CN116234572A

CN116234572A - 治疗性SIRPα抗体

Info

Publication number: CN116234572A
Application number: CN202180047164.8A
Authority: CN
Inventors: R·普罗; R·希布施; B·卡波恰; G·安德烈耶娃; D·S·佩雷拉
Original assignee: Anchi Oncology
Current assignee: Anchi Oncology
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2023-06-06
Also published as: JP2023524238A; WO2021222746A3; AU2021264006A1; US20230279108A1; BR112022021992A2; WO2021222746A2

Abstract

提供了具有不同功能特征的抗SIRPα单克隆抗体(抗SIRPα mAb)，包括多特异性SIRPα抗体，以及相关组合物和使用抗SIRPα mAb作为治疗剂用于预防和治疗实体癌和血液癌的方法。还提供了示例性抗SIRPα单克隆抗体的氨基酸序列。

Description

治疗性SIRPα抗体

技术领域

本公开涉及免疫疗法领域。本公开提供抗SIRPα抗体(抗SIRPα)，所述抗SIRPα抗体破坏SIRPα和CD47之间的相互作用，增强肿瘤细胞的吞噬作用，引起免疫反应的免疫调节，以及产生抗SIRPα抗体的方法和使用抗SIRPα抗体作为用于预防和治疗血液癌症和实体癌症的治疗剂。

背景技术

靶向适应性免疫(包括T细胞检查点、PD-1、PD-L1和CTLA-4)的治疗性抗体可增强T细胞免疫反应的细胞毒活性，提高了患有转移性疾病的患者的长期缓解甚或治愈的前景(Hodi 2010，McDermott 2015)。尽管取得了积极成果，但仍有对这些检查点抑制剂没有反应(原发性耐药)的大量患者，或对这些检查点抑制剂有反应但最终发展为疾病进展(获得性耐药)的患者(Pitt 2016，Restifo 2016，Sharma 2017)。最近的研究表明，耐药机制既可以是肿瘤细胞内在的，包括缺乏独特的肿瘤抗原蛋白或抑制肿瘤抗原呈递；也可以是肿瘤细胞外在的，包括浸润性T细胞、多余的抑制检查点的缺失、和/或存在肿瘤微环境中的免疫抑制细胞(Sharma 2017)。即使对于被认为对检查点抑制剂敏感的肿瘤，或当联合使用抗CTLA-4和抗PD-1/PDL-1药物时，大约50％的患者不会出现肿瘤缩小，并且所有接受治疗的患者的平均治疗持续时间或无进展生存期仍然相对较短约2-5个月的(Kazandjian，2016)。此外，一些最普遍的实体瘤和大多数血液恶性肿瘤使用这些检查点抑制剂显示出令人失望的结果。特别是，激素受体阳性乳腺癌、结直肠癌(非微卫星不稳定性)和前列腺癌似乎对这种类型的免疫操作不敏感，并且可能受益于不同的免疫治疗方法(Le2015，Dirix2015，Topalian2012，Graft2016)。这些发现强调需要替代或协同方法，这些方法靶向额外的检查点来活化先天免疫反应以及适应性免疫反应，以进一步改善临床结果。先天免疫反应的几个检查点存在于肿瘤细胞和骨髓细胞(巨噬细胞、树突细胞、单核细胞衍生的抑制细胞、粒细胞)上，所述检查点是影响肿瘤进展、转移和总体结果的肿瘤微环境的重要细胞成分(Barclay和van den Berg 2014，Yanagita 2017)。

信号调节蛋白α(SIgnal Regulatory Protein(SIRP)-α)或SIRPα，也称为CD172a、BIT或SHPS-1，是与SIRP蛋白的密切相关的SIRP配对受体家族的成员。SIRPα主要由造血细胞(hematopoietic cell)(包括巨噬细胞、树突细胞和粒细胞)表达，还在尤其是大脑、神经胶质细胞、平滑肌细胞和内皮细胞以及一些肿瘤细胞(Barclay和van den Berg 2014)的神经元上表达。SIPRα是一种跨膜蛋白，其具有包含三个Ig样结构域的胞外结构域和包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)的胞质区域。

编码人SIRPα的基因是多态性的，已报道最多达10种SIRPα单倍型(haplotype)[TakenakaK.等人，2007年和Brooke G.等人，2004年]。三个等位基因组(纯合子v1/v1、杂合子v1/v2和纯合子v2/v2)几乎涵盖了所有已进行基因分型的族群(Treffers LW等人，2018年和Sim J.等人，2020年)。针对SIRPα的泛等位基因特异性抗体将最广泛地靶向/阻断不同人群中的SIRPα/CD47检查点，因为在SIRPα的两个等位基因的杂合子阻断中，以增强巨噬细胞介导的吞噬作用(Sim J.等人，2020和Zhao XW等人，2011)。本公开的抗SIRPα mAb或其抗原结合片段结合人单核细胞系U937(SIRPα v1/v1)和THP-1(SIRPα v2/v2)(Tsai等人，2010)，不像mAb 18D5仅结合到U937(SIRPα v1/v1)(基于细胞的结合测定)(Tsai等人，2010年和van Eenennaam等人，2018年)。

由骨髓细胞表达的SIRPα与在许多肿瘤细胞以及一些正常细胞上表达或过表达的CD47的相互作用是调节骨髓功能(包括粘附、迁移、活化和抑制活性)的先天反应的重要免疫检查点。CD47/SIRPα相互作用调节靶细胞的巨噬细胞和树突细胞吞噬作用，所述靶细胞向吞噬细胞发送抑制性“不要吞噬我信号”。CD47与SIRPα的结合启动抑制性信号级联反应，从而在其细胞质ITIM磷酸化后抑制吞噬作用(Oldenborg 2000，Oldenborg 2001，Okazawa2005)，SHP-1和SHP-2的募集和结合，包含Src同源结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(Veillette1998，Oldenborg 2001)，抑制非肌肉肌球蛋白IIA和最终的吞噬功能(Tsai和Discher2008，Barclay和van den Berg 2014，Murata2014，Veillette和Chen2018，Matazaki2009)。作为“不要吞噬我”信号的CD47作用的一个重要推论是其作为“自我标记”的作用。这提供了对自身吞噬作用的显著阻碍，并阻断了随后的自身免疫反应(Oldenborg，2002，Oldenborg2004)。癌细胞使用CD47以“自我”掩饰，从而避开先天免疫系统和适应性免疫系统。阻断先天免疫细胞(如巨噬细胞和树突细胞)上的SIRPα和肿瘤细胞上的CD47的相互作用已成为癌症治疗中的可行目标。临床前数据表明，与抗CD47抗体类似，阻断SIRPα的抗体/CD47相互作用的抗SIRPα抗体在小鼠肿瘤模型中表现出抗肿瘤功效，无论是作为单一疗法还是与其他药物联合使用(Gauttier，2017；Ring，2017；Yanigita,2017；Poirier，2018；和Guattier，2018)。重要的是，除SIRPα/CD47相互作用中断后的先天免疫反应外，适应性免疫反应的产生似乎对于获得稳健的抗肿瘤反应至关重要(Tseng 2013，Li 2015，Xu 2017)。

DC细胞上SIRPα的表达及其与T细胞上CD47的相互作用似乎对诱导适应性免疫反应是重要的。据报道，阻断SIRPα/CD47相互作用影响DC刺激抗原特异性CD8+T细胞反应的能力，这与增强的DC介导的对肿瘤DNA的反应相关(Liu 2015，Xu 2017)。

SIRP配对受体家族的另一个成员SIRP-γ在人(而不是啮齿动物)T细胞表面上选择性表达，具有由4个氨基酸组成的短细胞质区域。SIRP-γ也与CD47结合，似乎对于介导T细胞和APC之间的粘附以及包括增殖和活化在内的T细胞功能很重要(Barclay和vandenBerg2014；以及Piccio，2005)。因此，阻断SIRPα和CD47之间的相互作用但不阻断SIRP-γ和CD47之间的相互作用可为保护T细胞功能提供优势。

本公开描述了具有不同功能特性的抗SIRPα mAb。本公开的抗体可用于治疗与人SIRPα相关的疾病和病症的多种治疗方法，包括使用抗SIRPα mAb作为治疗剂用于预防和治疗实体癌和血液癌。本公开的抗体也可用作诊断剂以确定组织样品中的抗SIRPα表达。本公开的实施方案包括分离的抗体及其免疫活性结合片段；包含一种或多种抗SIRPα单克隆抗体的药物组合物，优选所述抗体的嵌合或人源化形式；以及所述抗SIRPα单克隆抗体的治疗用途的方法。

本公开的实施方案包括mAb或其抗原结合片段，其通过参考特定结构特征来定义，即，CDR、或整个重链和轻链可变结构域、或整个重链和轻链的特定氨基酸序列。本文公开的所有这些抗体结合SIRPα、SIRPγ、或SIRPα和SIRPγ。

单克隆抗体或其抗原结合片段可包含至少一个、通常至少三个本文提供的CDR序列，通常与来自人可变区的框架序列(framework sequence)组合或作为分离的CDR肽。在一些实施方案中，抗体包含至少一个轻链，该轻链包含位于可变区框架中的本文提供的三个轻链CDR序列，该可变区框架可以是但不限于鼠或人可变区框架；和至少一个重链，该重链包含位于可变区框架中的本文提供的三个重链CDR序列，该可变区框架可以是但不限于人或鼠可变区框架。单克隆抗体或其抗原结合片段还包括单结构域抗体(例如骆驼科纳米抗体VHH或鲨鱼单结构域抗体或其抗原结合片段)和多特异性(例如双特异性)抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，6个CDR的组合包括但不限于选自以下的可变重链CDR1(HCDR1)、可变重链CDR2(HCDR2)、可变重链CDR3(HCDR3)、可变轻链CDR1(LCDR1)、可变轻链CDR2(LCDR2)和可变轻链CDR3(LCDR3)的组合：

包含SEQ ID NO：33的HCDR1、包含SEQ ID NO：34的HCDR2、包含SEQ ID NO：35的HCDR3、包含SEQ ID NO：1的LCDR1、包含SEQ ID NO：2的LCDR2、包含SEQ ID NO：3的LCDR3；

包含SEQ ID NO：36的HCDR1、包含SEQ ID NO：37的HCDR2、包含SEQ ID NO：38的HCDR3、包含SEQ ID NO：4的LCDR1、包含SEQ ID NO：5的LCDR2、包含SEQ ID NO：6的LCDR3；

包含SEQ ID NO：39的HCDR1、包含SEQ ID NO：40的HCDR2、包含SEQ ID NO：41的HCDR3、包含SEQ ID NO：7的LCDR1、包含SEQ ID NO：8的LCDR2、包含SEQ ID NO：9的LCDR3；

包含SEQ ID NO：42的HCDR1、包含SEQ ID NO：43的HCDR2、包含SEQ ID NO：44的HCDR3、包含SEQ ID NO：10的LCDR1、包含SEQ ID NO：11的LCDR2、包含SEQ ID NO：12的LCDR3；

包含SEQ ID NO：45的HCDR1、包含SEQ ID NO：46的HCDR2、包含SEQ ID NO：47的HCDR3、包含SEQ ID NO：13的LCDR1、包含SEQ ID NO：14的LCDR2、包含SEQ ID NO：15的LCDR3；

包含SEQ ID NO：48的HCDR1、包含SEQ ID NO：49的HCDR2、包含SEQ ID NO：50的HCDR3、包含SEQ ID NO：16的LCDR1、包含SEQ ID NO：17的LCDR2、包含SEQ ID NO：18的LCDR3；

包含SEQ ID NO：51的HCDR1、包含SEQ ID NO：52的HCDR2、包含SEQ ID NO：53的HCDR3、包含SEQ ID NO：19的LCDR1、包含SEQ ID NO：20的LCDR2、包含SEQ ID NO：21的LCDR3。

包含SEQ ID NO：54的HCDR1、包含SEQ ID NO：55的HCDR2、包含SEQ ID NO：56的HCDR3、包含SEQ ID NO：22的LCDR1、包含SEQ ID NO：23的LCDR2、包含SEQ ID NO：24的LCDR3。

包含SEQ ID NO：57的HCDR1、包含SEQ ID NO：58的HCDR2、包含SEQ ID NO：59的HCDR3、包含SEQ ID NO：25的LCDR1、包含SEQ ID NO：26的LCDR2、包含SEQ ID NO：27的LCDR3。

包含SEQ ID NO：60的HCDR1、包含SEQ ID NO：61的HCDR2、包含SEQ ID NO：62的HCDR3、包含SEQ ID NO：28的LCDR1、包含SEQ ID NO：29的LCDR2、包含SEQ ID NO：30的LCDR3。

包含SEQ ID NO：42的HCDR1、包含SEQ ID NO：43的HCDR2、包含SEQ ID NO：44的HCDR3、包含SEQ ID NO：10的LCDR1、包含SEQ ID NO：31的LCDR2、包含SEQ ID NO：12的LCDR3。

包含SEQ ID NO：42的HCDR1、包含SEQ ID NO：43的HCDR2、包含SEQ ID NO：44的HCDR3、包含SEQ ID NO：10的LCDR1、包含SEQ ID NO：31的LCDR2、包含SEQ ID NO：32的LCDR3。

包含SEQ ID NO：57的HCDR1、包含SEQ ID NO：58的HCDR2、包含SEQ ID NO：63的HCDR3、包含SEQ ID NO：25的LCDR1、包含SEQ ID NO：26的LCDR2、包含SEQ ID NO：27的LCDR3。

在一些实施方案中，抗SIRPα抗体包括抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列的重链可变结构域(V_H)：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97，以及与所述序列之一具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。可替代地或另外地，抗SIRPα抗体——包括抗体或其抗原结合片段——可包含轻链可变结构域(V_L)，所述轻链可变结构域(V_L)具有选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：79和SEQ ID NO：80，以及与所述序列之一具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

尽管选自上文列出的V_H结构域和V_L结构域序列组的V_H结构域和V_L结构域的所有可能配对都是允许的，但是公开了V_H结构域和V_L结构域的某些组合。因此，抗SIRPα抗体或其抗原结合片段是包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的组合的那些，其中所述组合选自：

i.包含氨基酸序列SEQ ID NO：81的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：64的轻链可变结构域；

ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：82的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：65的轻链可变结构域；

iii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：83的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：66的轻链可变结构域；

iv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：84的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：67的轻链可变结构域；

v.包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：68的轻链可变结构域；

vi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：69的轻链可变结构域；

vii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：87的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：70的轻链可变结构域；

viii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：88的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：71的轻链可变结构域；

ix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：72的轻链可变结构域；

x.包含氨基酸序列SEQ ID NO：90的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：73的轻链可变结构域；

xi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：74的轻链可变结构域；

xii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：75的轻链可变结构域；

xiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：76的轻链可变结构域；

xiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：74的轻链可变结构域；

xv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：75的轻链可变结构域；

xvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：76的轻链可变结构域；

xvii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：74的轻链可变结构域；

xviii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：75的轻链可变结构域；

xix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：76的轻链可变结构域；

xx.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：74的轻链可变结构域；

xxi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：75的轻链可变结构域；

xxii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：76的轻链可变结构域；

xxiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：84的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：77的轻链可变结构域；

xxiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：78的轻链可变结构域；

xxv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：79的轻链可变结构域；

xxvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：80的轻链可变结构域；

xxvii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：78的轻链可变结构域；

xxviii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：79的轻链可变结构域；

xxix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：80的轻链可变结构域；

xxx.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：78的轻链可变结构域；

xxxi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：79的轻链可变结构域；

xxxii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：80的轻链可变结构域；和

xxxiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQID NO：72的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，抗SIRPα抗体或其抗原结合片段还可包含重链可变结构域和轻链可变结构域的组合，其中所述重链可变结构域包含与上文(i)至(xxxiii)所示的重链氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的V_H序列，和/或所述轻链可变结构域包含与上文(i)至(xxxiii)所示的轻链氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的V_L序列。对于与这些参考序列具有特定百分比序列同一性的V_H和V_L结构域的抗SIRPα抗体，可以保留在(i)至(xxxiii)中特定V_H和V_L配对或组合。

对于所有实施方案，抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链可变结构域由与参考序列的特定百分比序列同一性定义，V_H和/或V_L结构域可能保留与参考序列中存在的相同的CDR序列，使得变异仅存在于框架区域内。

在另一个实施方案中，抗SIRPα抗体或其抗原结合片段是包含重链(HC)和轻链(LC)的组合的那些，其中所述组合选自：

i.包含氨基酸序列SEQ ID NO：109的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：98的轻链；

ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：110的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：99的轻链；

iii.包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的轻链；

iv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：112的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的轻链；

v.包含氨基酸序列SEQ ID NO：112的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：102的轻链；

vi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：112的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的轻链；

vii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：113的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的轻链；

viii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：113的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：102的轻链；

ix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：113的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的轻链；

x.包含氨基酸序列SEQ ID NO：114的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的轻链；

xi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：114的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：102的轻链；

xii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：114的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的轻链；

xiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：115的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的轻链；

xiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：115的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：102的轻链；

xv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：115的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的轻链；

xvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：116的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的轻链；

xvii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：117的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：105的轻链；

xviii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：117的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链；

xix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：117的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：107的轻链；

xx.包含氨基酸序列SEQ ID NO：118的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：105的轻链；

xxi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：118的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链；

xxii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：118的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：107的轻链；

xxiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：119的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：105的轻链；

xxiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：119的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链；

xxv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：119的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：107的轻链；和

xxvi.包含氨基酸序列SEQIDNO：120的重链和包含氨基酸序列SEQIDNO：108的轻链。

公开了多种形式的抗SIRPα mAb。例如，抗CD47 mAb可以是全长人源化抗体，其具有人框架和同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(更具体地IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的恒定区，以及在一些情况下具有多种突变以改变Fc受体功能或防止Fab臂交换，或可以是抗体片段，例如F(ab′)2片段、F(ab)片段、单链Fv片段(scFv)等，如本文所公开的。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段包含IgG同种型，所述IgG同种型选自IgG1、IgG1-N297Q、IgG2、IgG4、IgG4 S228P、IgG4 PE及它们的变体。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段除结合人SIRPα之外，还结合人SIRPγ。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段选择性结合人SIRPα。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段增加人肿瘤细胞的吞噬作用。

在一些实施方案中，如本文所公开的抗SIRPα mAb是特异性结合SIRPα和至少第二抗原的多特异性抗体，其中所述第二抗原是表达CD47的细胞的标志物。

在一些实施方案中，多特异性抗体的第二抗原选自CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD40、CD44、HER2、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、CD117、C-Met、PTHR2、EGFR、RANKL、SLAMF7、PD-L1、CD38、CD19/CD3、HAVCR2(TIM3)和GD2。

在一些实施方案中，人肿瘤细胞吞噬作用的增加是非Fc依赖性的。

在一些实施方案中，人肿瘤细胞吞噬作用的增加是Fc依赖性的。

在一些实施方案中，人肿瘤细胞吞噬作用的增加依赖于FcγR。

在一些实施方案中，FcγR选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段增加人肿瘤细胞的吞噬作用，并与靶向肿瘤细胞上的抗原的调理单克隆抗体(opsonizing monoclonal antibody)联合施用。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段增加人肿瘤细胞的吞噬作用，并与靶向肿瘤细胞上的抗原的调理单克隆抗体联合施用，其中所述调理单克隆抗体选自抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗RANKL、抗SLAMF7、抗PD-L1、抗CD38、抗CD19/CD3和抗GD2抗体中的一种或多种。在一些实施方案中，调理单克隆抗体选自利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地诺单抗(denosumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)，和地努妥昔单抗(dinutuximab)。

在一些实施方案中，调理单克隆抗体靶向CD20、EGFR和PD-L1。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段具有抗肿瘤活性。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段与抗CD47抗体联合施用，其中所述抗CD47抗体记载于美国专利10,239,945中，并通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段与抗EGFR抗体联合施用。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段与抗PD-1抗体联合施用。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段与抗CTLA-4抗体联合施用。

在一些实施方案中，本公开提供一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文公开的抗SIRPα mAb或抗原结合片段，任选地为嵌合或人源化形式，和药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段用于人类治疗。

在一些实施方案中，抗SIRPα mAb或其抗原结合片段用于预防或治疗人类患者的癌症。

在本公开之前，需要鉴定具有本文所述的功能特征的抗SIRPα mAb。本公开的抗SIRPα mAb表现出使mAb特别有利地于用于人类治疗、特别是用于预防和/或治疗实体癌和血液癌的特性的组合。

在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌(结肠直肠癌)、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌(非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌(头颈癌)、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、以及子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤(meduloblastoma)、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤(sarcoma)。

在一些实施方案中，白血病选自全身性肥大细胞增多症、急性淋巴细胞(成淋巴细胞)白血病(ALL)、T细胞-ALL、急性髓性白血病(AML)、粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生障碍/赘生物、骨髓增生异常综合征、单核细胞白血病、以及浆细胞白血病；其中所述淋巴瘤选自组织细胞性淋巴瘤和T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，如低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级别/滤泡性NHL、中等级别的弥漫性NHL、高级别成免疫细胞NHL、高级别成淋巴细胞NHL、高级别小非裂细胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)、巨大肿块(bulkydisease)NHL、以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)；并且其中所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、肺泡软部肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和软骨肉瘤。

在一些实施方案中，公开了一种使用抗SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段测定肿瘤和/或免疫细胞中SIRPα表达的方法，所述SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQIDNO：121序列内的表位。

在一些实施方案中，该方法包括获得患者样品，使所述患者样品与特异性结合SEQID NO：121序列内的表位的抗SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段接触，并测定抗体与患者样品的结合，其中抗体与患者样品的结合是诊断患者样品中的SIRPα表达的指标。

在一些实施方案中，公开了一种使用抗SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段测定肿瘤和/或免疫细胞中SIRPγ表达的方法，所述SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQIDNO：122序列内的表位。

在一些实施方案中，该方法包括获得患者样品，使所述患者样品与特异性结合SEQID NO：122序列内的表位的抗SIRPγ单克隆抗体或其抗原结合片段接触，并测定抗体与患者样品的结合，其中抗体与患者样品的结合是诊断患者样品中的SIRPγ表达的指标。

在一些实施方案中，肿瘤是原发性癌肿瘤或转移性癌肿瘤。

在一些实施方案中，测定抗SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段与患者样品的结合利用组织样品的免疫组织化学标记、酶联免疫吸附测定(ELISA)或流式细胞术。

在一些实施方案中，该方法包括肿瘤细胞，并且该测定包括测定抗SIRPα单克隆抗体或其抗原结合片段与患者样品的肿瘤细胞的结合。

根据以下提供的详细描述，本公开的进一步适用范围将变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实施例虽然指示了本公开的实施方案，但仅以示例的方式给出，因为在本公开的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言从该详细描述中将是显而易见的。

附图说明

通过以下详细描述结合附图，将更好地理解本公开的上述和其他方面、特征和优点，所有这些仅以示例的方式给出并且不限于本公开。

图1A-图1V。抗SIRP抗体与人SIRPα的结合。抗SIRP抗体与重组人SIRPα的结合通过固相ELISA测定。高结合ELISA板(plate)涂有重组人SIRPα，并加入浓度递增的抗SIRP抗体1小时。洗涤孔，然后与HRP标记的二抗孵育1小时，然后加入过氧化物酶底物，并测量450nm处的吸光度。显示了针对抗SIRPα抗体1-23的结果。

图2。杂交瘤衍生的mAb(SIR1、SIRP2和SIRP3)与表达SIRPα的THP1细胞的结合。测定了SIRP1、SIRP2和SIRP3与THP-1单核细胞系的结合。细胞使用浓度递增的抗体培养1小时。洗涤细胞，然后与用Alexaflour647标记的二抗孵育1小时。洗涤细胞并使用流式细胞术测量抗体结合。

图3A-图3V。抗SIRP抗体与人SIRPγ的结合。抗SIRP抗体与重组人SIRPγ(SIRPγ)通过固相ELISA测定。高结合ELISA板涂有重组人SIRPγ，并添加浓度递增的抗SIRP抗体1小时。洗涤孔，然后用HRP标记的二抗孵育1小时，然后加入过氧化物酶底物，并测量450nm处的吸光度。显示了针对抗SIRPα抗体1-23的结果。

图4A-图4B。SIRPmAb与表达SIRPγ的JurkatT细胞的结合。测定了SIRP1、SIRP2、SIRP3、SIRP4和SIRP9与JurkatT-ALL细胞的结合。细胞使用浓度递增的抗体培养1小时，图4A；或使用10μg/ml的抗SIRP抗体孵育1小时，图4B。洗涤细胞，然后用Alexaflour 647标记的二抗孵育1小时。洗涤细胞并使用流式细胞术测量抗体结合。

图5A-图5G。通过抗SIRP抗体阻断人CD47/SIRPα结合。抗SIRP抗体阻断CD47与重组人SIRα相互作用的能力通过固相ELISA测定。高结合ELISA板涂有重组人SIRPα，并添加浓度递增的抗SIRP抗体1小时。洗涤孔，然后用Fc标记的人CD47培养1小时。洗涤孔，然后用HRP标记的二抗孵育1小时，然后加入过氧化物酶底物，并测量450nm处的吸光度。

图6A-图6H。通过抗SIRP抗体阻断人CD47/SIRPγ结合。抗SIRP抗体阻断CD47与重组人SIRPγ相互作用的能力通过固相ELISA测定。高结合ELISA板涂有重组人SIRPγ，并添加浓度递增的抗SIRP抗体1小时。洗涤孔，然后用Fc标记的人CD47培养1小时。洗涤孔，然后用HRP标记的二抗孵育1小时，然后加入过氧化物酶底物，并测量450nm处的吸光度。

图7A-图7B。抗SIRP抗体增强吞噬作用。人巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度接种96孔板，并使其粘附24小时。将8x10⁴ CFSE(1μM)标记人Jurkat T细胞和浓度递增的抗SIRP抗体，图7A；或10μg/ml的抗SIRP抗体，图7B；添加到巨噬细胞培养物中并在37℃下培养3小时。去除未被吞噬的Jurkat细胞并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定总CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图8A-图8J。抗SIRP抗体与抗CD47抗体联合增强吞噬作用。人巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度接种96孔板，并使其粘附24小时。将8x10⁴ CFSE(1μM)标记的人Jurkat T细胞和浓度递增的单独抗SIRP抗体、单独抗CD47抗体、或抗SIRP抗体和抗CD47抗体的组合添加到巨噬细胞培养物中，并在37℃下培养3小时。去除未被吞噬的Jurkat细胞并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定总CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图9A-图9D。抗SIRP抗体与抗CD20抗体联合增强吞噬作用。人巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度接种96孔板，并使其粘附24小时。将8x10⁴ CFSE(1μM)标记的人RAJI淋巴瘤细胞和浓度递增的单独抗SIRP抗体、单独抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituxan)、或抗SIRP抗体和利妥昔单抗(Rituxan)的组合添加到巨噬细胞培养物中，并在37℃下培养3小时。去除未被吞噬的RAJI细胞并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定总CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图10A-图10B。抗SIRP抗体与抗EGFR和抗PD-L1抗体联合增强吞噬作用。人巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度接种96孔板，并使其粘附24小时。将8x10⁴CFSE(1μM)标记的人FaDuHNSCC和浓度递增的单独抗SIRP抗体、单独抗EGFR抗体爱必妥(Erbitux)、或抗SIRP抗体与爱必妥(Erbitux)的组合、或抗SIRP抗体与阿维单抗的组合添加到巨噬细胞培养物中并在37℃下培养3小时。去除未被吞噬的FaDu细胞并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CDl4进行染色。流式细胞仪用于测定总CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图11。抗SIRP抗体与巨噬细胞和树突细胞上的SIRPα结合。测定抗SIRP抗体与人巨噬细胞或树突细胞的结合。人单核细胞衍生的巨噬细胞用浓度递增的抗SIRP抗体孵育1小时。洗涤细胞，然后用AF647标记的二抗孵育45分钟，洗涤并使用流式细胞术测量抗体结合。

图12A-图12C。抗SIRP抗体与初始T细胞和活化T细胞上的SIRPγ结合。抗SIRP抗体与初始T细胞的结合(图12A和图12B)或活化的T细胞(图12C)在抗CD3包被板上活化3天后，通过流式细胞仪测定。将T细胞用浓度递增的抗SIRP抗体孵育1小时，洗涤细胞并加入FITC标记的抗小鼠二抗1小时。洗涤细胞并使用流式细胞术测量抗体结合。

图13。通过巨噬细胞上的抗SIRP抗体阻断人CD47/SIRPα结合。抗SIRP抗体阻断重组人CD47和巨噬细胞表达的SIRPα之间相互作用的能力通过流式细胞术测定。巨噬细胞上的Fc受体在用10μg/ml的抗SIRP抗体孵育之前被阻断。使用AF647标记的抗人二抗测量可溶性Fc标记的人CD47(20μg/ml)的结合。

图14A-图14B。抗SIRP抗体不抑制同种异体树突细胞刺激后的T细胞增殖。抗SIRP抗体对T细胞增殖的影响是通过在10μg/ml抗SIRP抗体的存在下活化CellTrace Violet标记的人CD3 T细胞和同种异体人类单核细胞来源的树突细胞，以1∶5的T细胞：DC测定的。流式细胞术用于测定共培养6-7天后增殖的CD3 T细胞的百分比。虚线表示hIgG4P对照的增殖。

图15。抗SIRP抗体不抑制抗原回忆反应(antigen recall response)。使用来自人巨细胞病毒血清反应阳性供体的PBMC评估抗SIRP抗体对T细胞抗原回忆反应的影响。CellTrace Violet染料标记的PBMC用10μg/ml的抗SIRP抗体在递增浓度的CMV抗原的存在下培养5天。T细胞增殖使用流式细胞术通过稀释CD4+T细胞群中的CellTrace Violet染料来测定。

图16。抗SIRP抗体影响SIRPα高阶结构和/或架构(architecture)。抗SIRP抗体对SIRPα的二聚化/聚类/架构(architecture)的影响通过使用流式细胞术(FCET)测量藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白(APC)偶联的非竞争性抗SIRP抗体之间的荧光共振能量转移(FRET)效率来评估。人CD14+单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF的AIM-V培养基中培养6天，以将其分化为巨噬细胞。用10μg/ml抗SIRP抗体治疗后3h，巨噬细胞使用PE或APC标记的非竞争性SIRPα抗体(克隆SE5A5)染色。使用流式细胞术测定PE/APC对之间的FRET效率，并使用三波长校正模型。

图17。抗SIRP抗体诱导SIRPα-抗体内化。使用人巨噬细胞和pHrodo绿(pHrodogreen)标记的抗SIRP抗体评估了抗SIRP抗体对SIRPα抗体复合物的内化的影响。对于巨噬细胞分化，从外周血单核细胞中分离出的人CD14+单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF的AIM-V培养基中体外培养7天。巨噬细胞用10μg/ml抗SIRP抗体在37℃下孵育最长达1小时，并通过流式细胞术测量内化。使用pHrodo绿微型蛋白质标记试剂盒标记SIRP抗体。

图18。抗SIRP单克隆抗体降低细胞表面SIRPα水平。使用人巨噬细胞通过流式细胞术评估抗SIRP抗体对细胞表面上的SIRPα表达水平的影响。从外周血单核细胞中分离出的人CD14+单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF的AIM-V培养基中体外分化7天以产生人巨噬细胞。人巨噬细胞在V形底96孔板中在AIM-V培养基中培养2小时。然后将细胞用10μg/mlmIgG1对照、SIPR4、SIRP9、18D5或KWAR23在4℃下孵育2小时，或在37℃、5％CO₂下培养2小时、4小时、6小时或24小时。随后，细胞表面SIRPα水平使用非竞争性荧光标记的抗SIRPα抗体通过流式细胞仪测量。

图19A-图19B。抗SIRP抗体诱导不依赖SIRPα等位基因变体的肿瘤细胞的吞噬作用。抗SIRPα抗体通过携带不同SIRPα等位基因变体的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的影响使用流式细胞术通过体外测定评估。来自不同SIRPα等位基因组供体(V1/V1、V1/V2和V2/V2)的人单核细胞来源的巨噬细胞与CD14+单核细胞分化，并在不添加补充剂的AIM-V培养基中培养2小时。人类癌细胞用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯标记，并以8x10⁴个细胞/孔的浓度添加到96孔板中的巨噬细胞培养物中。靶细胞和效应细胞混合后立即加入抗SIRP抗体。图19A显示了以不同浓度添加的抗SIRP或mIgG1对照抗体。19B显示了10μg/ml的浓度。在37℃下孵育4小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。使用细胞消化液(Accutase)分离巨噬细胞，并用100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体染色30分钟，然后通过流式细胞术进行分析。吞噬作用被确定为CD14+细胞群中CFSE+细胞的百分比。

图20。抗SIRP单克隆抗体对于SIRPα结合不会彼此竞争。抗SIRP抗体与人SIRPα结合的竞争使用His标记的人SIRPα蛋白和生物素化SIRPα抗体通过ELISA评估。

图21A-图21B。与人类癌细胞系结合的抗SIRP抗体与其SIRPα和SIRPγ的表达相关。在吞噬作用测定中使用的人类癌细胞系(Jurkat T-ALL、RAJI B细胞淋巴瘤、DLD-1结直肠腺癌、RL95-2子宫内膜癌和ES-2卵巢癌)中的抗SIRP mAb的结合以及SIRPα/β、SIRPγ和CD47的表面表达通过流式细胞术评估。图21A显示了在吞噬作用测定中使用的癌细胞系上的CD47表达(如通过商业抗CD47克隆B6H12测量的)、SIRPα/β表达(通过商业克隆SE5A5测量的)和SIRPγ表达(通过商业克隆LSB2.20测量的)。图21B显示了SIRP4和SIRP9的结合与商业抗SIRP抗体所见的SIRPα/β或SIRPγ表达密切相关。****表示p＜0.0001。

