BRPI0812691B1 - Anticorpos anti-cd79b, imunoconjugado, composições farmacêuticas, método de inibição do crescimento de uma célula que expressa cd79b, método de determinar a presença de cd79b e usos de um imunoconjugado - Google Patents

Anticorpos anti-cd79b, imunoconjugado, composições farmacêuticas, método de inibição do crescimento de uma célula que expressa cd79b, método de determinar a presença de cd79b e usos de um imunoconjugado Download PDF

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BRPI0812691B1
BRPI0812691B1 BRPI0812691-7A BRPI0812691A BRPI0812691B1 BR PI0812691 B1 BRPI0812691 B1 BR PI0812691B1 BR PI0812691 A BRPI0812691 A BR PI0812691A BR PI0812691 B1 BRPI0812691 B1 BR PI0812691B1
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BR
Brazil
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antibody
seq
sequence
cd79b
hvr
Prior art date
Application number
BRPI0812691-7A
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English (en)
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Yvonne Chen
David Dornan
Kristi Elkins
Andrew Polson
Bing Zheng
Mark Dennis
Jagath Reddy Junutula
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Genentech, Inc
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Publication date
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Publication of BRPI0812691B1 publication Critical patent/BRPI0812691B1/pt
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Abstract

ANTICORPOS, POLIPEPTÍDEOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-CD79b, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS DE INIBIÇÃO, MÉTODOS DE TRATAMENTO, MÉTODO DE DETERMINAR A PRESENÇA DE CD79B, MÉTODO DE LIGAR UM ANTICORPO, USOS DE UM ANTICORPO E USO DE UM IMUNOCONJUGADO. A presente invenção refere-se a composições de material úteis para o tratamento de tumor hematopiético em mamíferos e a métodos de usar estas composições de material para os mesmos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido não provisório, depositado em termos do Título 37 do CFR §1.53(b), reivindica benefícios, conforme faculta o Título 35 USC §119(e), do Pedido Provisório US 60/950.052, depositado em 16 de julho de 2007, Pedido Provisório US 61/025.137, depositado em 31 de janeiro de 2008, Pedido Provisório US 61/032.790, depositado em 29 de fevereiro de 2008 e Pedido Provisório US 61/054.709, depositado em 20 de maio de 2008, sendo que todos eles estão incorporados integralmente ao presente a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a composições de material útil para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de usar estas composições de material para o mesmo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Tumores malignos (cânceres) são a segunda causa líder de doença nos Estados Unidos, após a doença cardíaca (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento no número de células anormais, ou neoplásicas, derivadas de um tecido normal, que proliferam para formar uma massa de tumor, a invasão de tecidos adjacentes por estas células de tumor neoplásicas, e a geração de células malignas que eventualmente se espalham pelo sangue ou sistema linfático para nodos linfáticos regionais e para sítios distantes por um processo denominado metástase. Em um estado canceroso, uma célula prolifera sob condições em que células normais podem não se desenvolver. O câncer manifesta-se por si mesmo em uma ampla variedade de formas, caracterizadas por diferentes graus de invasividade e agressividade.
[004] Os cânceres que envolvem células geradas durante hematopoiese, um processo pelo qual os elementos celulares do sangue, como linfócitos, leucócitos, plaquetas, eritrócitos e células exterminadoras naturais (natural killer) são gerados, são referidos como cânceres hematopoiéticos. Os linfócitos que podem ser encontrados no sangue e tecido linfático e são críticos para resposta imune são categorizados em duas classes principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T), que mediam a imunidade mediada por células e humoral, respectivamente.
[005] As células B amadurecem dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação a antígeno em sua superfície celular. Quando uma primeira célula B primitiva encontra o antígeno para o qual seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a dividir-se rapidamente e sua progênie diferencia-se na memória de células B e células efetoras denominadas “células do plasma”. Como células B de memória têm um tempo de vida mais longo e continuam a expressar o anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula parental original como células do plasma não produzem o anticorpo ligado à membrana, mas, em vez disso, produz o anticorpo em uma forma que pode ser secretada. Os anticorpos secretados são a maior molécula efetora de imunidade humoral.
[006] As células T amadurecem dentro do timo que fornece um ambiente para a proliferação e diferenciação de células T imaturas. Durante a maturação das células T, as células T passam por redistribuições de genes que produzem o receptor de células T e a seleção positiva e negativa que ajuda a determinar o fenótipo da superfície celular da célula T madura. Como características dos marcadores da superfície celular de células T maduras são o complexo do CD3: receptor de célula T e um dos co-receptores, CD4 ou CD8.
[007] Em tentativas para descobrir como marcações celulares eficazes para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar polipeptídeos de transmembrana ou de outro modo associados à membrana que são especificamente expressos sobre a superfície de um ou mais tipo(s) particular(es) de célula cancerosa quando comparada a uma ou mais célula(s) não-cancerosa(s) normais. Frequentemente, tais polipeptídios associados à membrana são mais abundantemente expressos sobre a superfície de células de câncer quando comparados a sobre a superfície de células não-cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície de células associadas a tumor dá origem à capacidade para marcar especificamente células de câncer para destruição por terapias baseadas em anticorpo. A este respeito, nota-se que a terapia baseada em anticorpo se prova muito eficaz no tratamento de certos cânceres. Por exemplo, HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia) são anticorpos que são usados com sucesso para tratar câncer de mama e linfoma não-Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente, HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA que se liga seletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene do receptor 2 (HER2) do receptor do fator de crescimento epidérmico humano. A superexpressão da proteína HER2 é observada em 25-30% dos cânceres de mama primários. RITUXAN® é um anticorpo monoclonal de murino/humano quimérico de engenharia genética dirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos B normais e malignos. Ambos os anticorpos recombinantes são produzidos em células CHO.
[008] Em outras tentativas para descobrir marcações celulares eficazes para terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar (1) polipeptídeos associados a não-membranas que são especificamente produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) normal(is) não- cancerosas, (2) polipeptídeos que são produzidos por células de câncer em um nível de expressão que é significativamente mais alto do que o de uma ou mais célula(s) não-cancerosas normais, ou (3) polipeptídeos cuja expressão é especificamente limitada a somente um único (ou um número muito limitado de diferente(s)) tipo(s) de tecido tanto no estado canceroso como não-canceroso (por exemplo, tecido de tumor de próstata e de próstata normal). Estes polipeptídeos podem permanecer localizados intracelularmente ou podem ser secretados pela célula cancerosa. Além disso, tais polipeptídeos podem ser expressos não pela própria célula cancerosa, mas, mais exatamente, por células que produzem e/ou secretam polipeptídeos tendo um efeito melhorado da potencialidade e do crescimento sobre como células cancerosas. Tais polipeptídeos secretados são frequentemente proteínas, que fornecem células cancerosas com uma vantagem de crescimento sobre células normais, e incluem elementos tais como, por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de adesão celular, fatores de crescimento, e outros. Pode-se esperar que a identificação de antagonistas de tais polipeptídeos associados a não-membrana sirva como agentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cânceres. Além disso, a identificação do padrão de expressão de tais polipeptídeos pode ser útil para o diagnóstico de cânceres particulares em mamíferos.
[009] A despeito dos avanços acima identificados em terapia de câncer de mamíferos, há uma grande necessidade de agentes terapêuticos adicionais capazes de detectar a presença de tumor em um mamífero e para inibir eficazmente o crescimento de célula neoplásica. Consequentemente, é um objetivo da presente invenção identificar polipeptídeos, polipeptídeos associados a membrana celular ou polipeptídeos intracelulares cuja expressão é especificamente limitada a somente um único (ou um número muito limitado de diferente(s)) tipo(s) de tecido, tecidos hematopoiéticos, tanto em um estado canceroso como não-canceroso, e usar estes polipeptídeos, e seus ácidos nucleicos de codificação, para produzir composições de material útil no tratamento terapêutico e/ou detecção de câncer hematopoiético em mamíferos.
[010] CD79 é o componente de sinalização do receptor de célula B consistindo em um heterodímero covalente contendo CD79a, (Iga, mb-1) e CD79b (Igβ, B29). CD79a e CD79b contêm, cada um, um domínio de imunoglobulina (Ig) extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, um domínio motivo de ativação baseado no imunorreceptor de tirosina (ITAM). CD79 é expresso em células B e em células de linfoma não-Hodgkin (NHLs) (Cabezudo et al., Haematologica, 84: 413-418 (1999); D’Arena et al., Am. J. Hematol. 64: 275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol. Invest., 35: 93-114 (2006)). CD79a e CD79b e slg são todos requeridos para expressão na superfície de CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7)). A expressão média na superfície de CD79b sobre NHLs é similar àquela sobre células B normais, mas com uma faixa maior (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7 (2001)).
[011] Dada a expressão de CD79b, ela é benéfica para produzir anticorpos terapêuticos para o antígeno CD79b que cria mínima ou nenhuma antigenicidade quando administrado a pacientes, especialmente para tratamento crônico. A presente invenção satisfaz esta e outras necessidades. A presente invenção fornece os anticorpos anti-CD79b que superam como limitações das composições terapêuticas atuais, bem como oferecem vantagens adicionais que serão evidentes a partir da descrição detalhada abaixo.
[012] O uso de conjugados de anticorpo-droga (ADC), isto é, imunoconjugados, para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para exterminar ou inibir células de tumor no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al.,(2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu- Duvaz e Springer (1997) Adv. Droga Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278) permite a liberação dirigida da porção de droga em tumores, e o acúmulo intracelular nos mesmos, onde a administração sistêmica destes agentes de droga não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais bem como células de tumor procuradas para serem eliminadas (Baldwin et al.,(1986) Lancet PP. (15 de março de 1986): 603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review.”, em Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al.,(ed.s), pp. 475-506). Esforços para aperfeiçoar o índice terapêutico, isto é, eficácia máxima e toxicidade mínima de ADC focaliza a seletividade de anticorpos policlonais (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87) e monoclonais (mAbs) bem como propriedades de ligação de droga e de liberação de droga (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549). Porções de droga usadas nos conjugados de droga no anticorpo incluem toxinas de proteína bacteriana tal como toxina de difteria, toxinas de proteína de planta tais como ricina, moléculas pequenas tais como auristatinas, geldanamicina (Mandler et al., (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), caliqueamicina (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58: 2928; Himman et al., (1993) Cancer Res. 53: 33363342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et al., (1986) supra). As porções de droga podem afetar os mecanismos citotóxicos e citostáticos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA, ou inibição de topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas a anticorpos grandes ou ligantes do receptor de proteína.
[013] Os peptídeos de auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina (WO 02/088172), são conjugados como porções de droga para: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas); (ii) cAC10 que é específico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al., (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773; Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784; Francisco et al., (2003) Blood 102(4): 1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tal como rituxan (WO 04/032828) para o tratamento de cânceres expressando CD20 e distúrbios imunes; (iv) anticorpo 2H9 anti-EphB2R para o tratamento de câncer colorretal (Mao et al., (2004) Cancer Research 64(3): 781-788; (v) anticorpo de seletina E (Bhaskar et al., (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394; (vi) trastuzumab (HERCEPTIN®, US 2005/0238649), e (vi) anticorpos anti-CD30 (WO 03/043583). Variantes de auristatina E são descritas em, US 5767237 e US 6124431. Conjugados de monometila auristatina E para anticorpos monoclonais são descritos em Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, volume 45. Abstract Number 623, apresentado em 28 de março de 2004. Análogos MMAE e MMAF de auristatina são conjugados a diversos anticorpos (US 2005/0238649).
[014] Meios convencionais de fixar, isto é, ligar através de ligações covalentes, uma porção de droga a um anticorpo, geralmente, leva a uma mistura heterogênea de moléculas onde as porções de droga são fixadas a um número de sítios no anticorpo. Por exemplo, drogas citotóxicas são tipicamente conjugadas a anticorpos através de resíduos de lisina frequentemente numerosos de um anticorpo, gerando uma mistura de conjugado de anticorpo- droga heterogênea. Dependendo das condições de reação, a mistura heterogênea contém tipicamente uma distribuição de anticorpos com 0 a 8, ou mais, porções de droga fixadas. Além disso, em cada subgrupo de conjugados com uma relação inteira particular de porções de droga para anticorpo, é uma mistura potencialmente heterogênea onde a porção de droga é fixada em diversos sítios no anticorpo. Métodos analíticos e preparativos podem ser inadequados para separar e caracterizar como moléculas de espécie de conjugado de anticorpo-droga dentro da mistura heterogênea resultante de uma reação de conjugação. Os anticorpos são grandes, complexos e biomoléculas estruturalmente variadas, frequentemente com muitos grupos funcionais reativos. Suas reatividades com reagentes de ligantes e intermediários de droga- ligante são dependentes de fatores tais como pH, concentração, concentração de sal e co-solventes. Além disso, o processo de conjugação em múltiplas etapas pode ser não reprodutível devido a dificuldades em controlar como condições de reação e caracterizar os reagentes e intermediários.
[015] Tióis cisteína são reativos em pH neutro, diferente da maioria das aminas que são protonadas e de pH menos nucleofílico próximo de 7. Uma vez que grupos de tióis livres (RSH, sulfidrila) são relativamente reativos, proteínas com resíduos de cisteína existem em sua forma oxidada como oligômeros ligados a dissulfeto ou ligam internamente grupos dissulfeto. Proteínas extracelulares geralmente não têm tióis livres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, na página 55). Grupos tiol cisteína no anticorpo são geralmente mais reativos, isto é, mais nucleofílicos, para reagentes de conjugação eletrofílica do que grupos amina ou hidroxila no anticorpo. Resíduos de cisteína são introduzidos em proteínas por técnicas de engenharia genética para formar fixações covalentes para ligantes ou para formar novas ligações de dissulfeto intramolecular (Better et al., (1994) J. Biol. Chem. 13: 9644-9650; Bernhard et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al., (1994) Therapeutic Immunology 1: 247-255; Tu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al., (2000) J. of Biotechnology, 76: 207-214; Chmura et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(15): 8480-8484; US 6248564). No entanto, a engenharia nos grupos tiol cisteína pela mutação de múltiplos resíduos de aminoácidos de uma proteína para aminoácidos de cisteína é potencialmente problemática, particularmente no caso de resíduos não pareados (Cys livre) ou dos que são relativamente acessíveis para reação ou oxidação. Em soluções concentradas da proteína, se no periplasma de E. coli, sobrenadantes da cultura, ou proteína parcialmente ou completamente purificada, resíduos de Cys não pareados sobre a superfície da proteína podem parear e oxidar para formar dissulfetos intermoleculares, e, portanto, dímeros ou multímeros de proteína. A formação de dímeros de dissulfeto torna a nova Cys não reativa para conjugação em uma droga, ligante, ou outro rótulo. Além disso, se a proteína forma oxidativamente uma ligação de dissulfeto intramolecular entre a Cys recentemente engenheirada e um resíduo de Cys existente, ambos os grupos tiol Cys estão indisponíveis para interações e participações no sítio ativo. Além disso, a proteína pode tornar-se inativa ou não específica, por duplicação imperfeita ou perda da estrutura terciária (Zhang et al., (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).
[016] Anticorpos submetidos a engenharias com cisteína são designados como fragmentos de anticorpos FAB (thioFab) e expressos como anticorpos monoclonais (thioMab) de IgG, de comprimento completo (Junutula, J.R. et al., (2008) J Immunol Methods 332: 41-52; US 2007/0092940, cujos conteúdos são incorporados por referência). Anticorpos tioFab e tioMab são conjugados através de ligantes nos tióis cisteína recentemente introduzidos com reagentes de ligantes reativos com tiol e reagentes de ligantes de droga para preparar conjugados de anticorpo droga (Thio ADC).
[017] Todas como referências citadas aqui, incluindo pedidos e publicações de patente são incorporadas por referência em sua totalidade.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[018] A presente invenção fornece anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais dos mesmos, e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
[019] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga, de preferência de modo específico, a qualquer um dos polipeptídeos descritos acima e abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo Fab, Fab’ F(ab’)2 e fragmento Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, um maitansinóide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica, ou outros. Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e, de preferência, induzem a morte de uma célula à qual eles se ligam. Para fins de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente rotulados, fixados a um suporte sólido, ou outros.
[020] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD79b humanizado sendo que a afinidade monovalente (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para CD79b) ou afinidade em sua forma bivalente do anticorpo para CD79b (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento IgG para CD79b) é substancialmente a mesma que, menor do que, ou maior do que, a afinidade monovalente ou afinidade em sua forma bivalente, respectivamente, de um anticorpo de murino (por exemplo, afinidade do anticorpo de murino como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab ou como um fragmento IgG para CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma cadeia leve como descrito nas figuras 7a-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8a-B (SEQ ID NO: 14).
[021] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD79b humanizado sendo que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente para CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG para CD79b) é 0,4 nM, 0,2 nM ou 0,5 nM.
[022] Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, sendo que o anticorpo compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados a partir do grupo consistindo em: (i) HVR-L1 compreendendo sequência A1-A15, sendo que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) (ii) HVR-L2 compreendendo sequência B1-B7, sendo que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132) (iii) HVR-L3 compreendendo Sequência C1-C9, sendo que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133) (iv) HVR-H1 compreendendo Sequência D1-D10, sendo que D1D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134) (v) HVR-H2 compreendendo Sequência E1-E18, sendo que E1- E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 compreendendo sequência F1-F10, sendo que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
[023] Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, sendo que o anticorpo compreende pelo menos uma variante HVR sendo que a sequência da variante HVR compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência descrita na SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136.
[024] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 15 (SEQ ID NO: 164-166).
[025] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 15 (SEQ ID NO: 156-158).
[026] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 16 (SEQ ID NO: 183-185).
[027] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 16 (SEQ ID NO: 175-177).
[028] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 17 (SEQ ID NO: 202-204).
[029] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 17 (SEQ ID NO: 194-196).
[030] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC descrita na figura 18 (SEQ ID NO: 221-223).
[031] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC descrita na figura 18 (SEQ ID NO: 213-215).
[032] Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado de SEQ ID NO: 170, 189, 208 ou 227. Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo anti-CD79b compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 169, 188, 207 ou 226.
[033] Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livre e a sequência selecionada de SEQ ID NO: 251298. O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ligar-se a um polipeptídeo de CD79b. O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ser preparado por um processo compreendendo substituir um ou mais resíduos de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b parental por cisteína.
[034] Em um aspecto, a presente invenção inclui o anticorpo anti- CD79b submetido à engenharia com cisteína compreendendo um ou mais aminoácidos de cisteína livres sendo que o anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína liga-se a um polipeptídeo de CD79b e é preparado por um processo compreendendo substituir um ou mais resíduos de aminoácidos do anticorpo anti-CD79b parente por cisteína sendo que anticorpo parente compreende pelo menos uma sequência de HVR selecionada de: (a) Sequência A1-A15 compreendendo HVR-L1, sendo que A1- A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137); (b) Sequência B1-B7 compreendendo HVR-L2, sendo que B1- B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132); (c) Sequência C1-C9 compreendendo HVR-L3, sendo que C1C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133); (d) Sequência D1-D10 compreendendo HVR-H1, sendo que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134); (e) Sequência E1-E18 compreendendo HVR-H2, sendo que E1- E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (f) Sequência F1-F10 compreendendo HVR-H3, sendo que F1- F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138).
[035] O anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico. Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser conjugados a um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina ou maitansinóide. Os anticorpos da presente invenção podem, opcionalmente, ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e de preferência inibem crescimento ou proliferação de ou induz a morte da célula às quais eles se ligam para fins de diagnóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser detectavelmente rotulados, fixados a um suporte sólido, ou outros.
[036] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para produzir um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo CD79b (que, como definido aqui inclui o comprimento completo e fragmentos do mesmo), dito método compreendendo expressar em uma célula hospedeira apropriada um vetor recombinante da invenção codificando dia anticorpo (ou fragmento do mesmo), e recuperar dito anticorpo.
[037] Em um aspecto, presente a invenção é uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção ou um conjugado de anticorpo-droga da invenção, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[038] Em um aspecto, a presente invenção fornece um artigo de fabricação compreendendo um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, sendo que a composição compreende um ou mais anticorpos CD79b da invenção.
[039] Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos CD79b da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão.
[040] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo CD79b da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células.
[041] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um artigo de fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células.
[042] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um kit da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio proliferativo de células.
[043] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir o crescimento de uma célula que expressa CD79b, dito método compreendendo contatar a dita célula com um anticorpo da invenção desse modo causando uma inibição de crescimento de dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
[044] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um mamífero tendo um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, dito método compreendendo administrar a dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando eficazmente dito mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
[045] Em um aspecto, presente a invenção fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de células associado com a expressão aumentada de CD79b, dito método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando ou prevenindo eficazmente dito distúrbio proliferativo de células. Em uma modalidade, dito distúrbio proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
[046] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para inibir o crescimento de uma célula, sendo que o crescimento de dita célula é pelo menos em parte dependente de um efeito potencializador de crescimento de CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo inibindo o crescimento de dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
[047] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um tumor em um mamífero, sendo que o crescimento de dito tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito potencializador de crescimento do CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando eficazmente o dito tumor. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
[048] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar câncer compreendendo administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado descrito aqui, diluente aceitável, veículo ou excipiente.
[049] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir a proliferação de células B compreendendo expor uma célula a um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b.
[050] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de determinar a presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, dito método compreendendo expor dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinar a ligação de dia anticorpo a CD79b em dita amostra sendo que a ligação de dia anticorpo a CD79b em dita amostra é indicativa da presença de dita proteína em dita amostra.
[051] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de diagnosticar um distúrbio proliferativo de célula associado com um aumento em células, tal como células B, expressando CD79b é fornecido, o método compreendendo contatar células de teste em uma amostra biológica com qualquer um dos anticorpos acima; determinar o nível de anticorpo ligado às células de teste na amostra detectando a ligação do anticorpo a CD79b; e comparar o nível de anticorpo ligado às células em uma amostra de controle, sendo que o nível de anticorpo ligado é normalizado no número de células expressando CD79b nas amostras de teste e de controle, e sendo que o nível mais alto de anticorpo ligado na amostra de teste como comparado à amostra de controle indica a presença da distúrbio proliferativo de células associado com células expressando CD79b.
[052] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de detectar CD79b solúvel no sangue ou soro, o método compreendendo contatar uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de experimentar um distúrbio proliferativo de células B com um anticorpo anti- CD79b da invenção e detectar um aumento em CD79b solúvel na amostra de teste com relação a uma amostra de controle de sangue ou soro de um mamífero normal.
[053] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de ligar um anticorpo da invenção a uma célula que expressa CD79b, dito método compreendendo contatar dita célula com um anticorpo da invenção. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado a um agente inibidor de crescimento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[054] A figura 1 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) de um cDNA PRO36249, sendo que SEQ ID NO: 1 é a clone designado aqui como “DNA225786" (também referido aqui como “CD79b"). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
[055] A figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 1 mostrada na figura 1.
[056] A figura 3 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) de cadeia leve de anticorpo de murino CD79b quimérico (chMA79b) IgG1 (MA79b é um anticorpo anti-CD79b monoclonal de murino). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia leve de chMA79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
[057] A figura 4 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 mostrada na figura 3. Regiões variáveis são como regiões não sublinhadas.
[058] A figura 5 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5) de cadeia pesada do anticorpo de murino quimérico (chMA79b) IgG1 (MA79b é o anticorpo anti-CD79b monoclonal de murino). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada de chMA79b com os códons de partida e de parada mostrados em negrito e sublinhados.
[059] A figura 6 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) antes do códon de parada, derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO: 5 mostrada na figura 5. Regiões variáveis são como regiões não sublinhadas.
[060] As figuras 7A-B mostram o alinhamento de sequências de cadeias leves variáveis para o seguinte: a sequência de consenso kappa I humana de cadeia leve (rotulada como “huKI”; SEQ ID NO: 9) com VL-FR1, VL- FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO: 139-142, respectivamente), anticorpo anti- CD79b de murino (rotulado como “MA79b”; SEQ ID NO: 10), anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “enxerto huMA79b”; SEQ ID NO: 11), variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v17”; SEQ ID NO: 169), variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v18”; SEQ ID NO: 188), variante 28 anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 207) e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v32”; SEQ ID NO: 226). Como posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso de Kappa I leve variável estão mostradas em caixas.
[061] As figuras 8A-B mostram o alinhamento de sequências de vadeias pesadas variáveis para o seguinte: sequência de consenso do subgrupo III humana de cadeia pesada (rotulada como “humIII”; SEQ ID NO: 13) com VH- FR1, VH-FR2, VH-FR3, e VH-FR4 (SEQ ID NO: 143-146), anticorpo anti-CD79b de murino (rotulado como “MA79b”; SEQ ID NO: 14), anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b graft”; SEQ ID NO: 15) (contendo 71A, 73T e 78A), variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v17”; SEQ ID NO: 170) (contendo 71A, 73T e 78A), variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v18”; SEQ ID NO: 189) (contendo 71A, 73T e 78A), variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 208) (contendo 71A, 73T e 78A) e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b.v32”; SEQ ID NO: 227) (contendo 71A, 73T e 78A) como posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (HVRs) enxertadas de MA79b na estrutura de consenso do subgrupo III pesada variável estão mostradas em caixas.
[062] A figura 9 mostra várias sequências HVR de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b selecionadas (SEQ ID NO: 1721) sendo que cada variante tem uma troca de aminoácido única em um HVR único do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (HVR-L1 (SEQ ID NO: 131); HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133)) como sequências das cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis fora das trocas de aminoácido únicas foram idênticas ao enxerto de huMA79b e não são mostradas. Nenhuma troca foi observada em HVR-H1 (SEQ ID NO: 134), HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) ou HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b.
[063] A figura 10 mostra várias sequências HVR de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b selecionadas (SEQ ID NO: 22106), incluindo huMA79b L2-2 (também referido aqui como “L2”) um huMA79b H3-10 (também referido aqui como “H3”) sendo que cada variante tem múltiplas trocas de aminoácidos em uma região de HVR única do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133); HVR-H1 (SEQ ID NO: 134); porção de HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) é mostrada na figura 10 como SEQ ID NO: 107). As sequências de cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis fora das trocas de aminoácidos mostradas foram idênticas ao enxerto de huMA79b e não são mostradas. Nenhuma troca foi observada em HVR-L1 (SEQ ID NO: 131) ou HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b.
[064] A figura 11 mostra análise Biacore de anticorpos anti-CD79b selecionados, incluindo anticorpo CD79b de murino (rotulado como “MA79b”), anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b graft”), e variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b, incluindo mutações de huMA79b L2-2 (52R, 53K, 55G, 56R; SEQ ID NO: 22), huMA79b H3-10 (98I, 99R, 100L; SEQ ID NO: 94), huMA79b H1-6 (28P, 30T, 31R, 35N; SEQ ID NO: 57) e huMA79b L2/H3 (L2-2 e H3-10 descritas abaixo) para designar antígenos, incluindo o domínio extracelular de CD79b (huCD79becd) humano, o domínio extracelular de CD79b humano ligado a Fc (huCD79becd-Fc) e um peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b e chMA79b (SEQ ID NO: 16).
[065] A figura 12 mostra análise Biacore de anticorpos anti-CD79b selecionados, incluindo anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como “huMA79b graft”) e variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (rotulado como 1-34 na primeira coluna ou como “toda a estrutura” na primeira coluna) no domínio extracelular humano de CD79b (antígeno huCD79b- ecd). Variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b incluem uma variante de “toda a estrutura” onde resíduos de estrutura de murino potencialmente importantes estão presentes e variantes (rotuladas 1-34) com combinações de mutações de estrutura com ou sem mutações de HVR na cadeia leve variável e cadeia pesada variável como designado. A variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (referido aqui como “huMA79b.v17”) é rotulada como 17 na primeira coluna, variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (referida aqui como “huMA79b.v18”) é rotulada como 18 na primeira coluna, variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (referida aqui como “huMA79b.v28”) é rotulada como 28 na primeira coluna e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (referida aqui como “huMA79b.v32”) é rotulada como 32 na primeira coluna. A duplicação da ligação covalente é representada como o Kd da variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b particular (rotulada como “Kdvariante”)/o Kd do anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) (rotulado como “Kdquimera”); os valores sob a coluna rotulada “duplicação de ligação bivalente” representam Kdvariante/Kdquimera. Nenhuma ligação detectada é designada na figura como “NDB”.
[066] As figuras 13A-B (variável pesada (VH) estruturas de consenso) e a figura 14 (variável leve (VL) estruturas de consenso) descrevem sequências de estruturas de consenso humanas aceptoras exemplificativos para uso na prática da presente invenção com identificadores de sequência como a seguir: (Figuras 13A-B) estrutura de consenso do subgrupo I de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 108), estrutura de consenso do subgrupo I de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 109-111), estrutura de consenso do subgrupo II de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 112), estrutura de consenso do subgrupo II de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 113-115), estrutura de consenso do subgrupo III de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 116), estrutura de consenso do subgrupo III de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 117-119), estrutura aceptora humana de VH menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 120), estrutura aceptora humana de VH menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 121-122), estrutura 2 aceptora humana de VH menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 123) e estrutura 2 aceptora humana de VH menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NO: 124-26) e (Figura 14) estrutura de consenso do subgrupo I de kappa VL humano (SEQ ID NO: 127), estrutura de consenso do subgrupo II de kappa VL humano (SEQ ID NO: 128), estrutura de consenso do subgrupo III de kappa VL humano (SEQ ID NO: 129) e estrutura de consenso do subgrupo IV de kappa VL humano (SEQ ID NO: 130).
[067] As figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequência de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v17). As figuras 15A (cadeia leve) e 15B (cadeia pesada) mostram sequência de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v17) (SEQ ID NO: 152-159 (Figura 15A) e SEQ ID NO: 160168 (Figura 15B)). Sequência de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) das cadeias leves e pesadas de huMA79b.v17 são mostradas (SEQ ID NO: 303 (Figura 15A) e 304 (Figura 15B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos de domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 169 (Figura 15A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 170 (Figura 15B para cadeia pesada)).
[068] As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v18). As figuras 16A (cadeia leve) e 16B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v18) (SEQ ID NO: 171-178 (Figura 16A) e SEQ ID NO: 179187 (Figura 16B)). Sequências de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) da cadeia leve e cadeia pesada de huMA79b.v18 são mostradas (SEQ ID NO: 305 (Figura 16A) e 306 (Figura 16B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 188 (Figura 16A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 189 (Figura 16B para cadeia pesada)).
[069] As figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28). A figuras 17A (cadeia leve) e 17B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v28) (SEQ ID NO: 190-197 (Figura 17A) e SEQ ID NO: 198206 (Figura 17B). Sequências de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) de cadeias leves e pesadas de huMA79b.v28 são mostradas (SEQ ID NO: 307 (Figura 17A) e 308 (Figura 17B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. Sequências de aminoácidos de domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 207 (Figuras 7A-B para cadeia leve) e SEQ ID NO: 208 (Figuras 8A-B para cadeia pesada)).
[070] As figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32). Figuras 18A (cadeia leve) e 18B (cadeia pesada) mostram sequências de aminoácidos de estrutura (FR), região hipervariável (HVR), primeiro domínio constante (CL ou CH1) e Fc região (Fc) de uma modalidade de um anticorpo da invenção (huMA79b.v32) (SEQ ID NO: 209-216 (Figura 18A) e SEQ ID NO: 217225 (Figura 18B). Sequências de aminoácidos de comprimento completo (regiões variáveis e constantes) de cadeias leves e pesadas de huMA79b.v32 são mostradas (SEQ ID NO: 309 (Figura 18A) e 310 (Figura 18B), respectivamente, com os domínios constantes sublinhados. As sequências de aminoácidos dos domínios variáveis são mostradas (SEQ ID NO: 226 (Figura 18A para cadeia leve) e SEQ ID NO: 227 (Figura 18B para cadeia pesada)).
[071] A figura 19 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos de CD79b de humano (SEQ ID NO: 2), macaco cinomolgos (cyno) (SEQ ID NO: 7) e camundongo (SEQ ID NO: 8). CD79b de humano e de cyno têm 85% de identidade de aminoácido. A sequência de sinal, peptídeo de teste (o epítopo de 11 aminoácidos para MA79b, chMA79b e anti-cyno O anticorpo CD79b descrito no exemplo 1; ARSEDRYRNPK (SEQ ID NO: 12)), domínio de transmembrana (TM) e domínio do motivo de ativação baseado no imunorreceptor de tirosina (ITAM) são indicados. A região mostrada em caixas é a região de CD79b que está ausente na variante de emenda de CD79b (descrita no exemplo 1).
[072] A figura 20 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto de BJAB-luciferase que mostra que a administração do anticorpo anti-CD79bs ((a) chMA79b-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,9 (Tabela 9) e (b) huMA79b L2/H3-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,4 (Tabela 9)) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanos inibiu significativamente o crescimento do tumor. Os controles incluíram Herceptin® (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti- HER2-SMCC-DM1).
[073] A figura 21A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto humano) que mostra que a administração do anticorpo anti-CD79bs ((a) chMA79b-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,6 (Tabela 10), (b) huMA79b.v17-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,4 (Tabela 10), (c) huMA79b.v28-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,3 ou 3,4 (Tabela 10), (d) huMA79b.v18-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 3,4 (Tabela 10) e (e) huMA79b.v32-SMCC-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 2,9 (Tabela 10)) tem camundongos SCID tendo tumores de célula B célula humanos inibiu significativamente o crescimento de tumor. Os controles incluíram Herceptin® (trastuzumab)-SMCC- DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). A figura 21B é um traço em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos do estudo com xenoenxerto Granta-519 (Figura 21A e Tabela 10) mostrando que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 7 dias do estudo. “hu” refere-se a anticorpo humanizado e “ch” refere-se a anticorpo quimérico.
[074] A figura 22 mostra descrições de conjugados de anticorpo anti-CD79b droga submetido à engenharias por cisteína (ADC) onde uma porção da droga é fixada e um grupo de cisteína engenheirada na cadeia leve (LC-ADC); na cadeia pesada (HC-ADC); e na região de Fc (Fc-ADC).
[075] A figura 23 mostra as etapas de: (i) reduzir os adultos de dissulfeto cisteína e intercadeia e dissulfetos de intracadeia em um anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína (ThioMab) com o agente de redução TCEP (hidrocloreto de tris(2-carboxietil)fosfina); (ii) oxidando parcialmente, isto é reoxidação para reformar a intercadeia e dissulfetos de intracadeia, com dhAA (ácido de-hidroascórbico); e (iii) conjugação do anticorpo reoxidado com o intermediário ligante de droga para formar um conjugado de cisteína anti-CD79b droga (ADC).
[076] A figura 24 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 229) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) de anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína humanizado (thio- huMA79b.v17-HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (alanina de posição sequencial 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção de droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de Fc é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[077] A figura 25 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 231) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) de anticorpo anti-CD79b humanizado submetido à engenharia com cisteína (thio- huMA79b.v18-HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de alanina 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para uma cisteína. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica régios constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de Fc é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[078] A figura 26 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 233) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) de anticorpo anti-CD79b humanizado submetido à engenharia com cisteína (thio- huMA79b.v28-HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína. Uma porção a droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[079] A figura 27 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 235) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) de anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína (thio-MA79b-LC-V205C), uma valina na posição de Kabat 205 (valina na posição sequencial 209) de cadeia leve foi alterada para cisteína. Uma porção da droga pode ser fixada a um grupo de cisteína engenheirada na cadeia leve. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[080] A figura 28 mostra (A) uma sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 237) e (B) uma sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) de anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína (thio-MA79b-HC- A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de alanina 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[081] As figuras 29A-B são traçados em gráfico de FACS indicando qual ligação de conjugados de anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se ligam a CD79b expresso sobre a superfície de células de BJAB- luciferase é similar para os conjugados (A) variantes de LC (V205C) thioMAb e (B) HC (A118C) variantes de thioMAb de chMA79b com MMAF. A detecção foi com MS anti-humanIgG-PE. “Thio” refere-se ao anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[082] As figuras 30A-D são traçados em gráfico de FACS indicando qual ligação dos conjugados anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se ligam a CD79b expresso sobre a superfície de BJAB-luciferase células é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC (A118C) thioMAb de huMA79b.v18 e variantes conjugadas HC (A118C) thioMAb de huMA79b.v18 com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAF, (C) MMAE e (D) DM1)). A detecção foi com MS anti-humanIgG-PE. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[083] As figuras 31A-D são traçados em gráfico de FACS indicando qual ligação de conjugados anti-CD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se ligam a CD79b expresso sobre a superfície de células de BJAB- luciferase é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC (A118C) thioMAb s de huMA79b.v28 e variantes conjugadas HC (A118C) thioMAb de huMA79b.v28 com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)). A detecção foi com MS anti-humano-PE. “Thio” refere- se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[084] As figuras 32A-D são traçados em gráfico FACS indicando qual ligação de conjugados anti-cynoCD79b thioMAb droga (TDCs) da invenção que se liga ao CD79b expresso sobre a superfície de células BJAB expressando cynoCD79b é similar para (A) variantes nuas (não conjugadas) HC(A118C) thioMAb de anti-cynoCD79b (ch10D10) e variantes conjugadas HC(A118C) thioMAb de anti-cynoCD79b (ch10D10) com os conjugados de drogas diferentes mostrados ((B) MMAE, (C) DM1 e (D) MMAF)). A detecção foi com MS anti- huIgG-PE. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[085] A figura 33A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto humana) que mostra qual administração de anti-CD79b TDCs que variou em posição da cisteína engenheirada (LC (V205C) ou HC (A118C)) e/ou doses de droga diferentes em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 11) ou thio chMA79b-LC(V205C)-MC- MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,8 (Tabela 11) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram hu-anti-HER2-MC-MMAF e thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e chMA79b-MC-MMAF. A figura 33B é a traçado em gráfico da troca de peso percentual no camundongo a partir do estudo com xenoenxerto Granta-519 (a figura 33A e Tabela 11) mostram que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[086] A figura 34A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs a diferentes porções de drogas ligantes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 12), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 12), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 12), mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Controles incluem controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu- anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti- CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 34B é um traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos a partir do estudo de xenoenxerto BJAB-luciferase (Figura 34A e Tabela 12) mostrando que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 7 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[087] A figura 35A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto WSU-DLCL2 (linfoma de células grandes difusas) que mostra qual administração do conjugado anti-CD79b TDCs a porções de drogas ligantes diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 13), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 13), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 13), mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti- CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 35B é um traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos a partir do estudo com xenoenxerto WSU-DLCL2 (Figura 35A e Tabela 13) mostrando que não houve nenhuma troca significativa de peso durante os primeiros 7 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[088] A figura 36 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto DOHH2 (linfoma folicular) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-BMPEO-DM1 (a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 14)), thio huMA79b.v28-MC-MMAF (a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 14)) ou thio MA79b-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE (a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 14)) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE), controles huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti-CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)- HC(A118C)-MC-MMAF). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[089] A figura 37 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-luciferase (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrada em doses diferentes doses como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 15), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 15), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 15) mostraram uma inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram veículo (tampão sozinho), controles anti-HER2 (thio hu-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, controles thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), huMA79b.v28 (thio huMA79b.v28-HC(A118C)) e controles anti-CD22 (thio hu-anti-CD22(10F4v3)- HC(A118C)-MC-MMAF). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[090] A figura 38A é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-619 (linfoma de célula do manto humana) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1 ou MC-MMAF) e/ou administrado em doses diferentes como mostrado em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO- DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 16), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,95 (Tabela 16), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). A figura 38B é m traçado em gráfico da troca de peso percentual nos camundongos do estudo com xenoenxerto Granta-519 (figura 38A e Tabela 16) mostrando que não houve nenhuma troca significativa em peso durante os primeiros 14 dias do estudo. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[091] A figura 39 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto WSU-DLCL2 (linfoma de células grandes, difusas) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB- MMAE) e/ou administrado em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 17), thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 17) ou thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 17), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram veículo (tampão sozinho) e controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)- MC-MMAF, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[092] A figura 40 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto Granta-519 (linfoma de célula do manto humana) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO-DM1 ou MCvcPAB-MMAE) e/ou administrado em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)- BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 18) ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,87 (Tabela 18), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti- HER2 (thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[093] A figura 41 mostra um traçado em gráfico de resultados de ensaio de proliferação de células in vitro com (A) BJAB, (B) Granta-519 ou (C) células de tumor WSU-DLCL2, tratado com concentrações variadas de 0,001 a 10.000 ng de TDC per ml, incluindo: (1) thio hu anti-gD-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE de controle, carga de 2,0 MMAE/Ab, (2) thio hu anti-gD-HC(A118C)-MC- MMAFde controle, carga de 2,1 MMAF/Ab, (3) thio hu anti-gD-HC(A118C)- BMPEO-DM1 de controle, carga de 2,1 DM1/Ab, (4) thio huMA79b.v18- HC(A118C)-MC-MMAF, carga de 1,91 MMAF/Ab, (5) thio huMA79b.v18- HC(A118C)-BMPEO-DM1, carga de 1.8 DM1/Ab, e (6) thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, 2.0 carga de MMAE/Ab. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado. “gD” refere-se a glicoproteína D.
[094] A figura 42 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 238) de PRO283627 cDNA, sendo que SEQ ID NO: 235 é um clone designado como “DNA548455” (também referido aqui como “cyno CD79b”). A sequência de nucleotídeo codifica CD79b cinomolgo com os códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
[095] A figura 43 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 239) derivada de uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 235 mostrada na figura 42.
[096] A figura 44 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 240) de cadeia leve do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia leve do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10) com os códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
[097] A figura 45 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 241), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos, derivada de uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 240 mostrada na figura 44. Regiões variáveis (SEQ ID NO: 302) são regiões não sublinhadas.
[098] A figura 46 mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 242) de cadeia pesada do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10). A sequência de nucleotídeo codifica a cadeia pesada do anticorpo CD79b anti-cyno (ch10D10) com os códons de partida e parada mostrados em negrito e sublinhados.
[099] A figura 47 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 243), omitindo a primeira sequência de sinal de 18 aminoácidos e a última lisina (K) antes do códon de parada, derivada de uma sequência de codificação de SEQ ID NO: 242 mostrada na figura 46. Regiões variáveis (SEQ ID NO: 301) são regiões não sublinhadas.
[100] A figura 48 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 245) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) de anticorpo submetido à engenharia com anticorpo CD79b anti-cyno (Thio-anti-cynoCD79b- HC-A118C), em que uma alanina na posição EU 118 (posição sequencial de alanina 118; posição de Kabat 114) de cadeia pesada foi alterada para cisteína. Aminoácido D na posição Eu 6 (sombreado na figura) de cadeia pesada pode, alternativamente, ser E. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[101] A figura 49 mostra (A) a sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 300) e (B) a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) de anticorpo CD79b anti-cyno submetido à engenharia com cisteína (Thio-anti-cynoCD79b- LC-V205C), em que uma valina na posição de Kabat 205 (valina na posição sequencial 209) de cadeia leve foi alterada para cisteína. Aminoácido D na posição EU 6 (sombreado na figura) de cadeia pesada pode, alternativamente, ser E. Uma porção da droga pode ser fixada ao grupo de cisteína engenheirada na cadeia pesada. Em cada figura, o aminoácido alterado é mostrado no texto em negrito com duplo sublinhado. Sublinhado único indica regiões constantes. Regiões variáveis são regiões não sublinhadas. A região de FC é marcada por itálico. “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína.
[102] A figura 50 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79b) (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de conjugado anti-CD79b TDCs em porções de drogas ligantes diferentes (BMPEO- DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE) em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 19), thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19), ou thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19), thio CD79b anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)- BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1.8 (Tabela 19), thio CD79b anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF, a carga de droga foi aproximadamente 1,9 (Tabela 19) ou thio CD79b anti-cyno (ch10D10)- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, a carga de droga foi aproximadamente 1,86 (Tabela 19), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
[103] A figura 51 é um gráfico de inibição de crescimento de tumor in vivo em um modelo de xenoenxerto BJAB-cynoCD79b (células BJAB expressando cynoCD79B (linfoma de Burkitt) que mostra qual administração de anti-CD79b TDCs com a porção de droga ligante BMPEO-DM1 administrada em doses diferentes como mostrado, em camundongos SCID tendo tumores de células B humanas, inibiu significativamente o crescimento de tumor. Modelos de xenoenxertos tratados com thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,85 (Tabela 20) ou thio anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, a carga de droga foi aproximadamente 1,8 (Tabela 20), mostraram inibição significativa de crescimento de tumor durante o estudo. Os controles incluíram controles anti-HER2 (thio hu-anti- HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1) e controles huMA79b.v28 (thio huMA79b.v28- HC(A118C) e controles anti-cynoCD79b(ch10D10) (thio anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)). “Thio” refere-se a anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” refere-se a anticorpo humanizado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[104] A presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos de fabricação para identificar composições úteis para o tratamento de tumor hematopoiético em mamíferos e a métodos de usar estas composições de material para os mesmos.
[105] Detalhes destes métodos, composições, kits e artigos de fabricação são fornecidos aqui.
I. TÉCNICAS GERAIS
[106] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado ao contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia de células, bioquímica, e imunologia, que estão dentro do entendimento da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tal como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segundo edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Métodos in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e atualizações periódicas); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001).
II. DEFINIÇÕES
[107] Para fins de interpretar este relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice versa. No caso em que qualquer definição descrita conflite com qualquer documento incorporado aqui por referência, a definição descrita abaixo irá controlar.
[108] Um “marcador de superfície de células B” ou “antígeno de superfície de células B”, presentemente, é um antígeno expresso sobre a superfície da B célula que pode ser marcado com um antagonista que se liga a ele, incluindo, mas não limitado a anticorpos em um antígeno de superfície antígeno de células B ou uma forma solúvel de antígeno de superfície de células B capaz de antagonizar a ligação de um ligante ao antígeno de células B ocorrendo naturalmente. Marcadores de superfície de células B exemplificativos incluem os marcadores de superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, ver The Leukocyte Antígeno Facts Book, 2a Edição. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Outros marcadores de superfície de células B incluem RP105, FcRH2, CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, e 239287 de células B. O marcador de superfície de células B de particular interesse é de preferência expresso em células B comparado a outros tecidos de mamífero não de células e pode ser expresso em ambas as células precursoras e células B maduras.
[109] O termo “CD79b”, como usado aqui, refere-se a qualquer CD79b nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo humanos, macaco cinomolgo (cyno)) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado ao contrário. CD79b humano também é referido aqui como “PRO36249” (SEQ ID NO: 2) e codificado pelo sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) também referido aqui como “DNA225786”. CD79b de Cynomologus é também referido aqui como “cyno CD79b” ou “PRO283627” (SEQ ID NO: 239) e codificado pela sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 238) também referido aqui como “DNA548455”. O termo “CD79b” engloba CD79b não processado de “comprimento completo” bem como qualquer forma de CD79b que resulte de processamento na célula. O termo também engloba variantes de CD79b ocorrendo naturalmente, por exemplo, variantes de emenda, variantes alélicas e isoformas. Os polipeptídeos de CD79b descritos aqui podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipeptídeo de CD79b de sequência nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos como o polipeptídeo correspondente de CD79b derivado da natureza. Tais polipeptídeos de CD79b de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meio recombinante ou sintético. The termo "polipeptídeos de CD79b de sequência nativa" engloba especificamente as formas secretadas ou truncadas ocorrendo naturalmente do polipeptídeo de CD79b específico (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas de variantes ocorrendo naturalmente (por exemplo, alternativamente, formas emendadas) e variantes alélicas ocorrendo naturalmente do polipeptídeo. Em certas modalidades da invenção, os polipeptídeos CD79b de sequência nativa descritos aqui são polipeptídeos de sequência de nativa de comprimento completo compreendendo as sequências de aminoácidos de comprimento completo mostradas nas figuras anexas. Códons de partida e de parada (se indicados) são mostrados em fonte negrito e sublinhados nas figuras. Resíduos de ácido nucleico indicados como “N” nas figuras anexas são qualquer resíduo de ácido nucleico. No entanto, enquanto o polipeptídeo de CD79b descrito nas figures anexas são mostrados começar com resíduos de metionina designados aqui como posição 1 de aminoácido nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos de metionina localizados tanto a montante como a jusante da posição 1 de aminoácido nas figuras possam ser empregados como o resíduo de aminoácido de partida para o polipeptídeo de CD79bs.
[110] “MA79b” ou “anticorpo CD79b de murino” ou “anticorpo anti- CD79b de murino” é usado aqui para referir-se especificamente ao anticorpo CD79b monoclonal de murino sendo que o anticorpo CD79b monoclonal de murino compreende o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). O anticorpo CD79b monoclonal de murino pode ser adquirido de fontes comerciais tal como Biomeda (anti-anticorpos humanos CD79b; Foster City, CA), BDbioscience (anti-anticorpos humanos CD79b; San Diego, CA) ou Ancell (anti- anticorpos humanos CD79b; Bayport, MN) ou gerado de clone 3A2-2E7 de hibridoma American Type Culture Collection (ATCC) designação do depósito número HB11413, depositado com o ATCC em 20 de julho de 1993.
[111] “chMA79b” ou “anticorpo MA79b quimérico” é usado aqui para referir-se especificamente a anticorpo CD79b anti-humano quimérico (as previamente descrito no pedido US No 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006) sendo que o anticorpo anti-CD79b quimérico compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 4 (Figura 4). A cadeia leve de SEQ ID NO: 4 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e o domínio constante de cadeia leve de IgG1 humano. O anticorpo quimérico anti-CD79b compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 (Figura 6). A cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 compreende ainda o domínio variável de SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) e o domínio constante de cadeia pesada de IgG1 humano.
[112] “Anti-cynoCD79b” ou “CD79b anti-cyno” é usado aqui para referir-se a anticorpos que se ligam a cyno CD79b (SEQ ID NO: 239 de Figura 43) (como previamente descrito no pedido US No. 11/462,336, depositado em 3 de agosto de 2006). “Anti-cynoCD79b(ch10D10)” ou “ch10D10” é usado aqui para referir-se a anti-cynoCD79b quimérico (como previamente descrito no pedido US No. 11/462,336, depositado em 3 de agosto de 2006) que se liga a cynoCD79b (SEQ ID NO: 239 de Figura 43). Anti-cynoCD79b(ch10D10) ou ch10D10 é anticorpo anti-cynoCD79b quimérico que compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 241 (Figura 45). Anti-cynoCD79b(ch10D10) ou ch10D10 compreende ainda a cadeia pesada de SEQ ID NO: 243 (Figura 47).
[113] “MA79b-graft” ou “anticorpo humanizado enxertado com MA79b-” ou “enxerto de huMA79b” é usado aqui para referir-se especificamente ao enxerto gerado pelo enxertamento de regiões hipervariáveis de anticorpo anti- CD79b murino (MA79b) no consenso humano aceptor de VL kappa I (huKI) e consenso do subgrupo III humano VH (huIII) com R71A, N73T e L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) (Ver exemplo 1A e Figuras 7 (SEQ ID NO: 11) e 8 (SEQ ID NO: 15)).
[114] A “modificação” de um resíduo/posição de aminoácido, como usado aqui, refere-se a uma troca da sequência primária de aminoácidos como comparado a uma sequência de aminoácidos de partida, sendo que a troca resulta de uma alteração de sequência envolvendo ditos resíduo/posições de aminoácido, por exemplo, modificações típicas incluem substituição do resíduo (ou em dita posição) com outro aminoácido (por exemplo, uma substituição conservativa ou não-conservativa), a inserção de um ou mais (geralmente menos do que 5 ou 3) aminoácidos adjacentes a dito resíduo/posição, e deleção de dito resíduo/posição. Uma “substituição de aminoácido”, ou variação do mesmo, refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido existente em uma sequência predeterminada (de partida) de aminoácidos com um resíduo de aminoácido diferente. Geralmente e de preferência, a modificação resulta em alteração em pelo menos uma atividade físico-bioquímica do polipeptídeo variante comparado a um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de partida (ou do “tipo selvagem”). por exemplo, no caso de um anticorpo, a atividade físico-bioquímica que é alterada pode ser afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação quando de uma molécula de marcação
[115] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpo anti-CD79b monoclonal único (incluindo agonista, antagonista, anticorpos neutralizantes, anticorpo de comprimento completo ou intacto monoclonal), composições de anticorpo anti-CD79b com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles demonstrem a atividade biológica desejada), formados de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpo anti-CD79b de cadeia única, e fragmentos de anticorpo anti-CD79b (ver abaixo), incluindo fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv, diacorpos, anticorpos de domínio único (sdAbs), contanto que eles demonstrem a atividade biológica ou imunológica. O termo “imunoglobulina” (Ig) é usado intercambiável com o presente anticorpo. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade.
[116] O termo “anticorpo anti-CD79b” ou “um anticorpo que se liga a CD79b” refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar CD79b com afinidade suficiente tal que o anticorpo é útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico na marcação de CD79b. De preferência, a extensão de ligação de um anticorpo anti-CD79b para uma proteína não-CD79b, não relacionada, é menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD79b como medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD79b tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 nM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou < 0,1 nM. Em certas modalidades, o anticorpo anti- CD79b liga-se a um epítopo de CD79b que é conservado entre CD79b de diferentes espécies.
[117] Um "anticorpo isolado" é que é identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais de preferência mais do que 99% em peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N- sequência de aminoácidos terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) em homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou de não redução usando Coomassie blue ou, de preferência, coloração prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[118] As 4 unidades básicas de anticorpo de cadeia é a glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas junto com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, e consequentemente contêm 10 sítios de ligação a antígeno, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens compreendendo 2-5 das 4 unidades básicas de cadeia junto com a cadeia J). No caso de IgGs, as 4 unidades de cadeia é geralmente cerca de 150,000 Daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas umas às outras por uma ou mais ligação dissulfeto dependendo do isótipo da cadeia H. Cada cadeia H e cadeia L também tem ligações dissulfeto regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem no término-N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e cadeias Y e quatro domínios CH domínios para os isótipos μ e ε. Cada cadeia L tem um N-término, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. The VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares sejam para formar uma interface entre a cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada. O pareamento de VH e VL juntos forma um sítio de ligação a antígeno único. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e capítulo 6.
[119] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser determinada para um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, baseado nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser determinadas para diferentes classes ou isótipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, tendo cadeias pesadas designadas α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. As classes Y e α são ainda divididas em subclasses na base de diferenças relativamente menores na sequência e função de CH, por exemplo, os humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
[120] A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais de cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável de cadeia pesada pode ser referido como “VH.” O domínio variável de cadeia leve pode ser referido como “VL.” Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação a antígeno.
[121] O termo "variável" refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensamente na sequência entre anticorpos. O domínio V medeia a ligação a antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é igualmente distribuída através do espaço de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em estiramentos relativamente não variantes denominados regiões de estrutura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de regiões de variabilidade extrema denominadas “regiões hipervariáveis” que são cada uma de 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam conexão em laços, e em alguns casos fazendo parte da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelo FRs e, com as regiões hipervariáveis de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a antígeno, mas demonstram várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
[122] Um anticorpo “intacto” é um que compreende um sítio de ligação a antígeno bem como uma CL e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem domínios de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácidos dos mesmos. De preferência, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.
[123] Um “anticorpo nu” para os presentes fins, é um anticorpo que não é conjugado a um rótulo ou porção citotóxica.
[124] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a ligação a antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmento de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (ver patente US 5.641.870, exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende um sítio de ligação a antígeno do anticorpo intacto e assim retém a capacidade para ligar-se a antígeno.
[125] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", e um fragmento residual "Fc", uma designação refletindo a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L completa junto com o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação a antígeno, isto é., ele tem um único sítio de ligação a antígeno. O tratamento com pepsina de um anticorpo dá um fragmento grande único F(ab')2 que corresponde grosseiramente a dois fragmentos Fab ligados a dissulfeto tendo atividade de ligação a antígeno bivalente e é ainda capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem do fragmento Fab por ter poucos resíduos adicionais no término carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a presente designação para Fab' em que um resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. O fragmento F(ab')2 de anticorpos originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de articulação entre eles. Outras copulações químicas de fragmento de anticorpos são também conhecidas.
[126] O fragmento Fc compreende as porções terminas carbóxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, cuja região é também a parte reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
[127] "Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém a sítio de ligação e de reconhecimento de antígenos completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e leve em associação não-covalente, firme. Em uma espécie Fv (scFv) de cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante de peptídeo flexível tal que as cadeias leves e cadeia pesadas podem associar-se em uma estrutura “dimérica” análoga à de em uma espécie de duas cadeias de Fv, da duplicação destes dois domínios surgem seis laços hipervariáveis (3 laços cada um de cadeia H e L) que contribuem para os resíduos de aminoácidos para ligação a antígeno e conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligação inteiro.
[128] "Cadeia de Fv única" também abreviada como "sFv" ou “scFv” são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados em uma cadeia de polipeptídeo única. De preferência, o polipeptídeo de sFv compreendem ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilitam o sFv formar a estrutura desejada para ligação a antígeno. Para um estudo de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
[129] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmentos compreendem o domínio variável de pesada-cadeia (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Os fragmentos de anticorpos menores são preparados por construindo fragmentos sFv (ver o parágrafo precedente) com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL tal que a inter-cadeia, mas não a intra-cadeia, pareando os domínios V é obtida, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento tendo dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois sítios “cruzando” os fragmentos sFv em que os domínios VH e VL de dois anticorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeo diferentes. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:64446448 (1993). Triacorpos e tetracorpos são também descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[130] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos dos indivíduos compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações ocorrendo naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra uma determinante única no antígeno. Além disso, para sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O "monoclonal" modificador não deve ser construído como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, o anticorpo monoclonal útil na presente invenção pode ser preparado pela metodologia de hibridoma primeiramente descrita por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito usando métodos DNUm recombinante em células de planta ou de animais eucarióticas, bacterianas (ver, por exemplo, patente U.S. No. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também pode também ser isolado de bibliotecas de anticorpos de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
[131] Os presentes anticorpos monoclonais incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção de cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante das cadeia(s) é idêntico com ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (ver patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo o domínio variável de sequência de ligação a antígeno derivadas de um primata não-humano (por exemplo, Old World Macaco, Ape etc.), e sequências de região constante humanas.
[132] "Formas humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não-humano. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de espécies não-humanas (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade de anticorpo, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região (FR) da estrutura de imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para ainda para aprimorar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos de FRs são os da sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também, opcionalmente, compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para outros detalhes, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver também os seguintes artigos e referências de estudo citados aqui: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:10351038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994).
[133] “Thio” quando usado aqui refere-se a um anticorpo submetido à engenharia com cisteína enquanto “hu” quando usado aqui refere- se a um anticorpo humanizado.
[134] Um “anticorpo humano” é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou é feita usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos como descrito aqui. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação a antígeno não- humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos são métodos descritos in Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Ver também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados administrando o antígeno a um animal transgênico que é modificado para produzir tais anticorpos em resposta a desafio antigênico, mas cujos loci endógenos é desabilitado, por exemplo, xenocamundongo imunizado (ver, por exemplo, patente U.S. Pat. Nos. 6.075.181 e 6.150.584 com respeito à tecnologia de XENOMOUSETM). Ver também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) com respeito a anticorpos humanos gerados por uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.
[135] O termo “região hipervariável”, “HVR”, ou “HV”, quando usado aqui refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam laços estruturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). Um número de delineações de região hipervariável está em uso e é englobado aqui. As regiões determinantes da complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se ao contrário à localização dos laços estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). A extremidade do laço CDR-H1 de Chothia quando numerada usando a convenção da numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento do laço (isto é, porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, as extremidades do laço em 32; se somente 35A está presente, as extremidades do laço em 33; se ambos 35A e 35B estão presentes, as extremidades do laço em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre os laços estruturais de CDRs de Kabat e de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpo Oxford Molecular's AbM. As regiões hipervariáveis de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são indicados abaixo. Laço Kaba t AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
[136] As regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hipervariáveis estendidas” como a seguir: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra para cada uma destas definições.
[137] “Estrutura” ou resíduos “FR” são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável presentemente definidos.
[138] O termo “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat" ou “numeração da posição de aminoácidos como em Kabat”, e variações do mesmo, refere-se ao sistema de numeração usado para domínio variável de cadeia pesada ou domínio variável de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear atual pode conter alguns aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou CDR de domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um inserto de aminoácido único (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c etc. de acordo com Kabat) depois resíduo 82 FR de cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento a regiões de homologia da sequência do anticorpo com a sequência numerada de Kabat “padrão”
[139] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se referindo a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice de EU” é geralmente usado quando se referindo a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU descrito em Kabat et al., supra). O “índice de EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo EU de IgG1 humano. A menos que descrito ao contrário aqui, referências a números de resíduo no domínio variável de anticorpos significa numeração de resíduo pelo sistema de numeração de Kabat. A menos que descrito ao contrário aqui, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significa numeração de resíduos pelo sistema de numeração de EU (por exemplo, ver Pedido Provisório US No. 60/640,323, Figuras para numeração de EU).
[140] Um anticorpo “amadurecido por afinidade” é um com uma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo para antígeno, comparado a um anticorpo parente que não possui esta(s) alteração(ões). Anticorpos amadurecidos por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno de marcação. Anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem maturação de afinidade embaralhando os domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de HVR e/ou resíduos na estrutura é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
[141] Um anticorpo “de bloqueio” ou um anticorpo “antagonista” é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual ele se liga. Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.
[142] Um “anticorpo agonista”, como usado aqui, é um anticorpo que imida pelo menos uma das atividades funcionais do polipeptídeo de interesse.
[143] Um “anticorpo dependente da espécie”, por exemplo, um anticorpo IgE anti-humano de mamífero, é um anticorpo que tem uma ligação de afinidade mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem para o homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie “liga-se especificamente” a um antígeno humano (isto é, tem um valor (Kd) de afinidade de ligação de não mais do que cerca de 1 x 10-7 M, de preferência não mais do que cerca de 1 x 10-8 e mais de preferência não mais do que cerca de 1 x 10-9 M),mas tem uma afinidade de ligação para o homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cercas de 500 vezes, ou pelo menos cerca 1.000 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser de qualquer um de múltiplos tipos de anticorpos como definido acima, mas de preferência é um anticorpo humano ou humanizado
[144] “Afinidade de ligação” geralmente refere-se à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único da molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado ao contrário, como usado aqui, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade intrínseca de ligação que reflete uma interação 1:1 entre elementos do par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os presentemente descritos. Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam o antígeno lentamente e tendem a dissociar-se prontamente, enquanto anticorpos de alta geralmente ligam antígeno mais rápido e tendem a permanecer mais ligados. Uma variedade de métodos de medir afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas são descritas a seguir.
