JP7170331B2 - 固形及び血液癌の治療のための併用療法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，０３２号明細書、及び２０１７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，０３６号明細書、並びに２０１８年１月１５日に出願された米国特許出願第１５／８７１，８０２号明細書に対する優先権を主張し、これらは全て、あたかも本明細書に記載されているかのようにその全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
本開示は、概して、本明細書に記載するような異なる機能性プロフィールを有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体（抗ＣＤ４７ｍＡｂ）、抗ＣＤ４７ｍＡｂを作製する方法、並びに固形癌及び血液癌の予防及び治療のための治療薬としてこれらの抗ＣＤ４７ｍＡｂを抗癌剤と組み合わせて使用する方法に関する。
ＣＤ４７は、細胞外ＩｇＶ群ドメイン、５貫膜ドメイン、及び代替的にスプライシングされる細胞質テールから構成される細胞表面受容体である。２つのリガンドは、ＣＤ４７：シグナル阻害受容体タンパク質α（ＳＩＲＰα）及びトロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）に結合する。ＣＤ４７発現及び／又は活性は、いくつかの疾患及び障害に関連している。従って、固形癌及び血液癌の予防及び治療をはじめとする、抗癌剤と組み合わせて使用する、ヒトにおけるＣＤ４７と関連する疾患及び病状を治療するための治療用組成物及び方法が求められている。
抗癌剤と組み合わせた、固形及び血液癌の予防及び治療のための組成物及び方法が提供される。
本開示は、異なる機能プロフィールを有する抗ＣＤ４７ｍＡｂを記載する。これらの抗体は、以下から選択される特性の異なる組合せを有する：１）ＣＤ４７の１種若しくは複数種のホモログと交差反応性を示す；２）ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰα同士の相互作用を阻止する；３）ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する；４）感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する；５）ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導しない；６）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して低い結合、若しくは最小結合を有さない；７）ｈＲＢＣに対して低い結合を有する；８）ｈＲＢＣに対して最小結合を有する；９）ｈＲＢＣの低い凝集を引き起こす；１０）ｈＲＢＣの検出可能な凝集を引き起こさない；１１）一酸化窒素（ＮＯ）経路のＴＳＰ１阻害を逆転させる；１２）ＮＯ経路のＴＳＰ１阻害を逆転させない；１３）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす；１４）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こさない；１５）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす；１６）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こさない；１７）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こす；１８）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こさない；１９）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こす；２０）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こさない；２１）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こす；２２）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こさない；２３）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こす；２４）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こさない；２５）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす；２６）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こさない；２７）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こす；２８）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こさない；２９）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こす；３０）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こさない；３１）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有する；３２）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有さない；３３）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有する；３４）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有さない；並びに３５）ヒト腫瘍細胞によるアネキシンＡ１放出の増大を引き起こす。本開示の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、固形及び血液癌の予防及び治療をはじめとする、ヒト及び動物においてＣＤ４７と関連する疾患及び病状を治療するための様々な治療方法に有用である。本開示の抗体はまた、組織サンプル中のＣＤ４７発現のレベルを決定するための診断薬としても有用である。本開示の実施形態は、単離された抗体及びその免疫学的に活性な結合断片；１つ又は複数の抗ＣＤ４７ｍＡｂ、好ましくは、前記抗ＣＤ４７ｍＡｂのキメラ若しくはヒト化形態を含む医薬組成物；そうした抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の治療での使用方法；並びにこれらの抗ＣＤ４７ｍＡｂを産生する細胞株を含む。本開示の実施形態は、固形及び血液癌の予防及び治療に関連する疾患及び病状を治療するための抗癌剤と組み合わせた様々な治療方法に有用である。
本発明の実施形態は、抗ＣＤ４７ｍＡｂ及びその免疫活性結合断片；１つ又は複数の抗ＣＤ４７ｍＡｂ、好ましくは、前記抗ＣＤ４７ｍＡｂのキメラ若しくはヒト化形態を含む医薬組成物；抗癌剤と組み合わせた、このような抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の治療での使用方法を含む。
本開示の実施形態は、抗ＣＤ４７抗体、又はその抗原結合断片と、第２の抗癌剤との組合せを対象に投与することにより、対象の癌を予防又は治療する方法を含む。
本開示の実施形態は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片と、第２の抗癌剤との組合せを投与するステップを含み、この組合せは、抗ＣＤ４７抗体又は第２の抗癌剤の単剤療法投与と比較して、腫瘍細胞の細胞死を増大する。
本開示の実施形態は、本明細書に記載する抗ＣＤ４７抗体、又はその抗原結合断片と、第２の抗癌剤との組合せを投与するステップを含み、この組合せは、抗ＣＤ４７抗体又は第２の抗癌剤の単剤療法投与と比較して、免疫原性細胞死特性の発現を増大する。
本開示の実施形態は、本明細書に記載する抗ＣＤ４７抗体と、第２の抗癌剤との組合せを投与するステップを含み、この組合せは、抗ＣＤ４７抗体又は第２の抗癌剤の単剤療法投与と比較して、ヒト腫瘍細胞による細胞表面カルレティキュリン発現を増大する。
本開示の実施形態は、本明細書に記載する抗ＣＤ４７抗体と、第２の抗癌剤との組合せを投与するステップを含み、この組合せは、抗ＣＤ４７抗体又は第２の抗癌剤の単剤療法投与と比較して、ヒト腫瘍細胞によるＡＴＰの放出を増大する。
本開示の実施形態は、化学療法薬である第２の抗癌剤を含む。
本開示の実施形態は、化学療法薬を含み、これは、限定されないが、アントラサイクリン、白金、タキソール、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、及びアルキル化剤からなる化学療法薬クラスから選択される。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスのアントラサイクリンを含み、これは、限定されないが、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、及びイダルビシンからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、抗ＣＤ４７抗体と、ドキソルビシンである第２の抗癌剤を含む。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスの白金を含み、これは、限定されないが、オキサリプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチンからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスのタキソールを含み、これは、限定されないが、パクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスのトポイソメラーゼ阻害剤を含み、これは、限定されないが、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、及びミトキサントロンからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスの代謝拮抗剤を含み、代謝拮抗剤は、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、及びペルメトレキセドから選択される。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスの有糸分裂阻害剤を含み、有糸分裂阻害剤は、ビノレルビン、ビンブラスチン、及びビンクリスチンである。
本開示の実施形態は、化学療法薬クラスのアルキル化剤を含み、アルキル化剤は、テムゾロミドからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、抗癌剤を含み、抗癌剤は、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブである。
本開示の実施形態は、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、又はその抗原結合断片を含み、これらは、特定の構造的特徴、即ち、ＣＤＲ又は全重鎖若しくは軽鎖可変ドメインの何れかの指定されたアミノ酸配列を参照にして、本明細書に定義される。本開示の抗体は全て、ＣＤ４７に結合する。
モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、本明細書に記載するように、少なくとも１つ、通常３つのＣＤＲ配列を、通常、ヒト可変領域又は単離されたＣＤＲペプチド由来のフレームワーク配列と組み合わせて含んでもよい。１部の実施形態では、抗体は、可変領域フレームワーク（限定はしないが、マウス又はヒト可変領域フレームワークであってもよい）に位置する本明細書に記載の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１つの軽鎖と、可変領域フレームワーク（限定はしないが、ヒト又はマウス可変領域フレームワークであってもよい）に位置する本明細書に記載の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１つの重鎖とを含む。
本開示のいくつかの実施形態は、可変重鎖ＣＤＲ１、可変重鎖ＣＤＲ２、及び可変重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含む、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、又はその抗原結合断片であり、ここで、前記可変重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記可変重鎖ＣＤＲ２は、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記可変重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、可変重鎖ＣＤＲ２配列（ＨＣＤＲ２）の何れか１つ及び可変重鎖ＣＤＲ３配列（ＨＣＤＲ３）の何れか１つと組み合わせて、列記される可変重鎖ＣＤＲ１配列（ＨＣＤＲ１）の何れか１つを含んでもよい。しかし、単一共通ＶＨドメインに由来する、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の特定の実施形態が特に好ましく、その例は本明細書に記載する。
抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをさらに含み得、これは、ＶＨドメインと対合して、抗原結合ドメインを形成する。好ましい軽鎖可変ドメインは、可変軽鎖ＣＤＲ１、可変軽鎖ＣＤＲ２、及び可変軽鎖ＣＤＲ３を含むものであり、ここで、前記可変軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記可変軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み：前記可変軽鎖ＣＤＲ３は、任意選択で、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
軽鎖可変ドメインは、可変軽鎖ＣＤＲ２配列（ＬＣＤＲ２）の何れか１つ及び可変軽鎖ＣＤＲ３配列（ＬＣＤＲ３）の何れか１つと組み合わせて、列記される可変軽鎖ＣＤＲ１配列（ＬＣＤＲ１）の何れか１つを含んでもよい。しかし、単一共通ＶＬドメインに由来する、ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の特定の実施形態が特に好ましく、その例は本明細書に記載する。
ＶＬドメインと対合したＶＨドメインを含む何れか所与のＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、６つのＣＤＲ：可変重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、可変重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、可変重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）の組合せを含むであろう。上に挙げたＣＤＲ配列群から選択される６つのＣＤＲのあらゆる組合せが可能であり、本開示の範囲に含まれるが、６つのＣＤＲの特定の組合せが挙げられる。
６つのＣＤＲの好ましい組合せとしては、限定されないが、以下：
（ｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１、配列番号４を含むＨＣＤＲ２、配列番号７を含むＨＣＤＲ３、配列番号１１を含むＬＣＤＲ１、配列番号１５を含むＬＣＤＲ２、配列番号１８を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１、配列番号４を含むＨＣＤＲ２、配列番号８を含むＨＣＤＲ３、配列番号１１を含むＬＣＤＲ１、配列番号１５を含むＬＣＤＲ２、配列番号１８を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１、配列番号５を含むＨＣＤＲ２、配列番号９を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６を含むＬＣＤＲ２、配列番号１９を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号２を含むＨＣＤＲ１、配列番号５を含むＨＣＤＲ２、配列番号９を含むＨＣＤＲ３、配列番号１３を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６を含むＬＣＤＲ２、配列番号１９を含むＬＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号３を含むＨＣＤＲ１、配列番号６を含むＨＣＤＲ２、配列番号１０を含むＨＣＤＲ３、配列番号１４を含むＬＣＤＲ１、配列番号１７を含むＬＣＤＲ２、配列番号２０を含むＬＣＤＲ３；
からなる群から選択される可変重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、可変重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、可変重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、可変軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び可変軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）の組合せが挙げられる。
いくつかの抗ＣＤ４７ｍＡｂは、以下：配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０のアミノ酸配列、並びに列挙した配列の１つと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む、抗体又はその抗原結合断片を含む。これに代わり、又はこれに加えて、抗体又はその抗原結合断片をはじめとする好ましい抗ＣＤ４７ｍＡｂは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び配列番号５２のアミノ酸配列、並びに列挙した配列の１つと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでもよい。
上に挙げたＶＨ及びＶＬドメイン配列群から選択されるＶＨドメイン及びＶＬドメインの考えられる全ての対合は許容され、且つ本開示の範囲内であるが、ＶＨ及びＶＬドメインの特定の組合せが特に好ましい。従って、好ましい抗ＣＤ４７ｍＡｂ、又はその抗原結合断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の組合せを含むものであり、この組合せは、以下のものからなる群から選択される：