图22A-图22D。抗SIRP抗体诱导的吞噬作用涉及Fc受体。人单核细胞来源的巨噬细胞以3x10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板中，并允许粘附24小时。然后添加针对人Fc受体CD16、CD32和CD64的10μg/ml抗体(+Fc阻断)或30μg/ml mIgG1同种型对照(-Fc阻断)。紧接着，将8x10⁴个CFSE(1μM)标记的人类Jurkat T-ALL(图22A-图22B)细胞或DLD-1细胞(图22C-图22D)和浓度递增的抗SIRP抗体SIRP4(图22A-图22C)或SIRP9(图22B-图22D)添加到巨噬细胞培养物中并在37℃下孵育3小时。去除未被吞噬的癌细胞并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图23A-图23B。抗SIRP抗体诱导的吞噬作用依赖于FcγRII。人单核细胞来源的巨噬细胞以3x10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板中，并允许粘附24小时。然后单独添加针对人Fc受体CD16、CD32和CD64或mIgG1同种型对照的10μg/ml抗体。紧接着，将8x10⁴个CFSE(1μM)标记的人Jurkat T-ALL细胞和浓度递增的抗SIRP抗体SIRP4(图23A)或SIRP9(图23B)添加到巨噬细胞培养物中并在37℃下孵育3小时。去除未被吞噬的癌细胞，并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

图24A-图24B。抗SIRP抗体不会诱导正常自体人外周血单核细胞(PBMC)的吞噬作用。人单核细胞来源的巨噬细胞以3x10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板中，并允许粘附24小时。将8x10⁴个CFSE(1μM)标记的自体正常PBMC(图24A)或人类Jurkat T-ALL细胞(图24B)和浓度递增的抗SIRP抗体SIRP4或SIRP9添加到巨噬细胞培养物中，并在37℃下孵育3小时。去除未被吞噬的细胞，并洗涤巨噬细胞培养物。巨噬细胞被胰蛋白酶消化并针对CD14进行染色。流式细胞仪用于测定CD14⁺种群中CD14⁺/CFSE⁺细胞的百分比。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则与本公开相关的所用科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交有关所用的命名法和技术是本领域众所周知和常用的那些。

如本文所用，术语“SIRPα”和“含Src同源性2(SH2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶底物1(SHPS-1)”是同义词，可以互换使用。

术语“抗SIRPα抗体”是指本公开的抗体，其旨在用作治疗剂或诊断剂，并且特异性结合SIRPα、特别是人SIRPα。

术语“抗SIRP”是指本公开的抗体，其旨在用作治疗剂或诊断剂，并且特异性结合SIRPα、特别是人SIRPα，结合识别的两个常见变体SIRPαV1和SIRPαV2中的一个或两个，和/或SIRPγ及其抗体变体。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与之发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。与……“特异性结合”或“发生免疫反应”或者直接针对……“特异性结合”或“发生免疫反应”是指抗体与所需抗原的一种或多种抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(K_d＞10^-6M)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、单链Fv片段和单臂抗体。

如本文所用，适用于本发明的抗SIRPα化合物的术语“单克隆抗体(mAb)”是指源自单个拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是其生产方法。本公开的单克隆抗体优选存在于均质或基本均质的种群中。完整的mAb包含2条重链和2条轻链。

“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所公开，“抗体化合物”是指mAb及其抗原结合片段。可通过常规方法产生根据本公开内容表现出相似功能特性的其他抗体化合物。例如，可以用人SIRPα或其片段免疫小鼠，可回收和纯化所得抗体，并且可通过实施例中公开的方法来评估确定它们是否具有与本文公开的抗体化合物相似或相同的结合和功能特性。也可以通过常规方法制备抗原结合片段。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域众所周知的并且可见于例如Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第5-8章和第15章(Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，chapters 5-8and15)。

如本文所公开，“多特异性抗体(multi-specific antibodies)”是例如双特异性、三特异性或四特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体靶向SIRPα和/或SIRPγ以及一个分子中的至少一种其他抗原结合特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体可同时靶向SIRPα和/或SIRPγ以及至少第二抗原(双特异性)，或至少第二和第三抗原(三特异性)，或至少第二、第三和第四抗原(四特异性)，其中所述第二抗原、第三抗原和第四抗原在本文公开的肿瘤细胞上。

双特异性抗体是在一个分子中具有两种不同抗原结合特异性的抗体。因此，三特异性抗体是在一个分子中具有三种不同抗原结合特异性的抗体。四特异性抗体是在一个分子中具有四种不同抗原结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文公开的抗SIRPα抗体是靶向SIRPα和/或SIRPγ以及本文公开的肿瘤细胞上的第二抗原的双特异性抗体。

在一些实施方案中，双特异性抗体可包括具有对称或不对称结构的分子形式。

不对称双特异性抗体可包括但不限于双特异性抗体缀合物、杂交双特异性IgG、杂交双特异性IgM、“仅可变结构域”双特异性抗体分子、C_H1/C_L融合蛋白、Fab融合蛋白、非免疫球蛋白融合蛋白、Fc修饰的IgG、Fc修饰的IgM、附加的且Fc修饰的IgG、附加的且Fc修饰的IgGM，以及修饰的Fc和C_H3融合蛋白。

对称双特异性抗体可能包括但不限于附加的IgG-HC融合、附加的IgG-LC融合、附加的IgG-HC和LC融合、Fc融合、C_H3融合、IgE、IgMC_H2融合，F(ab′)₂、C_H1/CL融合蛋白、修饰的IgG和非免疫球蛋白融合蛋白。

单克隆抗体涵盖其中重链和/或轻链的一部分与鼠抗体、特别是鼠CDR中的相应序列相同或同源的抗体，而链的其余部分是与人类抗体中的相应序列相同或同源。本公开的其他实施方案包括这些单克隆抗体的抗原结合片段，其表现出与单克隆抗体相似或相同的结合和生物学特性。本公开的抗体可包含κ或λ轻链恒定区和重链IgA、IgD、IgE、IgG或IgM恒定区，包括IgG亚类IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的那些，并且在一些情形下具有多种突变以改变Fc受体功能。

可以通过本领域技术人员已知的各种方法中的任何一种来制备包含本公开的鼠CDR的单克隆抗体，包括重组DNA方法。

对抗体工程和改进的当前方法的综述可见于例如P.Chames编辑，(2012)抗体工程：方法和方案，第二版(分子生物学方法，第907册)，Humana出版社，ISBN-10：1617799734(P.Chames，Ed.，(2012)Antibody Engineering：Methods and Protocols，Second Edition(Methods in Molecular Biology，Book 907)，Humana Press，ISBN-10：1617799734)；C.R.Wood编辑，(2011)抗体药物发现(分子医学和药物化学，第4册)，帝国理工出版社(C.R.Wood，Ed.，(2011)Antibody Drug Discovery(Molecular Medicine and MedicinalChemistry，Book4)，Imperial College Press)；R.Kontermann和S.Dubel编辑，(2010)抗体工程第1卷和第2卷(施普林格协议(Springer Protocols))，第二版(R.Kontermann andS.Dubel，Eds.，(2010)Antibody Engineering Volumes 1and 2(Springer Protocols)，Second Edition)；以及W.Strohl和L.Strohl(2012)治疗性抗体工程：推动制药行业最强劲的增长领域的当前和未来前沿，伍德海德出版社(W.Strohl and L.Strohl(2012)Therapeutic antibody engineering：Current and future advances driving thestrongest growth area in the pharmaceutical industry，Woodhead Publishing)。

用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域众所周知的并且可见于例如Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第5-8章和第15章(Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，chapters 5-8 and 15)。

天然存在的全长抗体是“Y”形免疫球蛋白(Ig)分子，其包含四个多肽链：两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链，通过二硫键相互连接。每条链的氨基末端部分——称为片段抗原结合区(FAB)——包括约100-110个或更多氨基酸的可变区，主要通过其中包含的互补决定区(CDR)负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区(“Fc”区)。

CDR散布着更保守的区域，称为框架(“FR”)。许多FR的氨基酸序列是本领域众所周知的。每个轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，重链的3个CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR包含大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。LCVR和HCVR区域内CDR氨基酸残基的编号和定位符合众所周知的卡巴特编号协定(Kabat numbering convention)，Kabat等人(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列，第五版，NIH出版物第91-3242号(Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242)。

如本文所述，“抗原结合位点”还可以定义为“高变区(Hypervariable regions)”、“HVR”或“HV”，并且指抗体可变域的结构高变区，如Chothia和Lesk(Chothia和Lesk，Mol.Biol.(分子生物学)，196：901-917，1987)。有六个HVR，三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。Kabat定义的CDR在本文中使用，但H-CDR1除外，H-CDR1扩展为包括H1。

哺乳动物免疫球蛋白(Ig)重链有五种类型，用希腊字母α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)和μ(mu)表示，它们定义了抗体的分别为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的分类或同种型。IgG抗体可进一步分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

每种重链类型的特征在于具有本领域众所周知的序列的特定恒定区。恒定区在相同同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由三个串联免疫球蛋白(Ig)结构域组成的恒定区，以及用于增加灵活性的铰链区。重链μ和ε有由四个Ig结构域组成的恒定区。

铰链区是连接抗体Fc和Fab部分的柔性氨基酸序列。该区域包含可形成二硫键的半胱氨酸残基，所述二硫键将两条重链连接在一起。

重链的可变区在不同B细胞产生的抗体中不同，但对于单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体都是相同的。每条重链的可变区长约110个氨基酸，并由单个Ig结构域组成。

在哺乳动物中，轻链被分类为卡帕(kappa)(κ)或拉姆达(lambda)(λ)，并且其特征为本领域已知的特定恒定区。轻链具有两个连续的结构域：一个在氨基末端的可变结构域，和一个在羧基末端的恒定结构域。每个抗体包含两条始终相同的轻链；哺乳动物中每个抗体仅存在一种类型的轻链，即κ或λ。

Fc区——由两条重链组成，所述两条重链根据抗体的类别贡献三个或四个恒定域——在调节免疫细胞活性中发挥作用。通过与特定蛋白质结合，Fc区可确保每个抗体对给定抗原产生适当的免疫反应。Fc区还与多种细胞受体(如Fc受体)和其他免疫分子(如补体蛋白)结合。通过这样做，它介导了不同的生理效应，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的调理作用(opsonization)、细胞裂解和脱颗粒作用(degranulation)。

如本文所用，术语“表位(epitope)”是指位于抗体或抗体片段结合的肽或蛋白质上的特定氨基酸排列。表位通常由化学活性表面分子组(如氨基酸或糖侧链)组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性的，即涉及结合单个氨基酸序列；或构象的，即涉及结合抗原不同区域中的两个或多个氨基酸序列，这些序列在线性序列中可能不一定是连续的。

如本文所用，应用于本发明抗体化合物的术语“特异性结合”、“特异性地结合”、“特异性的结合”等是指特异性结合剂(例如抗体)结合目标分子种类优先于与特异性结合剂和目标分子种类混合的其他分子种类结合的能力。当特异性结合剂可以特异性结合目标分子时，就称其特异性识别目标分子种类。

如本文所用，术语“结合亲和力”是指一个分子与另一个分子在该分子上的位点处的结合强度。如果一个特定分子与另一个特定分子结合或特异性缔合，则认为这两个分子表现出彼此的结合亲和力。结合亲和力与一对分子的缔合常数和解离常数有关，但是对于测量或测定这些常数的本文的方法而言并不重要。相反，如本文所使用的描述所述方法的分子之间的相互作用的亲和力通常是在经验研究中观察到的表观亲和力(除非另有说明)，这可用于比较一个分子(例如，抗体或其他特定结合搭档)将结合其他两个分子(例如，肽的两个版本或变体)的相对强度。结合亲和力、缔合常数和解离常数的概念是众所周知的。

如本文所用，术语“序列同一性”是指当使序列对齐以最大化序列匹配时，即考虑间隙和插入，在两个或多个序列中的相应位置处相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可容易地通过已知方法计算，包括但不限于以下描述的方法：计算分子生物学，Lesk，A.M.编辑，牛津大学出版社，纽约，1988(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988)；生物计算：信息学和基因组项目，Smith，D.W.编辑，美国学术出版社(Academic Press)，纽约，1993(Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993)；序列数据的计算机分析，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，胡马纳出版社(Humana Press)，New Jersey，1994(Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994)；分子生物学中的序列分析，vonHeinje，G.，美国学术出版社，纽约，1987(Sequence Analysis in Molecular Biology，yonHeinje，G.，Academic Press，1987)；和序列分析入门，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，MStockton出版社，纽约，1991(Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath.，48：1073(1988)(Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988))。测定同一性的方法旨在提供测试序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法被编入公开可用的计算机程序中。

用于比较的序列的最佳比对可通过例如Smith＆Waterman的局部同源性算法进行、通过同源性比对算法进行、通过搜索相似性方法或通过这些算法的计算机化实施(GCGWisconsin Package的GAP、BESTFIT、PASTA、TFASTA，可从Accelrys，Inc.公司，美利坚合众国加利福尼亚州圣地亚哥获得)进行、或通过目视检查进行。通常参见Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215：403-410(1990)和Altschul等人，Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997)。

适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其记载于(Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；和Altschul，S.等人，J.Mol.Biol(分子生物学杂志)215：403-410(1990))。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中长度为W的短词来识别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词对齐时，这些短词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域词得分阈值。

这些初始的邻域单词点击数(word hit)充当启动搜索以查找包含它们的更长HSP的种子。然后，单词点击数沿着每个序列在两个方向上扩展到可以增加累积比对分数。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终；0)和N(不匹配残基的惩罚分数；始终；0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分数。在以下情况下，每个方向的单词点击数的扩展都会停止：累积比对分数从其最大实现值下降X数量，由于一个或多个负分数残基比对的累积，累积分数变为零或更低，或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)、10的期望值(E)、100的截止值、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵。

除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生的匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸序列与参考核酸序列比较中的最小和概率在一个实施方案中小于约0.1，在另一实施方案中小于约0.01，并且在又一实施方案中小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似。

如本文所用，术语“人源化”、“人源化”等是指将本文公开的鼠单克隆抗体CDR移植至人FR和恒定区。这些术语还包括分别通过例如Kashmiri等人(2005)Methods(方法)36(1)：25-34和Hou等人，(2008)J.Biochem.(生物化学杂志)144(1)：115-120中公开的方法对鼠类CDR和人FR进行的可能的进一步修饰以改善各种抗体特性，如下所述。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指mAb及其抗原结合片段，包括本文公开的抗体化合物，其具有与本文公开的那些相似的根据本公开的结合和功能特性，并且具有是源自非人抗体的基本上人或完全人周围的CDR的FR和恒定区。

如本文所用，术语“FR”或“框架序列”是指FR1至4中的任一个。本公开涵盖的人源化抗体和抗原结合片段包括这样的分子，其中FR1至4中的任何一个或多个基本上或完全是人的，即，其中存在个体基本上或完全是人的FR1至4的任何可能组合。例如，这包括其中FR1和FR2，FR1和FR3，FR1、FR2和FR3等基本上或完全是人的分子。基本上人的框架是那些与已知的人种系框架序列具有至少80％序列同一性的框架。优选地，基本上人的框架具有与本文公开的框架序列或已知的人种系框架序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

完全人框架是那些与已知人类种系框架序列相同的框架。人FR种系序列可以从国际免疫遗传学(international ImMunoGeneTics，IMGT)数据库和Marie-Paule Lefranc和Gerard Lefranc的免疫球蛋白知识手册，学术出版社，2001(The ImmunoglobulinFactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc，Academic Press，2001)，其内容通过引用整体并入本文。

免疫球蛋白知识手册(The Immunoglobulin Facts Book)是用于创建人类抗体库的人类种系免疫球蛋白基因的纲要，包括203个基因和459个等位基因的条目，共有837个显示序列。各个条目包括所有人类免疫球蛋白恒定基因，以及具有至少一个功能或开放阅读框等位基因和位于三个主要基因座中的种系可变基因、多样性基因和连接基因。例如，种系轻链FR可选自：IGKV3D-20、IGKV2-30、IGKV2-29、IGKV2-28、IGKV1-27、IGKV3-20、IGKV1-17、IGKV1-16、1-6、IGKV1-5、IGKV1-12、IGKV1D-16、IGKV2D-28、IGKV2D-29、IGKV3-11、IGKV1-9、IGKV1-39、IGKV1D-39和IGKV1D-33以及IGKJ1-5，并且种系重链FR可选自：IGHV1-2、IGHV1-18、IGHV1-46、IGHV1-69、IGHV2-5、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV3-20、IGHV3-66、IGHV3-72、IGHV3-74、IGHV4-31、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV3-48、IGHV4-39、IGHV4-59和IGHV5-51以及IGHJ1-6。