[145] “Ou melhor” quando usado aqui para referir-se à afinidade de ligação refere-se a uma ligação mais forte entre a molécula e seu parceiro de ligação. “Ou melhor” quando usado aqui refere-se a uma ligação mais forte, representada por um valor Kd numérico menor. Por exemplo, um anticorpo que tem uma afinidade para um antígeno de “0.6 nM ou melhor”, a afinidade do anticorpo para o antígeno é <.6 nM, isto é, .59 nM, .58 nM, .57 nM etc. ou qualquer valor menor do que 0.6 nM.
[146] Em uma modalidade, “Kd” ou “valor Kd” de acordo com esta invenção é medido por uma ligação radiorrotulada a ensaio de antígeno (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito pelo seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação da solução de Fabs para antígeno equilibrando Fab com uma concentração mínima de antígeno rotulado com (125I) na presença de uma série de titulação de antígeno não rotulado, então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, as placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS durante duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não-absorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM -antígeno são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar durante um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para assegurar que o equilíbrio é alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, para uma hora). A solução é então removida e a placa é lavada oito vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS. Quando as placas secaram, 150 μl/reservat0rio de cintilante (MicroScint-20; Packard) são adicionados e as placas são contadas em um contador gama Topcount (Packard) durante dez minutos. Concentrações de cada Fab, que deram menos do que ou igual a 20% de ligação máxima, são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos. De acordo com outra modalidade o Kd ou valor Kd é medido usando ensaios de ressonância plasmon e superfície usando um BIAcoreTM-2000 ou um BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 de antígeno imobilizado em ~10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-ethyl-N’- (3- dimetilaminopropil)-carbodiimide (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10mM, pH 4,8, em 5ug/ml (~0,2uM) antes de injeção em uma taxa de fluxo de 5ul/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína copulada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0.05% Tween 20 (PBST) a 25°C em uma taxa defluxo de aproximadamente 25ul/min. Taxas de associação (ligado) e taxas de dissociação (kdesligado) são calculadas usando um modelo de ligação Langmuir um-para-um simples (BIAcore Evaluation Software versão3.2) por ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a relação kligada/kdesligada por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a taxa ligada exceder 106 M-1 S-1 pelo ensaio de ressonância plasmon acima, então a taxa ligado pode ser determinada usando uma técnica de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou decréscimo na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa banda 16 nm) a 25oC do anticorpo anti-antígeno de 20nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medida em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM- Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta vermelha de agitação.
[147] Uma “taxa ligada (on-rate)” ou “taxa de associação” ou “taxa associação” ou “kligado” de acordo com esta invenção também pode ser determinada com a mesma técnica de ressonância plasmon de superfície descrito acima usando um BIAcoreTM-2000 ou um BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) como descrito acima.
[148] A frase “substancialmente similar,” ou “substancialmente a mesma”, como usado aqui, indica um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associado com o anticorpo de referência/comparador) tal que um dos versados na técnica poderiam considerar a diferença entre os dois valores a ser de pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, valores Kd). A diferença entre ditos dois valores é de preferência menos do que cerca de 50%, de preferência 40%, de preferência menos do que cerca de 30%, de preferência menos do que cerca de 20%, de preferência menos do que cerca de 10% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparador.
[149] A frase “substancialmente reduzido,” ou “substancialmente diferente”, como usado aqui, indica um grau suficientemente alto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e o outro associado com o anticorpo de referência/comparador) tal que um dos versados na técnica poderiam considerar a diferença entre os dois valores a serem de significado estatístico dentro do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, valores Kd, resposta de HAMA). A diferença entre ditos dois valores é de preferência maior do que cerca de 10%, de preferência maior do que cerca de 20%, de preferência maior do que cerca de 30%, de preferência maior do que cerca de 40%, de preferência maior do que cerca de 50% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparador.
[150] Um “antígeno” é um antígeno predeterminado ao qual um anticorpo pode ligar-se seletivamente. O antígeno de marcação pode ser polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto ocorrendo naturalmente ou sintético. De preferência, o antígeno de marcação é um polipeptídeo.
[151] Uma “estrutura humana aceptora” para os presentes fins é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de VL ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana, ou de uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura aceptora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter trocas de sequências de aminoácidos pré-existentes. Onde trocas de aminoácidos pré-existentes estão presentes, de preferência não mais do que 5 e de preferência 4 ou menos, ou 3 ou menos, trocas de aminoácidos pré- existentes estão presentes. Onde trocas de aminoácidos pré-existentes estão presentes em um VH, de preferência as trocas são somente em três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, a estrutura humana aceptora VL é idêntica na sequência para a sequência de estrutura de imunoglobulina humana VI ou sequência de estrutura de consenso humana.
[152] “Estrutura de consenso humana” é a estrutura que representa o resíduo de aminoácido ocorrendo mais comumente em uma seleção de imunoglobulina humana VL ou sequências de estrutura de VH. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como in Kabat et al. Em uma modalidade, para o VL, o subgrupo é subgrupo kappa I como in Kabat et al. Em uma modalidade para o VH. O subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al.
[153] Uma “estrutura de consenso do subgrupo III de VH” compreende a sequência de consenso obtida de uma sequência de aminoácidos no subgrupo III de variável pesada de Kabat et al. Em uma modalidade, sequência de aminoácidos da estrutura de consenso do subgrupo III de VH compreende pelo menos a porção ou todas de cada uma das seguintes sequências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143)-H1- WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145)-H3- WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
[154] A “estrutura de consenso do subgrupo I de VL” compreende a sequência de consenso obtida de uma sequência de aminoácidos no subgrupo I de kappa de variável leve de Kabat et al. Em uma modalidade, sequência de aminoácidos da estrutura de consenso do subgrupo I de VL compreende pelo menos uma porção ou toda de cada uma das seguintes sequências: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142).
[155] Uma “estrutura humana não modificada” é a estrutura humana que tem a mesma sequência de aminoácidos como a estrutura humana aceptora, por exemplo, desprovida de humanos em substituição(ões) de aminoácidos não-humanos na estrutura humana aceptora.
[156] Uma “região hipervariável alterada” para os presentes fins é a região hipervariável compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma a cerca de 16) substituição(ões) de aminoácidos.
[157] Uma “região hipervariável não modificada”, com os propósitos desta, é uma região hipervariável com a mesma sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano do qual ela foi derivada, isto é, uma que não tem uma ou mais substituições de aminoácidos nela.
[158] Um anticorpo “que liga” um antígeno de interesse, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo alvo associado a tumor, é um que liga o antígeno com afinidade suficiente, de maneira tal que o anticorpo seja usado como um agente terapêutico no alvejamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não reaja de maneira cruzada significativamente com outras proteínas. Em tais modalidades, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína “não alvo” será menos que cerca de 10 % da ligação do anticorpo a sua proteína alvo particular da maneira determinada por análise de separação de célula ativada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo particular alvo significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. Ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula comparada à ligação de uma molécula controle, que em geral é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo particular alvo, da maneira aqui usada, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-11 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-12 M ou mais. Em uma modalidade, o termo “ligação específica” refere-se à ligação onde uma molécula liga-se a um polipeptídeo particular ou epítopo em um polipeptídeo particular sem ligar-se substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[159] Um anticorpo que “inibe o crescimento de células de tumor que expressam um polipeptídeo CD79b” ou um anticorpo “inibitório de crescimento” é um que resulta na inibição de crescimento mensurável de células de câncer que expressam ou superexpressam o polipeptídeo CD79b apropriado. O polipeptídeo CD79b pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso na superfície de uma célula cancerígena ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma célula cancerígena. Anticorpos anti-CD79b inibitórios de crescimento preferidos inibem o crescimento de células de tumor que expressam CD79b em mais que 20 %, preferivelmente de cerca de 20 % a cerca de 50 %, e ainda mais preferivelmente, em mais que 50 % (por exemplo, de cerca de 50 % a cerca de 100 %) comparado ao controle apropriado, o controle sendo tipicamente células de tumor não tratadas com o anticorpo que está sendo testado. Em uma modalidade, a inibição de crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 μg/mL ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura de célula, onde a inibição de crescimento é determinada 1-10 dias após exposição das células de tumor ao anticorpo. A inibição de crescimento de células de tumor in vivo pode ser determinada de várias maneiras tal como é descrito na seção de exemplos experimentais a seguir. O anticorpo é inibitório de crescimento in vivo se administração do anticorpo anti-CD79b em cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resultar em redução no tamanho do tumor ou proliferação de célula de tumor em cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente em cerca de 5 a 30 dias.
[160] Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celular programada determinada pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célula é usualmente uma que superexpressa um polipeptídeo CD79b. Preferivelmente, a célula é uma célula de tumor, por exemplo, uma célula hematopoiética, tal como uma célula B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monócito, plaqueta ou eritrócito. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados a apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida por ligação de anexina; fragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de escada de DNA; e condensação nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento em células hipodiplóides. Preferivelmente, o anticorpo que induz apoptose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, na indução de ligação de anexina com relação à célula não tratada em um ensaio de ligação de anexina.
[161] Um anticorpo que “induz morte celular” é um que faz com que uma célula viável se torne não viável. A célula é uma que expressa um polipeptídeo CD79b e é de um tipo celular que expressa especificamente ou superexpressa um polipeptídeo CD79b. A célula pode ser célula cancerosa ou normal do tipo celular particular. O polipeptídeo CD79b pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso na superfície de uma célula cancerígena ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por uma célula cancerígena. A célula pode ser uma célula cancerígena, por exemplo, uma célula B ou célula T. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetoras imunes para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, o ensaio para morte celular pode ser realizado usando soro inativado pelo calor (isto é, na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunes. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, a perda de integridade de membrana avaliada pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser estimada com relação a células não tratadas. Anticorpos que induzem morte celular preferidos são aqueles que induzem absorção de PI no ensaio de captação de PI em células BT474.
[162] “Funções efetoras” do anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou sequência de região Fc variante de aminoácido) de um anticorpo, e variam com o isótipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infraregulação de receptores superficiais celulares (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.
[163] O termo “região Fc” é aqui usado para definir uma região C terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila deste. A lisina do terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou modificando recombinantemente por engenharia o ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo, Dessa maneira, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem nenhum resíduo K447 removido e populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem resíduo K447.
[164] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. “Funções efetoras” exemplificativos incluem ligação C1q, CDC, ligação de receptor Fc, ADCC, fagocitose, infraregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B, BCR), etc. Em geral, tais funções efetoras exigem que a região Fc combine com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas usando múltiplos ensaios da maneira revelada, por exemplo, aqui nas definições.
[165] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (Alótipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa bem como variantes de ocorrência natural destas.
[166] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituição(s) de aminoácido(s). Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado à uma região Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo pai, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo pai. A região Fc variante possuirá aqui preferivelmente pelo menos cerca de 80 % de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo pai, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de homologia a isso, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % de homologia a isso.
[167] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada nos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite estas células efetoras citotóxicas se ligarem especificamente a uma célula alvo que carrega antígeno e matar subsequentemente a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos “armam” as células citotóxicas e são absolutamente exigidos para tal exterminação. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FCYRIII, ao passo que monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito em patente U.S. 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetoras usadas para tais ensaios incluem células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998).
[168] "Fc receptor" ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além do mais, um FcR preferido é um que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos destes. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação a base de tirosina de imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FCYRIIB contém um motivo de inibição a base de tirosina de imunorreceptor (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver revisão M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a ser identificados no futuro, são aqui incluídos pelo termo "FcR". O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
[169] Ligação no peptídeo FcRn humano in vivo e ligação de FcRn de meia vida sérica de humano de alta afinidade polipeptídeos podem ser ensaiadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens celulares humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas para os quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. WO 2000/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpo com maior ou menor ligação a FcRs. Ver também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[170] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FCYRIII e realizam funções efetoras de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), células exterminadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.
[171] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação do caminho de complemento clássico é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados no seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, um ensaio CDC, por exemplo, da maneira descrita em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202:163 (1996), pode ser realizado. Variantes de polipeptídeo com sequências de aminoácidos de região Fc alteradas (polipeptídeos com uma região Fc variante) e maio ou menor capacidade de ligação de C1q são descritas, por exemplo, em patente U.S. 6.194.551 B1 e WO 1999/51642. Ver também, por exemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[172] O termo “anticorpo que compreende região Fc” refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. O C-terminal lisina (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removido, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou modificando recombinantemente por engenharia do ácido nucleico que codifica o anticorpo. Dessa maneira, uma composição que compreende um anticorpo com uma região Fc de acordo com esta invenção pode compreender um anticorpo com K447, com todo K447 removido, ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.
[173] O "domínio extracelular" do polipeptídeo CD79b ou “ECD” refere-se a uma forma do polipeptídeo CD79b que é essencialmente livre da transmembrana e domínios citoplasmáticos. Em geral, um ECD de polipeptídeo CD79b terá menos que 1 % de tais transmembrana e/ou domínios citoplasmáticos e, preferivelmente, terá menos que 0,5 % de tais domínios. Será entendido que quaisquer domínios de transmembrana identificados para os polipeptídeos CD79b da presente invenção são identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar qual tipo de domínio hidrofóbico. Os limites exatos de um domínio transmembrana podem variar, mas muito provavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer extremidade do domínio da maneira inicialmente aqui identificada. Portanto, opcionalmente, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b pode conter de cerca de 5 ou menos aminoácidos em qualquer lado do limite domínio transmembrana/domínio extracelular da maneira identificada nos exemplos ou especificação e tais polipeptídeos, com ou sem o peptídeo sinal associado, e ácido nucleico que os codifica, são contemplados pela presente invenção.
[174] O local aproximado dos “peptídeos sinais” do polipeptídeo CD79b aqui revelado pode ser mostrado na presente especificação e/ou as figuras que acompanham. Entretanto, nota-se que o limite do terminal C de um peptídeo sinal pode variar, mas muito provavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite do terminal C do peptídeo sinal, da maneira inicialmente aqui identificada, em que o limite do terminal C do peptídeo sinal pode ser identificado de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar esse tipo de elemento sequência de aminoácidos (por exemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Além do mais, também se reconhece que, em alguns casos, a clivagem de uma sequência sinal de um polipeptídeo secretado não é completamente uniforme, resultando em mais que uma espécie secretada. Estes polipeptídeos maduros, onde o peptídeo sinal é clivado em não mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite do terminal C do peptídeo sinal da maneira aqui identificada, e os polinucleotídeos que os codificam, são contemplados pela presente invenção.
[175] "Variante do polipeptídeo CD79b" significa um polipeptídeo CD79b, preferivelmente um polipeptídeo CD79b ativo, da maneira aqui definida com pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada (tal como aquela codificada por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptídeo CD79b de comprimento total). Tais variantes de polipeptídeo CD79b incluem, por exemplo, polipeptídeos CD79b em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, nos terminais N ou C da sequência de aminoácidos nativa de comprimento total. Em geral, uma variante de polipeptídeo CD79b terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos, com uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada. Em geral, variantes de polipeptídeos CD79b têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de comprimento ou mais. Opcionalmente, variantes de polipeptídeos CD79b terão não mais que uma substituição conservativa de aminoácido comparado à sequência de polipeptídeo CD79b nativa, alternativamente não mais que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições conservativas de aminoácido comparado à sequência de polipeptídeo CD79b nativa.
[176] "Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos" com relação a um peptídeo ou sequência de polipeptídeo, isto é, sequências de polipeptídeo CD79b aqui identificadas, é identificado como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no peptídeo ou sequência de polipeptídeo específico, isto é, sequência de polipeptídeo CD79b, após alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Alinhamento com propósitos de determinar percentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser atingido de várias maneiras que são conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente tais como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir alinhamento máximo com relação ao comprimento total das sequências que são comparadas. Entretanto, com propósitos aqui, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na tabela 1 a seguir. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na tabela 1 a seguir foi depositado com documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob No de Registro de Direito Autoral US TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na tabela 1 a seguir. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[177] Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (pode ser alternativamente fraseada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculado da maneira a seguir: 100 vezes a fração X/Y.
[178] em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como pares idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Percebe-se que onde o comprimento de sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento de sequência de aminoácidos B, o % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual ao % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A.
[179] "Polinucleotídeo variante de CD79b" ou “sequência de ácidos nucleicos variante CD79b” significa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD79b, preferivelmente um polipeptídeo CD79b ativo, da maneira aqui definida e que tem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada (tal como aquela codificada por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência de codificação completa para um polipeptídeo CD79b de comprimento total). Em geral, um polinucleotídeo variante de CD79b terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de ácidos nucleicos, alternativamente pelo menos cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência de ácidos nucleicos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total da maneira aqui revelada, uma sequência de polipeptídeo CD79b de sequência nativa de comprimento total que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, um domínio extracelular de um polipeptídeo CD79b, com ou sem a sequência sinal, da maneira aqui revelada ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada. Variantes não incluem a sequência de nucleotídeo nativo.
[180] Em geral, polinucleotídeos variantes de CD79b são pelo menos cerca de 5 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento, em que neste contexto o termo “cerca de” significa o comprimento da sequência de nucleotídeo referenciado mais ou menos 10 % daquele comprimento referenciado.
[181] "Percentual (%) de identidade de sequência de ácidos nucleicos" com relação a sequências de ácido nucleico que codificam CD79b aqui identificadas é definido como a porcentagem de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos na sequência de ácidos nucleicos CD79b de interesse, após alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência. Alinhamento com propósitos de determinar percentual identidade de sequência de ácidos nucleicos pode ser atingido de várias maneiras que são conhecidas pelos versados na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Entretanto, com propósitos aqui, os valores de % de identidade de sequência de ácidos nucleicos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na tabela 1 a seguir. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na tabela 1 a seguir foi depositado como documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado em U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 é publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na tabela 1 a seguir. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[182] Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de ácidos nucleicos, o % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de uma dada sequência de ácidos nucleicos C para, com, ou contra uma dada sequência de ácidos nucleicos D (que pode ser alternativamente fraseada como uma dada sequência de ácidos nucleicos C que tem ou compreende um certo % de identidade de sequência de ácidos nucleicos para, com, ou contra uma dada sequência de ácidos nucleicos D) é calculado da maneira a seguir: 100 vezes a fração W/Z, em que W é o número de nucleotídeos pontuados como pares idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de C e D, e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Percebe-se que onde o comprimento de sequência de ácidos nucleicos C não é igual ao comprimento de sequência de ácidos nucleicos D, a % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de C para D não será igual a % de identidade de sequência de ácidos nucleicos de D para C. A menos que de outra maneira especificamente declarada, todos os valores da % de identidade de sequência de ácidos nucleicos aqui usados são obtidos da maneira descrita no parágrafo imediatamente precedente usando o programa de computador ALIGN- 2.
[183] Em outras modalidades, polinucleotídeos variantes de CD79b são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo CD79b e que são capazes de hibridizar, preferivelmente em condições de hibridização e de lavagem rigorosas, nas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo CD79b de comprimento total da maneira aqui revelada. Variantes de polipeptídeos CD79b podem ser aqueles que são codificados por um polinucleotídeo variante de CD79b.
[184] O termo “região de codificação de comprimento total” quando usado com relação a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD79b refere-se à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo CD79b de comprimento total da invenção (que é frequentemente mostrado entre códons inicial e de parada, inclusive dele, nas figuras que acompanham). O termo “região de codificação de comprimento total” quando usado com relação a um ácido nucleico depositado em ATCC refere-se à porção que codifica polipeptídeo CD79b do DNAc que está inserido no vetor depositado com a ATCC (que é frequentemente mostrado entre códons inicial e de parada, inclusive nele, nas figuras que acompanham (códons inicial e de parada estão em negrito e sublinhados nas figuras)).
[185] "Isolado", quando usado para descrever os múltiplos polipeptídeos CD79b aqui revelados, significa polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interferem tipicamente com usos terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de Sequência de aminoácidos N terminal ou interna pelo uso de uma centrífuga sequenciadora, ou (2) até a homogeneidade por SDS-PAGE em condições de não redução ou redução usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração prata. O polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ em células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo CD79b não estará presente. Entretanto, em geral, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[186] Um ácido nucleico que codifica polipeptídeo CD79b "isolado" ou outro ácido nucleico que codifica polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula contaminante de ácido nucleico com a qual está em geral associada à fonte natural do ácido nucleico que codifica polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo isolado é diferente da forma ou ambiente no qual é encontrada na natureza. Portanto, moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo isolado são distinguidas da molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo específico uma vez que existem em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo isolado inclui moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo contido em células que expressam em geral o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossômico diferente daquele das células naturais.
[187] O termo "sequências controle" refere-se às sequências de DNA necessárias para a expressão de um sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e melhoradores.
[188] O ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, DNA para uma pré sequência ou líder secretório está operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se estiver expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou melhorador está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de maneira a facilitar a tradução. Em geral, "operavelmente ligado" significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, melhoradores não têm que ser contíguos. A ligação realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligantes são usados de acordo com a prática convencional.
[189] A "rigorosidade" de reações de hibridização é facilmente determinável pelos versados na técnica, e em geral é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas mais altas para anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtas precisam de temperaturas mais baixas. Em geral, a hibridização dependente da capacidade do DNA desnaturado reanelar quando as fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre a sonda e sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada. Portanto, em decorrência disto, temperaturas relativas mais altas tenderiam a tornar as condições de reação mais estritas, enquanto temperaturas mais baixas menos ainda. Para detalhes adicionais e explicação da rigorosidade de reações de hibridização, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[190] "Condições rigorosas" ou "condições de alta rigorosidade", da maneira aqui definida, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa concentração iônica e alta temperatura para lavar, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M /citrato de sódio 0,0015 M /dodecil sulfato de sódio 0,1 % a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50 % de (v/v) formamida com albumina sérica bovina 0,1 % /Ficoll 0,1 % /polivinilpirrolidona 0,1 % /tampão de fosfato de sódio 50mM em pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) hibridizam por toda a noite em uma solução que emprega formamida 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1 %, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/mL), SDS 0,1 %, e sulfato de dextran 10 % a 42°C, com uma lavagem de 10 minutos a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de 10 minutos de alta rigorosidade consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C.
[191] "Condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadas da maneira descrita por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, concentração iônica e % de SDS) menos estritas que aquelas descritas anteriormente. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é incubação por toda a noite a 37°C em uma solução que compreende: formamida 20 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, tricitrato de sódio 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextran 10 %, e 20 mg/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC em cerca de 37-50°C. Os versados na técnica identificarão como ajustar a temperatura, concentração iônica etc. da maneira necessária para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e similares.
[192] O termo "epítopo marcado" quando aqui usado refere-se a um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídeo CD79b ou anticorpo anti-CD79b ligado a um "polipeptídeo tag". O polipeptídeo tag tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser produzido, mesmo sendo curto o suficiente, de maneira tal que não interfira com atividade do polipeptídeo no qual está ligado. Preferivelmente, o polipeptídeo tag também é absolutamente exclusivo de maneira tal que o anticorpo não reage substancialmente de forma cruzada com outros epítopos. Polipeptídeos tag adequados em geral têm pelo menos seis resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (preferivelmente, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos).
[193] "Ativo" ou "atividade" com os propósitos desta refere-se a forma(s) de um polipeptídeo CD79b que retém uma atividade biológica e/ou imunológica de CD79b nativo ou de ocorrência natural, em que a atividade "biológica" refere-se a uma função biológica (tanto inibitória ou estimulatória) causada por um CD79b nativo ou de ocorrência natural sem ser a capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico dominado por um CD79b nativo ou de ocorrência natural e uma atividade “imunológica” refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigênico dominado por um CD79b nativo ou de ocorrência natural.
[194] O termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo CD79b nativo. Em uma maneira similar, o termo "agonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que mimetiza uma atividade biológica de um polipeptídeo CD79b nativo. Moléculas agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou sequência de aminoácidos variantes de polipeptídeos CD79b nativos, peptídeos, oligonucleotídeos antissentido, moléculas orgânicas pequenas etc. Métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo CD79b podem compreender colocar um polipeptídeo CD79b em contato com um molécula agonista ou antagonista candidata e medir uma mudança detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo CD79b.
[195] “Purificado” significa que uma molécula está presente em uma amostra em uma concentração de pelo menos 95 % em peso, ou pelo menos 98 % em peso da amostra na qual está contida.
[196] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” é uma molécula de ácido nucleico que é separada de pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico com a qual está em geral associada, por exemplo, em seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui adicionalmente uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam em geral a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou em um local cromossômico que é diferente de seu local cromossômico natural.
[197] Pretende-se que o termo "vetor", da maneira aqui usada, refira-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a uma alça de DNA dupla fita circular na qual segmentos adicionais de DNA podem estar ligados. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem estar ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais de mamífero) podem estar integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira, e são por meio disso, replicados junto com o genoma hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes nos quais eles estão eficientemente ligados. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indiferentemente já que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada.
[198] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", da maneira aqui usada indiferentemente, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser concedida antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após síntese, tal como por conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "capas", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleosídeos tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo frações pendentes, tal como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo queladores (por exemplo, metais, metais radioativos, baro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionalmente, quaisquer dos grupos hidroxila, em geral presentes nos açúcares, podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados em suportes sólidos ou semi-sólidos. O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou frações de grupo de capeamento orgânico de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivadas de grupos protetores padrão. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são em geral conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O- alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares anoméricos alfa, açúcares epiméricos tal como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, psedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas sem limitações, modalidades em que fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR.sub.2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OU', CO ou CH.sub.2 ("formacetal"), no qual cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou insubstituída (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
[199] "Oligonucleotídeo", da maneira aqui usada, em geral refere- se a polinucleotídeos curtos, em geral de fita dupla, em geral sintéticos que têm em geral, mas não necessariamente, menos que cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. As palavras "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivas. A descrição anterior para polinucleotídeos é igual e totalmente aplicável aos oligonucleotídeos.
[200] As palavras "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitações, cânceres hematopoiéticos ou cânceres relacionados ao sangue, tal como linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfoides, mas também cânceres do baço e cânceres dos linfonodos e também carcinoma, blastoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de câncer incluem cânceres associados a célula B, incluindo, por exemplo, linfomas de alto, intermediário e baixo grau (incluindo linfomas de célula B tais como, por exemplo, linfoma de célula B de tecido linfoide associado a mucosa e linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de célula do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de zona marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular, e linfoma de Hodgkin e linfomas de célula T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica (CLL), tal como leucemia de célula B (linfócitos CD5+ B), leucemia mieloide, tais como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide, tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL) e mielodisplasia), e outros cânceres hematológicos e/ou associados a célula B ou a célula T. São também incluídos cânceres de células hematopoiéticas adicionais, incluindo leucócitos polimorfonucleares, tais como basófilos, eosinófilos, neutrófilos e monócitos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células exterminadoras naturais. São também incluídos distúrbios proliferativos de célula B cancerosa selecionados dos seguintes: linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto. As origens de cânceres de célula B incluem como se segue: origens de linfoma de célula B de zona marginal em células B de memória na zona marginal, linfoma folicular e linfoma de célula B grande difusa originam-se em centrócitos na zona clara de centros germinais, leucemia linfocítica crônica e leucemia linfocítica pequena originam-se em células B1 (CD5+), linfoma de célula do manto origina-se em células B simples na zona do manto e linfoma de Burkitt origina-se em centroblastos na zona escura de centros germinais. Tecidos que incluem células hematopoiéticas aqui referidos como as “tecidos de célula hematopoiética” incluem timo e medula óssea e tecidos linfoides periféricos, tal como baço, linfonodos, tecidos linfoides associados à mucosa, tal como o tecidos linfoides associados ao intestino, tonsilas, placas de Peyer e apêndice e tecidos linfoides associados a outra mucosa, por exemplo, os revestimentos brônquicos. Exemplos particulares adicionais de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, carcinoma hepático, leucemia e outros distúrbios linfoproliferativos e múltiplos tipos de câncer de cabeça e pescoço.
[201] Uma “malignidade de célula B” inclui aqui linfoma não Hodgkin (NHL), incluindo NHL de baixo grau/folicular, NHL linfocítico pequeno (SL), NHL de grau intermediário/folicular, NHL de grau intermediário difuso, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de alto grau, NHL de doença volumosa, linfoma de célula do manto, Linfoma relacionado à AIDS, e macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma não Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin com predominância linfocitária (LPHD), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica crônica (CLL), NHL indolente incluindo NHL indolente reincidente e NHL indolente refratário com rituximab; leucemia, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, leucemia mieloblástica crônica; linfoma de célula do manto; e outras malignidades hematológicas. Tais malignidades podem ser tratadas com anticorpos direcionados contra marcadores de superfície de célula B, tal como CD79b. Pretende-se aqui que tais doenças sejam tratadas pela administração de um anticorpo direcionado contra um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado(“nu”) ou um anticorpo conjugado com um agente citotóxico da maneira aqui revelada. Pretende-se aqui também que tais doenças sejam tratadas por terapia de combinação incluindo um conjugado de medicamento de anticorpo anti-CD79b ou anticorpo anti-CD79b da invenção em combinação com outro anticorpo ou conjugado de medicamento de anticorpo, outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série. No método de tratamento exemplar da invenção, um anticorpo anti-CD79b da invenção é administrado em combinação com um anticorpo anti-CD20, imunoglobulina, ou fragmento de ligação de CD20 deste, tanto junto quanto sequencialmente. O anticorpo anti-CD20 pode ser um anticorpo nu ou um conjugado de medicamento de anticorpo. Em uma modalidade da terapia de combinação, o anticorpo anti-CD79b é um anticorpo da presente invenção e o anticorpo anti-CD20 é Rituxan® (rituximab).
[202] O termo “linfoma não Hodgkin” ou “NHL”, da maneira aqui usada, refere-se a um câncer do sistema linfático sem serem linfomas de Hodgkin. Os linfomas de Hodgkin podem ser em geral distinguidos de linfomas não Hodgkin pela presença de células de Reed-Sternberg em linfomas de Hodgkin e a ausência das ditas células em linfomas não Hodgkin. Exemplos de linfomas não Hodgkin incluídos pelo termo da maneira aqui usada incluem quaisquer daqueles que são identificados como tais pelos versados na técnica (por exemplo, um oncologista ou patologista) de acordo com esquemas de classificação conhecidos na técnica, tal como o esquema europeu americano revisado de linfoma (REAL) da maneira descrita em Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Ver, em particular, as listas nas figuras. 11.57, 11.58 e 11.59. Exemplos mais específicos incluem, mas sem limitações, NHL reincidente ou refratário, NHL de grau baixo de linha de frente, NHL estágio III/IV, NHL resistente à quimioterapia, leucemia linfoblástica de precursor B e/ou linfoma, linfoma linfocítico pequeno, leucemia de célula B linfocítica crônica e/ou proleucemia linfocítica e/ou linfoma linfocítico pequeno, linfoma prolinfocítico de célula B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmático, linfoma linfoplasmático, linfoma de célula B de zona marginal, linfoma esplênico de zona marginal, linfoma MALT de zona marginal extradonal, linfoma nodal de zona marginal, leucemia de célula pilosa, plasmacitoma e/ou mieloma de célula plasmática, linfoma de grau baixo/folicular, NHL de grau intermediário /folicular, linfoma de célula do manto, linfoma de centro de folículo (folicular), NHL de grau intermediário difuso, linfoma de célula B grande difusa, NHL agressivo (incluindo NHL de linha de frente agressivo e NHL reincidente agressivo), NHL reincidente ou refratário após transplante de célula tronco autóloga, linfoma de célula B grande mediastinal principal, linfoma de efusão primária, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de alto grau, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursora (periférica), micose fungóide e/ou síndrome de Sezary, linfomas de pele (cutâneo), linfoma anaplástico de célula grande, linfoma angiocêntrico.
[203] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficia do tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicas ou agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios a serem aqui tratados incluem condições cancerosas tais como tumores malignos e benignos; malignidades linfoides e não leucemias; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, imunológicos e outros relacionados à angiogênese. Distúrbios adicionais incluem condições cancerosas tais como distúrbios proliferativos de célula B e/ou tumores de célula B, por exemplo, linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
[204] Os termos “distúrbio de célula proliferativa” e “distúrbio proliferativo” referem-se à distúrbios que estão associados a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio de célula proliferativa é câncer.
[205] "Tumor", da maneira aqui usada, refere-se a todo crescimento celular e proliferação neoplásicos, quer maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
[206] Uma “doença autoimune” aqui é uma doença ou distúrbio que resulta e está direcionado contra os próprios tecidos ou órgãos de um indivíduo ou um co-segregado ou manifestação deste ou condição que resulta deste. Em muitos destes distúrbios autoimunes e anti-inflamatórios, inúmeros marcadores clínicos e laboratoriais podem existir, incluindo, mas sem limitação, hipergamaglobulinemia, altos níveis de autoanticorpos, depósitos de complexo antígeno-anticorpo em tecidos, benefício de tratamentos com corticosteroides ou imunossupressores, e agregados de célula linfoide em tecidos afetados. Sem ficar limitado a nenhuma teoria com relação à doença autoimune mediada por célula B, acredita-se que células B demonstram um efeito patogênico em doenças autoimunes humanas por meio de uma variedade de caminhos mecanicistas, incluindo produção de autoanticorpo, formação do complexo imune, ativação de célula dendrítica e T, síntese de citocina, liberação direta de quimiocina, e fornecendo um ninho para neolinfogênese ectópica. Cada um destes caminhos pode participar de diferentes graus na patologia das doenças autoimunes.
[207] "Doença autoimune" pode ser uma doença específica de órgão (isto é, a resposta imune é especificamente direcionada contra um sistema de órgão tal como o sistema endócrino, o sistema hematopoiético, a pele, o sistema cardiopulmonar, os sistemas gastrointestinal e hepático, o sistema renal, a tireóide, os ouvidos, o sistema neuromuscular, o sistema nervoso central, etc.) ou uma doença sistêmica que pode afetar sistemas de órgãos múltiplos (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide, polimiosite, etc.). Tais doenças preferidas incluem distúrbios reumatológicos autoimunes (tai como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, escleroderma, lúpus tais como SLE e nefrite de lúpus, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome de anticorpo anti-fosfolipídeo, e artrite psoriática), distúrbios gastrointestinais e hepáticos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças intestinais inflamatórias (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, e doença celíaca), vasculite (tais como, por exemplo, vasculite negativa para ANCA e vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener, e poliangiite microscópica), distúrbios neurológicos autoimunes (tal como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome opsoclonus mioclonus, miastenia grave, neuromielite ótica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e polineuropatias autoimunes), distúrbios renais (tal como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, e doença de Berger), distúrbios dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, coceiras, pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso, e lúpus eritematoso cutâneo), distúrbios hematológicos (tais como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura após transfusão, e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveíte, doenças auditivas autoimunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda da audição), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgão, e distúrbios endócrinos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças autoimunes relacionadas à diabetes tal como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), doença de Addison, e doença da tireoide autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). Tais doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite.
[208] Exemplos específicos de outras doenças autoimunes da maneira aqui definida, que em alguns casos incluem aquelas anteriormente listadas, incluem, mas sem limitações, artrite (aguda e crônica, artrite reumatoide incluindo artrite reumatoide de início juvenil e estágios tais como sinovite reumatoide, gota ou artrite gotosa, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral, osteoartrite, artrite crônica pró-gradiente, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa, artrite na menopausa, artrite por diminuição de estrogênio, e espondilite anquilosante/espondilite reumatoide), doença linfoproliferativa autoimune, doenças de pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase em placas, psoríase de gutatte, psoríase pustular, e psoríase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tais como febre de Hay e síndrome de Job, dermatite incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite esfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, coceiras, dermatite de forma herpética, dermatite numular, dermatite seborreica, dermatite não específica, dermatite de contato irritante primária, e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada ao X, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas, urticária tais como urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmica), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tais como MS espino-ótica, MS progressiva primária (PPMS), e MS reincidente remitente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite ótica (NMO), doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas por doença autoimune, inflamação gastrointestinal, colite tais como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante, e colite transmural, e doença intestinal inflamatória autoimune), inflamação intestinal, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, síndrome do diestress respiratório, incluindo síndrome do diestress respiratório do adulto ou aguda (ARDS), meningite, inflamação de toda ou partes da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, doença enxerto versus hospedeiro, angioedema tal como angioedema hereditário, dano ao nervo craniano como na meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurido escrotal, insuficiência ovariana prematura autoimune, perda repentina da audição em virtude de uma condição autoimune, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tais como encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, uveíte, tais como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior, ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite crônica ou aguda tais como GN primária, GN mediada por sistema imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN proliferativa de membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva (RPGN), nefrite proliferativa, insuficiência endócrina poliglandular autoimune, balanite incluindo balanite plasmacelular circunscrita, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrômico persistente, eritema multiforme, granuloma anular, líquen nítido, líquen escleroso e atrópico, líquen simples crônico, líquen espinuloso, líquen plano, ictiose lamelar, hiperceratose epidermolítica, ceratose pré-malígna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, alergias alimentares, alergias a medicamentos, alergias a insetos, distúrbios alérgicos raros tais como mastocitose, reação alérgica, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico, e eczema palmoplantar vesicular, asma tal como asma bronquial, asma brônquica, e asma autoimune, condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, reações imune contra antígenos estrangeiros tais como grupos sanguíneos fetais A-B-O durante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus, incluindo nefrite de lúpus, cerebrite lúpica, lúpus pediátrica, lúpus não renal, lúpus extra renal, lúpus discoide e lúpus eritematoso discoide, alopécia do lúpus, SLE, tal como SLE cutânea ou SLE cutânea subaguda, síndrome de lúpus neonatal (NLE), e lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de início juvenil (Tipo I), incluindo IDDM pediátrica, diabetes mellitus de início adulto (diabetes Tipo II), diabetes autoimune, diabetes insípidos idiopática, retinopatia diabética, nefropatia diabética, colite diabética, distúrbio arterial amplo diabético, respostas imunes associadas a hipersensibilidade aguda e de demora mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatoide, agranulocitose, vasculites (incluindo vasculite de grande vasos tais como polimialgia reumática e arterite de célula gigante (Takayasu), vasculite de vaso médio tais como doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa, imunovasculite, vasculite de CNS, vasculite cutânea, vasculite por hipersensibilidade, vasculite necrotizante tais como vasculite necrotizante fibrinoide e vasculite necrotizante sistêmica, vasculite negativa para ANCA, e vasculite associada a ANCA tal como síndrome de Churg-Strauss (CSS), granulomatose de Wegener, e poliangiite microscópica), arterite temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), doença de Addison, anemia ou aplasia pura de célula vermelha (PRCA), deficiência de fator VIII, hemofilia A, neutropenia(s) autoimune(s), citopenias tais como pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese de leucócito, distúrbios inflamatórios de CNS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de lesão de múltiplos órgãos tais como aquela secundárias para septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença de membrana de embasamento anti-glomerular, síndrome de anticorpo anti-fosfolipídeo, motoneuritis, neurite alérgica, doença/síndrome de Behçet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide ou pênfigo tais como penfigóide bolhoso, penfigóide cicatricial (membrana mucosa), penfigóide de pele, pênfigo vulgar, pênfigo paraneoplástico, pênfigo foliáceo, pênfigo penfigóide de membrana mucosa, e pênfigo eritematoso, epidermólise bolhosa adquirida, inflamação ocular, preferivelmente inflamação ocular alérgica tais como conjuntivite alérgica, doença bolhosa de IgA linear, inflamação da conjuntiva induzida por doença autoimune, poliendocrinopatias autoimune, doença ou síndrome de Reiter, lesão térmica em virtude de uma condição autoimune, pré-eclâmpsia, um distúrbio do complexo imune tais como nefrite por complexo imune, nefrite mediada por anticorpo, distúrbios neuroinflamatórios, polineuropatias, neuropatia crônica tal como polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura após transfusão (PTP), trombocitopenia induzida por heparina, e trombocitopenia mediada por doença autoimune ou imune incluindo, por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática(ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, esclerite tal como cerato-esclerite idiopática, epiesclerite, doença autoimune do testículo e ovário incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite tal como tireoidite autoimune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica(tireoidite de Hashimoto), ou tireoidite subaguda, doença da tireoide autoimune, hipotiroidismo idiopático, doença de Grave, doença do olho de Grave (oftalmopatia ou oftalmopatia associada a tireoide), síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes, por exemplo, tipo I (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas tais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tais como encefalomielite alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica e experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave associada a timoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus ou síndrome opsoclonus mioclonus (OMS), e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheeha, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupoide, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite tais como pneumonite intersticial linfoide (LIP), bronquiolite obliterante (non-transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia por IgA idiopática, dermatose por IgA linear, dermatose neutrofílica febril aguda, dermatose pustular subcorneal, dermatose acantolítica transiente, cirrose tal como cirrose biliar primária e pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, celíaca ou doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia por glúten), psilose refratária, psilose idiopática, crioglobulinemia tal como crioglobulinemia mista, esclerose amilotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), doença arterial coronária, doença do ouvido autoimune tal como doença do ouvido interno autoimune (AIED), perda da audição autoimune, policondrite tal como policondrite refratária ou reincidiva ou reincidente, proteinase alveolar pulmonar, ceratite tais como síndrome de Cogan/ceratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndrome de Sweet, rosacea autoimune, dor associada a zoster, amiloidose, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benígna e gamopatia monoclonal de significância não determinada, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatias do CNS, autismo, miopatia inflamatória, glomerulosclerose focal ou segmental ou focal segmental (FSGS), oftalmopatia endócrina, úveorretinite, coriorretinite, distúrbio hematológico autoimune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes tais como doenças desmielinizantes autoimunes e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Dressler, alopécia areata, alopécia total, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, por exemplo, em virtude de anticorpos anti-espermatozóico, doença de tecido conjuntivo misto, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome após cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão dos criadores de aves, angiite granulomatosa alérgica, angiite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tais como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação de transfusão, leprose, malária, doenças parasíticas tais como leishmaniose, tripanossomiase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose miocárdica, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, mediastinite fibrosante, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum e diutinum, eritroblastose fetal, faciite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariose, ciclite tais como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite (aguda ou crônica), ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), SCID, síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovírus, sepse (síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS)), endotoxemia, pancreatite, tiroxicose, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes após vacinação, infecção por rubéola congênita, infecção por Epstein-Barr vírus, caxumba, síndrome de Evan, insuficiência gonodal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós estreptocócica, tromboangite obliterante, tirotoxicose, tabes dorsalis, corioidite, polimialgia de célula gigantes, pneumonite por hipersensibilidade crônica, conjuntivite, tal como catarro vernal, ceratoconjuntivite seca, e ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia de mudança mínima, lesão por reperfusão-isquemia familiar benigna, reperfusão de órgão de transplante, autoimunidade retinal, inflamação articular, bronquite, doença pulmonar/canal de vetilação obstrutiva crônica, silicose, afta, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos (insuficiência vascular cerebral) tais como encefalopatia arteriosclerótica e retinopatia arteriosclerótica, aspermiogênese, hemólise autoimune, doença Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda da audição sensoneural, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileite regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática (oftalmite simpática), oftalmite neonatal, neurite ótica, orquite granulomatosa, pancreatite, poliradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia esplênica adquirida, timoma não maligno, timite linfofolicular, vitiligo, síndrome do choque tóxico, intoxicação alimentar, condições que envolvem infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócito, respostas imunes associadas a hipersensibilidade mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócito, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença antimemembrana basal glomerular, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primária, gastrite atrófica autoimune, doenças reumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, insuficiência poliendócrina, síndromes poliglandulares autoimunes, incluindo síndrome poliglandular tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de início adulto (AOIH), cardiomiopatia tal como cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmóide, frontal, maxilar, ou esfenóide, sinusite alérgica, um distúrbio relacionado a eosinófilo tais como eosinofilia, eosinofilia por infiltração pulmonar, síndrome de mialgia por eosinofilia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma, ou granulomas contendo eosinófilos, anafilaxia, espondiloartropatias, espondiloartrite seronegativa, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, epiesclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transiente da infância, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasis, distúrbios autoimunes associados a doença de colágeno, reumatismo tal como artrorreumatismo crônico, linfadenite, redução em resposta de pressão sanguínea, disfunção vascular, lesão de tecido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, e doença relacionada a vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrites, lesão por reperfusão, distúrbio isquêmico por reperfusão, lesão por reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, traqueobronquite linfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, falência múltipla de órgãos, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares e orbitais, síndromes associadas a transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocina, narcolepsia, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulite e endometriose. Pretende-se aqui que tais doenças sejam tratadas pela administração de um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de célula B, tal como CD79b, e inclui a administração de um anticorpo não conjugado (“nu”) ou um anticorpo conjugado com um agente citotóxico da maneira aqui revelada. Pretende-se também aqui que tais doenças sejam tratadas por terapia de combinação incluindo um anticorpo anti-CD79b ou conjugado de medicamento de anticorpo anti-CD79b da invenção em combinação com um outro anticorpo ou conjugado de medicamento de anticorpo, um outro agente citotóxico, radiação ou outro tratamento administrado simultaneamente ou em série.
[209] "Tratar" ou “tratamento” ou “alívio” refere-se tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou reduzir (diminuir) a condição ou distúrbio patológico alvejado. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm o distúrbio bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles cujo distúrbio pode ser prevenido. Um sujeito ou mamífero é "tratado" com êxito com relação a um câncer que expressa polipeptídeo CD79b se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo anti-CD79b de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostrar redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução no número de células de câncer ou ausência das células de câncer; redução no tamanho do tumor; inibição (isto é, diminuir alguma extensão e, preferivelmente, parar) de infiltração de célula cancerígena em órgãos periféricos incluindo a propagação do câncer no tecido mole e osso; inibição (isto é, diminuir alguma extensão e, preferivelmente, parar) de metástase do tumor; inibição, até alguma extensão, do crescimento do tumor; e/ou alívio até alguma extensão, de um ou mais dos sintomas associados com o câncer específico; morbidade e mortalidade reduzida, e melhoria na qualidade de vida. Até a extensão, o anticorpo anti-CD79b pode prevenir o crescimento e/ou matar células de câncer existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. A redução destes sinais ou sintomas também pode ser percebida pelo paciente.
[210] Os parâmetros anteriores para determinar o tratamento bem sucedido e melhoria na doença são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico. Para terapia de câncer, a eficiência pode ser medida, por exemplo, determinando o tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinando a taxa de resposta (RR). A metástase pode ser determinada por testes de estágio e por varredura óssea e testes para nível de cálcio e outras enzimas para determinar propagação para o osso. As varreduras CT também podem ser realizadas para procurar propagação na pélvis e linfonodos na área. Raios X de tórax e medições de níveis de enzimas hepáticas por métodos conhecidos são usados para procurar metástase nos pulmões e fígado, respectivamente. Outros métodos de rotina para monitorar a doença incluem ultrassonografia transretal (TRUS) e biópsia por agulha transretal (TRNB).
[211] Para câncer na bexiga, que é um câncer mais localizado, métodos para determinar o progresso da doença incluem avaliação citológica urinária por cistoscopia, monitoramento da presença de sangue na urina, visualização do trato urinário por sonografia ou um pielograma intravenoso, tomografia computadorizada (CT) e imageamento por ressonância magnética (MRI). A presença de metástase distante pode ser determinada por CT do abdome, Raios X de tórax, ou imageamento radionuclídeo do esqueleto.
[212] Administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s) em um modo contínuo da maneira contrária a um modo agudo, de maneira a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. Administração “intermitente” é o tratamento que não é realizado sucessivamente sem interrupção, mas certamente é cíclico na natureza.
[213] Um “indivíduo” é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem limitações, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esportes, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas modalidades, um mamífero é um humano.
[214] "Mamífero", com propósitos do tratamento de aliviar os sintomas de um câncer, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esportes, ou de estimação, tais como cachorros, gatos, gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras, coelhos etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.
[215] A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem.
[216] "Veículos", da maneira aqui usada, incluem veículos, excipientes, ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, que não são tóxicos para a célula ou mamífero que está sendo exposto a estes nas dosagens e concentrações empregadas. Em geral, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contra íons que forma sal tal como sódio; e/ou agentes tensoativos não iônicos tais como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.
[217] "Fase sólida" ou “suporte sólido” significa uma matriz não aquosa na qual um anticorpo da presente invenção pode se aderir ou anexar. Exemplos de fases sólidas aqui incluídos são aqueles formados parcial ou totalmente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas modalidades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; em outras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tal como aquela descrita na patente U.S. 4.275.149.
[218] Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de múltiplos tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou agente tensoativo que é usado para distribuição de um medicamento (tal como um anticorpo CD79b) a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.
[219] Uma molécula “pequena” ou molécula orgânica “pequena” é aqui definida pata ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons.
[220] Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais de fazenda (tais como vacas), animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas modalidades, um mamífero é humano.
[221] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma que permite a atividade biológica do ingrediente ativo seja efetiva, e que não contém nenhum componente adicional que é inaceitavelmente tóxico para um sujeito ao qual a formulação é administrada. Tal formulação pode ser estéril.
[222] Uma formulação “estéril” é asséptica e livre de todos os microrganismos vivos e seus esporos.
[223] Uma “quantidade efetiva” de um anticorpo da maneira aqui revelada é uma quantidade suficiente para executar um propósito especificamente declarado. Uma “quantidade efetiva” pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina, com relação ao propósito declarado.
[224] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou outro medicamento efetivo para “tratar” uma doença ou distúrbio em um sujeito ou mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente efetiva do medicamento pode reduzir o número de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, reduzir até alguma extensão e, preferivelmente, parar) a infiltração da célula cancerígena nos órgãos periféricos; inibir (isto é, reduzir até alguma extensão e, preferivelmente, parar) a metástase do tumor; inibir, até certa extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certa extensão um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Ver a definição aqui de “tratar”. Até certa extensão o medicamento pode prevenir crescimento e/ou matar células de câncer existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Uma “quantidade profilaticamente efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.
[225] Uma “quantidade inibitória de crescimento” de um anticorpo anti-CD79b é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula cancerígena, tanto in vitro quanto in vivo. Uma “quantidade inibitória de crescimento” de um anticorpo anti-CD79b com propósitos de inibir crescimento celular neoplásico pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina.
[226] Uma “quantidade citotóxica” de um anticorpo anti-CD79b é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula cancerígena, tanto in vitro quanto in vivo. Uma “quantidade citotóxica” de um anticorpo anti-CD79b com propósitos de inibir crescimento celular neoplásico pode ser determinada empiricamente e em uma maneira de rotina.
[227] Uma “célula que expressa CD79b” é uma célula que expressa um polipeptídeo CD79b endógeno ou transfectado tanto na superfície celular quanto em uma forma secretada. Um “câncer que expressa CD79b” é um câncer que compreende células que têm um polipeptídeo CD79b presente na superfície celular ou que produzem e secretam um polipeptídeo CD79b. Um “câncer que expressa CD79b” produz opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo CD79b na superfície de células deste, de maneira tal que um anticorpo anti-CD79b possa se ligar a ele e tenha um efeito terapêutico com relação ao câncer. Em uma outra modalidade, um “câncer que expressa CD79b” produz e secreta opcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo CD79b, de maneira tal que um anticorpo anti-CD79b antagonista possa se ligar a ele e tenha um efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação ao último, o antagonista pode ser um oligonucleotídeo antissentido que reduz, inibe ou previne a produção e secreção do polipeptídeo CD79b secretado por células de tumor. Um câncer que “superexpressa” um polipeptídeo CD79b é um que tem níveis significativamente maiores de polipeptídeo CD79b na superfície celular deste ou produz e secreta, comparado a um célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por maior transcrição ou tradução. A superexpressão do polipeptídeo CD79b pode ser determinada em um ensaio de detecção ou prognóstico avaliando maiores níveis da proteína CD79b presente na superfície de uma célula, ou secretada pela célula (por exemplo, por meio de um ensaio imunohistoquímico usando anticorpos anti-CD79b preparados contra um polipeptídeo CD79b isolado que pode ser preparado usando tecnologia do DNA recombinante a partir de um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo CD79b; análise de FACS etc.). Alternativamente, ou adicionalmente, pode-se medir níveis de ácido nucleico que codifica polipeptídeo CD79b ou RNAm na célula, por exemplo, por meio de hibridização por fluorescência in situ usando um ácido nucleico a base de sonda correspondente a um ácido nucleico que codifica CD79b ou o complemento deste; (FISH; ver WO98/45479 publicado em outubro de 1998), Southern blotting, Northern blotting, ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a superexpressão de polipeptídeo CD79b medindo antígeno espalhado em um fluido biológico tal como soro, por exemplo, usando ensaios a base de anticorpo (ver também, por exemplo, patente U.S. 4,933,294 depositada em 12 de junho de 1990; WO91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; patente U.S. 5,401,638 depositada em 28 de março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Métodos 132:73-80 (1990)). Os ensaios anteriores à parte, múltiplos ensaios in vivo são disponíveis aos versados na técnica. Por exemplo, pode-se expor células no corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, por varredura externa para radioatividade ou analisando uma biópsia obtida de um paciente previamente exposto ao anticorpo.
[228] Da maneira aqui usada, o termo "imunoadesina" significa moléculas semelhantes a anticorpo que combinam a especificidade da ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade da ligação desejada que é sem ser o sítio de reconhecimento e ligação do antígeno de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência contígua de aminoácido compreendendo pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um elemento de ligação. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tais como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM.
[229] A palavra "marcador" quando aqui usada refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente no anticorpo de maneira a gerar um anticorpo "marcado". o marcador pode ser detectável sozinha (por exemplo, marcas de radioisótopos ou marcas fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[230] O termo "agente citotóxico", da maneira aqui usada, refere- se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. Pretende-se que o termo inclua isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e fragmentos destes tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os múltiplos agentes antitumorais ou anticâncer revelados a seguir. Outros agentes citotóxicos são descritos a seguir. Um agente tumoricida causa destruição de células de tumor.
[231] Uma “toxina” é qualquer substância capaz de ter um efeito danoso no crescimento ou proliferação de uma célula.
[232] Um "agente quimioterápico" é um composto químico usado no tratamento de câncer, indiferente do mecanismo de ação. Classes de agentes quimioterápicos incluem, mas sem limitações: agentes de alquilação, antimetabólitos, alcaloides de planta de veneno fusorial, antibióticos citotóxicos/antitumorais, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotossintetizantes, e inibidores de quinase. Agentes quimioterápicos incluem compostos usados na “terapia alvejada” e quimioterapia convencional. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluoruracila, 5- fluoruracila, CAS No. 51-21-8), gemcitabine (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatinum(II), CAS No. 15663-27-1), carboplatina (CAS No. 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5-oxo- 2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4.3.0] nona- 2,7,9-trieno- 9-carboxamida, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifen ((Z)-2- [4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenóxi]-N,N-dimetil- etanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), e doxorrubicina (ADRIAMICINA®), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
[233] Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mesilato (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (sem Cremofor), formulações de nanopartícula de albumina modificadas por engenharia de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), cloranmbucila, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); sulfonatos de alquila tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamide e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinone); uma camptotecina (incluindo o topotecan análogo sintético); brioestatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolaestatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratiestatina; uma sarcodictiina; espongiestatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cliridratro de óxido de, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosouréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enediína (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama II, caliqueamicina ômega II (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como neocarzinostatina cromóforo e cromóforos de antibiótico cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinais, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinoestatina, zorubicina; anti-metabólitos tal como metotrexato e 5-fluoruracil (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, prorpionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de galo; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2- etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OU); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinóides tal como ácido retinóico; e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
[234] São também incluídos na definição de "agente quimioterápico": (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir ação do hormônio em tumores tais como anti-estrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifen), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tai como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestane; Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); (iv) inibidores de proteína quinase tais como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de quinase lipídica; (vi) oligonucleotídeos antissentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em caminhos de sinalização implicados na proliferação celular aberrante, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tal como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tal como inobidores de expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inobidores de expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de terapia de gene, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores de topoisomerase 1, tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes anti-angiogênicos tal como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
[235] São também incluídos na definição de "agente quimioterápico" anticorpos terapêuticos tais como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), e o conjugado de medicamento de anticorpo, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth).
[236] Um "agente inibitório de crescimento" quando aqui usado refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerígena que expressa CD79b, tanto in vitro quanto in vivo. Assim, o agente inibitório de crescimento pode ser um que reduz significativamente o percentual de célula que expressa CD79bs na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local sem ser a fase S), tais como agentes que induzem captura de G1 e captura de fase M. Bloqueadores clássicos de fase M incluem os vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de topoisomerase II tais como doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida e bleomicina. Aqueles agentes que capturam G1 também agem na captura da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoruracila, e ara-C. Informação adicional pode ser observada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. O taxanos (paclitaxel e docetaxel) são medicamentos anticâncer ambos derivados da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos prevenindo a depolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células.
[237] “Doxorrubicina” é um antibiótico antraciclina. O nome químico completo de doxorrubicina é (8S-cis)-10- [(3-amino-2,3,6-trideoxi-α-L- lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11-triidroxi-8-(hidroxiacetil)-1- metóxi-5,12-naftacenediona.
[238] O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celular que agem em outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeo tradicionais. Estão incluídos entre as citocinas hormônio de crescimento tal como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-α e beta. De necrose tumoral; substância que inibe muleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de crescimento endoteila vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tal como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento semelhante a insulina -I e -II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tais como interferon -α, -β, e -Y; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM- CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL- 1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e estojo de elemento de ligação (KL). Da maneira aqui usada, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.
[239] O termo “instrução para uso” é usado para referir-se à instruções normalmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informação acerca das indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou cuidados com relação ao uso de tais produtos terapêuticos.
[240] O termo “metabólito intracelular” refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um conjugado de anticorpo-medicamento (ADC). O processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático, tal como clivagem proteolítica de um ligante de peptídeo do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tais como uma hidrazona, éster ou amida. Metabólitos intracelulares incluem, mas sem limitações, anticorpos e medicamento livre que tem sido submetido a clivagem intracelular após entrada, difusão, absorção ou transporte em uma célula.
[241] Os termos “clivado intracelularmente” e “clivagem intracelular” referem-se a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula em um conjugado de anticorpo-medicamento (ADC) por meio do qual a anexação covalente, isto é, ligante, entre a fração de medicamento (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando no medicamento livre dissociado do anticorpo dentro da célula. As frações clivadas do ADC são assim metabólitos intracelulares.
[242] O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistêmica (isto é, níveis de sangue/plasma) de uma dada quantidade de medicamento administrado a um paciente. Biodisponibilidade é um termo absoluto que indica medição tanto do tempo (taxa) quanto da quantidade total (extensão) de medicamento que atinge a circulação geral de uma forma de dosagem administrada.
[243] O termo “atividade citotóxica” refere-se a um efeito de crescimento de exterminação celular, citostático ou inibitório de um ADC ou um metabólito intracelular de um ADC. Atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50, que é a concentração (molar ou de massa) por unidade de volume no qual a metade das células sobrevive.
[244] O termo "alquila" da maneira aqui usada refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada saturado de um a doze átomos de carbono (C1-C12), em que o radical alquila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos a seguir. Em outra modalidade, um radical alquila tem um a oito átomos de carbono (C1-C8), ou um a seis átomos de carbono (C1-C6). Exemplos de grupos alquila incluem, mas sem limitações, metil (Me, -CH3), etil (Et, -CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propil (i-Bu, i-butil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, - C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (- CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (- C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butil (- CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexil (- CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexil (- CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil- 2-pentil (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil (- CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil- 2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-heptil, 1-octil, e similares.
[245] O termo "alquenila" refere-se a radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação dupla carbono-carbono, sp2, em que o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos, e inclui radicais com orientações "cis" e "trans" ou, alternativamente, orientações "E" e "Z". Exemplos incluem, mas sem limitações, etilenila ou vinil (-CH=CH2), alila (-CH2CH=CH2) e similares.
[246] O termo "alquinila" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente linear ou ramificado de dois a oito átomos de carbono (C2-C8) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, um ligação tripla carbono-carbono, sp, em que o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos. Exemplos incluem, mas sem limitações, etinil (-C CH), propinil (propargil, -CH2C CH), e similares.
[247] Os termos "carbociclo", "carbocíclico", "anel carbocíclico" e "cicloalquila" referem-se a um anel monovalente não aromático saturado ou parcialmente não saturado com 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como um anel bicíclico. Carbociclos bicíclicos com 7 a 12 átomos podem ser arranjados, por exemplo, como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], e carbociclos bicíclicos com 9 ou 10 átomos no anel podem ser arranjados como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6], ou como sistemas ligados tais como biciclo [2.2.1]heptano, biciclo [2.2.2]octano e biciclo [3.2.2]nonano. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem, mas sem limitações, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, cicloexila, 1-cicloex- 1-enila, 1-cicloex-2-enila, 1-cicloex-3-enila, cicloexadienila, cicloeptila, ciclo- octila, ciclononila, ciclodecila, cicloundecila, ciclododecila e similares.
[248] "Arila" significa um radical hidrocarboneto aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono simples de um sistema de anel aromático pai. Alguns grupos arila estão representados nas estruturas exemplificativos como "Ar". Arila inclui radicais bicíclicos compreendendo um anel aromático ligado a um anel saturado, parcialmente insaturado ou anel carbocíclico aromático. Grupos arila típicos incluem, mas sem limitações, radicais derivados de benzeno (fenila), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, indanila, 1,2-diidronaftaleno, 1,2,3,4-tetraidronaftila e similares. Grupos arila são opcionalmente substituídos de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
[249] Os termos "heterociclo," "heterocíclico" e "anel heterocíclico" são aqui usados indiferentemente e referem-se a um radical carboxílico saturado ou um parcialmente insaturado (isto é, com uma ou mais ligações duplas e/ou triplas no anel) de 3 a 20 átomos no anel, no qual pelo menos um átomo do anel é um heteroátomo selecionado de nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, os átomos do anel remanescente sendo C, onde um ou mais átomos do anel é opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos a seguir. Um heterociclo pode ser um monociclo com 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um biciclo com 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 6 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterociclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; "The Chemistry of Heterociclic Compound, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 até hoje), em particular, Volumes 13, 14, 16, 19, e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterocíclico" também inclui radicais onde radicais heterociclo são ligados com um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel aromático, carbocíclico ou heterocíclico. Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas sem limitações, pirrolidinila, tetraidrofuranila, diidrofuranila, tetraidrotienila, tetraidropiranila, diidropiranila, tetraidrotiopiranila, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanila, piperazinila, homopiperazinila, azetidinila, oxetanila, tietanila, homopiperidinila, oxepanila, tiepanila, oxazepinila, diazepinila, tiazepinila, 2-pirrolinila, 3- pirrolinila, indolinila, 2H-piranila, 4H-piranila, dioxanila, 1,3-dioxolanila, pirazolinila, ditianila, ditiolanila, diidropiranila, diidrotienila, diidrofuranila, pirazolidinilimidazolinila, imidazolidinila, 3-azabiciclo [3.1.0]hexanila, 3- azabiciclo [4.1.0]heptanila, azabiciclo [2.2.2]hexanila, 3H-indolila quinolizinila e uréia N-piridila. Frações espiro também estão incluídas no escopo desta definição. Exemplos de um grupo heterocíclico em que 2 átomos do anel de carbono são substituídos por frações oxo (=O) são pirimidinonila e 1,1 -dioxo- tiomorfolinila. Os grupos heterociclo são aqui opcionalmente substituídos de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
[250] O termo "heteroarila" refere-se a um radical aromático monovalente de anéis de 5, 6 ou 7membros, e inclui sistemas de anéis ligados (pelo menos um dos quais é aromático) de 5-20 átomos, contendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos de grupos heteroarila são piridinila (incluindo, por exemplo, 2-hidroxipiridinila), imidazolila, imidazopiridinila, pirimidinila (incluindo, por exemplo, 4-hidroxipirimidinila), pirazolila, triazolila, pirazinila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, oxazolila, isotiazolila, pirrolila, quinolinila, isoquinolinila, indolila, benzimidazolila, benzofuranila, cinnolinila, indazolila, indolizinila, ftalazinila, piridazinila, triazinila, isoindolila, pteridinila, purinila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, tiadiazolila, furazanila, benzofurazanila, benzotiofenila, benzotiazolila, benzoxazolila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila e furopiridinila. Grupos heteroarila são opcionalmente substituídos de forma independente com um ou mais substituintes aqui descritos.