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４１を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４９を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５２を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５２を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５２を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５２を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｘ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４４を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４４を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５１を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５１を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５２を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５１を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４７を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４７を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４７を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｘ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４７を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４７を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｖｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４３を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４６を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５０を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｉｘ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｘ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｘｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号４８を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５１を含む軽鎖可変ドメイン；及び
（ｘｘｘｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、アミノ酸配列配列番号５１を含む軽鎖可変ドメイン。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変ドメインが、上の（ｉ）～（ｘｘｘｉｖ）に示される重鎖アミノ酸配列と、少なくとも８５％の配列同一性、又は少なくとも９０％の配列同一性、又は少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、並びに／又は軽鎖可変ドメインが、上の（ｉ）～（ｘｘｘｉｖ）に示される軽鎖アミノ酸配列と、少なくとも８５％の配列同一性、又は少なくとも９０％の配列同一性、又は少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの組合せを含んでもよい。（ｉ）～（ｘｘｘｉｖ）の特定のＶＨ及びＶＬ対合又は部分的組合せを、これらの基準配列に対して特定のパーセンテージの配列同一性を有するＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＤ４７抗体のために維持してもよい。
抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインが、基準配列に対する具体的な配列同一性パーセンテージによって定義される全ての実施形態について、ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、相違がフレームワーク領域内にのみ存在するように、基準配列内に存在するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を保持してもよい。
別の実施形態では、好ましいＣＤ４７抗体、又はその抗原結合断片は、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）の組合せを含むものであり、この組合せは、以下：
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６６を含む軽鎖；
（ｉｉ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖；
（ｉｉｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６９を含む軽鎖；
（ｉｖ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖；
（ｖ）配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖；
（ｖｉ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖；
（ｖｉｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖；
（ｖｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖；
（ｉｘ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖；
（ｘｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７２を含む軽鎖；
（ｘｉｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖；
（ｘｉｉｉ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖；
（ｘｉｖ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７０を含む軽鎖；
（ｘｖ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖；
（ｘｖｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖；
（ｘｖｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖；
（ｘｉｘ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖；
（ｘｘ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７４を含む軽鎖；
（ｘｘｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号３１を含む軽鎖；
（ｘｘｉｖ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｖ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖；
（ｘｘｖｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号６８を含む軽鎖；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号１００を含む軽鎖；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７５を含む軽鎖；
（ｘｘｉｘ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｘ）配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｘｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７１を含む軽鎖；
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖；
（ｘｘｘｉｖ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号７３を含む軽鎖
からなる群から選択され；
ここで、ＶＨアミノ酸配列は、それらと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であり、ＶＬアミノ酸配列は、それらと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体はまた、ヒトの治療に使用するために提案される、従来技術の抗ＣＤ４７抗体では呈示されない特性の組合せも特徴とする。従って、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないこと
を特徴とする。
本明細書に記載されるさらに別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の少ない凝集を引き起こすこと
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に特異的に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．低いｈＲＢＣ結合を有すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないと共に；
ｅ．ｈＲＢＣに対して最小結合を有する
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないと共に；
ｅ．低いｈＲＢＣ結合を有すること
を特徴とする。
本明細書に記載する抗ＣＤ４７抗体のさらに別の実施形態はまた、ヒト治療用途に提案されている従来技術の抗ＣＤ４７抗体により呈示されない特性の組合せも特徴とする。従って、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体は、以下に挙げる特徴のうち１つ又は複数をさらに特徴とする：
ａ．ヒト腫瘍細胞による細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす；
ｂ．ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こす；
ｃ．ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こす；
ｄ．ヒト腫瘍細胞によるアネキシンＡ１放出の増大を引き起こす；
ｅ．ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こす；
ｆ．ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こす；
ｇ．ヒト腫瘍細胞による細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす；
ｈ．ヒト腫瘍細胞による細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こす；並びに
ｉ．ヒト腫瘍細胞による細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こす。
本明細書に記載される別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、及びラットＣＤ４７に結合する。
本明細書に記載されるまた別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、非ヒト霊長類ＣＤ４７にも特異的に結合し、ここで、非ヒト霊長類は、限定されないが、カニクイザル、ミドリザル、アカゲザル及びリスザルを含み得る。
本明細書に記載されるまた別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、正常なヒト細胞に対して低い結合を有し、こうしたヒト細胞として、限定されないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）が挙げられる。
本明細書に記載されるまた別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、生理的ｐＨより酸性ｐＨが高いほど、ヒトＣＤ４７に対して高い親和性を有する。
一部の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、下記の特徴の１つ又は複数をさらに有し得る：１）ＣＤ４７の１種若しくは複数種のホモログと交差反応性を示す；２）ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰα同士の相互作用を阻止する；３）ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する；４）感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する；５）ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導しない；６）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して低い結合、若しくは最小結合を有さない；７）ｈＲＢＣに対して低い結合を有する；８）ｈＲＢＣに対して最小結合を有する；９）ｈＲＢＣの低い凝集を引き起こす；１０）ｈＲＢＣの検出可能な凝集を引き起こさない；１１）一酸化窒素（ＮＯ）経路のＴＳＰ１阻害を逆転させる；１２）ＮＯ経路のＴＳＰ１阻害を逆転させない；１３）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす；１４）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こさない；１５）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす；１６）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こさない；１７）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こす；１８）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こさない；１９）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こす；２０）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こさない；２１）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こす；２２）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こさない；２３）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こす；２４）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こさない；２５）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす；２６）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こさない；２７）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こす；２８）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こさない；２９）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こす；３０）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こさない；３１）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有する；３２）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有さない；３３）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有する；３４）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有さない；並びに３５）ヒト腫瘍細胞によるアネキシンＡ１放出の増大を引き起こす。
開示される抗ＣＤ４７ｍＡｂの様々な形態が本明細書で考慮される。例えば、抗ＣＤ４７ｍＡｂは、本明細書に開示されるように、ヒトフレームワークと、アイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、より具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の定常領域を有し、場合によっては、Ｆｃ受容体機能を改変する、若しくはＦａｂアーム交換を防止する様々な突然変異を有する完全長ヒト化抗体、又は抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）などであってよい。
一部の実施形態では、治療法は、ＣＤ４７に結合する薬剤と、抗癌剤である第２の薬剤との組合せを提供する。目的の特定の組合せは、本明細書に開示される通り、抗ＣＤ４７ｍＡｂと、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、及びイダルビシンとを含み、この組合せは、乳癌、卵巣癌、胃癌、及び肝細胞癌の治療に特に有用である。抗ＣＤ４７と白金、例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチンの組合せは、ＣＲＣ及びＮＳＣＬＣの治療に特に有用である。抗ＣＤ４７とタキソール、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルの組合せは、乳癌、ＮＳＣＬＣ、胃癌、及び前立腺癌の治療に特に有用である。抗ＣＤ４７とシクロホスファミドの組合せは、乳癌の治療に特に有用である。抗ＣＤ４７とトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、及びミトキサントロンの組合せは、ＣＲＣ、小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、及びＮＳＣＬＣの治療に特に有用である。抗ＣＤ４７とアルキル化剤、例えば、テモゾロミドの組合せは、ＧＢＭ、黒色腫、及び多発性骨髄腫の治療に特に有用である。一部の実施形態では、ＣＤ４７に結合する薬剤と、放射線療法との組合せを提供する治療法も、多様な固形及び血液癌適用について相加効果及び相乗効果を達成し得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ４７ｍＡｂ又はその断片、任意選択でキメラ若しくはヒト化形態の１つ若しくは複数と、薬学的に許容される担体、希釈剤、若しくは賦形剤とを含む、医薬組成物又は動物用医薬組成物。
本開示の実施形態のいくつかは、抗癌剤と組み合わせて、本明細書に開示される抗ＣＤ４７ｍＡｂ又は断片、任意選択でキメラ若しくはヒト化形態の１つと、薬学的に許容される担体、希釈剤、若しくは賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示以前から、本明細書に記載するような機能プロフィールを有する抗ＣＤ４７ｍＡｂを同定することが求められていた。本開示の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、抗癌剤と組み合わせた、異なる特性の組合せ、特に、ヒトの療法、とりわけ固形癌及び血液癌の予防及び治療での使用に、抗ＣＤ４７ｍＡｂを特に有利若しくは好適にする特性の組合せを呈示する。