基本上人FR是与已知的人种系FR序列具有至少80％序列同一性的那些。优选地，基本上人的框架具有与本文公开的框架序列或已知的人类种系框架序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

本公开涵盖的CDR不仅包括本文具体公开的那些，并且还包括具有与本文公开的CDR序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的CDR序列。可替代地，本公开涵盖的CDR不仅包括本文具体公开的那些，并且还包括与本文公开的CDR序列相比在相应位置具有1、2、3、4或5个氨基酸变化的CDR序列。此类序列相同的CDR或氨基酸修饰的CDR优选结合完整抗体所识别的抗原。

除本文公开的人源化抗体外，具有相似功能特性的人源化抗体还可使用Almagro等人，生物科学前沿，抗体人源化，(2008)1月1日；13：1619-33(Frontiers inBiosciences.Humanization of antibodies.(2008)Jan 1；13：1619-33)的几种不同方法生成。在一种方法中，将亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高度序列同一性的人框架中。新框架的序列同一性通常为至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列与亲本抗体化合物的相应框架的序列相同。在框架具有少于100个氨基酸残基的情况下，可改变一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基。与亲本抗体相比，该移植可导致结合亲和力降低。如果是这种情况，该框架可根据Queen等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)88：2869公开的具体标准在某些位置回复突变(back-mutate)为亲本框架。记载可用于基于同源性和回复突变生成人源化变体的方法的其他参考文献包括如Olimpieri等人，生物信息学(Bioinformatics)，2015年2月1日；31(3)：434-435和美国专利4,816,397、5,225,539和5,693,761；以及Winter和同事的方法(Jones等人，(1986)自然(Nature)321：522-525；Riechmann等人，(1988)自然332：323-327；和Verhoeyen等人，(1988)科学(Science)239：1534-1536所记载的。

人源化始于嵌合化，嵌合化是在1980年代上半叶开发的方法(Morrison，S.L.、M.J.Johnson、L.A.Herzenberg＆V.T.Oi：嵌合人抗体分子：具有人恒定区结构域的小鼠抗原结合结构域(Chimeric human antibody molecules：mouse antigen-binding domainswith human constant region domains)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，81，6851-5(1984))，包括将鼠抗体的可变(V)结构域与人类恒定(C)结构域相结合，以生成具有约70％人含量的分子。

几种不同的方法可用于产生本文所述的人源化抗体。在一种方法中，将亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人FR中。新FR的序列同一性通常为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列与亲本抗体化合物中的相应FR相同。在FR具有少于100个氨基酸残基的情况下，可改变一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基。与亲本抗体相比，该移植可导致结合亲和力降低。如果是这种情况，FR可根据Queen等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)88：2869公开的具体标准在某些位置回复突变为亲本框架。记载可用于基于同源性和回复突变生成人源化变体的方法的其他参考文献包括如Olimpieri等人，生物信息学(Bioinformatics)，2015年2月1日；31(3)：434-435和美国专利4,816,397、5,225,539和5,693,761；以及Winter和同事的方法(Jones等人，(1986)自然(Nature)321：522-525；Riechmann等人，(1988)自然332：323-327；和Verhoeyen等人，(1988)科学(Science)239：1534-1536所记载的。

可如下所述进行考虑用于回复突变的残基的鉴定。当氨基酸属于以下类别时，正在使用的人种系序列的框架氨基酸(“受体FR”)被来自亲本抗体化合物框架(“供体FR”)的框架氨基酸取代：

(a)受体框架的人FR中的氨基酸在该位置对于人类框架而言是不常见的，而供体免疫球蛋白中相应的氨基酸在该位置对于人类框架而言是典型的；

(b)氨基酸的位置紧邻其中一个CDR；或

(c)在三维免疫球蛋白模型中框架氨基酸的任何侧链原子在CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(angstroms)(中心到中心)内。

当受体框架的人FR中的每个氨基酸和供体框架中的相应氨基酸对于人框架在该位置通常不常见时，可在该位置用对于人框架典型的氨基酸替换所述氨基酸。这种回复突变标准使技术人员能够恢复亲本抗体化合物的活性。

另一种产生与本文公开的抗体化合物表现出相似功能特性的人源化抗体的方法涉及在不改变框架的情况下随机突变移植的CDR内的氨基酸，并筛选结合亲和力和其他功能特性与亲本抗体化合物一样好或比其更好的所得分子。还可在每个CDR内的每个氨基酸位置引入单个突变，然后评估所述突变对结合亲和力和其他功能特性的影响。可以组合产生改进特性的单个突变，以评估它们彼此组合的效果。

此外，上述两种方法的组合是可能的。CDR移植后，技术人员除了在CDR中引入氨基酸变化外，还可回复突变特定的FR。该方法记载于Wu等人，(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)294：151-162。

应用本公开的教导，本领域技术人员可以使用常用技术，例如定点诱变，来取代本公开的CDR和FR序列内的氨基酸，从而产生源自本发明序列的更多可变区氨基酸序列。最多可以在特定取代位点引入所有天然存在的氨基酸。然后，本文公开的方法可用于筛选这些额外的可变区氨基酸序列以鉴定具有指定体内功能的序列。由此，可以鉴定适于制备根据本公开内容的人源化抗体及其抗原结合部分的更多序列。优选地，框架内的氨基酸取代限于本文公开的四种轻链和/或重链FR中的任何一种或多种内的一个、两个、三个、四个或五个位置。优选地，CDR内的氨基酸取代限于三种轻链和/或重链CDR中的任何一种或多种内的一个、两个、三个、四个或五个位置。上述这些FR和CDR内的多种变化的组合也是可能的。

通过引入上述氨基酸修饰产生的抗体化合物的功能特性与本文公开的特定分子所示的那些相一致，可通过本文公开的实施例中的方法来证实。

如上所述，为了避免在患者中引发人抗鼠抗体(HAMA)反应的问题，已对鼠抗体进行基因操作，通过将它们的互补决定区(CDR)移植到人免疫球蛋白分子的可变轻(V_L)框架和可变重(V_H)框架，同时保留那些被认为对抗原结合位点的完整性至关重要的鼠框架残基，以逐步用人类对应物中存在的氨基酸残基替换它们的鼠含量。然而，人源化抗体的异种CDR可在患者体内引起抗独特型(anti-idiotypic，anti-Id)反应。

为了最小化抗Id反应，开发了通过将抗体-配体相互作用中最关键的CDR残基移植到人框架上来人源化异种抗体的程序，称为“SDR移植”，其中仅CDRS的关键特异性决定残基(specificity determining residue，SDR)被移植到人类框架上。该程序记载于Kashmiri等人，(2005)方法(method)36(1)：25-34，包括通过已知结构的抗原-抗体复合物的三维结构数据库或通过抗体结合位点的突变分析来识别SDR。另一种涉及保留更多CDR残基的人源化的方法是基于“缩写的”CDR的移植，即包括所有SDR的CDR残基延伸(stretch)。Kashmiri等人还公开了评估人源化抗体对来自于已施用鼠抗体的患者血清的反应性的程序。

构建具有改进的免疫原性特性的人抗体变体的另一种策略公开于Hou等人，(2008)J.Biochem.(生物化学杂志)144(1)：115-120。这些作者使用计算机辅助同源建模构建的4C8分子模型，通过CDR移植从4C8(一种鼠类抗人CD34单克隆抗体)开发了人源化抗体。使用该分子模型，作者鉴定了在抗原结合中具有潜在重要性的FR残基。通过将这些关键的鼠FR残基转移到基于与鼠抗体FR的同源性以及鼠CDR残基所选择的人抗体框架上，生成了4C8的人源化版本。由此产生的人源化抗体显示出与原始鼠抗体相似的抗原结合亲和力和特异性，表明它可能是临床上常规使用的鼠抗CD34抗体的替代物。

本公开的实施方案涵盖为避免被人类免疫系统识别而产生的抗体，其含有任何组合形式的本文公开的CDR，使得预期的mAb可含有来自本文公开的单个鼠mAb的CDR组，或来自两个或三个所公开的鼠mAb的单个CDR的CDR组的轻链和重链。这样的mAb可通过分子生物学的标准技术产生并使用本文描述的测定法筛选所需的活性。由此，本公开提供了一种“混合和匹配”方法来创建新的mAb，所述新的mAb包含来自所公开的鼠mAb的CDR的混合物，以实现新的或改进的治疗活性。

与本文公开的分子“竞争”的本公开涵盖的单克隆抗体或其抗原结合片段是在这样的位点结合人SIRPα的那些，所述位点与现有的分子结合位点相同或与其重叠。竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段可例如通过抗体竞争测定来鉴定。例如，纯化或部分纯化的人SIRPα胞外结构域样品可以结合到固体支持物上。然后，添加本公开的抗体化合物或其抗原结合片段和怀疑能够与所述公开的抗体化合物竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。两种分子中的一种被标记。如果标记的化合物和未标记的化合物结合到SIRPα上的分隔和离散位点，无论是否存在可疑的竞争化合物，标记的化合物都会结合到相同的水平。然而，如果相互作用位点相同或重叠，则未标记的化合物将竞争，与抗原结合的标记的化合物的量将降低。如果未标记的化合物过量存在，很少的(如果有)标记的化合物将结合。出于本公开的目的，竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段是将当前抗体化合物与SIRPα结合降低约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的那些。进行所述竞争测定的程序的细节在本领域中是众所周知的，并且可见于例如Harlow和Lane(1988)，抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(Harlow and Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y)。可使用纯化的抗体对此类测定进行定量。标准曲线通过滴定一种抗体自身来建立，即，相同的抗体用于标记物和竞争物。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段来抑制标记分子与板结合的能力。绘制结果，并比较达到所需结合抑制程度所需的浓度。

在此类竞争测定中与本公开的抗体化合物竞争的mAb或其抗原结合片段是否具有与当前抗体化合物相同或相似的功能特性可通过这些方法结合以下实施例2-7中描述的方法来确定。在多种实施方案中，与本文公开的抗体化合物相比，用于本文涵盖的治疗方法的竞争抗体具有约50％至约100％或约125％或更多的本文所述的生物活性。在一些实施方案中，与本文公开的抗体化合物相比，竞争抗体具有约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同的生物活性，如通过下文提供的实施例中公开的方法测定的。

用于组合物和方法的mAb或其抗原结合片段或竞争抗体可以是本文所述的任何同种型。此外，任何这些同种型都可包含如下的进一步氨基酸修饰。

本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或竞争抗体可以是人IgG1同种型。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG1恒定区以改变抗体半衰期。抗体半衰期在很大程度上受Fc依赖性与新生儿Fc受体相互作用的调节(Roopenian和Alikesh，2007)。单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG1恒定区可以被修饰，以增加半衰期，包括但不限于氨基酸修饰N434A、T307A/E380A/N434A(Petkova等人，2006；Yeung等，2009)；M252Y/S254T/T256E(Dall’Acqua等人，2006)；T250Q/M428L(Hinton等人，2006)；和M428L/N434S(Zalevsky等人，2010)。

与增加半衰期相反，在某些情况下需要缩短半衰期，使得降低与高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)抗体相关的不良事件的可能性(Presta 2008)。可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgGl恒定区，以缩短半衰期和/或减少内源性IgG，包括但不限于氨基酸修饰I253A(Petkova等人，2006)；P257I/N434H、D376V/N434H(Datta-Mannan等人，2007)；和M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F(Vaccaro等人，2005)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG1恒定区，以增加或减少抗体效应子功能。这些抗体效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、C1q结合和与Fc受体的改变结合。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgGl恒定区，以增加抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰S298A/E333A/K334(Shields等人，2001)；S239D/I332E和S239D/A330L/I332E(Lazar等人，2006)；F234L/R292P/Y300L、F234L/R292P/Y300L/P393L和F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L(Stevenhagen等人，2007)；G236A、G236A/S239D/I332E和G236A/S239D/A330L/I332E(Richards等人，2008)；K326A/E333A、K326A/E333S和K326W/E333S(Idusogie等人，2001)；S267E和S267E/L328F(Smith等人，2012)；H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S234T和S267E/H268F/S324T(Moore等人，2010)；S298G/T299A(Sazinsky等人，2008)；E382V/M428I(Jung等人，2010)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG1恒定区，以减少抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰N297A和N297Q(Bolt等人，1993；Walker等人，1989)；L234A/L235A(Xu等人，2000)；K214T/E233P/L234V/L235A/G236-deleted/A327G/P331A/D356E/L358M(Ghevaert等人，2008)；C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(McEarchern等人，2007)；S267E/L328F(Chu等人，2008)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG1恒定区，以降低抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰V234A/G237A(Cole等人，1999)；E233D、G237D、P238D、H268Q、H268D、P271G、V309L、A330S、A330R、P331S、H268Q/A330S/V309L/P331S、H268D/A330S/V309L/P331S、H268Q/A330RfV309L/P331S、H268D/A330R/V309L/P331S、E233D/A330R、E233D/A330S、E233D/P271G/A330R、E233D/P271G/A330S、G237D/H268D/P271G、G237D/H268Q/P271G、G237D/P271G/A330R、G237D/P271G/A330S、E233D/H268D/P271G/A330R、E233D/H268Q/P271G/A330R、E233D/H268D/P271G/A330S、E233D/H268Q/P271G/A330S、G237D/H268D/P271G/A330R、G237D/H268Q/P271G/A330R、G237D/H268D/P271G/A330S、G237D/H268Q/P271G/A330S、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R、E233D/G237D/H268Q/P271G/A330R、E233D/G237D/H268D/P271G/A330S、E233D/G237D/H268Q/P271G/A330S、P238D/E233D/A330R、P238D/E233D/A330S、P238D/E233D/P271G/A330R、P238D/E233D/P271G/A330S、P238D/G237D/H268D/P271G、P238D/G237D/H268Q/P271G、P238D/G237D/P271G/A330R、P238D/G237D/P271G/A330S、P238D/E233D/H268D/P271G/A330R、P238D/E233D/H268Q/P271G/A330R、P238D/E233D/H268D/P271G/A330S、P238D/E233D/H268Q/P271G/A330S、P238D/G237D/H268D/P271G/A330R、P238D/G237D/H268Q/P271G/A330R、P238D/G237D/H268D/P271G/A330S、P238D/G237D/H268Q/P271G/A330S、P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R、P238D/E233D/G237D/H268Q/P271G/A330R、P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330S、P238D/E233D/G237D/H268Q/P271G/A330S(An等人，2009；Mimoto，2013)。

本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或竞争抗体可以是人IgG2同种型。

可修饰本文描述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG2恒定区，以增加或减少抗体效应子功能。这些抗体效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和C1q结合，以及与Fc受体的改变结合。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG2恒定区，以增加抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰K326A/E333S(Idusogie等人，2001)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG2恒定区，以降低抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰V234A/G237A(Cole等人，1999)；E233D、G237D、P238D、H268Q、H268D、P271G、V309L、A330S、A330R、P331S、H268Q/A330S/V309L/P331S、H268D/A330S/V309L/P331S、H268Q/A330R/V309L/P331S、H268D/A330R/V309L/P331S、E233D/A330R、E233D/A330S、E233D/P271G/A330R、E233D/P271G/A330S、G237D/H268D/P271G、G237D/H268Q/P271G、G237D/P271G/A330R、G237D/P271G/A330S、E233D/H268D/P271G/A330R、E233D/H268Q/P271G/A330R、E233D/H268D/P271G/A330S、E233D/H268Q/P271G/A330S、G237D/H268D/P271G/A330R、G237D/H268Q/P271G/A330R、G237D/H268D/P271G/A330S、G237D/H268Q/P271G/A330S、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R、E233D/G237D/H268Q/P271G/A330R、E233D/G237D/H268D/P271G/A330S、E233D/G237D/H268Q/P271G/A330S、P238D/E233D/A330R、P238D/E233D/A330S、P238D/E233D/P271G/A330R、P238D/E233D/P271G/A330S、P238D/G237D/H268D/P271G、P238D/G237D/H268Q/P271G、P238D/G237D/P271G/A330R、P238D/G237D/P271G/A330S、P238D/E233D/H268D/P271G/A330R、P238D/E233D/H268Q/P271G/A330R、P238D/E233D/H268D/P271G/A330S、P238D/E233D/H268Q/P271G/A330S、P238D/G237D/H268D/P271G/A330R、P238D/G237D/H268Q/P271G/A330R、P238D/G237D/H268D/P271G/A330S、P238D/G237D/H268Q/P271G/A330S、P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330R、P238D/E233D/G237D/H268Q/P271G/A330R、P238D/E233D/G237D/H268D/P271G/A330S、P238D/E233D/G237D/H268Q/P271G/A330S(An等人，2009；Mimoto，2013)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG2的Fc区，以改变同种型和/或激动活性，包括但不限于氨基酸修饰C127S(C_H1结构域)、C232S、C233S、C232S/C233S、C236S和C239S(White等人，2015；Lightle等人，2010)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG2的Fc区，以表现出减少的FcγR结合能力但具有保守的FcRn结合。这些IgG Fc突变体使可溶性或细胞表面抗原的治疗靶向成为可能，同时最大限度地减少免疫效应子功能和补体介导的细胞毒性的Fc相关的参与。在一个实施方案中，根据EU编号系统，IgG2 Fc突变体包含V234A、G237A、P238S。在另一个实施方案中，根据EU编号系统，IgG2 Fc突变体包含V234A、G237A、H268Q或H268A、V309L、A330S、P331S。在一个具体方面，根据EU编号系统，IgG2 Fc突变体包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S以及任选地P233S。