[251] Os grupos heterociclo ou heteroarila podem ser carbono (carbono-ligado) ou nitrogênio (nitrogênio-ligado) ligado onde é possível. Como exemplo e sem limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados ao carbono estão ligados na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furan, tetraidrofuran, tiofuran, tiofeno, pirrol ou tetraidropirrol, posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina.
[252] Como exemplo e sem limitação, heterociclos ou heteroarilas ligados ao nitrogênio estão ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3- imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou β-carbolina.
[253] "Alquileno” refere-se a um radical hidrocarboneto saturado, de cadeia reta ou ramificada, cíclico de 1-18 átomos de carbono, e com dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de diferentes átomos de carbono de um alcano pai. Radicais alquilenos típicos incluem, mas sem limitações: metileno (-CH2-) 1,2- etil (-CH2CH2-), 1,3-propil (-CH2CH2CH2-), 1,4-butil (-CH2CH2CH2CH2-) e similares.
[254] Um “alquileno C1-C10” é um grupo hidrocarboneto de cadeia reta, saturado da fórmula -(CH2)1-10-. Exemplos de um alquileno C1-C10 incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno e decaleno.
[255] “Alquenileno” refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de cadeia reta ou ramificada ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e com dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois diferentes átomos de carbono de um alceno pais. Radicais alquenileno típicos incluem, mas sem limitações: 1,2- etileno (-CH=CH-).
[256] “Alquinileno” refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de cadeia reta ou ramificada ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e com dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou dois diferentes átomos de carbono de um alcino pai. Radicais alquinileno típicos incluem, mas sem limitações: acetileno (-C^C-), propargil (-CH2C=C-), e 4-pentinil (-CH2CH2CH2C C-).
[257] Um “arileno” é um grupo arila que tem duas ligações covalentes e pode estar na configuração orto, meta, ou para da maneira mostrada nas seguintes estruturas:
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na qual o grupo fenila pode ser insubstituído ou substituído com até quatro grupos incluindo, mas sem limitação, -alquila C1-C8, -O-( alquil C1-C8), -arila, - C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OU’, -C(O)NH2 , -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, - S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -halogênio, -N3 , -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 e -CN; em que cada R’ é independentemente selecionado de H, - alquil C1-C8 e aril.
[258] "Arilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, mas sem limitações, benzila, 2-feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1- ila e similares. O grupo arilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquila, incluindo grupos alcanila, alquenila ou alquinila, dos grupos arilalquila tem 1 a 6 átomos de carbono e a fração arila tem 5 a 14 átomos de carbono.
[259] "Heteroarilalquila" refere-se a um radical alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarila. Grupos heteroarilalquila típicos incluem, mas sem limitações, 2- benzimidazolilmetila, 2-furiletila e similares. O grupo heteroarilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquila, incluindo grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo tem 1 a 6 átomos de carbono e a fração heteroarila tem 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S. A fração heteroarila do grupo heteroarilalquil pode ser um monociclo com 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo com 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6].
[260] O termo "profármaco" da maneira usada neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de um composto da invenção que pode ser menos tóxico para as células comparado ao composto ou fármaco pai e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente ativado ou convertido na forma pai mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al., " Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Medicament Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os profármacos desta invenção incluem, mas sem limitações, profármacos contendo fosfato, profármacos contendo fosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo peptídeo, profármacos modificados por D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos contendo e-lactâmico, profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída, profármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, profármacos de 5-fluorcitosina e outra 5-fluoruridina que podem ser convertidos no medicamento livre citotóxico mais ativo. Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de promedicamento para uso nesta invenção incluem, mas sem limitações, compostos da invenção e agentes quimioterápicos tais como anteriormente descritos.
[261] Um "metabólito" é um produto fabricado por meio do metabolismo no corpo de um composto ou sal especificado deste. Metabólitos de um composto podem ser identificados usando técnicas de rotina conhecidas na técnica e suas atividades determinadas usando testes tais como aqueles aqui descritos. Tais produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática e similares do composto administrado. Dessa maneira, a presente invenção inclui metabólitos de compostos da invenção, incluindo compostos produzidos por um processo que compreende colocar um composto desta invenção em contato com um mamífero por um período de tempo suficiente para render um produto metabólico deste.
[262] Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de múltiplos tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou agente tensoativo que é usado para distribuição de um medicamento a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.
[263] "Ligante" refere-se a uma fração química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que anexa covalentemente um anticorpo a uma fração de medicamento. Em várias modalidades, ligantes incluem um radical bivalente tais como uma alquildiila, uma arildiila, uma heteroarildiila, frações tal como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenóxi, PEG, polimetileneóxi) e alquilamino (por exemplo, polietileneamino, Jeffamine™); e diácido éster e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
[264] A palavra "quiral" refere-se a moléculas que têm a propriedade de não sobreponibilidade da imagem especular parceira, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são sobreponíveis na sua imagem especular parceira.
[265] A palavra "estereoisômeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com relação ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[266] "Diastereômero" refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra. Diastereômeros têm diferentes propriedades físicas, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. Misturas de diastereômeros podem separadas em procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cromatografia.
[267] "Enantiômeros" refere-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens especulares não sobreponíveis um do outro.
[268] Em geral, definições e convenções estereoquímicas aqui seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compound (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, isto é, eles têm a capacidade de girar o plano da luz polarizada no plano. Descrevendo um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usado para simbolizar a configuração absoluta da molécula com relação a seu(s) centro(s) quiral(s). Os prefixos d e l ou (+) e (-) são empregados para indicar o sinal de rotação da luz polarizada no plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levorotatório. Um composto prefixo com (+) ou d é dextrorotatório. Para uma dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos com a exceção de que eles são imagens especulares um do outro. Um estereoisômero específico também pode ser referido como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é geralmente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura de enantiômeros 50:50 é referida como uma mistura racêmica ou um racemato que pode ocorrer onde não existe nenhuma estereoseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, destituídas de atividade ótica.
[269] O termo "tautômero" ou "forma tautomérica" refere-se a isômeros estruturais de energias diferentes que são interconvertíveis por meio de uma barreira de baixa energia. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos como tautômeros prototrópicos) incluem interconversões por meio de migração de um próton, tais como isomerizações ceto-enol e imina-enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões por reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
[270] O termo "sal farmaceuticamente aceitável", da maneira aqui usada, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto da invenção. Sais exemplificativos incluem, mas sem limitação, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, saccarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato “mesilato”, etanossulfonato, benzenossulfonato, p- toluenossulfonato, e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis(2-hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula tal como um íon acetato, um íon succinato ou outro contra-íon. O contra-íon pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto pai. Além do mais, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais que um átomo carregado em sua estrutura. Exemplos onde múltiplos átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplos contra-íons. Consequentemente, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomo carregados e/ou um ou mais contraíons.
[271] Se o composto da invenção for uma base, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer método adequado disponível na técnica, por exemplo, tratamento da base livre com um ácido inorgânico, tais como ácido hidroclorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico e similares, ou com um ácido orgânico, tais como ácido acético, ácido trifluoracético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malônico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido piranosidílico, tal como ácido glucurônico ou ácido galacturônico, um ácido alfa hidróxi, tal como ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, um ácido aromático, tal como ácido benzoico ou ácido cinâmico, um ácido sulfônico, tal como ácido p-toluenossulfônico ou ácido etanossulfônico ou similares.
[272] Se o composto da invenção for um ácido, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer método adequado, por exemplo, tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou orgânica, tal como uma amina (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de metal alcalino terroso ou similares. Exemplos ilustrativos de sais adequados incluem, mas sem limitações, sais orgânicos derivados de aminoácidos, tais como glicina e arginina, amônia, aminas primárias, secundárias e terciárias, e aminas cíclicas, tais como piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cálcio, potássio, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio.
[273] O termo "farmaceuticamente aceitável" indica que a substância ou composição tem que ser compatível quimicamente e/ou toxicologicamente com os outros ingredientes que compreendem uma formulação, e/ou o mamífero que está sendo tratado com isso.
[274] Um "solvato" refere-se a uma associação ou complexo de uma ou mais moléculas solventes e um composto da invenção. Exemplos de solventes que formam solvatos incluem, mas sem limitações, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etila, ácido acético e etanolamina. O termo "hidrato" refere-se ao complexo onde a molécula solvente é água.
[275] O termo "grupo protetor" refere-se a um substituinte que é comumente empregado para bloquear ou proteger uma funcionalidade particular reagindo ao mesmo tempo outros grupos funcionais no composto. Por exemplo, um "grupo protetor de amino" é um substituinte anexado a um grupo amino que bloqueia ou protege a funcionalidade amino no composto. Grupos protetores de amino adequados incluem acetila, trifluoracetila, t-butoxicarbonila (BOC), benziloxicarbonila (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonila (Fmoc). Similarmente, um "grupo protetor de hidróxi" refere-se a um substituinte de um grupo hidróxi que bloqueia ou protege a funcionalidade hidróxi. Grupos protetores adequados incluem acetila e silila. Um "grupo protetor de carbóxi" refere-se a um substituinte do grupo carbóxi que bloqueia ou protege a funcionalidade carbóxi. Grupos protetores de carbóxi comuns incluem fenilsulfoniletila, cianoetila, 2- (trimetilsilil)etila, 2-(trimetilsilil)etoximetila, 2-(p-toluenesulfonil)etila, 2-(p- nitrofenilsulfenil)etila, 2-(difenilfosfino)-etila, nitroetila e similares. Para uma descrição geral de grupos protetores e seu uso, ver T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
[276] “Grupo abandonador” refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por um outro grupo funcional. Certos grupos abandonadores são bem conhecidos na técnica e exemplos incluem, mas sem limitações, um haleto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metanossulfonila (mesila), p-toluenossulfonila (tossila), trifluormetilsulfonila (triflato) e trifluormetilsulfonato. ABREVIAÇÕES COMPONENTES LIGANTES MC = 6-maleimidocaproila Val-Cit ou “vc” = valina-citrulina (um dipeptídeo exemplar em um ligante clivável por protease) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanóico PAB = p-aminobenziloxicarbonila (um exemplo de um componente ligante “auto emulativo”) Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (em que o peptídeo ligante ligado foi modificado para prevenir sua clivagem por catepsem B) MC(PEG)6-OH = maleimidocaproil- polietileno glicol (pode ser anexado ao anticorpo cisteína). MEDICAMENTOS CITOTÓXICOS MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718); MMAF = variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina nos terminais C do medicamento (MW 731.5); MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) em uma ligação amida no terminal C fenilalanina (MW 801.5); MMAF-TEG = MMAF com tetraetileno glicol esterificado com a fenilalanina; MMAF-NtBu = N-t-butila, anexada como uma amida nos terminais C de MMAF; DM1 = N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina; DM3 = N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina; DM4 = N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- maitansina.
[277] Abreviações adicionais são como se segue: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonil), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3- dicicloexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, DIEA é N,N-diisopropiletilamina, dil é dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é etilenoglicol dimetil éter (ou 1,2-dimetoxietano), DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é ácido 5,5’- ditiobis(2-nitrobenzóico), DTPA é ácido dietilenetriaminepentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2-diidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa por eletroaspersão, EtOAc é acetato de etil, Fmoc é N-(9-fluorenilmetóxicarbonil), gli é glicina, HATU é hexafluorfosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia líquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrila, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetila (ou 4- metoxitritila), nor é (1S, 2R)-(+)-norefedrina, PBS é salina tamponada com fosfato (pH 7,4), PEG é polietileno glicol, Ph é fenila, Pnp é p-nitrofenila, MC é 6- maleimidocaproila, phe é L-fenilalanina, PyBrop é hexafluorfosfato de bromo tris- pirrolidino fosfônio, SEC é cromatografia por exclusão de tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoracético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e val é valina.
[278] Um “aminoácido sem cisteína” refere-se a um resíduo de aminoácido cisteína que foi modificado por engenharia em um anticorpo parental, tem um tiol grupo funcional tiol (-SH), e não está emparelhado como uma ponte de dissulfeto intramolecular ou intermolecular.
[279] O termo “valor de reatividade de tiol” é uma caracterização quantitativa da reatividade dos aminoácidos sem cisteína. O valor de reatividade de tiol é o percentual de um aminoácido sem cisteína em um anticorpo modificado por engenharia com cisteína que reage com um reagente reativo de tiol, e convertido a um valor máximo de 1. Por exemplo, um aminoácido sem cisteína em um anticorpo modificado por engenharia com cisteína que reage em 100 % de rendimento com um reagente reativo de tiol, tal como um reagente de biotina-maleimida, para formar um anticorpo marcado com biotina tem um valor de reatividade de tiol de 1,0. Outro aminoácido modificado por engenharia com cisteína no mesmo ou em diferente anticorpo parental que reage em 80 % de rendimento com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0,8. Outro aminoácido modificado por engenharia com cisteína no mesmo ou em diferente anticorpo parental que falha totalmente em reagir com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0. A determinação do valor de reatividade de tiol de uma cisteína particular pode ser conduzida por ensaio de ELISA, espectroscopia de massa, cromatografia líquida, autorradiografia, ou outros testes analíticos quantitativos.
[280] Um "anticorpo parental" é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos da qual um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por um ou mais resíduos de cisteína. O anticorpo parental pode compreender uma sequência tipo selvagem ou nativa. O anticorpo parental pode ter sequência de modificação de aminoácidos pré-existente (tais como adições, deleções e/ou substituições) com relação a outro tipo selvagem ou nativo, ou formas modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo biologicamente importante. Anticorpos direcionados contra antígenos não polipeptídeos (tais como antígenos de glicolipídios associados a tumor; ver U.S. 5091178) são também considerados. TABELA 1
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111. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA INVENÇÃO
[281] A presente invenção fornece anticorpos anti-CD79b ou fragmentos funcionais destes, e seu método de uso no tratamento de tumores hematopoiéticos.
[282] Em um aspecto, presente a invenção fornece um anticorpo que se liga, preferivelmente de maneira específica, a quaisquer dos polipeptídeos descritos anteriormente ou a seguir. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, incluindo fragmento Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, diacorpo, anticorpo de domínio único, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo anti-polipeptídeo CD79b a seu respectivo epítopo antigênico. Anticorpos da presente invenção podem opcionalmente estar conjugados com um agente inibitório de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um auristatina, um maitansinóide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos da presente invenção podem opcionalmente ser produzidos em células CHO ou células bacterianas e, preferivelmente, induzir morte de uma célula na qual ele se liga. Com propósitos de detecção, os anticorpos da presente invenção podem ser marcados detectavelmente, anexados a um suporte sólido ou similares.
[283] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é substancialmente a mesma como a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[284] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é menor, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor que a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[285] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade monovalente do anticorpo com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab com CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior que a afinidade monovalente de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo murina como um fragmento Fab com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b), compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[286] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é substancialmente a mesma como a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab com CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[287] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é menor, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 vezes menor, como a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG com CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[288] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é maior, por exemplo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior que a afinidade de um anticorpo murina (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) ou um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento de IgG com CD79b) em sua forma bivalente, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada da maneira descrita nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14).
[289] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM +/- 0,04.
[290] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,3 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,32 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,36 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,44 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,48 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,3 nM e 0,5 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,32 nM e 0,48 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,36 nM e 0,44 nM.
[291] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM +/0.02.
[292] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,1 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,12 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,14 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,16 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,18 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,2 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,22 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,24 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,26 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,28 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,30 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,1 nM e 0,3 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,12 nM e 0,28 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,14 nM e 0,26 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,16 nM e 0,24 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,18 nM e 0,22 nM.
[293] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM. Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM +/- 0,1.
[294] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,4 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,5 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,6 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) é 0,7 nM ou maior. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,3 nM e 0,7 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,4 nM e 0,6 nM. Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado anti-CD79b em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente com CD79b (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG com CD79b) está entre 0,5 nM e 0,55 nM.
[295] Em um aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo murina com CD79b é substancialmente a mesma como a afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outro aspecto, a afinidade monovalente do anticorpo murina com CD79b é substancialmente a mesma da afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências de domínio variáveis de um anticorpo gerado a partir de hibridoma depositado com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 ou anticorpo quimérico compreendendo os domínios variáveis de anticorpo gerado a partir de hibridomas depositado com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993.
[296] Como está bem estabelecido na técnica, afinidade de ligação de um elemento de ligação com seu receptor pode ser determinada usando qualquer de uma variedade de ensaios, e expressa em função de uma variedade de valores quantitativos. Dessa maneira, em uma modalidade, a afinidade de ligação é expressa como valores Kd e reflete afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com menores efeitos de ansiosidade). Em geral e preferivelmente, afinidade de ligação é medida in vitro, quer em ambiente sem célula ou associado a célula. Da maneira aqui descrita com maiores detalhes, diferença multiplicatória na afinidade de ligação pode ser quantificada em função da razão da valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (por exemplo, na forma Fab) e o valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparador (por exemplo, na forma Fab) (por exemplo, um anticorpo murina com sequências hipervariáveis de região doadora), em que os valores da afinidade de ligação são determinados em condições de ensaio similar. Assim, em uma modalidade, a diferença multiplicatória na afinidade de ligação é determinada como a razão dos valores Kd do anticorpo humanizado na forma Fab e o dito anticorpo Fab de referência/comparador. Por exemplo, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (A) tiver uma afinidade que é “3 vezes menor” que a afinidade de um anticorpo referência (M), então se o valor Kd para A for 3x, o valor Kd de M seria 1x, e a razão de Kd de A até Kd de M seria 3:1. Ao contrário, em uma modalidade, se um anticorpo da invenção (C) tiver uma afinidade que é “3 vezes maior” que a afinidade de um anticorpo referência (R), então se o valor Kd para C for 1x, o valor Kd de R seria 3x, e a razão de Kd de C até Kd de R seria 1:3. Quaisquer dos inúmeros ensaios conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos, podem ser usados para obter medições de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.
[297] Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, em que o anticorpo compreende: (a) pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131); (ii) HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132); (iii) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133); (iv) HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134); (v) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
[298] Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da presente invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 132. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção que compreende estas sequências (em combinação da maneira aqui descrita) é humanizado ou humano.
[299] Em um aspecto, um anticorpo que se liga a CD79b é fornecido, em que o anticorpo compreende: (a) pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1-A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131); (ii) HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132); (iii) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133); (iv) HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1-D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134); (v) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1-E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (vi) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1-F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); e (b) pelo menos uma variante HVR em que a sequência variante HVR compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 ou 136. Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 132. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 133. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 134. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 135. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO: 136. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção que compreende estas sequências (em combinação da maneira aqui descrita) é humanizado ou humano.
[300] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135, e 136, e em que SEQ ID NO: 131 corresponde a um HVR-L1, SEQ ID NO: 132 corresponde a HVR-L2, SEQ ID NO: 133 corresponde a um HVR-L3, SEQ ID NO: 134 corresponde a um HVR-H1, SEQ ID NO: 135 corresponde a um HVR- H2, e SEQ ID NO: 136 corresponde a um HVR-H3. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR- H2, e HVR-H3, em que cada um, em ordem, compreende SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 e 136.
[301] HVRs variantes em um anticorpo da presente invenção podem ter modificações de um ou mais resíduos no HVR. Em uma modalidade, um HVR-L1 variante compreende uma substituição nas seguintes posições: A4 (K), A9 (E ou S) e A10 (A ou S). Em uma modalidade, um HVR-L2 variante compreende 1-5 substituições (1, 2, 3, 4 ou 5) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: B2 (S ou G), B3 (R ou G), B4 (K, R, Y, I, H ou Q), B5 (R), B6 (G, K, UM, R, S ou L) e B7 (R, N, T ou G). Em uma modalidade, um HVR- L3 variante compreende 1-4 substituições (1, 2, 3 ou 4) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: C1 (N ou D), C2 (N ou P), C3 (D ou R), C5 (S, K, A, Q, D, L ou G), C6 (UM, E ou N), C7 (A), C8 (R) e C9 (N). Em uma modalidade, um HVR-H1 variante compreende 1-7 substituições (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: D1 (P), D2 (F), D3 (P, S, Y, G ou N), D4 (L ou V), D5 (T, R, N, K, C, G ou P), D6 (R, T, K ou G), D8 (F), D9 (V OU L) e D10 (S, Q, N ou D). Em uma modalidade, um HVR-H3 variante compreende 1-3 substituições (1, 2 ou 3) em qualquer uma ou combinação das seguintes posições: F4 (R ou I), F6 (I ou F), F7 (K, C, R, V ou F), F8 (L), e F9 (S). Letra(s) nos parênteses após cada posição indica um aminoácido de substituição ilustrativo (isto é, substituição); evidente aos versados na técnica, adequação de outros aminoácidos como aminoácidos de substituição no contexto aqui descrito pode ser rotineiramente determinada usando técnicas conhecidas e/ou aqui descritas. Em uma modalidade, A9 em uma variante HVR-L1 é E. Em uma modalidade, F6 em uma variante HVR-H3 é I. Em uma modalidade, F7 em uma variante HVR-H3 é R. Em uma modalidade, F8 em uma variante HVR-H3 é L. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A9 é E e uma variante HVR-H3 em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Em uma modalidade, A9 em uma variante HVR-L1 é S. Em uma modalidade um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A9 é S e uma variante HVR-H3 em que F6 é I, F7 é R e F8 é L.
[302] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-L1 em que A4 é K. Em algumas modalidades, a dita variante HVR-L1 compreende HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR- H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L1 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é um ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L1 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é a. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente um sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
[303] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é R, B4 é K, B6 é G e B7 é R. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é R, B4 é Y, B6 é K e B7 é R. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L2 em que B3 é R B4 é K e B6 é G. Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 133, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é um ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo variante HVR-L2 compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
[304] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-L3 em que C5 é K. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-L3 em que C5 é S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 134, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é um ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-L3 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
[305] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-H1 em que D3 é P, D5 é T, D6 é R e D10 é N. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR- H1 em que D3 é P, D5 é N, D6 é R e D10 é N. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR- L3, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 135 e 136. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H1 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
[306] Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é I e F8 é L. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F6 é I, F7 é R e F8 é L. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H3 variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2 em que cada um compreende, em ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134 e 135. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR- H3 variante compreende adicionalmente um HVR-L1 variante em que A9 é E ou S e/ou A10 é A ou S. Em algumas modalidades, o dito anticorpo HVR-H3 variante compreende adicionalmente um HVR-L3 variante em que C6 é E ou N e/ou C7 é A. Em algumas modalidades, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em alguma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F. Em uma modalidade destes anticorpos, a sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III humana) 48 é I, 67 é A, 69 é F, 71 é A, 73 é T, 75 é S, 78 é A e ou 80 é M. Em algumas modalidades destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana. Em uma modalidade destes anticorpos, o arcabouço da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve KI humana compreende substituição na posição 4 e/ou 47. Em algumas modalidades destes anticorpos, posição (da sequência consenso de arcabouço de cadeia leve kI humana) 4 é L e/ou 47 é F.
[307] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as sequências HVR representadas na figura 9 (SEQ ID NO: 17-21) e/ou figura 10 (SEQ ID NO: 22106).
[308] Um agente terapêutico para uso em um sujeito hospedeiro elicita preferivelmente pouca a nenhuma resposta imunogênica contra o agente no dito sujeito. Em uma modalidade, a invenção fornece um agente como este. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado que elicita e/ou espera-se que elicite uma resposta de anticorpo anti- camundongo humano (HAMA) em um nível substancialmente reduzido comparado a um anticorpo que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 e 14 em um sujeito hospedeiro. Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo humanizado que elicita e/ou espera-se que elicite mínima ou nenhuma resposta de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA). Em um exemplo, um anticorpo da invenção elicita resposta de anticorpo anti-camundongo que está em um nível clinicamente aceitável ou menos.
[309] Um anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender uma ou mais sequências hipervariáveis (por exemplo, arcabouço) de região de consenso humana e/ou não humana em seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações adicionais estão presentes nas sequências hipervariáveis de região de consenso humana e/ou não humana. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço humana, que em uma modalidade é a sequência consenso de arcabouço do subgrupo III. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73 e/ou 78. Em uma modalidade, a dita substituição é R71A, N73T e/ou L78A, em qualquer combinação desta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III variante compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73 e/ou 78. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T e/ou L78A. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço de cadeia pesada do subgrupo III variante compreende substituição na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A e/ou L80M. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço humana, que em uma modalidade é a sequência consenso de arcabouço KI. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço KI variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço kI variante pode compreender uma substituição na posição 4. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência consenso de arcabouço kI variante pode compreender uma substituição na posição 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L e/ou L47F.
[310] Como é conhecido na técnica, e da maneira aqui descrita em mais detalhes a seguir, a posição do aminoácido/limite que delineia uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica (da maneira descrita a seguir). Algumas posições em um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas em que considera-se que estas posições estejam em uma região hipervariável em um conjunto de critérios considerando-se ao mesmo tempo estarem fora de uma região hipervariável em um conjunto diferente de critérios. Uma ou mais destas posições também podem ser observadas em regiões hipervariáveis estendidas (da maneira descrita adicionalmente a seguir). A invenção fornece anticorpos que compreendem modificações nestas posições hipervariáveis híbridas. Em uma modalidade, estas posições hipervariáveis incluem uma ou mais posições 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 e 101-102 em um domínio variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 24-29, 35-36, 46-49, 56 e 97 em um domínio variável de cadeia leve. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço de subgrupo humano variante humana modificada em uma ou mais posições hipervariáveis híbridas.
[311] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante humana modificada em uma ou mais das posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição G26P. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F27Y. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T28P, S, Y, G ou N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição F29L ou F29V. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S30T, R, N, K, C, G ou P. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A33W ou A33F. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição M34I, V ou L. Em uma modalidade S35E, Q, N ou D. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição V48I. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S49G. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição Y58N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A60N. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição D61E. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S62I. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição V63F. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição A93T. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição D101S.
[312] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo I kappa humano variante modificada em uma ou mais das posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição R24K. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição Q27K. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S28D ou E. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição I29G, A ou S. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição S56R, N, T ou G. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma substituição T97N.
[313] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante humana modificada em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou todas as posições 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 e 101. Em uma modalidade, a modificação é selecionada do grupo que consiste em G26P, F27Y, T28P (S, Y, G ou N), F29L (V), S30T (R, N, K, C, G ou P), A33W (F), M34I (V ou L), S35E (Q, N ou D), V48I, S49G, Y58N, A60N, D61E, S62I, V63F, A93T e D101S. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo III variante modificada na posição 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 e/ou 80. Em uma modalidade, a dita substituição é V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A e/ou L80M.
[314] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência consenso de arcabouço do subgrupo I kappa humano variante modificada em 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as posições 24, 27-29, 56 e 97. Em uma modalidade, a modificação é selecionada do grupo que consiste em R24K, Q27K, S28D (E), I29G (A ou S), S56R (N, T ou G) e T97N. Em algumas modalidades da invenção, um anticorpo da invenção compreende uma sequência consenso de arcabouço KI variante modificada na posição 4 e/ou 47. Em uma modalidade, a dita substituição é M4L e/ou L47F.
[315] Um anticorpo da presente invenção pode compreender quaisquer sequências humanas ou sequências consenso de arcabouço de cadeia leve humanas adequadas, contanto que o anticorpo exiba as características biológicas adequadas (por exemplo, uma afinidade de ligação desejada). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) da sequência de arcabouço humano de cadeia leve k. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) de sequência consenso de arcabouço de subgrupo I k humano.
[316] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve que compreende sequência de arcabouço representada em SEQ ID NO: 9 (Figuras 7A-B) e/ou 13 (Figuras 8A-B).
[317] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo humanizado anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico. Em um aspecto, o anticorpo humanizado anti-CD79b conjugado com um agente citotóxico inibe a progressão do tumor em xenoenxertos.
[318] Em um aspecto, tanto o anticorpo humanizado quanto anticorpo quimérico são monovalentes. Em uma modalidade, tanto o anticorpo humanizado quanto quimérico compreendem uma região Fab única ligada a uma região Fc. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico de referência compreende sequências de domínio variável descritas nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14) ligadas a uma região Fc humana. Em uma modalidade, a região Fc humana é aquela de uma IgG (por exemplo, IgG1, 2, 3 ou 4).
[319] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 164-166). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 160-163). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende o sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 15 (SEQ ID NO: 167 e/ou 168) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 164-166), e a sequência FR1- HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 15, SEQ ID NO: 160-163), e a CH1 e/ou Fc (Figura 15, SEQ ID NO: 167 e/ou 168).
[320] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 156158). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 15 (SEQ ID NO: 152-155). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 15 (SEQ ID NO: 159). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155) representadas na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2- LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO:156-158), e a sequência CL1 (SEQ ID NO: 159) representadas na figura 15. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155) representada na figura 15, e a sequência CL1 representada na figura 15 (SEQ ID NO: 159).
[321] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 183-185). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 179-182). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 16 (SEQ ID NO: 186 e/ou 187) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 183-185), e a sequência FR1- HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 16, SEQ ID NO: 179-182), e a CH1 e/ou Fc (Figura 16, SEQ ID NO: 186 e/ou 187).
[322] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 175177). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 16 (SEQ ID NO: 171-174). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 16 (SEQ ID NO: 178). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representadas na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2- LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência CL1 (SEQ ID NO: 178) representadas na figura 16. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174) representada na figura 16, e a sequência CL1 representada na figura 16 (SEQ ID NO: 178).
[323] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 202-204). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 198-201). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 17 (SEQ ID NO: 205 e/ou 206) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 202-204), e a sequência FR1- HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 17, SEQ ID NO: 198-201), e a CH1 e/ou Fc (Figura 17, SEQ ID NO: 205 e/ou 206).
[324] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 194196). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 17 (SEQ ID NO: 190-193). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 17 (SEQ ID NO: 197). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) representadas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2- LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência CL1 (SEQ ID NO: 197) representadas na figura 17. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193) representada na figura 17, e a sequência CL1 representada na figura 17 (SEQ ID NO: 197).
[325] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 221-223). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 217-220). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3- HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 217-220). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência CH1 e/ou Fc representada na figura 18 (SEQ ID NO: 224 e/ou 225) Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 221-223), e a sequência FR1- HC, FR2-HC, FR3-HC e/ou FR4-HC (Figura 18, SEQ ID NO: 217-220), e a CH1 e/ou Fc (Figura 18, SEQ ID NO: 224 e/ou 225).
[326] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 213215). Em uma modalidade, o domínio variável compreende sequência FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada na figura 18 (SEQ ID NO: 209-212). Em uma modalidade, o anticorpo compreende sequência CL1 representada na figura 18 (SEQ ID NO: 216). Em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representadas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2- LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência CL1 (SEQ ID NO: 216) representadas na figura 18. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), e a sequência FR1- LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212) representada na figura 18, e a sequência CL1 representada na figura 18 (SEQ ID NO: 216).
[327] Em um aspecto, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos modificados por engenharia com cisteína onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo parental são substituídos por um aminoácido sem cisteína da maneira revelada em WO2006/034488; U.S. 2007/0092940 (aqui incorporada pela referência na sua íntegra). Qualquer forma de anticorpo anti- CD79b pode ser assim modificada por engenharia, isto é, mutada. Por exemplo, um fragmento Fab de anticorpo parental pode ser modificado por engenharia para formar um Fab modificado por engenharia com cisteína, aqui referido como “TioFab.” Similarmente, um anticorpo monoclonal pai pode ser modificado por engenharia para formar um “TioMab.” Nota-se que uma mutação de sítio único produz um resíduo de cisteína modificado por engenharia único em um TioFab, enquanto uma mutação de sítio único produz dois resíduos de cisteína modificados por engenharia em um TioMab, em virtude da natureza dimérica do anticorpo IgG. Os anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção incluem anticorpos monoclonais, humanizados ou anticorpos monoclonais quiméricos, e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, polipeptídeos de fusão e análogos que se ligam preferivelmente a polipeptídeos CD79b associados a célula. Um anticorpo modificado por engenharia com cisteína pode compreender alternativamente um anticorpo que compreende uma cisteína em uma posição aqui revelada no anticorpo ou Fab, que resulta do desenho da sequência e/ou seleção do anticorpo, sem alterar necessariamente um anticorpo parental, tal como por desenho e seleção de anticorpo de exibição de fago ou por meio de novo desenho de sequências de arcabouço de cadeia leve e/ou cadeia pesada e regiões constantes. U anticorpo modificado por engenharia com cisteína compreende um ou mais aminoácidos sem cisteína com um valor de reatividade de tiol nas faixas de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0 ou 0,8 a 1.0. Um aminoácido sem cisteína é um resíduo de cisteína que foi modificado por engenharia no anticorpo parental e não é parte de uma ponte de dissulfeto. Anticorpos modificados por engenharia com cisteína são usados para anexação de compostos citotóxicos e/ou de imageamento no sítio da cisteína modificada por engenharia por meio de, por exemplo, uma maleimida ou haloacetila. A reatividade nucleofílica da funcionalidade do tiol de um resíduo Cis em um grupo maleimida é cerca de 1.000 vezes maior comparada a qualquer outra funcionalidade de aminoácido em uma proteína, tais como resíduos de grupo amino de lisina ou o grupo amino N-terminal. A funcionalidade específica do tiol em reagentes iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas pH maior (>9.0) e tempos de reação mais longos são exigidos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).
[328] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína da presente invenção compreende uma cisteína modificada por engenharia em qualquer uma das seguintes posições, onde o posição é numerada de acordo com Kabat et al. na cadeia leve (ver Kabat et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e de acordo com a numeração EU na cadeia pesada (incluindo a região Fc) (ver Kabat et al. (1991), supra) , em que a região constante de cadeia leve representada por sublinhado na figura 24A, 25A, 26A, 27A, 28, 48A e 49A está na posição 109 (numeração Kabat) e a região constante de cadeia pesada representada por sublinhado nas figuras 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 48B e 49B está na posição 118 (numeração EU). A posição também pode ser referida por sua posição na numeração sequencial dos aminoácidos de cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento total mostrada nas figuras 24-28, 48 e 49. De acordo com uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína modificada por engenharia em LC-V205C (número Kabat: Val 205; número sequencial 209 na figura 27A e 49A modificado por engenharia para ser Cis nesta posição). A cisteína modificada por engenharia na cadeia leve é mostrada em Bold, texto duplo sublinhado nas figuras 27A e 49A. De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína modificada por engenharia em HC-A118C (número EU: Ala 118; número Kabat 114; número sequencial 118 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado por engenharia para ser Cis nesta posição). A cisteína modificada por engenharia na cadeia pesada é mostrada em Bold, texto duplo sublinhado na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B. De acordo com uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b compreende uma cisteína modificada por engenharia em Fc-S400C (número EU: Ser 400; número Kabat 396; número sequencial 400 na figura 24B, 25B, 26B, 28B ou 48B modificado por engenharia para ser Cis nesta posição). Em outras modalidades, a cisteína modificada por engenharia da cadeia pesada (incluindo a região Fc) está em qualquer uma das seguintes posições (de acordo com a numeração Kabat com numeração EU em parênteses): 5, 23, 84, 112, 114 (numeração EU 118), 116 (numeração EU 120), 278 (numeração EU 282), 371 (numeração EU 375) ou 396 (numeração EU 400). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo humanizado anti-CD79b pai da invenção são: V5C, A23C, A84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo quimérico anti-CD79b pai da invenção são: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo anti- cinoCD79b pai da invenção são: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (numeração EU A118C), T116C (numeração EU T120C), V278C (numeração EU V282C), S371C (numeração EU S375C) ou S396C (numeração EU S400C). Em outras modalidades, a cisteína modificada por engenharia de cadeia leve está em qualquer uma das seguintes posições (de acordo com a numeração Kabat): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo humanizado anti-CD79b pai da invenção são: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C ou V205C. Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo quimérico anti-CD79b pai da invenção são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C ou V205C. Assim, mudanças no aminoácido nestas posições por um anticorpo anti-cinoCD79b pai da invenção são: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C ou V205C.
[329] Em um aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína que compreende um ou mais aminoácidos sem cisteína em que o anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína liga-se a um polipeptídeo CD79b e é preparado por um processo que compreende substituir um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo parental anti-CD79b por cisteína em que o anticorpo parental compreende pelo menos uma sequência HVR selecionada de: (a) HVR-L1 que compreende sequência A1-A15, em que A1- A15 é KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) ou KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137); (b) HVR-L2 que compreende sequência B1-B7, em que B1-B7 é AASNLES (SEQ ID NO: 132); (c) HVR-L3 que compreende sequência C1-C9, em que C1-C9 é QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133); (d) HVR-H1 que compreende sequência D1-D10, em que D1 D10 é GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134); (e) HVR-H2 que compreende sequência E1-E18, em que E1- E18 é GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135) e (f) HVR-H3 que compreende sequência F1-F10, em que F1- F10 é TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) ou TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138).
[330] Em um certo aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos, com um anticorpo modificado por engenharia com cisteína tendo uma sequência de aminoácidos de comprimento total da maneira aqui revelada, ou uma sequência de aminoácidos de anticorpo modificado por engenharia com cisteína que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada.
[331] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado que compreende uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza o complemento de uma molécula de DNA que codifica (a) um anticorpo modificado por engenharia com cisteína com uma sequência de aminoácidos de comprimento total da maneira aqui revelada, (b) uma sequência de aminoácidos de anticorpo modificado por engenharia com cisteína que necessita do peptídeo sinal da maneira aqui revelada, (c) um domínio extracelular de um anticorpo transmembrana modificado por engenharia com proteína cisteína, com ou sem o peptídeo sinal, da maneira aqui revelada, (d) uma sequência de aminoácidos codificada por quaisquer das sequências de ácido nucleico aqui reveladas ou (e) qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de aminoácidos de comprimento total de anticorpo modificado por engenharia com cisteína da maneira aqui revelada.
[332] Em um aspecto específico, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado sem a sequência sinal N-terminal e/ou sem a metionina de iniciação e é codificado por uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos como esta da maneira aqui descrita. Processos para produzir o mesmo também são aqui descritos, em que aqueles processos compreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a codificação apropriada da molécula de ácido nucleico em condições adequadas para expressão do anticorpo modificado por engenharia com cisteína e recuperar o anticorpo modificado por engenharia com cisteína a partir da cultura de célula.
[333] Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína isolado que está tanto no domínio transmembrana deletado quanto no domínio transmembrana inativado. Processos para produzir o mesmo são também aqui descritos, em que aqueles processos compreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor que compreende a codificação apropriadas da molécula de ácido nucleico em condições adequadas para expressão do anticorpo modificado por engenharia com cisteína e recuperar o anticorpo modificado por engenharia com cisteína a partir da cultura de célula.
[334] Em outros aspectos, a presente invenção fornece anticorpos quiméricos anti-CD79b isolado modificados por engenharia com cisteína compreendendo quaisquer dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína aqui descritos ligados a um polipeptídeo heterólogo (não-CD79b). Exemplos de tais moléculas quiméricas compreendem quaisquer dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína aqui descritos ligados a um polipeptídeo heterólogo tal como, por exemplo, uma sequência tag de epítopo ou uma região Fc de uma imunoglobulina.
[335] O anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única ou anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b a seu respectivo epítopo antigênico. Anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente conjugados com um agente inibitório de crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, uma auristatina, uma maitansinoide, um derivado de dolostatina ou uma caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, um enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos da presente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e, preferivelmente, inibem o crescimento ou proliferação de ou induzem a morte de uma célula na qual eles se ligam. Com propósitos de diagnóstico, os anticorpos da presente invenção podem ser marcados detectavelmente, anexados a um suporte sólido ou similares.
[336] Em outros aspectos da presente invenção, a invenção fornece vetores compreendendo DNA que codifica quaisquer dos anticorpos anti-CD79b e anticorpos anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína aqui descritos. São também fornecidas célula hospedeiras que compreendem qualquer vetor como este. A título de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produzir quaisquer dos polipeptídeos aqui descritos é fornecido adicionalmente e compreende cultivar células hospedeiras em condições adequadas para expressão do polipeptídeo desejado e recuperar o polipeptídeo desejado da cultura de célula.
[337] Anticorpos modificados por engenharia com cisteína pode ser usado no tratamento de câncer e inclui anticorpos específicos para superfície celular e receptores transmembrana, e antígenos associado a tumor (TAA). Tais anticorpos podem ser usados como anticorpos nus (não conjugado com um medicamento ou fração de marcador) ou como conjugados de anticorpo- medicamento (ADC). Anticorpos modificados por engenharia com cisteína da invenção podem ser acoplados específica e eficientemente ao sítio com um reagente reativo de tiol. O reagente reativo de tiol pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente de marcador de captura, um reagente fluoróforo ou um intermediário medicamento-ligante. O anticorpo modificado por engenharia com cisteína pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado em um suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma fração de medicamento. A reatividade de tiol pode ser generalizada para qualquer anticorpo onde a substituição de aminoácidos com aminoácidos cisteína reativos pode ser realizada em faixas na cadeia leve selecionadas de faixas de aminoácidos: L10- L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; e em faixas na cadeia pesada selecionadas de faixas de aminoácidos: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, e na região Fc em faixas selecionadas de H270-H280, H366-H376, H391-401, onde a numeração de posições aminoácido começa na posição 1 do sistema Kabat de numeração (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e continua sequencialmente depois da maneira revelada em WO2006034488; U.S. 2007/0092940. Reatividade de tiol também pode ser generalizada em certos domínios de um anticorpo, tais como o domínio constante de cadeia leve (CL) e domínio constante de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Substituições de cisteína que resultam em valor de reatividade de tióis de 0,6 e maior podem ser realizadas no domínio constante de cadeia pesada α, δ, ε, Y, e μ de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, incluindo as subclasses IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Tais anticorpos e seus usos são revelados em WO2006/034488; U.S. 2007/0092940.
[338] Anticorpos modificados por engenharia com cisteína da invenção mantêm preferivelmente a capacidade de ligação de antígeno de suas contrapartes de anticorpo parental tipo selvagem. Assim, anticorpos modificados por engenharia com cisteína são capazes de se ligar, preferivelmente de maneira específica, a antígenos. Tais antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados a tumor (TAA), proteínas de receptor de superfície celular e outras moléculas celulares de superfície, proteínas transmembrana, proteínas de sinalização, fatores regulatórios de sobrevivência celular, fatores regulatórios de proliferação celular, moléculas associadas (por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente com) ao desenvolvimento ou diferenciação do tecido, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas na regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas na vasculogênese e moléculas associadas (por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente com) a angiogênese. O antígeno associado a tumor pode ser um fator de diferenciação de agrupamento (isto é, uma proteína CD incluindo, mas sem limitação, CD79b). Anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção mantêm a capacidade de ligação de antígeno de suas contrapartes de anticorpo anti-CD79b pai. Assim, anticorpos anti-CD79b modificados por engenharia com cisteína da invenção são capazes de se ligar, preferivelmente de maneira específica, a antígenos CD79b incluindo isoformas beta e/ou alfa anti-CD79b humanas, incluindo quando tais antígenos são expressos na superfície de células, incluindo, sem limitação, células B.
[339] Em um aspecto, anticorpos da presente invenção podem ser conjugados com qualquer fração de marcador que pode ser covalentemente anexada ao anticorpo por meio uma fração reativa, uma fração ativada ou um grupo tiol de cisteína reativa (Singh et al., (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). o marcador anexada pode funcionar em: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com uma segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, para dar FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou maior afinidade de ligação, com antígeno ou elemento de ligação; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, por carga, hidrofobicidade, forma, ou outros parâmetros físicos, ou (v) fornecer uma fração de captura para modular elemento de afinidade de ligação, ligação anticorpo/antígeno ou complexação iônica.
[340] Anticorpos modificados por engenharia com cisteína marcados podem ser usados em ensaios de diagnósticos, por exemplo, para detectar a expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos ou soro específicos. Para aplicações de diagnósticos, o anticorpo será tipicamente marcado com uma fração detectável. Marcas numerosas são disponíveis as quais podem estar em geral agrupadas nas seguintes categorias:
[341] Radioisótopos (radionuclídeos), tais como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At ou 213Bi. Anticorpos marcados com radioisótopo são usados em experimentos de imageamento de receptor alvejado. O anticorpo pode ser marcado com reagentes de elemento de ligação que ligam, quelam ou complexam de outra forma um metal radioisótipo onde o reagente é reativo com o tiol de cisteína modificado por engenharia do anticorpo, usando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Elementos de ligação de quelação que podem complexar um íon metálico incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocíclicos, Dallas, TX). Radionuclídeos podem ser alvejados por meio de complexação com os conjugados de anticorpo-medicamento da invenção (Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146).
[342] Reagentes ligantes tal como DOTA-maleimida (4- maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados pela reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) ativado com com isopropilcloroformato (Aldrich), após o procedimento de Axworthy et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807). Reagentes de DOTA-maleimida reagem com os aminoácidos sem cisteína dos anticorpos modificados por engenharia com cisteína e fornecem um elemento de ligação de complexação metálica no anticorpo (Lewis et al., (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Reagentes de marcação de ligante de quelação tal como DOTA-NHS ácido (1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético mono (N-hidroxisuccinimida éster) são comercialmente disponíveis (Macrocíclicos, Dallas, TX). Imageamento do receptor alvo com anticorpos marcados com radionuclídeo pode promover um marcador de ativação de caminho por detecção e quantificação de acúmulo progressivo de anticorpos em tecido de tumor (Albert et al., (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). O conjugado rádio-metais pode permanecer intracelular após degradação lipossomal.
[343] Complexos metal-quelado adequado como marcas de anticorpo para experimentos de imageamento são revelados: U.S 5342606; U.S 5428155; U.S 5316757; U.S 5480990; U.S 5462725; U.S 5428139; U.S 5385893; U.S 5739294; U.S 5750660; U.S 5834456; Hnatowich et al.,(1983) J. Immunol. Metods 65:147-157; Meares et al., (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al., (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al., (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al., (1992) Bioconjugate Chem. 3:346350; Nikula et al., (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al., (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al., (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al., (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al., (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al., (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al., (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al., (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al., (2004) J. Nucl. Med. 45:129137; DeNardo et al., (1998) Clinical Cncer Research 4:2483-90; Blend et al., (2003) Cncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al., (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al., (1998) J. Nucl. Med. 39:82936; Mardirossian et al., (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al., (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
[344] Marcas fluorescentes tais como quelados terrosos raros (quelados de európio), tipos fluorescentes incluindo FITC, 5-carboxifluoresceina, 6-carboxi fluoresceina; tipos rodamina incluindo TAMRA; dansil; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; vermelho Texas; e análogos destes. As marcas fluorescentes podem ser conjugadas com anticorpos usando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Corantes fluorescentes e reagentes de marcador fluorescente incluem aqueles que são comercialmente disponíveis pela Invitrogen/Molecular Sondas (Eugene, OU) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
[345] Várias marcas de enzima-substrato são disponíveis ou reveladas (U.S. 4275149). Em geral, a enzima em geral catalisa uma alteração química de um substrato cromogênico que pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medido espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma mudança na fluorescência são descritas anteriormente. O substrato quimioluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; U.S. 4737456), luciferina, 2,3-diidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase do rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), β- galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), heterocíclico oxidases (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas para conjugar enzimas nos anticorpos são descritos em O'Sullivan et al., (1981) “Metods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, em Metods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.
[346] Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) peroxidase de rábano silvestre (HRP) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou substrato fluorgênico 4- metilumbelliferil-β-D-galactosidase.
[347] Inúmeras outras combinações enzima-substrato são disponíveis aos versados na técnica. Para uma revisão geral, ver U.S. 4275149 e U.S. 4318980.
[348] Um marcador pode ser indiretamente conjugada com uma cadeia lateral de aminoácido, uma cadeia lateral de aminoácido ativado, um anticorpo modificado por engenharia com cisteína e similares. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e quaisquer das três amplas categorias de marcas anteriormente mencionadas podem ser conjugadas com avidina ou estreptavidina ou vice versa. Biotina liga-se seletivamente à estreptavidina e assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo nesta maneira indireta. Alternativamente, para atingir conjugação indireta da marcador com o polipeptídeo variante, o polipeptídeo variante é conjugado com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos tipos diferentes de marcas mencionados anteriormente é conjugado com um polipeptídeo variante anti- hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Assim, conjugação indireta da marcador com o polipeptídeo variante pode ser atingida (Hermanson, G. (1996) em Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
[349] O anticorpo da presente invenção pode ser empregado em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ELISA, ensaios de ligação competitivos, ensaios do sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).
[350] Um marcador de detecção pode ser usado para localizar, visualizar e quantificar uma ligação ou evento de reconhecimento. Os anticorpos marcados da invenção podem detectar receptores de superfície celular. Um outro uso para anticorpos detectavelmente marcados é um método de imunocaptura a base de microesferas compreendendo conjugar uma microesfera com um anticorpo marcado fluorescente e detectar um sinal de fluorescência mediante ligação de um elemento de ligação. Metodologias de detecção de ligação similar utilizam o efeito da ressonância de plásmon de superfície (SPR) para medir e detectar interações anticorpo-antígeno.
[351] Marcas de detecção tais como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et al., (1997) "Synthesis of Funcionalised fluorescents Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) fornecem um sinal detectável e são em geral aplicáveis para marcar anticorpos, preferivelmente com as seguintes propriedades: (i) o anticorpo marcado pode produzir um sinal muito alto com fundo baixo de maneira tal que pequenas quantidades de anticorpos podem ser sensivelmente detectados tanto em ensaios sem célula quanto a base de célula; e (ii) o anticorpo marcado pode ser fotoestável de maneira tal que o sinal fluorescente pode ser observado, monitorado e gravado sem fotodegradação significativa. Para aplicações que envolvem ligação de superfície celular de anticorpo marcado em membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, as marcas preferivelmente (iii) apresentam boa solubilidade em água para atingir concentração de conjugado e sensibilidade de detecção efetivos e (iv) são não tóxicos para células vivas de maneira a não interromper os processos metabólicos normais das células ou causar morte celular prematura.
[352] A quantificação direta de intensidade de fluorescência celular e enumeração de eventos fluorescentemente marcados, por exemplo, ligação de superfície celular de conjugados peptídeo-corante, pode ser conduzida em um sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster Citi, Calif.) que automatiza ensaios de mistura e leitura não radioativos com células vivas ou microesferas (Miraglia, "Homogeneous cell- and beadbased assays for high throughput screening using fluormetric microvolume assay technology", (1999) J. de Biomolecular Screening 4:193-204). Os usos de anticorpos marcados também incluem ensaios de ligação de receptor de superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios imunoabsorventes ligados à fluorescência (FLISA), clivagem por caspase (Zheng, "Caspase-3 controls both citoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; U.S. 6372907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow citometric detection of fosfatidilserine expression on early apoptotic cell using fluorescein labelled Anexina V" (1995) J. Immunol. Métodos 184:39-51) e ensaios de citotoxicidade. Tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico pode ser usada para identificar a supra ou infraregulação de uma molécula que é alvejada na superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluormetric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
[353] Anticorpos marcados da invenção são usados como biomarcadores e sondas de imageamento pelos múltiplos métodos e técnicas de imageamento biomédico e molecular tais como: (i) MRI (imageamento de ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computadorizada); (iii) SPECT (tomografia computada por emissão de fóton único); (iv) PET (tomografia de emissão de pósitron) Chen et al., (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultrassom. Imunoscintigrafia é um procedimento de imageamento no qual anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados a um animal ou paciente humano e uma ilustração é tirada de sítios no corpos onde se localiza o anticorpo (U.S. 6528624). Biomarcadores de imageamento podem ser medidos e avaliados objetivamente como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas em uma intervenção terapêutica. Biomarcadores podem ser de múltiplos tipos: Tipo 0 são marcadores de histórico natural de uma doença e correlaciona-se longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo, determinação de MRI de inflamação sinovial em artrite reumatoide; marcadores Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de ação, ainda por meio do mecanismo, podem não estar associados ao resultado clínico; marcadores Tipo II funcionam como pontos finais substitutos onde na mudança ou sinal, o biomarcador prediz um benefício clínico para “validar” a resposta alvejada, tal como erosão óssea medida em artrite reumatoide por CT. Biomarcadores de imageamento podem assim fornecer informação terapêutica farmacodinâmica (PD) com relação a: (i) expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de um agente terapêutico na proteína alvo, isto é, seletividade, e (iii) dados de liberação e farmacocinética de meia vida. Vantagens de biomarcadores de imageamento in vivo com relação biomarcadores de laboratório incluem: tratamento não invasivo, determinação quantificável de todo o corpo, determinação e dosagem repetitiva, isto é, pontos de tempo múltiplos, e efeitos potencialmente transferíveis a partir de resultado pré-clínico (animal pequeno) a clínico (humano). Para algumas aplicações, bioimageamento substitui ou diminui o número de experimentos com animal em estudos pré-clínicos.
[354] Métodos de marcação de peptídeo são bem conhecidos. Ver Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al., (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work e E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. e Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I e II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin e New York; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al.,(2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al.,(2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al.,(2002) Bioconjugate Chem. 13:110115; Mier et al.,(2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
[355] Peptídeos e proteínas marcados com duas frações, um repórter fluorescente e inibidor em proximidade suficiente, submetem-se a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Grupos repórteres são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados por luz em certo comprimento de onda e energia de transferência em um grupo aceptor ou inibidor com o deslocamento Stokes apropriado para emissão em brilho máximo. Corantes fluorescentes incluem moléculas com maior aromaticidade, tais como fluoresceína e rodamina e seus derivados. O repórter fluorescente pode ser parcial ou significativamente inibido pela fração inibidora em um peptídeo intacto. Mediante clivagem do peptídeo por uma peptidase ou protease, um aumento detectável na fluorescência pode ser medido (Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzyms”, Metods in Enzymology, Academic Press, 248:1834).
[356] Os anticorpos marcados da invenção também podem ser usados como um agente de purificação de afinidade. Neste processo, o anticorpo marcado é imobilizado em uma fase sólida como uma resina Sephadex ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado está conectado com uma amostra que contém o antígeno a ser purificado e, consequentemente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto o antígeno a ser purificado, que está ligado à variante do polipeptídeo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão glicina, pH 5,0, que liberará o antígeno do variante de polipeptídeo.
[357] Reagentes de marcação carregam tipicamente funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com uma cisteína tiol de um anticorpo modificado por engenharia com cisteína para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente ligante para formar um intermediário ligante- marcador, ou (iii) com um anticorpo ligante para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reativa de reagentes de marcação incluei: maleimida, haloacetila, iodoacetamida succinimidil éster (por exemplo, NHS, N-hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6-diclorotriazinila, pentafluorfenil éster, e fosforamidita, embora outros grupos funcionais também possam ser usados.
[358] Um grupo funcional reativo exemplar é N-hidroxisuccinimidil éster (NHS) de um grupo carboxila substituinte de um marcador detectável, por exemplo, biotina ou um corante fluorescente. O NHS éster do marcador pode ser realizado, isolado, purificado, e/ou caracterizado, ou pode ser formado in situ e reagido com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxila do marcador é ativada reagindo com alguma combinação de um reagente carbodiimida, por exemplo, dicicloexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente urônio, por exemplo, TSTU tetrafluorborato de (O-(N-Succinimidil)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio, HBTU (O- benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio hexafluorfosfato), ou HATU (O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio hexafluorfosfato), um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), e N-hidroxisuccinimida para dar o NHS éster da marcador. Em alguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados in situ por ativação do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado marcador-anticorpo em uma etapa. Outros reagentes de ativação e acoplamento incluem TBTU (2-(1H-benzotriazo-1-il)-1-1,3,3-tetrametilurônio hexafluorfosfato), TFFH (N,N’,N”,N’”-tetrametilurônio 2-flúor-hexafluorfosfato), hexafluorfosfato de PyBOP (benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfônio, EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-diidro-quinolina), DCC (dicicloexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSNT (1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H- 1,2,4-triazol, e haletos de aril sulfonila, por exemplo, cloreto de triisopropilbenzenossulfonila.
COMPOSTOS FAB DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA DA INVENÇÃO:
[359] Em um aspecto, o anticorpo da invenção está ligado a uma proteína de ligação de albumina. A ligação plasma-proteína pode ser de uma maneira eficiente de melhorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. Albumina é a proteína mais abundante no plasma. Peptídeos de ligação de albumina sérica (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínio ativo fundidas, incluindo alteração, absorção, penetração e difusão de tecido. Estes parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados por seleção específica da sequência de peptídeo de ligação de albumina sérica apropriada (U.S. 20040001827). Uma série de peptídeos de ligação de albumina foram identificados triando a exibição de fago (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As a General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Compostos da invenção incluem preceitos de sequências ABP por: (i) Dennis et al., (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 nas tabelas III e IV, página 35038; (ii) U.S. 20040001827 em [0076] SEQ ID NO: 9-22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12-13, todos os quais são aqui incorporados pela referência. Fabs de ligação de albumina (ABP) são modificados por engenharia fundindo um peptídeo de ligação de albumina ao terminal C de Fab de cadeia pesada em razão estequiométrica 1:1 (1 ABP / 1 Fab). Observa-se que a associação destes ABP-Fabs com albumina aumenta a meia vida do anticorpo em mais que 25 vezes em coelhos e camundongos. Os resíduos Cis reativos anteriormente descritos podem, portanto, ser introduzidos nestes ABP-Fabs e usados para conjugação de sítio específico com medicamentos citotóxicos seguido por estudos em animal in vivo.
[360] Sequências de peptídeos de ligação de albumina exemplificativos incluem, mas sem limitações, as sequências de aminoácidos listadas em SEQ ID NO: 246-250: CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 246 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 247 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 248 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 249 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 250
CONJUGADOS DE ANTICORPO-MEDICAMENTO
[361] Em um outro aspecto, a invenção fornece imunoconjugados, ou conjugados de anticorpo-medicamento (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, um medicamento, um agente inibitório de crescimento, um toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Em um outro aspecto, a invenção fornece adicionalmente métodos de usar os imunoconjugados. Em um aspecto, um imunoconjugado compreende quaisquer dos anteriores anticorpos anti-CD79b anexados covalentemente a um agente citotóxico ou um agente detectável.
[362] Em um aspecto, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b. Em uma outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado pelo fragmento Fab de um anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, um anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B) ou um anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de cada anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413 depositado com a ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de IgG1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se ao mesmo epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b (isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
[363] Em outro aspecto, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epítopo em CD79b distinto de um epítopo ligado por um outro anticorpo CD79b. Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epítopo em CD79b distinto de um epítopo ligado pelo fragmento Fab de anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas HB11413 depositados com a ATCC em 20 de julho de 1993, anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de cada anticorpo gerado a partir de hibridomas HB11413depositados com a ATCC em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de IgG1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção liga-se a um epítopo em CD79b distinto de um epítopo em CD79b ligado por um outro anticorpo CD79b (isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
[364] Em outro aspecto, um anticorpo CD79b da invenção é distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab do anticorpo monoclonal gerado a partir de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993, o anticorpo monoclonal que compreende os domínios variáveis de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B), ou anticorpo quimérico compreendendo o domínio variável de anticorpo gerado a partir de hibridomas depositados com a ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993 e domínios constantes de IgG1, ou os domínios variáveis de anticorpo monoclonal que compreendem as sequências de SEQ ID NO: 10 (Figuras 7A-B) e SEQ ID NO: 14 (Figuras 8A-B). Em outra modalidade, um anticorpo CD79b da invenção é distinto de (isto é, não é) um fragmento Fab de um outro anticorpo CD79b ((isto é, CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), anticorpo CD79b anti-humano (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
[365] Em um aspecto, um anticorpo da invenção liga-se especificamente a CD79b de uma primeira espécie animal, e não se liga especificamente a CD79b de uma segunda espécie animal. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é humana e/ou primata (por exemplo, macaco cinomolgo), e a segunda espécie animal é murina (por exemplo, camundongo) e/ou canina. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é humana. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é primata, por exemplo, macaco cinomolgo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é murina, por exemplo, camundongo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é canina.
[366] Em um aspecto, a invenção fornece composições que compreendem um ou mais anticorpos da invenção e um veículo. Em uma modalidade, o veículo é farmaceuticamente aceitável.
[367] Em um aspecto, a invenção fornece ácido nucleicos que codificam um anticorpo CD79b da invenção.
[368] Em um aspecto, a invenção fornece vetores que compreendem um ácido nucleico da invenção.
[369] Em um aspecto, a invenção fornece células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico ou um vetor da invenção. Um vetor pode ser de qualquer tipo, por exemplo um vetor recombinante tal como um vetor de expressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode ser usada. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula procariótica, por exemplo, E. coli. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero tal como célula de ovário do hamster chinês (CHO).
[370] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para produzir um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo CD79b (que, da maneira aqui definida inclui comprimento total e fragmentos deste), o dito método compreendendo expressar em uma célula hospedeira adequada um vetor recombinante da invenção que codifica o dito anticorpo (ou fragmento deste), e recuperar o dito anticorpo.