一部の実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、これは、ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導し；ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、細胞上に存在するＣＤ４７に対するｐＨ依存的結合を呈示する。他の実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、これは、ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し；ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、細胞上に存在するＣＤ４７に対するｐＨ依存的結合を呈示する。他の実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、これは、ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導し；ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、正常細胞に対して低い結合を呈示する。一実施形態では、これらの細胞は、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、ＰＢＭＣ又はＲＢＣ（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、ヒト末梢血単核細胞若しくはヒトＲＢＣ）であってよい。他の実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、これは、ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し；ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、正常細胞に対して低い結合を呈示する。一実施形態では、これらの細胞は、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、ＰＢＭＣ又はＲＢＣ（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、ヒト末梢血単核細胞若しくはヒトＲＢＣ）であってよい。別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、ｐＨ依存的結合及び細胞に対する低い結合の両方を呈示する。
本開示の適用可能性のさらなる範囲は、以下に記載する詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明及び具体的な例は、本開示のいくつかの実施形態を示してはいるが、本開示の精神及び範囲内の様々な変更及び修正は、詳細な説明から当業者に対して明らかになることから、あくまで例示として賦与されるに過ぎないことは理解すべきである。
本開示の上記及びその他の態様、特徴、及び利点は、添付の図面と共に考慮される以下の詳細な説明からよりよく理解されよう。尚、これらの図面は全て、例示として賦与されるに過ぎず、本開示を限定するものではない。
図１Ａは、ヒトＣＤ４７を発現するヒトＯＶ１０細胞に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ヒトＣＤ４７を発現するＯＶ１０細胞株（ＯＶ１０ｈＣＤ４７）セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のｍＡｂを細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図１Ｂは、ヒトＣＤ４７を発現するヒトＯＶ１０細胞に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＯＶ１０ ＣＤ４７セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のＶＬＸ４の代表的ｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図２Ａは、ヒトＲＢＣ（ｈＲＢＣ）に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂの結合を示す。新しく単離したｈＲＢＣを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。様々な濃度のＶＬＸ４ｍＡｂと一緒にｈＲＢＣを３７℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図２Ｂは、ヒトＲＢＣに対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂの結合を示す。新しく単離したｈＲＢＣを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。様々な濃度のＶＬＸ４ｍＡｂと一緒にｈＲＢＣを３７℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図３Ａは、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞に対するＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＯＶ１０ｈＣＤ４７セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ８ ＩｇＧ４ ＰＥキメラ（ｘｉ）又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のＶＬＸ８の代表的ｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図３Ｂは、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞に対するＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＯＶ１０ｈＣＤ４７セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ８キメラ又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のＶＬＸ８の代表的ｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図４Ａは、ヒトＲＢＣに対するＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂの結合を示す。新しく単離したヒトＲＢＣを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ８ ＩｇＧ４ ＰＥｘｉ又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ ＰＥ）の結合を決定した。様々な濃度のＶＬＸ８ｍＡｂと一緒にＲＢＣを３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図４Ｂは、ヒトＲＢＣに対するＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂの結合を示す。新しく単離したヒトＲＢＣを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ８ ＩｇＧ４ ＰＥｘｉ又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２）の結合を決定した。様々な濃度のＶＬＸ８ｍＡｂと一緒にＲＢＣを３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図５Ａは、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞に対するＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＯＶ１０ヒトＣＤ４７セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ９ ＩｇＧ２ｘｉ又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０５ ＩｇＧ２）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図５Ｂは、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞に対するＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＯＶ１０ｈＣＤ４７セルベースＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ９ ＩｇＧ２ｘｉ又はヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ２）の結合を決定した。ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、アッセイの時点で密集とした。様々な濃度のｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図６Ａは、ＣＤ４７に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの特異的結合を示す。野生型及びＣＤ４７ノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥの結合をフローサイトメトリーにより決定した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図６Ｂは、ＣＤ４７に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの特異的結合を示す。野生型及びＣＤ４７ノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２の結合をフローサイトメトリーにより決定した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図７は、ヒトＲＢＣに対するＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂの結合を示す。新しく単離したヒトｈＲＢＣを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ９ ＩｇＧ２ｘｉ又はヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂの結合（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ２， ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ２ ａｎｄ ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２）を決定した。様々な濃度のＶＬＸ９ｍＡｂと一緒にＲＢＣを３７℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体と一緒に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて抗体結合を測定した。 図８Ａは、ヒト動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＨＡＥＣに対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。アクターゼを用いて、ＨＡＥＣをフラスコから除去した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図８Ｂは、ヒト骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＳｋＭＣに対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。アクターゼを用いて、ＳｋＭＣをフラスコから除去した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図８Ｃは、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｌ）に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＨＭＶＥＣ－Ｌに対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。アクターゼを用いて、ＨＭＶＥＣ－Ｌをフラスコから除去した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図８Ｄは、ヒト尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ）に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＲＴＥＣに対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。アクターゼを用いて、ＲＴＥＣをフラスコから除去した。様々な濃度のｍＡｂを１×１０４個の細胞に１時間かけて添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図８Ｅは、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＣＤ３＋細胞に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。ＣＤ３＋細胞を９６ウェルプレートに平板培養した。様々な濃度のｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図８Ｆは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するＶＬＸヒト化ｍＡｂの結合を示す。ＰＢＭＣに対するＶＬＸヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）の結合をフローサイトメトリーにより決定した。ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに平板培養した。様々な濃度のｍＡｂを１時間かけて細胞に添加した。細胞を洗浄してから、ＦＩＴＣ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ標識を測定した。 図９Ａは、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に対するヒト化ｍＡｂのｐＨ依存的及びｐＨ非依存的結合を示す。固相ＣＤ４７ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２の結合を決定した。Ｈｉｓ－ＣＤ４７をマイクロタイターウェルに吸着させ、洗浄してから、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをｐＨ６又は８のウェルに１時間かけて添加した。ウェルを洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図９Ｂは、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に対するヒト化ｍＡｂのｐＨ依存的及びｐＨ非依存的結合を示す。固相ＣＤ４７ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２の結合を決定した。Ｈｉｓ－ＣＤ４７をマイクロタイターウェルに吸着させ、洗浄してから、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをｐＨ６又は８のウェルに１時間かけて添加した。ウェルを洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図９Ｃは、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に対するヒト化ｍＡｂのｐＨ依存的及びｐＨ非依存的結合を示す。固相ＣＤ４７ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥの結合を決定した。Ｈｉｓ－ＣＤ４７をマイクロタイターウェルに吸着させ、洗浄してから、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをｐＨ６又は８のウェルに１時間かけて添加した。ウェルを洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図９Ｄは、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に対するヒト化ｍＡｂのｐＨ依存的及びｐＨ非依存的結合を示す。固相ＣＤ４７ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＣＤ４７に対するＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥの結合を決定した。Ｈｉｓ－ＣＤ４７をマイクロタイターウェルに吸着させ、洗浄してから、様々な濃度のヒト化ｍＡｂをｐＨ６又は８のウェルに１時間かけて添加した。ウェルを洗浄してから、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒に１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。 図１０は、ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞のＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止することを示す。１０％培地を含むＲＰＭＩ中で、１．５×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を５μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２）又は対照抗体と一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。等量の蛍光標識ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて結合を評価した。 図１１は、ＶＬＸ４ ＣＤ４７キメラｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４キメラｍＡｂをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１２Ａは、ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌの抗体をマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１２Ｂは、ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌの抗体をマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１３Ａは、ＶＬＸ８ ＣＤ４７キメラｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８キメラｍＡｂをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１３Ｂは、ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌの抗体をマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１４Ａは、ＶＬＸ９ ＣＤ４７キメラｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９キメラｍＡｂをマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１４Ｂは、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトマクロファージによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大することを示す。ヒトマクロファージを９６ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０４細胞の濃度でプレーティングし、２４時間かけて付着させた。５×１０４個のＣＦＳＥ（１μＭ）標識ヒトＪｕｒｋａｔ細胞と１μｇ／ｍｌの抗体をマクロファージ培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。貪食されていないＪｕｒｋａｔ 細胞を除去し、マクロファージ培養物を入念に洗浄した。マクロファージをトリプシン処理してから、ＣＤ１４について洗浄した。フローサイトメトリーを用いて、全ＣＤ１４＋集団中のＣＤ１４＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを決定した。 図１５Ａは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーによりシグナルを検出した。