本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或竞争抗体可以是人IgG3同种型。

单克隆抗体或其抗原结合片段的人IgG3恒定区，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段的人IgG3恒定区可在一个或多个氨基酸处进行修饰以增加抗体半衰期、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或细胞凋亡活性。

所述单克隆抗体或其抗原结合片段的人IgG3恒定区，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段的人IgG3恒定区可在氨基酸R435H处进行修饰以增加抗体半衰期。

本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或竞争抗体可以是人IgG4同种型。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG4恒定区，以降低抗体效应子功能。这些抗体效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

可修饰本文所述的单克隆抗体、其抗原结合片段或竞争抗体的人IgG4恒定区，以防止Fab臂交换和/或降低抗体效应子功能，包括但不限于氨基酸修饰F234A/L235A(Alegre等人，1994)；S228P、L235E和S228P/L235E(Reddy等人，2000)。

如本文所用，术语“肿瘤”指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前及癌细胞和组织。

如本文所用，术语“癌症(cancer)”、“癌性(cancerous)”和“肿瘤(tumor)”并不相互排斥。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以异常细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(即霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(liver cancer)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤(hepaticcarcinoma)、白血病和其他淋巴增生性疾病，以及多种类型的头颈癌。

如本文所用，术语“易感癌”是指这样的癌，其细胞表达CD47、IRPα、或CD47和SIRPα并且对用来自本公开的防止CD47和SIRPα之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段、或竞争抗体或其抗原结合片段的治疗有反应。

如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指身体的免疫系统转向自身并错误地攻击健康细胞。

如本文所用，术语“炎性疾病”是指以炎症为特征的疾病，所述炎症是包括以下的基本病理过程：组织学上明显的细胞学变化、细胞浸润和介质释放的动态复合，其发生在感染血管和邻近组织中，对由物理、化学或生物制剂引起的损伤或异常刺激产生反应，包括局部反应和由此产生的形态变化；破坏或移除有害材料；以及导致修复和治愈的反应。

如本文所用，术语“自身炎症性疾病”是指当先天免疫系统因未知原因引起炎症时导致的疾病。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”(″treating″or″treat”or″treatment″)是指减缓、中断、阻止、控制、停止、减少或逆转体征、症状、障碍、病症或疾病的进展或严重性，但不一定涉及完全消除所有与疾病相关的体征、症状、病症或障碍。术语“治疗”等是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。

如本文所用，术语“有效量”是指本公开的抗体化合物的量或剂量，其在对患者或器官进行单剂量或多剂量施用后提供所需的治疗或预防。

对于任何特定受试者的精确有效量将取决于他们的体型和健康状况、他们病症的性质和程度、以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合。给定患者的有效量由常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。本发明抗体化合物的治疗有效量还可包含将每单剂量约0.1mg/kg至约150mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg、约0.1mg/kg至约50mg/kg、或约0.05mg/kg至约10mg/kg的量施用至获取的器官或患者。在这方面，已知的基于抗体的药物提供指导。例如，Herceptin^TM(赫赛汀)通过静脉输注21mg/ml溶液施用，其中初始负荷剂量为4mg/kg体重，每周维持剂量为2mg/kg体重；例如，Rituxan^TM(美罗华)以375mg/m²每周施用。

医疗保健提供者可以通过监测抗体化合物对肿瘤消退、循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞或抗肿瘤反应的影响来确定对任何个体患者的治疗有效量。通过这些方法获得的数据的分析允许在治疗期间修改治疗方案，使得施用本公开的抗体化合物的最佳量，无论是单独使用还是彼此组合使用，或是与另一种治疗剂组合使用，或两者，从而还可以确定治疗的持续时间。由此，可以在治疗过程中修改给药/治疗方案，使得表现出令人满意的功效的单独或组合使用的抗体化合物的最低量被施用，并且从而所述化合物的施用仅持续到成功治疗患者所必需的。已知的基于抗体的药物提供了与施用频率相关的指导，例如药物是否应每天、每周、每月等给药。频率和剂量还可取决于症状的严重程度。

在一些实施方案中，本公开露的抗体化合物可以用作人医学和兽医学中的药物，该药物通过多种路径给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、囊内、心室内、经皮、经皮肤、局部、皮下、肿瘤内、鼻内、肠内、舌下、阴道内、血管内或直肠路径。组合物还可以直接给予至病灶(如肿瘤)内。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。皮下注射器也可以用于给予药物组合物。典型地，这些治疗组合物可以制备为可注射剂，即或者作为液体溶液或者悬浮液。也可以制备在注射前适于溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。兽医应用包括治疗伴侣/宠物动物，如猫和狗；役用动物，如导盲犬或服务犬，以及马；运动动物，如马和狗；动物园动物，如灵长类动物、猫科动物(如狮子和老虎)、熊科动物等；以及其他圈养的珍稀动物。

可以通过本领域中熟知的方法制备此类药物组合物。参见例如，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第21版(2005)，Lippincott Williams＆Wilkins(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司)，费城，宾夕法尼亚州，并且包括本文公开的一种或多种抗体化合物、以及药学上可接受的，例如生理学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂。

癌症适应症

本文公开了有效作为癌症治疗剂的抗SIRPα mAb及其抗原结合片段，这些治疗剂优选胃肠外给予至患有易感性血液癌和实体癌的患者，这些癌症包括但不限于白血病，包括全身性肥大细胞增多症、急性淋巴细胞(成淋巴细胞)白血病(ALL)、T细胞-ALL、急性髓性白血病(AML)、粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生障碍/赘生物、单核细胞白血病、以及浆细胞白血病；多发性骨髓瘤(MM)；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)；淋巴瘤，包括组织细胞性淋巴瘤和T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，如低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级别/滤泡性NHL、中等级别的弥漫性NHL、高级别成免疫细胞NHL、高级别成淋巴细胞NHL、高级别小非裂细胞NHL、巨大肿块(bulky disease)NHL；实体肿瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌(结肠直肠癌)、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌(非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌(肝癌、肝细胞瘤)、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌(头颈癌)、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、以及子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤(meduloblastoma)、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤，该肉瘤包括但不限于骨肉瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤，以及软骨肉瘤(chrondrosarcoma)；以及黑色素瘤。

癌症治疗

如本领域普通技术人员熟知的，当单药治疗或程序不能充分地治疗或治愈疾病或病症时，常常在癌症治疗中采用组合疗法。常规的癌症治疗常常涉及手术、放射治疗、细胞毒性药物的组合以实现相加作用和协同作用、或任何或所有这些方法的组合。特别有用的化学治疗与生物治疗组合采用通过不同的作用机制起作用的药物，从而增加癌细胞控制或杀死，增加免疫系统控制癌细胞生长的能力，降低在治疗期间的抗药性的可能，并且通过允许使用降低剂量的各种药物而将可能的重叠毒性降低到最低限度。

可用于由本发明方法涵盖的组合疗法的常规抗肿瘤和抗赘生物药剂的类别公开于Goodman＆Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗学的药理学基础]，第十二版(2010)L.L.Brunton，B.A.Chabner和B.C.Knollmann编辑，第VIII部分，“Chemotherapy of Neoplastic Diseases[肿瘤性疾病的化疗]”，第60-63章，第1665-1770页，麦格劳希尔集团，纽约中(Goodman＆Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，Twelfth Edition(2010)L.L.Brunton，B.A.Chabner，andB.C.Knollmann Eds.，Section VIII，“Chemotherapy of Neoplastic Diseases”，Chapters 60-63，pp.1665-1770，McGraw-Hill，NY)，包括但不限于蒽环类、铂类、紫杉酚、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、和烷化剂。

除了前述内容之外，本公开的这些方法与癌症适应症的治疗相关，并且进一步包括经由手术、放射、和/或向有需要的患者给予有效量的化学小分子或生物药物来治疗患者，该化学小分子或生物药物包括但不限于，常规使用的或目前正在开发的用来治疗肿瘤病症的肽、多肽、蛋白质、核酸治疗剂。这包括除了本文公开的那些之外的抗体及其抗原结合片段、细胞因子、反义寡核苷酸、siRNA、以及miRNA。

本文公开和要求保护的治疗方法包括使用本文公开的单独抗体、和/或彼此的组合、和/或与本公开的结合SIRPα的其抗原结合片段的组合、和/或还与表现出适当的生物/治疗活性的竞争性抗体的组合，例如，这些抗体化合物实现最大治疗功效的所有可能组合。

另外，本发明治疗方法还涵盖使用这些抗体、其抗原结合片段、其竞争性抗体和组合、与以下各项的进一步组合：(1)选自手术、放射、抗肿瘤和抗赘生物剂的一种或多种抗肿瘤治疗性治疗，或任何这些的组合；或者(2)抗肿瘤生物剂中的一种或多种；或者(3)对于本领域普通技术人员显而易见的处于一种或多种适当组合中的(1)或(2)的任何前述等效物，以便针对特定适应症实现所希望的治疗性治疗作用。

通过调节影响对肿瘤抗原的T细胞应答的共刺激性或抑制性相互作用增加对癌症的免疫应答的抗体和小分子药物(包括免疫检验点的抑制剂和共刺激分子的调节剂)在由本文所涵盖的组合治疗方法的背景下也具有特别的意义并且包括但不限于其他抗SIRPα抗体。向患者给予结合SIRPα蛋白的治疗剂，例如结合SIRPα并防止CD47与SIRPα之间的相互作用的抗体或小分子的给药，从而使得癌细胞经由吞噬清除。结合SIRPα蛋白的治疗剂与针对一种或多种另外的细胞靶标的治疗剂(例如抗体、化学小分子或生物药物)组合，该一种或多种另外的细胞靶标选自：CD47(分化簇47)、CD70(分化簇70)、CD200(OX-2膜糖蛋白，分化簇200)、CD154(分化簇154，CD40L，CD40配体，分化簇40配体)、CD223(淋巴细胞激活基因3，LAG3，分化簇223)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、GITR(TNFRSF18，糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，激活诱导的TNFR家族受体，AITR，肿瘤坏死因子受体超家族成员18)、CD20(分化簇20)、CD28(分化簇28)、CD40(分化簇40，Bp50，CDW40，TNFRSF5，肿瘤坏死因子受体超家族成员5，p50)、CD86(B7-2，分化簇86)、CD160(分化簇160，BY55，NK1，NK28)、CD258(LIGHT，分化簇258，肿瘤坏死因子配体超家族成员14，TNFSF14，疱疹病毒进入调控因子配体(HVEM-L)、CD270(HVEM，肿瘤坏死因子受体超家族成员14，疱疹病毒进入调控因子，分化簇270，LIGHTR，HVEA)、CD275(ICOSL，ICOS配体，诱导型T细胞共刺激物配体，分化簇275)、CD276(B7-H3，B7同系物3，分化簇276)、OX40L(OX40配体)、B7-H4(B7同系物4，VTCN1，含有V-set结构域的T-细胞激活抑制剂1)、GITRL(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体-配体，糖皮质激素诱导的TNFR-配体)、4-1BBL(4-1BB配体)、CD3(分化簇3，T3D)、CD25(IL2Rα，分化簇25，白介素-2受体α链，IL-2受体α链)、CD48(分化簇48，B-淋巴细胞激活标记，BLAST-1，信号传导淋巴细胞激活分子2，SLAMF2)、CD66a(癌胚抗原细胞粘附分子-1，癌胚抗原相关细胞粘附分子1，胆汁糖蛋白，BGP，BGP1，BGPI，分化簇66a)、CD80(B7-1，分化簇80)、CD94(分化簇94)、NKG2A(自然杀伤组2A，杀伤细胞凝集素样受体亚家族D成员1，KLRD1)、CD96(分化簇96，TActILE，T细胞激活增加的晚期表达)、CD112(PVRL2，粘连蛋白，脊髓灰质炎病毒受体相关2，疱疹病毒进入调控因子B，HVEB，粘连蛋白-2，分化簇112)、CD115(CSF1R，集落刺激因子1受体，巨噬细胞集落刺激因子受体，M-CSFR，分化簇115)、CD205(DEC-205，LY75，淋巴细胞抗原75，分化簇205)、CD226(DNAM1，分化簇226，DNAX辅助分子-1，PTA1，血小板和T细胞激活抗原1)、CD244(分化簇244，自然杀伤细胞受体2B4)、CD262(DR5，TrailR2，TRAIL-R2，肿瘤坏死因子受体超家族成员10b，TNFRSF10B，分化簇262，KILLER，TRICK2，TRICKB，ZTNFR9，TRICK2A，TRICK2B)、CD284(Toll样受体-4，TLR4，分化簇284)、CD288(Toll样受体-8，TLR8，分化簇288)、白血病抑制因子(LIF)、TNFSF15(肿瘤坏死因子超家族成员15，血管内皮细胞生长抑制因子，VEGI，TL1A)、TDO2(色氨酸2,3-加双氧酶，TPH2，TRPO)、IGF-1R(I型胰岛素样生长因子)、GD2(双唾液酸神经节苷脂2)、TMIGD2(跨膜和含有免疫球蛋白结构域蛋白质2)、RGMB(RGM结构域家族，成员B)、VISTA(T细胞激活的含有V-结构域免疫球蛋白抑制因子，B7-H5，B7同系物5)、BTNL2(嗜乳脂蛋白样蛋白2)、Btn(嗜乳脂蛋白家族)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，Vstm3，WUCAM)、Siglecs(唾液酸结合Ig样凝集素)，即SIGLEC-15、神经营养蛋白，VEGFR(血管内皮生长因子受体)、ILT家族(LIR，免疫球蛋白样转录家族，白细胞免疫球蛋白样受体)、NKG家族(自然杀伤组家族，C型凝集素跨膜受体)、MICA(MHCI类多肽相关序列A)、TGFβ(转化生长因子β)、STING途径(干扰素基因途径的刺激因子)、精氨酸酶(精氨酸脒基酶，刀豆氨酸酶，L-精氨酸酶，精氨酸转脒酶)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、以及HHLA2(B7-H7，B7y，HERV-H LTR-相关蛋白2，B7同系物7)、PD-1的抑制剂(程序性细胞死亡蛋白1，PD-1，CD279，分化簇279)、PD-L1(B7-H1，B7同系物1，程序性死亡-配体1，CD274，分化簇274)、PD-L2(B7-DC，程序性细胞死亡1配体2，PDCD1LG2，CD273，分化簇273)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，CD152，分化簇152)、BTLA(B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子，CD272，分化簇272)、吲哚胺2，3-加双氧酶(IDO，IDO1)、TIM3(HAVCR2，甲型肝炎病毒细胞受体2，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，KIM-3，肾损伤分子3，TIMD-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-结构域3)、A2A腺苷受体(ADO受体)、CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1，分化簇39，ENTPD1)、以及CD73(外-5′-核苷酸酶，5’-核苷酸酶，5’-NT，分化簇73)、CD27(分化簇27)、ICOS(CD278，分化簇278，诱导性T-细胞共刺激因子)、CD137(4-1BB，分化簇137，肿瘤坏死因子受体超家族成员9，TNFRSF9)、OX40(CD134，分化簇134)、TNFSF25(肿瘤坏死因子受体超家族成员25)、IL-10(白介素-10，人细胞因子合成抑制因子，CSIF)和半乳凝素。

(爱必妥)(西妥昔单抗，百时美施贵宝(Bristol-Meyers Squibb))是批准的重组人/小鼠嵌合单克隆抗体的实例，所述抗体特异性结合到人表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外结构域。

(利妥昔单抗，Biogen IDEC/Genentech)是批准的抗CD20抗体的实例。

(易普利姆玛)(伊匹单抗；百时美施贵宝)是批准的抗CTLA-4抗体的实例。

(派姆单抗；默克)和/>

(纳武单抗；百时美施贵宝公司)是批准的抗PD-1抗体的实例。

TECENTRIQ^TM(泰圣奇)(阿特珠单抗；罗氏)是批准的抗PD-L1抗体的实例。

BAVENCIO^TM(阿维鲁单抗，默克和辉瑞以及礼来公司(EliLilly))是批准的抗PD-L1抗体的实例。

IMFINZI^TM(度伐单抗；医学免疫/阿斯利康)是批准的抗PD-L1抗体的实例。

实施例说明了本公开的多种实施方案，但不应将其视为仅将本公开限制于这些具体公开的实施方案。

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实施例2

SIRP单克隆抗体与SIRPα的结合

本公开的抗SIRP单克隆抗体(mAb)与SIRP alpha(SIRPα)的结合使用Fc标记的人SIRPα通过固相ELISA测定。体外测量可溶性抗SIRP抗体的结合。