[371] Em um aspecto, a invenção fornece um artigo de fabricação que compreende um recipiente; e uma composição contida no recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos CD79b da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, uma composição que compreende um anticorpo compreende adicionalmente um veículo, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um artigo de fabricação da invenção compreende adicionalmente instruções para administrar a composição (por exemplo, o anticorpo) a um sujeito.
[372] Em um aspecto, a invenção fornece um estojo que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição compreendendo um ou mais anticorpos CD79b da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Em uma modalidade, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, uma composição que compreende um anticorpo antagonista compreende adicionalmente um veículo, que em algumas modalidades é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um estojo compreende adicionalmente instruções para administrar a composição (por exemplo, o anticorpo) a um sujeito.
[373] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo CD79b da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[374] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ácido nucleico da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[375] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um vetor de expressão da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[376] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de uma célula hospedeira da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[377] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um artigo de fabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[378] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um estojo da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor e/ou um distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, câncer, tumor e/ou distúrbio de célula proliferativa é selecionado de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[379] Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibir o crescimento de uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com um anticorpo da invenção causando por meio disso uma inibição de crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[380] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um mamífero com um tumor canceroso compreendendo uma célula que expressa CD79b, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo da invenção, tratando efetivamente por meio disso o dito mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[381] Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio de célula proliferativa associado a maior expressão de CD79b, o dito método compreendendo administrar a um sujeito que necessita de tal tratamento uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, tratando ou prevenindo efetivamente por meio disso o dito distúrbio de célula proliferativa. Em uma modalidade, o dito distúrbio proliferativo é câncer. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[382] Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir o crescimento de uma célula, em que crescimento da dita célula depende pelo menos em parte de um efeito de potenciação de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, inibindo por meio disso o crescimento da dita célula. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[383] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar terapeuticamente um tumor em um mamífero, em que o crescimento do dito tumor depende pelo menos em parte de um efeito de potenciação de crescimento de CD79b, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com uma quantidade efetiva de um anticorpo da invenção, tratando efetivamente por meio disso o dito tumor. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[384] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar câncer que compreende administrar a um paciente a formulação farmacêutica compreendendo um imunoconjugado aqui descrito, diluente, veículo ou excipiente aceitável. Em uma modalidade, o câncer é selecionado do linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. Em uma modalidade, ao paciente é administrado um agente citotóxico em combinação com o conjugado do composto anticorpo-medicamento.
[385] Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibir proliferação de célula B compreendendo expor uma célula a um imunoconjugado que compreende um anticorpo da invenção em condições permissivas para ligação do imunoconjugado no CD79b. Em uma modalidade, a proliferação de célula B é selecionada de linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto. Em uma modalidade, a célula B é um xenoenxerto. Em uma modalidade, a exposição ocorre in vitro. Em uma modalidade, a exposição ocorre in vivo.
[386] Em um aspecto, a invenção fornece um método de determinar o presença de CD79b em uma amostra suspeita de conter CD79b, o dito método compreendendo expor a dita amostra a um anticorpo da invenção, e determinar a ligação do dito anticorpo no CD79b na dita amostra, em que a ligação do dito anticorpo no CD79b na dita amostra é indicativa da presença da dita proteína na dita amostra. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra biológica. In um modalidade adicional, a amostra biológica compreende células B. Em uma modalidade, a amostra biológica é de um mamífero experimentando ou suspeito de experimentar um distúrbio de célula B e/ou um distúrbio proliferativo de célula B incluindo, mas sem limitação, linfoma, linfoma não Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
[387] Em um aspecto, um método de diagnosticar um distúrbio de célula proliferativa associado a um aumento nas células, tal como células B, que expressam CD79b é fornecido, o método compreende colocar uma células teste em uma amostra biológica em contato com quaisquer dos anticorpos anteriores; determinar o nível de anticorpo ligado à células testes na amostra detectando a ligação do anticorpo no CD79b; e comparar o nível de anticorpo ligado nas células em uma amostra controle, em que o nível de anticorpo ligado é normalizado com o número de célula que expressa CD79bs nas amostras teste e controle, e em que um nível maior de anticorpo ligado na amostra teste comparado à amostra controle indica a presença de um distúrbio de célula proliferativa associado a células que expressam CD79b.
[388] Em um aspecto, um método de detectar CD79b solúvel em sangue ou soro é fornecido, o método compreendendo colocar uma amostra teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de experimentar um distúrbio de célula B proliferativo em contato com um anticorpo anti-CD79b da invenção e detectar um aumento em CD79b solúvel na amostra teste com relação a uma amostra controle de sangue ou soro de um mamífero normal. Em uma modalidade, o método de detectar é usado como um método de diagnosticar um distúrbio proliferativo de célula B associado a um aumento em CD79b solúvel em sangue ou soro de um mamífero.
[389] Em um aspecto, um método de ligar um anticorpo da invenção a uma célula que expressa CD79b é fornecido, o dito método compreendendo colocar a dita célula em contato com um anticorpo da invenção. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico. Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um agente inibitório de crescimento.
[390] Métodos da invenção podem ser usados para afetar qualquer estado patológico adequado, por exemplo, células e/ou tecidos associados a expressão de CD79b. Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula hematopoiética. Por exemplo, uma célula hematopoiética pode ser uma selecionada do grupo que consiste em um linfócito, leucócito, plaqueta, eritrócito e célula de exterminação natural. Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula B ou célula T. Em uma modalidade, uma célula que é alvejada em um método da invenção é uma célula cancerígena. Por exemplo, uma célula cancerígena pode ser uma selecionada do grupo que consiste em uma célula de linfoma, célula de leucemia ou célula de mieloma.
[391] Métodos da invenção podem compreendem adicionalmente etapas de tratamento adicionais. Por exemplo, em uma modalidade, um método compreende adicionalmente uma etapa em que uma célula e/ou tecido alvejado (por exemplo, uma célula cancerígena) é exposto ao tratamento de radiação ou um agente quimioterápico.
[392] Da maneira aqui descrita, CD79b é um componente de sinalização do receptor de célula B. Dessa maneira, em uma modalidade de métodos da invenção, uma célula que é alvejada (por exemplo, uma célula cancerígena) é uma na qual CD79b é expresso comparado a uma célula que não expressa CD79b. Em um modalidade adicional, a célula alvejada é uma célula cancerígena na qual a expressão de CD79b é maior comparada à uma célula não normal de câncer do mesmo tipo de tecido. Em uma modalidade, um método da invenção causa a morte de uma célula alvejada.
[393] Em outros aspectos da presente invenção, a invenção fornece vetores compreendendo DNA que codifica quaisquer dos anticorpos aqui descritos. Célula hospedeira que compreende qualquer vetor como este também são fornecidas. A título de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produzir quaisquer dos anticorpos aqui descritos é fornecido adicionalmente e compreende cultivar células hospedeiras em condições adequadas para expressão do anticorpo desejado e recuperar o anticorpo desejado da cultura de célula.
[394] Ainda em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição de material compreendendo um anticorpo anti-CD79b da maneira aqui descrita, em combinação com um veículo. Opcionalmente, o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
[395] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de um anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b da maneira aqui descrita, para a preparação de um medicamento usado no tratamento de uma condição que é responsiva ao anticorpo de polipeptídeo anti-CD79b.
[396] Um outro aspecto da invenção é uma composição que compreende uma mistura de compostos anticorpo-medicamento da fórmula I onde o carregamento médio de medicamento por anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5 ou cerca de 3 a cerca de 4.
[397] Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica incluindo um composto da fórmula I ADC, uma mistura de compostos da fórmula I ADC, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[398] Um outro aspecto fornece uma combinação farmacêutica que compreende um composto da fórmula I ADC e um segundo composto com propriedades anticâncer ou outros efeitos terapêuticos.
[399] Um outro aspecto é um método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor ou células de câncer que compreende tratar as células com uma quantidade de um conjugado de anticorpo-medicamento da fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, que é efetivo para matar ou inibir a proliferação das células de tumor ou células de câncer.
[400] Um outro aspecto é um método de tratar câncer que compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica incluindo uma fórmula I ADC.
[401] Um outro aspecto inclui artigos de fabricação, isto é, estojos, compreendendo um conjugado de anticorpo-medicamento, um recipiente, e uma instrução para uso ou marcador indicando um tratamento.
[402] Um aspecto da invenção é um método para preparar um conjugado de medicamento da fórmula I de anticorpo composto que compreende as etapas de: (a) reagir um grupo de cisteína modificada por engenharia do anticorpo modificado por engenharia com cisteína com um reagente ligante para formar intermediário anticorpo-ligante Ab-L; e (b) reagir Ab-L com uma fração ativada de medicamento D; por meio do que o conjugado de anticorpo- medicamento é formado; ou que compreende as etapas de: (c) reagir um grupo nucleofílico de uma fração de medicamento com um reagente ligante para formar intermediário medicamento-ligante D-L; e (d) reagir D-L com um grupo de cisteína modificada por engenharia do anticorpo modificado por engenharia com cisteína; por meio do que o conjugado de anticorpo-medicamento é formado.
[403] Um aspecto da invenção é um ensaio para detectar células de câncer que compreende: (a) expor células a um conjugado anticorpo anti- CD79b modificado por engenharia com cisteína-medicamento; e (b) determinar a extensão da ligação do conjugado anticorpo anti-CD79b modificado por engenharia com cisteína-medicamento composto nas células.
A. ANTICORPOS ANTI-CD79B
[404] Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD79b que podem ser aqui usados como agentes terapêuticos. Anticorpos exemplificativos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
1. ANTICORPOS POLICLONAIS
[405] Anticorpos policlonais são preferivelmente aumentados em animais por injeções subcutâneas múltiplas (sc) ou intraperitoneal (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Podem ser usados para conjugar o antígeno relevante (especialmente quando peptídeos sintéticos são usados) em uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado com a hemocianina do caramujo (KLH), albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugação por meio de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.
[406] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados combinando, por exemplo, 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em sítios múltiplos. Sete a 14 dias depois, é coletado sangue dos animais e o soro é ensaiado para titulação de anticorpo. Os animais são estimulados até a titulação platô. Os conjugados também podem ser preparados em cultura de célula recombinantes como fusões proteicas. Além disso, agentes de agregação tal como alume são usados adequadamente para melhorar a resposta imune.
2. ANTICORPOS MONOCLONAIS
[407] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser preparado por métodos de DNA recombinante (patente U.S. 4,816,567).
[408] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado da maneira descrita anteriormente para elicitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente na proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e a seguir ligados com uma linhagem celular de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
[409] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas em um meio de cultura adequado, no qual o meio contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma não fundidas pai (também referidas como fusão). Por exemplo, se as células de mieloma pai precisam da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas incluirão tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes HGPRT.
[410] Células de mieloma de fusão preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam produção estável de alto nível de anticorpo pelas células que produzem o anticorpo selecionado, e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas. Linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma em murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e SP-2 e derivados, por exemplo, células X63-Ag8-653 disponíveis pela American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[411] Meio de cultura no qual células de hibridoma são crescidas é ensaiado para produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade da ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA).
[412] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal, por exemplo, pode ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[413] Uma vez que células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas são identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e crescidos por métodos padrões (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles e Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo como tumores de ascite em um animal, por exemplo, por injeção intraperitoneal das células em camundongos.
[414] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são separados adequadamente do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tal como, por exemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando proteína A ou proteína G- Sepharose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise etc.
[415] DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeia pesadas e leves de anticorpos murina). As células de hibridoma funcionam como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são a seguir transfectados em célula hospedeiras, tais como células E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outra maneira proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão na expressão recombinante em DNA de bactérias que codificam o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).
[416] Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando as técnicas descritas em McCafferti et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) misturando as cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito amplas (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicional para isolamento de anticorpos monoclonais.
[417] O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir polipeptídeos de anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, substituindo sequências de domínio constante de cadeia pesada e cadeia leve humanas (CH e CL) pelas sequências homólogas de murino (patente U.S. 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou fundindo a sequência de codificação de imunoglobulina com toda ou parte da sequência de codificação com um polipeptídeo não imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As sequências de polipeptídeos não imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou elas podem ser substituídas pelos domínios variáveis de um sítio de cominação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno diferente.
3. ANTICORPOS HUMANOS E HUMANIZADOS
[418] Os anticorpos anti-CD79b da presente invenção podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (murinos, por exemplo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação a antígenos), que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que os resíduos de uma região determinadora de complementaridade (CDR) do recebedor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tais como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da estrutura de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram nem nas sequências do anticorpo recebedor nem nas da CDR importada nem nas da estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
[419] Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Refere-se a estes resíduos de aminoácidos não humanos como resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente conduzida seguindo-se o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo-se as sequências correspondentes de um anticorpo humano por CDRs ou sequências de CDRs de roedores. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (patente U.S. No. 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente proveniente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos provenientes de sítios análogos em anticorpos de roedores.
[420] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade e resposta HAMA (anticorpo humano anti- murino) quando o anticorpo é destinado a ser usado para a terapêutica humana. A redução ou a eliminação de uma resposta HAMA constitui um aspecto significativo do desenvolvimento clínico de agentes terapêuticos adequados. Veja, por exemplo, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Conforme descrito no presente documento, a invenção propõe anticorpos que são humanizados de tal modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ser ainda obtidas usando-se métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais serão descritos com mais detalhes abaixo. De acordo com o método denominado “do melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é testada contra a biblioteca integral de sequências conhecidas de domínios variáveis humanos. A sequência do domínio V humano que estiver mais próxima à do roedor é identificada e a região de estrutura (FR) humana em seu interior aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Um outro método usa uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
[421] Uma sequência de aminoácidos, por exemplo, proveniente de um anticorpo conforme descrito no presente documento pode servir como uma sequência de partida (genitora) para diversificação da(s) sequência(s) de estrutura e/ou hipervariáveis. Refere-se a uma sequência de estrutura selecionada à qual uma sequência hipervariável de partida se liga como uma estrutura humana aceitadora. Embora as estruturas humanas aceitadoras possam ser provenientes ou derivadas de uma imunoglobulina humana (as regiões VL e/ou VH suas), é preferível que as estruturas humanas aceitadoras sejam provenientes ou derivadas de uma sequência de estrutura de consenso humana, uma vez que tais estruturas demonstraram ter uma imunogenicidade mínima ou nenhuma em pacientes humanos.
[422] Nos casos em que a aceitadora é derivada de uma imunoglobulina humana, pode-se selecionar opcionalmente uma sequência de estrutura humana que é selecionada com base na sua homologia à sequência de estrutura doadora por alinhamento da sequência de estrutura doadora com diversas sequências de estrutura humanas em uma coleção de sequências de estrutura humanas e selecionar a sequência de estrutura com uma maior homologia como o aceitador.
[423] Em uma modalidade, as estruturas de consenso humanas do presente invenção são provenientes ou derivadas de sequências de estrutura de consenso do subgrupo III de VH e/ou do subgrupo I capa de VL.
[424] Assim, a estrutura humana aceitadora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas as sequências de estrutura abaixo: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo FR3 compreende RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 147), em que X1 é A ou R, X2 é T ou N, e X3 é A ou L, FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
[425] Exemplos de estruturas de consenso de VH incluem: Estrutura de consenso do subgrupo I de VH humano subtraída de CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 108); estrutura de consenso do subgrupo I de VH humano subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 109-111); estrutura de consenso do subgrupo II de VH humano subtraída de CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 112); estrutura de consenso do subgrupo II de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 113-115); estrutura de consenso do subgrupo III de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 116); estrutura de consenso do subgrupo III de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 117-119); estrutura aceitadora de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 120); estrutura aceitadora de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 121-122); estrutura aceitadora 2 de VH humana subtraída das CDRs de Kabat (SEQ ID NO: 123); ou estrutura aceitadora 2 de VH humana subtraída das regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NO: 124-126).
[426] Em uma modalidade, a estrutura aceitadora de VH humana compreende uma, duas, três ou todas as seguintes sequências de estrutura: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144), FR3 compreendendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 148), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149), RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 150), ou RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 151) FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
[427] A estrutura humana aceitadora VL pode compreender, uma, duas, três ou todas as sequências de estruturas: FR1 compreendendo DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139), FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140), FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142). Exemplos de estruturas de consenso VL incluem: Estrutura de consenso do subgrupo I kappa humano VL (SEQ ID NO: 127); estrutura de consenso do subgrupo II kappa humano VL (SEQ ID NO: 128); estrutura de consenso do subgrupo III kappa humano VL (SEQ ID NO: 129); ou estrutura de consenso do subgrupo IV kappa humano VL (SEQ ID NO: 130)
[428] Embora a aceitadora possa ser idêntica em sequência a sequência de estrutura humana selecionada, quer seja proveniente de uma imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, a presente invenção propõe que a sequência aceitadora possa compreender substituições de aminoácidos pré-existentes relativas à sequência de imunoglobulina humana ou sequência de estrutura de consenso humana. Estas substituições pré- existentes são, de preferência, mínimas; geralmente quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácido somente relativa à sequência de imunoglobulina humana ou à sequência de estrutura de consenso.
[429] Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados às estruturas humanas aceitadoras VL e/ou VH. Pode- se incorporar, por exemplo, resíduos que correspondem aos resíduos de CDR de Kabat, aos resíduos de alça hipervariável de Chothia, aos resíduos Abm, e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, são incorporados os resíduos de região hipervariável prolongada seguintes: 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3).
[430] Embora seja discutida no presente documento a “incorporação” de resíduo de região hipervariável, deve se observar que isso pode ser produzido de diversos modos, ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desejada pode ser gerado, por exemplo, por mutação do ácido nucleico que codifica a sequência do domínio variável murino de modo que os seus resíduos de estrutura sejam alterados nos resíduos de estrutura humana aceitadora, ou por mutação do ácido nucleico que codifica a sequência de domínio variável humana de modo que o resíduos do domínio hipervariável são alterados em resíduos não humanos, ou por síntese de ácido nucleico que codifica a sequência desejada etc.
[431] Nos exemplo do presente documento, as variantes enxertadas com região hipervariável foram geradas por mutagênese de Kunkel de ácido nucleico que codifica as sequências aceitadoras humanas, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Alterações adequadas podem ser introduzidas na estrutura e/ou na região hipervariável, usando-se técnicas de rotina, para corrigir e restabelecer as interações adequadas entre a região hipervariável e o antígeno.
[432] A exibição de fagos (fagomídeo) (a que se refere também aqui como exibição de fagos em alguns contextos) pode ser usada como um método conveniente e rápido para a geração e teste de muitos anticorpos variantes potenciais diferentes em uma biblioteca gerada pela aleatorização de sequências. No entanto, outros métodos para a preparação e teste de anticorpos alterados estão disponíveis aos versados na técnica.
[433] A tecnologia de exibição de fagos (fagomídeo) proporcionou uma ferramenta poderosa para a geração e seleção de proteínas inéditas que se ligam a um ligante, tal como um antígeno. Usando-se as técnicas de exibição de fagos (fagomídeo) permite a geração de grandes bibliotecas de variantes de proteínas que podem ser rapidamente selecionadas para aquelas sequências que se ligam a uma molécula alvo com alto grau de afinidade. Os ácidos nucleicos que codificam peptídeos variantes são geralmente ligados a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de revestimento viral, tal como a proteína do gene III ou a proteína do gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de exibição de fagomídeo monovalentes em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína ou o polipeptídeo está fundida a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma porção da proteína do gene III (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). Em um sistema de exibição de fagomídeo monovalente, o gene de fusão é expresso a níveis baixos e as proteínas do gene III do tipo selvagem são também expressas de modo tal, que é conservada a ineficácia das partículas. Métodos de geração de bibliotecas de peptídeos e a seleção destas bibliotecas já foram divulgados em muitas patentes (tais como, por exemplo, patente U.S. No. 5.723.286, patente U.S. No. 5.432.018, patente U.S. No. 5.580.717, patente U.S. No. 5.427.908 e patente U.S. No. 5.498.530).
[434] Foram preparadas bibliotecas de anticorpos ou de polipeptídeos que se ligam a antígeno em uma série de modos incluindo por alteração de um único gene por inserção de sequências aleatórias de DNA ou por clonagem de uma família de genes aparentados. Os métodos para a exibição de anticorpos ou de fragmentos que se ligam a antígeno usando-se exibição de fagos (fagomídeo) foram descritos nas patentes U.S. Nos. 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717, e 5.658.727. A biblioteca é então testada para expressão de anticorpos ou de proteínas que se ligam a antígeno com as características desejadas.
[435] Métodos de substituição de um aminoácido de escolha em um ácido nucleico gabarito são bem estabelecidos na técnica, sendo alguns deles descritos no presente documento. Os resíduos de região hipervariável, por exemplo, podem ser substituídos usando-se o método de Kunkel. Veja, por exemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
[436] A sequência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntos de códons projetados para os resíduos de região hipervariável a serem alterados. Um conjunto de códons é um conjunto de sequências de tripletos de nucleotídeos diferentes usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Os conjuntos de códons podem ser representados usando-se símbolos para designar nucleotídeos específicos ou misturas equimolares de nucleotídeos conforme mostrado abaixo de acordo com o código IUB. CÓDIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A ou C ou T) B (C ou G ou T) V (A ou C ou G) D (A ou G ou T) H N (A ou C ou G ou T).
[437] No conjunto de códons DVK, por exemplo, D pode consistir nos nucleotídeos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de códons pode apresentar 18 códons diferentes e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys.
[438] Os conjuntos de oligonucleotídeos ou iniciadores podem ser sintetizados usando-se métodos padrão. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fase sólida, contendo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto de códons que codificará o grupo desejado de aminoácidos. A síntese de oligonucleotídeos com uma “degeneração” de nucleotídeos selecionada em determinadas posições é conhecida nesta técnica. Tais conjuntos de nucleotídeos que têm determinados conjuntos de códons podem ser sintetizados usando-se sintetizadores comerciais de ácidos nucleicos (disponíveis de Applied Biosystems, Foster City, CA, por exemplo) ou podem ser obtidos no comércio (de Life Technologies, Rockville, MDF, por exemplo). Portanto, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados que tem um conjunto de códons específico tipicamente incluirá uma multiplicidade de oligonucleotídeos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códons no interior da sequência como um todo. Os oligonucleotídeos, conforme usados de acordo com a presente invenção, têm sequências que permitem a hibridização a um gabarito de ácido nucleico de domínio variável e podem também incluir sítios de enzima de restrição para fins de clonagem.
[439] Em um método, as sequências de ácidos nucleicos que codificam ácidos nucleicos variantes podem ser criadas por mutagênese mediada por oligonucleotídeo. Esta técnica é conhecida na técnica conforme descrita por Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987). Resumindo, as sequências de ácidos nucleicos que codificam aminoácidos variantes são criadas hibridizando-se um conjunto de oligonucleotídeos que codifica os conjuntos de códons desejados em um gabarito de DNA, em que o gabarito consiste na forma de um único filamento do plasmídeo que contém uma sequência de gabarito de ácido nucleico de região variável. Depois da hibridização, usa-se polimerase de DNA para sintetizar um filamento segundo complementar integral do gabarito que assim incorporará o iniciador de oligonucleotídeo e conterá os conjuntos de códons conforme fornecidos pelo conjunto de oligonucleotídeos.
[440] Geralmente, os oligonucleotídeos de pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento são usados. Um oligonucleotídeo ótimo terá de 12 a 15 nucleotídeos que são totalmente complementares ao gabarito dos dois lados do(s) nucleotídeo(s) que codifica(m) a mutação(ões). Isto assegura que o oligonucleotídeo hibridizará adequadamente com a molécula de gabarito de DNA de um filamento único. Os oligonucleotídeos são facilmente sintetizados usando- se técnicas conhecidas na técnica tais como as descritas por Crea et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).
[441] O gabarito de DNA é gerado por aqueles vetores ou que são derivados dos vetores M13 de bacteriófagos (os vetores M13mp18 e M13mp19 disponíveis no mercado são adequados) ou aqueles vetores que contêm uma origem de replicação de fago de um único filamento conforme descrito por Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que deve ser submetido a mutação pode ser inserido em um destes vetores para gerar gabarito de um único filamento. A produção do gabarito de um único filamento é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et al., acima.
[442] Para se alterar a sequência de DNA nativo, o oligonucleotídeo é hibridizado com o gabarito de um único filamento em condições de hibridização adequadas. Uma enzima de polimerização de DNA, geralmente a T7 DNA polimerase ou o fragmento Klenow de DNA polimerase I, é então acrescentada para sintetizar o filamento complementar do gabarito usando o oligonucleotídeo como um iniciador para a síntese. Uma molécula heteroduplex é então formada de tal modo que um filamento de DNA codifica a forma que sofreu mutação do gene 1, e o outro filamento (o gabarito original) codifica a sequência nativa inalterada do gene 1. A molécula heteroduplex é então transformada em uma célula hospedeira adequada, geralmente um procarionte, tal como JM101 de E. coli. Depois de se ter cultivado as células elas são dispostas sobre placas de agarose e testadas usando-se o iniciador de oligonucleotídeo rádio-rotulado com um 32-Fosfato para identificar as colônias bacterianas que contêm o DNA que sofreu mutação.
[443] O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo tal, que é criada uma molécula homoduplex em que os dois filamentos do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões). AS modificações são as seguintes. O oligonucleotídeo de um único filamento é desnaturado no gabarito de um único filamento conforme descrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleotídeos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxiriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que pode ser obtida de Amersham). Esta mistura é acrescentada ao complexo gabarito oligonucleotídeo. Depois da adição da DNA polimerase a esta mistura, é gerado um filamento de DNA idêntico ao gabarito exceto pelas bases que sofreram mutação. Além disso, este novo filamento de DNA conterá dCTP-(aS) em de dCTP, que serve para protegê- lo da digestão por endonuclease de restrição. Depois do filamento do gabarito do heteroduplex de dois filamentos ter levado um pique com uma enzima de restrição adequada, o filamento do gabarito pode ser digerido com ExoIII nuclease ou com uma outra nuclease adequada além da região que contém o(s) sítio(s) a ser(em) submetidos a mutagênese. A reação é então interrompida, para deixar uma molécula que é somente parcialmente constituída por um único filamento. Um homoduplex de DNA de dois filamentos completo é então formado usando-se DNA polimerase na presença de todos os quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatos, ATP e DNA ligase. Esta molécula de homoduplex pode então ser transformada em uma célula hospedeira adequada.
[444] Conforme já indicado anteriormente, a sequência do conjunto de oligonucleotídeos tem um comprimento suficiente para se hibridizar com o ácido nucleico do gabarito e pode também, mas não necessariamente, conter sítios de restrição. O gabarito de DNA pode ser gerado por aqueles vetores que ou são derivados dos vetores M13 de bacteriófagos ou de vetores que contêm uma origem de replicação de fagos de um único filamento conforme descrito por Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Portanto, o DNA que é submetido a mutação deve ser inserido me um destes vetores para gerar gabarito de um só filamento. A produção do gabarito de um só filamento é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et al. acima.
[445] De acordo com um outro método, a ligação a antígeno pode ser restaurada durante a humanização dos anticorpos por meio da seleção das regiões hipervariáveis reparadas (Pedido No. 11/061,841, depositado em 18 de fevereiro de 2005). O método inclui a incorporação de regiões hipervariáveis não humanas sobre uma estrutura aceitadora e a introdução ainda de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma ou mais regiões hipervariáveis sem modificação da sequência de estrutura aceitadora. Alternativamente, a introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos pode ser acompanhada por modificações na sequência de estrutura aceitadora.
[446] De acordo com um outro método, pode ser gerada uma biblioteca provendo-se a montante e a jusante conjuntos de oligonucleotídeos, tendo cada conjunto uma multiplicidade de oligonucleotídeos com diferentes sequências, estabelecidas as sequências diferentes pelos conjuntos de códons providos dentro da sequência dos oligonucleotídeos. Os conjuntos de oligonucleotídeos a montante e a jusante, juntamente com uma sequência de ácidos nucleicos de gabarito do domínio variável podem ser usadas em uma reação em cadeia de polimerase para gerar uma “biblioteca” de produtos de PCR. Pode-se referir aos produtos de PCR como sendo “cassetes de ácido nucleico”, uma vez que eles podem ser ligados com outras sequências de ácidos nucleicos correlatas ou não correlatas, tal como proteínas do invólucro viral, por exemplo, e domínios de dimerização, usando técnicas de biologia molecular estabelecidas.
[447] A sequência dos iniciadores de PCR inclui uma ou mais dos conjuntos de códons projetados para serem acessíveis a solvente e posições extremamente diversas em uma região hipervariável. Conforme foi descrito acima, um conjunto de códons é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleotídeos usadas para codificar aminoácidos variantes desejados.
[448] Os seletores de anticorpos que satisfazem os critérios desejados, conforme selecionados por etapas de teste/seleção adequadas podem ser isolados e clonados usando-se técnicas recombinantes padrão.
[449] É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados conservando-se o seu alto grau de afinidade de ligação para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esta meta, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências de origem e diversos produtos humanizados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências de origem e das humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina são habitualmente disponíveis e os versados na técnica estão familiarizados com eles. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos de RF podem ser selecionados e combinados com as sequências recebedoras e importadas, de modo que é atingida a característica desejada do anticorpo, tal como uma afinidade maior para o(s) antígeno(s) alvo(s). Em geral, os resíduos de região hipervariável são diretamente e extremamente substancialmente envolvidos na influência da ligação a antígeno.
[450] Diversas formas de um anticorpo anti-CD79b humanizado são reivindicadas. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode consistir em um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgG1 intacto.
[451] Como uma alternativa à humanização podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível, por exemplo, se produzir animais transgênicos (camundongos, por exemplo) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório total de anticorpos humanos na ausência da produção endógena de imunoglobulina. Foi descrito, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação (JH) de cadeia pesada de anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinal humana para tais camundongos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos depois de serem desafiados com antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); patentes U.S. Nos. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; e WO 97/17852.
[452] Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) pode ser usada para a produção de anticorpos humanos e de fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina provenientes de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpos são clonados no quadro ou a um gene de proteína de invólucro importante ou insignificante de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpos na superfície da partícula de fago. Como a proteína filamentosa contém uma cópia de DNA de um único filamento do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que apresenta estas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula b. A exibição de fago pode ser conduzida em uma variedade de formatos, resenhados em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993), por exemplo. Diversas fontes de segmentos de genes V podem ser usadas para exibição de fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatorial aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V proveniente de doadores humanos não imunizados pode ser construído e podem ser isolados anticorpos a um arranjo diverso de antígenos incluindo auto-antígenos) essencialmente seguindo-se as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Veja, também, patentes U.S. Nos. 5.565.332 e 5.573.905.
[453] Conforme discutido acima, os anticorpos humanos podem ser gerados também por células B ativadas in vitro (veja patentes U.S. No. 5.567.610 e 5.229.275).
4. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
[454] Em determinadas circunstâncias existem vantagens de se usar fragmentos de anticorpos de preferência a anticorpos integrais. O tamanho menor dos fragmentos permite uma rápida eliminação e pode levar a um acesso melhor aos tumores sólidos.
[455] Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica dos anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em E. coli e ser secretados a partir dela, permitindo assim a produção pronta de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab’-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e ser quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, os fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab’)2 com uma meia vida in vivo aumentada compreendendo resíduos de epítopo de ligação a receptor de recuperação são descritos na patente U.S. No. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos se tornarão aparentes aos versados na técnica. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de uma única cadeia (scFv). Veja WO 93/16185; patente U.S. No. 5.571.894; e patente U.S. No. 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes; portanto, eles são adequados para ligação não específica reduzida durante uso in vivo. As proteínas de fusão sfv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora ou no terminal amino ou no terminal carbóxi de um sFv. Veja Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpo pode também ser um “anticorpo linear”, por exemplo, conforme descrito na patente U.S. No. 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
5. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS
[456] Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplificativos podem se ligar a dois epítopos diferentes de uma proteína CD79b, conforme descrita no presente documento. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação a CD79b com um sítio de ligação para uma outra proteína. Alternativamente um braço de anti-CD79b pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeantes sobre um leucócito tal como uma molécula de receptor de célula T (CD3, por exemplo) ou receptores de Fc para IgG (FCYR), tais como FCYRI (CD64), FCYRII (CD32) e FCYRIII (CD16), de modo a concentrar e localizar mecanismos de defesa celular à célula que expressa CD79b. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam CD79b. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a CD79b e um braço que se liga ao agente citotóxico (saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo, por exemplo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados em forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (anticorpos biespecíficos de F(ab’)2, por exemplo).
[457] O documento WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIII e a patente U.S. No. 5.837.234 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRI. Um anticorpo biespecífico anti- ErbB2/Fcα é apresentado no documento WO98/02463. A patente U.S. No. 5.821.337 instrui sobre um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
[458] Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Devido à associação aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpos, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é geralmente conduzida por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos análogos são descritos no documento WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
[459] De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos tendo especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são ligados a sequências de domínio constante de imunoglobulina. É preferível que a fusão se produza comum domínio constante de cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2, e CH3. É preferível se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação a cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, de cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co- transfectados em uma célula hospedeira adequada. Isto proporciona uma maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos nas modalidades quando relações desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na construção dão o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado. No entanto, é possível se inserir as sequências de codificação para duas das três cadeias polipeptídicas ou para todas as três em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em relações iguais resulta em grandes rendimentos ou quando as relações não têm nenhum efeito significativo sobre o rendimento da combinação desejada de cadeias.
[460] Em uma modalidade preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi descoberto que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeias indesejáveis de imunoglobulina, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica permite um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, veja, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
[461] De acordo com outra abordagem descrita no patente U.S. No. 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser construída para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos provenientes da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (com tirosina ou triptofano, por exemplo). São criadas “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição das cadeias laterais de aminoácidos grandes por outras menores (por alanina ou treonina, por exemplo). Isto proporciona um mecanismo para se aumentar o rendimento do heterodímero em relação aos produtos finais indesejáveis tais como homodímeros.
[462] Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. Um dos anticorpos no heteroconjugado, por exemplo, pode ser acoplado a avidina, o outro à biotina. Tais ácidos nucleicos têm sido propostos, por exemplo, para direcionas células do sistema imune para células indesejáveis (patente U.S. No. 4.676.980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser preparados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Agentes reticuladores adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na patente U.S. No. 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.
[463] Foram também descritas na literatura técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, usando-se ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença de agentes complexadores de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab’ gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab’-TNB é então reconvertido no Fab’-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab’-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
[464] O progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab’-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico totalmente humanizado F(ab’)2. Cada fragmento Fab’ foi separadamente secretado a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressavam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, assim como desencadear a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos em tumores mamários humanos.
[465] Diversas técnicas para a produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir da cultura de células recombinantes já foram descritas. Foram produzidos anticorpos biespecíficos, por exemplo, usando-se zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos zíperes de leucina provenientes de proteínas Fos e Jun foram ligados a porções Fab’ de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros dos anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros, sendo então reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem uma VH conectada a uma VL por um ligante que é demasiado curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a se parear com os domínios VL e VH complementares de um outro fragmento, formando assim, dois sítios de ligação a antígeno. Uma outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos com o uso de dímeros de Fv (sFv) de uma única cadeia foi também relatada. Veja Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
[466] Anticorpos tendo mais de duas valências são também reivindicados. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
6. ANTICORPOS HETEROCONJUGADOS
[467] Anticorpos heteroconjugados também incidem no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados por covalência. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejáveis [patente U.S. No. 4.676.980], e para o tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Reivindica-se que os anticorpos possam ser preparados in vitro usando-se métodos conhecidos na química de síntese de proteínas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticuladores. Podem ser construídas imunotoxinas, por exemplo, usando-se uma reação de permuta de dissulfetos ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os que são divulgados, por exemplo, na patente U.S. No. 4.676.980.
7. ANTICORPOS MULTIVALENTES
[468] Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) com uma maior rapidez do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são distintos dos da classe de IgM) contendo três ou mais sítios de ligação a antígeno (anticorpos tetravalente, por exemplo), que podem ser facilmente produzidos pela expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação a antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região dobradiça. Neste contexto, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação a antígeno no terminal amino à região Fc. O anticorpo multivalente preferido na presente invenção compreende (ou consiste em) três a aproximadamente oito, mas, de preferência, quatro, sítios de ligação a antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e, de preferência, duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s), por exemplo, pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n- Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s), por exemplo, pode compreender: VH-CH1-ligante flexível- VH-CH1-cadeia de região de Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia de região de Fc. O anticorpo multivalente da presente invenção compreende, de preferência, ainda pelo menos dois (e, de preferência, quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender de aproximadamente dois a aproximadamente oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve propostos pela presente invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda um domínio CL.
8. CONSTRUÇÃO DA FUNÇÃO EFETORA
[469] Pode ser desejável se modificar o anticorpo da presente invenção no tocante à função efetora, por exemplo, de modo a aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser atingido introduzindo-se um ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente, ou adicionalmente, pode(m) ser introduzido(s) resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação nesta região de ligação dissulfeto entre cadeias. O anticorpo homodimérico deste modo gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou capacidade aumentada de destruição de células mediada por complemento e uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentada. Veja Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com uma atividade aumentada antitumoral podem também ser preparados usando-se reticuladores heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e possa assim ter capacidades melhoradas de lise de complemento e de ADCC. Veja Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para se aumentar a meia vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor de recuperação ao anticorpo (especialmente a um fragmento de anticorpo), conforme descrito na patente U.S. No. 5.739.277, por exemplo. Conforme empregado no presente documento, o termo “epítopo de ligação a receptor de recuperação” se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, por exemplo) que é responsável pelo aumento da meia vida sérica in vivo da molécula de IgG.
9. IMUNOCONJUGADOS
[470] A presente invenção também se refere a imunoconjugados (a que se refere indiferentemente como “conjugados anticorpo-medicamento”, ou “ADCs”) compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, um agente inibidor de crescimento, uma toxina (uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um rádio- conjugado).
[471] Em determinadas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterápico ou outra toxina. Os agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de rádio núclídeos é disponível para a produção de anticorpos rádio-conjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais dos imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como o aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazônio- benzoil)-etileno diamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitro benzeno). Uma imunotoxina de ricina, por exemplo, pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). O ácido 1-isotioccanatobenzil??-3- metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) rotulado com carbono 14 é um agente quelante exemplar para a conjugação de rádio-nucleotídeo ao anticorpo. Veja WO94/11026.
[472] Os conjugados de um anticorpo e de um ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, peptídeos de auristatina, tais como monometilauristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina), maitansinóides, tais como DM1, um tricoteno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, são também ligados a gabaritos de acordo com a presente invenção.
IMUNOCONJUGADOS EXEMPLIFICATIVOS - CONJUGADOS ANTICORPO -FÁRMACO
[473] Um imunoconjugado (ou “conjugado anticorpo-fármaco” (“ADC”)) da presente invenção pode ser da Fórmula I, abaixo, em que o anticorpo é conjugado (isto é, ligado por covalência) a uma ou mais frações fármaco (D) por meio de um ligante opcional (l). Os ADCs podem incluir conjugados tioMAb de fármacos (“TDC”). Ab-(L-D)p I.
[474] Consequentemente, o anticorpo pode ser conjugado ao medicamento ou diretamente ou por meio de um ligante. Na Fórmula I, p é o número médio de frações medicamentosas por anticorpo, que pode variar, por exemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 frações medicamentosas por anticorpo, e em determinadas modalidades, de 1 a aproximadamente 8 frações fármaco por anticorpo. A invenção inclui uma composição que compreende uma mistura de compostos anticorpo-fármaco da Fórmula I em que a carga média de fármaco por anticorpo é de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 ou de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. A. LIGANTES EXEMPLIFICATIVOS
[475] Um ligante pode compreender um ou mais componentes de ligante. Componentes de ligante exemplificativos incluem 6-maleimido caproíla (“MC”), maleimido propanoíla (“MP”), valina-citrulina (“val-cit” ou “vc”), alanina-fenilalanina (“ala-phe”), p-amino benzilóxi carbonila (um “PAB”), e aqueles que resultam da conjugação com reagentes de ligante: N- succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato (“SPP”), N-succinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (“SMCC”, a que se refere também como “MCC”), N-succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato (“SIAB”). Diversos componentes de ligantes são conhecidos na técnica, sendo alguns deles descritos abaixo.
[476] Um ligante pode ser um “ligante clivável”, facilitando a liberação de um fármaco na célula. Pode ser usado, por exemplo, um ligante instável em ácido (hidrazona, por exemplo), ligante sensível a protease (sensível a peptidase, por exemplo), ligante instável à luz, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente U.S. No. 5.208.020).
[477] Em determinadas modalidades, um ligante é conforme mostrado na Fórmula II abaixo:
Figure img0032
em que A é uma unidade prolongadora e a é um número inteiro de 0 a 1; W é uma unidade aminoácido, e w é um número inteiro de 0 a 12; Y é uma unidade espaçadora e y é 0, 1 ou 2; e Ab, D e p são definidos como acima para a Fórmula I. Modalidades exemplificativas de tais ligantes são descritas no documento US 2005-0238649 A1, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência.
[478] Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma “unidade prolongadora” que liga um anticorpo a um outro componente de ligante ou a uma fração fármaco. Unidades prolongadoras exemplificativos são apresentadas abaixo (em que a linha ondulada indica os sítios de ligação por covalência a um anticorpo):
Figure img0033
Figure img0034
[479] Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma unidade aminoácido. Em uma tal modalidade, a unidade aminoácido permite a clivagem do ligante por uma protease, facilitando assim a liberação do fármaco do imunoconjugado por exposição a proteases intracelulares, tais como enzimas lisossômicas. Veja, por exemplo, Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784. Unidades aminoácidos exemplificativos incluem, sem limitação, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo e um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplificativos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); ou N-metil-valina- citrulina (Me-val-cit). Os tripeptídeos exemplificativos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Uma unidade aminoácido pode compreender resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente, assim como aminoácidos de menor importância e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente tais como citrulina. As unidades aminoácidos podem ser projetadas e otimizadas em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima específica, tal como uma protease associada a tumor, por exemplo, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.
[480] Em algumas modalidades, um componente de ligante pode compreender uma unidade “espaçadora” que liga o anticorpo a uma fração fármaco, quer diretamente ou por meio de uma unidade prolongadora e/ou uma unidade aminoácido. Uma unidade espaçadora pode ser “auto-imoladora” ou uma “não auto- imoladora”. Uma unidade espaçadora não “auto-imoladora” é uma em que parte ou a totalidade da unidade espaçadora continua ligada à fração fármaco depois da clivagem enzimática (proteolítica, por exemplo) de ADC. Exemplos de unidades espaçadoras não auto-imoladoras incluem, sem limitação, uma unidade espaçadora de glicina e uma unidade espaçadora de glicina-glicina. Outras combinações de espaçadores peptídicos passíveis de clivagem enzimática específica a sequência são também reivindicadas. A clivagem enzimática de um ADC contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina, por exemplo, por uma protease associada a uma célula tumoral resultaria na liberação da fração glicina-glicina-fármaco do restante de ADC. Em uma tal modalidade, a porção glicina-glicina-fármaco é então submetida a uma etapa separada de hidrólise na célula tumoral, clivando assim a unidade espaçadora glicina-glicina da fração fármaco.
[481] Uma unidade espaçadora “auto-imoladora” permite a liberação da fração fármaco sem uma etapa separada de hidrólise. Em determinadas modalidades, uma unidade espaçadora de um ligante compreende uma unidade p-amino benzila. Em uma tal modalidade, um álcool p-amino benzílico está ligado a uma unidade amino por meio de uma ligação amida, e um carbamato, metilcarbamato ou carbonato é produzido entre o álcool benzílico e um agente citotóxico. Veja, por exemplo, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. Em uma modalidade, a unidade espaçadora é p-amino benzilóxi carbonila (PAB). Em determinadas modalidades, a porção fenileno de uma unidade p-amino benzila é substituída com Qm, em que Q é -alquila C1-C8, -O-(alquila C1C8), -halogênio,- nitro ou -ciano; e m é um número inteiro variando de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras auto-imoladoras incluem ainda, mas sem limitação, compostos aromáticos que são eletronicamente análogos ao álcool p-aminobenzílico (veja, por exemplo, o documento US 2005/0256030 A1), tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e acetais orto- ou para-aminobenzílicos. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização depois da hidrólise da ligação amida, tais como as amidas do ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas de anéis biciclo [2.2.1] e sistemas de anéis biciclo [2.2.2] adequadamente substituídos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815); e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). A eliminação de fármacos contendo aminas e que são substituídos na posição a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também exemplos de unidades espaçadoras auto- imoladoras úteis em ADCs.
[482] Em uma modalidade, uma unidade espaçadora é uma unidade de bis(hidroximetil) estireno ramificado (BHMS), conforme ilustrado abaixo e que pode ser usado para incorporar e liberar uma multiplicidade de fármacos.
Figure img0035
em que Q é -alquila C1-C8, -O-(alquila C1-C8), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a aproximadamente 20.
[483] Em uma outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma fração fármaco por meio de uma ramificação, fração ligante multifuncional a um anticorpo (Sun et al., (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al., (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Os ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar de fármaco para anticorpo, isto é, a carga, que é relacionada à potência de ADC. Assim, no caso em que um anticorpo cisteína submetido à engenharia contém somente um grupo cisteína tiol reativo, pode ser ligada uma multiplicidade de frações fármaco por meio de um ligante dendrítico.
[484] Os componentes de ligantes exemplificativos e suas combinações são apresentados abaixo dentro do contexto de ADCs da Fórmula II:
Figure img0036
[485] Os componentes de ligantes, incluindo unidades prolongadoras, espaçadoras e aminoácidos, podem ser sintetizados por métodos conhecido na técnica, tais como os descritos no documento US 20050238649 A1.
B. FRAÇÕES FÁRMACO EXEMPLIFICATIVOS (1) MAITANSINA E MAITANSINÓIDES
[486] Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas maitansinóides. Os maitansinóides são inibidores mitóticos que atuam por inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez do arbusto da África oriental Maytenus serrata (patente U.S. No. 3.896.111). Subsequentemente, foi descoberto que determinados micróbios também produziam maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres de C3 maitansinol (patente U.S. No. 4.151.042). O maitansinol sintético e seus derivados e análogos são divulgados, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.
[487] As frações de fármacos maitansinóides são frações fármaco atraentes em conjugados de anticorpo-fármaco, pois elas são: (i) relativamente accessíveis para a preparação por fermentação ou por modificação química ou por derivação de produtos de fermentação, (ii) passível de derivação com grupos funcionais adequados para conjugação por meio de ligantes dissulfeto e não dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis no plasma e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.
[488] Os compostos de maitansina adequados para uso como frações fármaco maitansinóides são conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos usando- se técnicas de engenharia genética e de fermentação (US. 6790952; US. 2005/0170475; Yu et al., (2002) PNAS 99:7968-7973). Maitansinol e análogos de maitansinol podem também ser preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
[489] As frações fármaco maitansinóides exemplificativos incluem aquelas que têm um anel aromático modificado, tais como: C-19-descloro (patente U.S. No. 4.256.746) (preparado por redução de ansamitocina P2 com hidreto de alumínio lítio); C-20-hidróxi (ou C-20-desmetila) +/-C-19-descloro (patentes US. Nos. 4.361.650 e 4.307.016) (preparados por desmetilação usando-se Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando-se LAH); e C- 20-desmetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-descloro (patente U.S. No. 4.294.757) (preparado por acilação usando-se cloretos de acila) e aqueles que têm modificações em outras posições.
[490] As frações fármaco maitansinóides exemplificativos também incluem aquelas que têm modificações tais como: C-9-SH (patente U.S. No. 4.424.219) (preparada pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5); C-14- alcoximetila (desmetóxi/CH2 OR)(patente US. No. 4.331.598); C-14-hidróxi metila ou acilóxi metila (CH2OH ou CH2OAc) (patente US 4.450.254) (preparada a partir de Nocardia); C-15-hidróxi/acilóxi (patente US 4.364.866) (preparada pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metóxi (patentes US 4.313.946 e 4.315.929) (isolada de Trewia nudiflora); C-18-N-desmetila (patentes US 4.362.663 e 4.322.348) (preparada pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desóxi (patente US 4371533) (preparada por redução do maitansinol por tetracloreto de titânio/LAH).
[491] Muitas posições nos compostos de maitansina são conhecidas como sendo úteis como posição de ligação, dependendo do tipo de ligação. Para a formação de uma ligação éster, por exemplo, a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C15 modificada com um grupo hidroxila e a posição C-20 tendo um grupo hidroxila são todas adequadas (patente U.S. No. 5.208.020; US RE39151; patente U.S. No. 6.913.748; patente US 7.368.565; US 2006/0167245; US 2007/0037972).
[492] As frações fármaco maitansinóides incluem aquelas que têm a estrutura:
Figure img0037
em que a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo de enxofre da fração fármaco maitansinóide a um ligante de um ADC. R pode ser independentemente H ou um alquila C1-C6. A cadeia que liga o grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanila, etanila, ou propila, isto é, m é 1, 2, ou 3 (patente US 6.334.10; patente US patente US 5.208.020; patente US 7.276.497; Chari et al., (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
[493] Todos os estereoisômeros da fração fármaco maitansinóide são reivindicadas para os compostos da presente invenção, isto é, qualquer combinação de configurações R e S nos carbonos quirais de D. Em uma modalidade, a fração fármaco maitansinóide terá a seguinte estrutura estereoquímica:
Figure img0038
[494] Modalidades exemplificativas de frações fármaco de maitansinóides incluem: DM1; DM3; e DM4, que têm as estruturas:
Figure img0039
em que a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo de enxofre do fármaco a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco. (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).
[495] Outros conjugados anticorpo-fármaco maitansinóides exemplificativos têm as seguintes estrutura e abreviaturas, (em que Ab é anticorpo e p varia de 1 a aproximadamente 8):
Figure img0040
[496] Conjugados anticorpo-fármaco o ■
Figure img0041
DM1 está ligado através de um ligante BMPEO a um grupo tiol do anticorpo têm a estrutura e abreviatura: em que Ab é anticorpo; n é 0, 1, ou 2; e p é 1, 2, 3, ou 4.
[497] Imunoconjugados que contêm maitansinóides, métodos da sua preparação e seu uso terapêutico são divulgados, por exemplo, em Erickson, et al., (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; nas patentes US 5.208.020, 5.416.064, US 2005/0276812 A1, e na patente europeia EP 0 425 235 B1, cujo conteúdo é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência.
[498] Conjugados de anticorpo-maitansinóide são preparados por ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem diminuir significativamente a atividade biológica ou do anticorpo ou da molécula de maitansinóide. Veja, por exemplo, a patente U.S. No. 5.208.020 (cujo conteúdo é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência). Os maitansinóides podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na patente U.S. No. 5.208.020 e nas outras patentes e publicações não de patentes a que se refere acima, tais como maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
[499] Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica de preparação de conjugados de anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, os descritos na patente U.S. No. 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1; em Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); e em US 2005/016993 A1, sendo o conteúdo de todos estes documentos expressamente incorporados ao presente documento a título de referência. Os conjugados anticorpo-maitansinóide que compreendem o componente de ligante SMCC podem ser preparados conforme divulgado em US 2005/0276812 A1, “Antibody-drug conjugates and Methods.” Os ligantes compreendem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos instáveis a ácido, grupos instáveis a luz, grupos instáveis a peptidase, ou grupos instáveis a esterase, conforme divulgado nas patentes identificadas acima. Ligantes adicionais são descritos e exemplificados no presente documento.
[500] Conjugados de anticorpo com maitansinóide podem ser preparados usando-se uma variedades de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato succinimidil-4-(N-maleimidometil) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- diazônio-benzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno). Em determinadas modalidades, o agente de acoplamento é propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) ou pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para produzir uma ligação dissulfeto.
[501] O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo de ligação. Uma ligação éster, por exemplo, pode ser formada por reação com um grupo hidroxila usando-se técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendo um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 tendo um grupo hidroxila. Em uma modalidade, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou d um análogo de maitansinol.
(2) AURISTATINAS E DOLASTATINAS
[502] Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a dolastatina ou a um análogo ou derivado peptídico de dolastatina, uma auristatina, por exemplo (patentes U.S. Nos. 5.635.483; 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraram que interferem na dinâmica de microtúbulos, na hidrólise de GTP na divisão nuclear e celular, (Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm uma atividade anticancerígena (Patente U.S. No. 5663149) e antifúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração fármaco dolostatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxila) da fração fármaco peptídica (WO 02/088172).
[503] Modalidades exemplificativas de auristatina incluem as frações fármaco monometil auristatina ligadas ao terminal N DE e DF (US 2005/0238649, divulgadas em Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentada em 28 de março de 2004, cujo conteúdo é expressamente incorporado integralmente ao presente documento a título de referência).
[504] Uma fração fármaco peptídica pode ser selecionada das Fórmulas DE e DF abaixo:
Figure img0042
Figure img0043
em que a linha ondulada de DE e de DF indica o sítio de ligação por covalência a um anticorpo ou a um anticorpo-componente de ligante, e independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquila C1-C8; R3 é selecionado de H, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, (alquil C1-C8)-arila, (alquil C1-C8)-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e alquil C1-C8 - (heterociclo C3-C8); R4 é selecionado de H, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, (alquil C1-C8)-arila, (alquil C1-C8)-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e (alquil C1-C8)- (heterociclo C3-C8); R5 é selecionado de H e metila.
[505] Ou então R4 e R5 formam, em conjunto, um anel carbocíclico e têm a fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquila C1-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquila C1-C8; R7 é selecionado de H, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, alquil (C1-C8)-arila, alquil C1-C8 -(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e alquil (C1-C8)- (heterociclo C3-C8); Cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8 e O-(alquila C1-C8); R9 é selecionado de H e alquila C1-C8; R10 é selecionado de arila ou heterociclo C3-C8; Z é O, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquila C1-C8 R11 é selecionado de H, alquila C1-C20, arila, heterociclo C3-C8, - (R13O)m-R14, ou -(R13O)m-CH(R15)2; m é um número inteiro que varia de 1-1000; R13 é C2-C8 alquila; R14éH ou C1-C8 alquila.
[506] A cada ocorrência, R15 é independentemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, ou -(CH2)n-SO3-(alquila C1-C8).
[507] A cada ocorrência, R16 é independentemente H, alquila C1C8, ou -(CH2)n-COOH; R18 é selecionado de -C(R8)2-C(R8)2-arila, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), e -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); e n é um número inteiro que varia de 0 a 6.
[508] Em uma modalidade, R3, R4 e R7 são independentemente isopropila ou sec-butila e R5 é -H ou metila. Em uma modalidade exemplar, cada um de R3 e R4 é isopropila, R5 é -H, e R7 é sec-butila.
[509] Em uma outra modalidade ainda, cada um de R2 e R6 é metila, e R9 é -H.
[510] Em uma outra modalidade ainda, a cada ocorrência, R8 é - OCH3.
[511] Em uma modalidade exemplar, cada um de R3 e R4 é isopropila, cada um de R2 e R6 é metila, R5 é -H, R7 é sec-butila, a cada ocorrência, R8 é -OCH3, e R9 é -H.
[512] Em uma modalidade, Z é -O- ou -NH-.
[513] Em uma modalidade, R10 é arila.
[514] Em uma modalidade exemplar, R10 é -fenila.
[515] Em uma modalidade exemplar, quando Z é -O-, R11 é -H, metila ou t-butila.
[516] Em uma modalidade, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é -(CH2)n-N(R16)2, e R16 é alquila -C1-C8 ou -(CH2)n-COOH.
[517] Em uma outra modalidade, quando Z é -NH, R11 é - CH(R15)2, em que R15 é -(CH2)n-SO3H.
[518] Uma modalidade exemplar de auristatina da fórmula DE é MMAE, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado de anticorpo-fármaco:
Figure img0044
[519] Uma modalidade exemplar de auristatina da fórmula DF é MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (veja US 2005/0238649 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124):
Figure img0045
[520] Outras modalidades exemplificativas incluem compostos de monometil valina tendo modificações carbóxi de fenilalanina no terminal C da porção fármaco pentapeptídica auristatina (WO 2007/008848) e compostos de monometil valina tendo modificações de cadeia lateral de fenilalanina no terminal C da fração fármaco pentapeptídica auristatina. (WO 2007/008603).
[521] Outras frações fármaco incluem os seguintes derivados de MMAF, em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
Figure img0046
Figure img0047
Figure img0048
[522] Em um aspecto, grupos hidrófilos, incluindo, mas sem limitação, ésteres de trietileno glicol (TEG), conforme mostrado acima, podem ser ligados à fração fármaco em R11. Sem e querer ser cerceado por qualquer teoria específica, supõe-se que os grupos hidrófilos auxiliam na internalização e na não aglomeração da fração fármaco.
[523] Modalidades exemplificativas de ADCs da Fórmula I compreendendo uma auristatina/dolostatina ou derivado seu, são descritos em US 2005-0238649 e em Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência. Modalidades exemplificativas de ADCs da Fórmula i compreendem MMAE ou MMAF e diversos componentes de ligante têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que “Ab” é um anticorpo; p é de 1 a aproximadamente 8, “Val- Cit” ou “vc” é um dipeptídeo valina-citrulina; e “S” é um átomo de enxofre). Deve- se observar que em determinadas descrições estruturais de ADC ligado a enxofre no presente documento, o anticorpo é representado como “Ab-S” simplesmente para indicar a característica de ligação a enxofre e não para indicar que um átomo de enxofre específico porta uma multiplicidade de frações ligante-fármaco. O parênteses à esquerda das estruturas abaixo pode também ser colocado à esquerda do átomo de enxofre, entre Ab e S, o que seria uma descrição equivalente do ADC da presente invenção descrito em todo o documento.
Figure img0049
Figure img0050
[524] Modalidades exemplificativas de ADCs da Fórmula I compreendendo MMAF e diversos componentes de ligante incluem ainda Ab- MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. O que é interessante é que foi mostrado que os imunoconjugados que compreendem MMAF ligado a um anticorpo por um ligante que não é proteoliticamente clivável possuem uma atividade comparável aos imunoconjugados que compreendem MMAF ligado a um anticorpo por um ligante proteoliticamente clivável. Veja, Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Em tais casos, acredita-se que a liberação do fármaco é efetuada pela degradação do anticorpo na célula. Id.
[525] Tipicamente, as frações fármaco baseadas em peptídeo podem ser preparadas pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (veja E. Schroder e K. Lubke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. As frações fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos: US 2005-0238649 A1; patente U.S. No. 5.635.483; patente U.S. No. 5.780.588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
[526] Mais especificamente, as frações fármaco auristatina/dolastatina da fórmula DF, tais como MMAF e seus derivados, podem ser preparadas, usando-se métodos descritos na patente U.S. No. 2005-0238649 A1 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. As frações fármaco auristatina/dolostatina da fórmula DE, tais como MMAE e seus derivados, podem ser preparadas usando-se métodos descritos em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. As frações fármaco-ligante MC-MMAF, MC- MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, e MC-vc-PAB-MMAE podem ser convenientemente sintetizadas por métodos de rotina, tais como os descritos, por exemplo, em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, e publicação de pedido de patente No. US 2005/0238649 A1, sendo então conjugadas a um anticorpo de interesse.
(3) CALIQUEAMICINA
[527] Em outras modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras de DNA de dois filamentos a concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, veja as patentes U.S. Nos. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas concedidas à American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, sem limitação, y1I, α2I, α3I, N- acetil—YlI, PSAG e θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998), e as patentes U.S. citadas acima concedidas a American Cyanamid). Um outro fármaco antitumoral ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifoliato. Tanto a caliqueamicina como QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpo aumenta muito os seus efeitos citotóxicos.
c. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS
[528] Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados a um anticorpo incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracila, a família de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288, descritos nas patentes U.S. Nos. 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamicinas (patente U.S. No. 5.877.296).
[529] Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem a cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.
[530] A presente invenção reivindica ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto que tenha atividade nucleolítica (tal como, por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; DNase).
[531] Em determinadas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um átomo extremamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos rádio-conjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o imunoconjugado é usado para a detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, tais como, por exemplo, tc99m ou I123, ou um rótulo de spin para o imageamento por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como imageamento por ressonância magnética, IRM), tais como iodo-123, iodo- 131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[532] Os rádio-rótulos ou outros rótulos podem ser incorporados ao imunoconjugado de modos conhecidos. O peptídeo, por exemplo, pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando-se precursores adequados de aminoácidos envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez do hidrogênio. Rótulos tais como tc99m ou I123, Re186, Re188 e 111 podem ser ligados por meio de um resíduo de cisteína no peptídeo. O ítrio- 90 pode ser ligado por meio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
[533] Em determinadas modalidades, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo conjugado a uma enzima ativadora de profármaco que converte um profármaco (um agente quimioterápico de peptidila, por exemplo, veja WO 81/01145) em um fármaco ativo, tal como um fármaco anticancerígeno. Tais imunoconjugados são úteis na terapia por profármaco mediado por enzima dependente de anticorpo (“ADEPT”). As enzimas que podem ser conjugadas a um anticorpo incluem, mas sem limitação, fosfatases alcalinas, que são úteis para a conversão de profármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatases que são úteis para a conversão de profármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase, que é útil para a conversão de 5-flúor-citosina não tóxica no fármaco anticancerígeno 5- fluoruracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L) que são úteis para a conversão de profármacos contendo peptídeos nos fármacos livres; D- alanilcarbóxi peptidases, que são úteis para a conversão de profármacos que contêm substituintes de D-aminoácido; enzimas clivadoras de carboidrato tais como β-galactosidase e neuraminidase, que são úteis para a conversão de profármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, que é útil para a conversão de fármacos derivados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase e penicilina G amidase, que são úteis para a conversão de fármacos derivados nos seus nitrogênios de amina com grupos fenóxi-acetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. As enzimas podem ser covalentemente ligadas a anticorpos por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
D. CARGA DE FÁRMACO
[534] A carga de fármaco é representada por p, o número médio de frações de fármaco por anticorpo em uma molécula da Fórmula I. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 frações de fármaco (D) por anticorpo. Os ADCs da Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma série de frações fármaco, de 1 a 20. O número médio de frações fármaco por anticorpo nas preparações de ADC a partir de reações de conjugação pode ser caracterizada por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de ADC homogêneo em que p consiste em um valor determinado podem ser obtidas a partir de ADC com outras cargas de fármaco por meios tais como HPLC de fase reversa ou por eletroforese. As formulações farmacêuticas dos conjugados anticorpo-fármaco da Fórmula I podem assim constituir uma mistura heterogênea de tais conjugados com anticorpos ligados a 1, 2, 3, 4, ou mais frações fármaco.