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１５Ｂは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１５Ｃは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１５Ｄは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿６ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１５Ｅは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿６ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーを実施した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１５Ｆは、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ａは、可溶性ＶＬＸ８ ＣＤ４７キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８キメラｍＡｂ（ＶＬＸ８ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ及びＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ｂは、可溶性ＶＬＸ８キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８キメラｍＡｂ（ＶＬＸ８ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ及びＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ｃは、可溶性ＶＬＸ８ キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８キメラｍＡｂ（ＶＬＸ８ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ及びＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ｄは、可溶性ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ）及びキメラｍＡｂ：ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ｅは、可溶性ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ）及びキメラｍＡｂ：ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１６Ｆは、可溶性ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ）及びキメラｍＡｂ：ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ａは、可溶性ＶＬＸ９キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０４個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ ＣＤ４７キメラｍＡｂ（ＶＬＸ９ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ、ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉ及びＶＬＸ９ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ｂは、可溶性ＶＬＸ９キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０４個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ ＣＤ４７キメラｍＡｂ（ＶＬＸ９ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ、ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉ及びＶＬＸ９ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ｃは、可溶性ＶＬＸ９キメラｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０４個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ ＣＤ４７キメラｍＡｂ（ＶＬＸ９ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ、ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉ及びＶＬＸ９ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ｄは、可溶性ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１～１０ ＩｇＧ１）及びキメラｍＡｂ ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶで染色し、シグナルをフローサイトメトリーにより検出した。ＶＬＸ９ ＩｇＧ２（ｘｉ）は、マウス／ヒトキメラである。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ｅは、可溶性ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１～１０ ＩｇＧ１）及びキメラｍＡｂ ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＶＬＸ９ ＩｇＧ２（ｘｉ）は、マウス／ヒトキメラである。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）である細胞の％としてデータを示す。 図１７Ｆは、可溶性ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０４）を１μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１～１０ ＩｇＧ１）及びキメラｍＡｂ ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＶＬＸ９ ＩｇＧ２（ｘｉ）は、マウス／ヒトキメラである。アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）である細胞の％としてデータを示す。 図１８は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞のミトコンドリア脱分極の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＪＣ－１色素蛍光の変化を評価した。データは、ミトコンドリア脱分極を有する細胞の％として表す。 図１９は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表す。 図２０は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞による細胞表面タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＰＤＩＡ３発現を評価した。データは、ＰＤＩＡ３陽性の細胞の％として表す。 図２１は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞による細胞表面ＨＳＰ７０発現の増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＨＳＰ７０発現を評価した。データは、ＨＳＰ７０陽性の細胞の％として表す。 図２２は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞による細胞表面ＨＳＰ９０発現の増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＨＳＰ９０発現を評価した。データは、ＨＳＰ９０陽性の細胞の％として表す。 図２３は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の放出を増加することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＡＴＰ定量キットを用いて分析した。データは、上清中のｐＭ ＡＴＰとして表す。 図２４は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＨＭＧＢ１免疫アッセイを用いて分析した。データは、上清中のＨＭＧＢ１のｎｇ／ｍｌとして表す。 図２５は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトラージ（Ｒａｊｉ）細胞によるＣＸＣＬ１０放出を増加することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＣＸＣＬ１０免疫アッセイを用いて分析した。データは、上清中のＣＸＣＬ１０のｎｇ／ｍｌとして表す。 図２６は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＪｕｒｋａｔ細胞におけるミトコンドリア脱分極の誘導を示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＪＣ－１色素蛍光の変化を評価した。データは、ミトコンドリア脱分極を有する細胞の％として表す。 図２７は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞による細胞表面カルレティキュリン発現を増大することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表す。 図２８は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞による細胞表面ＰＤＩＡ３発現を増大することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＰＤＩＡ３発現を評価した。データは、ＰＤＩＡ３陽性の細胞の％として表す。 図２９は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞による細胞表面ＨＳＰ７０発現を増大することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＨＳＰ７０発現を評価した。データは、ＨＳＰ７０陽性の細胞の％として表す。 図３０は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞による細胞表面ＨＳＰ９０発現を増大することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによりＨＳＰ９０発現を評価した。データは、ＨＳＰ９０陽性の細胞の％として表す。 図３１は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞によるＡＴＰ放出を増加することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＡＴＰ定量キットを用いて分析した。データは、上清中のｐＭ ＡＴＰとして表す。 図３２は、可溶性ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞によるＨＭＧＢ１放出を増加することを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ２、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２）、陰性ＩｇＧ対照抗体又は陽性対照としての１μＭのミトキサントロンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＨＭＧＢ１免疫アッセイを用いて分析した。データは、上清中のＨＭＧＢ１のｎｇ／ｍｌとして表す。 図３３は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．３～１００ｎＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．３～１００ｎＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図３４は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．３～１００ｎＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．３～１００ｎＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図３５は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞による細胞表面カルレティキュリン発現の相乗的又は相加的増大を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．３～１００ｎＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．３～１００ｎＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表される。 図３６は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的及び／又は相加的ＡＴＰ放出を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．３～１００ｎＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．３～１００ｎＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＡＴＰ定量キットを用いて分析した。データは、上清中のｐＭ ＡＴＰとして発現される。 図３７Ａは、ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂによるｈＲＢＣの凝集を示す。様々な濃度のヒト化ＶＬＸ４ｍＡｂ（２５μｇ／ｍＬ～０．４ｎｇ／ｍＬ）とｈＲＢＣのインキュベーション後に、血球凝集を評価した（ＶＬＸｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１，ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ）。血液を希釈（１：５０）し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで３回洗浄した。等量の抗体（７５μｌ）と一緒にｈＲＢＣをＵ底９６ウェルプレートに添加し、３７℃で３時間、次に４℃で一晩インキュベートした。 図３７Ｂは、ＶＬＸ８キメラ及びヒト化ｍＡｂによるｈＲＢＣの凝集を示す。様々な濃度のヒト化ＶＬＸ４ｍＡｂ（２５μｇ／ｍＬ～０．４ｎｇ／ｍＬ）及びキメラｍＡｂ ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉとｈＲＢＣのインキュベーション後に、血球凝集を評価した（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１，＿０２，＿０３，＿０８，＿０９，＿１０，＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ）。血液を希釈（１：５０）し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで３回洗浄した。等量の抗体（７５μｌ）と一緒にｈＲＢＣをＵ底９６ウェルプレートに添加し、３７℃で３時間、次に４℃で一晩インキュベートした。 図３８Ａは、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＲＢＣの凝集を示す。様々な濃度のＶＬＸ９ ＩｇＧ２キメラ（ｘｉ）及びヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂとヒトＲＢＣのインキュベーション後に、血球凝集を評価した（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１から＿０６ ＩｇＧ２）。血液を希釈（１：５０）し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで３回洗浄した。等量の抗体（７５μｌ）と一緒にＲＢＣをＵ底９６ウェルプレートに添加し、３７℃で３時間、次に４℃で一晩インキュベートした。 図３８Ｂは、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによるヒトＲＢＣの凝集を示す。様々な濃度のＶＬＸ９ ＩｇＧ２キメラ（ｘｉ）及びヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂとヒトＲＢＣのインキュベーション後に、血球凝集を評価した。血液を希釈（１：５０）し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで３回洗浄した。等量の抗体（７５μｌ）と一緒にＲＢＣをＵ底９６ウェルプレートに添加し、３７℃で３時間、次に４℃で一晩インキュベートした。 図３９は、ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂは、ラージ（Ｒａｊｉ）異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を抑制することを示す。５×１０６個のラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍細胞の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を雌ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下接種した。接種から５日後、腫瘍体積を測定し、３１～７４ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスをランダムに８～１０匹／グループに分けた。この時点でＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、抗体５Ｘ／週の腹腔内注射により４週間にわたって５ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。 図４０は、ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂは、ラージ（Ｒａｊｉ）異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を抑制することを示す。５×１０６個のラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍細胞の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を雌ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下接種した。接種から５日後、腫瘍体積を測定し、３１～７４ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスをランダムに８～１０匹／グループに分けた。この時点でＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、抗体５Ｘ／週の腹腔内注射により４週間にわたって５ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。 図４１は、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、ラージ（Ｒａｊｉ）異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を抑制することを示す。５×１０６個のラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍細胞の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を雌ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下接種した。