKLEIK
>SEQ ID No. 5
2E8 VH CDR1 아미노산
RYGMS
>SEQ ID No. 6
2E8 VH CDR2 아미노산
MMKTKGGRTYYPDSVKG
>SEQ ID No. 7
2E8 VH CDR3 amino acid
DGYY
>SEQ ID No. 8
2E8 VK CDR1 아미노산
KSSQSLLHSDGKTYLN
>SEQ ID No. 9
2E8 VK CDR2 아미노산
LVSKLDS
>SEQ ID No. 10
2E8 VK CDR3 아미노산
WQGTHLWT
>SEQ ID No. 11
2E8 인간화 VH 변이체 1 DNA
GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCATGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCATCTACTTTTGCGCCTCCGACGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA
>SEQ ID No. 12
2E8 인간화 VH 변이체 2 DNA
GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCATGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTTTTGCGCCTCCGACGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA
>SEQ ID No. 13
2E8 인간화 VH 변이체 3 DNA
GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCATGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCTCCGACGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA
>SEQ ID No. 14
2E8 안간화 VH 변이체 4 DNA
GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCATGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGACGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA
>SEQ ID No. 15
2E8 안간화 VH 변이체 5 DNA
GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCATGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCTCCGACGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA
>SEQ ID No. 16
2E8 인간화 VK 변이체 1 DNA
GACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGACCCTGTCCGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCCAAGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCTGTGGACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAA
>SEQ ID No. 17
2E8 인간화 VK 변이체 2 DNA
GACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGACCCTGTCCGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTCGGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCTGTGGACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAA
>SEQ ID No. 18
2E8 인간화 VK 변이체 3 DNA
GACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTCGGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCTGTGGACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAA
>SEQ ID No. 19
2E8 인간화 VK 변이체 4 DNA
GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTCGGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCTGTGGACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAA
>SEQ ID No. 20
2E8 인간화 VH 변이체 1 아미노산
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLKAEDTAIYFCASDGYYWGQGTTVTVSS
>SEQ ID No. 21
2E8 인간화 VH 변이체 2 아미노산
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAIYFCASDGYYWGQGTTVTVSS
>SEQ ID No. 22
2E8 인간화 VH 변이체 3 아미노산
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAIYYCASDGYYWGQGTTVTVSS
>SEQ ID No. 23
2E8 인간화 VH 변이체 4 아미노산
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASDGYYWGQGTTVTVSS
>SEQ ID No. 24
2E8 인간화 VH 변이체 5 아미노산
EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAIYYCASDGYYWGQGTTVTVSS
>SEQ ID No. 25
2E8 인간화 VK 변이체 1 아미노산
DVLMTQTPLTLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK
>SEQ ID No. 26
2E8 인간화 VK 변이체 2 아미노산
DVLMTQTPLTLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK
>SEQ ID No. 27
2E8 인간화 VK 변이체 3 아미노산
DVLMTQTPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK
>SEQ ID No. 28
2E8 인간화 VK 변이체 4 아미노산
DVVMTQTPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK
<110> Antitope Limited <120> HUMANISED ANTI-CD52 ANTIBODIES <130> 13FPI-11-06_EP <150> US 61/497,005 <151> 2011-06-01 <150> PCT/EP 2012/060345 <151> 2012-06-01 <150> GB 1109238.4 <151> 2011-06-01 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 2E8 Mouse VH DNA <400> 1 gaggtgcacc tgatggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaatg atgaaaacta aaggtggtag gacctattat 180 ccagacagtg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatct atttctgtgc aagtgatggt 300 tactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 2E8 Mouse VK DNA <400> 2 gatgttttga tgacccagac tccactcact ttgtcggtaa ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acatttgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa actggaaatc aaa 333 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 2E8 Mouse VH <400> 3 Glu Val His Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 2E8 Mouse VK <400> 4 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 VH CDR1 <400> 5 Arg Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 VH CDR2 <400> 6 Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 VH CDR3 <400> 7 Asp Gly Tyr Tyr 1 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 VK CDR1 <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 VK CDR2 <400> 9 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 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ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccatct acttttgcgc ctccgacggc 300 tactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtcatca 339 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 3 DNA <400> 13 gaggtgcacc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agatacggca tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaact ggtggccatg atgaagacca agggcggcag aacctactac 180 cccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccatct actactgcgc ctccgacggc 300 tactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtcatca 339 <210> 14 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 4 DNA <400> 14 gaggtgcacc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agatacggca tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaact ggtggccatg atgaagacca agggcggcag aacctactac 180 cccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ctccgacggc 300 tactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtcatca 339 <210> 15 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 5 DNA <400> 15 gaggtgcacc tggtggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agatacggca tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccatg atgaagacca agggcggcag aacctactac 180 cccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccatct actactgcgc ctccgacggc 300 tactactggg gccagggcac caccgtgacc