[535] Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Nos casos em que a ligação é um cisteína tiol, por exemplo, como nas modalidades exemplificativas acima, um anticorpo pode ter somente um ou diversos grupos tiol de cisteína ou pode ter somente um ou diversos grupos tiol suficientemente reativos através dos quais o ligante pode ser ligado. Em determinadas modalidades, uma carga de fármaco maior, da ordem de p>5, por exemplo, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade de determinados conjugados anticorpo-fármaco. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC da presente invenção varia de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; ou de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Na verdade, foi demonstrado que para determinados ADCs, a relação ótima de frações fármaco para anticorpo pode ser inferior a 8 e pode ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Veja US 2005-0238649 A1.
[536] Em determinadas modalidades, um número menor do que o máximo teórico de frações fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário fármaco-ligante ou com o reagente de ligante, conforme será discutido abaixo. Geralmente anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que possam ser ligados a uma fração fármaco; na verdade a maioria de resíduos tiol de cisteína em anticorpos existem em forma de pontes dissulfeto. Em determinadas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como o ditiotreitol (DTT) ou tricarbonil etilfosfina (TCEP), em condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol reativos de cisteína. Em determinadas modalidades, um anticorpo é submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteína.
[537] A carga (relação fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes modos, por, por exemplo: (i) limitação do excesso molar do intermediário fármaco-ligante ou reagente de ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (iii) condições parciais ou limitantes redutoras para a modificação de tiol de cisteína.
[538] Deve ficar subentendido que nos casos em que um grupo nucleofílico reage com um intermediário fármaco-ligante ou com um regente de ligante seguido por reagente de fração fármaco, então o produto resultante consiste em uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais frações fármaco ligadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um ensaio de anticorpo ELISA duplo, que é específico para o anticorpo e específico para o fármaco. Moléculas individuais de ADC podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por cromatografia de interação hidrófoba, por exemplo, (veja, por exemplo, McDonagh et al., (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004). Em determinadas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado a partir da mistura de conjugação por eletroforese ou por cromatografia. E. DETERMINADOS MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOS
[539] Um ADC da Fórmula I pode ser preparado por diversas vias empregando reações, condições e reagentes da química orgânica conhecidos dos versados na técnica, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente de ligante bivalente para formar Ab-L por meio de uma ligação covalente, fazendo-se em seguida reagir com uma fração fármaco D; e (2) a reação de um grupo nucleofílico de uma fração fármaco com um reagente bivalente de ligante, para formar D-L, por meio de uma ligação covalente, fazendo-se, em seguida, reagir com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos exemplificativos para a preparação de um ADC da Fórmula I por meio desta última via são descritos em US 2005-0238649 A1, que é expressamente incorporado ao presente documento a título de referência.
[540] Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas sem limitação: (i) grupos amina de terminal N, (ii) grupos amina de cadeia lateral, lisina, por exemplo, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, de cisteína, por exemplo, e (iv) grupos hidroxila ou amino de glicídios, nos casos em que o anticorpo é glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre frações ligantes e reagentes de ligantes, incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos, e haletos de ácidos; (ii) haletos de alquila e de benzila tais como halo-acetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxila, e maleimida. Determinados anticorpos têm dissulfetos reduzíveis entre cadeias, isto é, pontes de cisteína. Pode-se tornar os anticorpos reativos para conjugação com reagentes de ligante por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) ou com tricarbonil etilfosfina (TCEP), de modo tal que o anticorpo seja total ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína formará assim, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por modificação de resíduos de lisina, fazendo-se os resíduos de lisina reagir, por exemplo, com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina em um tiol. Os grupos tiol reativos podem ser introduzidos em um anticorpo por introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por preparação de anticorpos variantes, por exemplo, que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteína não nativa).
[541] Os conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção podem também ser produzidos por reação entre um grupo eletrofílico sobre um anticorpo, tal como um grupo carbonila de aldeído ou de cetona, com um grupo nucleofílico em um reagente de ligante ou fármaco. Grupos nucleofílicos úteis em um reagente de ligante incluem, sem limitação, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tio-semicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida. Em uma modalidade, um anticorpo é modificado para introduzir frações eletrofílicas que são capazes de reagir com substituintes nucleofílicos no reagente de ligante ou fármaco. Em uma outra modalidade, os glicosídeos de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, com reagentes oxidantes de periodato, por exemplo, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina dos reagentes de ligante ou com frações fármaco. Os grupos de base de Shiff de imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos por reagentes de boridreto, por exemplo, para formar ligações amina estáveis. Em uma modalidade, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado ou com galactose oxidase ou com metaperiodato de sódio podem resultar em grupos carbonila (aldeído e cetona) no anticorpo que podem reagir com grupos adequados no fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em uma outra modalidade, anticorpos contendo resíduos serina ou treonina no terminal N podem reagir com metaperiodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente U.S. No. 5.362.852). Pode-se fazer um tal aldeído reagir com uma fração fármaco ou com um nucleófilo de ligante.
[542] Grupos nucleofílicos sobre uma fração fármaco incluem, mas sem limitação: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tio- semicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas frações ligante e reagentes de ligante que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos, e haletos de ácidos; (ii) haletos de alquila e de benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, grupos carboxila e maleimida.
[543] Os compostos da presente invenção expressamente reivindicam, mas sem limitação, ADC preparado com os seguintes reagentes reticuladores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo- MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (benzoato de succinimidil- (4-vinilsulfona)) que são disponíveis no comércio (de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A, por exemplo; veja páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.)
[544] Imunoconjugados que compreendem um anticorpo e um agente citotóxico podem também ser preparados, usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como propionato de N- succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimido-metila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como aldeído glutárico), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (tais como bis-(p-diazônio-benzoil)-etileno diamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Uma imunotoxina de rícino, por exemplo, pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentacético (MX-DTPA) rotulado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para a conjugação de rádio-nucleotídeo ao anticorpo. Veja WO94/11026.
[545] Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico pode ser produzida, por exemplo, por técnicas recombinantes ou por síntese de peptídeo. Uma molécula de DNA recombinante pode compreender regiões que codificam as porções anticorpo e citotóxica do conjugado adjacentes entre si ou separados por uma região que codifica um peptídeo ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
[546] Em uma outra modalidade, um anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento a tumor em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, removendo-se em seguida o conjugado que não se ligou da circulação usando- se um agente de eliminação e administrando-se, em seguida, um “ligante” (avidina, por exemplo) que é conjugado a um agente citotóxico (um rádio- nucleotídeo, por exemplo).
IMUNOCONJUGADOS EXEMPLIFICATIVOS-CONJUGADOS TIO-ANTICORPO-FÁRMACO A. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CD79B CISTEÍNA-SUBMETIDO À ENGENHARIA
[547] O DNA que codifica uma variante de sequência de aminoácido de anticorpos anti-CD79b cisteína submetidos à engenharia e anticorpos originais anti-CD79b da presente invenção é preparado por uma variedade de modos que incluem, mas sem limitação, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos que ocorrem naturalmente), preparação por mutagênese direcionada a sítio (ou mediada por oligonucleotídeo) (Carter (1985) et al.,Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al.,(1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et al.,(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260), PCR mutagênese (Higuchi, (1990) em PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al., (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; e Vallette et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), e mutagênese de cassete (Wells et al., (1985) Gene 34:315-323) de um DNA preparado anteriormente que codificas o polipeptídeo. Os protocolos kits e reagentes de mutagênese, são disponíveis no comércio, tais como, por exemplo, o kit QuikChange® Multi Site- Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutações singulares são também geradas por mutagênese direcionada a oligonucleotídeo usando-se DNA de plasmídeo de dois filamentos como gabarito por mutagênese a base de PCR (Sambrook e Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. edição; Zoller et al., (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. e Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Variantes de anticorpos recombinantes podem ser construídos também por manipulação do fragmento de restrição ou por PCR de prolongamento por sobreposição com oligonucleotídeos sintéticos. Iniciadores mutagênicos codificam as substituição (ões) de códons de cisteína. Podem ser empregadas técnicas padrão de mutagênese para gerar DNA que codifica tais anticorpos mutantes cisteína submetidos à engenharia (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova York, N.Y., 1993).
[548] A tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti- CD79b e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina provenientes de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, são clonados genes de domínio V de anticorpo no quadro ou em um gene de proteína importante ou não importante do revestimento de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos funcionais de anticorpos na superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de um único filamento do genoma do fago, também resultam seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo na seleção do gene que codifica o anticorpo que apresenta essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B (Johnson et al., (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al.,(1991) Nature, 352:624-628; Marks et al.,(1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et al., (1993) EMBO J. 12:725-734; patente U.S. No. 5.565.332; patente U.S. No. 5.573.905; patente U.S. No. 5.567.610; patente U.S. No. 5.229.275).
[549] Os anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizados usando-se metodologia de síntese de oligopeptídeos conhecida ou podem ser preparados e purificados usando-se a tecnologia recombinante. A sequência de aminoácidos adequada ou porção dela, podem ser produzidas por síntese direta de peptídeos usando-se técnicas em fase sólida (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). Pode ser conduzida a síntese da proteína in vitro usando-se técnicas manuais ou por automatização. A síntese em fase sólida automatizada pode ser efetuada, por exemplo, empregando-se aminoácidos protegidos por t-BOC ou por Fmoc e usando-se um sintetizador de peptídeos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), usando-se as instruções do fabricante. Diversas porções do anticorpo anti- CD79B podem ser sintetizadas quimicamente separadamente e combinadas usando-se métodos químicos e enzimáticos para produzir o anticorpo anti- CD79b desejado ou polipeptídeo CD79b.
[550] Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (Morimoto et al., (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; e Brennan et al., (1985) Science, 229:81), ou produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab, Fv e ScFv do anticorpo anti-CD79b podem ser todos expressos em E. coli e secretados a partir dela, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas no presente documento. Alternativamente, os fragmentos Fab’-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e ser quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., (1992) Bio/Technology 10:163-167), ou isolados diretamente da cultura de células hospedeira recombinantes. O anticorpo anti-CD79b pode ser um fragmento Fv de uma única cadeia (scFv) (WO 93/16185; patente US 5.571.894; patente US 5.587.458). O fragmento do anticorpo anti-CD79b pode também constituir um “anticorpo linear” (patente US 5.641.870). Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
[551] A descrição abaixo se refere principalmente à produção de anticorpos anti-CD79b por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico que codifica anticorpo anti-CD79b. O DNA que codifica anticorpos anti-CD79b pode ser obtido de uma biblioteca de DNAc preparada a partir de tecido que se acredita que possua o RNAm de anticorpo anti-CD79b e que se acredita que o expresse a um nível detectável. Consequentemente, o DNA de anticorpo anti-CD79b humano ou de polipeptídeo de CD79b pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de DNAc preparada a partir de tecido humano. O gene que codifica o anticorpo anti-CD79b pode também ser obtido de uma biblioteca genômica ou por procedimentos sintéticos conhecidos (tais, por exemplo, como síntese automatizada de ácido nucleico).
[552] O projeto, os métodos de seleção e preparação da presente invenção permitem anticorpos anti-CD79b cisteína submetidos à engenharia que são reativos com a funcionalidade eletrofílica. Estes métodos permitem ainda compostos conjugados de anticorpos tais como compostos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) com moléculas de fármaco em sítios designados, projetados seletivos. Os resíduos de cisteína reativos na superfície do anticorpo permitem que se conjugue especificamente a fração fármaco através de um grupo reativo tiol tal como maleimida ou haloacetila. A reatividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo de Cys a um grupo maleimida é de aproximadamente 1000 vezes maior em comparação com qualquer outra funcionalidade aminoácido em uma proteína, tal como grupo amino de resíduos de lisina ou o grupo amino no terminal N. A funcionalidade tiol específica em reagentes de iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas são necessários valores pH maiores (> 9,0) e tempos de reação mais prolongados (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres). A quantidade de til livre em uma proteína pode ser estimada pelo ensaio padrão de Ellman. A imunoglobulina M é um exemplo de pentâmero ligado por dissulfeto, ao passo que a imunoglobulina G é um exemplo de uma proteína com pontes dissulfeto internas que ligam entre si subunidades. Nas proteínas como estas, a redução das ligações dissulfeto com um reagente tal como ditiotreitol (DTT) ou selenol (Singh et al., (2002) Anal. Biochem. 304:147156) é necessária para gerar o tiol livre reativo. Esta abordagem pode resultar na perda da estrutura terciária do anticorpo e da especificidade de ligação a antígeno.
[553] O ensaio PHESELECTOR (ELISA de fagos para Seleção de Tióis Reativos, em inglês Phage ELISA for Selection of Reactive Tiols) permite a detecção de grupos cisteína reativos em anticorpos em um formato de fago de ELISA, auxiliando assim, no projeto de anticorpos cisteína submetidos à engenharia (Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol. Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). O anticorpo cisteína submetido à engenharia é disposto nas superfícies dos poços, incubando-se, em seguida, com partículas de fagos, adicionando-se anticorpo secundário rotulado com HRP, e detectandose a absorbância. As proteínas mutantes exibidas no fato podem ser testadas de um modo rápido, robusto e com alto rendimento. As bibliotecas de anticorpos cisteína submetidos à engenharia podem ser produzidas e submetidas a seleção de ligação, usando-se a mesma abordagem para identificar adequadamente sítios reativos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas aleatórias de fagos de proteínas de anticorpos ou de outras proteínas. Esta técnica inclui fazer- se reagir as proteínas mutantes de cisteína exibidas no fago com um reagente de afinidade ou com um grupo repórter que é também reativo a tiol.
[554] O ensaio PHESELECTOR permite que se teste os grupos tiol reativos em anticorpos. A identificação da variante A121C por este método é exemplar. A molécula Fab integral pode ser efetivamente examinada para a identificação de mais variantes TioFab com grupos tiol reativos. Foi empregado um parâmetro, a acessibilidade à superfície fracionária para a identificação e quantificação da acessibilidade do solvente aos resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo. A acessibilidade à superfície pode ser expressa como a área superficial (A2) que se pode colocar em contato com uma molécula de solvente, com água, por exemplo. O espaço ocupado de água é de aproximadamente uma esfera de raio 1,4 A. O software é livremente disponível e pode se obter sua licença livremente (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825, ou por Internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) em forma de programas CCP4 Suite de cristalografia que emprega algoritmos para calcular a acessibilidade à superfície de cada aminoácido de uma proteína com coordenadas conhecidas derivadas de uma cristalografia de raios X (“The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography” (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Dois módulos de software exemplificativos que efetuam os cálculos de acessibilidade a superfície são “AREAIMOL” e “SURFACE”, baseados nos algoritmos de B. Lee e F. M. Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400. AREAIMOL define a superfície de uma proteína acessível a solvente como o lócus do centro de uma esfera de sondagem (representando uma molécula de solvente) à medida que ela rola sobre a superfície de Van der Waals da proteína. AREAIMOL calcula a área superficial acessível a solvente gerando pontos na superfície de uma esfera estendida ao redor de cada átomo (a uma distância do centro do átomo igual à soma dos raios do átomo e da sonda), e eliminando aqueles que se encontram dentro de esferas equivalentes associadas com átomos vizinhos. AREAIMOL encontra a área de átomos acessível a solvente em um arquivo de coordenadas de PDB, e resume a área acessível por resíduo, por cadeia e para a totalidade da molécula. As áreas acessíveis (ou diferenças de áreas) para átomos individuais podem ser inscritas em um arquivo de saída pseudo-PDR. AREAIMOL pressupõe um único raio para cada elemento, e somente reconhece um número limitado de elementos diferentes.
[555] AREAIMOL e SURFACE relatam acessibilidades absolutas, isto é, o número de Angstroms (A) ao quadrado. A acessibilidade à superfície fracionária é calculada por referência a um estado padrão relevante para um aminoácido no interior do polipeptídeo. O estado de referência é o tripeptídeo Gly-X-Gly, em que X é o aminoácido de interesse, e o estado de referência deve ser uma conformação “prolongada”, isto é, como aquelas em filamentos beta. A conformação prolongada maximiza a acessibilidade de X. Uma área acessível calculada é dividida pela área acessível em um estado de referência de tripeptídeo Gly-X-Gly e relata o quociente, que é uma acessibilidade fracionária. A porcentagem de acessibilidade é uma acessibilidade fracionária multiplicada por 100. Um outro algoritmo exemplar para se calcular a acessibilidade à superfície é baseada no módulo SOLV do programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel) que calcula a acessibilidade fracionária de um resíduo de aminoácido a uma esfera de água baseada nas coordenadas de raios X do polipeptídeo. A acessibilidade fracionária à superfície para cada aminoácido em um anticorpo pode ser calculada usando-se informações disponíveis sobre a estrutura cristalina (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995).
[556] O DNA que codifica os anticorpos cisteína submetidos à engenharia é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (usando-se sondas de oligonucleotídeo, por exemplo, que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte de um tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símios, células Ovarianas de Hamster Chinês (CHO), ou outras células hospedeiras de mamíferos, tais como células de mieloma, (patente U.S. No. 5.807.715; U.S. 2005/0048572; U.S. 2004/0229310) que em outras circunstâncias não produzem a proteína de anticorpo, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
[557] Depois de projetados e selecionados, os anticorpos cisteína submetidos à engenharia, TioFabs, por exemplo, juntamente com os resíduos de Cys submetidos à engenharia, “aminoácidos de cisteína livre” podem ser produzidos por: (i) expressão em um sistema bacteriano, de E. coli, por exemplo (Skerra et al., (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188) ou em um sistema de cultura de células de mamíferos (WO 01/00245), em células ovarianas de Hamster Chinês (CHO), por exemplo; e (ii) purificação usando-se técnicas de purificação habituais de proteínas (Lowman et al., (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988).
[558] Os grupos tiol de Cys engenheirada reagem com reagentes eletrofílicos de ligante e com intermediários fármaco-ligante para formar os conjugados de fármaco e anticorpo cisteína submetido à engenharia e outros anticorpos cisteína submetidos à engenharia rotulados. Os resíduos Cys de anticorpos cisteína submetidos à engenharia, e presentes nos anticorpos originais, que são emparelhados para formar ligações dissulfeto entre cadeias e no interior de cadeias não têm nenhum grupo tiol reativo (a não ser que sejam tratados com um agente redutor) e não reagem com reagentes eletrofílicos de ligante ou com intermediários fármaco-ligante. O resíduo Cys recém construído, pode permanecer sem parear e é capaz de reagir, isto é, de se conjugar com um reagente eletrofílico de ligante ou com um intermediário fármaco-ligante, tal como um fármaco-maleimida. Os intermediários fármaco-ligante exemplificativos incluem: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE, e MC-vc-PAB-MMAF. As posições na estrutura dos resíduos Cys submetidos à engenharia das cadeias pesadas e leves são numeradas de acordo com um sistema de numeração de sequência. Este sistema de numeração de sequência é correlacionado com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) começando no terminal N, difere do esquema de numeração de Kabat (carreira inferior) por inserções indicadas com a, b, c. Usando-se o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real pode conter um número menor de aminoácidos ou um número adicional de aminoácidos correspondendo a um encurtamento de uma FR ou de uma CDR do domínio variável ou a inserções delas. Os sítios de variante de cadeia pesada cisteína engenheirada são identificados pelos esquemas de numeração de sequência e de numeração de Kabat.
[559] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia é preparado por um processo que compreende: (a) a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de um anticorpo anti-CD79b originário por cisteína; e (b) a determinação da reatividade a tiol do anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia fazendo-se reagir o anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente reativo a tiol.
[560] O anticorpo cisteína submetido à engenharia pode ser mais reativo do que o anticorpo originário com o reagente reativo a tiol.
[561] Os resíduos de aminoácido cisteína livres podem estar localizados nas cadeias pesadas ou leves, ou nos domínios constantes ou variáveis. Os fragmentos de anticorpos, Fab, por exemplo, podem também ser submetidos à engenharia com um ou mais aminoácido cisteína substituindo os aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpos cisteína submetidos à engenharia.
[562] Uma outra modalidade da presente invenção propõe um método de preparação (construção) de um anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia, compreendendo: (i) a introdução de um ou mais aminoácidos cisteína em um anticorpo anti-CD79b originário para gerar o anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia; e (ii) a determinação da reatividade a tiol do anticorpo cisteína submetido à engenharia de um reagente reativo a tiol; em que o anticorpo cisteína submetido à engenharia é mais reativo do que o anticorpo originário com o reagente reativo a tiol. A etapa (a) do método de preparação de um anticorpo cisteína submetido à engenharia pode compreender: (iii) a mutagênese de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo cisteína submetido à engenharia; (iv) a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia; e (v) i) o isolamento e a purificação do anticorpo cisteína submetido à engenharia.
[563] A etapa (b) do método de preparação de anticorpo cisteína submetido à engenharia pode compreender a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia em uma partícula viral selecionada de um fago ou de uma partícula de fagomídeo.
[564] A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo cisteína submetido à engenharia pode também compreender: (i) fazer-se reagir o anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente de afinidade reativo a tiol para gerar um anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade; e (ii) medir-se a ligação do anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade a um meio de captura. Uma outra modalidade da presente invenção consiste em um método de teste de anticorpos cisteína submetidos à engenharia com aminoácidos cisteína não emparelhados extremamente reativos para reatividade a tiol, compreendendo: (a) introduzir-se um ou mais aminoácidos cisteína em um anticorpo originário para gerar um anticorpo cisteína submetido à engenharia; (b) fazer-se reagir o anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente de afinidade para reativo a tiol para gerar um anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade; e (c) medir-se a ligação do anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado para afinidade a um meio de captura; (d) determinar-se a reatividade a tiol do anticorpo cisteína submetido à engenharia com o reagente reativo a tiol.
[565] A etapa (a) do método de teste de anticorpos cisteína submetidos à engenharia pode compreender: (i) a mutagênese de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anticorpo cisteína submetido à engenharia; (ii) a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia; e (iii) o isolamento e a purificação do anticorpo cisteína submetido à engenharia.
[566] A etapa (b) do método de se testar os anticorpos cisteína submetidos à engenharia pode compreender a expressão do anticorpo cisteína submetido à engenharia em uma partícula viral selecionada de uma partícula de fago ou de um fagomídeo.
[567] A etapa (b) do método de seleção dos anticorpos cisteína submetido a engenharias também pode compreender: (i) reagir o anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente com afinidade para tiol-reativo a fim de gerar um anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado por afinidade; e (ii) medir a ligação do anticorpo cisteína submetido à engenharia rotulado por afinidade para um meio de captura. B. ENGENHARIA DE CISTEÍNA DAS VARIANTES IGG DE ANTI-CD79B
[568] Introduziu-se cisteína ao sítio da cadeia pesada 118 (numeração EU) (equivalente à posição 118 da cadeia pesada, numeração sequencial) aos anticorpos anti-CD79b monoclonais de origem, quiméricos de comprimento total ou na cadeia leve 205 (numeração Kabat) (equivalente à numeração sequencial da posição de cadeia leve 209) aos anticorpos anti- CD79b monoclonais de origem, quiméricos pelos métodos de engenharia de cisteína aqui descritos.
[569] Os anticorpos cisteína submetido à engenharias com cisteína na cadeia pesada 118 (numeração EU) foram: (a) thio-MA79b.v17- HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 228) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 229), Figure 24; (b) thio-MA79b.v18-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 230) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 231), Figure 25; (c) thio-MA79b.v28-HC(A118C), com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 232) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 233), Figure 26; (d) thio-MA79b-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 236) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 237), Figure 28; e (e) thio-anti-cynoCD79b-HC(A118C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 244) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 245), Figure 48.
[570] Anticorpos cisteína submetido à engenharias com cisteína na cadeia leve 205 (numeração Kabat) gerados foram: (a) thio-MA79b- LC(V205C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 234) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 235), Figura 27 e (b) thio-anti- cynoCD79b(ch10D10)-LC(V205C) com a sequência de cadeia pesada (SEQ ID NO: 299) e sequência de cadeia leve (SEQ ID NO: 300), Figura 49.
[571] Esses anticorpos monoclonais cisteína submetido à engenharias foram expressos em células CHO (Ovário de Hamster chinês) por fermentação passageira em meio contendo cisteína 1mM.
[572] De acordo com uma modalidade, os anticorpos anti-CD79b cisteína submetido à engenharias de MA79b humanizados, compreende um ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID Nos 251-259, Tabela 2). TABELA 2: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIAS MA79B HUMANIZADOS
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[573] De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias MA79b quiméricos compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 260-268, Tabela 3). TABELA 3: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIA CHMA79B
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[574] De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias anti-cynoCD79b(ch10D10) compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia pesada com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 269-277 Tabela 4) TABELA 4: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO DE CADEIA PESADA SEQUENCIAL, KABAT E EU PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIA ANTI-CYNO CD79B(CH10D10)
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[575] De acordo com uma modalidade, anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias MA79b humanizados compreendem uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 278-284, Tabela 5) TABELA 5: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE E KABAT PARA VARIANTES DO ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIA MA79B HUMANIZADAS
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[576] De acordo com uma modalidade, os anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias de MA79b quiméricos compreende uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 285-291, Tabela 6) TABELA 6: COMPARAÇÃO DE NUMERAÇÃO SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE E KABAT PARA VARIANTES DE ANTICORPO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIAS MA79B QUIMÉRICO
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[577] De acordo com uma modalidade anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias anti-cynoCD79b(ch10D10) compreende uma ou mais das seguintes sequências de cadeia leve com um aminoácido cisteína livre (SEQ ID NO: 292-298, Tabela 7) TABELA 7: COMPARAÇÃO DA NUMERAÇÃO KABAT E SEQUENCIAL DE CADEIA LEVE PARA VARIANTES DO ANTICORPO ANTI-CD79B SUBMETIDO À ENGENHARIA DE CISTEÍNA (CH10D10)
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C. ANTICORPOS ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIAS ROTULADOS
[578] Os anticorpos anti-CD79b cisteína submetido à engenharia podem ser acoplados especificamente e eficientemente ao sítio com um reagente tiol-reativo. O reagente tiol-reativo pode ser um reagente ligante multifuncional, um elemento de apreensão, ou seja, reagente com rótulo de afinidade (por exemplo, um reagente biotina-ligado), um rótulo de detecção (por exemplo, um reagente fluoróforo) um reagente de imobilização de fase sólida (por exemplo, SEPHAROSE™, poliestireno, ou vidro), ou um intermediário fármaco-ligante. Um exemplo de um reagente tiol-reativo é N-etil maleimida (NEM). Numa modalidade exemplar, a reação de um ThioFab com um reagente biotina-ligado propicia um ThioFab com um ligante funcionalizado que pode ser adicionalmente reagido com uma reagente da fração do fármaco ou outro rótulo. A reação de um ThioFab com um intermediário fármaco-ligante obtém um conjunto fármaco-ThioFab.
[579] Métodos exemplificativos aqui descritos podem ser aplicados em geral, à identificação e produção de anticorpos e, em geral, a outras proteínas aplicando-se as etapas de planejamento e análise aqui descritos.
[580] Uma tal abordagem pode ser aplicada a conjugação de outros reagentes tiol-reativos, em que o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, um iodoacetamida, um dissulfeto de piridila ou outro par de conjugação tiol-reativo (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes e Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). O reagente tiol-reativo pode ser uma fração de fármaco, um fluoróforo, tal como um corante fluorescente como fluoresceína ou rodamina, um agente quelante para um imageamento ou metal radioterapêutico, um rótulo peptidila ou não peptídila ou marcador de detecção, ou um agente modificador da depuração, tal como múltiplos isômeros de polietileno glicol, um peptídeo que se liga a um terceiro componente, ou um outro carboidrato ou agente lipofílico. D. USO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDOS À ENGENHARIA
[581] Os anticorpos anti-CD79b cisteína submetido a engenharias e seus conjugados podem encontrar uso como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico. A presente invenção propicia ainda métodos de prevenção, manejo, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados com um distúrbio relacionado a célula B. Em particular, a presente invenção propicia métodos de prevenção, manejo, tratamento ou melhora de um ou mais sintomas associados com um distúrbio proliferativo celular, como câncer por exemplo, linfoma, linfoma de não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo recidivo, NHL indolente recidivo, NHL contumaz, NHL indolente contumaz, leucemia linfocítica crônica (CÉLULAS), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula de revestimento. A presente invenção propicia ainda métodos para o diagnóstico de um distúrbio relacionado a CD79b ou predisposição a desenvolver esse distúrbio, bem como a métodos para identificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, que de preferência, ligam polipeptídeo CD79B associados a célula B.
[582] Uma outra modalidade da presente invenção dirige-se ao uso de um anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia para preparação de um medicamento de utilidade no tratamento de uma condição responsável por um distúrbio relacionado a célula B. E. CONJUGADOS FÁRMACO-ANTICORPO CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIAS (CONJUGADOS TIO-FARMACO-ANTICORPO (TDCS))
[583] Um outro aspecto da invenção se trata de um composto conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia (Ab) e uma fração de fármaco auristatina (D) em que o anticorpo cisteína submetido à engenharia é ligado por meio de um ou mais aminoácidos cisteína livres por uma fração do ligante (L) a D; tendo o composto a seguinte Fórmula I: Ab-(L-D)p i em que p é 1, 2, 3, ou 4; e em que o anticorpo cisteína submetido à engenharia é preparado por um processo compreendendo a substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-CD79b original por um ou mais aminoácidos cistina livres.
[584] Um outro aspecto da invenção é uma composição compreendendo uma mistura de compostos anticorpo-fármaco de Fórmula I em que a introdução de fármaco médio para o anticorpo é cerca de 2 a cerca de 5, ou cerca de 3 a cerca de 4.
[585] As figuras 24 a 28 e 48 a 49 mostram modalidades dos conjugados anticorpo anti-CD79b-fármaco cisteína submetido a engenharias (ADC) em que uma fração do fármaco auristatina é ligada a um grupo cisteína submetido à engenharia em: cadeia leve (LC-ADC) ou cadeia pesada (HC-ADC).
[586] Vantagens potenciais dos conjugados de anticorpo anti- CD79b-fármaco cisteína submetido à engenharias incluem melhor segurança (índice terapêutico maior)melhores parâmetros PK, pontes dissulfeto intercadeias do anticorpo, ficam retidas o que pode estabilizar o conjugado e reter sua conformação de ligação ativa, os sítios de conjugação do fármaco são definidos, e a preparação dos conjugados anticorpo-fármaco cisteína submetido à engenharias da conjugação dos anticorpos cisteína submetido à engenharias para os reagentes fármaco-ligante resulta em um produto mais homogêneo.
LIGANTES
[587] "Ligante" Unidade Ligante" ou "ligação" significa uma fração química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma fração de fármaco. Em várias modalidades um ligante é especificado como L. Um "ligante" (L) é uma fração bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais frações de Fármaco (D) e uma unidade do anticorpo (Ab) formando conjugados anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula I). Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) podem ser preparados, convenientemente usando-se um Ligante com funcionalidade reativa para ligação ao Fármaco e ao Anticorpo. Um cisteína tiol de um anticorpo cisteína submetido à engenharia (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de um reagente ligante, uma fração de fármaco ou intermediário fármaco-ligante.
[588] Num aspecto, um Ligante possui um sítio reativo que possui um grupo eletrofílico que é reativo para uma cisteína nucleofílica presente em um anticorpo. A cisteína tiol do anticorpo é reativa com um grupo eletrofílico em um Ligante e forma uma ponte covalente para um Ligante. Grupos eletrofílicos úteis incluem, sem limitação, grupos maleimida e haloacetamida.
[589] Ligantes incluem um radical bivalente tal como um alquildiila, um arileno um heteroarileno, frações tais como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenóxi, PEG, polimetileneóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine™) e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
[590] Anticorpos cisteína submetido a engenharias reagem com reagentes ligantes ou intermediários fármaco-ligante com grupos funcionais eletrofílicos tais como maleimida ou um a-halo carbonila de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman et al., (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, e de acordo com o protocolo do Exemplo 6.
[591] O ligante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplificativos incluem 6-maleimidocaproíla ("MC"), maleimidopropanoila ("MP), valina-citrulina (val-cit) ou vc), alanina- fenilalanina (ala-phe ou af), para-aminobenziloxicarbonila (PAB), N-succinimidila 4-(2-priidiltio pentanoato (SPP), N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloexano- 1-carboxilato (SMCC), N-succinimidil (4-iodo-acetil)aminobenzoato (SIAB), etileneóxi -CH2CH2O- como uma ou mais unidades de repetição (EO ou PEO). Componentes ligantes adicionais são do conhecimento da técnica e alguns estão aqui descritos.
[592] Numa modalidade, o ligante L de um ADC possui a fórmula:
Figure img0060
em que: -A- é uma unidade Tensora covalentemente ligada a uma cisteína tiol do anticorpo (Ab); a e 0 ou 1; cada -W- é independentemente uma unidade Aminoácido; w é independentemente um inteiro variando de 0 a 12; -Y- é uma unidade espaçadora covalentemente ligada à fração do fármaco; e y é 0, 1 ou 2. UNIDADE TENSORA
[593] A unidade Tensora (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-). Neste sentido, um anticorpo (Ab) tem o grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de um Tensor. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes em um anticorpo, seja naturalmente ou via manipulação química, incluem, sem limitação, a sulfidrila (-SH), amino, hidroxila, carboxila, o grupo hidroxil anomérico de um carboidrato e carboxila. Em um aspecto, os grupos funcionais de anticorpo são sulfidrila ou amino. Grupos sulfidrila podem ser geados por redução de uma ponte dissulfeto intramolecular de um anticorpo. Alternativamente, grupos sulfidrila podem ser gerados por reação de um grupo amino de uma fração lisina de um anticorpo usando 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou um outro reagente gerador de sulfidrila. Numa modalidade, um anticorpo (Ab) tem um grupo cisteína tiol livre que pode formar uma ponte com um grupo funcional eletrofílico de uma Unidade Tensora. Unidades tensoras exemplificativos de conjugados de Fórmula I estão ilustrados nas Fórmulas Ii e III, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são como indicados supra, e R17 é um radical bivalente selecionado de: (CH2)r, C3-C8 carbociclila, O-(CH2)r, arileno, (CH2)r-arileno, -arileno-(CH2)r-, (CH2)r-(C3-C8 carbociclila), (C3-C8 carbociclila)-(CH2)r, C3-C8 heterociclila, (CH2)r-(C3-C8 heterociclila), -(C3-C8 heterociclila)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, e -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r- ; em que Rb é H, C1-C6 alquila, fenila, ou benzila; e r é independentemente um inteiro que varia de 1-10.
[594] Arileno inclui radicais hidrocarboneto bivalentes aromáticos de 6 a 20 átomo de carbono derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do sistema de anel aromático. Grupos arileno típicos incluem, sem limitação a radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similares.
[595] Grupos heterociclila incluem, um sistema de anel em que um ou mais átomos no anel é um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio e enxofre. O radical heterociclo compreende 1 a 20 átomo de carbono, e 1 a 3 heteroátomos selecionado de N, O, P e S. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomo de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P, e S), por exemplo, um sistema biciclo [4,5], [5,5], 5,6], ou [6,6]. Heterociclos estão descritos em Paquette Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente os capítulos 1, 3, 4, 6, 7, and 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), particularmente os volumes 13, 14, 16, 19, and 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
[596] Exemplos de heterociclos incluem à guisa de exemplo e não de limitação: piridila, diidropridila, tetraidropiridila (piperidila), tiazolla, tetraidrotiofenila, tetraidrotiofenila oxidado com enxofre, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4- piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetraidrofuranila, bis- tetraidrofuranila, tetraidropiranila, bis-tetraidropiranila, tetraidroquinolinila, tetrahidroisoquinolinila, decahidroquinolinila, octahidroisoquinolinila, azocinila, triazinila, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H- indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinnolinila, pteridinila, 4Ah-carbazolila, carbazolila, β-carbolinila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morflinila, oxazolidinila, benzotriazolila, benzisoxazolila, oxindolila, benzoxazolinila, e isatinoila.
[597] Grupos carbociclila incluem um anel saturado ou insaturado com 3 a 7 átomo de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono com um biciclo. Carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente, 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], 5,6], ou [6,6]. ou 9 a 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplo de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, cicloexila, 1-cicloex-1-enila, 1-cicloex-2-enila, 1-cicloex-3-enila, cicloeptila, e ciclooctila.
[598] Deve ficar entendido que, de todas as modalidades exemplificativas de Fórmula I, ADC como II-VI que, mesmo onde não indicado expressamente, de 1 a 4 frações de fármaco são ligadas a um anticorpo (p = 1 a 4), dependendo do número de resíduos de cisteína submetido a engenharias.
Figure img0061
[599] Uma unidade Tensora de Fórmula II ilustrativa é derivada de maleimido-caproíla (MC) em que R17 é -(CH2)5-:
Figure img0062
[600] Uma unidade Tensora ilustrativa de Fórmula II, sendo derivada de maleimidopropanoila 9MP) em que R17 é -(CH2)2-:
Figure img0063
[601] Uma outra unidade Tensora ilustrativa de Fórmula II em que R17 é -(CH2CH2O)r-CH2 - e r é 2:
Figure img0064
[602] Uma outra unidade Tensora de Formula II em que R17 é
Figure img0065
[603] Uma unidade Tensora ilustrativa de Fórmula III em que R17 é -(CH2)5-:
Figure img0066
[604] Numa outra modalidade, a unidade Tensora está ligada ao anticorpo anti-CD79b cisteína submetido à engenharia via uma ponte dissulfeto entre o átomo de enxofre cisteína submetido à engenharia do anticorpo e um átomo de enxofre da unidade Tensora. Uma unidade Tensora representativa desta modalidade está ilustrada pela Fórmula IV, em que R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são como acima indicados.
Figure img0067
[605] Numa outra modalidade ainda, o grupo reativo da unidade Tensora contém um grupo funcional tiol-reativo que pode formar uma ponte com um tiol cisteína livre de um anticorpo. Exemplos de grupos funcionais tiol-reativos incluem, sem limitação, a maleimida, α-haloacetila, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, ésteres 4-nitrofenílicos, ésteres pentafluorfenílicos, ésteres tetrafluorfenílicos, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos.
[606] Unidades Tensoras representativas desta modalidade estão ilustradas nas Fórmulas Va e Vb, em que -R17-, Ab-, -W-, -Y, -D, w e y são como supracitados;
Figure img0068
[607] Numa outra modalidade, o ligante pode ser um ligante tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma fração de fármaco, por meio de uma fração de ligante multifuncional ramificada a um anticorpo. (Sun et al., (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al., (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar do fármaco para anticorpo, ou seja, por meio de carga, relacionada à potência do ADC. Portanto, sempre que em um anticorpo cisteína submetido à engenharia constar apenas um grupo cisteína tiol reativo, uma plêiade de frações de fármaco pode ser ligada através de um ligante dendrítico.
UNIDADE DE AMINOÁCIDO
[608] O ligante pode compreender resíduos de aminoácido. A unidade de aminoácido (Ww-) quando presente, liga o anticorpo (Ab) à fração do fármaco (D) do conjugado anticorpo-fármaco cisteína submetido a engenharia (ADC) da invenção.
[609] -Ww- é uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Resíduos de aminoácido compreendendo a unidade de Aminoácido incluem os de ocorrência natural, bem como os aminoácidos secundários e análogos de aminoácido de ocorrência natural, tais como citrulina. Cada unidade -W- independentemente, possui a fórmula citada abaixo entre colchetes, e w é um número inteiro que varia de 0 a 12:
Figure img0069
em que R19 é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butia, benzila, para-hidroxibenzila, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, - CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, (CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, - (CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, - (CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, - CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetila-,
Figure img0070
[610] Quando R19 é diferente de hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R19 está preso é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R19 está ligado, está, independentemente na configuração (S) ou (R) ou em uma mistura racêmica. Unidades de aminoácido podem assim, ser enantiomericamente puras, racêmicas ou diastereoméricas.
[611] Unidades de Aminoácido -Ww- exemplificativos incluem um dipeptideo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplificativos incluem valina-citrulina (Vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplificativos incluem glicina-valina-citrulina (gly-val- cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácido compreendendo um componente ligante de aminoácido incluem os que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos secundários e análogos de aminoácido de ocorrência não natural, tais como citrulina.
[612] A unidade de aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, a fim de liberar a fração de fármaco (-D), que, numa modalidade, é protonada in vivo com a liberação fornecendo um Fármaco (D). Componentes ligantes de aminoácido podem ser planejados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma determina enzima, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D ou uma plasmina protease.
UNIDADE ESPAÇADORA
[613] A unidade espaçadora (-Yy-) quando presente (y = 1 ou 2) liga uma unidade de aminoácido (Ww-) 1a fração de fármaco (D) quando está presente uma unidade de aminoácido (w = 1 a 12). Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade de estiramento à fração de Fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora liga a fração de fármaco à unidade de anticorpo quando ambas as unidades, de aminoácido e unidade de estiramento estão ausentes, (w, y = 0). As unidades espaçadoras pertencem a dois tipos genéricos: auto-imolador e não auto-imolador. Uma unidade espaçadora que não é auto-imoladora é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à fração de Fármaco após clivagem, particularmente, enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco ou da fração-ligante do Fármaco. Quando uma unidade espaçadora glicina-glicina contendo ADC ou uma unidade espaçadora glicina passa por clivagem enzimática via uma protease associada a célula de tumor, uma protease associada a célula de câncer ou uma protease associada a linfócito, uma fração de glicina-glicina-Fármaco ou uma fração glicina-Fármaco é clivada de Ab-Aa-Ww-. Numa modalidade, uma reação de hidrolise independente ocorre dentro da célula alvo, clivando a ligação da fração glicina- Fármaco liberando o Fármaco.
[614] Numa outra modalidade, -Yy- é uma unidade para- aminobenzilcarbamoila (PAB) cuja porção fenileno é substituída com Qm, caso em que Q é C1-8 alquila, -O-(C1-C8-alquila), -halogênio, nitro ou ciano e m é um n° inteiro que varia de 0 a 4.
[615] Modalidades exemplificativas de uma unidade espaçadora auto-imoladora (-Y-) são Gly-Gly-; Gly-, -Ala-Phe-, Val-Cit-.
[616] Numa modalidade, uma fração-ligante de Fármaco ou um ADC é proporcionado no caso em que a unidade espaçadora está ausente (y = 0) ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável deste.
[617] Alternativamente, um ADC contendo uma unidade espaçadora auto-imoladora pode liberar -D. Numa modalidade, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -WW- via o átomo de nitrogênio do amino do grupo PAB, e ligado diretamente a -D via um grupo carbonato, carbamato ou éter, onde o ADC possui a estrutura exemplificativa:
Figure img0071
em que Q é C1-8 alquila ou -O-(C1-8 alquila), halogênio, nitro ou ciano, m é um n° inteiro variando de 0 a 4 e p varia de 1 a 4.
[618] Ouros exemplos de espaçadores auto-imoladores incluem, sem limitação a compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PAB tais como derivados 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), análogos de PAB heterocíclicos (US 2005/0256030), beta-glucuronídeos (WO 2007/011968), e orto ou para- aminobenzilacetais. Espaçadores que sofrem ciclização podem ser usados, por meio de hidrólise da ligação amida, tal como, amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo [2.2.1] e biciclo [2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm et al.,(1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., (1990) J. Org. Chem. 55:5867). A eliminação de fármacos contendo amina os quais são substituídos em glicina (Kingsbury et al., (1984) J. Med. Chem. 27:1447) são também exemplos de espaçadores auto-imoladores úteis em ADCs.
[619] Unidades Espaçadoras exemplificativos (-Yy-) são representadas pelas Fórmulas X - XII:
Figure img0072
LIGANTES DENDRÍTICOS
[620] Numa outra modalidade, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente a mais de uma fração de fármaco através de uma fração de ramificação do ligante multifuncional para um anticorpo (Sun et al., (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al., (2003 (Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a relação molar do fármaco para anticorpo, ou seja, por meio de introdução, que está relacionado com a potência ADC. Assim, onde um anticorpo cisteína submetido à engenharia portar apenas um grupo tiol cisteína reativo, frações múltiplas do fármaco pode ser ligadas através de um ligante dendrítico. Modalidades exemplificativas de ligantes dendríticos ramificados, incluem, unidades dendriméricas 2,6-bis(hidroximetil)-para-cresol e 2,4,6- tris(hidroximetil)-fenol WO 2004/01993; Szalai et al., (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al., (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al., (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
[621] Numa modalidade, a unidade Espaçadora é um bis(hidroximetil)estireno ramificado (B HMS), que pode ser empregada para incorporar e liberar múltiplos fármacos com a estrutura:
Figure img0073
compreendendo uma unidade de dendrímero 2-(4- aminobenzilideno)propano-1,3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al.,(2003) Angews, Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), em que Q é um C1-8 alquila, -O-(C1-8) alquila), -halogênio, nitro ou ciano; m é um n° inteiro variando de 0 a 4 n é 0 ou 1 e p varia de 1 a 4.
[622] Modalidades exemplificativas de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I incluem XIIIA (MC), XIIIb (val-cit), XIIIc (MC-val- cit) e XIIId (MC-al-cit-PAB);
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Figure img0075
[623] Outras modalidades exemplificativas de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula Ia incluem XlVa - e
Figure img0076
Figure img0077
e R é independentemente H ou C1-6 alquila e n é 1 a 12.
[624] Numa outra modalidade, um ligante possui um grupo funcional reativo dotado de um grupo nucleofílico reativo para um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo, incluem, sem limitação, grupos carbonila aldeído e cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente para uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um Ligante, incluem, sem limitação hidrazida, oxima, amino, hidrazima, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e aril- hidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo propicia um sítio conveniente para ligação a um Ligante.
[625] Tipicamente, Ligantes do tipo peptídeo podem ser preparados formando-se uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Essas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese na fase líquida (E. Schroder and K. Lubke (1965) “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press) bem conhecido no campo da química de peptídeos. Intermediários de ligantes podem ser conjugados com qualquer combinação ou sequência de reações incluindo unidades Espaçadoras, Tensoras e Aminoácido. As unidades Espaçadores, Tensoras, e Aminoácido podem empregar grupos funcionais reativos que são eletrofílicos, nucleofílicos ou radical livre por natureza. Grupos funcionais reativos incluem, sem limitação a carboxilas, hidroxilas, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato e grupos de partida, tais como O-mesila, O-tosila, -Cl, -Br, -I- ou maleimida.
[626] Por exemplo, um substituinte carregado como sulfonato (- SO3), ou amônio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a fração de fármaco, ou ainda, facilitar a reação de acoplamento de Ab-L (intermediário anticorpo-ligante) com D, ou D-L (intermediário fármaco-ligante) com AB, dependendo da vi sintética empregada na preparação de ADC.
REAGENTES LIGANTES
[627] Conjugados de anticorpo e auristatina podem ser produzidos por emprego de uma série de reagentes ligantes bifuncionais tais como N- succinimidil-3-(2-piridil-ditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato (HCl) ésteres ativos (tais como di-succinimidil suberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-ácido (tais como bis (para-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-benzoil diazônio)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos flúor bis-ativos (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno).
[628] Os conjugados anticorpo-fármaco podem ainda ser preparados com reagentes ligantes: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC- SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo- GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), incluindo os reagentes bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietileneglicol (BM(PEO)2), e 1,11-bis-maleimidotrietilenoglicol (BM(PEO)3), os quais são comercialmente disponíveis de Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, e outros fornecedores de reagentes. Reagentes bis-maleimida permitem a ligação do grupo tiol de um anticorpo cisteína submetido à engenharia a uma fração de fármaco contendo tiol, rótulo ou intermediário ligante num modo sequencial ou concorrente. Outros grupos funcionais, além de maleimida, reativos com um grupo tiol de um anticorpo cisteína submetido à engenharia, fração de fármaco, rótulo ou intermediário ligante incluem iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, dissulfeto, piridil dissulfeto, isocianato e isotiocianato.
Figure img0078
[629] Reagentes ligantes úteis também podem ser obtidos por outras fontes comerciais, como em Toki et al., (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al., (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; and WO 04/032828.
[630] Tensores de Fórmula (IIIa) podem ser introduzidos em um Ligante reagindo-se os seguintes reagentes ligantes com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido: em que n é um n° inteiro variando de 1 a 10 e T é H ou -SO3Na;
Figure img0079
em que n é um n° inteiro que varia de 0 a 3
Figure img0080
Figure img0081
[631] Unidades tensoras podem ser introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes bifuncionais com o N-terminal de uma unidade de Aminoácido.
Figure img0082
em que X é Br ou I.
[632] Unidades tensoras da fórmula também podem ser introduzidas em um Ligante reagindo-se os seguintes reagentes bifuncionais com o N-terminal de uma unidade de aminoácido:
Figure img0083
[633] Um Reagente ligante dipeptídico valina-citrulina (val-cit ou vc) com uma unidade Tensora maleimida e uma unidade Espaçadora para- aminobenzilcarbamoíla (PAB) auto-imoladora tem a estrutura:
Figure img0084
[634] Um reagente ligante dipeptídico phe-lys (Mtr, mono-4- metoxitritila) com uma unidade Tensora maleimida e uma unidade Espaçadora auto-imoladora PAB pode ser preparado de acordo com Dubowchik et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38-5257-60, tendo a estrutura:
Figure img0085
PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-CD79B CISTEÍNA SUBMETIDO À ENGENHARIAS
[635] O ADC da Fórmula I pode ser preparado por várias vias empregando-se reações de química orgânica, condições e reagentes do conhecimento dos versados na técnica, incluindo : (1) reação de um grupo cisteína de um anticorpo cisteína submetido à engenharia com um reagente ligante para formar o intermediário anticorpo-ligante Ab-I, via uma ligação covalente, seguido por reação com uma fração D de fármaco ativada e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fármaco com um reagente ligante, 0para formar o intermediário fármaco-ligante D-L, via uma ligação covalente, seguido por reação com um grupo cisteína de um anticorpo cisteína submetido à engenharia. Métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma série de anticorpos cisteína submetido à engenharias, frações de fármaco, e ligantes para preparar os conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I.
[636] Grupos tiol de anticorpo cisteína são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em reagentes ligantes e intermediários fármaco-ligante incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos e halogenetos de ácido; (ii) halogenetos de alquila e benzila, tais como haloacetamidas, (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida e (iv) dissulfetos, incluindo piridil dissulfetos, via troca de sulfeto. Grupos nucleofílicos em uma fração de fármaco incluem, sem limitação a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato e grupos aril-hidrazida capazes de reagir formando ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes.
[637] Anticorpos cisteína submetido à engenharias podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou cloridrato de (tris(2-carboxietil)fosfina TCEP; Getz et al.,(1999) Anal. Biochem. Vol. 273; 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) seguido por nova oxidação para reformar pontes dissulfeto intercadeias e intracadeia (Exemplo 5). Por exemplo, anticorpos monoclonais cisteína submetido a engenharias de comprimento total (ThioMabs) expressos em células CHO são reduzidos com cerca de um excesso 50 vezes molar de TCEP por 3 horas a 37°C para reduzir pontes dissulfeto em adutos cisteína que podem formar-se entre os resíduos de cisteína recentemente introduzidos e a cisteína presente no meio de cultura. O ThioMab reduzido é diluído e introduzido em uma coluna HiTrap em acetato de sódio 10 mM pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 03, M. Pontes dissulfeto foram reestabelecidas entre resíduos cisteína presentes no Mab original com sulfato de cobre aquoso (200 nM) diluído (CuSO4) a temperatura ambiente, durante a noite. Alternativamente, ácido deidroascórbico (DHAA) é um oxidante eficaz para reestabelecer os grupos dissulfeto intracadeia do anticorpo cisteína submetido à engenharia após clivagem redutiva dos adutos de cisteína. Outros oxidantes, ou seja, agentes de oxidação e condições oxidantes que são do conhecimento da técnica podem ser empregados. A oxidação ao ar ambiente também é eficaz. Esta etapa de reoxidação branda, parcial forma dissulfetos de intracadeia eficientemente com grande fidelidade preservando os grupos tiol dos resíduos de cisteína recentemente introduzidos. Um excesso aproximado de 10 X do intermediário fármaco-ligante por exemplo, MC-vc-PAB-MMAE, foi adicionado, misturado e deixado em repouso por cerca de uma hora a temperatura ambiente para realizar a conjugação e formar o conjugado anticorpo-fármaco anti-CD79b. A mistura de conjugação foi filtrada em gel e introduzida e purificada por uma coluna HiTrap S removendo-se o excesso do intermediário fármaco-ligante e outras impurezas.
[638] A figura 23 mostra o processo genérico para preparar um anticorpo cisteína submetido à engenharia expresso de cultura celular par conjugação. Quando o meio de cultura de célula contém cisteína, os adutos dissulfeto podem formar-se entre o aminoácido cisteína recentemente introduzido e a cisteína do meio de cultura. Esses adutos cisteína, ilustrados como u círculo no ThioMab exemplar (esquerda) da Figura 23, devem ser reduzidos para gerar anticorpos cisteína submetido à engenharias reativados para conjugação. Adutos de cisteína presumivelmente, junto com várias pontes dissulfeto de cadeia intermediária são clivados redutivamente para conferir uma forma reduzida do anticorpo com agentes redutores tais como TCEP. As pontes dissulfeto de cadeia intermediária entre resíduos cisteína emparelhados são reformadas sob oxidação parcial com sulfato de cobre, DHAA, ou exposição ao oxigênio ambiente. Os resíduos de cisteína submetido à engenharias recentemente introduzidos e não pareados permanecem disponíveis para reação com reagentes ligantes ou intermediários fármaco-ligantes formando os conjugados de anticorpo da invenção. O ThoMabs expresso em linhagem de célula de mamífero resulta em duto Cys externamente conjugado a um Cys submetido à engenharia através da formação de ponte -S-S-. Portanto, os ThoMabs purificados são tratados com procedimentos de redução e reoxidação conforme descrito no Exemplo 5 para produzir Thio Mabs reativos. Esses ThioMabs são empregados para conjugação com fármacos citotóxicos contendo maleimida, fluoróforos e outros rótulos.
IMUNOLIPOSSOMAS
[639] Os anticorpos anti-CD79b aqui apresentados também podem ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de múltiplos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos úteis na distribuição de um fármaco para um mamífero. Os componentes do lipossoma são normalmente dispostos em uma formação em bicamada similar à disposição de lipídios das membranas biológicas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos do conhecimento da técnica, como os descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes. Nos. U.S. 4.485.045 e 4,544.545; e WO97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Os lipossomas com tempo de circulação intensificado estão descritos na Patente U.S. No. 5.013.556.
[640] Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido produzindo lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados em lipossomas conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via reação de troca de dissulfeto intermediária. Um agente quimioterapêutico está contido, opcionalmente dentro do lipossoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
B. ALGUNS MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS 1. SELEÇÃO PARA ANTICORPOS ANTI-CD79B COM AS DESEJADAS PROPRIEDADES
[641] Técnicas para gerar anticorpos que se ligam a polipeptídeos CD79b foram descritas acima. Pode-se selecionar ainda anticorpos com algumas características biológicas, conforme desejado.
[642] Os efeitos inibidores do crescimento de um anticorpo anti- CD79b da invenção podem ser avaliados por métodos do conhecimento da técnica, por exemplo, usando-se células que expressam um polipeptídeo CD79b seja, endógeno ou seguindo a transfecção com o gene CD79b. Por exemplo, linhas de célula de tumor apropriadas e células transfectadas com cD79b podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-CD79b da invenção em concentrações variadas por uns poucos dias (por exemplo, 2 a 7) dias e manchadas com cristal violeta ou MTT ou, ainda, analisadas por outro ensaio colorimétrico. Um outro método de se medir a proliferação seria por comparação da absorção de H3-timidina por células tratadas na presença ou ausência de um anticorpo anti-CD79b da invenção. Após o tratamento, as células são colhidas e a quantidade de radioatividade incorporada ao DNA quantificada em um contador de cintilação. Controles positivos adequados incluem o tratamento de uma linha de célula selecionada com um anticorpo inibidor do crescimento conhecido por inibir o crescimento daquela linha de célula. A inibição do crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada de múltiplos modos conhecidos da técnica. A célula de tumor pode ser uma que superexpressa um polipeptídeo CD79b. O anticorpo anti-CD79b irá inibir a proliferação celular de uma célula de tumor expressando CD79b in vitro ou in vivo em cerca de 25 a 100% em comparação com a célula de tumor não tratada, mais preferivelmente em cerca de 30 a 100%, e mesmo mais preferivelmente em cerca de 50 a 100% ou 70 a 100% numa modalidade, a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 03 μg/ml. A inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração do anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição do crescimento é determina de 1 a 10 dias após exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso a administração do anticorpo anti-CD79b a cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo resulte na redução do tamanho do tumor ou redução da proliferação de célula de tumor dentro de cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.
[643] Para selecionar um anticorpo anti-CD79b que induz morte celular, a perda da integridade de membrana conforme indicado, por exemplo, por iodeto de propídio (PI), azul tripano ou absorção de 7AAD pode ser avaliada em relação ao controle. Um ensaio de absorção de PI pode ser realizado na ausência de complemento de células efetoras imune. Células tumorais expressando polipeptídeo Cd79b são incubadas com meio apenas ou meio contendo o apropriado anticorpo anti-CD79b (por exemplo, cerca de 10 μg/ml). As células são incubadas por um período de tempo de 3 dias. Seguinte a cada tratamento as células sal lavada fazendo-se alíquotas em tubos de 12 x 75 firmemente tampados de 35 mm (1ml por tubo, 3 tubos pó grupo de tratamento) para remoção dos grumos de célula. Os tubos então recebem PI (10 μg/ml). As amostras podem ser analisadas usando-se citometria de fluxo FACSCAN® e software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos anti- CD79b que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular como determinado pro absorção de PI podem ser selecionados como anticorpos anti- CD79b indutores de morte celular.
[644] Para selecionar com critério os anticorpos que se ligam a um epítopo e um polipeptídeos Cd79b ligado por um anticorpo de interesse, pode- se realizar um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensaio pode ser usado para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo sítio ou epítopo como um anticorpo anti-CD79b conhecido. Alternativamente, ou além disso, o mapeamento do epítopo pode ser realizado pelo método conhecido na técnica. Por exemplo, a sequência de anticorpo pode ser mutagenizada como por varredura de alanina para identificar resíduos de contato. O anticorpo mutante é inicialmente testado para ligação com o anticorpo policlonal para garantir dobra apropriada. Num método diferente, peptídeos correspondendo a diferentes regiões de um polipeptídeos CD79b podem ser usados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epítopo caracterizado ou conhecido.
2. ALGUNS MÉTODOS DE SELEÇÃO DE BIBLIOTECA
[645] Os anticorpos anti-CD79b da invenção podem ser produzidos por uso de bibliotecas combinatórias para selecionar os anticorpos com a desejada atividade ou atividades. Por exemplo, uma série de métodos são conhecidos na técnica para geração de bibliotecas de visualização de fato e seleção dessas bibliotecas para os anticorpos dotados das desejadas características de ligação. Tais métodos são descritos, geralmente em Hoogenboom et al., (2001) Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), e, em determinadas modalidades, em Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093.
[646] A princípio, os clones de anticorpo sintéticos são selecionados por seleção de bibliotecas de fago contendo o fago que apresenta múltiplos fragmentos da região variável do anticorpo (FV) fundida à proteína capeada com fago. Tais bibliotecas de fago resultam por cromatografia de afinidade contra o desejado antígeno. Os clones expressando fragmentos Fv capazes de ligar-se ao desejado antígeno são adsorvidos ao antígeno, sendo assim separados dos clones de não ligação na biblioteca. Os clones de ligação são então purificados do antígeno e podem ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/purificação do antígeno. Quaisquer anticorpos anti- Cd79b da invenção podem ser obtidos por planejamento de um procedimento de seleção do antígeno adequado a fim de escolher o clone do fago de interesse seguido por construção de um anticorpo anti-CD79b de comprimento total usando as sequências FV do clone de fago de interesse e sequências da região constante adequadas (Fc) descritas em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
[647] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é formado de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, cada um das cadeias leve (VL) e pesada (VH), que apresentam, ambas, três circuitos hipervariáveis (HVRs) ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs). Domínios variáveis podem ser visualizados funcionalmente no fago, seja como fragmentos de cadeia simples (scFV), em que VH e VL são ligadas covalentemente por meio de um peptídeo curto, flexível ou como fragmentos de Fab, em que são cada qual ligados a um domínio constante e interagem não covalentemente, conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994). Conforme aqui empregado, clones de fago codificando scFv e clones de fago codificando Fab são coletivamente referidos como "clones de fago Fv" ou "clones Fv".
[648] Repertórios de genes VH e VL podem ser clonados em separado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago que podem então ser pesquisados para clones de ligação ao antígeno como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (19994). Bibliotecas de fontes imunizadas propiciam anticorpos de alta afinidade ao imunógeno sem requerer hibridomas de construção. Alternativamente, o repertório natural pode ser clonado para dar uma única fonte de anticorpos humanos a uma ampla faixa de auto-antígeno e também de antígenos não autógenos sem qualquer imunização conforme descrito por Griffith set al., EMBO J, 12:7725-734 (1993). Finalmente bibliotecas naturais também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem de segmentos de gene V não rearranjados de células tronco e pelo uso de iniciadores da PCR contendo uma sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e realizar o rearrranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992).
[649] Em algumas modalidades, o fago filamentoso é empregado para visualizar fragmentos de anticorpo por fusão à proteína pII de revestimento secundário. Os fragmentos de anticorpo podem ser visualizados como fragmentos Fv de cadeia simples, em que os domínios VH e VL são ligados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador polipeptídico flexível, por exemplo, como descrito por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) ou como fragmentos Fab em que uma cadeia é fundida a pIII e a outra é secretada no periplasma de célula hospedeira bacteriana, onde o conjunto de uma estrutura proteica revestida de Fab que torna-se visualizada na superfície do fago por deslocamento de algumas proteínas de revestimento do tipo selvagem por exemplo, como descrito em Hoogenboom et al., Nucl. Acids. Res. 19: 4133-4137 (1991).
[650] Em geral, ácido nucleico codificando fragmentos de gene de anticorpo são obtidos de células imune coletadas de humanos ou de animais. Caso se deseje uma biblioteca inclinada a favorecer clones anti-CD79b, o indivíduo é imunizado com CD79b para gerar uma resposta de anticorpo e células do baço e/ou células B circulantes diferentes de linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperados para construção de biblioteca. Numa modalidade preferida, é obtida uma biblioteca de fragmento genético de anticorpo humano inclinada a favorecer os clones anti-CD79b gerando-se uma resposta de anticorpo anti-CD79b em camundongos transgênicos portando uma arranjo genético de imunoglobulina humana funcional (e carecendo de um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional) , de modo que a imunização com CD79b dá origem a anticorpos humanos produtores de células B contra CD79b. A geração de camundongos transgênicos produtores de anticorpo humano está descrita a seguir.