接種から５日後、腫瘍体積を測定し、３１～７４ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスをランダムに８～１０匹／グループに分けた。この時点でＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、抗体５Ｘ／週の腹腔内注射により４週間にわたって５ｍｇ／ｋｇの抗体で処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。 図４２Ａは、カニクイザルにヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂを静脈内注入により投与した後の血中ヘモグロビンレベルを示す。ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２又はビヒクルを、１日目に５ｍｇ／ｋｇの用量及び１８日目に１５ｍｇ／ｋｇの用量で１時間の静脈内注入として投与した。全試験期間を通してヘモグロビンレベルをモニターし、対照値に対して正規化した。 図４２Ｂは、カニクイザルにヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂを静脈内注入により投与した後の血中ＲＢＣレベルを示す。ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２又はビヒクルを、１日目に５ｍｇ／ｋｇの用量及び１８日目に１５ｍｇ／ｋｇの用量で１時間の静脈内注入として投与した。全試験期間を通してＲＢＣレベルをモニターし、対照値に対して正規化した。 図４３は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図４４は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図４５は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表される。 図４６は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２ヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図４７は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２ヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図４８は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２ヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表される。 図４９は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図５０は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図５１は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥヒト化ｍＡｂによるヒトＯＶ９０細胞の細胞死の誘導を示す。ＭＢＣＤ／１９９培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ９０細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ又は０．４２μＭドキソルビシンと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性の細胞の％として表される。 図５２は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図５３は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図５４は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、エピルビシンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのエピルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００５～０．４２μＭのエピルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図５５は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、エピルビシンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのエピルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００５～０．４２μＭのエピルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図５６は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ドセタキセルと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００２～０．１３５μＭのドセタキセル単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００２～０．１３５μＭのドセタキセルの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図５７は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、エピルビシンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００２～０．１３５μＭのドセタキセル単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００２～０．１３５μＭのドセタキセルの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図５８は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ゲムシタビンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００３～０．３μＭのゲムシタビン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００３～０．３μＭのゲムシタビンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図５９は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ゲムシタビンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００３～０．３μＭのゲムシタビン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００３～０．３μＭのゲムシタビンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図６０は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、ゲムシタビンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．００３～０．３μＭのゲムシタビン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．００３～０．３μＭのゲムシタビンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性且つ７ＡＡＤ－である細胞の％として表される。 図６１は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、イリノテカンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．６３～５１ｎＭのイリノテカン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．６３～５１ｎＭのイリノテカンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図６２は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、イリノテカンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．６３～５１ｎＭのイリノテカン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．６３～５１ｎＭのイリノテカンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図６３は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、イリノテカンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．６３～５１ｎＭのイリノテカン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．６３～５１ｎＭのイリノテカンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性且つ７ＡＡＤ－である細胞の％として表される。 図６４は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、オキサリプラチンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図６５は、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、オキサリプラチンと組み合わせて、ヒトＯＶ１０／３１５細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＯＶ１０／３１５細胞を０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ単独、０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥと０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図６６は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２と０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図６７は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２と０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図６８は、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２と０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性且つ７ＡＡＤ－である細胞の％として表される。 図６９は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞を定量した。 図７０は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、細胞をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞を定量した。 図７１は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いてカルレティキュリン発現を評価した。データは、カルレティキュリン陽性且つ７ＡＡＤ－である細胞の％として表される。 図７２は、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、化学療法薬ドキソルビシンと組み合わせて、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の相乗的又は相加的細胞死を引き起こすことを示す。ＲＰＭＩ培地中で、１×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。無細胞上清を収集し、ＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。データは、上清中のＨＭＧＢ１のｎｇ／ｍｌとして表される。 図７３は、ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を抑制することを示す。２×１０７個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１ｔ腫瘍細胞の懸濁液を含有する０．２ｍＬの７０％ＲＰＭＩ／３０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を雌ＮＳＧマウスの乳腺脂肪体に同所接種した。接種から１９日後、腫瘍体積を測定し、５５～１７９ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスをランダムに１０匹／グループに分けた。この時点で、ＶＬＸｈ８ｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、腹腔内注射により５ｍｇ／ｋｇの抗体５×／週で５週間にわたり処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。
定義
別に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から別のことが要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学に関して使用される命名法、並びにそれらの技術は、当技術分野で公知であり、一般に使用されている。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ４７」、「インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）」、「卵巣癌抗原ＯＡ３」、「Ｒｈ関連抗原」及び「ＭＥＲＧ」は、同意語であり、置き換え可能に使用され得る。
用語「抗ＣＤ４７抗体」は、治療又は診断薬としての使用を目的とし、従って、典型的には、治療及び／又は診断薬として有用である上で必要な結合親和性を有する本開示の抗体を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。～と、若しくは～に対して「特異的に結合する」又は「免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ又は複数の抗原決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応しないか、又ははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０－６）で結合することを意味する。抗体としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖Ｆｖ断片、及び単一アーム（ｏｎｅ－ａｒｍｅｄ）抗体が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本開示の抗体化合物に適用される場合、例えば、任意の真核、原核、若しくはファージクローンをはじめとする単一コピー若しくはクローンから得られる抗体を指すものであり、それらを生成する方法ではない。本開示のｍＡｂは、均一又はほぼ均一の集団に存在するのが好ましい。完全なｍＡｂは、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の１部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書に開示されるように、「抗体化合物」は、ｍＡｂ及びその抗原結合断片を指す。本開示に従う類似の機能的特性を呈示する別の抗体化合物は、従来の方法により作製することができる。例えば、マウスをヒトＣＤ４７又はその断片で免疫し、得られた抗体を回収し、精製することができ、それらが本明細書に開示される抗体化合物と類似の、若しくは同じ結合及び機能的特性を有するか否かの決定は、以下の実施例３～１６に開示される方法によって評価することができる。また、抗原結合断片も、従来の方法により調製することができる。抗体及び抗原結合断片を生成及び精製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、以下：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５～８章及び第１５章に見出すことができる。
モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の１部分が、マウス抗体の対応する配列、特にマウスＣＤＲと同一、又は相同的であるが、鎖の残りは、ヒト抗体の対応する配列と同一、又は相同的である抗体を包含する。本開示の他の実施形態は、モノクローナル抗体と類似若しくは同一の結合及び生物学的特性を呈示するこれらのモノクローナル抗体の抗原結合断片を含む。本開示の抗体は、κ又はλ軽鎖定常領域、及び重鎖ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＭ定常領域を含んでよく、そうしたものとして、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のものがあり、これらは、場合によっては、Ｆｃ受容体機能を改変するための様々な突然変異を含む。
本明細書に開示されるマウスＣＤＲを含有するモノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ方法をはじめとする、当業者には周知の様々な方法の何れかによって調製することができる。
抗体改変及び改善のための最新の方法についての論評は、例えば、以下：Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ，Ｅｄ．，（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｏｋ ９０７），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１０：１６１７７９９７３４；Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｄ，Ｅｄ．，（２０１１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｏｋ ４），Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄｓ．，（２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；並びにＷ．Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｄｒｉｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことができる。
抗体及び抗原結合断片を生成及び精製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、以下：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第５～８章及び第１５章に見出すことができる。
天然に存在する完全長抗体は、４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合により互いに連結された２つの同じ重（Ｈ）鎖と２つの同じ軽（Ｌ）鎖を含む、「Ｙ」型の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である。フラグメント抗原結合領域（ＦＡＢ）と呼ばれる各鎖のアミノ酸末端部分は、主として、そこに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介した抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域（「Ｆｃ」領域）を画定する。