Fc标记的人SIRPα(ACRO＃SIG-H5251，基因型变体1)以在4℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释过夜的1μg/ml的浓度吸附到高结合微量滴定板上。除去包被溶液，洗涤孔，然后用75％酪蛋白于含有0.5％Tween20的PBS(PBST)中在室温下振荡阻断60分钟。去除阻断溶液，洗涤孔，并在室温下培养60分钟，同时用PBST稀释的鼠或人抗SIRP mAb以30μg/ml的起始浓度振荡并以3倍连续稀释降低浓度。用PBST洗涤孔3次，并在室温下培养60分钟，同时用PBST中1∶10000稀释的HRP标记的驴抗小鼠或抗人二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories)进行振荡。洗涤孔，然后用过氧化物酶底物培养，并测量450nm处的吸光度。使用非线性拟合模型(GraphPad Prism)计算表观亲和力。

如表1所示，所有可溶性抗SIRP mAb与人SIRPα结合，其中亲和力在皮摩尔到纳摩尔范围内。图1A-图1V展示了本公开的抗体的代表性结合曲线。

表1.抗SIRP抗体与人SIRPα的结合。

	人SIRPα结合K_d(pM)
		SIRP1	39
SIRP2	182
		SIRP3	289
SIRP4	161
		SIRP5	65
SIRP6	131
		SIRP7	197
SIRP8	57
		SIRP9	583
SIRP10	＞10,000
		SIRP11	194
SIRP12	165
		SIRP13	1,565
SIRP14	565
		SIRP15	608
SIRP16	＞40,000
		SIRP17	326
SIRP18	364
		SIRP19	＞19,000
SIRP20	157
		SIRP21	274
SIRP22	＞11,000
		SIRP23	164

实施例3

小鼠抗SIRP mAb与表达SIRPα的THP-1细胞的结合

杂交瘤来源的小鼠SIRP抗体SIRP1、SIRP2和SIRP3与表达SIRPα而不是SIRPγ的THP-1细胞的结合活性通过流式细胞术测定。

使用在PBS中稀释的浓度递增的mAb在pH7.2下，使THP-1细胞在37℃下培养60分钟。然后，用PBS洗涤细胞，并使用Alexa Fluor-647标记的驴抗小鼠抗体(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))于PBS中再孵育1小时。洗涤细胞，并使用C6 Accuri流式细胞仪(BD公司(Becton Dickinson))分析结合。

如图2所示，所有抗体以浓度依赖方式与表达SIRPα的THP-1细胞结合。

实施例4

SIRP mAb与SIRPγ的结合

本公开的抗SIRP抗体与SIRP gamma(SIRPγ)的结合使用Fc标记的人SIRPγ通过ELISA测定。体外测量可溶性抗SIRP抗体的结合。

Fc标记的人SIRPγ(ACRO#SIG-H5253)以在4℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中过夜的1μg/ml的浓度吸附到高结合微量滴定板上。除去包被溶液，洗涤孔，然后用75％酪蛋白于含有0.5％Tween 20的PBS(PBST)中在室温下振荡阻断60分钟。去除阻断溶液，洗涤孔，并在室温下培养60分钟，同时用PBST稀释的抗SIRP mAb以30μg/ml的起始浓度振荡并以3倍连续稀释降低浓度。用PBST洗涤孔3次，并在室温下培养60分钟，同时用PBST中1∶10,000稀释的HRP标记的驴抗小鼠或抗人二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories)进行振荡。洗涤孔，然后用过氧化物酶底物培养，并测量450nm处的吸光度。使用非线性拟合模型(GraphPadPrism)计算表观亲和力。

如表2所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP2、SIRP3、SIRP4、SIRP5、SIRP6、SIRP7、SIRP9、SIRP10、SIRP11、SIRP12、SIRP16、SIRP17、SIRP18、SIRP20、SIRP21和SIRP23以皮摩尔或纳摩尔范围内的表观亲和力与人SIRPγ结合。此外，抗SIRP mAb SIRP1、SIRP8、SIRP13、SIRP14、SIRP15、SIRP19和SIRP22在mAb浓度最高达30μg/ml时不明显结合人SIRPγ。图3A-图3V展示了源自本公开的抗体的代表性结合曲线。

表2.抗SIRP抗体与人SIRPγ的结合。

	人SIRPγ结合K_d(pM)
		SIRP1	*NB
SIRP2	734
		SIRP3	170
SIRP4	274
		SIRP5	126
SIRP6	183
		SIRP7	99
SIRP8	*NB
		SIRP9	510
SIRP10	＞10,000
		SIRP11	7,223
SIRP12	＞12,000
		SIRP13	*NB
SIRP14	*NB
		SIRP15	＞14,000
SIRP16	*NB
		SIRP17	＞15,000
SIRP18	＞34,000
		SIRP19	*NB
SIRP20	＞29,000
		SIRP21	＞21,000
SIRP22	*NB
		SIRP23	225

*NB-在mAb浓度最高达30μg/ml时未检测到结合

实施例5

小鼠mAb与表达SIRPγ的Jurkat T细胞的结合

小鼠杂交瘤来源的SIRP mAb与表达SIRPγ而非SIRPα的Jurkat细胞的结合活性通过流式细胞术测定。

使用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的浓度递增的抗SIRP mAb在pH7.2下，使Jurkat细胞在37℃、5％CO₂下孵育60分钟。然后，用PBS洗涤细胞，并使用Alexa Fluor-647标记的驴抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)于PBS中再孵育1小时。洗涤细胞，并使用C6 Accuri流式细胞仪(Becton Dickinson)分析结合。可替代地，用饱和浓度10μg/ml的SIRP mAb于含有1mM EDTA(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))、1％FBS(Biowest)于PBS(康宁公司(Corning))中的结合缓冲液，将细胞在37℃下培养1小时。然后，洗涤细胞，并在相同条件下使用驴抗小鼠IgG异硫氰酸荧光素(FITC)-连接的二抗(JacksonImmunoResearch Laboratories)染色45分钟。然后，洗涤细胞并通过流式细胞术(Attune，生命科技公司(Life Technologies))进行分析。

如图4A所示，SIRP3结合表达SIRPγ的Jurkat细胞，而SIRP2或SIRP1未表现出结合。此外，如图4B所示，SIRP9以10μg/ml的浓度与Jurkat细胞结合，与先前示出的与SIRPγ结合的KWAR-23相当，而SIRP4未表现出与Jurkat细胞上的SIRPγ的结合。

实施例6

抗SIRP mAb阻断CD47/SIRPα结合

使用包被有组氨酸(HIS)标记的人SIRPα的ELISA板采用以下方法以体外评估本公开的抗SIRP抗体阻断CD47与SIRPα结合的能力。

HIS标记的人SIRPα(ACRO#SIG-H5225)以在4℃下在PBS中稀释过夜的1μg/ml的浓度吸附到高结合微量滴定板上。除去包被溶液，洗涤孔，然后用75％酪蛋白于含有0.5％Tween 20的PBS(PBST)中在室温下振荡阻断60分钟。去除阻断溶液，洗涤孔，并在室温下孵育60分钟，同时用PBST稀释的抗SIRP mAb以30μg/ml的起始浓度振荡并通过3倍连续稀释降低浓度。用PBST洗涤孔3次，并在室温下孵育60分钟，同时用PBST中浓度为250ng/ml的FC标记的人CD47(ACRO#CD7-H5256)振荡。用PBST洗涤孔3次，并在室温下培养60分钟，同时用PBST中1∶10,000稀释的HRP标记的驴抗小鼠或抗人二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories)进行振荡。洗涤孔，然后用过氧化物酶底物培养，并测量450nm处的吸光度。使用非线性拟合模型(GraphPad Prism)计算表观亲和力。

如表3所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP2、SIRP3、SIRP4和SIRP7阻断人SIRPα与人CD47的结合，其中IC₅₀值在纳摩尔范围内。此外，可溶性抗SIRP mAb SIRP1、SIRP5、SIRP6、SIRP8和SIRP10在mAb浓度最高达30μg/ml时无法阻断人SIRPα与人CD47的结合。图5A-图5G展示了源自本公开的抗体的代表性抑制曲线。

表3.抗SIRP抗体阻断CD47/SIRPα结合。

	SIRPα阻断(IC₅₀ nM)
		SIRP1	*NB
SIRP2	3
		SIRP3	2.7
SIRP4	0.71
		SIRP5	*NB
SIRP6	*NB
		SIRP7	1.1
SIRP8	*NB
		SIRP10	*NB

*NB-在最高达30μg/ml的mAb浓度下未检测到阻断

实施例7

抗SIRP单克隆抗体阻断CD47/SIRPγ结合

使用包被有HIS标记的人CD47的ELISA板采用以下方法以体外评估本公开的抗SIRP mAb对CD47与SIRPγ结合的作用。

HIS标记的人CD47(ACRO#CD7-H5227)以在4℃下在PBS中稀释过夜的2μg/ml的浓度吸附到高结合微量滴定板上。除去包被溶液，洗涤孔，然后用75％酪蛋白于含有0.5％Tween20的PBS(PBST)中在室温下振荡阻断60分钟。去除阻断溶液，洗涤孔，并在室温下孵育60分钟，同时用PBST稀释的抗SIRP mAb以30μg/ml的起始浓度，然后以3倍连续稀释降低浓度，以及0.5μg/ml的人SIRPγ(ACRO#SIG-H5253)振荡。用PBST洗涤孔3次，并在室温下培养60分钟，同时用PBST中浓度为250ng/ml的FC标记的人CD47(ACRO＃CD7-H5256)振荡。用PBST洗涤孔3次，并在室温下培养60分钟，同时用PBST中1∶10000稀释的HRP标记的驴抗小鼠或抗人二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories)进行振荡。洗涤孔，然后用过氧化物酶底物培养，并测量450nm处的吸光度。使用非线性拟合模型(GraphPad Prism)计算表观亲和力。

如表4所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP2、SIRP3、SIRP4、SIRP5、SIRP6和SIRP7阻断人SIRPγ与人CD47的结合，其中IC₅₀值在纳摩尔范围内。此外，可溶性抗SIRP mAb SIRP1、SIRP8、SIRP9和SIRP10在mAb浓度最高达30μg/ml时无法阻断人SIRPγ与人CD47的结合。图6A-图6H展示了源自本公开的抗体的代表性抑制曲线。

表4.抗SIRP抗体阻断CD47/SIRPγ结合。

	SIRPγ阻断(IC₅₀nM)
		SIRP1	*NB
SIRP2	3.5
		SIRP3	0.96
SIRP4	0.44
		SIRP5	0.163
SIRP6	0.86
		SIRP7	0.63
SIRP8	*NB
		SIRP9	*NB
SIRP10	*NB

*NB-在最高达30μg/ml的mAb浓度下未检测到阻断

实施例8

抗SIRP mAb诱导吞噬作用

使用流式细胞术采用以下方法以体外评估抗SIRP mAb对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术(leukapheresis)，并在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(LifeTechnologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中在补充有50ng/ml M-CSF的100μl AIM-V培养基中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板，并允许粘附24小时。在效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，靶标人类癌细胞(Jurkat)用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并以8x10⁴个细胞于100μl不含补充剂的AIM-V培养基中添加到巨噬细胞培养基中。在混合靶细胞和效应细胞之后，立即加入不同浓度的抗SIRP mAb，图7A，或10μg/ml抗体，图7B；并在37℃下培养3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后将细胞在细胞消化液(StemcellTechnologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中培养30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

如图7A和图7B所示，与鼠IgG1对照抗体(Biolegend)相比，可溶性抗SIRP mAbSIRP4、SIRP9、SIRP11、SIRP12、SIRP13、SIRP14、SIRP15、SIRP16、SIRP17、SIRP18、SIRP19、SIRP20、SIRP21、SIRP22和SIRP23诱导人巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。相比之下，可溶性抗SIRP mAb SIRP1、SIRP2、SIRP3、SIRP7、SIRP8和SIRP10不诱导人巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。

实施例9

当与抗CD47抗体联合时抗SIRP mAb诱导吞噬作用

使用流式细胞术采用以下方法以体外评估抗SIRP mAb和抗CD47 mAb联合对巨噬细胞的诱导吞噬肿瘤细胞的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术(leukapheresis)，并在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(LifeTechnologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中在补充有50ng/ml M-CSF的100μl AIM-V培养基中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板，并允许粘附24小时。在效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，靶标人类癌细胞(Jurkat)用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并以8x10⁴个细胞于100μl不含补充剂的AIM-V培养基中添加到巨噬细胞培养基中。在混合靶细胞和效应细胞之后，立即添加不同浓度的单独的抗SIRP mAb、单独的抗CD47mAb(已知会诱导吞噬作用)或抗SIRP mAb和抗CD47 mAb一起，并允许在37℃下培养3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后将细胞在细胞消化液(Stemcell Technologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中孵育30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

如图8A-图8J所示，与单独使用任一种药物相比，所有可溶性抗SIRP mAb SIRP1、SIRP2、SIRP3、SIRP4、SIRP5、SIRP7、SIRP12、SIRP20、SIRP21和SIRP22与抗CD47mAb联合使用时，更大程度地增加人巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用。

实施例10

抗SIRP mAb联合利妥昔单抗诱导吞噬作用

使用流式细胞术采用以下方法以体外评估抗SIRP mAb和抗CD20 mAb联合对巨噬细胞的诱导吞噬肿瘤细胞的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术(leukapheresis)，并在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(LifeTechnologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中在补充有50ng/ml M-CSF的100μl AIM-V培养基中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板，并允许粘附24小时。效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，靶标人类癌细胞(RAJI)用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并以8x10⁴个细胞于100μl不含补充剂的AIM-V培养基中添加到巨噬细胞培养基中。在混合靶细胞和效应细胞之后，立即添加不同浓度的单独的抗SIRP mAb、单独的抗CD20 mAb(利妥昔单抗，罗氏)或抗SIRP mAb和抗CD20mAb一起，并允许在37℃下孵育3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后将细胞在细胞消化液(Stemcell Technologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中培养30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，LifeTechnologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

如图9A-图9D所示，与单独使用任一种药物相比，所有可溶性抗SIRP mAb SIRP1、SIRP2、SIRP3和SIRP7与抗CD20 mAb联合使用时，更大程度地增加人巨噬细胞对RAJI细胞的吞噬作用。

实施例11

抗SIRP mAb与Erbitux和阿维单抗联合诱导吞噬作用

使用流式细胞术采用以下方法以体外评估抗SIRP mAb和抗EGFR mAb或抗PD-L1mAb组合对巨噬细胞的诱导吞噬肿瘤细胞的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术(leukapheresis)，并在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(LifeTechnologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中在补充有50ng/ml M-CSF的100μl AIM-V培养基中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板，并允许粘附24小时。效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，靶标人类癌细胞(FaDu或ES-2)用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并以8x10⁴个细胞于100μl不含补充剂的AIM-V培养基中添加到巨噬细胞培养基中。在混合靶细胞和效应细胞之后，立即添加不同浓度的单独的抗SIRP mAb、单独的抗EGFR mAb(Erbitux，百时美施贵宝)、抗PD-L1 mAb(阿维单抗，辉瑞(Pfizer))、或抗SIRP mAb和抗EGFR mAb一起，并允许在37℃下孵育3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后将细胞在细胞消化液(Stemcell Technologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中培养30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

如图10A所示，与单独使用任一种药物相比，可溶性抗SIRP mAb SIRP4与抗EGFRmAb联合使用时，更大程度地增加人巨噬细胞对FaDu细胞的吞噬作用。如图10B所示，与单独使用任一种药物相比，可溶性抗SIRP mAb SIRP4与抗PD-L1 mAb联合使用时，更大程度地增加人巨噬细胞对ES-2细胞的吞噬作用。

实施例12

抗SIRP mAb与人巨噬细胞和树突细胞结合

使用流式细胞术采用以下方法以评估抗SIRP mAb与表达SIRPα的细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)的结合。

从外周血单核细胞(Astarte Biologics)分离的人CD14⁺单核细胞体外分化7天，分化为巨噬细胞或树突细胞。对于巨噬细胞分化，将单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中培养7天。对于树突细胞分化，将单核细胞在存在10％人AB血清(Valley Biomedical)、200ng/ml GM-CSF(Biolegend)和50ng/mlIL-4(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中培养。在37℃、5％CO₂下使用含有1mM EDTA(Sigma Aldrich)和1％FBS(Biowest)于PBS(Corning)中的结合缓冲液中的SIRPmAb连续稀释液孵育细胞1小时。然后，洗涤细胞，并在相同条件下使用驴抗小鼠IgG异硫氰酸荧光素(FITC)-连接的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories)染色45分钟。随后将细胞用与Alexa Fluor 647荧光团结合的抗CD14或抗CD11c(分别来自LifeTechnologies和Biolegend)在冰上染色30分钟，洗涤，并通过流式细胞术(Attune，LifeTechnologies)进行分析。结合评估为从仅用二抗染色的细胞中减除的CD14⁺或CD11c⁺细胞的中值FITC荧光强度。