[651] O enriquecimento adicional para populações de célula reativas a anti-CD79b pode ser obtido usando-se um procedimento de seleção criteriosa adequado para isolar células B expressando anticorpo ligado à membrana específica para CD79b, por exemplo, por separação da célula usando-se cromatografia de afinidade a CD79b ou adsorção de células para CD79b rotulado com fluorocromo seguido por classificação de célula ativada por fluxo (FACS).
[652] Alternativamente, o uso de células de baço e/ou células B ou outros PBLs de um doador não imunizado propicia uma melhor representação do possível repertório de anticorpo como também permite a construção de uma biblioteca de anticorpo usando qualquer espécie animal (humano ou não) em que CD79b não é antigênico. Para bibliotecas que incorporam construção de gene de anticorpo in vitro, são coletadas células tronco do indivíduo para obter- se ácidos nucleicos codificando segmentos genéticos do anticorpo não rearranjado. As células imune de interesse podem ser obtidas de uma série de espécies animais, tais como humano, camundongo, rato, lagomorfa, lupino, canino, felino, porcino, bovino, equino e espécies avícolas etc.
[653] Segmentos genéticos variáveis o anticorpo codificando ácido nucleico (incluindo segmentos VH e VL) ao recuperados das células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de gene Vh e Vl rearranjados o desejado DNA pode ser obtido por isolamento de DNA ou mRNA genômico de linfócitos seguido por reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores combinando-se com as extremidades 5'e 3'dos genes Vh e VL rearranjados conforme descrito em Orlandi et al., Proc. Natl. acad. Sci (USA), 86: 3833-3837 (1989), fazendo desse modo, diversos repertórios de gene V para expressão. Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico, com iniciadores traseiros na extremidade 5'o éxon codificando o domínio V maduro e iniciadores dianteiros baseados em um segmento J, conforme descrito em Orlandi et al., (1989) e em Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989). Entretanto, para amplificação de cDNA, os iniciadores traseiros também podem ser baseados no éxon líder conforme descrito em Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991) e iniciadores dianteiros inseridos na região constante conforme descrito em Sastry et al., Proc. Natl. acad. Sci (USA), 86: 5728-5732 (1989). A fim de maximizar a complementaridade, pode-se incorporar degeneração nos iniciadores conforme descrito em Orlandi et al., (1989) ou Sastry et al., (1978). Em algumas modalidades, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo emprego de iniciadores da PCR visados para cada família do gene V de modo a amplificar todos os arranjos VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico de célula imune, por exemplo, como descrito no método de Marrks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991) ou como descrito no método de Orum, et al., Nucleic Acids Res, 1:4491-4498 (1993). Para clonagem do Dna amplificado em vetores de expressão pode-ser introduzir sítios de restrição raros dentro do iniciador da PCR como um identificador em uma extremidade como descrito em Orlandi et al., (1989) ou por amplificação da PCR adicional com um iniciador marcado, conforme descrito em Clackson et al., Nature, 32:624-628 (1991).
[654] Os repertórios de genes V sinteticamente rearranjados podem ser derivados in vitro de segmentos de gene V. A maior parte dos segmentos de gene VH humanos foram clonados e sequenciados (descrito em Tomlinson et al., J. Mol> Bio. 227: 776-798 (1991) e mapeados (descrito em Matsuda et al., Nature Genet, 3: 88-94 (1993); esses segmentos clonados (incluindo todas as conformações principais do laço H1 e H2) podem ser usados para gerar diversos repertórios genéticos VH com iniciadores da PCR codificando laços H3 de sequência e comprimentos diversos como descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). Repertórios Vh também podem ser feitos com toda a diversidade da sequência focada em um laço H3 longo de um único comprimento conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 4457-4461 (1992) Segmentos humanos VK e Vk foram clonados e sequenciados (descrito e Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993) e podem ser empregados para produzir repertórios de cadeia leve sintética. Repertórios de gene V sintéticos com base em uma faixa de dobras Vh e VL, com comprimentos L3 e H3 irão codificar anticorpos de considerável diversidade estrutural. Seguinte à amplificação do gene V codificando DNAs, segmentos de gene V de linha germinativa podem ser rearranjados in vitro de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992).
[655] Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos por combinação de repertórios de gene VH e VL juntos de múltiplos modos. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetores recombinados in vitro por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et al., Gene 128: 119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatorial por exemplo, o sistema loxP descrito em Waterhouse et al., Nucl. acids. Res. 21: 2265-2266 (1993). A abordagem da recombinação in vivo explora a natureza de cadeia dupla dos fragmentos Fab para superar o limite no tamanho da biblioteca imposto por eficiência de transformação de E. coli. Repertórios VH e VL naturais são clonados em separado, um em um fagomídeo e o outro em um vetor de fago. As duas bibliotecas são então combinadas por infecção do fago de bactérias contendo o fagomídeo de modo que cada célula contenha uma diferente combinação e o tamanho da biblioteca seja apenas limitado pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo de modo que os genes VH e VL são recombinados em um único replicon e são enrolados juntos em virions de fago. Essas vastas bibliotecas propiciam grandes números de diversos anticorpos de boa afinidade (Kd-1 de cerca de 10-8M)
[656] Alternativamente, os repertórios podem ser clonados sequencialmente ao mesmo vetor, por exemplo, como descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou reunidos juntos para a PCR sendo a seguir clonados, por exemplo, como descrito em Clakson et al., Nature, 352:624-618 (1991). O conjunto de PCR também pode ser usado para unir DNAs de VH e VL com DNA codificando um espaçador peptídico flexível formando repertórios de uma única cadeia Fv (scFv). Em uma outra técnica ainda, "conjunto da PCR na célula" é empregado para combinar os genes VH e VL dentro de linfócitos por PCR e a seguir os repertórios de clone dos genes ligados, como descrito em Embleton et al., Nucl. Acids Res. 20:3831-3837 (1992).
[657] Os anticorpos produzidos por bibliotecas simples (ou natural ou sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd-1 de cerca de 106 a 107 M1), porém a maturação da afinidade também pode ser imitada in vitro por construção e nova seleção de bibliotecas secundárias conforme descrito em Winter et al., (1994) supra. Por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vitro mediante uso de polimerase sujeita a erro (descrito em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) no método de Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) ou no método de Gram e al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação por afinidade pode ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, usando-se PCR com iniciadores portando sequência aleatória medindo a CDR de interesse, em clones Fv individuais selecionados e exame criterioso para clones de maior afinidade. O WO 9607754 (publicado em 14 de marco de 1996) descreveu um método para induzir metagênese em uma região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeia leve. Uma outra tentativa eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados por apresentação de fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrência natural obtidos de doadores não imunizados e análise criteriosa para maior afinidade em múltiplos turnos de rearranjo de cadeia, conforme descrito em Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades de cerca de 10-9 M ou menos ainda.
[658] O exame criterioso de bibliotecas pode ser realizado por várias técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, CD79b pode ser usado para revestir os poços de placas de adsorção, expressos em células hospedeiras fixadas às placas de adsorção ou usados para classificar e célula, ou conjugados à biotina para captura com microesferas revestidas de estreptavidina ou usados em qualquer outro método para dimensão de bibliotecas de apresentação de fago.
[659] As amostras da biblioteca de fago são contatadas com CD79b imobilizado sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma parte das partícula de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo o pH, resistência iônica, temperatura e similares, são selecionados para imitar as condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e a seguir purificados por ácido por exemplo, conforme descrito em Barbas et al., Proc. natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991) ou por álcali, por exemplo, conforme descrito em Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 582-597 (1991) ou por competição ao antígeno de CD79b, por exemplo, num procedimento semelhante ao método de competição do antígeno de Clakson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecidos 20- 1000 vezes em um único turno de seleção. Além disso, os fagos enriquecidos podem desenvolver-se em cultura bacteriana e ser submetidos a outros turnos de seleção.
[660] A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos de anticorpo em um único fago podem combinar-se simultaneamente com o antígeno. Os anticorpos com cinética de dissociação rápida (e afinidades fracas de ligação) podem ser retidos mediante emprego de curtas lavagens, apresentação multivalente de fago e alta densidade de revestimento do antígeno na fase sólida. A alta densidade não apenas estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas também favorece a religação do fago que se dissociou. A seleção de anticorpos com lenta cinética de dissociação (e boas afinidades de ligação) pode ser promovida mediante emprego de longas lavagens e apresentação monovalente de fago conforme descrito em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) e em WO 92/09690 e uma lenta densidade de revestimento do antígeno conforme descrito em Marks et al., Biotechnol, 10:779783 (1992).
[661] É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que se diferenciam ligeiramente, para CD79b. Contudo, a mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo, conforme realizado em algumas técnicas de maturação por afinidade) tem probabilidade de originar muitos mutantes, a maioria deles de ligação ao antígeno, e uns poucos, com maior afinidade. Com CD79b limitante, raros fagos de alta afinidade poderiam ter competido. A fim de reter todos os mutantes de maior afinidade, os fagos podem ser incubados com excesso de CD79b biotinilado, porém com CD79b biotinilado a uma concentração de molaridade mais baixa do que a afinidade molar alvo constante para CD79b. Os fagos de ligação de alta afinidade podem então ser capturados por microesferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Uma "captura equilibrada" como essa permite aos anticorpos serem selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permita o isolamento dos clones mutantes com afinidade, no mínimo duas vezes mais alta do que um grande excesso de fagos com menor afinidade. As condições empregadas na lavagem de fagos ligados a uma fase sólida também podem ser manipuladas para discriminação com base na cinética de dissociação.
[662] Clones anti-CD79b podem ser selecionados com base na atividade. Em algumas modalidades, a invenção propicia anticorpos anti-CD79b que se ligam a células vivas que expressam CD79b naturalmente. Numa modalidade, a invenção propicia anticorpos anti-CD79b que bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e CD79b, porém não bloqueiam a ligação entre um ligante de CD79b e uma segunda proteína. Clones Fv correspondentes a esses anticorpos anti-CD79b podem ser selecionados por (1) isolamento de clones anti-Cd79b de uma biblioteca de fago, conforme descrito acima, e, opcionalmente amplificação da população isolada de clones de fago pelo desenvolvimento da população em um hospedeiro bacteriano adequado; (2) selecionar CD79b e uma segunda proteína contra os quais se deseja atividade de bloqueio e de não bloqueio, respectivamente; (3) adsorver os clones de fago anti-CD79b para CD79b imobilizado; (4) usar um excesso da segunda proteína para purificar quaisquer clones indesejados que reconhecem determinantes de ligação a CD79b, que sobrepõe-se ou são divididos com determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) purificar os clones que permanecem adsorvidos seguinte a etapa 94). Opcionalmente, os clones com as desejadas propriedades de bloqueio e não bloqueio podem ser ainda enriquecidos por repetição dos procedimentos de seleção aqui descritos, uma ou mais vezes.
[663] DNA codificando anticorpos monoclonais derivados de hibridoma ou clones Fv apresentando fago da invenção é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais, (por exemplo, pelo uso de iniciadores de oligonucleotídeo planejados a amplificar de modo específico as regiões de codificação de cadeia pesada e leve de interesse de matriz de DNA do hibridoma ou fago). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem, de outro modo, proteína imunoglobulina, para obter a síntese dos desejados anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos publicados sobre expressão recombinante em bactérias de DNA codificando anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).
[664] DNA codificando os clones Fv da invenção podem ser combinados com sequências de DNA conhecidas codificando regiões constantes de cadeia pesada e/ou cadeia leve (por exemplo, as sequências de DNA apropriadas podem ser obtidas de Kabat et al., supra) para formar clones codificando cadeias pesadas e/ou leves de comprimento total ou parcial. Será considerado que as regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para este fim, incluindo regiões constantes IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE e que essas regiões constantes podem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal. Um clone Fv derivado de DNA de domínio variável de um animal (como um humano) e a seguir ligado ao DNA de região constante de uma outra espécie animal para formar sequências de codificação para cadeia pesada e/ou leve de comprimento total "híbrida" está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" conforme aqui empregado. Em algumas modalidades, um clone Fv derivado de DNA humano variável é ligado ao DNA de região constante humano formando sequências de codificação para cadeias pesada e/ou leve humanas de comprimento total ou parcial.
[665] DNA codificando o anticorpo anti-CD79b derivado de um hibridoma também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humana, no lugar de sequências de murino homólogas derivadas de clone do hibridoma (por exemplo, como no método de Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81: 6851-6855 (1984). DNA codificando anticorpo ou fragmento derivado de hibridoma ou clone Fv pode ser adicionalmente modificado por ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeos não-imunoglobulina. Deste modo, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" tendo a especificidade de ligação dos anticorpos derivados de clone Fv ou clone de hibridoma da invenção.
C. TERAPIA DE PROFÁRMACO MEDIADA POR ENZIMA DEPENDENTE DE ANTICORPO (ADEPT)
[666] Os anticorpos da presente invenção também podem ser empregados em ADEPT por conjugação do anticorpo a uma enzima ativadora de profármaco que converte um profármaco (por exemplo, um agente peptidil quimioterapêutico, ver WO 81/01145) a um fármaco anticâncer ativo. Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente n° U.S. 4.975.278.
[667] O componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um profármaco de modo tal que o converta em sua forma citotóxica mais ativa.
[668] As enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, sem limitação a fosfatase alcalina útil para converter profármaco contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase úteis na conversão de profármaco contendo sulfato em fármacos livres; desaminase citosina úteis para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anti-câncer, 5-fluoruracil; proteases tais como protease serratia, termoisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), de utilidade na conversão de profármacos contendo peptídeo nos fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis na conversão de profármaco que contenham substituintes D-aminoácido; enzimas de clivagem de carboidrato, tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis na conversão de fármacos glicosilados nos fármacos livres; β-lactamase úteis na conversão de fármacos derivatizados com β-lactamas nos fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis na conversão de fármacos derivatizados em seus nitrogênios amina com fenoxiacetil ou grupo fenilacetila, respectivamente, nos fármacos livres. Alternativamente, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas" podem ser empregados na conversão dos profármaco da invenção nos fármacos ativos livres (ver, por exemplo, Massy Nature, 328: 457-458 (987). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados conforme aqui descrito para distribuição da abzima a uma população de célula de tumor.
[669] As enzimas desta invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-CD79b por técnicas conhecidas na arte técnica como o uso dos reagentes de reticulação hetero-bifuncionais descritos supra. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção ligados a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídos usando técnicas de DNA recombinante do conhecimento na técnica (ver por exemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
D. ANTICORPO ANTI-CD79B
[670] Além dos anticorpos anti-CD79b aqui descritos, considera- se a preparação de variantes do anticorpo anti-CD79b. Variantes de anticorpo anti-CD79b podem ser preparadas por introdução de alterações nucleotídicas apropriadas ao DNA de codificação, e/ou por síntese do desejado anticorpo ou polipeptídeo. Os versados na técnica apreciarão, que alterações de aminoácido podem alterar os processos pós-traducionais do anticorpo anti-CD79b tais como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação ou alteração das características de ancoragem da membrana.
[671] Variações nos anticorpos anti-CD79b aqui descritas podem ser feitas, por exemplo, usando quaisquer técnicas e linhas de referência para mutações conservadoras e não conservadores descritas, por exemplo, na Patente n° U.S. 5.364.934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons codificando o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em uma mudança na sequência de aminoácido quando se compara com o anticorpo ou polipeptídeo da sequência nativa. Opcionalmente, a variação se dá por substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais domínios do anticorpo anti-CD79b. A orientação na determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a desejada atividade pode ser vista por comparação da sequência do anticorpo anti-CD79b com aquela das moléculas de proteína conhecidas homólogas e minimizando o número de alterações na sequência de aminoácido feitas nas regiões de alta homologia. Substituições de aminoácido podem ser o resultado de substituições de um aminoácido com um outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas similares tais como a substituição de uma leucina com uma serina, ou seja, substituições de aminoácido conservadoras. Inserções ou deleções podem, ser, opcionalmente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada por produção sistemática de inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e teste das variantes resultantes para atividade apresentada pela sequência nativa de comprimento total ou madura.
[672] São, por esse intermédio fornecidos fragmentos de anticorpo anti-CD79b. Esses fragmentos podem ser truncados no N-terminal ou C-terminal ou podem carecer de resíduos internos, por exemplo, quando comparado com um anticorpo ou proteína nativa de comprimento total. Alguns fragmentos carecem de resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma desejada atividade biológica do anticorpo anti-CD79b.
[673] Fragmentos do anticorpo anti-CD79b podem ser preparados por qualquer série de técnicas convencionais. Os desejados fragmentos de peptídeo podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de anticorpo ou polipeptídeo por digestão enzimática, por exemplo, por tratamento da proteína com uma enzima conhecida por clivar as proteína nos sítios indicados pelos resíduos de aminoácido particulares, ou por digestão do DNA com enzimas de restrição adequadas, e isolamento do desejado fragmento. Uma outra técnica adequada ainda, envolve isolamento e amplificação de um fragmento de DNA codificando um desejado fragmento de anticorpo ou polipeptídeo, por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os oligonucleotídeos que definem os terminais desejados do fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5'e 3' na PCR. Preferivelmente, fragmentos do anticorpo anti-CD79b dividem pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com o anticorpo anti-CD79b nativo aqui apresentado.
[674] Em modalidades particulares, substituições conservadoras de interesse são mostradas na Tabela 8 sob o título de substituições preferidas. Caso essas substituições resultem em uma alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas substituições exemplificativos na Tabela 8 ou como descrito mais abaixo na referência às classes de aminoácido são introduzidas sendo os produtos examinados. TABELA 8
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[675] Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do anticorpo anti-CD79b são realizadas por substituições seletivas que diferem significativamente em seu efeito de manutenção (a) da estrutura da estrutura central do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral comum. (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, iIe; (2) hidrofílicos neutros: cis, ser, thr, (3) ácidos: asp,glu; (4) básicos: asn, gln, his lys, arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro, e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
[676] Substituições não conservadoras terão como consequência, a substituição de um membro doe uma dessas classes por uma outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição ou, mais preferivelmente, aos sítios remanescentes (não conservados).
[677] As variações podem ser feitas utilizando métodos do conhecimento da técnica como metagênese mediada a oligonucleotídeo (direcionada ao sítio) escaneamento de alanina e metagênese por PCR. A metagênese direcionada o sítio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], metagênese de cassete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], metagênese de seleção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA da variante anticorpo anti-CD79b.
[678] A análise de exploração de aminoácido também pode ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência adjacente. Dentre os aminoácidos explorados preferidos estão aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Esses aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de exploração preferido dentre este grupo porque ele elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável de alterar a conformação da cadeia principal da variante (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Alanina também é tipicamente preferida porque ele é o aminoácido mais comum. Além disso, ele é frequentemente encontrado em posições tanto recobertas, quanto expostas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Caso substituições de alanina não produzam quantidades adequadas da variante pode-se usar um aminoácido isotérico.
[679] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da adequada conformação do anticorpo anti-CD79b também pode ser substituído em geral com serina, a fim de incrementar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticulação aberrante. De modo inverso, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo anti-CD79b para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
[680] Um tipo particularmente preferido de variante substituída envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo de origem (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para mais desenvolvimento terão propriedades biológicas incrementadas em relação ao anticorpo original do qual elas foram geradas. Um modo conveniente para geração dessas variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando apresentação de fago. Em resumo múltiplos sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) sofrem mutação para gerar todas as possíveis substituições amino em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas em um modo monovalente das partículas de fago filamentoso como fusões ao produto III genético de M13 envolvido em cada partícula. As variantes vistas pelo fago são então examinadas quanto a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como aqui descrito. De modo a identificar sítios da região hipervariável candidatos para modificação, pode-se realizar metagênese de exploração de alanina a fim de identificar resíduos da região hipervariável que contribui significativamente para ligação ao antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o polipeptídeo CD79b. Esses resíduos de contato e resíduos adjacentes são candidatos para substituições de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez que essas variantes sejam geradas, o quadro de variantes é submetido ao exame criterioso conforme aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para mais descobertas.
[681] Moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácido do anticorpo anti-CD79b são preparadas por uma série de métodos do conhecimento da técnica. Esses métodos incluem, sem limitação a: isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por metagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada o sítio), metagênese de PCR e metagênese do cassete de uma variante preparada de antemão ou uma versão não-variante do anticorpo anti-CD79b.
E. MODIFICAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B
[682] Modificações covalentes dos anticorpos anti-CD79b estão incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir resíduos de aminoácido alvejados de um anticorpo anti-CD79b com um agente de derivatização orgânico capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos N- ou C- terminais do anticorpo anti-CD79b. A derivatização com agentes bifuncionais é de utilidade, por exemplo, para reticulação do anticorpo anti-CD79b a uma matriz de suporte hidrossolúvel ou superfície para uso no método de purificação dos anticorpos anti-CD79b e vice- versa. Agentes de reticulação de emprego comum, incluem, por exemplo, 1,1- bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azido-salicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dissuccinimidilicos, tais como propionato de 3,3'-ditiobis succinimidila, maleimidas bifuncionais como bis-N-maleimidido-1,8-octano e agentes tais como 3-(para-azidofenil(ditio]propioimidato de metila.
[683] Outras modificações incluem a desamidação de resíduos de glutaminila e asparaginila nos correspondentes resíduos glutamila e aspartila, respectivamente, a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, a metilação dos grupos com cadeias laterais de α-amino de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 7986 (1983)], a acetilação do N-terminal amina e a amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.
[684] Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti- CD79b incluído no escopo desta invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do ant ou polipeptídeos. "alterar o padrão de glicosilação nativo" pretende para os fins a que se destinam deletar uma ou mais frações carboidrato encontradas na sequência nativa de anticorpo anti-CD79b (seja por remoção do sítio de glicosilação subjacente ou por deletar a glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo anti-CD79b de sequência nativa. Além disso, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma mudança na natureza e proporções de várias frações de carboidrato presentes.
[685] A glicosilação dos anticorpos e de outros polipeptídeos se dá tipicamente, ou em ligação a N ou em ligação a O e refere-se à ligação da fração carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da fração carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de, ou essas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligado refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora possa ser também empregados 5-hidroxipropila ou 5-hidroxilisina.
[686] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo anti-CD79b é realizada, de modo conveniente por alteração da sequência de aminoácido de modo que esta contenha uma ou mais sequências de tripeptídeo supracitadas (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feita por adição de, ou substituição por um ou mais resíduo serina ou treonina para a sequência do anticorpo anti-CD79b original (para sítios de glicosilação O- ligados). A sequência de aminoácido de anticorpo anti-CD79b pode ser, opcionalmente alterada por meio de alterações a nível do DNA, particularmente por mutação do DNA codificando o anticorpo anti-CD79b em bases pré- selecionadas tal que os códons sejam gerados, os quais se traduzirão nos desejados aminoácidos.
[687] Um outro meio de aumentar o número de frações de carboidrato no anticorpo anti-CD79b é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo. Esses métodos estão descritos na técnica, por exemplo, em WO 87/05330 published 11 September 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
[688] A remoção das frações carboidrato presentes no anticorpo anti-CD79b pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou por substituição mutacional dos códons que codificam para resíduos de aminoácido que se prestam como alvos para a glicosilação. As técnicas de desglicosilação químicas são conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de frações de carboidrato nos polipeptídeos pode ser realizada mediante emprego de uma série de endo- e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
[689] Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti- CD79b compreende a ligação do anticorpo a um de uma série de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, do modo descrito nas. Patentes Nos. U.S 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. O anticorpo também pode ser encerrado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-metilmetacrilato respectivamente) em sistemas de fornecimento de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesfera e albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são apresntadas em Remington's Pharmaceutica Sciences 16a. edição, Oslo, A., Ed. (1980).
[690] O anticorpo anti-CD79b da presente invenção também pode ser modificado num modo a formar moléculas quiméricas compreendendo um anticorpo anti-CD79b ligado a um outro polipeptídeos heterólogo ou sequência de aminoácido.
[691] Numa modalidade, uma molécula quimérica como essa compreende uma fusão do anticorpo anti-CD79b com um polipeptídeo marcador que propicia um epítopo ao qual pode ser seletivamente ligado um anticorpo anti- marcador. O epítopo marcador é em geral colocado no terminal amino- ou carboxila do anticorpo anti-CD79b. A presença dessas formas de epítopo marcadas do anticorpo anti-CD79b pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo marcador. Ainda, a provisão do epítopo marcador permite ao anticorpo anti-CD79b ser prontamente purificado por purificação de afinidade usando-se um anticorpo anti- marcador ou um outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao epítopo marcador. Múltiplos polipeptídeos marcadores e seus respectivos anticorpos são do conhecimento da técnica. Exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gli); o polipeptídeos marcador flu HA e seu anticorpo 12 CAS5 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os anticorpos dos mesmos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador da glicoproteína D do vírus Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547- 553 (1990)]. Outros polipeptídeos marcadores incluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o peptídeo epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um peptídeo epítopo de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína 10 do gene T7 [Lutz- Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
[692] Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do anticorpo anti-CD79b com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina" (tal como uma fusão poderia ser para a região Fc da molécula IgG. As fusões IG preferivelmente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio de transmembrana deletada ou inativada) de um anticorpo anti-CD79b no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula Ig. Numa modalidade particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui a articulação CH2 e CH3 ou a articulação de regiões CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgG1. Para a produção da fusão de imunoglobulina ver também Patente N° U.S. 5.428.130 concedida em junho de 1995.
F. PREPARAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CD79B
[693] A descrição a seguir refere-se principalmente à produção dos anticorpos anti-cD79b por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b. Naturalmente que, considera-se que os métodos alternativos que se enquadrem no conhecimento da técnica podem ser empregados para preparar anticorpos anti-CD79B. Por exemplo, a sequência de aminoácido apropriada, ou partes deste, pode ser produzida por síntese peptídica direta usando técnicas de fase sólida (ver por exemplo, [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:21492154 (1963)]. A síntese proteica in vitro pode ser realizada usando-se técnicas manuais ou automatizadas. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, usando-se um Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) com instruções do fabricante. Várias partes do anticorpo anti-CD79b podem ser quimicamente sintetizadas em separado e combinadas usando-se métodos enzimáticos químicos para produzir o desejado anticorpo anti-CD79b.
1. ISOLAMENTO DE DNA CODIFICANDO ANTICORPO ANTI-CD79B
[694] DNA codificando anticorpo anti-CD79b pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido tido por ser dotado de mRNA de anticorpo anti-CD79b e expressá-lo a um nível detectável. Portanto, DNA de anticorpo anti-CD79b humano pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido humano. o gene codificando o anticorpo anti-CD79b pode também ser obtido de uma biblioteca genômico ou por procedimentos sintéticos conhecidos, (por exemplo, síntese de ácido nucleico automatizada).
[695] As bibliotecas podem ser examinadas com sondas genéticas (como oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20 a 80 bases) planejadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. A seleção do cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser realizada usando-se procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Uma alternativa para se isolar o gene codificando o anticorpo anti-CD79b seria o uso de metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
[696] As técnicas para exame de uma biblioteca de cDNA são do conhecimento da técnica. As sequências de oligonucleotídeo selecionados como sondas genéticas devem ser de comprimento suficiente e com credibilidade suficiente para que, os falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferivelmente rotulado de modo que ele possa ser detectado com a hibridização ao DNA na biblioteca sendo examinada com rigor. Métodos de rotulação são do conhecimento da técnica, e incluem o uso de radio-rótulos como ATP P32-rotulado, biotinilação ou rotulação enzimática. Condições de hibridização, incluindo rigidez moderada e alta rigidez são proporcionados em Sambrook et al., supra.
[697] As sequências identificadas nesses métodos de análise meticulosa podem ser comparadas e alinhadas a outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicos como em GenBank ou outras bases de dados de sequência privada. A identidade da sequência (a nível, tanto de aminoácido como de nucleotídeo) dentro das regiões definidas da molécula ou pela sequência de comprimento total pode ser determinada usando- se métodos do conhecimento da técnica e como aqui descrito.
[698] O ácido nucleico tendo a sequência de codificação pode ser obtido por análise meticulosa de bibliotecas de cDNA ou genômica selecionadas usando-se a sequência de aminoácido deduzida aqui apresentada pela primeira vez, e, caso necessário usando-se procedimentos de extensão de iniciador convencional como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de mRNA que podem não ter sido elaborados por transcrição reversa ao cDNA.
2. SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[699] As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem aqui descritos para produção de anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformante, ou amplificar os genes codificando as desejadas sequências. As condições de cultura, tais como meio, temperatura, pH e similar, podem ser selecionadas pelo versado na técnica, sem experimentação indevida. Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células podem ser vistas em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra.
[700] Os métodos de transfecção de célula eucarionte e transformação de célula procarionte significando introdução do DNA ao hospedeiro de modo que o DNA seja replicável, seja como um extracromossomo ou por integrante cromossomal, são do conhecimento da técnica, por exemplo, CaCl2, CaPO4, mediado por lipossoma, polietileno glicol/DMSO e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando- se técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito me Sambrook et al., supra, ou eletroporação é em geral usado para procariontes. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de algumas células de planta, conforme descrito por Shaw et al. Gene, 23:315 (1983) e WO 89/08859, publicado em 29 de junho de 1980. Para células de mamífero, sem essas paredes celulares, o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham and van der Eb Virology, 52: 456-467 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de transfecções de sistema hospedeiro de célula de mamífero foram descritos na Patente U.S. n° 4.399.316. A transformação em levedura é tipicamente realizada de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para introdução do dNA às células como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriana, com células intatas, ou poli-cátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, também podem ser empregados. Para várias técnicas de transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
[701] Células hospedeira adequadas para clonagem ou expressão do DNA aos vetores presentes incluem células procariontes, levedura ou eucariontes superiores. A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES
[702] Procariontes adequados incluem, sem limitação às arquebactérias e eubactérias tais como organismos gram-negativos ou gram- positivos, por exemplo, Enterobacteriaceas, como E. coli. Várias cepas de E. coli são publicamente disponíveis, como E. coli cepa K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procariontes adequadas incluem, Enterobacteriaceae tais como: Escherichia, por exemplo., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P revelada em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces. Esses exemplos são ilustrativos sem ser limitantes. A cepa W3110 é um hospedeiro particularmente preferido, ou hospedeiro original, porque ela é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante. Preferivelmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, por exemplo, a cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposito No. 27,325) pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo exemplos de tais hospedeiros, inclusive: E. coli W3110 cepa 1A2, que tem o genótipo completo tonA ; E. coli W3110 cepa 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55,244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; E. coli W3110 cepa 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 cepa 40B4, que se trata da cepa 37D6 com uma mutação de deleção degP não resistente a canamicina; E. coli W3110 cepa 33D3 com o genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (U.S. Pat. No. 5,639,635) e uma cepa de E. coli com protease periplásmática mutante revelada na Patente No. U.S. 4.946.783 concedida em 7 de agosto de 1990. Outras cepas e seus derivados tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliX 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308(ATCC 31,608) também são adequadas. Esses exemplos são ilustrativos e não limitantes da invenção. Métodos para construção de derivados de quaisquer dessas bactérias supracitadas com genótipos definidos são do conhecimento da técnica estando descritos, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Faz-se geralmente necessário selecionar a bactéria apropriada levando-se em conta a capacidade de replicação do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, E. coli, espécies Serratia ou Salmonella podem ser adequadamente empregadas como o hospedeiro, quando plasmídeos bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease adicionais podem ser incorporados convenientemente, na cultura celular. Alternativamente, métodos in vitro de clonagem, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico são adequados.
[703] Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpo e proteínas de fusão ao anticorpo podem ser produzidos nas bactérias, particularmente, quando não são necessários a glicosilação e função efetora Fc, como quando o anticorpo terapêutico é conjugado em um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por ele próprio mostra eficácia na destruição de célula de tumor. Anticorpos de comprimento total têm meia-vida maior em circulação. A produção de E. coli é mais rápida e menos onerosa. Para expressão dos fragmentos de anticorpo e polipeptídeos nas bactérias, ver, por exemplo, U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), e U.S. 5,840,523 (Simmons et al.), que descrevem a região de iniciação de tradução (TIR) e sequências sinalizadoras para expressão otimizada e secreção, sendo essas patentes ora incorporadas por referência. Após a expressão o anticorpo é isolado da pasta de célula de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado por meio de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G, dependendo do isótipo. A purificação final pode ser feita similarmente ao processo para purificação de anticorpo expresso por exemplo, em células de CHO. B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIONTES
[704] Além dos procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação do anticorpo anti-CD79b. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucarionte inferior comumente empregado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicado em 2 de maio de 1985); hospedeiro Kluyveromyces (U.S. Patent No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como por exemplo, Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos, tal como por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como: A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotrópicas são aqui adequadas incluindo, sem limitação: a, levedura capaz de crescer em metanol selecionadas do gênero consistindo em: Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma relação de espécies específicas exemplificativos desta classe de leveduras pode ser vista em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[705] Células hospedeiras adequadas para expressão do anticorpo anti-CD79b glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de inseto, como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, como culturas de célula de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco. Numerosas cepas baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivos correspondentes de hospedeiros foram identificadas, tais como: Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), and Bombyx mori. Uma série de cepas virais para transfecção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV e vírus tais podem ser empregados como os vírus presentes de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[706] Contudo, o maior interesse consistiu em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por V40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster recém- nascido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco African green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34);células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de murino (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[707] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem supracitados para produção do anticorpo anti-CD79b e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme adequado, para induzir promotores, seleção de transformantes, ou amplificação de genes codificando as desejadas sequências.
3. SELEÇÃO E USO DE UM VETOR DE REPLICAÇÃO
[708] Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, o ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou Dna genômico) codificando o mesmo e isolado e inserido em um vetor de replicação para ulterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificando o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo capazes de ligar-se especificamente aos genes codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte, da célula hospedeira usada. Em geral, células hospedeiras preferidas são de origem, ou procarionte ou eucarionte (geralmente de mamífero).
[709] O vetor, pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida ao vetor por uma série de procedimentos. Em geral o DNA é inserido em um adequado sítio de endonuclease de restrição usando técnicas conhecidas nesse campo. Componentes de vetor incluem em geral, sem limitação, a um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção dos vetores adequados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas aos versados na técnica.
[710] O CD79b pode ser produzido de modo recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeos de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou ele pode ser uma parte do DNA codificando anticorpo anti-CD79b o qual é inserido ao vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo de fosfatases alcalinas, penicilinase, lpp, ou sequência líder de enterotoxina II termoestável. Para secreção de levedura a sequência de sinal pode ser por exemplo, a líder levedura invertase, líder fator alfa (incluindo sequências líderes fator-2 de Saccharomyces e Kluyveromyces, sendo a última descrita na Patente No. U.S 5,010,182), ou líder fosfatase ácida, a líder glicoamilase de C. albicans (EP 362,179 publicada em 4 de abril de 1990), ou a sequência de sinal descrita em WO 90/13646, publicada em 15 de novembro de 1990. Na expressão de célula de mamífero, as sequências de sinal de mamífero podem ser usadas para direcionar secreção da proteína, tal como sequência de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou de espécie relacionada, bem como sequência líderes secretoras virais. A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES
[711] Sequências de polinucleotídeo codificando componentes de polipeptídeo do anticorpo da invenção podem ser obtidas usando-se técnicas recombinantes padrão. As sequências de polinucleotídeo desejadas podem ser isoladas e sequenciadas de células produtoras de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas da PCR. Uma vez obtidas, as sequências codificando os polipeptídeos são inseridas ao vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procariontes. Muitos vetores disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para as finalidades da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos que irão ser inseridos ao vetor e da célula hospedeira particular que irá ser transformada com o vetor. Cada vetor contém múltiplos componentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que ele reside.
[712] Em geral, vetores de plasmídeo contendo o replicon e sequências de controle derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados juntamente com esses hospedeiros. Ambos os vetores de expressão e de clonagem contém uma sequência de ácido nucleico que permite ao vetor replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas, bem como sequências marcadoras que são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Essas sequências são do conhecimento para uma gama de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322, o qual contém genes codificando resistência a ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) fornecendo assim meios fáceis para identificar células transformadas, é adequado para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamífero, pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago também podem conter ou ser modificados para conter, promotores os quais podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 usados para expressão de anticorpos particulares estão descritos em detalhes em Carter et al., na Patente n° U.S. 5.648.237.
[713] Além disso, vetores de fago contendo replicon e sequências de controle compatíveis com os microrganismos hospedeiros podem ser usados como vetores transformantes em conexão com esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal como XGEM.TM-11 pode ser usado para produzir um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.
[714] O vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares promotor-cístron codificando cada um dos componentes de polipeptídeo. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a jusante 5' de um cístron que modula sua expressão. Promotores procariontes tipicamente, enquadram-se em duas classes, indutivas e constitutivas. O promotor induzível é um promotor que inicia os níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle, em respostas a alterações nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura.
[715] Um grande número de promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode ser ligado operavelmente ao DNA cístron codificando a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor do DNA de origem via digestão com enzima de restrição e inserção da sequência de promotor isolada ao vetor da invenção. Tanto a sequência do promotor nativa e muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a amplificação e/ou expressão dos genes alvos. Em algumas modalidades, os promotores heterólogos são utilizados como eles, em geral, permitem maior transcrição e maiores rendimentos do gene alvo expressão, quando se compara com o promotor de polipeptídeo alvo nativo.
[716] Promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são do conhecimento da técnica. Promotores adequados para uso com hospedeiros procariontes incluem o promotor PhoA, o β- galactamase e sistemas de promotor de lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] e promotores híbridos tais como, o tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] ou o promotor trc. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência Shine Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA codificando o anticorpo anti-CD79b. Contudo, outros promotores que são funcionais em bactérias (como outros promotores bacterianos ou de fato conhecidos) são adequados também. Suas sequências de nucleotídeo foram publicadas, permitindo, portanto, a um operador versado ligá-los operavelmente ao cístron codificando as cadeias alvo leve e pesada (Siebenlist et al., (1980) Cell 20:269) usando ligantes ou adaptadores para suprir quaisquer sítios de restrição exigidos.
[717] Em um aspecto da invenção cada cístron dentro do vetor recombinante compreende um componente da sequência de sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos por toda a membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou ela pode ser uma parte do DNA de polipeptídeo alvo, que é inserido ao vetor. A sequência de sinal selecionada para fins desta invenção, deve ser uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procarionte selecionada por exemplo, do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes enterotoxina II termoestáveis (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA e MBP. Numa modalidade, da invenção, as sequências de sinal empregadas em ambos os cístrons do sistema de expressão são sequências de sinal STII ou suas variantes.
[718] Num outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não necessitam da presença de sequências de sinal de secreção dentro de cada cístron. Neste aspecto, cadeias leve e pesada de imunoglobulina são expressas, dobradas e combinadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Algumas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas de E. coli trxB) propiciam condições citoplasmáticas favoráveis para formação de ponte dissulfeto, permitindo assim adequado dobramento e montagem das subunidades de proteína expressas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[719] A presente invenção obtém um sistema de expressão em que a relação quantitativa dos componentes do polipeptídeo expressos pode ser modulada de modo a maximizar o rendimento dos anticorpos adequadamente secretados e combinados da invenção. Uma tal modulação é realizada pelo menos em parte, por intensidades traducionais na modulação simultânea para os componentes de polipeptídeo.
[720] Uma técnica para modular a intensidade traducional está apresentada em Simmons et al., na Patente n° U.S. 5.840.523. Ela utiliza variantes da região de iniciação traducional (TIR) dentro de um cístron. Para uma dada TIR, uma série de variantes de sequência de aminoácido ou ácido nucleico pode ser criada com uma faixa de intensidades traducionais, propiciando assim um meio conveniente pelo qual, se ajusta este fator para o desejado nível de expressão da cadeia específica. Variantes TIR podem ser geradas pro técnicas de metagênese convencionais que resultam em alterações do códon que podem alterar a sequência de aminoácido, embora alterações silenciosas na sequência de nucleotídeo sejam preferidas. Alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento de sequências Shine-Delgarno juntamente com alterações na sequência de sinal. Um método para gerar sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de códon" no início de uma sequência de codificação que não altera a sequência de aminoácido da sequência de sinal, (ou seja, as alterações são mudas). Pode-se realizar isto por aliteração da terceira posição do nucleotídeo de cada códon; adicionalmente alguns aminoácidos tais como leucina, serina, e arginina, têm múltiplas primeira e segunda posições, que podem adicionar complexidade na composição do banco. Este método de metagênese está descrito em detalhe em Yansura et al., (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol 4: 151-158.
[721] Preferivelmente, um conjunto de vetores é gerado com uma faixa de intensidades TIR para cada cístron. Este conjunto limitado propicia uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia, bem como o rendimento dos desejados produtos de anticorpo sob várias combinações de intensidade TIR. Intensidades TIR podem ser determinadas quantificando-se o nível de expressão de um gene repórter conforme descrito em detalhes em Simmons et al., Patente n° U.S. 5.840.523. Com base na comparação da intensidade traducional, as desejadas TIRs individuais são selecionadas para combinação nos construtores do vetor de expressão da invenção. B. CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIONTES
[722] Os componentes de vetor em geral, incluem, sem limitação a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. (1) COMPONENTE DA SEQUÊNCIA DE SlNAL
[723] Um vetor para emprego em uma célula hospedeira eucarionte também pode conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada preferivelmente, é uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão de célula de mamífero, as sequências de sinal de mamífero, bem como as sequências líderes secretoras virais, por exemplo, a de sinal gD herpes simples, estão disponíveis.
[724] O DNA para essa região precursora está ligado em quadro de leitura ao DNA codificando o anticorpo. (2) ORIGEM DE REPLICAÇÃO
[725] Em geral, um componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem SV40 pode ser usada, tipicamente apenas porque contém o promotor primário. (3) COMPONENTE DO GENE DE SELEÇÃO
[726] Vetores de expressão e clonagem conterão, tipicamente um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteína que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis do meio complexo, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli.
[727] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. AS células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e por isso, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[728] Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para absorção do ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b, tal como DHFR ou timidina quinase, metalotionein-1 e -II, preferivelmente genes metalotioneina de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase etc. Uma célula hospedeira apropriada quando se emprega DHFR tipo selvagem é a linhagem de célula CHO em atividade dHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096) preparado e propagado conforme descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:4216 (1989). por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DHFR são primeiramente identificadas por cultura de todos os transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx) um antagonista competitivo de DHFR. Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem contendo DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA codificando um anticorpo, proteína DHFR tipo selvagem, e um outro marcador selecionável com aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionados por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418, ver a Patente n° U.S. 4.965.199.
[729] Um gene de seleção adequado para emprego em leveduras é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trp1 propicia um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura carecendo da capacidade de desenvolver-se em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. (4) COMPONENTE PROMOTOR
[730] Vetores de expressão e clonagem contém normalmente um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD79b para dirigir a síntese de mRNA. Os promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos.
[731] Genes virtualmente aleucarióticos, tem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde é iniciada a transcrição. Uma outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da extremidade poli A para a extremidade 3'da sequência de codificação. Todas essas sequências são adequadamente inseridas aos vetores de expressão eucariontes.
[732] Exemplos de sequências promotoras adequadas para emprego com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3- fosfoglicerato quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.
[733] Outros promotores de levedura que são promotores indutivos com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento são as regiões do promotor para desidrogenase alcoólica , isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para emprego na expressão de levedura então descritos ainda em EP 73.657.
[734] A transcrição do anticorpo anti-CD79b de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, pro promotores obtidos dos genomas de vírus tais como vírus polioma, vírus de bexiga das aves (UK 2.211.204, publicado em 5 de julho de 1989) adenovírus (ta; como Adenovírus 2), vírus de papiloma de bovino, vírus de sarcoma avícola, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e vírus de símio (SV40) de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que, esses promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
[735] Os promotores primitivos e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor primário imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus de papiloma bovino como um vetor, está apresentado na Patente n° U.S. 4.419.446. Uma modificado desta sistema está descrita na Patente no U.S. 4.601.978. Ver também Reyes etal., Nature, 297:598-601 (1982) na expressão de cDNA de β-interferon humano em células de murídeo sob o controle do promotor timidina quinase de vírus de herpes simples. Alternativamente a repetição terminal longa do Vírus de Sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. (5) COMPONENTE DO ELEMENTO INTENSIFICADOR
[736] A transcrição de um DNA codificando o anticorpo anti- CD79b pro eucariontes superiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência intensificadora ao vetor. Intensificadores são elementos de atuação - cis do DNA., normalmente de cerca de 10 a 300 pb (pares de base) que atuam em um promotor, para aumentar sua transcrição. Muitas sequências intensificadores são conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, pode-se empregar um intensificador de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o intensificador SV40 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270) o intensificador de promotor primitivo de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) em elementos intensificadores para ativação de promotores eucariontes. O intensificador pode ser dividido no vetor a uma posição 5'ou 3' para a sequência de codificação do anticorpo anti-CD79b, porém está de preferência localizado no sítio 5'do promotor. (6) COMPONENTE DE TERMINAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO
[737] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucariontes (levedura, fungos, inseto, plantas animais, humanos ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão ainda, sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Essas sequências estão normalmente disponíveis de regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3' de DNAs ou cDNAs eucariontes ou virais. Essas regiões contém segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos de poliadenilação na parte não traduzida do mRNA codificando o anticorpo anti-CD79b. Um componente útil de terminação da transcrição é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Ver WO94/11026 e o vetor de expressão aí apresentado.
[738] Outros métodos, vetores e células hospedeiras adicionais adequados para adaptação à síntese do anticorpo anti-CD79b em cultura de célula de vertebrado recombinante estão descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058. 4. CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[739] As células hospedeiras usadas na produção do anticorpo anti-CD79b desta invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIONTES
[740] As células procariontes usadas na produção dos polipeptídeos da invenção são cultivadas em meio conhecido na técnica adequado para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meio adequado inclui caldo luria (LB) mais suplementos nutrientes necessários. Em algumas modalidades, o meio contém ainda um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, a fim de permitir, seletivamente, o crescimento de células procariontes contendo o vetor de expressão. Por exemplo, é adicionado ampicilina ao meio para crescimento de células expressando o gene resistente par ampicilina.
[741] Quaisquer suplementos necessários, além de carbono, nitrogênio e fontes de fosfato inorgânico podem ser incluídos também, a concentrações adequadas introduzidos separadamente, ou como uma mistura com um outro suplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados do grupo consistindo em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
[742] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em temperaturas apropriadas. Para cultura de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida está na faixa de cerca de 20°C a cerca de 39°C, mais de preferência de cerca de 25°C a cerca de 37°C, mais ainda de preferência a cerca de 30°C. o pH do meio pode ser qualquer pH na faixa de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é de preferência de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, e mais de preferência cerca de 7,0.
[743] Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão da invenção, a expressão de proteína é induzida sob condições apropriadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da invenção, os promotores PhoA são usados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio limitante de fosfato para indução. De preferência, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P (ver, por exemplo, Simmons et al., J. Immunol. Métodos (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregado, como é conhecido na técnica.
[744] Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados dentro e recuperados do periplasma de células hospedeiras. A recuperação de proteína tipicamente envolve romper o microrganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células são rompidas, resíduos de células ou células totais podem ser removidas por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser ainda purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas em um meio de cultura e isoladas no mesmo. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante de cultura sendo filtrado e concentrado para outra purificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser ainda isolados e identificados usando métodos comumente conhecidos tal como eletroforese de gel poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.
[745] Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpos é conduzida em uma grande quantidade por um processo de fermentação. Múltiplos procedimentos de fermentação em bateladas alimentadas em grande escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Fermentações em grande escala têm pelo menos 1.000 litros de capacidade, de preferência cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam impelidores agitadores para distribuir o oxigênio e os nutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono/energia preferida). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que é não mais do que aproximadamente 100 litros em capacidade volumétrica, e pode estar na faixa de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
[746] Em um processo de fermentação, a indução de expressão de proteína é tipicamente iniciada após as células serem cultivadas nas condições apropriadas em uma densidade desejada, por exemplo, um OD550 de cerca de 180-220, estágio em que as células estão na fase estacionária inicial. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com a construção de vetor empregada, como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas durante períodos mais curtos antes da indução. As células são geralmente induzidas durante cerca de 12 a 50 horas, embora tempos de indução mais longos ou mais curtos possam ser usados.
[747] Para aperfeiçoar o rendimento de produção e qualidade dos polipeptídeos da invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para aperfeiçoar a montagem e duplicação apropriadas dos polipeptídeos de anticorpos secretados, proteínas protetoras superexpressando vetores adicionais, tal como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis,trans-isomerase com atividade protetora) podem ser usadas para co-transformar as células procarióticas hospedeiras. As proteínas protetoras são demonstradas para facilitar a duplicação solubilidade apropriadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., patente U.S. No. 6.083.715; Georgiou et al., patente U.S. No. 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
[748] Para minimizar proteólise de proteínas heterólogas de expressão (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas cepas hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, cepas de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes codificando proteases bacterianas conhecidas tal como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações das mesmas. Algumas cepas deficientes de protease em E. coli estão disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., patente U.S. No. 5.264.365; Georgiou et al., patente U.S. No. 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
[749] Em uma modalidade, cepas de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos superexpressando uma ou mais proteínas protetoras são usadas como células hospedeiras em um sistema de expressão da invenção. B. CÉLULAS EUCARIÓTICAS HOSPEDEIRAS
[750] Meios comercialmente disponíveis tal como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential meio ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio Eagle Modificado com Dulbecco ((DMEM), Sigma) são apropriados para cultivar células hospedeiras. Além disso, quaisquer meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes U.S. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tal como adenosina e timidina), antibióticos (tal como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais em uma faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que poderão ser conhecidas dos versados na técnica. As condições de cultura, tal como temperatura, pH, e outros, são as previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente a um versado na técnica.
5. AMPLIFICAÇÃO/EXPRESSÃO DO GENE DE DETECÇÃO
[751] A amplificação e/ou expressão de gene pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada, baseada nas sequências aqui fornecidas. Alternativamente, os anticorpos podem ser empregados que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de DNA, duplexes de RNA e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de DNA- proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser rotulados e o ensaio pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de modo que na formação do duplex sobre a superfície, a presença de anticorpo ligado a um duplex pode ser detectada.
[752] Alternativamente, a expressão de gene pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imuno-histoquímica de células ou seções de tecidos e ensaio de cultura de célula de fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto de gene. Anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser tanto monoclonais como policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo de CD79b de sequência nativa ou contra um peptídeo sintético baseado nas sequências de DNA presentemente fornecidas ou contra sequência exógena fundida a DNA de CD79b e codificando um epítopo de anticorpo específico
6. PURIFICAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-CD79B
[753] As formas do anticorpo anti-CD79b podem ser recuperadas do meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se ligado à membrana, e pode ser liberado de uma membrana usando a solução detergente apropriada (por exemplo Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. Células empregadas na expressão do anticorpo anti-CD79b podem ser rompidas por múltiplos meios físicos ou químicos, tal como ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou agentes de lise de células.
[754] Pode ser desejado purificar o anticorpo anti-CD79b de proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação apropriados por fracionamento ou uma coluna de troca iônica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromato focalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; filtração de gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de Sepharose proteína A para remover contaminantes tal como IgG; e colunas quelantes de metal para ligar formar marcadas de epítopos do anticorpo anti- CD79b. Múltiplos métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos por exemplo in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionadas dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do anticorpo anti-CD79b particular produzido.
[755] Quando se usa técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, em um espaço periplásmico ou diretamente secretado em um meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, o resíduo particulado, tanto células hospedeiras como fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para um espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min. O resíduo de células pode ser removido por centrifugação. Quando o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiramente concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes casuais
[756] A composição do anticorpo preparada das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese de gel, diálise, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade sendo uma técnica de purificação. A adequabilidade da proteína A como um ligante de afinidade depende de espécies e isótipos de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas de Y1 , Y2 ou cadeias leves de Y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para Y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é fixado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tal como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que podem ser obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tal como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, cromatografia HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE™ cromatografia sobre uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como a coluna de ácido poliaspártico), cromato focalização, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[757] Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo e contaminantes de interesse pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo usando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizada em concentrações com baixo teor de sal, (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal).
G. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[758] Os conjugados anticorpo-droga (ADC) da invenção podem ser administrados por qualquer via apropriada em uma condição a ser tratada. O ADC será tipicamente administrado parenteralmente, isto é infusão, subcutâneo, intramuscular, intravenosa, intradérmica intratecal e epidural.
[759] Para tratar estes cânceres, em uma modalidade, o conjugado anticorpo-droga é administrado por infusão intravenosa. A dosagem administrada por infusão está em uma faixa de cerca de 1 μg/m2 a cerca de 10.000 μg/m2 por dose, geralmente uma dose por semana para um total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, a faixa de dosagem é cerca de 1 μg/m2 a cerca de 1000 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 ao cerca de 800 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 a cerca de 600 μg/m2, cerca de 1 μg/m2 a cerca de 400 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 500 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 300 μg/m2, cerca de 10 μg/m2 a cerca de 200 μg/m2, e cerca de 1 μg/m2 a cerca de 200 μg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, tempos múltiplos por semana, mas menos do que uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para suavizar ou aliviar os sintomas da doença. A administração por continuar em qualquer um dos intervalos descritos até a remissão do tumor ou sintomas do linfoma, leucemia senso tratados. A administração pode continuar até remissão ou mitigação dos sintomas ser obtida onde tal remissão ou mitigação é prolongado por tal administração continuada.
[760] A invenção também fornece um método de aliviar uma doença autoimune, compreendendo administrar a um paciente sofrendo de uma doença autoimune, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado anticorpo MA79b-droga humanizado de qualquer uma das modalidades precedentes. Nas modalidades preferidas, o anticorpo é administrado intravenosamente ou subcutaneamente. O conjugado anticorpo-droga é administrado intravenosamente em uma dosagem na faixa de cerca de 1 μg/m2 ao cerca de 100 mg/ m2 por dose e em uma modalidade específica, a dosagem é 1 μg/m2 a cerca de 500 μg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, templos múltiplos por semana, mas menos do que uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos de uma vez por dia, tempos múltiplos por mês, mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para suavizar ou aliviar os sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer um dos intervalos descritos até mitigação ou alívio de sintomas de doença autoimune sendo tratada. A administração pode continuar após mitigação de ou alívio de sintomas ser obtida, onde tal alívio ou mitigação é prolongada por tal administração continuada.
[761] A invenção também fornece um método de tratar um distúrbio de células B compreendendo administrar a um paciente sofrendo de um distúrbio de células B, tal como um distúrbio proliferativo de células B (incluindo sem limitação linfoma e leucemia) ou uma doença autoimune, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo MA79b humanizado de qualquer uma das modalidades precedentes, cujo anticorpo não é conjugado a uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente administrado em uma faixa de dosagem de cerca de 1 μg/m2 ao cerca de 1000 mg/m2.
[762] Em um aspecto, a invenção fornece ainda formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção e/ou pelo menos um imunoconjugado do mesmo e/ou pelo menos um anticorpo conjugado anti-CD79b-droga da invenção. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo, e (2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende (1) um anticorpo da invenção e/ou um imunoconjugado do mesmo e, opcionalmente, (2) pelo menos um agente terapêutico adicional. Os agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não estão limitados aos descritos abaixo. O ADC tipicamente será administrado parenteralmente, isto é infusão, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intradérmico, intratecal e epidural.
[763] Formulações terapêuticas compreendendo um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado CD79b usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem misturando o anticorpo ou imunoconjugado, tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), em uma forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tal como acetato, Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzotônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; tonificantes tal como trealose e cloreto de sódio; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensoativo tal como polissorbato; contraíons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína complexes); e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[764] As presentes formulações também podem conter mais do que um composto ativo, como necessário, para uma indicação particular sendo tratada, de preferência as com atividades complementares que não afetam adversamente um à outra. Por exemplo, além de um anticorpo anti-CD79b, pode ser desejável incluir em uma formulação um anticorpo adicional, por exemplo, um segundo anticorpo anti-CD79b que liga um epítopo diferente sobre o polipeptídeo de CF79b., ou um anticorpo em alguma outra marcação tal como um fator de crescimento que afeta o crescimento do câncer particular. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode ainda compreender um agente quimioterápico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor de crescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotetor. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
[765] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[766] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou álcool poli (vinílico))), polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e Y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico- ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Polímeros brancos tal como acetato de etileno-vinila e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas durante 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo durante um longo período, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis trocas em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo e agregação é a formação S-S intermolecular através da troca de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida modificando-se os resíduos de sulfidrila obtidos, liofilizando soluções acídicas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.
[767] Um anticorpo pode ser formulado em qualquer forma apropriada para liberar a um célula/tecido de marcação. Por exemplo, os anticorpos podem ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composto de múltiplos tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para liberação de uma droga a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente dispostos em uma formação em bicamada, similar a uma disposição de lipídeos de membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e WO97/38731 publicado em 23 de outubro de1997. Lipossomas com tempo de circulação melhorado são descritos na patente US No. 5.013.556.
[768] Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por um método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para dar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados a um lipossoma como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterápico está opcionalmente contido dentro do lipossoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
[769] As formulações a serem usadas para administração in vivo precisam ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através das membranas de filtração estéril.
H. TRATAMENTO COM ANTICORPO ANTI-CD79BS
[770] Para determinar a expressão de CD79b em um câncer, múltiplos ensaios de detecção estão disponíveis. Em uma modalidade, a superexpressão do polipeptídeo de CD79b pode ser analisada por imuno- histoquímica (IHC). Seções de tecido de uma biopsia de tumor embutidas em parafina podem ser submetidas ao ensaio IHC e concederam um critério de intensidade de coloração da proteína CD79b como a seguir: Classificação 0 - nenhuma coloração é observada ou a coloração da membrana é observada em menos do que 10% das células de tumor. Classificação 1+ - uma coloração de membrana pálida/claramente perceptível é detectada em mais do que 10% das células de tumor. As células são somente coloridas em parte de suas membranas. Classificação 2+ - uma coloração de membrana completa fraca a moderada é observada em mais do que 10% das células de tumor. Classificação 3+ - uma coloração complete forte a moderada é observada em mais do que 10% das células de tumor.
[771] Os tumores com classificações 0 ou 1+ para expressão do polipeptídeo CD79b podem ser caracterizados como não superexpressando CD79b, enquanto os tumores com classificações 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando CD79b.
[772] Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios FISH tal como o INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido de tumor embutido em parafina, fixado com formalina para determinar a extensão (se qualquer) da superexpressão de CD79b em um tumor.
[773] A superexpressão ou amplificação de CD79b pode ser avaliada usando ensaio de detecção in vivo, por exemplo, administrando uma molécula (tal como um anticorpo) que liga a molécula a ser detectada e é etiquetada com um rótulo detectável (por exemplo, um isótopo radioativo ou um rótulo fluorescente) e escaneando o paciente externamente para localização do rótulo.
[774] Como descrito acima, o anticorpo anti-CD79bs da invenção tem várias aplicações não-terapêuticas. O anticorpo anti-CD79bs da presente invenção pode ser útil para escalação de cânceres expressando o polipeptídeo de CD79b (por exemplo, em rádio formação de imagem). Os anticorpos são também úteis para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células, para detecção e quantificação de polipeptídeo de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot, para exterminar ou eliminar células expressando CD79b da população de células misturadas como uma etapa em uma purificação de outras células.
[775] Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento de câncer envolve a ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remover um tecido canceroso, terapia de radiação, e quimioterapia. Terapia com o anticorpo anti-CD79b pode ser especialmente desejável em pacientes idosos que não toleram bem a toxicidade e efeitos colaterais de quimioterapia na doença metastática onde a terapia de radiação tem utilidade limitada. O anticorpos anti-CD79bs marcando o tumor da invenção são úteis para aliviar cânceres expressando CD79b no diagnóstico inicial da doença ou durante recaída. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-CD79b pode ser usado sozinho ou em terapia de combinação com, por exemplo, hormônios, anti- angiogênese, ou compostos rotulados, ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Tratamento com o anticorpo anti-CD79b pode ser administrado em conjunção com outras formas de terapia convencional, tanto consecutivamente com terapia pré- ou pós-convencional. Drogas quimioterapêuticas tal como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustine e mitoxantrone são usadas no tratamento de câncer, em particular, em pacientes em risco satisfatório. No presente método da invenção para tratar ou aliviar câncer, pode ser administrado ao paciente com câncer o anticorpo anti-CD79b em conjunção com o tratamento com o um ou mais dos agentes quimioterápicos precedentes. Em particular, terapia de combinação com paclitaxel e derivados modificados (ver, por exemplo, EP0600517) é contemplada. O anticorpo anti-CD79b será administrado com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterápico. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD79b é administrado em conjunção com quimioterapia para melhorar a atividade e eficácia do agente quimioterápico, por exemplo, paclitaxel. O Physicians’ Desk Reference (PDR) descreve dosagens dos agentes que são usados no tratamento de múltiplos cânceres. O regime de dosagem e as dosagens das drogas quimioterapêuticas acima mencionadas que são terapeuticamente eficazes dependerão de um câncer particular sendo tratado, da avidez da doença e de outros fatores familiares a um clínico versado na técnica e podem ser determinados por um clínico.
[776] Em uma modalidade particular, um conjugado compreendendo um anticorpo anti-CD79b conjugado com o agente citotóxico é administrado a um paciente. De preferência, o imunoconjugado ligado à proteína CD79b é internalizado por uma célula, resultando em uma eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado em exterminar a célula de câncer à qual ele se liga. Em uma modalidade preferida, o agente citotóxico marca ou interfere com o ácido nucleico na célula de câncer. Exemplos de tais agentes citotóxicos são descritos acima e incluem include maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e endonucleases de DNA
[777] O anticorpo anti-CD79bs ou conjugados de toxina do mesmo são administrados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por administração intramuscular, intraperitoneal, intracérebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou vias de inalação. A administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo é preferida.
[778] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo anti-CD79b. A administração combinada inclui a co- administração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, sendo que, de preferência, existe um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas. De preferência, tal terapia de combinação resulta em um efeito terapêutico sinergético.
[779] Também pode ser desejável combinar a administração do anticorpo anti-CD79b ou anticorpos, com administração de um anticorpo dirigido contra outro antígeno de tumor associado com o câncer particular.
[780] Em outra modalidade, os métodos de tratamento terapêutico da presente invenção envolvem a administração combinada de um anticorpo anti-CD79b (ou anticorpos), e um ou mais agentes quimioterápicos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo a co-administração de coquetéis de agentes quimioterápicos diferentes, ou outro(s) agente(s) citotóxico(s) ou outro(s) agente(s) terapêutico(s) que também inibem o crescimento do tumor. Agentes quimioterápicos incluem fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5- fluorouracila, melphalan, ciclo-fosfamida, hidroxiuréia e hidroxiureiataxanos (tal como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. Os programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo praticante da técnica. Os programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia também são também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O anticorpo pode ser combinado com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto anti- estrogênio tal como tamoxifen; uma anti-progesterona tal como onapristone (ver, EP 616 812); ou um anti-androgênio tal como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Quando o câncer a ser tratado é câncer independente de androgênio, o paciente pode previamente ter sido submetido a terapia com anti-androgênio e, após o câncer tornar-se independente de androgênio, o anticorpo anti-CD79b (e opcionalmente outros agentes como descritos acima) pode ser administrado ao paciente.