ＣＤＲには、フレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域が散在する。多くのＦＲのアミノ酸配列が当技術分野で公知である。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、次の順にアミノ末端からカルボキシ末端まで配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付け及び配置は、公知のＫａｂａｔナンバーリング則（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に従う。
本明細書に記載するように、「抗原結合部位」は、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」として定義することができ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７）により定義される通りの抗体可変ドメインの構造的に超可変領域を指す。６つのＨＶＲがあり、そのうち、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に存在する。本明細書では、延長されてＨ１を含むＨ－ＣＤＲ１を除き、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲを使用した。
ギリシャ文字α（アルファ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、γ（ガンマ）、及びμ（ミュー）と称される５つのタイプの哺乳類免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖があり、これらは、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＭとして抗体のクラス又はアイソタイプを定義する。ＩｇＧ抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４にさらに区分され得る。
各重鎖タイプは、当技術分野で公知である配列を含み特定の定常領域を特徴とする。定常領域は、同じアイソタイプのあらゆる抗体で同一であるが、別のアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、及びδは、３つのタンデム免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインから構成される定常領域と、柔軟性追加のためのヒンジ領域とを含む。重鎖μ及びεは、４つのＩｇドメインから構成される定常領域を有する。
ヒンジ領域は、抗体のＦｃ及びＦａｂ部分を連結させる柔軟なアミノ酸区間がある。この領域は、２つの重鎖を連結するジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含有する。
重鎖の可変領域は、別のＢ細胞により産生される抗体では異なるが、単一Ｂ細胞又はＢ細胞クローンにより産生されるあらゆる抗体については同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸長さであり、単一Ｉｇドメインから構成される。
哺乳類の場合、軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）として分類され、当技術分野において公知の特定の定常領域を特徴とする。軽鎖は、２つの連続的ドメイン：アミノ酸末端に１つの可変ドメインと、カルボキシ末端に１つの定常ドメインを有する。各抗体は、常に同一である２つの軽鎖を含み；哺乳類において、１抗体につき軽鎖κ又はλの１タイプしか存在しない。
抗体のクラスに応じて３つ又は４つの定常ドメインを提供する２つの重鎖から構成されるＦｃ領域は、免疫細胞の活性をモジュレートする上で役割を果たす。特定のタンパク質に結合することにより、Ｆｃ領域は、各抗体が所与の抗原に対して適切な免疫応答を生み出すことを確実にする。Ｆｃ領域はまた、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、並びに補体タンパク質などの他の免疫分子にも結合する。これによって、Ｆｃ領域は、オプソニン化、細胞溶解、並びに肥満細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒を媒介する。
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」は、抗体又は抗体断片が結合するペプチド若しくはタンパク質に位置するアミノ酸の具体的な配列を指す。エピトープは、多くの場合、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、特定の三次元構造特徴、並びに特定の電荷特徴を備える。エピトープは、線状、すなわち、アミノ酸の単一配列への結合を含むか、又は立体配座、すなわち、抗原（線状配列では必ずしも連続的ではなくてもよい）の様々な領域内のアミノ酸の２つ以上の配列への結合を含むかのいずれであってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」、「特異的に結合する」、「特異的結合」、及び本発明の抗体化合物に適用される同等の用語は、特定の結合物質（抗体など）が、特定の結合物質及び標的分子種が混合されている他の分子種との結合に優先して、標的分子種に結合する能力を指す。特定の結合物質は、標的と特異的に結合することができるとき、標的分子種を特異的に認識すると言える。
本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」は、当該分子上の１部位における１つの分子と別の分子の結合の強度を指す。特定の分子が別の特定の分子と特異的に結合するか、又は会合する場合、これらの２つの分子は、互いに結合親和性を呈示すると言える。結合親和性は、１対の分子の会合定数及び解離定数に関するが、これらの定数を測定又は決定することは、本明細書に記載の方法には重要ではない。それよりも、記載される方法の分子同士の相互作用を説明するために本明細書で用いられる親和性は、一般に、実験的試験で観測される見かけ上の親和性（別に明示されない限り）であり、これを用いて、１つの分子（例えば、抗体又は他の特異的結合相手）が、２つの他の分子（例えば、ペプチドの２つのバージョン又は変異体）に結合する相対強度を比較することができる。結合親和性、会合定数、及び解離定数の概念は、公知である。
本明細書で使用されるとき、用語「配列同一性」は、配列マッチングを最大にするように、すなわち、ギャップと挿入を計算に入れて、配列をアラインメントしたときの２つ以上の配列の対応する位置における同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、公知の方法によって容易に計算することができ、そうした方法として、限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。同一性を決定する方法は、試験される配列同士の最大マッチを与えるように設計されている。さらに、同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムにコード化されている。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムにより、相同性アラインメントアルゴリズムにより、類似性の検索方法により、又はこれらアルゴリズムのコンピュータ用実装（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＰＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａから入手可能）、又は肉眼検査により実施することができる。概要は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）を参照されたい。
配列同一性及び配列類似性の割合（％）を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから一般に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の数の閾値スコアＴに一致するか、又はそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードの同定によって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる。
これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含む、より長いＨＳＰを見出すための検索開始のシード（ｓｅｅｄ）として作用する。次に、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（１対のマッチする残基についての報酬スコア；常に；０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に；０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その達成された最大値から量Ｘだけ低下した場合、１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアが０以下になる場合、又は何れかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定付ける。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）：１１、期待値（Ｅ）：１０、カットオフ：１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）：３、期待値（Ｅ）：１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する。
同一性の割合（％）の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列同士の類似性の統計解析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の１つの尺度は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これによって、２つのヌクレオチド同士又はアミノ酸配列同士のマッチが偶然に起こる確率の指標が得られる。例えば、試験核酸配列と基準核酸配列を比較した最小和確率が、一実施形態で約０．１未満、別の実施形態で約０．０１未満、また別の実施形態で約０．００１未満である場合、試験核酸配列は基準配列に類似するとみなされる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化（された）」、「ヒト化」などは、ヒトＦＲ及び定常領域に、本明細書に開示されるマウスモノクローナル抗体ＣＤＲを移植することを指す。これらの用語には、以下に説明するように、様々な抗体特性を改善する目的で、例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：２５－３４及びＨｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４４（１）：１１５－１２０に開示される方法によりそれぞれマウスＣＤＲ、及びヒトＦＲに対して可能なさらなる修飾も含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、本明細書に開示される抗体化合物をはじめとする、本明細書に開示されるものと類似する開示に従う結合及び機能的特性を有し、且つＦＲと、非ヒト抗体由来の実質的にヒト又は完全にヒトの周囲ＣＤＲである定常領域とを有するｍＡｂ及び抗原結合断片を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＦＲ」又は「フレームワーク配列」は、ＦＲ１～４の何れか１つを指す。本開示により包含されるヒト化抗体及び抗原結合断片は、ＦＲ１～４の何れか１つ又は複数が、実質的又は完全にヒト由来である、すなわち、実質的又は完全にヒトのＦＲ１～４の考えられる組合せの何れかが存在する、分子を含む。例えば、これは、ＦＲ１とＦＲ２、ＦＲ１とＦＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３などが実質的又は完全にヒト由来である分子を含む。実質的にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的にヒトのフレームワークは、本明細書に開示されるフレームワーク配列、又は既知のヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
完全にヒトのフレームワークは、既知のヒト生殖細胞系フレームワーク配列と同じものである。ヒトＦＲ生殖細胞系配列は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース及びＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１によるＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋから取得することができ、その内容は、全体として参照により本明細書に開示組み込む。
Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋは、ヒト抗体レパトアを作製するために使用されるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子の概要であり、２０３の遺伝子と４５９の対立遺伝子のエントリーを含み、総計８３７の配列が展示されている。個々のエントリーは、全て、少なくとも１つの機能性又はオープンリーディングフレーム対立遺伝子を有し、且つ３つの主要遺伝子座に位置する、ヒト免疫グロブリン定常遺伝子、並びに生殖細胞系可変、多様性、及びジョイニング遺伝子を含む。例えば、生殖細胞系軽鎖ＦＲは、以下：ＩＧＫＶ３Ｄ－２０、ＩＧＫＶ２－３０、ＩＧＫＶ２－２９、ＩＧＫＶ２－２８、ＩＧＫＶ１－２７、ＩＧＫＶ３－２０、ＩＧＫＶ１－１７、ＩＧＫＶ１－１６、１－６、ＩＧＫＶ１－５、ＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１Ｄ－１６、ＩＧＫＶ２Ｄ－２８、ＩＧＫＶ２Ｄ－２９、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９及びＩＧＫＶ１Ｄ－３３並びにＩＧＫＪ１－５からなる群から選択することができ、また、生殖細胞系重鎖ＦＲは、以下：ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－１８、ＩＧＨＶ１－４６、ＩＧＨＶ１－６９、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ２－２６、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ１－８、ＩＧＨＶ３－９、ＩＧＨＶ３－１１、ＩＧＨＶ３－１５、ＩＧＨＶ３－２０、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ３－７２、ＩＧＨＶ３－７４、ＩＧＨＶ４－３１、ＩＧＨＶ３－２１、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－４８、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ４－５９及びＩＧＨＶ５－５１並びにＩＧＨＪ１－６からなる群から選択することができる。
実質的にヒトのＦＲは、既知のヒト生殖細胞系ＦＲ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的にヒトのフレームワークは、本明細書に開示されるフレームワーク配列、又は既知のヒト生殖細胞系フレームワーク配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
本開示に含まれるＣＤＲは、本明細書に具体的に開示されるものだけではなく、本明細書に開示されるＣＤＲ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列も含む。或いは、本開示に含まれるＣＤＲは、本明細書に具体的に開示されるものだけではなく、本明細書に開示されるＣＤＲ配列と比較して、対応する位置に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸変更を有するＣＤＲ配列も含む。このような配列が同一、又はアミノ酸が修飾されたＣＤＲは、好ましくは、インタクトな抗体によって認識される抗原に結合する。
ヒト化は、キメラ化によって始まり、これは、１９８０年代前半に開発された方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｍ．Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｖ．Ｔ．Ｏｉ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，６８５１－５（１９８４））であり、マウス抗体の可変（Ｖ）ドメインをヒト定常（Ｃ）ドメインと組み合わせて、約７０％のヒト含有率を含む分子を作製することから構成される。
本開示は、いくつかの異なる方法を用いて作製することができるヒト化抗体を含み、こうした方法として、Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．（２００８）Ｊａｎ １；１３：１６１９－３３に記載されているものがある。
一アプローチでは、親抗体化合物ＣＤＲは、親抗体化合物フレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワークに移植される。新規フレームワークの配列同一性は、一般に、親抗体化合物中の対応するフレームワークの配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。１００アミノ酸残基未満を有するフレームワークの場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基を変更することができる。この移植によって、親抗体のそれと比較して結合親和性の低下が起こり得る。その場合には、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９により開示される具体的な基準に基づいて、いくつかの位置でフレームワークを親フレームワークに復帰突然変異させることができる。相同性及び復帰突然変異に基づいてヒト化変異体を作製する上で有用な方法を記載する別の参照文献としては、以下に記載されるものなどが挙げられる：Ｏｌｉｍｐｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５ Ｆｅｂ １；３１（３）：４３４－４３５及び米国特許第４，８１６，３９７号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、及び同第５，６９３，７６１号明細書；及びＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ－ｗｏｒｋｅｒｓの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；並びにＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６。
復帰突然変異のために考慮すべき残基の同定は、以下に記載するように実施することができる。アミノ酸が下記のカテゴリーに入るとき、使用されているヒト生殖細胞系配列のフレームワークアミノ酸（「アクセプターＦＲ」）は、親抗体化合物のフレームワーク由来のフレームワークアミノ酸（「ドナーＦＲ」）により置換される：
（ａ）アクセプターフレームワークのヒトＦＲ内のアミノ酸が、その位置のヒトフレームワークでは稀であるが、ドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸は、その位置のヒトフレームワークでは典型的である；
（ｂ）アミノ酸の位置が、ＣＤＲの１つに隣接している；又は
（ｃ）フレームワークアミノ酸の何れかの側鎖原子が、三次元免疫グロブリンモデル中のＣＤＲアミノ酸の何れかの原子から約５～６オングストローム（中心間）以内にある。