如表5所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP3、SIRP4、SIRP5和SIRP9以及OSE-18D5和KWAR-23与树突细胞和/或巨噬细胞上细胞表达的SIRPα以皮摩尔范围的表观亲和力结合。图11展示了源自本公开的抗体的代表性结合曲线。

表5.抗SIRP mAb与表达SIRPα的人细胞的结合。

	人巨噬细胞结合K_d(pM)	人树突细胞结合K_d(pM)
			SIRP3	ND*	3.47
SIRP4	20.7	50
			SIRP5	ND*	770
SIRP9	93.7	ND*
			18D5	37.3	41.2
KWAR-23	ND*	23.4

*未测定(Not determined)

实施例13

抗SIRP mAb显示出与人CD3⁺T细胞的可变结合

使用流式细胞术采用以下方法以评估抗SIRP mAb与人CD3 T细胞的结合。

在37℃、5％CO₂下使用含有1mM EDTA(Sigma Aldrich)、1％FBS(Biowest)于PBS(Corning)中的结合缓冲液中的SIRP mAb连续稀释液，在96孔V形底板中以2.5×10⁵个细胞/孔，孵育从外周血单核细胞(Astarte Biologics)分离的人CD3 T细胞1小时。然后，洗涤细胞，并在相同条件下使用驴抗小鼠IgG异硫氰酸荧光素(FITC)-连接的二抗(JacksonImmunoResearch Laboratories)染色45分钟。随后将细胞用与3-羧基-6,8-二氟-7-羟基香豆素(太平洋蓝(Pacific Blue))荧光团(BioLegend)结合的抗CD3在冰上染色30分钟，洗涤，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)进行分析。结合评估为从仅用二抗染色的CD3⁺细胞中减除的CD3⁺细胞的中值FITC荧光强度。除LSB2.20(BioLegend)外，所有SIRP抗体均在内部产生。对于活化的T细胞，在结合测定之前，在涂有10μg/ml抗CD3(克隆UCHT1；BioLegend)的96孔平底板中，在0.5μg/ml抗CD28(克隆CD28.2；BioLegend)的存在下，CD3T细胞以1×10⁵个细胞/孔活化72小时。

如表6所示，可溶性SIRP3、SIRP7、SIRP9、KWAR-23和SIRPγ特异性抗体LSB2.20以皮摩尔范围内的亲和力结合T细胞。抗SIRPmAb SIRP4、SIRP5和OSE-18D5的亲和力要低得多，并且在纳摩尔范围内。图12A、图12B和图12C展示了源自本公开的抗体的代表性结合曲线。

表6.抗SIRP抗体与表达SIRPγ的人T细胞的结合。

*NC未计算；平均荧光强度与mIgG1背景水平相当

**未测定。

实施例14

抗SIRP mAb不阻断可溶性CD47/细胞SIRPγ结合

使用可溶性人IgG1 Fc标记的人CD47采用以下方法以评估本公开的抗SIRP抗体对阻断可溶性CD47与表达SIRPγ的细胞结合的影响。

在37℃、5％CO₂下使用10μg/ml的含有1mM EDTA(Sigma Aldrich)、1％FBS(Biowest)于PBS(Corning)中的结合缓冲液中的抗SIRP mAb，以2.5×10⁵个细胞/孔，孵育人T-ALL细胞(Jurkat)1小时。之后，添加可溶性人IgG1 Fc标记的人CD47(ACRO#CD7-H5256)，终浓度为50μg/ml，细胞如前所述再培养1小时。然后，将细胞粗略地(extensively)洗涤，并在相同条件下使用与Alexa Fluor 647(Jackson ImmunoResearch)结合的驴抗人抗体染色45分钟。通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析样品。为了进行分析，在不存在可溶性Fc标记的CD47的情况下，从Alexa Fluor 647荧光强度中值中减去背景人IgG1 Fc染色。阻断评估为与鼠IgG1(Biolegend，MOPC-21)对照相比，在SIRP mAb的存在下，Alexa Fluor 647的背景校正的中值荧光强度的降低。

如表7所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP4、SIRP9和OSE18D5不阻断细胞表达的SIRPγ与可溶性人CD47的结合。KWAR-23确实阻断了Jurkat细胞表达的SIRPγ与可溶性人CD47的结合。

表7.通过抗SIRP抗体阻断CD47/SIRPγ结合。

	可溶性CD47与Jurkat上的SIRPγ结合的阻断
		SIRP4	非阻断
SIRP9	非阻断
		OSE 18D5	非阻断
KWAR-23	阻断

实施例15

抗SIRP mAb阻断可溶性CD47/细胞SIRPα结合

使用人巨噬细胞和可溶性人IgG1 Fc标记的人CD47采用以下方法，以评估本公开的抗SIRP抗体对可溶性CD47与表达SIRPα的细胞的结合的影响。

在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中，从外周血单核细胞(Astarte Biologics)分离的人CD14⁺单核细胞体外分化7天。然后在室温下用人Fc受体阻断溶液(Biolegend)阻断巨噬细胞Fc受体20分钟。然后，洗涤细胞，并在37℃、5％CO₂下使用10μg/ml的含有1mM EDTA(Sigma Aldrich)、1％FBS(Biowest)于PBS(Corning)中的结合缓冲液中的抗SIRP mAb孵育1h。之后，添加可溶性人IgG1 Fc标记的人CD47(ACRO#CD7-H5256)，终浓度为20μg/ml，细胞如前所述再培养1小时。然后，将细胞粗略地洗涤，并在相同条件下使用与Alexa Fluor 647(Jackson ImmunoResearch)结合的驴抗人抗体染色45分钟。通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析样品。为了进行分析，在不存在可溶性Fc标记的CD47的情况下，从Alexa Fluor 647荧光强度中值中减去背景人IgG1 Fc染色。阻断评估为与鼠IgG1(Biolegend，MOPC-21)对照相比，在SIRP mAb的存在下，Alexa Fluor 647的背景校正中值荧光强度的降低。在这些测定中使用四种不同的单核细胞供体，每个测试的抗体最少使用三种供体。

如图13所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP4和SIRP9阻断巨噬细胞上细胞表达的SIRPα与可溶性人CD47的结合。OSE 18D5 mAb不阻断细胞表达的SIRPα与可溶性人CD47的结合。

实施例16

抗SIRP mAb不抑制T细胞增殖

评估抗SIRPmAb对同种异体树突细胞诱导的T细胞增殖的影响体外使用流式细胞术采用以下方法。

人单核细胞来源的树突细胞是通过在补充有10％的人AB血清(ValleyBiomedical)、200ng/ml GM-CSF(Biolegend)和50ng/ml IL-4(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中孵育CD14⁺单核细胞(Astarte Biologics)六天产生的，其中在第2天添加新鲜的、充满细胞因子的培养基。对于同种异体树突细胞和T细胞共培养试验，未成熟的树突细胞以每孔1x10⁵个细胞的浓度重新接种到96孔板上。将来自四个不同供体的CellTrace^TM Violet(Life Technologies)荧光细胞增殖染料标记的同种异体健康供体衍生的CD3⁺T细胞(Astarte Biologics)以1∶5的DC∶T细胞比例添加到培养物中。立即以10μg/ml的饱和浓度立即添加抗SIRP mAb，并将细胞在37℃、5％CO₂下在200μl的总体积中孵育6-7天。然后，通过用移液管吸头刮擦孔来分离细胞，并在荧光活化的细胞分选缓冲液(1％FBS，Biowest，于PBS中)中洗涤。然后，将细胞使用PerCP-Cy5.5荧光染料标记的CD3抗体(Biolegend)在冰上培养30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，LifeTechnologies)进行分析。通过CD3⁺细胞群内的CellTrace^TM Violet染料的稀释来测量T细胞增殖。

如图14A和图14B所示，与对照抗体(Biolegend)相比，抗SIRP mAb SIRP3、SIRP4、SIRP5、SIRP9、SIRP11、SIRP12、SIRP13、SIRP14、SIRP15、SIRP17、SIRP18、SIRP20、SIRP21、SIRP23和OSE-18D5对T细胞增殖没有显著影响。相比之下，阻断SIRPα和SIRPγ与CD47结合的KWAR-23抑制T细胞增殖。

实施例17

抗SIRP mAb不抑制抗原特异性T细胞回忆反应

评估抗SIRP单克隆抗体对T细胞抗原回忆反应(recall response)的影响体外使用流式细胞术采用以下方法。

来自巨细胞病毒血清阳性供体(Astarte Biologics)的人外周血单核细胞用CellTrace^TM Violet(Life Technologies)荧光细胞增殖染料标记，并在96孔板中以200,000个细胞/孔接种。然后，将细胞使用不同浓度的巨细胞病毒抗原(Astarte Biologics)在补充有10％人AB血清(Valley Biomedical)的AIM-V培养基(Life Technologies)中孵育，诱导T细胞增殖的抗原依赖性刺激。立即以10μg/ml的饱和浓度立即添加抗SIRP mAb以及抗CD47 mAb、克隆B6H12(Biolegend)，并将细胞在37℃、5％CO₂下孵育五天。T细胞增殖通过稀释CD4⁺细胞群中的CellTrace^TM Violet染料来测量。

如图15所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP4、SIRP5和SIRP9不抑制T细胞引发CMV抗原回忆反应的能力。相比之下，与鼠IgG1对照抗体(Biolegend)相比，已知抑制T细胞反应的抗CD47抗体克隆B6H12减少了T细胞增殖。

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实施例19

抗SIRP单克隆抗体对

架构(Architecture)的影响/>

使用人巨噬细胞和以藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)标记的非竞争性SIRPα抗体采用流式细胞术(FCET)方法测定的以下荧光共振能量转移(FRET)，来评估本公开的抗SIRP抗体对SIRPα结构、SIRPα在二聚体、多聚体或簇中的组织的影响。

从外周血单核细胞(Astarte Biologics)中分离出的人CD14单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF(BioLegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中体外分化7天。对于FRET测定，根据先前描述的FCET方法使用PE和APC标记的针对SIRPα的抗体(Batard等人，2002)。抗体-PE偶联供体和抗体-APC偶联受体之间的FRET表明这两个分子非常接近。使用细胞消化液将人巨噬细胞从板上分离，洗涤，并在V形底96孔板中在AIM-V培养基中培养2小时。然后，将细胞用10μg/ml SIPR4、SIRP9或mIgG1对照在37℃、5％CO₂下孵育2小时。随后，洗涤细胞，将等摩尔浓度的SIRP抗体克隆SE5A5-PE和SE5A5-APC(均来自BioLegend)合并(终浓度为10μg/ml)，并添加到细胞悬浮液中。在等摩尔量的未标记SE5A5(BioLegend)的存在下，细胞还用SE5A5-PE或SE5A5-APC标记进行单荧光团染色。将细胞在冰上染色30分钟，洗涤，并在流式细胞仪(Attune，Life Technologies)上分析。使用三种波长校正方法(Batard等人，2002)计算FRET效率，假设SE5A5-APC和SE5A5-PE的蛋白质与染料的比例为1∶1(使用BioLegend提供的信息)。

如图16所示，抗SIRP mAb SIRP9降低SE5A5-PE供体和SE5A5-APC受体之间的FRET效率。抗SIRP mAb SIRP4不会降低SE5A5-PE供体和SE5A5-APC受体之间的FRET效率。

实施例20

通过巨噬细胞进行的抗SIRP单克隆抗体内化

使用人巨噬细胞和pHrodo绿标记的抗SIRP抗体采用以下方法评估本公开的抗SIRP抗体对SIRPα抗体复合物内化的影响。pHrodo绿染料(pHrodo green dye)仅在酸性内化隔室中发出一次荧光。

从外周血单核细胞(Astarte Biologics)中分离出的人CD14⁺单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF(BioLegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中体外分化7天。按照制造商的说明，使用pHrodo Green微型蛋白质标记试剂盒(Invitrogen)标记SIRP抗体。所有抗体之间的标记效率相当。将抗体稀释到巨噬细胞生长培养基中，并加热至37℃。在指定的时间，从巨噬细胞中去除培养基，并替换为含有10μg/ml标记抗体的培养基，并在37℃下继续孵育最多1小时。培养后，去除培养基，并使用细胞消化液(STEMCELL Technologies)将细胞从板上分离。细胞在400g下沉淀，用冰冷的PBS(Corning)洗涤，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)进行分析。内化被量化为pHrodo绿⁺活的单细胞的百分比。

如图17所示，可溶抗SIRP mAb SIRP4诱导SIRPα抗体复合物的内化。在较小程度上，可溶性抗SIRP9 mAb诱导SIRPα抗体复合物的内化。

实施例21

抗SIRP单克隆抗体降低细胞表面SIRPα水平

使用人巨噬细胞采用以下基于流式细胞术的方法，以评估本公开的抗SIRP抗体对细胞表面SIRPα表达水平的影响。

从外周血单核细胞(Astarte Biologics)中分离出的人CD14⁺单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中体外分化7天。使用细胞消化液(STEMCELL Technologies)将人巨噬细胞从板上分离，洗涤，并在V形底96孔板中在AIM-V培养基中孵育2小时。然后，将细胞用10μg/ml mIgG1对照、SIPR4、SIRP9、18D5或KWAR23在4℃下培养2小时，或在37℃、5％CO₂下孵育2小时、4小时、6小时或24小时。随后，在流式细胞术(FC)缓冲液(2％FBS于PBS中)中洗涤细胞，并使用非竞争性荧光标记的抗SIRPα抗体测量细胞表面SIRPα水平。对于SIRP4、18D5和KWAR23，使用Alexa Fluor 647标记的抗SIRP抗体SIRP9。SIRP9-AF647使用来自Life Technologies的分子探针的Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒生成。对于SIRP4，使用藻红蛋白标记的抗SIRP抗体SE5A5(BioLegend)。为了进行荧光抗体标记，将细胞在冰上染色30分钟，清洗，并在流式细胞仪(Attune，LifeTechnologies)上进行分析。荧光水平标准化为mIgG1对照处理的巨噬细胞的中值荧光强度，所述巨噬细胞在冰上用相应的荧光SIRP抗体染色。

如图18所示，抗SIRP mAb SIRP4显示出SIRPα表面水平降低。抗SIRP mAb SIRP9、18D5或KWAR23未显示出SIRPα表面水平降低。

实施例22

抗SIRP单克隆抗体抗体增加巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，与SIRP无关α等位变体

使用流式细胞术采用以下体外方法以评估抗SIRPα抗体通过携带不同SIRPα等位基因变体的巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的影响。

来自不同SIRPα等位基因组(V1/V1、V1/V2和V2/V2的人单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs/MQs))从CD14⁺单核细胞分化而来。CD14⁺单核细胞购自Astarte Biologics或使用泛单核细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从外周血单核细胞(PBMC，AllCells和Hemacare)中富集。将单核细胞以5×10⁴个细胞/孔接种到96孔平底板上，并在补充有10％FBS(Biowest)和50ng/ml M-CSF(BioLegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中体外分化7天以生成MDM。

体外吞噬作用测定设置之前，人MDM在不含补充剂的AIM-V培养基中培养2小时。人类癌细胞用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并在96孔板中，在不含补充剂的AIM-V培养基中以8x10⁴个细胞/孔的浓度添加到巨噬细胞培养物中。在混合靶细胞和效应细胞之后，立即添加不同浓度的抗SIRP或mIgG1对照抗体(图19A)或浓度为10μg/ml(图19B)，并允许在37℃下孵育4小时。4小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后，将细胞在细胞消化液(Innovative CellTechnologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到96孔V形底板中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中培养30分钟，洗涤一次，然后通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)进行分析。吞噬作用测定为CD14⁺细胞群内的CFSE⁺的百分比。

如图19A-19B所示，抗SIRP抗体SIRP4和SIRP9诱导肿瘤的吞噬作用，不依赖SIRPα等位基因变体。

实施例23

抗SIRP单克隆抗体抗体不会彼此竞争与SIRPα的结合

评估本公开的抗SIRP抗体之间在结合人SIRP方面的竞争α，以下ELISA方法使用His标记的人SIRPα蛋白质和生物素化SIRPα抗体。

根据制造商的说明，使用EZ-Link^TM Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(ThermoScientific)对抗SIRPα的抗体进行生物素化，并使用固相ELISA进行确认其与人SIRPα的结合。对于竞争性ELISA，平板吸附人SIRPα(组氨酸标记的，ACRObiosystems)在1.25μg/ml生物素化SIRP抗体的存在下以成对方式在室温下使用连续稀释的未生物素化SIRP抗体孵育1小时。对于检测，使用1∶5000HRP链霉抗生物素蛋白(BioLegend)和过氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetramentylbenzidine)(TMB，Thermo Scientific)，并通过加入1N H₂SO₄终止反应。使用Synergy H1酶标仪(BioTek)测定450nm处的吸光度。