gtgtcatca 339 <210> 16 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 1 DNA <400> 16 gacgtgctga tgacccagac ccccctgacc ctgtccgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtcctccca gtccctgctg cactccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 ctgcagcagc ggcctggcca gtcccccaag cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 tccggcgtgc ccgacagatt caccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcatc tactactgct ggcagggcac ccatctgtgg 300 accttcggcg gaggcacaaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 17 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 2 DNA <400> 17 gacgtgctga tgacccagac ccccctgacc ctgtccgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtcctccca gtccctgctg cactccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 ctgcagcagc ggcctggcca gtctcctcgg cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 tccggcgtgc ccgacagatt caccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcatc tactactgct ggcagggcac ccatctgtgg 300 accttcggcg gaggcacaaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 18 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 3 DNA <400> 18 gacgtgctga tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtcctccca gtccctgctg cactccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 ctgcagcagc ggcctggcca gtctcctcgg cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 tccggcgtgc ccgacagatt caccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcatc tactactgct ggcagggcac ccatctgtgg 300 accttcggcg gaggcacaaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 19 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 4 DNA <400> 19 gacgtggtga tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtcctccca gtccctgctg cactccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 ctgcagcagc ggcctggcca gtctcctcgg cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 tccggcgtgc ccgacagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcatc tactactgct ggcagggcac ccatctgtgg 300 accttcggcg gaggcacaaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 1 <400> 20 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 21 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 2 <400> 21 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 3 <400> 22 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 4 <400> 23 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VH Variant 5 <400> 24 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Met Met Lys Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 1 <400> 25 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E8 Humanised VK Variant 2 <400> 26 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 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Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (26)

  1. 하기 군으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 CDR서열을 포함하는 항- CD52 항체 ;
    (i) 서열 RYGMS(서열번호 5)를 포함하는 CDRH1 ;
    (ii) 서열 MMKTKGGRTYYPDSVKG(서열번호 6)를 포함하는 CDRH2 ;
    (iii)서열 DGYY(서열번호 7)를 포함하는 CDRH3 ;
    (iv) 서열 KSSQSLLHSDGKTYLN(서열번호 8)을 포함하는 CDRL1 ;
    (v) 서열 LVSKLDS(서열번호 9)를 포함하는 CDRL2 ; 및
    (vi) 서열 WQGTHLWT(서열번호 10)를 포함하는 CDRL3.
  2. 중쇄 가변영역에 대해 서열번호 20 내지 24를 구성하는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 가변영역 서열과 짝지어 경쇄(light chain) 가변영역(variable region)에 대해 서열번호 25 내지 28로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 서열을 포함하는 항-CD52 항체.
  3. 중쇄 가변영역로서 서열번호 22와 짝지어 경쇄 가변영역에 대해 서열번호 28를 포함하는 항-CD52 항체.
  4. 인간 개체군(population) 유래 HLA-DR 동종이형(allotype)의 분포를 갖는 50 명의 인간의 혈액 시료 내에서 CD4+ 보조 T 세포 반응의 유도를 위해 생체 외에서 시험할 때, 4% 이하(＜＝)의 T 세포 반응을 유발하는, 제 1항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항-CD52 항체.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서, 상기 가변영역 서열을 인간 항체 가변영역 내의 서열로부터 전적으로 유래되는 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제 5항에 있어서, 인간 불변영역과 함께 가변영역으로 구성되는 항체.
  7. 제 6항에 있어서, 인간 중쇄 불변영역은 동종(isotype) IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 변이된 IgG 불변영역이고, 및 인간 경쇄 인간 불변영역은 동종 카파(kappa)인 항체.
  8. 제 6항에 있어서, 인간 불변영역가 IgG1 및 카파인 항체.
  9. 제 6항에 있어서, 인간 불변영역가 IgG4 및 카파인 항체.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 scFv 또는 Fab인 항체.
  11. 제 1 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD52에 특이적으로 결합되는 다가특이적(multispecific) 단백질의 구성요소이고, 추가적으로, 하나 또는 그 이상의 다른 분자와 결합 또는 상호작용하는 항체.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide).
  13. 제 12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 제 13에 있어서, 상기 벡터는 발현벡터인 벡터.
  15. 제 13항 또는 제 14항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵세포(prokaryotic)인 숙주세포.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 숙주세포는 진핵세포(eukaryotic)인 숙주세포.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 숙주세포는 포유류(mammalian)인 숙주세포.
  19. 제 1항 내지 11항 중 어느 항의 항-CD52 항체를 포함하는 조성물.
  20. 제 12항의 폴리뉴클레오디드 또는 제 13항 또는 제 14항의 벡터를 포함하는 조성물.
  21. 치료를 필요로 하는 개체에 유효한 양의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 항체, 제 12항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 19항 또는 제 20항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 CLL 및 다른 백혈병(leukemias); 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관염(vasculitis), 근염(myositis) 및 당뇨병(diabetes)을 포함하는 자가면역 질환(autoimmune diseases); 및 기관 이식 거부반응(organ transplant rejection) 및 이식 편대 숙주 질병(graft-vs-host disease)을 포함하는 질병의 치료 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 유효한 양의 화학치료 제제(chemotherapeutic agent)를 병용 투여(co-administering) 하는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
  23. 제 21 또는 22항의 어느 항에 있어서, 유효한 양의 약학적 담체(pharmaceutical carrier)를 추가적으로 병용 추여 하는 것을 포함하는 방법.
  24. 인간 CD52가 관련된 질병의 진단을 위해 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 항체를 사용하여 시료 내의 인간 CD42 항원의 존재를 검출하는 방법.
  25. 인간 CD52가 관련된 질병의 진단을 위해 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 사용하여 시료 내의 인간 CD42 항원의 존재를 검출하는 방법.
  26. 인간 개체군(population) 유래 HLA-DR 동종이형(allotype)의 분포를 갖는 50 명의 인간의 혈액 시료 내에서 CD4+ 보조 T 세포 반응의 유도를 위해 생체 외에서 시험할 때, 4% 이하(＜＝)의 T 세포 반응을 유발하는 항-CD52 항체.
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