アクセプターフレームワークのヒトＦＲ内のアミノ酸の各々及びドナーフレームワーク内の対応するアミノ酸が、概して、その位置のヒトフレームワークでは稀であるとき、そのようなアミノ酸は、その位置のヒトフレームワークに典型的なアミノ酸により置換することができる。この復帰突然変異の基準によって親抗体化合物の活動を復帰させることが可能になる。
本明細書に開示される抗体化合物と類似の機能的特性を提示するヒト化抗体を作製する別のアプローチは、フレームワークを変更することなく、移植ＣＤＲ内でアミノ酸をランダムに突然変異させるステップ、次に、親抗体化合物のそれと同等又はより優れた結合親和性及びその他の機能的特性について、得られた分子をスクリーニングするステップを含む。さらに、単一の突然変異を各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置に導入した後、結合親和性及びその他の機能的特性に対するそうした突然変異の作用を評価することもできる。改善された特性をもたらす単一突然変異を組み合わせて、相互の組合せの作用を評価することができる。
さらに、以上のアプローチの両方の組合せも可能である。ＣＤＲ移植後、ＣＤＲにアミノ酸変更を導入する以外に、特定のＦＲを復帰突然変異させることができる。この方法は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１－１６２に記載されている。
本開示の教示を適用して、当業者は、例えば、部位指定突然変異誘発などの一般的技術を使用して、本明細書に開示されるＣＤＲ及びＦＲ配列内のアミノ酸を置換することにより、この配列に由来する別の可変領域アミノ酸配列を作製することができる。最大全部の天然に存在するアミノ酸を特定の置換部位に導入することができる。本明細書に開示される方法を用いて、これらの追加可変領域アミノ酸配列をスクリーニングすることにより、表示されるインビボ機能を有する配列を同定することができる。このようにして、本開示に従ってヒト化抗体及びその抗原結合部分を作製するのに好適なさらなる配列を同定することができる。フレームワーク内のアミノ酸置換は、本明細書に開示される４つの軽鎖及び／又は重鎖ＦＲの何れか１つ又は複数において１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つの位置に制限するのが好ましい。ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３つの軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲの何れか１つ又は複数において１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つの位置に制限するのが好ましい。前述したこれらのＦＲ及びＣＤＲ内の様々な変更の組合せも可能である。
上述のアミノ酸修飾を導入することにより作製した抗体化合物の機能的特性が、本明細書に開示される特定の分子により呈示されるものと一致することは、以下に開示する実施例の方法により確認することができる。
上に記載したように、患者にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する問題を回避するために、マウス抗体を遺伝子操作し、ヒト免疫グロブリン分子の可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）フレームワーク上に、相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することによって、抗原結合部位の完全性に必須とみなされるこれらのマウスフレームワーク残基は維持しながら、そのマウス内容物をそのヒト対応部分に存在するアミノ酸残基で段階的に置換した。しかし、ヒト化抗体の異種ＣＤＲは、患者に抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）応答を引き起こし得る。
抗Ｉｄ応答を最小限にするために、ヒトフレームワークに、抗体－リガンド相互作用に最も重要なＣＤＲ残基だけを移植する（「ＳＤＲ移植」と呼ばれる）ことによって、異種抗体をヒト化する方法が開発されており、この方法では、ＣＤＲの必須特異性決定残基（ＳＤＲ）だけがヒトフレームワークに移植される。この方法は、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：２５－３４に記載されており、既知構造の抗原－抗体複合体の三次元構造のデータベースを用いた、又は抗体結合部位の突然変異分析によるＳＤＲの同定を含む。より多くのＣＤＲ残基の保持を含むヒト化のための別のアプローチは、「短縮」ＣＤＲ、すなわち、全てのＳＤＲを含むＣＤＲ残基の区間の移植に基づくものである。Ｋａｓｈｍｉｒｉらは、マウス抗体を投与された患者からの血清に対するヒト化抗体の反応性を評価する方法も開示している。
改善された免疫原性を有するヒト抗体変異体を構築する別の戦略は、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４４（１）：１１５－１２０に開示されている。これらの著者らは、コンピュータ支援相同性モデル化により構築された４Ｃ８の分子モデルを用いるＣＤＲ移植により、４Ｃ８からのヒト化抗体、すなわち、マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体を開発した。この分子モデルを用いて、上記の著者らは、抗原結合に潜在的に重要なＦＲ残基を同定した。４Ｃ８のヒト化バージョンは、マウス抗体ＦＲに対する相同性に基づいて選択されたヒト抗体フレームワークにこれらの重要なマウスＦＲ残基を、マウスＣＤＲ残基と一緒に移植することによって作製された。得られたヒト化抗体は、本来のマウス抗体のそれと類似した抗原結合親和性及び特異性を有することが判明したが、これは、臨床的に常用されているマウス抗ＣＤ３４抗体の代替物となり得ることを示唆している。
本開示の実施形態は、考慮されるｍＡｂが、本明細書に開示される単一マウスｍＡｂ由来のＣＤＲのセット、又は開示されるマウスｍＡｂの２つ若しくは３つに由来する個別のＣＤＲを含むＣＤＲのセットを含有する軽鎖及び重鎖を含むことができるように、任意の組合せ形態で本明細書に開示されるＣＤＲを含むヒト免疫系による認識を回避するように作製された抗体を包含する。こうしたｍＡｂは、分子生物学の標準的技術により作製し、本明細書に記載されるアッセイを用いて、所望の活性についてスクリーニングすることができる。このようにして、本開示は、新たな、又は改善された治療活性を達成するために、開示されるマウスｍＡｂ由来のＣＤＲの混合物を含む新規のｍＡｂを作製する「ミックス及びマッチ（ｍｉｘ ａｎｄ ｍａｔｃｈ）」アプローチを提供する。
本明細書に開示される分子と「競合する」本開示により包含されるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、本開示の分子が結合する部位と同一であるか、又はそれとオーバーラップする部位でヒトＣＤ４７に結合するものである。競合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、抗体競合アッセイによって同定することができる。例えば、精製した、又は部分的に精製したヒトＣＤ４７細胞外ドメインのサンプルを固体支持体に結合することができる。次に、本開示の抗体化合物、又はその抗原結合断片並びにそのような開示抗体化合物と競合することができると思われるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を添加する。２つの分子のうちの一方を標識する。標識化合物及び非標識化合物が結合して、ＣＤ４７上の個別且つ独立の部位に結合すれば、標識化合物は、推定競合化合物が存在するか否かにかかわらず、同じレベルで結合するであろう。しかし、相互作用の部位が同一又はオーバーラップする場合には、非標識化合物は競合し、抗原に結合する標識化合物の量は低下するであろう。非標識化合物が過剰に存在する場合には、もしあるとしても、ごくわずかの標識化合物が結合するであろう。本開示の目的のために、競合モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４７に対する本発明の抗体化合物の結合を約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％低減するものである。こうした競合アッセイを実施する方法の詳細は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙに見出すことができる。こうしたアッセイは、精製抗体を用いることによって、定量的にすることができる。標準曲線は、１つの抗体をそれ自体に対して力価測定することによって作成し、言い換えれば、同じ抗体を標識及び競合者の両方に使用する。非標識競合モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、プレートに対する標識分子の結合を阻害する能力を滴定する。結果をプロットして、所望の程度の結合阻害を達成するのに必要な濃度を比較する。
こうした競合アッセイで本開示の抗体化合物と競合するｍＡｂ又はその抗原結合断片が、本開示の抗体化合物と同じ若しくは類似の機能的特性を有するか否かは、これらの方法を、以下の実施例に記載する方法と組み合わせて、決定することができる。様々な実施形態では、本明細書に包含される治療方法に使用するための競合抗体は、本明細書に開示される抗体化合物のそれと比較して、約５０％～約１００％又は約１２５％、若しくはそれ以上の範囲の本明細書に記載するような生物学的活性を有する。一部の実施形態では、競合抗体は、以下に記載する実施例に開示の方法により決定される通り、本明細書に開示される抗体化合物のそれと比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は同一の生物学的活性を有する。
本組成物及び方法において有用なｍＡｂ若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体は、本明細書に記載されるアイソタイプのいずれであってもよい。さらに、これらのアイソタイプのいずれも、後述する通り、さらなるアミノ酸修飾を含んでもよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであってよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、抗体半減期を改変することができる。抗体半減期は、大部分が、新生児Ｆｃ受容体とのＦｃ依存性相互作用により調節される（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ａｎｄ Ａｌｉｋｅｓｈ，２００７）。モノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、半減期を延長することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，２００６）；Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）；及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）が挙げられる。
半減期の延長とは反対に、例えば、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）抗体に関連する有害事象の可能性を低減するために、短い半減期が所望されるいくつかの状況がある（Ｐｒｅｓｔａ ２００８）。本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、半減期を短縮する、及び／又は内在性ＩｇＧを低減することもでき、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｉ２５３Ａ（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６）；Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）；及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を増大又は低減することができる。こうした抗体エフェクター機能として、限定されないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体に対する結合の改変が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を増大することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ及びＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）；Ｆ２３４Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２３４Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９３Ｌ、及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔｅｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）；Ｇ２３６Ａ，Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ｓ及びＫ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｓ２６７Ｅ及びＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）；Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ２３４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）；Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ（Ｓａｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）；Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を低減することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾Ｎ２９７Ａ及びＮ２９７Ｑ（Ｂｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）；Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３５６Ｅ／Ｌ３５８Ｍ（Ｇｈｅｖａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００８）；Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）；Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ （Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ１定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を低減することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）；Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｒ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｉｍｏｔｏ，２０１３）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであってもよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を増大又は低減することができる。こうした抗体エフェクター機能として、限定されないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及びＣ１ｑ結合、並びにＦｃ受容体に対する結合の改変が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を増大することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ｓ（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を低減することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）；Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｒ、Ｐ３３１Ｓ、Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３３０Ｒ／Ｖ３０９Ｌ／Ｐ３３１Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ｐ２３８Ｄ／Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｑ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｓ（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｉｍｏｔｏ，２０１３）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域を修飾して、アイソフォーム及び／又はアゴニスト活性を改変することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｃ１２７Ｓ（ＣＨ１ドメイン）、Ｃ２３２Ｓ、Ｃ２３３Ｓ、Ｃ２３２Ｓ／Ｃ２３３Ｓ、Ｃ２３６Ｓ、及びＣ２３９Ｓ（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｌｉｇｈｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体は、ヒトＩｇＧ３アイソタイプであってもよい。
モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ３定常領域であって、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片の前記ヒトＩｇＧ３定常領域を１つ又は複数のアミノ酸にて修飾して、抗体半減期、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、又はアポトーシス活性を増大することができる。
モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合断片のヒトＩｇＧ３定常領域であって、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片の前記ヒトＩｇＧ３定常領域をアミノ酸Ｒ４３５Ｈにて修飾して、抗体半減期を延長することができる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ４定常領域を修飾して、抗体エフェクター機能を低減することができる。こうした抗体エフェクター機能として、限定されないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）が挙げられる。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体、その抗原結合断片、又は競合抗体のヒトＩｇＧ４定常領域を修飾して、Ｆａｂアーム交換を防止する、及び／又は抗体エフェクター機能を低減することができ、そのようなものとして、限定されないが、アミノ酸修飾：Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）；Ｓ２２８Ｐ，Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）が挙げられる。