如图20所示，抗SIRP mAb SIRP9不与SIRP4、OSE(18D5)和KWAR23竞争同SIRPα的结合。抗人SIRP mAb SIRP4与OSE(18D5)竞争同SIRPα的结合，但不与SIRP9或KWAR-23竞争同SIRPα的结合。

实施例24

抗SIRP单克隆抗体对人类癌细胞系表现出多种结合模式

使用流式细胞术采用以下方法，以评估抗SIRP mAb与吞噬作用测定中的人类癌细胞系的结合以及这些细胞系对SIRPα/β、SIRPγ和CD47的表达。

人类癌细胞系(Jurkat T-ALL、RAJI B细胞淋巴瘤、DLD-1结直肠腺癌、RL95-2子宫内膜癌和ES-2卵巢癌)购自美国模式培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，并按照供应商的建议进行培养。为了评估这些细胞系上SIRPα、SIRPγ和CD47的水平，将非粘附细胞系收集在它们的生长培养基中，并使用细胞消化液(StemcellTechnologies)将粘附细胞系从它们的培养板上分离。然后，将细胞用PBS洗涤，以1×10⁵个细胞/孔置于96孔V型底板中，并用识别人SIRPα/β(克隆SE5A5)、SIRPγ(克隆LSB2.20)或CD47(克隆B6H12)的商业藻红蛋白(PE)标记的抗体孵育，这些抗体均购自BioLegend，在流式细胞术缓冲液(1％FBS于PBS中)中在冰上孵育30分钟。然后，洗涤细胞，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)进行分析。为了测量SIRP4和SIRP9 mAb与癌细胞系的结合，在37℃、5％CO₂下，将细胞置于含有10μg/ml SIRP mAb或鼠IgG1对照(BioLegend)的上述96孔V形底板中1小时，在含有1mM EDTA(Sigma Aldrich)、1％FBS(Biowest)于PBS(Corning)中的结合缓冲液中。然后，洗涤细胞，并在相同条件下用驴抗小鼠IgG异硫氰酸荧光素(FITC)-连接的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories)染色45分钟，然后洗涤，并通过流式细胞仪(Attune，Life Technologies)进行分析。

如图21A所示，使用具有已知特异性的SIRP mAb，Jurkat细胞表达SIRPγ，ES-2细胞表达SIRPα/β，而其余细胞系不表达SIRPα/β或SIRPγ。所有测试的细胞系均表达CD47。如图21B所示，SIRP9结合Jurkat(SIRPγ)和ES-2(SIRPα/β)细胞系，SIRP4仅结合ES-2(SIRPα/β)细胞系，但不结合Jurkat(SIRPγ)。

实施例25

抗SIRP mAb诱导的吞噬作用取决于FcγR的参与

使用流式细胞术采用以下方法，来体外评估通过巨噬细胞阻断人Fc受体对抗SIRPmAb诱导的肿瘤细胞吞噬作用的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术，并在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(Life Technologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板在100μl的补充有50ng/ml M-CSF的AIM-V培养基中，并允许粘附24小时。在效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，添加由针对人CD16(克隆3G8，英杰(Invitrogen))、CD32(克隆AT10，Invitrogen)和CD64(克隆10.1，Invitrogen)的功能阻断抗体组成的人Fc抗体混合物，各自终浓度为10μg/ml(+Fc阻断)。30μg/ml mIgG1(Biolegend)用作同种型对照(-Fc阻断)。紧接着，靶标人类癌细胞Jurkat(图22A和图22B)或DLD-1(图22C和图22D)使用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；Sigma Aldrich)标记，并在不含补充剂的100μl的AIM-V培养基中以8x10⁴个细胞的浓度添加到巨噬细胞培养物中。在靶细胞和效应细胞混合后，立即添加各种浓度的抗SIRP mAb SIRP4(图22A和图22C)或SIRP9(图22B和图22D)，并允许在37℃下孵育3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后，将细胞在细胞消化液(Stemcell Technologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中孵育30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

为了剖析单个Fc受体的作用，如上所述进行吞噬作用，但是Fc阻断抗体以10μg/ml单独添加，并与10μg/ml的对照mIgG1进行比较。

如图22A和图22B所示，可溶性抗SIRP mAb SIRP4和SIRP9诱导人巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬作用，但吞噬活性通过添加Fc阻断抗体混合物而消除。当DLD-1细胞用作靶细胞时，用SIRP4(图22C)和SIRP9(图22D)观察到相同的效果。如图23所示，CD32(FcγRII)而非CD16或CD64的功能性阻断抑制SIRP4(图23A)和SIRP9(图23B)诱导的Jurkat T-ALL细胞的吞噬作用。这与已知的与Fc受体的同种型相互作用一致。

实施例26

抗SIRP抗体不诱导正常自体人外周血单核细胞的吞噬作用

使用流式细胞术采用以下方法，以体外评估本公开的抗SIRP抗体对正常非癌细胞的吞噬作用的影响。

人单核细胞来源的巨噬细胞来源于健康人外周血的白细胞分离术。为了产生巨噬细胞，CD14⁺单核细胞在补充有50ng/ml M-CSF(Biolegend)的AIM-V培养基(LifeTechnologies)中培养7天。为了体外吞噬作用测定，在96孔板中，将巨噬细胞以每孔3x10⁴个细胞的浓度重新铺板在100μl的补充有50ng/ml M-CSF的AIM-V培养基中，并允许粘附24小时。在效应巨噬细胞粘附在培养皿上之后，正常的自体人外周血单核细胞(图24A)或Jurkat T-ALL细胞(图24B)用1μM 5(6)-羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚酯(CFSE；SigmaAldrich)标记，并在不含补充剂的100μl的AIM-V培养基中以8x10⁴个细胞的浓度添加到巨噬细胞培养物中。在靶细胞和效应细胞混合后，立即添加不同浓度的抗SIRP抗体SIRP4或SIRP9，并允许在37℃下孵育3小时。3小时后，去除所有未被吞噬的细胞，剩余细胞用PBS洗涤3次。然后，将细胞在细胞消化液(Stemcell Technologies)中培养以分离巨噬细胞，收集到微量离心管中，并在100ng别藻蓝蛋白(APC)标记的CD14抗体(BD biosciences)中培养30分钟，洗涤一次，并通过流式细胞术(Attune，Life Technologies)分析CD14⁺细胞(也是CFSE⁺)的百分比，表明完全的吞噬作用。

如图24A所示，可溶性抗SIRP抗体SIRP4和SIRP9不诱导人巨噬细胞对PBMC的吞噬作用。相比之下，如图24B所示，SIRP4和SIRP9以剂量依赖的方式诱导巨噬细胞对Jurkat T-ALL细胞的吞噬作用。

Claims

1.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用特异性结合人SIRPα的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段诱导癌细胞的吞噬作用而不诱导正常外周血单核细胞(PBMC)的吞噬作用，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段包含治疗癌症的有效量的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2、LCDR3)和三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，

其中所述三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2、LCDR3)选自：

i.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；

ii.SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；

iii.SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9；

iv.SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12；

v.SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15；

vi.SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18；

vii.SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21；

viii.SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24；

ix.SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27；

x.SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30；

xi.SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：12；

xii.SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32；

xiii.SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27；

并且所述三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2、HCDR3)选自：

xiv.SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；

xv.SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38；

xvi.SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；

xvii.SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44；

xviii.SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47；

xix.SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50；

xx.SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53；

xxi.SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56；

xxii.SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59；

xxiii.SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62；和

xxiv.SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63。

2.根据权利要求18所述的方法，其中特异性结合人SIRPα的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)选自：

i.包含氨基酸序列SEQ ID NO：81的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：64的轻链可变结构域；

ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：82的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：65的轻链可变结构域；

iii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：83的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：66的轻链可变结构域；

iv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：84的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：67的轻链可变结构域；

v.包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：68的轻链可变结构域；

vi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：69的轻链可变结构域；

vii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：87的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：70的轻链可变结构域；

viii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：88的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：71的轻链可变结构域；

ix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：72的轻链可变结构域；

x.包含氨基酸序列SEQ ID NO：90的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：73的轻链可变结构域；

xi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：74的轻链可变结构域；

xii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：75的轻链可变结构域；

xiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：76的轻链可变结构域；

xiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：74的轻链可变结构域；

xv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：75的轻链可变结构域；

xvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：76的轻链可变结构域；

xvii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：74的轻链可变结构域；

xviii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：75的轻链可变结构域；

xix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：76的轻链可变结构域；

xx.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：74的轻链可变结构域；

xxi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：75的轻链可变结构域；

xxii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：76的轻链可变结构域；

xxiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：84的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：77的轻链可变结构域；

xxiv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：78的轻链可变结构域；

xxv.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：79的轻链可变结构域；

xxvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的轻链可变结构域；

xxvii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：78的轻链可变结构域；

xxviii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：79的轻链可变结构域；

xxix.包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的轻链可变结构域；

xxx.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：78的轻链可变结构域；

xxxi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：79的轻链可变结构域；

xxxii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：97的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：80的轻链可变结构域；和

xxxiii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ IDNO：72的轻链可变结构域。

3.根据权利要求18所述的方法，其中特异性结合人SIRPα的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自以下的一条重链和一条轻链：

iii.包含氨基酸序列SEQ ID NO：111的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：100的轻链；

xxvi.包含氨基酸序列SEQ ID NO：120的重链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：108的轻链。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含IgG同种型，所述IgG同种型选自IgG1、IgG1-N297Q、IgG2、IgG4、IgG4 S228P、IgG4 PE及它们的变体。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合人SIRPα和人SIRPγ。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中吞噬作用的所述诱导是Fc依赖性的。

7.根据权利要求6所述的方法，其中吞噬作用的所述诱导依赖于FcγR。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述FcγR选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与化疗剂或治疗性抗体联合施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述治疗性抗体针对选自以下的细胞靶标：CD47(分化簇47)、CD70(分化簇70)、CD200(OX-2膜糖蛋白，分化簇200)、CD154(分化簇154，CD40L，CD40配体，分化簇40配体)、CD223(淋巴细胞激活基因3，LAG3，分化簇223)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、GITR(TNFRSF18，糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，激活诱导的TNFR家族受体，AITR，肿瘤坏死因子受体超家族成员18)、CD20(分化簇20)、CD28(分化簇28)、CD40(分化簇40，Bp50，CDW40，TNFRSF5，肿瘤坏死因子受体超家族成员5，p50)、CD86(B7-2，分化簇86)、CD160(分化簇160，BY55，NK1，NK28)、CD258(LIGHT，分化簇258，肿瘤坏死因子配体超家族成员14，TNFSF14，疱疹病毒进入调控因子配体(HVEM-L)、CD270(HVEM，肿瘤坏死因子受体超家族成员14，疱疹病毒进入调控因子，分化簇270，LIGHTR，HVEA)、CD275(ICOSL，ICOS配体，诱导型T细胞共刺激物配体，分化簇275)、CD276(B7-H3，B7同系物3，分化簇276)、OX40L(OX40配体)、B7-H4(B7同系物4，VTCN1，含有V-set结构域的T-细胞激活抑制剂1)、GITRL(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体-配体，糖皮质激素诱导的TNFR-配体)、4-1BBL(4-1BB配体)、CD3(分化簇3，T3D)、CD25(IL2Rα，分化簇25，白介素-2受体α链，IL-2受体α链)、CD48(分化簇48，B-淋巴细胞激活标记，BLAST-1，信号传导淋巴细胞激活分子2，SLAMF2)、CD66a(癌胚抗原细胞粘附分子-1，癌胚抗原相关细胞粘附分子1，胆汁糖蛋白，BGP，BGP1，BGPI，分化簇66a)、CD80(B7-1，分化簇80)、CD94(分化簇94)、NKG2A(自然杀伤组2A，杀伤细胞凝集素样受体亚家族D成员1，KLRD1)、CD96(分化簇96，TActILE，T细胞激活增加的晚期表达)、CD112(PVRL2，粘连蛋白，脊髓灰质炎病毒受体相关2，疱疹病毒进入调控因子B，HVEB，粘连蛋白-2，分化簇112)、CD115(CSF1R，集落刺激因子1受体，巨噬细胞集落刺激因子受体，M-CSFR，分化簇115)、CD205(DEC-205，LY75，淋巴细胞抗原75，分化簇205)、CD226(DNAM1，分化簇226，DNAX辅助分子-1，PTA1，血小板和T细胞激活抗原1)、CD244(分化簇244，自然杀伤细胞受体2B4)、CD262(DR5，TrailR2，TRAIL-R2，肿瘤坏死因子受体超家族成员10b，TNFRSF10B，分化簇262，KILLER，TRICK2，TRICKB，ZTNFR9，TRICK2A，TRICK2B)、CD284(Toll样受体-4，TLR4，分化簇284)、CD288(Toll样受体-8，TLR8，分化簇288)、白血病抑制因子(LIF)、TNFSF15(肿瘤坏死因子超家族成员15，血管内皮细胞生长抑制因子，VEGI，TL1A)、TDO2(色氨酸2，3-加双氧酶，TPH2，TRPO)、IGF-1R(I型胰岛素样生长因子)、GD2(双唾液酸神经节苷脂2)、TMIGD2(跨膜和含有免疫球蛋白结构域蛋白质2)、RGMB(RGM结构域家族，成员B)、VISTA(T细胞激活的含有V-结构域免疫球蛋白抑制因子，B7-H5，B7同系物5)、BTNL2(嗜乳脂蛋白样蛋白2)、Btn(嗜乳脂蛋白家族)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，Vstm3，WUCAM)、Siglecs(唾液酸结合Ig样凝集素)，即SIGLEC-15、神经营养蛋白，VEGFR(血管内皮生长因子受体)、ILT家族(LIR，免疫球蛋白样转录家族，白细胞免疫球蛋白样受体)、NKG家族(自然杀伤组家族，C型凝集素跨膜受体)、MICA(MHCI类多肽相关序列A)、TGFβ(转化生长因子β)、STING途径(干扰素基因途径的刺激因子)、精氨酸酶(精氨酸脒基酶，刀豆氨酸酶，L-精氨酸酶，精氨酸转脒酶)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、以及HHLA2(B7-H7，B7y，HERV-H LTR-相关蛋白2，B7同系物7)、PD-1的抑制剂(程序性细胞死亡蛋白1，PD-1，CD279，分化簇279)、PD-L1(B7-H1，B7同系物1，程序性死亡-配体1，CD274，分化簇274)、PD-L2(B7-DC，程序性细胞死亡1配体2，PDCD1LG2，CD273，分化簇273)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，CD152，分化簇152)、BTLA(B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子，CD272，分化簇272)、吲哚胺2，3-加双氧酶(IDO，IDO1)、TIM3(HAVCR2，甲型肝炎病毒细胞受体2，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，KIM-3，肾损伤分子3，TIMD-3，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-结构域3)、A2A腺苷受体(ADO受体)、CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1，分化簇39，ENTPD1)、以及CD73(外-5′-核苷酸酶，5’-核苷酸酶，5’-NT，分化簇73)、CD27(分化簇27)、ICOS(CD278，分化簇278，诱导性T-细胞共刺激因子)、CD137(4-1BB，分化簇137，肿瘤坏死因子受体超家族成员9，TNFRSF9)、OX40(CD134，分化簇134)、TNFSF25(肿瘤坏死因子受体超家族成员25)、IL-10(白介素-10，人细胞因子合成抑制因子，CSIF)、PVRIG(含脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白)和半乳凝素。

11.根据权利要求1-3、7、8和10中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与靶向肿瘤细胞上的抗原的调理抗体联合施用。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述调理抗体选自抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗RANKL、抗SLAMF7、抗PD-L1、抗CD38、抗CD19/CD3和抗GD2抗体中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述调理抗体选自利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、地诺单抗、帕妥珠单抗、帕尼单抗、埃罗妥珠单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、耐昔妥珠单抗、达雷木单抗、阿托珠单抗、博纳吐单抗和地努妥昔单抗中的一种或多种。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述调理抗体选自抗CD20、抗EGFR、抗PD-1和抗PD-L1抗体中的一种或多种。

15.根据权利要求1-3、7、8、10和12-14中任一项所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌(结肠直肠癌)、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌(非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌(头颈癌)、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、以及子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述白血病选自全身性肥大细胞增多症、急性淋巴细胞(成淋巴细胞)白血病(ALL)、T细胞-ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生障碍/赘生物、骨髓增生异常综合征、单核细胞白血病、以及浆细胞白血病。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述淋巴瘤选自：组织细胞性淋巴瘤和T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，如低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级别/滤泡性NHL、中等级别的弥漫性NHL、高级别成免疫细胞NHL、高级别成淋巴细胞NHL、高级别小非裂细胞NHL、巨大肿块NHL、以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、肺泡软部肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和软骨肉瘤。

19.根据权利要求1-3、7、8、10、12-14和16-18中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是泛等位基因的。

20.根据权利要求1-3、7、8、10、12-14和16-18中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段影响SIRPα二聚化、聚簇和架构中的一种或多种。

21.根据权利要求1-3、7、8、10、12-14和16-18中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段引起细胞表面SIRPα的减少。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞表面SIRPα被内化。