[781] Algumas vezes, pode ser benéfico também co-administrar um cardioprotetor (para prevenir ou reduzir a disfunção miocardíaca associada com a terapia) ou uma ou mais citoquinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células de câncer e/ou terapia de radiação (por exemplo, terapia ou irradiação de feixe externo com agente rotulado radioativo, tal como um anticorpo), antes, simultaneamente com, ou pós-terapia com anticorpo. As dosagens apropriadas para qualquer um dos agentes co-administrados acima são as presentemente usadas e podem ser diminuídas devido a uma ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-CD79b.
[782] A composição do anticorpo da invenção será formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos da invenção presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente usados em uma mesma dosagem e com as vias de administração usadas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora.
[783] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem e o modo de administração serão escolhidos por um clínico de acordo com os critérios conhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, antes da terapia, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e da discrição do clínico atendente. O anticorpo é apropriadamente administrado a um paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. De preferência, o anticorpo é administrado intravenosamente por infusão intravenosa ou por injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 50 mg/kg do peso corporal (por exemplo, cerca de 0,1-15mg/kg/dose) do anticorpo podem ser uma dosagem candidata inicial para administração a um paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Um regime de dosagem pode compreender administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-CD79b. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais longas, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. O progresso desta terapia pode ser prontamente monitorado por métodos e ensaios convencionais e baseado em critérios conhecidos de um clínico ou outras pessoas versadas na técnica.
[784] A parte a administração da proteína do anticorpo a um paciente, a presente aplicação contempla a administração do anticorpo por uma terapia de genes. Tal administração de ácido nucleico codificando o anticorpo é englobada pela expressão “administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo”. Ver, por exemplo, WO96/07321 publicado em 14 de março de 1996 com referência ao uso de uma terapia de genes para gerar anticorpos intracelulares.
[785] Existem duas abordagens maiores para levar o ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para liberação in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no paciente, geralmente em um lado onde o anticorpo é requerido. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente tanto diretamente, como, por exemplo, encapsuladas nas membranas porosas que são implantadas em um paciente (ver, por exemplo, patentes U.S. Nos. 4.892.538 e 5.283.187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido em células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas apropriadas para a transferência de ácido nucleico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão de células de DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio etc. Um vetor comumente usado para liberação ex vivo do gene é um vetor retroviral.
[786] As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo preferidas incluem transfecção com vetores virais (tal como adenovírus, vírus de Herpes simplex I, ou vírus adenoassociado) e sistemas baseados em lipídeo (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeos do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Para estudo dos protocolos de marcação de gene e terapia de gene atualmente conhecidos, ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver também WO 93/25673 e as referências citadas no mesmo.
[787] O anticorpo anti-CD79bs da invenção pode estar em formas diferentes englobadas pela definição de “anticorpo” aqui. Assim, os anticorpos incluem anticorpo de comprimento completo ou intacto, fragmentos de anticorpo, anticorpo de sequência nativa ou variante aminoácidos, anticorpos humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados, e fragmentos funcionais dos mesmos. Nos anticorpos de fusão, uma sequência de anticorpo é fundida a uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer funções efetoras desejadas. Como discutido em mais detalhe nas presentes seções, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu ligado sobre uma superfície de célula pode induzir pode induzir citotoxicidade, por exemplo, por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou recrutar complemento em citotoxicidade dependente de complemento. Ou algum outro mecanismo. Alternativamente, quando é desejável eliminar ou reduzir a função efetora, assim como minimizar os efeitos colaterais ou complicações terapêuticas, algumas outras regiões Fc podem ser usadas.
[788] Em uma modalidade, o anticorpo compete para ligação ou ligar-se substancialmente ao mesmo epítopo como os anticorpos da invenção. Anticorpos tendo características biológicas dos presentes anticorpos anti- CD79bs da invenção também são também contemplados, especificamente incluindo a marcação de tumor in vivo e qualquer inibição de proliferação de células ou características citotóxicas.
[789] Métodos de produzir os anticorpos acima são descritos em detalhe aqui.
[790] Os presentes anticorpos anti-CD79bs são úteis para tratar um câncer expressando CD79b ou aliviar um ou mais sintomas de câncer em um mamífero. Tal câncer inclui, mas não está limitado a cânceres hematopoiéticos ou cânceres relacionados ao sangue, tal como linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfoides, mas, também, cânceres de baço e cânceres de nodos linfáticos. Exemplos mais particulares de tais cânceres associados a células B, incluindo, por exemplo, linfomas de grau alto, intermediário e baixo (incluindo linfomas de células B, tal como, por exemplo, linfoma de células B de tecido linfoide associado à mucosa, e linfoma não- Hodgkin, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da zona marginal, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular, e linfoma de Hodgkin e linfomas de células T) e leucemias (incluindo leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica, tal como leucemia de células B (linfócitos CD5+ B), leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfoblástica aguda), e outros cânceres hematológicos e/ou associados a células B ou células T. Os cânceres englobam cânceres metastáticos de qualquer um os anticorpos precedentes. O anticorpo é capaz de ligar-se a pelo menos uma porção de células de câncer que expressam polipeptídeo de CD79b no mamífero. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é eficaz para destruir ou exterminar células de tumor expressando CD79b ou inibem o crescimento de tais células de tumor, in vitro ou in vivo, na ligação ao polipeptídeo de CD79b em uma célula. Tal anticorpo inclui um anticorpo anti-CD79b nu (não conjugado a qualquer agente). Anticorpos nus que têm propriedades de inibição de crescimento de célula ou citotóxicas podem ser ainda atrelados com um agente citotóxico para tornar os mesmos ainda mais potentes na destruição de células de tumor. As propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo anti-CD79b, por exemplo, conjugando o anticorpo com um agente citotóxico, para formar um imunoconjugado como descrito aqui. O agente citotóxico ou o agente inibidor de crescimento é de preferência uma molécula pequena. Toxinas tais como caliqueamicina ou um maitansinóide e análogos ou derivados dos mesmos, são preferíveis.
[791] A invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD79b da invenção, e um veículo. Para os fins de tratar composições de câncer, as composições podem ser administradas a um paciente em necessidade de tal tratamento, sendo que a composição pode compreender um ou mais anticorpo anti-CD79bs presente como um imunoconjugado ou como o anticorpo nu. Em uma outra modalidade, as composições podem compreender estes anticorpos em combinação com outros agentes terapêuticos tal como agentes inibidores de crescimento ou citotóxicos. A invenção também fornece formulações compreendendo um anticorpo anti- CD79b da invenção, e um veículo. Em uma modalidade, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
[792] Outro aspecto da invenção são ácidos nucleicos isolados codificando o anticorpo anti-CD79bs. Ácidos nucleicos codificando ambas as cadeias H e L e especialmente os resíduos da região hipervariável, as cadeias que codificam um anticorpo de sequência nativa bem como variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo, são englobados.
[793] A invenção também fornece métodos úteis para tratar um câncer expressando polipeptídeo de CD79b ou aliviar um ou mais sintomas de câncer em um mamífero, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD79b a um mamífero. As composições terapêuticas de anticorpo podem ser administradas a curto prazo (aguda) ou crônica, ou intermitente como dirigido pelo clínico. Também fornecidos são métodos de inibir o crescimento de, e exterminar uma célula expressando polipeptídeo de CD79b.
[794] A invenção também fornece kits e artigos de fabricação compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b. Kits contendo o anticorpo anti-CD79bs procura usar, por exemplo, ensaios de extermínio de células de CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células. Por exemplo, para isolamento e purificação de CD79b, o kit pode conter um anticorpo anti-CD79b copulado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Os kits podem ser fornecidos os quais contêm os anticorpos para a detecção e quantificação de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Tal anticorpo útil for detecção pode ser fornecido com um rótulo tal como um rótulo de rádio ou fluorescente. TRATAMENTOS COM CONJUGADO ANTICORPO-DROGA
[795] É contemplado que os conjugados anticorpo-droga (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças ou distúrbios, por exemplo caracterizados pela superexpressão de um antígeno de tumor. As condições exemplificativos ou distúrbios hiperproliferativos incluem tumores benignos ou malignos; leucemia e malignidades linfoides. Outras incluem distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais, blastocoélicos, inflamatórios, angiogênicos e imunológicos, incluindo autoimunes.
[796] Os compostos ADC que são identificados em modelos de animal e ensaios baseados em células podem ainda ser testados em primadas carregando tumor e experiências clínicas humanas. As experiências clínicas humanas podem ser projetadas para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-CD79b ou imunoconjugado da invenção em pacientes experimentando um distúrbio de células B incluindo sem limitação linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto. A experiência clínica pode ser projetada para avaliar a eficácia de um ADC em combinações com regimes terapêuticos conhecidos, tal como radiação e/ou quimioterapia envolvendo quimioterapia e/ou agente citotóxicos conhecidos
[797] Geralmente, a doença ou distúrbio a ser tratado é uma doença hiperproliferativa tal como um distúrbio proliferativo de células B e/ou um câncer de células B. Exemplos de câncer a ser tratado aqui incluem, mas não estão limitados a, distúrbio proliferativo de células B é selecionado de linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente NHL, NHL refratário, NHL refratário indolente, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula manto.
[798] O câncer pode compreender células expressando CD79b, de tal modo que os ADC da presente invenção são capazes de ligar-se a células de câncer. Para determinar a expressão de CD79b no câncer, múltiplos ensaios de diagnóstico/prognóstico estão disponíveis. Em uma modalidade, a superexpressão de CD79b pode ser analisada por IHC. Seções de tecido de uma biopsia de tumor embutidas em parafina podem ser submetidas ao ensaio de IHC e concederam um critério de intensidade de coloração de proteína CD79b com respeito ao grau de coloração e em qual proporção de células de tumor examinadas.
[799] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um ADC dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se a molécula é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e da discrição do clínico atendente. A molécula é apropriadamente administrada ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo 0.1-20 mg/kg) da molécula é uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode estar na faixa de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está na faixa de cerca de 0.1 a cerca de 10 mg/kg do peso do paciente.
[800] Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até uma supressão dos sintomas da doença desejada ocorrer. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-ErbB2. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
J. TERAPIA DE COMBINAÇÃO
[801] Um conjugado anticorpo-droga (ADC) da invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto tendo propriedades anti-câncer. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem tem, de preferência, atividades complementares ao ADC da combinação de tal modo que elas não afetam adversamente uma à outra.
[802] O segundo composto pode ser um agente quimioterápico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor de crescimento, agente anti- hormonal, e/ou cardioprotetor. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido. Uma composição farmacêutica contendo um ADC da invenção também pode ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico tal como um inibidor de formação de tubulina, um inibidor de topoisomerase, ou um aglutinante de DNA.
[803] Em um aspecto, o primeiro composto é um anti-CD79b ADC da invenção e o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 (tanto um anticorpo nu como um ADC). Em uma modalidade o segundo composto é um anticorpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®) ou 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Outros anticorpos úteis para imunoterapia combinada com anti- CD79b ADCs da invenção incluem sem limitação, anti-VEGF (por exemplo, Avastin®).
[804] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração de um agente anticâncer identificado de acordo com esta invenção, incluindo sem limitação terapia de radiação e/ou transplantes de medula óssea e do sangue periférico, e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterápico, ou um agente inibidor de crescimento. Em uma de tais modalidades, um agente quimioterápico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hudroxudaunorrubicina, adriamicinan, doxorrubinicina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêuticos tal como anti-CD20 (por exemplo, Rituxan®) ou anti-VEGF (por exemplo, Avastin®).
[805] A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada incluis a coadministração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, sendo que, de preferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.
[806] Em uma modalidade, tratamento com um ADC envolve a administração combinada de um agente anticâncer identificado aqui, e um ou mais agentes quimioterápicos ou agentes inibidores de crescimento, incluindo a coadministração de coquetéis de agentes quimioterápicos diferentes. Os agentes quimioterápicos incluem taxanos (tal como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. Os programas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como empiricamente determinado por um praticante. Os programas de preparação e dosagem para tal quimioterapia também são descritos em “Chemotherapy Service”, (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
[807] Dosagens apropriadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são as presentemente usadas e podem ser diminuídas devido a uma ação combinada (sinergia) do agente recentemente identificado e outros agentes quimioterápicos ou tratamentos.
[808] A terapia de combinação pode fornecer “sinergia” e prova “sinergética”, isto é, o efeito obtido quando os ingredientes ativos usados juntos é maior do que a soma de efeitos que resulta de usar os compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser obtido quando os ingredientes ativos são: (1) co-formulados e administrados ou liberados simultaneamente em um formulação de dosagem única, combinada; (2) liberados por alternação ou em paralelo como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando liberado em terapia de alternação, um efeito sinérgico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou liberados sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, enquanto em terapia de combinação as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntas.
K. ARTIGOS E KITS DE FABRICAÇÃO
[809] Outra modalidade da invenção é um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de câncer expressando CD79b. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de acondicionamento em ou associados com o recipiente. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que é eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição do câncer e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-CD79b da invenção. O rótulo ou inserto de acondicionamento indica que a composição é usada para tratar câncer. O rótulo ou inserto de acondicionamento compreenderá ainda instruções para administrar a composição do anticorpo a um paciente com câncer. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele ainda pode incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[810] Kits também são fornecidos que são úteis para múltiplos fins, por exemplo, para ensaios de extermínio de células expressando CD79b, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de CD79b de células. Para isolamento e purificação de polipeptídeo de CD79b, o kit pode conter um anticorpo anti-CD79b copulado a contas (por exemplo, contas de sepharose). Os kits podem ser fornecidos os quais contêm os anticorpos para detecção e quantificação de polipeptídeo de CD79b in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Como com o artigo de fabricação, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de acondicionamento em ou associado com o recipiente. O recipiente retém uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD79b da invenção. Recipientes adicionais podem ser incluídos que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle. O rótulo ou inserto de acondicionamento pode fornecer uma descrição da composição como instruções para o uso de detecção ou in vitro pretendido.
L. USOS PARA POLIPEPTÍDEO DE CD79B
[811] Esta invenção engloba métodos de triagem de compostos para identificar os que imitam o polipeptídeo de CD79b (agonistas) ou previnem o efeito do polipeptídeo de CD79b (antagonistas). Ensaios de triagem para candidatos a droga antagonista são projetados para identificar os compostos que se ligam ou complexam com o polipeptídeo de CD79bs codificado pelos genes aqui identificados, ou de outro modo interferem com a interação de polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares, incluindo, por exemplo, inibir a expressão de polipeptídeo de CD79b de células. Tais ensaios de triagem incluirão ensaios receptivos a triagem de alta produção de bibliotecas de produtos químicos, tornando os mesmos particularmente apropriados para identificar candidatos à droga de molécula pequena.
[812] Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímicos, imunoensaios, e ensaios baseados em célula, que são bem caracterizados na técnica.
[813] Todos os ensaios para antagonistas são comuns em que eles chamam para contatar o candidato a droga com o polipeptídeo de CD79b codificado por um ácido nucleico identificado aqui sob condições e durante um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.
[814] Nos ensaios de ligação, a interação é ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado em uma mistura de reação. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo de CD79b codificado por um gene identificado aqui ou um candidato a droga, é imobilizada em uma fase sólida, por exemplo, em uma placa de microtítulo, por fixações covalentes ou não- covalentes. A fixação não-covalente geralmente é realizada revestindo a superfície sólida com a solução do polipeptídeo de CD79b e secando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo de CD79b a ser imobilizado pode ser usado para ancorar o mesmo em uma superfície sólida. O ensaio é realizado adicionando um componente não-imobilizado, que pode ser rotulado por um rótulo detectável, no componente imobilizado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, os componentes não reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados em uma superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não-imobilizado conduz um rótulo detectável, a detecção do rótulo imobilizado na superfície indica que ocorreu a complexação. Quando o componente originalmente não-imobilizado não conduz um rótulo, a complexação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo rotulado especificamente ligando o complexo imobilizado.
[815] Se o composto candidato interage com, mas não se liga a um polipeptídeo de CD79b particular codificado por um gene identificado aqui, sua interação com esse polipeptídeo pode ser ensaiada por métodos bem conhecidos para detectar interações proteína-proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tal como, por exemplo, reticulação, co- imunoprecipitação, e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, as interações proteína-proteína podem ser monitoradas usando um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como descrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores de transcrição, tal como levedura GAL4, consistem em dois domínios modulares fisicamente discretos, um agindo como o domínio de ligação de DNA, o outro funcionando como o domínio de ativação de transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações acima (geralmente referidos como o "sistema de dois híbridos ") leva vantagem desta propriedade e empresa proteínas de dois híbridos, um em que a proteína de marcação é fundida a um domínio de ligação de GAL4, e o outro, em proteínas de ativação candidatas são fundidas em um domínio de ativação. A expressão de um gene repórter GAL1- lacZ sob o controle de um promotor ativado com GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 pela interação proteína-proteína. Colônias contendo polipeptídeos interagindo são detectadas com um substrato quimérico para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKERTM) para identificar interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando uma técnica de dois híbridos é comercialmente disponível de Clontech. Este sistema também pode ser estendido para mapear domínios de proteína envolvidos em interações de proteína específicas bem como para apontar com precisão aminoácidos e resíduos que são cruciais para as interações.
[816] Compostos que interferem com a interação de um gene codificando um polipeptídeo de CD79b identificado aqui e outros componentes intra- ou extracelulares podem ser testados como a seguir: geralmente uma mistura de reação é preparada contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob condições e durante um tempo permitindo a interação e ligação de dois produtos. Para testar a capacidade de um composto candidato para inibir ligação, a reação é realizada em uma ausência ou presença do composto de teste. Além disso, um placebo pode ser adicionado a uma terceira mistura de reação, para servir como controle positivo. A ligação entre (formação de complexo) o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente em uma mistura é monitorada como descrito acima. A formação de um complexo em reação(ões) de controle, mas não em uma mistura de reação contendo o composto de teste, indica que o composto de teste interfere com o interação do composto de teste e seu parceiro de reação.
[817] Para testar antagonistas, o polipeptídeo de CD79b pode ser adicionado a uma célula junto com o composto a ser triado para uma atividade particular e a capacidade do composto para inibir a atividade de interesse na presença do polipeptídeo de CD79b indica que o composto é um antagonista para um polipeptídeo de CD79b. Alternativamente, os antagonistas podem ser detectados combinando o polipeptídeo de CD79b e um antagonista potencial com receptores de polipeptídeo de CD79b ligados à membrana em condições apropriadas para um ensaio de inibição competitivo. O polipeptídeo de CD79b pode ser rotulado, tal como por radioatividade, de tal modo que o número de moléculas de polipeptídeo de CD79b ligadas a um receptor pode ser usado para determinar a eficácia antagonista do potencial. O gene codificando o receptor pode ser identificado por numerosos métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, bateia de ligantes e classificação FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). De preferência, a clonagem de expressão é empregada sendo que o RNA poliadenilado RNA é preparado a partir de uma célula respondente a um polipeptídeo de CD79b e uma biblioteca de cDNA criada deste RNA é dividida em reservatórios e usada para transfectar células COS ou outras células que são cultivadas em lâminas de vidro que não são respondentes para um polipeptídeo de CD79b. Células transfectadas que são cultivadas em lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo de CD79b rotulado. O polipeptídeo de CD79b pode ser rotulado por uma variedade de meios incluindo iodação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma quinase de proteína específica do sítio. Após fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise autorradiográfica. Reservatórios positivos são identificados e sub-reservatórios são preparados e re- transfectados usando um processo de re-triagem de sub-reservatório interativo eventualmente rendendo um clone único que codifica o receptor putativo.
[818] Como uma abordagem alternativa para identificação de receptor, o polipeptídeo de CD79b rotulado pode ser ligado por foto-afinidade com membrana de células ou preparações de extratos que expressam a molécula receptora. O material reticulado é decomposto por PAGE e exposto a um filme de. O complexo rotulado contendo o receptor pode ser excisado, decomposto em fragmentos de peptídeo, e submetido a micro-sequenciamento de proteína. A sequência de aminoácidos do micro-sequenciamento poderia ser para designar um conjunto de sondas de oligonucleotídeo degeneradas para triar uma biblioteca de cDNA para identificar o gene codificando o receptor putativo.
[819] Em outro ensaio para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação de membrana expressando o receptor seriam incubadas com polipeptídeo de CD79b rotulado na presença do composto candidato. A capacidade do composto melhorar ou bloquear sua interação pode não ser medida.
[820] Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluem um oligonucleotídeo que se liga a fusões de imunoglobulina com polipeptídeo de CD79b, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonal e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotípicos, e versões humanizadas ou quiméricas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma proteína intimamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipeptídeo de CD79b que reconhece o receptor, mas não confere nenhum efeito, desse modo inibindo competitivamente a ação do polipeptídeo de CD79b.
[821] Anticorpos ligando especificamente um polipeptídeo de CD79b identificado aqui, bem como outras moléculas identificas pelos ensaios de triagem descritos acima, podem ser administrados para um tratamento de múltiplos distúrbios, incluindo câncer, na forma de composições farmacêuticas.
[822] Se o polipeptídeo de CD79b é intracelular e anticorpos totais são usados como inibidores, anticorpos internalizantes são preferidos. No entanto, lipofecções ou lipossomas também podem ser usadas para liberar o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, nas células. Quando os fragmentos de anticorpo são usados, o menor fragmento inibitório que se liga especificamente a um domínio de ligação da proteína de marcação é preferido. Por exemplo, baseado em sequências de região variável de um anticorpo, moléculas de peptídeo podem ser projetadas, as quais retêm a capacidade de ligar a sequência de proteína de marcação. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante. Ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).
[823] A presente formulação também pode conter mais do que um composto ativo, como necessário, para uma indicação particular sendo tratada, de preferência os com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente que melhora sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citoquina, agente quimioterápico, ou agente inibidor de crescimento. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.
M. DERIVADOS DE ANTICORPO
[824] Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. De preferência, as porções apropriadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de anidrido de etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados a um anticorpo pode variar, e se mais do que um polímero é fixado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado baseado em considerações incluindo, mas não limitadas a propriedades particulares ou funções do anticorpo a serem aperfeiçoadas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.
N. MÉTODO DE TRIAGEM
[825] Ainda outra modalidade da presente invenção é dirigida a um método de determinar a presença de um polipeptídeo de CD79b em uma amostra suspeita de conter o polipeptídeo de CD79b, sendo que o método compreende expor a amostra a um conjugado anticorpo-droga do mesmo, que se liga a um polipeptídeo de CD79b e determinar a ligação do conjugado anticorpo-droga do mesmo, ao polipeptídeo de CD79b em uma amostra, sendo que a presença de tal ligação é indicativa da presença do polipeptídeo de CD79b na amostra. Opcionalmente, a amostra pode conter células (que podem ser células de câncer) suspeitas de expressar o polipeptídeo de CD79b. O conjugado anticorpo-droga do mesmo, empregado em um método pode opcionalmente ser rotulado detectavelmente, fixado a um suporte sólido, ou outros.
[826] Outra modalidade da presente invenção é dirigida a um método de diagnosticar a presença de um tumor em um mamífero, sendo que o método compreende (a) contatar uma amostra de teste compreendendo células de tecido obtidas de um mamífero com um conjugado anticorpo-droga das mesmas, que se liga a um polipeptídeo de CD79b e (b) detectar a formação de um complexo entre o conjugado anticorpo-droga do mesmo, e o polipeptídeo de CD79b em uma amostra de teste, sendo que a formação de um complexo é indicativo da presença de um tumor em um mamífero. Opcionalmente, o conjugado anticorpo-droga do mesmo, é rotulado detectavelmente, fixado a um suporte sólido, ou outros, e/ou a amostra de teste de células de tecido é obtida de um indivíduo suspeito de ter um tumor canceroso.
IV. Outros Métodos De Usar Anticorpo Anti-Cd79b E Imunoconjugados A. Métodos De Diagnóstico E Métodos De Detecção
[827] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD79bs e imunoconjugados da invenção são úteis para detectar a presença de CD79b em uma amostra biológica. O termo “detectar” como usado aqui engloba a detecção quantitativa e qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em certas modalidades, tais tecidos incluem tecidos normais e/ou canceroso que expressam CD79b em níveis mais altos com relação a outros tecidos, por exemplo, células B células e/ou tecidos associados a células B.
[828] Em um aspecto, a invenção fornece a método de detectar a presença de CD79b em um amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b.
[829] Em um aspecto, a invenção fornece um método de diagnosticar um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o método compreende contatar uma célula de teste com um anticorpo anti-CD79b; determinar o nível de expressão (tanto quantitativamente como qualitativamente) de CD79b por uma célula de teste detectando a ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b; e comparar o nível de expressão de CD79b pela célula de teste com o nível de expressão de CD79b por uma célula de controle (por exemplo, uma célula normal da mesma origem de tecido como a célula de teste ou uma célula que expressa CD79b em níveis comparáveis a tal célula normal), sendo que um nível de expressão de CD79b mais alto pela célula de teste como comparado a uma célula de controle indica a presença de um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, a célula de teste é obtida de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado com a expressão aumentada de CD79b. Em certas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo de células, tal como um câncer ou um tumor.
[830] Distúrbios proliferativos de células exemplificativos que podem ser diagnosticados usando um anticorpo da invenção incluem um distúrbio de células B e/ou a distúrbio proliferativo de células B incluindo, mas não limitados a, linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula manto.
[831] Em certas modalidades, um método de diagnóstico ou de detecção, tal como os descritos acima, compreende detectar a ligação de um anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso sobre a superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida de uma célula expressando CD79b sobre sua superfície. Em certas modalidades, o método compreende contatar uma célula com um anticorpo anti-CD79b sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-CD79b a CD79b, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b sobre a superfície de célula. Um ensaio exemplar para detectar a ligação de um anticorpo anti-CD79b a CD79b expresso sobre a superfície de uma célula é o “ensaio FACS”.
[832] Certos outros métodos podem ser usados para detectar a ligação do anticorpo anti-CD79bs a CD79b. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a ensaios de ligação de antígeno que são bem conhecidos na técnica, tal como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a ensaio), imunoensaios em “sanduíche”, ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, e imuno-histoquímica (IHC).
[833] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD79b são rotulados. Os rótulos incluem, mas não estão limitados a, rótulos ou porções que são diretamente detectadas (tais como rótulos fluorescentes, cromofóricos, densos de elétron, quimioluminescentes e radioativos), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são indiretamente detectados, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Rótulos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, e 131I, fluoróforos tais como quelatos de terra rata ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (Pat. U.S. No. 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de raiz forete (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeos, por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose, e glicose-6- fosfato deidrogenase, oxidases heterocíclicas tal como oxidase de uricase e xantina, copulados com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, rótulos giratórios, rótulos de bacteriófagos, radicais livres estáveis, e outros.
[834] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD79b são imobilizados em uma matriz insolúvel. A imobilização acarreta separar o anticorpo anti-CD79b de qualquer CD79b que permanece livre em solução. Isto é convencionalmente realizado tanto insolubizando o anticorpo anti-CD79b antes do procedimento do ensaio, como por adsorção em uma matriz insolúvel em água ou superfície (Bennich et al., U.S. 3.720.760), ou copulação covalente (por exemplo, usando reticulação de glutaraldeído), ou insolubilizando o anticorpo anti-CD79b após formação de um complexo entre o anticorpo anti-CD79b e CD79b, por exemplo, por imunoprecipitação.
[835] Qualquer uma das modalidades de diagnóstico ou detecção acima pode ser realizada usando um imunoconjugado da invenção em lugar de ou além da adição de um anticorpo anti-CD79b. B. MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[836] Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser usado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo, e in vivo. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento ou proliferação de células, tanto in vivo como in vitro, o método compreendendo expor uma célula a um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a CD79b. “Inibir o crescimento ou proliferação de células” significa diminuir um crescimento ou proliferação de células em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100%, e inclui induzir a morte de células.. Em certas modalidades, a célula é uma célula de tumor. Em certas modalidades, a célula é uma célula B. Em certas modalidades, a célula é um xenoenxerto, por exemplo, como exemplificado aqui.
[837] Em um aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é usado para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo de células B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células é associado com a expressão e/ou atividade de CD79b aumentada. Por exemplo, em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células B é associado com a expressão de CD79b aumentada sobre a superfície de uma célula B. Em certas modalidades, o distúrbio proliferativo de células B é um tumor ou um câncer. Exemplos de distúrbios proliferativos de células B a serem tratados pelos anticorpos ou imunoconjugados da invenção incluem, mas não estão limitados a linfoma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula manto.
[838] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar um distúrbio proliferativo de células B compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo. Em certas modalidades, um método para tratar um distúrbio proliferativo de células B compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado anti-CD79b e, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os fornecidos abaixo. Em certas modalidades, um método para tratar um distúrbio proliferativo de células compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo 1) um imunoconjugado compreendendo um anticorpo anti- CD79b e um agente citotóxico; e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como os fornecidos abaixo.
[839] Em um aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ligar CD79b de outras espécies diferentes de humanos. Consequentemente, anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados para ligarCD79b, por exemplo, em uma cultura de células contendo CD79b, em humanos, ou em outros mamíferos tendo um CD79b com a qual um anticorpo ou imunoconjugado da invenção reticula (por exemplo, macacos chimpanzé, babuíno, sagui, cinomolgo e resus, porco ou camundongo). Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser usado para marcar CD79b em células B contatando o anticorpo ou imunoconjugado com CD79b para formar um anticorpo ou complexo imunoconjugado-antígeno, de tal modo que uma citotoxina conjugada do imunoconjugado acessa o interior da célula. Em uma modalidade, o CD79b é CD79b humano.
[840] Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser usado em um método para ligar CD79b em um individual sofrendo de um distúrbio associado com a expressão e/ou atividade de CD79b aumentada, o método compreendendo administrar ao indivíduo o anticorpo ou imunoconjugado tal que CD79b no indivíduo é ligado. Em uma modalidade, o anticorpo ou imunoconjugado ligado é internalizado em CD79b expressando células B. Em uma modalidade, o CD79b é CD79b humano, e o indivíduo é um indivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero expressando CD79b ao qual um anti-CD79b se liga. Ainda outro indivíduo pode ser um mamífero em cujo CD79b é introduzido (por exemplo, por administração de CD79b ou por expressão de um transgene codificando CD79b).
[841] Um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um humano para fins terapêuticos. Além disso, um anticorpo anti- CD79b ou imunoconjugado pode ser administrado a um mamífero não humano expressando CD79b com o qual o anticorpo reticula (por exemplo, um primata, porco, rato, ou camundongo) para fins veterinários ou como um modelo de animal de doença humana. Com referência ao último, tais modelos de animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção (por exemplo, teste de dosagens e cursos de tempo de administração).
[842] Anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional é um agente citotóxico, um agente quimioterápico, ou um agente inibidor de crescimento. Em uma destas modalidades, um agente quimioterápico é um agente ou combinações de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorrubincina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP, ou COP, ou imunoterapêuticos tais como anti-CD20 (por exemplo, Rituxan®) ou anti-VEGF (por exemplo, Avastin®), sendo que a terapia de combinação é útil no tratamento de cânceres e/ou distúrbios de células B tais como distúrbios proliferativos de células B incluindo linfoma, linfoma não- Hodgkin (NHL), NHL agressivo NHL, NHL agressivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL), e linfoma de célula do manto.
[843] Tais terapias de combinação indicadas acima englobam administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas formulações ou em separado), e a administração separada, caso em que, a administração do anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção também podem ser usados em combinação com terapia de radiação.
[844] Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional ou adjuvante) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o anticorpo ou imunoconjugado é apropriadamente administrado por infusão de pulso, particularmente com doses declinantes do anticorpo ou imunoconjugado. A dosagem pode ser por qualquer via apropriada, por exemplo por injeções, tal como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.
[845] Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser formulados. Dosados e administrados de um modo consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, ou sítio de liberação do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. O anticorpo ou imunoconjugado não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou imunoconjugado presentes em uma formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estas são geralmente usadas nas mesmas dosagens e com vias de administração como descrito aqui, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que é empiricamente/clinicamente determinada ser apropriada.
[846] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou imunoconjugado da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais, tal como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo ou imunoconjugado, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo ou imunoconjugado é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo ou imunoconjugado, e da discrição do clínico atendente. O anticorpo ou imunoconjugado é apropriadamente administrado a um paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg (por exemplo 0.1mg/kg-20mg/kg) de anticorpo ou imunoconjugado podem ser uma dosagem candidata inicial para administração a um paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica na faixa de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante múltiplos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode geralmente ser sustentado até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer uma dosagem exemplar de anticorpo ou imunoconjugado pode estar em uma faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) de anticorpo ou imunoconjugado pode ser administrada a um paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo toda semana ou de três em três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo cerca de seis doses de anticorpo ou imunoconjugado). Uma dose de carga inicial mais alta, seguidas por uma ou mais doses mais baixas pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. C. ENSAIOS DE ATIVIDADE
[847] Os anticorpos anti-CD79b e imunoconjugados da invenção podem ser caracterizados por suas propriedades físico/químicas e/ou atividades biológicas por múltiplos ensaios conhecidos em uma técnica. 1. ENSAIOS DE ATIVIDADE
[848] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos anti-CD79b ou imunoconjugados dos mesmos tendo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a capacidade de inibir o crescimento ou proliferação de células (por exemplo, atividade de “extermínio de células”), ou a capacidade de induzir a morte de células, incluindo morte de células programada (apoptose). Os anticorpos ou imunoconjugados tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro são também fornecidos.
[849] Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação de células in vitro. Ensaios para inibição do crescimento e proliferação de células também são bem conhecidos em uma técnica. Certos ensaios para proliferação de células, exemplificados pelos ensaios de “extermínio de células” descritos aqui|, medem a viabilidade celular. Um destes ensaios é o CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Ensaio, que está comercialmente disponível de Promega (Madison, WI). Esse ensaio determina o número de células viáveis em uma cultura baseada na quantificação de ATP presente, que é uma indicação de células metabolicamente ativas. Ver Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, pat. Pat. No. 6602677. O ensaio pode ser conduzido em formato de 96 ou 384 reservatórios, tornando o mesmo receptivo para triagem de alta produção automática (HTS). Ver Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. O procedimento de ensaio envolve adicionar um reagente único (CellTiter-Glo® Reagent) diretamente às células cultivadas. Este resultado em lise de células e a geração de um sinal luminescente produzido por uma reação de luciferase. O sinal luminescente é proporcional a uma quantidade de ATP presente, que é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes na cultura. Os dados podem ser registrados por câmera de luminômetro ou dispositivo de formação de imagem em câmera CCD. A produção de luminescência é expressa como unidades relativamente claras (RLU).
[850] Outro ensaio para proliferação de células é o ensaio “MTT”, a ensaio colorimétrico que mede a oxidação de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazóleo para formazan por redutase mitocôndria. Como o ensaio CellTiter-GloTM, este ensaio indica o número de células metabolicamente ativas presentes em uma cultura de célula. Ver, por exemplo, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, e Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882.
[851] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de induzir a morte de células in vitro. Ensaios para indução de morte de células são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, estes ensaios medem, por exemplo, a perda de integridade da membrana como indicado por absorção de iodeto de propídio (PI), trypan blue (ver, Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), ou 7AAD. Em um ensaio de absorção de células PI exemplar, as células são cultivadas em meio Eagle modificado com Dubelcco (D-MEM):Ham's F-12 (50:50) suplementado com 10% FBS inativado com calor (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Assim, o ensaio é realizado na ausência de complemento e células efetoras imunes. são semeadas em uma densidade de 3 x 106 por prato em pratos de 100 x 20 mm e deixadas fixar durante a noite. O meio é removido e substituído com meio novo sozinho ou meio contendo várias concentrações do anticorpo ou imunoconjugado. As células são incubadas durante um período de tempo de 3 dias. Após o tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, a pelota é recolocada em suspensão in 3 m de tampão de ligação de Ca2+ frio e (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) e aliquotadas em tubos de 12 x 75 mm cobertos com coadores de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupos de tratamento) para remoção de grumos de células. Tubos recebem PI (10 μg/ml). As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Anticorpos ou imunoconjugados que incluem níveis estatisticamente significativos de morte de células, como determinado por absorção de PI, são assim identificados.
[852] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado é testado para sua capacidade de induzir apoptose (morte de células programada) in vitro. Um ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é um ensaio de ligação a anexina. Em um ensaio de anexina exemplar, as células são cultivadas e semeadas em pratos, como discutido no parágrafo precedente. O meio é removido e substituído com meio novo sozinho ou meio contendo 0,001 to 10 μg/ml do anticorpo ou imunoconjugado. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são então centrifugadas, recolocadas em suspensão em tampão de ligação de Ca2+, e aliquotadas em tubos, como discutido no parágrafo precedente. Os tubos então recebem anexina rotulada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 μg/ml). As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN™ e um software FACSCONVERT™ CellQuest (BD Biosciences). Anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são assim identificados. Outro ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é o ensaio colorimétrico de ELISA de DNA com histona para detectar degradação internucleossomal de DNA genômico. Tal ensaio pode ser realizado usando, por exemplo, o kit ELISA de detecção de morte de células (Roche, Palo Alto, CA).
[853] Células para uso em qualquer dos ensaios in vitro acima incluem células ou linhagens de células que expressam naturalmente CD79b ou que são engenheiradas para expressar CD79b. Tais células incluem células de tumor que superexpressam CD79b com relação a células normais da mesma origem de tecido. Tais células também incluem linhagens de células (incluindo linhagens de células de tumor) que expressam CD79b e linhagens de células que não expressam normalmente CD79b, mas são transfectadas com ácido nucleico codificando CD79b.
[854] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação dede células in vivo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b ou imunoconjugado do mesmo é testado para sua capacidade de inibir o crescimento de tumor in vivo. Sistemas de modelo in vivo, tal como modelos de xenoenxertos, podem ser usados para tal teste em um sistema de xenoenxerto exemplar, células de tumor humanas são introduzidas em um animal não-humano apropriadamente imunocomprometido, por exemplo, um camundongo SCID. Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção é administrado a um animal. A capacidade do anticorpo ou imunoconjugado para inibir ou diminuir o crescimento de tumor é medida. Em certas modalidades do sistema de xenoenxerto acima, as células de tumor humanas são células de tumor de um paciente humano. Tais células úteis para preparar modelos de enxerto para preparar xenoenxertos incluem linhagens de células de leucemia humana e de linfoma, que incluem, sem limitação as células BJAB-luc (uma linhagem de células de linfoma de Burkitt negativas para EBV transfectada com o gene repórter de luciferase), células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL- 1923), células SuDHL-4 (DSMZ, Braunschweig, Germany, AAC 495), células DoHH2 (ver Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 5:221-224 (1991), e Kluin- Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8:1385-1391 (1994)), células Granta-519 (ver Jadayel, D.M. et al., Leukemia 11(1):64-72 (1997)). Em certas modalidades, as células de tumor humanas são introduzidas em um animal não humano apropriadamente imunocomprometido por injeção subcutânea ou por transplantação em um sítio apropriado, tal como uma almofada de gordura mamária. 2. LIGAÇÃO ENSAIOS E OUTROS ENSAIOS
[855] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de ligação a antígeno. Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD79b é testado para sua capacidade de ligar-se a CD79b expresso sobre a superfície de uma célula. Um ensaio FACS pode ser usado para tal testagem.
[856] Em um aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo monoclonal que compete com anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79b.v17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado para ligação a CD79b. Em certas modalidades, tal anticorpo de competição liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional de murino) que é ligado pelo anticorpo MA79b de murino, anticorpo MA79bv.17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado. Ensaios de competição exemplificativos incluem, mas não estão limitados a ensaios de rotina tal como os fornecidos em Harlow e Lane (1988) Anticorpos: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epítopo Mapping Protocols,” in Métodos in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dois anticorpos são citados para ligar-se a um mesmo epítopo se cada um bloqueia a ligação ao outro por 50% ou mais.
[857] Em um ensaio de competição exemplar, CD79b mobilizado é incubado em um solução compreendendo um primeiro anticorpo rotulado que se liga a CD79b (por exemplo, anticorpo MAT9b de murino, anticorpo MA79b.v17 humanizado e/ou anticorpo MA79b.v18 humanizado e/ou MA79b.v28 humanizado e/ou MA79b.v32 humanizado) e o segundo anticorpo não rotulado que está sendo testado para sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para ligação a CD79b. Um segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, CD79b imobilizado é incubado em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo rotulado, mas não o segundo anticorpo rotulado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a CD79b, excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de rótulo associado com CD79b imobilizado é medida. Se a quantidade de rótulo associada com CD79b imobilizado é substancialmente reduzida em uma amostra de teste com relação a uma amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação a CD79b. Em certas modalidades, CD79b humanizado está presente sobre a superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida de uma célula expressando CD79b em sua superfície.
[858] Em um aspecto, anticorpos anti-CD79b purificados podem ser ainda caracterizados por uma série de ensaios, incluindo, mas não limitados a sequenciamento N-terminal, análise e aminoácidos, cromatografia líquida de alta pressão por exclusão de tamanho desnaturante (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão de papaína.
[859] Em uma modalidade, a invenção contempla um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas as funções, que tornam o mesmo um candidato desejável para muitas aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (tal como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em certas modalidades, as atividades de Fc do anticorpo são medidas para assegurar que somente as propriedades desejadas são mantidas. Ensaios citotóxicos in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/ depleção de atividades e CDC e/ou de ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação do receptor de Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo é desprovido de ligação FcyR ligação (portanto, atividade provavelmente desprovida de ADCC), mas retém capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam Fc (RIII somente, enquanto os monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão de FcR células hematopoiéticas é resumida na tabela 3 na página 464on de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro ensaio para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na patente U.S. No. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e Natural células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo de animal tal como o descrito em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é capaz de ligar C1q e, portanto, atividade sem CDC. Para avaliar a ativação complementar, um ensaio de CDC, por exemplo como descrito in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202:163 (1996), pode ser realizado. A ligação a FcRn e determinações de apuração in vivo /meia vida também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica.
[860] Os seguintes exemplos são oferecidos para fins ilustrativos somente, e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de modo algum.
[861] Todas as referências de patentes e literatura citadas no presente relatório descritivo são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
[862] Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado ao contrário. Anticorpos usados nos exemplos incluem anticorpos comercialmente disponíveis, mas não estão limitados a anti-CD79b (anticorpo adquirido de Biomeda (Foster City, CA) ou BDbioscience (San Diego, CA) ou Ancell (Bayport, MN)), anti-CD79b (gerado de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993), e anticorpo anti-CD79bs quimérico (compreendendo domínios variáveis de anticorpos gerados de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993). A fonte destas células identificadas nos seguintes exemplos, e por todo o relatório descritivo, por números de acesso de ATCC, é o American Type Cultura Collection, Manassas, VA.
EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
[863] Os números de resíduos estão de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of proteínas of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Abreviações de aminoácido de letra única são usadas. Degenerações de DNA são representadas usando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
A. ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
[864] Múltiplos anticorpos anti-CD79b humanizados foram gerados. Os domínios VL e VH de anticorpo MA79b (MA79b) de murino (Roswell Park Cancer Institute; Okazaki et al., Blood, 81:84-94 (1993)) foram alinhados domínios I VL de kappa I de consenso humano (huKI) e VH de consenso de subgrupo III humano (huIII). Para fazer o enxerto de HVR, usou- se a estrutura de FH aceptora, que difere de um domínio VH de consenso de subgrupo III humano em 3 posições: R71A, N73T, e L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)). Regiões hipervariáveis de murino MA79b (MA79b) foram engenheiradas em uma estrutura de consenso humana aceptora para gerar um enxerto de HVR direto de MA79b (aqui referido como “enxerto de MA79b” ou “enxerto de MA79b” ou “anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b” ou “enxerto de huMA79b”). No domínio VL, as seguintes regiões foram enxertadas a um aceptora de consenso humano: posições 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) (figuras 7A- B). No domínio VH, posições 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 93-102 (H3) foram enxertadas (figuras 8A-B). MacCallum et al. (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)) analisaram as estruturas de cristal do complexo anticorpo e antígeno e verificaram que as posições 49, 93 e 94 de cadeia pesada são parte da região de contato e são, assim, incluídas na definição de HVR-H2 e HVR-H3 quando humanizando anticorpos.
[865] A variante enxerto direto (enxerto de huMA79b) foi gerada por mutagênese de Kunkel, tanto como o Fab exibido em um fago e como um IgG, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Os clones corretos foram avaliados por sequenciamento de DNA.
B. VARIANTES DE ENXERTO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
[866] Variantes de enxerto de anticorpo anti-CD79b que incluíram diversidade mutacional nas regiões hipervariáveis do anticorpo “humanizado” MA79b enxertado foram geradas usando bibliotecas de fagos. As variantes de enxerto de anticorpo anti-CD79b incluíram tanto uma variação de posição única no HVRs (figura 9) como variações de posição múltiplas no HVRs (figura 10).
C. SELEÇÃO DE FAGOS
[867] Para seleção de fagos, o domínio extracelular de CD79b (huCD79becd) (2 μg/ml) foi imobilizado em PBS em placas de microtítulo MaxiSorp (Nunc) durante a noite a 4oC. As placas foram bloqueadas durante pelo menos 1 h usando Casein Blocker (Pierce). Os fagos foram coletados do sobrenadante de cultura e colocados em suspensão em PBS contendo 0,5% de BSA e 0,05% de Tween 20 (PBSBT). Após a adição da biblioteca de fagos e seleção de fagos durante 2 h, os reservatórios de microtítulo foram extensivamente lavados com PBS PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) para remover fagos não ligados e fagos ligados foram eluídos incubando os reservatórios com 100 mM HCl durante 30 min. A estringência de seleção pode ser aumentada durante ciclos sucessivos de seleção aumentando o número de lavagens com PBST ou incubando com huCD79becd solúvel durante períodos de tempo crescentes antes da eluição.
[868] Os fagos eluídos foram neutralizados com 1 M Tris, pH 8 e amplificados usando células XL1-Blue e fagos auxiliares M13/KO7 e cultivados durante a noite a 37 °C in 2YT, 50 μg/ml carbenacilina. Os títulos de fagos eluídos de um reservatório contendo a marcação foram comparados a títulos de fagos recuperados de um reservatório não contendo marcação para enriquecimento da avaliação.
D. PRODUÇÃO DE FAB E PRODUÇÃO DE IGG
[869] Para expressar proteína de Fab para medições de afinidade, um códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 em um vetor de exibição de fagos. Os clones foram transformados em células de E. coli 34B8 e cultivados em meios completos C.R.A.P. média a 30°C (Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). As células foram coletadas por centrifugação, colocadas em suspensão em PBS, 100 μM PMSF, 100 μM benzamidina, 2,4 mM EDTA e rompidas abertas usando um microfluidizador. Fab foi purificado com cromatografia de afinidade de proteína G.
[870] Para fins de triagem, variantes de IgG foram inicialmente produzidas em 293 células. Vetores codificando VL e VH (25 μg) foram transfectados em 293 células usando o sistema FuGene. 500 μl de FuGene foram misturados com 4,5 ml de meio DMEM não contendo nenhum FBS e incubados em temperatura ambiente durante 5 min. Cada cadeia (25 μg) foi adicionada a esta mistura e incubada em temperatura ambiente durante 20 min e então transferidos para um frasco para transfecção durante a noite a 37°C em 5% de CO2. No dia seguinte, o meio contendo a mistura de transfecção mistura foi removido e substituído com 23 ml de meio PS04 com 0,1 ml/L de elementos traço (A0934) e 10 mg/L de insulina (A0940). As células foram incubadas durante mais 5 dias após o que o meio foi coletado a 1000 rpm durante 5 min e filtrado estéril usando um filtro de ligação de proteína de 0.22 μm. As amostras podem ser armazenadas a 4°C após a adição de 2,5 ml de PMSF a 0,1% PMSF para cada 125 ml de meio.
E. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE)
[871] Para determinação de afinidade de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b, o domínio extracelular de CD79b humano (huCD79becd) foi expresso em células CHO sozinhas ou como uma fusão de Fc (huCD79becd-Fc) e purificada por meios convencionais. Além disso, um peptídeo de 16 aminoácidos (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16) contendo um epítopo para MA79b foi sintetizado por meios convencionais.
[872] A caracterização do epítopo para o anticorpo MA79b (rotulado como “peptídeo de teste” na figura 19) foi previamente descrita no Pedido US No. 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006. O epítopo para MA79b estava localizado em na região de peptídeo extracelular peptídeo distal ao domínio de transmembrana e estava presente em um comprimento completo e formas truncadas de CD79b humano (Cragg, Blood, 100(9): 3068-76 (2002)), que são descritas em células B normais e malignas (Hashimoto, S. et al., Mol. Immunol., 32(9): 651-9 (1995); Alfarano et al., Blood, 93(7): 2327-35 (1999)). A forma truncada de CD79b é desprovida do domínio como Ig extracelular (o domínio como Ig extracelular que não está presente em uma truncada emendada de CD79b é mostrada em caixas na figura 19).
[873] A ligação de variantes de Fab e IgG de MA79b, o anticorpo “humanizado” enxertado como MA79b ou as variantes do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b em huCD79becd ou huCD79b-Fc imobilizado ou o peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo for MA79b foi medido por ressonância plasmática de superfície. As determinações de afinidade foram realizadas por ressonância de plasmon de superfície usando um BIAcoreTM-2000. O antígeno, huCD79becd ou huCD79b-Fc foi imobilizado (aproximadamente 50 - 200 RU) em 10 mM acetato de sódio pH 4,8 em um chip sensor CM5. Devido a um grande efeito de ânsia, as medições de afinidades foram sensíveis a uma quantidade de huCD79becd imobilizado. Por esta razão, as afinidades, determinadas por amostras realizadas em dias diferentes, foram normalizadas em MA79b que foi realizado junto à lateral como um padrão. Em experiências que mediram a ligação a um peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16), o peptídeo biotinilado foi capturado (aproximadamente 20 RU) em um chip sensor revestido com estreptavidina. Variante anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b purificado (como Fab ou IgG) (um diluição de duas vezes em série de 0,5 a 1000 nM in PBST) foi injetada em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Cada exemplo foi analisado com uma associação de 4 minutos e dissociação de 10 minutos. Após cada injeção, o chip foi regenerado usando 10 mM glicina pH 1,7.
[874] A resposta de ligação foi corrigida subtraindo uma célula de fluxo de controle da variante anticorpo “humanizado” enxertado com fluxo de células de MA79b (como Fab ou IgG). Um modelo Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e koff foi usado para análises cinéticas.
F. ANÁLISE DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
[875] Para ainda determinar a ligação das variantes de Fab variantes de variantes de anticorpo ou anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b, a ligação de variantes de Fab e/ou IgG a células DoHH-2 foram analisadas usando análise FACS. Além disso, a ligação de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b a célula luciferase BJAB foi analisada usando análise FACS.
[876] Para análise FACS de variantes de Fab de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (versão de IgG version usada como um controle)), células DoHH-2 (1 x 106 in 100 μl volume) foram primeiramente incubadas com ou sem 1 μg de anticorpo monoclonal anti-CD79b de camundongo original (MA79b) durante 30 minutes, antes de adicionar 1 μg da variante Fab individual (ou anticorpo de controle). Ig anti-humano de camundongo conjugado a PE, cadeia leve kappa (clone G20-193, BD Biosciences, San Diego, CA) foi usado como o anticorpo de detecção secundário, uma vez que todas as variantes de Fab carregam cadeia leve de kappa e células DoHH-2 não expressam a cadeia leve de kappa sobre a superfície da célula.
[877] Para análise FACS adicional de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (versão IgG de chMA79b usado como um controle), 1,0 μg, 0,1 μg ou 0,01 μg de anticorpo foi titulado por milhão de células de células de luciferase BJAB. Ig humano anti- camundongo conjugado a PE foi usado como o anticorpo de detecção secundário.
G. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
[878] Para ainda determinar a ligação de variantes de IgG tendo trocas em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), a ligação de variantes de IgG iodadas a células BJAB expressando CD79b humano e CD79b de cynomologous foi analisada e a análise Scatchard foi realizada.
[879] Para análise Scatchard, 0,5 nM MA79b rotulado com I125 ou huMA79b L2/H3 foi competido contra MA79b ou huMA79b L2/H3 não rotulado, respectivamente, na faixa de 50 a 0,.02 nM (diluição em série 1:2 etapa 12) na presença de uma linhagem de BJAB estavelmente transfectada expressando CD79b de cinomolgo. Após uma incubação de quarto horas a 4°C, as células foram lavadas e as contagens de pelotas de célula foram lidas por um contador gamma (1470 WIZARD Automatic Gamma Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA). Todos os pontos foram feitos em triplicata e contados durante 10 minutos. O COM médio foi usado para cálculo de Kd usando o programa New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO A. RESULTADOS DA GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B HUMANIZADO
[880] A estrutura aceptora humana usada para a geração de anticorpo anti-CD79b humanizado compreendendo o domínio VL kappa I de consenso e uma variante do domínio VH de consenso do subgrupo III humano. A variante do domínio VH tem 3 trocas de consenso humano: R71A, N73T e L78A. o VL e os domínios VH MA79b foram alinhados com os domínios do subgrupo III e kappa I humano; cada HVR foi identificado e então enxertado em uma estrutura aceptora humana para gerar um enxerto de HVR que pode ser exibido como Fab no fago (figuras 7 e 8).
[881] O fago demonstrou o enxerto de MA79b como um Fab ligado a huCD79becd imobilizado (dados não mostrados). No entanto, quando a sequência do enxerto de huMA79b foi expressa como um IgG, análise FACS de sua afinidade para huCD79becd indicou que a afinidade de ligação foi reduzida acima de 100 vez (dados não mostrados) e análise Biacore indicou uma perda acima de 50 vezes (figura 11). 1. REPARO DE CDR
[882] Variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b que foram capazes de ligar-se a huCD79becd imobilizado com as seguintes trocas de sequência foram identificadas.
[883] Somente trocas de sequência marcando HVRs em VL foram observadas em uma biblioteca contendo trocas de posição únicas e são mostradas na figura 9 (para mutações de L1: mutação Q27K (SEQ ID NO: 17; SPL-2), (para mutações de L.1: L54R (SEQ ID NO: 18), E55K (SEQ ID NO: 19)), e (para mutações mutação L,3: E93S (SEQ ID NO: 20; SPL-5), E93K (SEQ ID NO: 21)).
[884] Somente trocas de sequência marcando HVRs em L2, L3, H1 e H3 foram observadas em bibliotecas contendo múltiplas trocas de posição e são mostradas na figura 10 (para mutações L2: S52R, N53K, E55G e S56R (SEQ ID NO: 22; mutação L2-2); N53R (SEQ ID NO: 23); S52R, N53K, E55G e S56N (SEQ ID NO: 24); S52R, N53K, E55K e S56R (SEQ ID NO: 25); S52R, N53Y, E55K e S56R (SEQ ID NO: 26; mutação L2-29); S52R, N53K e E55K (SEQ ID NO: 27); S52R, N53K e E55A (SEQ ID NO: 28); S52G, N53I, E55A e S56R (SEQ ID NO: 29); S52R, N53K, E55R (SEQ ID NO: 30); S52R, N53K e E55G (SEQ ID NO: 31; mutação L2-38); S52R, N53H, E55K e S56R (SEQ ID NO: 32); A51S, S52R, N53Y, E55S e S56R (SEQ ID NO: 33); A51G, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 34); L54R e E55K (SEQ ID NO: 35); N53K e E55G (SEQ ID NO: 36); S52R, N53Y, E55R e S56R (SEQ ID NO: 37); S52R, N53R, E55R e S56T (SEQ ID NO: 38); S52R, N53R, E55G e S56R (SEQ ID NO: 39); S52R, N53Q, L54R, E55K e S56R (SEQ ID NO: 40); S52R, N53K, E55L e S56R (SEQ ID NO: 41); S52R, N53K, E55K e S56N (SEQ ID NO: 42); S52R, N53K, E55G e S56T (SEQ ID NO: 43); S52R, N53K, E55G e S56G (SEQ ID NO: 44); e S52R, N53K, E55A e S56R (SEQ ID NO: 45)), (para mutações L.3: E93A (SEQ ID NO: 46); E93Q (SEQ ID NO: 47); nenhuma mutação (SEQ ID NO: 48); E93D (SEQ ID NO: 49); E93L (SEQ ID NO: 50); Q89N, Q90N, E93G e T97N (SEQ ID NO: 51); Q90P, S91D, D94A e L96R (SEQ ID NO: 52); Q89D, S91R e E93A (SEQ ID NO: 53)), (para mutações H1: T28P, S30T, S31R e E35S (SEQ ID NO: 54); T28P, S30R e E35Q (SEQ ID NO: 55); T28P, S30T e mutação E35N (SEQ ID NO: 56); T28P, S30T, S31R e E36N (SEQ ID NO: 57; H1-6)); S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 58); T28S e S30K (SEQ ID NO: 59); G26P, T28S, F29L, S30C, S31T, W33F e E35D (SEQ ID NO: 60); T28Y e S30T (SEQ ID NO: 61); T28P, S30G, S31R, I34V e E35N (SEQ ID NO: 62); S30K e S31K (SEQ ID NO: 63); T28P, S30T e E35Q (SEQ ID NO: 64); T28P, S30R e S31R (SEQ ID NO: 65); T28P, F29V, S30G, S31R e E35S (SEQ ID NO: 66); T28P, S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 67; mutação H1-1); T28G, S30T e E35S (SEQ ID NO: 68); S30T, I34L e E35S (SEQ ID NO: 69); S30T (SEQ ID NO: 70); S31G e E35N (SEQ ID NO: 71); S30R, S31R e E35N (SEQ ID NO: 72); T28S, S30R e E35N (SEQ ID NO: 73); T28S, S30R, S31R e E35N (SEQ ID NO: 74); T28S, S30R e S31R (SEQ ID NO: 75); T28S, S30P, I34L e E35Q (SEQ ID NO: 76); T28P, S30T e S31R (SEQ ID NO: 77); T28P e S31G (SEQ ID NO: 78); T28P, S30R e E35S (SEQ ID NO: 79); T28P, S30R e E35N (SEQ ID NO: 80); T28P, S30R e S31G (SEQ ID NO: 81); T28P, S30N e S31R (SEQ ID NO: 82); T28P, S30N, S31G e E35N (SEQ ID NO: 83); T28N, F29V, I34L e E35S (SEQ ID NO: 84); Y27F, T28P, S30T e E35S (SEQ ID NO: 85); e Y27F, T28P, S30N, S31R e E35N (SEQ ID NO: 86)) e (para mutações H3: V98I e F100L (SEQ ID NO: 87; mutação H3-12); nenhuma mutação (SEQ ID NO: 88); Y99K e F100L (SEQ ID NO: 89); F100L (SEQ ID NO: 90); V98I (SEQ ID NO: 91); V98F, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 92); F100L (SEQ ID NO: 93); V98I, Y99R e F100L (SEQ ID NO: 94; mutação H3-10); V98I, Y99K e F100L (SEQ ID NO: 95); V98I e Y99R (SEQ ID NO: 96); V98I (SEQ ID NO: 97); D101S (SEQ ID NO: 98); Y99V e F100L (SEQ ID NO: 99); Y99R e F100L (SEQ ID NO: 100); Y99R (SEQ ID NO: 101); Y99F e F100L (SEQ ID NO: 102); V98I e F100L (SEQ ID NO: 103); V98I (SEQ ID NO: 104); V96R, Y99C e F100L (SEQ ID NO: 105); e V96I (SEQ ID NO: 106)).
[885] Clones selecionados foram reformados como Fab para análise por FACS e como IgG para outras análises por Biacore e Scatchard.
A. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE)
[886] Como mostrado na figura 11, mostrando análise Biacore, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade para o anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b. Os ensaios de ressonância de Plasmon de superfície mostraram que apesar de nenhuma das variantes testadas com trocas de HVR únicas terem uma afinidade similar a MA79b, a combinação de trocas identificadas em HVR- L2 e HVR-H3 (variante L2/H3 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b; também referidas aqui como huMA79b L2/H3) leva a uma variante com afinidade similar (figura 11) como MA79b quando ligando a huCD79becd ou huCD79becd- Fc L2/H3 imobilizado ou o peptídeo de 16 aminoácidos contendo o epítopo para MA79b como determinado por análise Biacore.
[887] Análise de ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) de MA79b a antígeno (huCD79becd-Fc) (figura 11, fileira 1, compara Fab a colunas de IgG) sugere que um componente de avidez de 100 vezes presente emMA79b pode estar desprovido de variantes de afinidade melhoradas. Especificamente, na variante L2-2 de anticorpo “humanizado”! enxertado com MA79b (também referido aqui como L2-2 de huMA79b) que demonstra uma melhora de 5 vezes na ligação monomérica comparada a MA79b (figura 11, fileiras 1 e 3, compara colunas de Fab), afinidade não aparente é ganha em L2-2 reformando huMA79b L2-2 como um IgG) (Figura 11, fileira 4, compara Fab a colunas de IgG). Além disso, o anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b HVR (enxerto de huMA79b) demonstra a perda deste componente de avidez na ligação (figure 11, fileira 2, compara Fab a colunas de IgG). A capacidade de melhorar a ligação através da avidez pode ser desejável na ligação a antígenos de superfície de células.
B. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
[888] Como avaliado por análise Scatchard Análise, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequência individuais que melhoram a afinidade para o de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b. Especificamente, os ensaios de ligação de células mostraram que a afinidade de MA79b e variante L2/H3 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b L2/H3 (huMA79b) (reformadas como IgG) para ligação de células BJAB expressando estavelmente CD79b de cynomologous e CD79b humano endógeno foi com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 ± 0,14 nM) e 0,52 nM (L2/H3 de huMA79b; Kd = 0,52 ± 0,1 nM), respectivamente (dados não mostrados), como determinado por análise Scatchard.
C. DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
[889] Como avaliado por análise FACS, esta abordagem de reparo de CDR identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoraram a ligação de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (enxerto de huMA79b) a células DoHH-2 (dados não mostrados). Especificamente, a análise FACS de variantes de Fab (mutações L2-2, H3-10 e H1-1) identificas de bibliotecas de SP e de 6 SR em células DoHH-2 mostrou ligação de variantes de Fab e enxerto de huMA79b (formatado como um IgG) a DoHH-2 células (dados não mostrados). Além disso, análise FACS Análise de variantes de Fab mostraram que a ligação de variantes de Fab variantes a células DoHH-2 foi bloqueada por pré-incubação com anticorpo monoclonal anti-CD79b de murino (MA79b) (dados não mostrados).
2. REPARO DA ESTRUTURA
[890] As trocas de sequência HVR introduzidas em HVR-L2 da variante LE/H3 de huMA79b L2/H3 foram radicalmente diferentes das observadas em qualquer linhagem de células embrionárias. A variante L2/H3 de huMA79b, quando conjugada a DM1, foi observada ser eficaz na inibição de crescimento de tumor em um modelo in vivo de xenoenxerto de camundongo (Tabela 9). Uma vez que a análise da ligação monomérica (Fab) versus ligação dimérica (IgG) da variante L2/H3 de huMA79b a antígeno mostrou uma perda de avidez (Figura 11), o reparo da estrutura foi realizado como descrito abaixo.
[891] Para explorar o papel de posições da estrutura em ligação a antígeno dimérica, uma variante de posições de “toda a estrutura foi construída em que posições da estrutura de murino potencialmente importantes foram incorporadas em um anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b HVR (enxerto de huMA79b). Esta variante (referida na figura 12 como “toda a estrutura”), desprovida de quaisquer trocas de HVR, possuía afinidade de ligação dimérica similar ao anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) (Figure 12) como avaliado por análise Biacore e análise Scatchard.
[892] As variantes de IgG, incluindo resíduos de estrutura de murino nas posições 4 e/ou 47 (VL) e/ou posições 47, 48, 67, 69, 71, 73, 74, 78 e/ou 80 (VH) foram geradas para determinar o ajuste mínimo de posições de estrutura necessário para manter alta afinidade, ligação dimérica (figura 12). Resíduos de estrutura de murino são mostrados nas figuras 7A-B (SEQ ID NO: 10) e figuras 8A-B (SEQ ID NO: 14). Verificou-se que 47 posições de estrutura em VL, e 75 e 80 em VH eram dispensáveis como evidenciado pelo de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b e variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v17) (figura 12, fileira rotulada como 17).
[893] Variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (MA79b.v18; figura 12, fileira rotulada como 18), que inclui resíduos da estrutura de murino nas posições 4 in VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH e ainda inclui trocas em HVR-H3 (referido na figura 13 como “H3-H10” e descrito abaixo como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, mostrou uma melhora adicional de 2 vezes (figura 12, fileira rotulada como 28) em ligação dimérica quando comparado à variante 17 (figura 12, fileira rotulada como 17).
[894] Para evitar resultados de fabricação potenciais, um sítio de formação de ácido iso-aspártico potencial (Asp-Gly) em HVR-L1 das variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b foi eliminado convertendo D28 em Glu (ácido glutâmico) (D28E; ver variante 28; também referida aqui como “huMA79b.v28”; figura 12, fileira rotulada como 28). Outras substituições para estabilidade em VL de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b também foram toleradas incluindo D28 a Ser (serina) (D28E; ver variante 32; também referida aqui como “huMA79b.v32”; figura 12, fileira rotulada como 32).
[895] Variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v28; figura 12, fileira rotulada como 28), que inclui: (1) resíduos da estrutura de murino nas posições 4 em VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, (2) as trocas ainda incluem em HVR-H3 (referido na figura 12 como “H3- 10” e descrito acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, e (3) além disso as trocas ainda incluem em HVR-L1 (D28E, descritas acima) foram caracterizadas por análise Biacore.
[896] Variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (MA79b.v32; figura 12, fileira rotulada como 32), que inclui: (1)resíduos de murino da estrutura de murino nas posições 4 in VL, e 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, (2) outras trocas incluem em HVR-H3 (referido na figura 12 como “H3- 10” e descrito acima como mutação H3-10), incluindo V98I, Y99R e F100L, e (3) além disso as trocas ainda incluem em HVR-L1 (D28S, descrito acima) foram caracterizadas por análise Biacore.
A. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE BIACORE)
[897] Como mostrado na figura 12, mostrando análise Biacore, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para huCD79becd. Os ensaios de ressonância de plasmon de superfície mostraram que a variante 28 do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v28; com posições da estrutura de murino nas posições 4 em VL, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V98I, Y99R e F100L (também descrito acima) e a mutação D28E em HVR-L1 (para estabilidade, ver a descrição acima); a figura 12, fileira rotulada como 28) e a variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v32; com a estrutura de murino nas posições 4 em VL, 47, 48, 67, 69, 71, 73 e 78 em VH, bem como a mutação H3-10 em HVR-H3 (V98I, Y99R e F100L (também descrito acima) e a mutação D28S em HVR-L1 (para estabilidade, ver descrição abaixo); figura 12, fileira rotulada como 32) tem afinidade equivalente a anticorpo MA79b quimérico (chMA79b) quando da ligação a huCD79becd imobilizado como determinado análise Biacore.
B. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE (ANÁLISE SCATCHARD)
[898] Como avaliado por análise As, similar a uma análise Biacore, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a afinidade do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (enxerto huMA79b). Os ensaios de ligação de células mostraram que a afinidade de MA79b, variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v28; ver figura 12, fileira rotulada como 28) (reformatada como IgG), e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v32; ver figura 12, fileira rotulada como 32) para ligar células BJAB expressando estavelmente CD79b de cynomolgous e CD79b endógeno humano com valores Kd de 0,63 nM (MA79b; Kd = 0,63 ± 0,14 nM), 0,44 nM (huMA79b.v28; Kd = 0,44 ± 0,04 nM), e 0,24 nM (huMA79b.v32; Kd = 0,24 ± 0,02 nM), respectivamente (dados não mostrados), como determinado por análise Scatchard.
C. DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÃO (ANÁLISE FACS)
[899] Como avaliado por análise FACS, esta abordagem de reparo de estrutura identificou muitas trocas de sequências individuais que melhoram a ligação do anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (enxerto de huMA79b) a células de luciferase BJAB (dados não mostrados). Especificamente, a análise FACS de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (variantes huMA79b.v28 e huMA79b.v32) para células de luciferase BJAB mostrou ligação a células de luciferase BJAB t (dados não mostrados). B. DISCUSSÃO DA GERAÇÃO ANTICORPOS ANTI-CD79B HUMANIZADOS
[900] Partindo de um enxerto do murino 6 MA79b HVRs (como definido como posições 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) e 93-102 (H3)) em um VL Kappa I de consenso humano e VH do subgrupo IIII VH (contendo A71, T73 e A78), o reparo de CDR foi usado para identificar trocas em HVRs 1-6 que melhora a afinidade de ligação. Trocas das sequências de HVR identificadas nas figuras 10 e 11 ou combinações destas trocas levam a variantes de MA79b humanizadas com afinidades similares a MA79b.
[901] Alternativamente, o reparo da estrutura foi usado para recapturar a avidez da ligação dimérica pela adição das posições 4 à estrutura em VL, e 48, 67, e 69 em VH no enxerto de huMA79b (que inclui resíduos da estrutura de murino em 71, 73 e 78 de VH) (figura 12; variante 17 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v17)). A afinidade destas variantes de mutação de estrutura para o antígeno huCD79becd foi ainda melhorada pela adição de 3 trocas em HVR-H3: V98I, Y99R e F100L (figura 12; variante 18 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v18)). Um sítio de formação de ácido iso-aspártico potencial em HVR-L1 foi eliminado com a mutação D28E mutação (figura 12; variante 28 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b (huMA79b.v28)). EXEMPLO 2: GERAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-CD79B DRUG (ADCS)
[902] Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b, as variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b foram conjugadas a drogas, tal como DM1. As variantes conjugadas a DMI incluíram as variantes tendo trocas em HVR-L2 e HVR-H3 (huMA79b L2/H3), huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32.
[903] As drogas usadas para geração do conjugado anticorpo- drogas (ADCs) para o anticorpo anti-CD79bs incluíram derivados de maitansinóide DM1 e dolostatina 10 monometilauristatina E (MMAE) e monometilauristatina F (MMAF). (US 2005/0276812; US 2005/0238649; Doronina et al., Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006); Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003); Erickson et al., Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006), todos sendo incorporados aqui por referência em sua totalidade). Ligantes úteis para a geração de ADCs são BMPEO, SPP ou SMCC (também referidos aqui como “MCC”) para DM1 e MC ou MC-vc-PAB para MMAE e MMAF. Para DM1, os anticorpos foram ligados a um grupo thio de DM1 e através de um grupo amino de lisina usando o reagente ligante SMCC. Alternativamente, para DM1, os anticorpos foram ligados a DM1 através de um grupo e-amino de lisina usando o ligante SPP Pentanoato de N-succinimidil 4-(2'-piridilditio)) reage com o grupo amino épsilon de lisinas para dar o ligante reativo dissulfeto de 2- piridila em uma proteína. Com ligantes SPP, quando da reação com o sulfidral livre (por exemplo, DM1), o grupo piridila é substituído, deixando o DMI fixado por uma ligação dissulfeto reduzível. DM1 fixado por um ligante SPP é liberado sob condições de redução (isto é, por exemplo, dentro das células) enquanto DM1 fixado pelo ligante SMCC é resistente a clivagem em condições de redução. Além disso, SMCC-DM1 ADCs induzem a toxicidade da célula se o ADC é internalizado e marcado em um lisossoma causando a liberação de lisina -Nn- DM1, que é um agente anti-mitótico eficaz dentro de uma célula, e quando liberada da célula, a lisina-Nδ-DM1 é não-tóxica (Erickson et al., Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006)) Para MMAE e MMAF, os anticorpos estavam ligados a MMAE ou MMAF através de cisteína por maleimidocaproil-valina-citrulina (vc)-p- aminobenziloxicarbonila (MC-vc-PAB). Para MMAF, os anticorpos foram alternativamente ligados a MMAF através de cisteína por ligante de maleimidocaproíla (MC). O ligante MC-vc-PAB é clivável por proteases intercelulares tal como catepsina B e quando clivado, libera droga livre (Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003)) Enquanto o MC é resistente a clivagem por proteases intracelulares.
[904] Os conjugados anticorpo-drogas (ADCs) para anti-CD79b, usando SMCC e DM1, foram gerados semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0276812. Anticorpos purificados anti-CD79b foram trocados com tampão em uma solução contendo 50 mM fosfato de potássio e 2mM EDTA, pH 7,0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) foi dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado a uma solução de anticorpo para produzir uma relação molar SMCC/Ab de 10:1. A reação foi deixada prosseguir durante três horas em temperatura ambiente com misturação. O anticorpo modificado com SMCC foi subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em 35 mM citrato de sódio com 150 mM NaCl e 2 mM EDTA, pH 6,0. DM1, dissolvido em DMA, foi adicionado a uma preparação de anticorpo SMCC para dar uma relação molar de DMI para anticorpo de 10:1. A reação foi deixada prosseguir durante 4-20 h em temperatura ambiente com misturação. A solução de anticorpo modificado com DM1 foi diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover DM1 não reagido, filtrada estéril, e armazenada a 4 graus C. Tipicamente, um rendimento de anticorpo de 40-60% foi obtido através deste processo. A preparação foi geralmente >95% monomérica como avaliado por filtração de gel e varredura com luz de laser. Uma vez que DM1 tem uma absorção máxima a 252 nm, a quantidade de droga ligada a um anticorpo pode ser determinada por medições de absorção diferenciais a 252 e 280 nm. Tipicamente, a relação de droga para anticorpo foi 3 para 4.
[905] Os conjugados anticorpo-drogas (ADCs) para anticorpo anti- CD79bs descrito aqui usando ligantes SPP-DM1 podem ser gerados semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0276812.Anticorpos aAnti-CD79b purificados são trocados com tampão em uma solução contendo 50 mM fosfato de potássio e 2 mM EDTA, pH 7,0. O SPP (Imunogene) foi dissolvido em DMA e adicionado a uma solução de anticorpo para produzir uma relação molar de SPP/Ab final de aproximadamente 10:1, a relação exata dependendo da carga de droga desejada do anticorpo. Uma relação de 10:1 geralmente resultará em um relação de droga para anticorpo de aproximadamente 3-4. O SPP é deixado reagir durante 3-4 horas em temperatura ambiente com misturação. O anticorpo modificado com SPP é subsequentemente purificado em uma coluna de dessalinização GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada em 35 mM citrato de sódio com 150 mM NaCl e 2 mM EDTA, pH 6,0 ou solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. DM1 é dissolvido em DMA e adicionado à preparação de anticorpo SPP para dar uma relação molar de DM1 para anticorpo de 10:1, que resulta em excesso molar de 3 -4 vezes sobre os ligantes de SPP disponíveis em um o anticorpo. A reação com DM1 é deixada prosseguir durante 4-20 h em temperatura ambiente com misturação. A solução de anticorpo modificada com DM1 é diafiltrada com 20 volumes de PBS para remover DMI não reagido, filtrada estéril, e armazenada a4 graus C. Tipicamente, rendimentos do anticorpo de 40-60% ou mais são obtidos com este processo. O conjugado anticorpo-droga é geralmente >95% monomérico como avaliado por filtração de gel e varredura de luz laser. A quantidade de droga ligada é determinada pó medições de absorção diferenciais a 252 e 280 nm como descrito para a preparação de conjugados SMCC-DM1 (descrito abaixo).
[906] Conjugados anticorpo-drogas (ADC) para anticorpos anti- CD79b descritos aqui usando os ligantes de droga MC-MMAF, MC-MMAE, MC- val-cit (vc)-PAB-MMAE ou MC-val-cit (vc)-PAB-MMAF também podem ser gerados semelhantemente ao procedimento descrito em US 2005/0238649. Anticorpo anti-CD79b purificado é dissolvido em 500 mM borato de sódio e 500 mM cloreto de sódio em pH 8,0 e ainda tratado com um excesso de 100 MM ditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 graus C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1 mM DTPA. O valor de tiol/Ab é verificado para determinar a concentração de anticorpo reduzido a partir de absorvência a 280 nm da solução e a concentração de tiol por reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvência a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PSS foi resfriado em gelo. O ligante de droga, por exemplo, MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE, em DMSO, é dissolvido em uma acetonitrila e água, e adicionado a um anticorpo resfriado em PBS. Após incubação durante uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriamento e cobre quaisquer grupos tiol de anticorpo não reagido. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o conjugado anticorpo-droga, é purificado e dessalinizado por eluição através da resina G25 em PBS, filtrada através de filtros de 0,2 μm em condições estéreis, e congeladas para armazenamento.
[907] Os conjugados anticorpo-drogas (usando o anticorpo anti- CD79bs descrito aqui) foram diluídos a 2 x 10 μg/ml em um meio de ensaio. Os conjugados foram ligados com reticuladores SMCC (ligante de dissulfeto alternativo pode ser usado para SPP em toxina de maitansinóide DM1) (Ver US 2005/0276812 e US 2005/0238649). Além disso, os conjugados podem ser ligados com MC-valina-citrulina (vc)-PAB ou MC em derivados de dolastatina10, toxina monometilauristatina E (MMAE) ou toxina monometilauristatina F (MMAF) (Ver Pedido US No. 11/141.344, depositado em 31 de maio de 2005 e Pedido US No. 10/983.340, depositado em 5 de novembro de 2004). Controles negativos incluíram conjugados baseados em HERCEPTIN® (trastuzumab) (anti-HER2) (SMCC-DM1 ou SPP-DM1 ou MC-vc-MMAE ou MC-vc-MMAF). Os controles positivos podem incluir L-DMI livre equivalente à dose de carga de conjugado. As amostras foram vortexadas para assegurar mistura homogênea antes da diluição.
[908] O anticorpo anti-CD79b para conjugação de droga incluiu anticorpos MA79b quiméricos (chMA79b) e variante de anticorpo huMA79b L2/H3 e huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32 descritos aqui Exemplo 1). Outros anticorpos para conjugação podem incluir quaisquer anticorpos descritos aqui Exemplo 1).
EXEMPLO 3: ENSAIO DE EXTERMÍNIO DE CÉLULAS DE TUMOR IN VIVO A. XENOENXERTOS
[909] Para testar a eficácia de variantes de IgG de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b tendo trocas em HVR-L2 e HVR- H3 (huMA79b L2/H3), o a variante huMA79b L2/H3 foi conjugada a DM1 e o efeito da variante conjugada em tumores de camundongos foi analisado.
[910] Especificamente, a capacidade dos anticorpos regredirem, tumores em múltiplos modelos de xenoenxertos, incluindo células RAMOS, células BJAB, (linhagem de células de linfoma de Burkitt que contêm a translocalização, translocalização de (2;8)(p112;q24) (IGK-MYC), um gene p53 mutado e são vírus Epstein-Barr (EBV) negativo) (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), células Granta 519 (linhagem de célula de linfoma de célula do manto) que contêm a t(11;14)(q13;q32) (BCL1-IGH) translocação que resulta em uma superexpressão de ciclina D1 (BCL1), contém deleções P16INK4B e P16INK4A e são EBV positivos) (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)). Células U698M (linhagem de células B de linfosarcoma linfloblástico (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001) e célula DoHH2 (linhagem de células de linfoma folicular que contém a característica de translocação de linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) cujos resultados em uma superexpressão de Bcl-2 conduzida por uma cadeia pesada contêm a deleção P16INK4A, contém a translocação t(8;14)(q24;q32) (IGH-MYC) e são negativos para EBV) (Drexler, H.G., o Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), pode ser examinado.
[911] Para análise da eficácia de variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para análise da eficácia do mesmo, camundongos SCID fêmeas (de 6 a 8 semanas de idade de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) foram inoculados subcutaneamente com 2 X 107 células de luciferase BAJB ou células Granta-519 por injeção nos flancos de camundongo em um flanco de camundongo SCID de CB17 ICR e os tumores de xenoenxerto foram deixados crescer em uma média de 200 mm2. O dia 0 refere-se ao dia que os tumores estavam na média de 200 mm2 e quando a primeira/ ou única dose de tratamento foi administrada, a menos que especificamente indicado abaixo. O volume do tumor foi calculado baseado em duas dimensões, medidas usando paquímetro, e foi expresso em mm3 de acordo com a fórmula: V= 0,5a X b2, onde a e b são os diâmetros longo e curto do tumor, respectivamente. Dados coletados de cada grupo experimental foram expressos como média + desvio padrão. Grupos de 10 camundongos foram tratados com uma dose intravenosa (i.v.) única de 50 μg e 210 μg de droga ligada ao anticorpo camundongo/m2 (correspondendo a ~1-4 mg/kg de camundongo) com variantes de anticorpo humanizado” enxertado com MA79b ou conjugado anticorpo- drogas de controle. Os tumores foram medidos tanto uma vez como duas vezes por semana por toda a experiência. Os pesos corporais dos camundongos foram medidos tanto uma vez como duas vezes por semana por toda a experiência. Os camundongos foram eutanasiados antes dos volumes do tumor alcançarem 3000 mm3 ou quando os tumores mostraram sinais de ulceração iminente. Todos os protocolos dos animais foram aprovados por um Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC).
[912] Os ligantes entre o anticorpo e a toxina que foram usados foram reticulador de SMCC de tioéter SMCC para DM1. Ligantes adicionais podem incluir ligados de dissulfeto SPP ou reticulador SMCC de tioéter para DM1 ou MC ou MC-valina-citrulina(vc)-PAB ou (uma valina-citrulina (vc)) reagente ligante de dipeptídeo) tendo um componente de maleimida e componente de para-aminobenzlcarbamoíla (PAB) auto-imolante para monometilauristatina E (MMAE) ou monometilauristana F (MMAF). As toxinas usadas foram DM1. Toxinas adicionais podem incluir MME ou MMAF.
[913] Anticorpos CD79b para esta experiência incluíram anticorpos quiméricos MA79b (chMA79b) como descrito no Pedido US No. 11/462.336, depositado em 3 de agosto de 2006 bem como variantes de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b descritas aqui (ver Exemplo 1A). Anticorpos adicionais podem incluir anticorpos comercialmente disponíveis, incluindo anticorpo anti-CD79b, e anticorpos monoclonais MA79b gerados de hibridomas depositados com o ATCC como HB11413 em 20 de julho de 1993.
[914] Os controles negativos incluíram conjugados (SMCC-DM1) baseados em anti-HER2 (HERCEPTIN® (trastuzumab)
B. RESULTADOS 1. BJAB-XENOENXERTOS DE LUCIFERASE
[915] Em um curso de tempo de 35 dias com conjugados de droga e doses como mostrado na tabela 9, a variante de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b L2/H3 (variante huMA79b L2/H3) (reformada como IgG) e anticorpo quimérico anti-CD79b (chMA79b) conjugado a DM1 (huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1, respectivamente), mostrou inibição de crescimento de tumor em camundongos SCID com tumores de luciferases BJAB comparado ao controle negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC- DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (como indicado na tabela 9) no dia 0 para todos os ADCs e controles. Especificamente, os anticorpos huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 (reformados como IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significativamente o crescimento de tumor (figura 20). Além disso, na tabela 9, o número de camundongos fora do número total de camundongos testados mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu para 0 mm3) são indicados. TABELA 9
Figure img0088
2. XENOENXERTOS GRANTA-519
[916] Em um curso de tempo de 14 dias com conjugados de droga e doses como mostrado na tabela 10, variante 17, variante 18, variante 28 e variante 32 de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b, (huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 e huMA79b.v32, respectivamente) (reformadas como IgG) e anticorpo anti-CD79b quimérico (chMA79b) conjugado a DM1 (huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC-DM1, huMA79b.v28-SMCC- DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1 e chMA79b-SMCC-DM1, respectivamente), mostraram inibição de crescimento de tumor em camundongos SCID com tumores Granta-519 comparado ao controle negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1). ADCs foram administrados em uma dose única (como indicado na tabela 10) no dia 0 para todos os ADCs e controles. Especificamente, os anticorpos huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1 e huMA79b.v18-SMCC- DM1 (reformados como IgG) e chMA79b-SMCC-DM1 inibiram significativamente o crescimento de tumor (figura 21A).
[917] Além disso, o tratamento com huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC- DM1 e chMA79b-SMCC-DM1 e controle HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC- DM1 (anti-HER2-SMCC-DM1) não resultou em um decréscimo no peso corporal percentual dos camundongos (figura 21B). Além disso, na tabela 10, o número de camundongos fora do número total de dez camundongos testados mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia 0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu para 0 mm3) são indicados. TABELA 10
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[918] À luz da capacidade de ADCs de anticorpo “humanizado” enxertado com MA79b para inibir significativamente a progressão de tumor em xenoenxertos, moléculas de CD79b podem ser excelentes marcações para terapia de tumores em mamífero incluindo cânceres associados a células B, tal como linfomas (isto é linfoma não- Hodgkin), leucemias (isto é leucemia linfocítica crônica), e outros cânceres de células hematopoiéticas. Além disso, ADCs “humanizados”! enxertados em MA79b são úteis para reduzir o crescimento de tumores in vivo, incluindo cânceres associados a células B, tal como linfomas (isto é linfoma não-Hodgkin), leucemias (isto é leucemia linfocítica crônica), e outros cânceres de células hematopoiéticas.
EXEMPLO 4: CO-LOCALIZAÇÃO DO ANTICORPO CD79B
[919] Para determinar onde variantes de anticorpo e anticorpo “humanizados” enxertados com MA79b são liberados quando da internalização em uma célula, estudos de co-localização do anticorpo anti-CD79b internalizado em linhagens de células B pode ser avaliado em linhagens de células Ramos. LAMP-1 é um marcador para endossomas e lisossomas tardios (Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology, 139(3): 639-649 (1997); Hunziker et al., Bioessays, 18:379-389 (1996); Mellman et al., Annu. Rev. Dev. Biology, 12:575-625 (1996)), incluindo compartimentos de classe I de MHC (MIICs), que é um compartimento como endossoma/lisossoma tardio. HLA-DM é um marcador para MIICs.
[920] Células de Ramos são incubadas durante 3 horas a 37°C com 1 μg/ml de variantes de anticorpo e anticorpo “humanizados” enxertados com MA79b.MA79b, bloco (Miltenyi) e 25μg/ml Alexa647-Transferrina (Molecular Probes) em meio livre de carbonato completo (Gibco) com a presença de 10μg/ml leupeptina (Roche) e 5μM pepstatina (Roche) para inibir a degradação lisossomal. As células são então lavadas duas vezes, fixadas com 3% de paraformaldeído (Electron Microscopy Sciences) durante 20 minutos em temperatura ambiente, resfriadas com 50 mM NH4Cl (Sigma), permeabilizadas com 0.4% de saponina/2% FBS/1% BSA durante 20 minutos, então incubadas com 1 μg/ml Cy3 anti-camundongo (Jackson Immunoresearch) durante 20 minutos. A reação é então bloqueada durante 20 minutos com IgG de camundongo (Molecular Probes), seguido por uma incubação de 30 minutos com Image-iT FX Signal Enhancer (Molecular Probes). As células são finalmente incubadas com anti-LAMPq de camundongo rotulado com Zenon Alexa488 (BD Pharmingen), a marcador para ambos lisossomas e MIIC (um compartimento como lisossoma que é parte da via de classe II de MHC), durante 20 minutos, e pós-fixadas com 3% de PFA. As células são recolocadas em suspensão em 20μl de tampão de saponina e deixadas aderir a lâminas revestidas com poli-lisina (Sigma) antes de montar uma cobertura de vidro com VectaShield contendo DAPI (Vetor Laboratories). Para imunofluorescência do MIIC ou lisossomas, as células são fixadas, permeabilizadas e melhoradas como acima, então co- coloridas com Alexa555-HLA-DM (BD Pharmingen) rotulado com Zenon e Alexa488-Lamp1 na presença de excesso de camundongo IgG como pelas instruções do fabricante (Molecular Probes).
[921] Consequentemente, variantes de anticorpo e anticorpo “humanizados” enxertados com MA79b.MA79b com MIIC ou lisossomas de linhagens de células B, como avaliado por imunofluorescência, pode indicar moléculas como excelentes agentes para terapia de tumores em mamíferos, incluindo cânceres associados a células B, tal como linfomas (isto é linfoma não -Hodgkin), leucemias (isto é leucemia linfocítica crônica), e outros cânceres células hematopoiéticas.
EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO OF ANTICORPOS ANTI-CD70B SUBMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEÍNA
[922] A preparação de anticorpos anti-CD79b submetido à engenharias com cisteína foi realizada descrito aqui.
[923] DNA codificando o anticorpo MA79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 4, figura 4; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 5, figura 5), foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o DNA de cadeia leve e de cadeia pesada codificando o anticorpo MA79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 5; figura 5) também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a região FC de cadeia pesada.
[924] DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 304, figura 15) foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v17 (cadeia leve, SEQ ID NO: 303; figura 15; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 304; figura 15), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o cadeia leve ou a região FC do cadeia pesada.
[925] DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 306, figura 16) foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v18 (cadeia leve, SEQ ID NO: 305; figura 16; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 306; figura 16), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o cadeia leve ou a região Fc de cadeia pesada.
[926] DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, figura 17), foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificara cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo huMA79b.v28 (cadeia leve, SEQ ID NO: 307, figura 17; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 308, figura 17), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar o cadeia leve ou a região Fc de cadeia pesada.
[927] DNA codificando o anticorpo huMA79b.v32 (cadeia leve, SEQ ID NO: 310, figura 18; e cadeia pesada, SEQ ID NO: 309, figura 18) pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar as cadeias leve e cadeia pesada.
[928] DNA codificando o anticorpo anti-cyno CD79b (cadeia leve, SEQ ID NO: 241; figura 45 e cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, figura 47), foi mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a cadeia leve e cadeia pesada. DNA codificando o anticorpo anti-cyno CD79b (cadeia pesada, SEQ ID NO: 243, Figura 47), também pode ser mutagenizado por métodos descritos aqui para modificar a região FC de cadeia pesada.
[929] Na preparação dos anticorpos anti-CD79b submetido a engenharias com cisteína, DNA codificando a cadeia leve foi mutagenizado para substituir cisteína por valina na posição 205 de Kabat na cadeia leve (posição sequencial 209) como mostrado na figura 27 (cadeia leve SEQ ID NO: 235 de MA79b thioMAb) e Figura 49 (cadeia leve SEQ ID NO: 300 de thioMAb anti-cyno CD79b (ch10D10)). DNA codificando a cadeia pesada foi mutagenizado para substituir cisteína por alanina na posição 118 em uma cadeia pesada (posição sequencial posição 118; número de Kabat número 114) como mostrado na figura 48 (cadeia pesada SEQ ID NO: 244 de thioMAb anticorpo anti-cyno CD79b (ch10D10)), figura 28 (cadeia pesada SEQ ID NO: 236 de MA79b thioMAb), figura 24 (cadeia pesada SEQ ID NO: 228 de thioMAb huMA79b.v17), Figure 25 (cadeia pesada SEQ ID NO: 230 de thioMAb huMA79b.v18) e na figura 26 (cadeia pesada SEQ ID NO: 232 de thioMAb huMA79b.v28). A região FC do anticorpo anti-CD79bs pode ser mutagenizada para substituir cisteína por serina na posição 400 EU em uma cadeia pesada de região Fc (posição sequencial 400; número 396 de Kabat) como mostrado nas Tabelas 2-4. A. PREPARAÇÃO ANTICORPOS-ANTICD79B SUBMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEÍNA PARA CONJUGAÇÃO POR REDUÇÃO E REOXIDAÇÃO
[930] Anticorpos monoclonais anti-CD79b submetido à engenharias com cisteína, de comprimento completo (ThioMabs) expressos em células CHO e purificados em uma cromatografia de afinidade de proteína seguido por uma cromatografia de tamanho de exclusão. Os anticorpos purificados são reconstituídos 500mM borato de sódio e 500 mM cloreto de sódio a cerca de pH 8,.0 e reduzidos excesso molar de cerca de 50-100 vezes de 1 mM TCEP hidrocloreto de (tris(2-carboxietil)fosfiba; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante cerca de 1-2 h a 37 °C. O ThioMab reduzido é diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em 10 mM acetato de sódio, pH 5, e eluído com PBS contendo 0,3M cloreto de sódio. O ThioMab reduzido eluído é tratado com 2 mM de ácido dehidroascórbico (dhAA) em pH 7 durante 3 horas, ou 2 mM sulfato de cobre aquoso (CuSO4) em temperatura ambiente durante a noite. A oxidação do ar ambiente também pode ser eficaz. O tampão é trocado por eleição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1mM DTPA. O valor de tiol/Ab é estimado determinando a concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvência a 280 nm da solução e a concentração de tiol por reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvência a 412 nm.
EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE DROGA ANTICORPO ANTI-CD79B SUBMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEÍNA POR CONJUGAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD79B SUBMETIDO À ENGENHARIA COM CISTEÍNA E INTERMEDIÁRIOS LIGANTES DE DROGA SUBMETIDO À ENGENHARIAS COM CISTEÍNA
[931] Após os procedimentos de redução e reoxidação do exemplo 5, o anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com cisteína é reconstituído em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e resfriado em gelo, em equivalentes de cerca de 1,5 molar com relação às cisteínas engenheiradas pelo anticorpo de um intermediário ligante de droga auristatina, tal como MC-MMAE (maleimidocaproil-monometil auristatina E), MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE, ou MC-val-cit-PAB-MMAF, com o grupo funcional reativo com tiol tal como maleimida, é dissolvido em DMSO, diluído em acetonitrila e água, e adicionados a um anticorpo reoxidado reduzido com resfriamento em PBS. Após cerca de uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar e cobre quaisquer grupos tiol não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o conjugado droga anticorpo CD79b submetido à engenharia com cisteína é purificado e dessalinizado por eluição através de uma resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 μm em condições estéreis, e congelado para armazenamento
[932] A preparação de huMA79b.v18-HC(A118C) thioMAb- BMPEO-DM1 foi realizada como a seguir. A cisteína livre em huMA79b.v18- HC(A118C) thioMAb foi modificada pelo reagente bis-maleimida BM(PEO)3 (Pierce Chemical), deixando um grupo maleimida não reagido sobre uma superfície do anticorpo. Isto foi realizado dissolvendo BM(PEO)3 em uma mistura de 50% de etanol/água em uma concentração de 10 mM e adicionando um excesso molar de dez vezes de BM(PEO)3 a uma solução contendo huMA79b.v18-HC(A118C) thioMAb em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolar) e deixando reagir durante 1 hora. O excesso de BM(PEO)3 foi removido por filtração com gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em 30 mM citrato, pH 6 com 150 mM tampão de NaCl. Um excesso molar de DM1 dissolvido 10 vezes aproximadamente em dimetil acetamida (DMA) foi adicionado ao intermediário huMA79b.v18- HC(A118C) thioMAb-BMPEO. Dimetilformamida (DMF) também pode ser empregada para dissolver o reagente da porção de droga. A mistura de reação foi deixada reagir durante a noite antes de filtração com gel ou diálise em PBS para remover droga não reagida. A filtração com gel em colunas S200 em PBS foi usada para remover agregados de peso molecular alto e fornecer huMA79b.v18-HC(A118C) thioMAb-BMPEO-DM1 purificado.
[933] Pelos mesmos protocolos, controle de thio hu-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, controle de thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- MMAF, controle de thi hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e controle de thio anti-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF foram gerados.
[934] Pelos procedimentos acima, os seguintes conjugados de droga anticorpo anti-CD79b submetido à engenharia com proteína (TDCs) foram preparados e testados: 1. thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-MMAF; 2. thio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação de A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e BMPEO-DM1; 3. thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE por conjugação de A118C thio huMA79b.v18-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 4. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de A118C thio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-MMAF; 5. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação de thio huMA79b.v28-HC(A118C) e BMPEO-DM1; 6. thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-val-cit-PAB-MMAE por conjugação de thio huMA79b.v28-HC(A118C) e MC-val-cit-PAB-MMAE; 7. thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de A118C thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC-MMAF; 8. thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 por conjugação de A118C thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e BMPEO-DM1; 9. thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE por conjugação de A118C thio anti-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) e MC-val- cit-PAB-MMAE; 10. thio MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF por conjugação de thio MA79b-HC(A118C) e MC-MMAF; e 11. thio MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF por conjugação de thio MA79b-LC(V205C) e MC-MMAF.
EXEMPLO 7: CARACTERIZAÇÃO DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE CONJUGADOS DROGA THIOMAB SUBMETIDOS À ENGENHARIA COM CISTEÍNA A ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE CÉLULA
[935] A afinidade de ligação de conjugado de drogas thio huMA79b.v18, thio huMA79b.v28 e thio MA79b em CD79b expresso em células de luciferase BJAB foi determinada por análise FACS. Além disso, a afinidade de ligação de conjugados de droga thio anti-cynoCD79b(ch10D10) a CD79b expresso em células BJAB expressando cynoCD79b foi determinada por análise FACS.
[936] Resumidamente, aproximadamente 1x106 células em 100 μl foram contatadas com quantidades variadas (1,0 μg, 01. μg ou 0.01 μg de Ab por células Ab por milhão de células de luciferase BAJB ou células BJAB expressando cynoCD79b (para anti-cynoCD79b thioMAbs)) de um dos seguintes conjugados droga anti-cD79 ou nus (Ab não conjugado como um controle): (1) thio MA79b- LC(V205C)-MC-MMAF ou (2) thio MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF (figuras 29A-B, respectivamente); (3) thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, (4) thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-vcPAB-MMAE ou (5) thio huMA79b.v18-HC(A118C)- BMPEO-DM1 (figuras 30B-D, respectivamente); (6) thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE, (7) thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, ou (8) thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF (ver figuras 31B-31D, respectivamente); ou (9) thio anti-cynoCDb79(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, (10) thio anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 ou (11) thio anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF (ver figuras 32B-32D, respectivamente). Ig anti-humano de camundongo conjugado a PE foi usado como o anticorpo de detecção secundária (BD Cat#555787).
[937] O anticorpo anti-CD79 ligado à superfície da célula foi detectado usando o conjugado PE de Ig de camundongo anti-humano. Os traços em gráfico das figuras 29-32 indicam que a ligação foi aproximadamente igual para todos os conjugados thioMAb-droga testados.
EXEMPLO 8: ENSAIO PARA REDUÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS IN VITRO POR CONJUGADOS ANTI-CD79B THIOMAB-DROGA.
[938] A potência in vitro de conjugados anti-CD79b ThioMAb- droga (incluindo thio huMA79b.v18-HC(A118C)-MCMMAF, thio huMA79b.v28- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1), foi medida por um ensaio de proliferação de células (figura 41A, BJAB-luciferase; Figura 41B, Granta-519; Figura 41C, WSU-DLCL2). O Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp CellTiter-Glo® é um método de ensaio homogêneo comercialmente disponível de (Promega Corp., Madison, WI), na expressão recombinante de luciferase Coleoptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670). Este ensaio de proliferação de células determina o número de células viáveis em cultura baseada na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al., J. Immunol. Metho., 160: 81-88 (1993); US 6602677). O ensaio de CellTiter-Glo® foi conduzido no formato de 96 reservatórios, tornando o mesmo receptivo a triagem de alta produção automática (HTS) (Cree et al., AntiCancer Drogas, 6:398-404 (1995)). O procedimento de ensaio homogêneo ensaio envolve a adição de reagente único (The CellTiter-Glo® Reagent) diretamente a células cultivadas em meio suplementado com soro.
[939] O formato homogêneo “medida da mistura adicionada resulta em lise de células e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. O substrato, Besouro Luciferina, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume recombinante com a conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fótons. As células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativas (RLU). Os dados podem ser registrados por luminômetro ou dispositivo de formação de imagem de câmera CCD. A saída de luminescência é apresentada como RLU, medida no curso de tempo. A % de RLU é a percentagem de RLU normalizada comparada a um controle de “conjugado de não-droga. Alternativamente os fótons de luminescência podem ser contados em um contador de cintilação na presença de um cintilante. As unidades claras podem ser representadas então como CPS (contagens por segundo).
[940] A eficácia dos conjugados thioMAb-droga foi medida por um ensaio de proliferação de células empregando o seguinte protocolo, adaptado de CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, boletim técnico TB288; Mendoza et al., Cancer Res., 62: 5485-5488 (2002)): [1] Uma alíquota de 40 μl da cultura de células contendo cerca de 3000 células BJAB, Granta-519 ou WSU-DLCL2 no meio foi depositada em cada reservatório de uma placa emparedada opaca de 384 reservatórios. [2] TDC (conjugado ThioMab-Droga (10 μl) foi adicionado a reservatórios experimentais quadruplicados na concentração final de 3333, 1111, 370, 123, 41, 13,7, 4.6 ou 1,5 ng/mL, com reservatórios de controle de "conjugado não-droga " recebendo o meio sozinho, e incubado durante 3 dias. [3] As placas foram equilibradas em temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. [4] Reagente CellTiter-Glo (50 μl) foi adicionado. [5] Os conteúdos foram misturados durante 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise de células. [6] A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência. [7] A luminescência foi registrada e expostas gráficos como %RLU (unidades de luminescência relativas). Os dados das células incubadas com o meio livre de conjugado-droga foram traçados em gráfico a 0,51 ng/ml.
[941] Meios: Cultura de células BJAB, Granta-519 e WSU-DLCL2 em RPMI1640/10%FBS/2mM glutamina.
EXEMPLO 9: ENSAIO PARA INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR IN VIVO PELOS CONJUGADOS ANTI-CD79B THIOMAB DROGA A. GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA MENTLE HUMANA)
[942] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados thioMAb-droga em xenoenxertos de Granta-519 (linfoma de célula do manto humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 11, abaixo.
[943] O Ab de controle foi hu-anti-HER2-MC-MMAF ou MA79b- MC-MMAF. HC(A118C) thioMAb foi thio hu-anti-HER2-HC(A118C)-MMAF thioMAb. Os resultados são mostrados na tabela 11 e figura 33.
[944] A figura 33A é uma troca de traços em gráfico no volume médio do tumor no curso de tempo no enxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com A118C de cadeia pesada ou anti- CD79b TDCs V205C de cadeia leve, em doses como mostrado na tabela 11. Especificamente, a administração de thio chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF e thio chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (anti-hu-HER2-MC-MMAF e thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF. Outros controles incluíram MA79b-MC-MMAF.
[945] Além disso, no mesmo estudo, a percentagem de troca de peso corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (figura 33B) indicaram que a administração destes conjugados thioMAb droga não resulta em uma percentagem de peso de peso corporal ou perda de peso durante este período.
[946] Além disso, ainda, na tabela 11, o número de camundongos fora do número total testado mostrou PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 11 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO T HIO CHMA79B-HC(A1 18C) Ou T HIO CHMA79B- LC(V205C) MMAF EM ENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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B. XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT)
[947] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3 (acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados de droga adicionais foi testada em enxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17. Os conjugados de droga e as doses (administrados no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 12, abaixo.
[948] O anticorpo de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). HC (A118C) thioMAb de controle foi thio hu-anti-HER2- HC(A118C o anticorpo) anticorpo thioMab (conjugado a BMPEO-DM1, MC- MMAF ou MCvcPAB-MMAE), thio huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 12 e figura 34, abaixo.
[949] A figura 34A é uma troca de traçados em gráfico no volume do tumor no curso de tempo nos xenoenxertos de BJAB-Luciferase em camundongos SCID CB17 tratados m os conjugados de droga huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb, como mostrado na tabela 12. Especificamente, a administração conjugado de droga thio huMA79b.v28- HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thioMAb mostrou uma inibição de crescimento de tumor quando comparado ao conjugado de droga de anticorpo de controle negativo (thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- DM1, thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e thio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). Outros controles foram thio-huMA79b.v28- HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio-hu-anti-CD22(10F4v3)- HC(A118C)-MC-MMAF.
[950] Além disso, no mesmo estudo, a percentagem de troca de peso corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (figura 34B) indicaram que a administração destes conjugados ThioMab-droga não causou um decréscimo significativo na percentagem de peso de peso corporal ou perda de peso durante este período.
[951] Além disso, ainda, na tabela 12, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 12 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAFEDM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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C. XENOENXERTOS DE C. WSU-DLCL2 (LINFOMA DE CÉLULAS GRANDES DIFUSAS
[952] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxerto como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia de conjugados thioMab-droga em xenoenxertos de WSU-DLCL2 em linfoma folicular (Linfoma de Células Grandes Difusas) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses são mostradas na tabela 13, abaixo.
[953] O anticorpo de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). HC(A118C) thioMAb de controle foi anticorpo thioMab thio hu- anti-HER2-HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), thio huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio anti- CD22 10F4v3-HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 13 abaixo.
[954] A figura 35A é uma troca de traçado em gráfico em volume de tumor médio no curso de tempo no xenoenxerto de WSU-DLCL2 (Linfoma de Células Grandes Difusas) em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs de anti-CD79b A118C de cadeia pesada, e, doses como mostrado na tabela 13. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF, thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-huMA79b.v28-HC(A118C)). Outros controles incluíram thio- huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 e thio hu-anti- CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF.
[955] O TDC de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB- MMAE pareceu ser o mais eficaz dos agentes de teste neste estudo.
[956] Além disso, em algum estudo, a troca de percentagem de peso corporal nos primeiros 7 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (figura 35B) indicaram que a administração destes conjugados thioMab-droga não causou um decréscimo significativo na percentagem do peso corporal ou perda de peso durante este período.
[957] Além disso, ainda, na figura 13, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 13 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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D. XENOENXERTOS DE DOHH2 (LINFOMA FOLICULAR)
[958] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a capacidade dos conjugados thioMab-droga para reduzir o volume do tumor de células B em modelos de xenoenxerto de DOHH2 em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 14, abaixo.
[959] O Ab de controle foi huMA79b.v28 (conjugado a SMCC-DM1). O HC(A118C) thioMAb de controle foi thio hu-anti-HER2-HC(A118C) thioMAb (conjugado a BMPEO-DM1, MC-MMAF ou MCvcPAB-MMAE), thio huMA79b.v28- HC(A118C) thioMab e thio hu-anti-CD22-HC(A118C) (conjugado a MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 14 e figura 36.
[960] A figura 36A is uma troca em traçado de gráfico em volume de tumor médio no curso de tempo no enxerto de células DOHH2 em camundongos SCID CB17 com TDCs de A118C de cadeia pesada, em doses como mostrado na figura 14.nas doses mostradas na tabela 14. Especificamente, a administração dos conjugados de droga thio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF e conjugados de droga thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE thioMAb nas doses mostradas na tabela 14 mostrou uma inibição de crescimento de tumor quando comparado aos conjugados de droga de controle negativo (hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 de controle thio, hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF de controle thio, hu-anti- HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de controle thio. Outros controles incluíram huMA79b.v28-HC(A118C) de controle thio, anti-CD22-HC(A118C)- MC-MMAF de controle thio e huMA79b.v28-HC(A118C) e huMA79b.v28- SMCC-DM1 de controle.
[961] Além disso, ainda, na tabela 14, o número de camundongos fora do número total mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 14 REDUÇÃO DO VOLUME DE TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1, MMAF E MMAE XENOENXERTOS DE DOHH2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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E. XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE (LINFOMA DE BURKITT)
[962] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de enxertos como descrito no exemplo 3, variando os conjugados anticorpo droga e as doses administradas, a eficácia dos conjugados de droga em xenoenxertos de BJAB-luciferase (Linfoma de Burkitt) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 15, abaixo.
[963] O anticorpo de controle foi o veículo (tampão (para ADC) sozinho). HC (A118C) thioMAb de controle foi o anticorpo thioMab thio hu-anti-HER2- HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF), thio huMA79b.v28-HC(A118C) thioMAb ou thio anti-CD22 10F4v3-HC(A118C) thioMAb (conjugado a MC-MMAF). Estes resultados são mostrados na tabela 15, abaixo.
[964] A figura 37A é uma troca em traçado em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo e, xenoenxertos de BJAB-luciferase em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 15. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos controles negativos (thio-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-anti- HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). Outros controles incluíram thio huMA79b.v28- HC(A118C) e thio-10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF.
[965] Além disso, ainda, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 15 REDUÇÃO DO VOLUME DE TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-LUCIFERASE EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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F. XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFÓCITO DE CÉLULA DO MANTO HUMANA)
[966] Em um estudo similar, o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab-droga em xenoenxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 16, abaixo).
[967] O HC(A118C) thioMAb de controle foi thio hu-anti-HER2- HC(A118C) thioMAb (conjugado a BMPEO-DM1 ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 16 e figura 38.
[968] A figura 38A é uma troca de traçados em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no enxerto de Granta 519 em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, em doses como mostrado na tabela 16. Especificamente, a administração do conjugado thioMab-droga a thio huMA79b.v28-HC-(A118C)-BMPEO-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF nas doses mostradas na tabela 16 mostraram uma inibição de crescimento de tumor quando comparados aos conjugados de droga de controle.
[969] Além disso, no mesmo estudo, a percentagem da troca de peso corporal nos primeiros 14 dias foi determinada em cada grupo de dosagem. Os resultados (figura 38B) indicaram que administração deste conjugado thioMab-droga não resultou em um decréscimo na percentagem do peso corporal ou causou perda de peso durante este período.
[970] Na tabela 16, o número de camundongos para um número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo). TABELA 16 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1 E MMAF XENOENXERTOS EM GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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G. XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 (LINFOMA DE CÉLULA GRANDE DIFUSA)
[971] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver acima), variando os conjugados de droga e doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab- droga em xenoenxertos de WSU-DLCL2 (Linfoma de Célula Grande Difusa) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 17, abaixo.
[972] O anticorpo de controle foi veículo (tampão (para ADC) sozinho). Os thioMabs de controle foram anticorpo thioMabs thio hu-anti-HER2- HC(A118C) (conjugado a BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE ou MC-MMAF). Os resultados são mostrados na tabela 17 e figura 39.
[973] A figura 39 é uma troca de traçado em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no xenoenxerto de WSU-DLC12 em camundongos SCID CB17 tratados com o TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 17. Especificamente a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF e thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (na dose Ab de 0,5, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparado aos (thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu- anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC- MMAF e veículo A) de controles negativos.
[974] Além disso, ainda, na tabela 17, o número de camundongos para um número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 17 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) MMAE, MMAF E DM1 EM XENOENXERTOS DE WSU-DLCL2 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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H. XENOENXERTOS DE GRANTA-519 (LINFOMA DE CÉLULA DO MANTO HUMANA)
[975] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab- droga em enxertos de Granta-519 (Linfoma de Célula do manto Humana) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 18, abaixo.
[976] Os thio Mabs de controle foram thio hu-anti-HER2- HC(A118C) (conjugados a BMPEO-DM1) e anticorpo thioMabthio hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thioMAbs.
[977] A figura 40A é uma troca de traçados em gráfico no volume de tumor médio no curso de tempo no enxerto de Granta-519 em camundongos SCID CB17 tratados com TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, em doses como mostrado na tabela 18. Especificamente a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 e thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MCvcPAB-MMAE (em doses de Ab de 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg e 4,0 mg/kg) mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparada a (thio-anti-HER2- HC(A118C)-BMPEO-DM1 e thio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE de controle negativo.
[978] Além disso, ainda, na tabela 18, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 18 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1 E MMAE EM XENOENXERTOS DE GRANTA-519 EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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I. XENOENXERTOS DE BJAB-CYNO CD79B
[979] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab- droga em células BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando xenoenxertos de cynoCD79b (BJAB-cynoCD79b) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 18, abaixo.
[980] O Ab de controle foi veículo (tampão sozinho). Os thio Mabs de controle foram thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio-hu-anti- HER2-HC(A118C)-MC-MMAF e anticorpo de thioMabs thio-hu-anti-HER2- HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Os resultados são mostrados na tabela 19 e figura 50.
[981] A figura 50 é um traçado em gráfico da inibição de crescimento de tumor no curso de tempo no xenoenxerto de BJAB-cynoCD79b em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses como mostrado na tabela 19. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, thio huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio huMA79b.v28-HC(A118C)- MC-MMAF bem como thio-anti-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO- DM1, thio-anti-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio-anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF mostrou a inibição de crescimento de tumor quando comparada a (thio-anti-HER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1, thio-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE e thio-anti-HER2- HC(A118C)-MC-MMAF de controles negativos e veículo A).
[982] Além disso, ainda, na tabela 19, o número de camundongos fora do número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 19 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO ANTI-CYNO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1, MMAF Ou MMAE Ou THIO HUMA79B.V28 DM1, MMAF Ou MMAE XENOENXERTOS EM BJAB-CYNO CD79B EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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J. XENOENXERTOS DE BJAB-CYNO CD79B
[983] Em um estudo similar, usando o mesmo protocolo de estudo de xenoenxertos como descrito no exemplo 3 (ver abaixo), variando os conjugados de droga e as doses administradas, a eficácia do conjugado thioMab- droga em células BJAB (Linfoma de Burkitt) expressando xenoenxertos de cynoCD79b (BJAB-cynoCD79b) em camundongos SCID CB17 foi estudada. Os conjugados de droga e as doses (administradas no dia 0 para todos os ADCs e controles) são mostrados na tabela 19, abaixo.
[984] O thioMab de controle foi thio-hu-anti-HER2-HC(A118C)- BMPEO-DM1, thio-huMA79b.v28-HC(A118C), e anticorpo thioMabs thio-anti- cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C). Os resultados são mostrados na tabela 20 e figura 51.
[985] A figura 51 é um traçado em gráfico da inibição de crescimento de tumor no curso de tempo no enxerto de BJAB-cynoCD79b em camundongos SCID CB17 tratados com os TDCs anti-CD79b de A118C de cadeia pesada, nas doses mostradas na tabela 20. Especificamente, a administração de thio huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 bem como de thio-anti-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 mostrou inibição de crescimento de tumor quando comparada (thio-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO- DM1 de controles negativos. Outros controles incluíram thio-hu-MA79b.v28- HC(A118C) e thio-anti-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C).
[986] Os resultados são mostrados na tabela 20, abaixo. Na tabela 20, o número de camundongos para o número total testado mostrando PR = Regressão Parcial (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu abaixo de 50% do volume do tumor medido no dia (0) ou CR = Remissão Completa (onde o volume do tumor em qualquer tempo após a administração caiu a 0 mm3) é indicado e NA = não aplicável. (DAR = Droga para Relação de Anticorpo) TABELA 20 REDUÇÃO DO VOLUME DO TUMOR IN VIVO, ADMINISTRAÇÃO DO CONJUGADO THIO ANTI-CYNO CD79B(CH10D10)-HC(A118C) DM1 OU THIO HUMA79B.V28-HC(A118C) DM1 EM XENOENXERTOS DE BJAB-CYNO CD79B EM CAMUNDONGOS SCID CB17
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[987] O relatório descritivo escrito acima é considerado o bastante para possibilitar que um versado na técnica pratique a invenção. O escopo da presente invenção não se limita à construção depositada, uma vez que a modalidade depositada tem a finalidade única de ilustrar determinados aspectos da invenção e todas as interpretações que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção. O depósito do presente material não constitui uma admissão de que a descrição escrita contida aqui é inadequada para capacitar a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o melhor modo da mesma, nem deve ser interpretada como limitadora do escopo das reivindicações nas ilustrações específicas que ela representa. Naturalmente, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas aqui, tornar- se-ão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição acima e estão dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (88)

1. ANTICORPO ANTI-CD79b, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de qualquer de SEQ ID NOs: 131, 194 e 213; (ii) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 132; (iii) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133; (iv) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 134; (v) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 135; e (vi) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 138.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: uma HVR-L1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 131, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 132, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133, uma HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 134, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 135 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 138.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 188 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 189.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 305 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 306.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: uma HVR-L1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 194, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 132, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133, uma HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 134, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 135 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 138.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 208.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 307 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 308.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: uma HVR-L1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 213, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 132, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 133, uma HVR-H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 134, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 135 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 138.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 226 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 227.
10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 309 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 310.
11. ANTICORPO ANTI-CD79b, caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 169 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 170.
12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 303 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 304.
13. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo biespecífico.
14. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5 a 6, 8 a 9 e 11, caracterizado por ser um fragmento de anticorpo.
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito fragmento de anticorpo ser um fragmento Fab.
16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser fundido a um peptídeo de ligação de albumina.
17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo peptídeo de ligação de albumina compreender uma sequência selecionada a partir de qualquer de SEQ ID Nos: 246 a 250.
18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo anti-CD79b, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
19. IMUNOCONJUGADO, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo anti-CD79b, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, covalentemente fixado a um agente citotóxico.
20. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado de um grupo que consiste em uma toxina, um agente quimioterápico, uma porção de droga, um antibiótico, um isótopo radioativo e uma enzima nucleofílica.
21. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo fato de que o imunoconjugado tem a fórmula Ab-(L-D)p, sendo que: (a) Ab é o anticorpo anti-CD79b ; (b) L é uma porção ligante; (c) D é o agente citotóxico; e (d) p varia de 1 a 20.
22. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que L compreende um ligante selecionado de um ou mais de 6-maleimidocaproíla (MC), maleimidopropanoíla (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-aminobenziloxicarbonila (PAB), pentanoato de N-succinimidil 4-(2-piridiltio) (SPP), ciclo-hexano-1 carboxilato de N-succinimidil 4-(N-maleimidometila) (SMCC), éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-(2-piridilditio)butírico (SPDB), bis-maleimido polietilenoglicol (BMPEO) e aminobenzoato de N-succinimidil (4-iodo-acetila) (SIAB).
23. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22, caracterizado por D ser selecionado a partir do grupo consistindo em um maitansinóide, uma auristatina e uma dolastatina.
24. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado por D ser auristatina, em que D é a porção de droga de fórmula DE ou DF:
Figure img0105
e em que cada um de R2 e R6 é metila, cada um de R3 e R4 é isopropila, R5 é H ou metila, R7 é sec-butila, cada R8 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em CH3, OCH3, OH e H, e R9 é H, R10 é arila, Z é -O- ou -NH-; R11 é H, alquila Ci-C8ou -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH- 2)2-O-CH3 e R18 é -C(R8)2-C(R8)2-arila.
25. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 23, caracterizado por D ser dolastatina.
26. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 23, caracterizado por D ser MMAE ou MMAF.
27. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 23 ou 26, caracterizado pelo dito imunoconjugado compreender a formula Ab-(L-MMAE)p, em que p varia de 2 a 5.
28. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 23 ou 26, caracterizado pelo dito imunoconjugado compreender a formula Ab-(L-MMAF)p, em que p varia de 2 a 5.
29. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 28, caracterizado por L compreender val-cit, MC, PAB e/ou MC-PAB.
30. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2i a 29, caracterizado por L compreender MC-val-cit-PAB.
31. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado D ser maitansinóide.
32. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo dito maitansinóide ser DM1, DM3 ou DM4.
33. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23 ou 26 a 32, caracterizado pelo dito imunoconjugado compreender uma estrutura selecionada a partir do grupo consistindo em:
Figure img0106
em que Val é valina e Cit é citrulina.
34. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23 e 26 a 33, caracterizado dito imunoconjugado compreender a estrutura:
Figure img0107
35. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26 e 29 a 34, caracterizado por p ser de 1 a 8.
36. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26 e 29 a 35, caracterizado por p ser de 2 a 5.
37. IMUNOCONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 36, caracterizado pelo p ser de 3 a 4.
38. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 37, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
39. MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE UMA CÉLULA QUE EXPRESSA CD79b, caracterizado pelo fato de que dito método compreende contatar in vitro dita célula com um imunoconjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 37, desse modo causando uma inibição do crescimento de dita célula.
40. MÉTODO DE DETERMINAR A PRESENÇA DE CD79B, em uma amostra biológica suspeita de conter CD79b, caracterizado pelo fato de que dito método compreendendo expor in vitro dita amostra biológica a um anticorpo anti-CD79b, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e determinar a ligação de dito anticorpo anti-CD79b a CD79b em dita amostra biológica, sendo que a ligação de dito anticorpo anti-CD79b a CD79b em dita amostra biológica é indicativa da presença de dita proteína em dita amostra.
41. USO DE UM IMUNOCONJUGADO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 37, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para tratar um distúrbio proliferativo de células B cancerosas em um indivíduo.
42. USO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo de células B cancerosas é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma, mieloma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, NHL agressivo reincidente, linfoma indolente, NHL indolente reincidente, NHL reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), linfoma folicular (FL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
43. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL.
44. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
45. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL reincidente ou NHL refratário.
46. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 42, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser FL.
47. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizado pelo medicamento compreender ainda uma quantidade efetiva de outro agente terapêutico.
48. USO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo agente terapêutico ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um agente quimioterápico, um agente citotóxico, um agente antiangiogênico, um agente imunossupressor, uma pró droga, uma citoquina, um antagonista de citoquina, radioterapia citotóxica, um corticosteroide, uma vacina de câncer e um agente inibidor de crescimento.
49. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 48, caracterizado pelo agente terapêutico ser selecionado de um ou mais de tamoxifen, letrozol, exemestane, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina, imatinib mesilato, sorafenib, lapatinib, trastuzumab, cisplatina, gemcitabine, metotrexato, vinblastina, carboplatina, paclitaxel, 5-fluorouracil, doxorrubicina, bortezomib, melphalan, prednisona, prednisolona e docetaxel.
50. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 48, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20.
51. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 48, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20 e o distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
52. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 48, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20 e o distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser FL.
53. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser rituximab.
54. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo agente terapêutico ser um agente quimioterápico.
55. USO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo agente quimioterápico compreender (i) um ou mais de ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina e prednisona; ou (ii) um ou mais de ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina e prednisolona.
56. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 55, caracterizado pelo agente terapêutico compreender (i) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
57. USO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo medicamento compreender ainda uma quantidade efetiva de um agente quimioterápico.
58. USO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo agente terapêutico compreender (i) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
59. USO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
60. USO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL.
61. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser rituximab.
62. USO DE UM IMUNOCONJUGADO, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento para tratar um distúrbio proliferativo de células B cancerosas em um indivíduo, em que o imunoconjugado compreender um anticorpo anti-CD79b (Ab), em que Ab compreende uma HVR-L1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 194, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 195, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 196, uma HVR- H1 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 202, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 203 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 204; em que o imunoconjugado compreende a fórmula:
Figure img0108
em que Val é valina, Cit é citrulina e p varia de 1 a 8.
63. USO, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo Ab compreender um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 207.
64. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 63, caracterizado pelo Ab compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 308 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 307.
65. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo de células B cancerosas é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma, mieloma, linfoma não-Hodgkin (NHL), NHL agressivo, linfoma indolente, NHL indolente reincidente, NHL reincidente, NHL refratário, NHL indolente refratário, NHL agressivo reincidente, linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), linfoma folicular (FL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno, leucemia, leucemia de célula capilar (HCL), leucemia linfocítica aguda (ALL) e linfoma de célula do manto.
66. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
67. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser FL.
68. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL.
69. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL reincidente ou NHL refratário.
70. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 69, caracterizado pelo medicamento compreender ainda uma quantidade efetiva de outro agente terapêutico.
71. USO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo agente terapêutico ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um agente quimioterápico, um agente citotóxico, um agente antiangiogênico, um agente imunossupressor, uma pró droga, uma citoquina, um antagonista de citoquina, radioterapia citotóxica, um corticosteroide, uma vacina de câncer e um agente inibidor de crescimento.
72. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 71, caracterizado pelo agente terapêutico ser selecionado de um ou mais de tamoxifen, letrozol, exemestane, anastrozol, irinotecan, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina, imatinib mesilato, sorafenib, lapatinib, trastuzumab, cisplatina, gemcitabine, metotrexato, vinblastina, carboplatina, paclitaxel, 5-fluorouracil, doxorrubicina, bortezomib, melphalan, prednisona, prednisolona e docetaxel.
73. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 71, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20.
74. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 71, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20 e o distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
75. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 71, caracterizado pelo agente terapêutico ser um anticorpo anti-CD20 e o distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser FL.
76. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser rituximab.
77. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 72, caracterizado pelo agente terapêutico ser um agente quimioterápico.
78. USO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo agente quimioterápico compreender (i) um ou mais de ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina e prednisona; ou (ii) um ou mais de ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, vincristina e prednisolona.
79. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 78, caracterizado pelo agente terapêutico compreender (i) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
80. USO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo medicamento compreender ainda uma quantidade efetiva de um agente quimioterápico.
81. USO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo agente terapêutico compreender (i) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
82. USO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser NHL.
83. USO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBCL.
84. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 83, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser rituximab.
85. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo dito distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser DLBC, em que o medicamento compreende ainda uma quantidade efetiva de um de (i) rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
86. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo dito distúrbio proliferativo de células B cancerosas ser FL, em que o medicamento compreende ainda uma quantidade efetiva de um de (i) rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisona; ou (ii) rituximabe, ciclofosfamida, doxorrubicina e prednisolona.
87. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 86, caracterizado por p variar de 2 a 5.
88. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 87, caracterizado por p variar de 3 a 4.
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