本開示は、相乗的組合せを記載し、改善された有効性をもたらすことができ、その効果は、腫瘍細胞総数；再発までの時間；他の臨床有効性；及び他の患者の健康状態の指標により測定され得る。或いは、有害な副作用、例えば、非標的組織、免疫状態、及び他の臨床指標に対する障害を低減しながら、単剤療法の有効性と同等である治療効果のための相乗的組合せ。本発明の相乗的組合せは、ＣＤ４７機能を阻害又は阻止するようにターゲティングされる薬剤；及び化学療法薬又は抗癌剤である薬剤と組み合わせる。この組合せは、薬剤、より具体的には、抗ＣＤ４７抗体と、化学療法薬、例えばアントラサイクリン、白金、タキソール、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、及びアルキル化剤からなる化学療法薬クラスとの１つ又は複数の組合せを用いて提供することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「併用療法」は、対象を２つ以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬）に対して同時に曝露する状況を指す。一部の実施形態では、２種以上の薬剤を同時に投与してもよいし：一部の実施形態では、こうした薬剤は、順序投与してもよく；一部の実施形態では、こうした薬剤は、重複投与レジメンで投与される。
本明細書で使用されるとき、用語「相乗的」又は「相乗効果」は、組み合わせた場合にそれらの個別の効果の和よりも大きい効果を生み出すような２種以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬）の相互作用を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「相加的」又は「相加効果」は、組み合わせて用いた場合にそれらの個別の効果の和と同じ総合効果を生み出すような２種以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬）の相互作用を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍」は、悪性又は良性にかかわらず、あらゆる腫瘍細胞成長及び増殖、並びにあらゆる前癌及び癌性細胞と前癌及び癌性組織を指す。
用語「癌」、「癌性」、及び「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、互いに限定的ではない。
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には異常細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指すか、又は記述する。癌の例として、限定されないが、癌腫、リンパ腫（すなわち、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。こうした癌の具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜若しくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、白血病及びその他のリンパ増殖性障害、並びに多様なタイプの頭部及び頚部癌が挙げられる。
用語「感受性癌」は、本明細書で使用されるとき、その細胞が、ＣＤ４７を発現し、且つ本開示の抗体若しくはその抗原結合断片、又は競合抗体若しくはその抗原結合断片による治療に対して応答性である癌を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」又は「治療する」又は「治療」とは、徴候、症状、障害、病状、若しくは疾患の進行又は重症度を遅延、阻止、停止、制御、停止、低減、若しくは逆転させることを意味するが、必ずしも全ての疾患関連の徴候、症状、病状、若しくは障害の排除を意味するわけではない。用語「治療する（こと）」などは、発症開始後の疾患又は病状の徴候若しくは症状を改善する治療介入を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、患者又は臓器に対する１若しくは複数用量の投与時に、所望される治療若しくは予防をもたらす本開示の抗体化合物の量又は用量を指す。
任意の特定の対象に対する正確な有効量は、その大きさ及び健康状態、その病状の性質及び程度、並びに投与するために選択された治療薬又は治療薬の組合せに応じて変動する。所与の患者の有効量は、常用の実験により決定され、これは、臨床医の判断で行われる。本開示の抗体化合物の治療有効量はまた、摘出された臓器又は患者に投与される１用量当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量を含み得る。公知の抗体系薬剤は、これに関してガイダンスを提供する。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入により投与され、その場合、初期負荷投与が４ｍｇ／ｋｇ体重、毎週の維持投与が２ｍｇ／ｋｇ体重であり；Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）は、例えば、毎週３７５ｍｇ／ｍ２で投与される。
任意の個別患者に対する治療有効量は、腫瘍退縮、循環腫瘍細胞、腫瘍幹細胞又は抗腫瘍応答に対する抗体化合物の作用をモニターすることによって、医療提供者が決定することができる。これらの方法で得られたデータの解析によって、療法中の治療レジメンの変更が可能になり、その結果、単独で若しくは互いに組み合わせて、又は別の治療薬と組み合わせて、或いはその両方で使用されるかにかかわらず、本開示の抗体化合物の最適量が投与され、しかも、同様に治療期間も決定することができる。このようにして、投薬／治療レジメンを療法の過程で変更することでき、その結果、満足な効果を示す、単独で若しくは組み合わせて使用される最も低い量の抗体化合物が投与され、しかも、そうした化合物の投与は、患者の治療に成功するのに必要な期間だけ継続される。公知の抗体系薬剤は、例えば、薬剤が、毎日、毎週、毎月などで投与されるべきかにかかわらず、投与頻度に関するガイダンスを提供している。頻度及び投与量は、症状の重症度に応じても変動し得る。
一部の実施形態では、本開示の抗体化合物は、ヒト及び動物医療における薬剤として使用することができ、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、心室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、腫瘍内、鼻内、腸内、舌下、膣内、小胞内又は直腸経路を含む様々な経路により投与される。組成物はまた、腫瘍などの病変に直接投与することもできる。投薬治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールのいずれであってもよい。さらに、医薬組成物を投与するために、Ｈｙｐｏスプレーを使用してもよい。典型的には、治療組成物は、溶液又は懸濁液の何れかの形態で、注射液として調製することができる。また、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態を調製することもできる。獣医学適用には、ネコ及びイヌなどのコンパニオン／ペット動物；盲導犬若しくは介助犬、及びウマなどの使役動物；ウマ及びイヌなどの競技動物；霊長類、ライオン及びトラなどのネコ科動物、クマなどを含む動物園動物；並びに飼育されている他の有用な動物の治療が含まれる。
こうした医薬組成物は、当技術分野において公知の方法により調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい。また、医薬組成物は、本明細書に開示される１つ又は複数の抗体化合物、及び薬学的若しくは獣医学的に許容される、例えば、生理学的に許容される、担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
本開示は、個別の機能プロフィールを有する抗ＣＤ４７ｍＡｂを記載する。これらの抗体は、以下から選択される特性の異なる組合せを有する：これらの抗体は、以下から選択される特性の異なる組合せを有する：１）ＣＤ４７の１種若しくは複数種のホモログと交差反応性を示す；２）ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰα同士の相互作用を阻止する；３）ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する；４）感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する；５）ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導しない；６）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して低い結合、若しくは最小結合を有さない；７）ｈＲＢＣに対して低い結合を有する；８）ｈＲＢＣに対して最小結合を有する；９）ｈＲＢＣの低い凝集を起こす；１０）ｈＲＢＣの検出可能な凝集を引き起こさない；１１）一酸化窒素（ＮＯ）経路のＴＳＰ１阻害を逆転させる；１２）ＮＯ経路のＴＳＰ１阻害を逆転させない；１３）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす；１４）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こさない；１５）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす；１６）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こさない；１７）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こす；１８）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こさない；１９）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こす；２０）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こさない；２１）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こす；２２）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こさない；２３）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こす；２４）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こさない；２５）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす；２６）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こさない；２７）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こす；２８）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こさない；２９）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こす；３０）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こさない；３１）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有する；３２）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有さない；３３）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有する；３４）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有さない；並びに３５）ヒト腫瘍細胞によるアネキシンＡ１放出の増大を引き起こす。
本開示の抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合断片は、従来技術の抗ＣＤ４７抗体とは異なる特性の組合せを有する。これらの特性及び特徴について、これからさらに詳しく説明する。本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＣＤ４７に結合する」は、例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイ又はセルベースアッセイにおいて、５０ｎＭを超える見かけＫｄで結合することを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「見かけ結合親和性及び見かけＫｄ」は、様々な抗体濃度で、結合データの非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）により決定される。
様々な種のＣＤ４７への結合
本開示の抗ＣＤ４７抗体、及びその抗原結合断片は、ヒトＣＤ４７に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、１種又は複数種のＣＤ４７のホモログ、例えば、非ヒト霊長類由来のＣＤ４７ホモログと交差反応性を示す。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＣＤ４７抗体、及びその抗原結合断片は、ヒトＣＤ４７、並びに非ヒト霊長類、マウス、ラット、及び／又はウサギ由来のＣＤ４７に結合する。他の種のホモログとの交差反応性は、治療用抗体の開発及び試験に特に有用となり得る。例えば、治療用抗体の前臨床毒性試験は、限定されないが、カニクイザル、ミドリザル、アカゲザル及びリスザルをはじめとする、非ヒト霊長類種で実施されることが多い。従って、これらの種のホモログとの交差反応性は、臨床候補としての抗体の開発にとって特に有用となり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ４７の１種又は複数種のホモログと交差反応する」とは、５０ｎＭを超える見かけＫｄで結合することを意味する。
ＣＤ４７とＳＩＲＰα同士の相互作用の阻止及び食作用の促進
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られるＣＤ４７は、細胞外Ｎ末端ＩｇＶドメイン、５膜通過貫膜ドメイン、及び代替的にスプライシングされている短いＣ末端細胞内テールから構成される５０ｋＤａの細胞表面受容体である。
２つのリガンドが、ＣＤ４７：シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）及びトロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）に結合する。ＴＳＰ１は、血漿中に存在し、血小板をはじめとする多くの細胞により合成される。ＳＩＲＰαは、造血細胞上に発現され、こうした細胞として、マクロファージ及び樹状細胞がある。
食細胞上のＳＩＲＰαが標的細胞上のＣＤ４７に結合すると、この相互作用は、標的細胞の食作用を防止する。ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用は、実際に「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルを食細胞に送る（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２０５１－２０５４，２０００）。治療に際して、抗ＣＤ４７ｍＡｂによりＳＩＲＰαとＣＤ４７の相互作用を阻止すれば、宿主の免疫系による癌細胞の取り込み及びクリアランスを促進することによって、有効な抗癌治療を提供することができる。従って、いくつかの抗ＣＤ４７ｍＡｂの重要な機能的特性は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用を阻止して、マクロファージによるＣＤ４７発現腫瘍細胞の食作用を達成する能力である。いくつかの抗ＣＤ４７ｍＡｂが、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用を阻止することがわかっており、例えば、以下のものが挙げられる：Ｂ６Ｈ１２（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９４：３６３３－３６４３，１９９９；Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５４７－２５５４，２００１；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０７：２５４８－２５５６，２００６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７：１００２８－１００３６，２００２；Ｒｅｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５：１８２－１９３，２００５）、ＢＲＩＣ１２６（Ｖｅｒｎｏｎ－Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２１３０－２１３７，２０００；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０７：２５４８－２５５６，２００６）、ＣＣ２Ｃ６（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９４：３６３３－３６４３，１９９９）、及び１Ｆ７（Ｒｅｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５：１８２－１９３，２００５）。また、Ｂ６Ｈ１２及びＢＲＩＣ１２６も、ヒト及びマウスマクロファージによるヒト腫瘍細胞の食作用を引き起こすことが明らかにされている（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（１７）：６６６２－６６６７，２０１２；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４２：６９９－７１３，２０１２；欧州特許第２ ２４２ ５１２ Ｂ１号明細書）。２Ｄ３などの他の既存の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用を阻止せず（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９４：３６３３－３６４３，１９９９；Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２５４７－２５５４，２００１；Ｒｅｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５：１８２－１９３，２００５）、腫瘍細胞の食作用を引き起こさない（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（１７）：６６６２－６６６７，２０１２；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４２：６９９－７１３，２０１２；欧州特許第２ ２４２ ５１２ Ｂ１号明細書）。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止する」とは、非処置の細胞又は陰性抗体で処置した細胞の何れかと比較して、抗ＣＤ４７ｍＡｂによる細胞上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰα－ＦＣの結合の５０％超の低減を意味する。
本明細書に記載される開示の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用を阻止して、ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する。
癌細胞の「食作用」は、マクロファージによるこうした細胞の貪食及び消化、並びにこれらの癌細胞の最終的な消化又は分解、並びにさらなるプロセシングに付すための消化又は分解細胞成分の細胞外、若しくは細胞内への放出を指す。ＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、癌細胞のマクロファージ食作用を増大する。そうでなければ、癌細胞上のＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合は、これらの細胞が、マクロファージ食作用を免れることを可能にするであろう。癌細胞は、生存能を有するか、又は生存癌細胞であり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する」とは、非処置の細胞又は陰性抗体で処置した細胞の何れかと比較して、抗ＣＤ４７ｍＡｂの存在下でヒトマクロファージによるヒト腫瘍細胞の食作用の２倍超の増大を意味する。
腫瘍細胞の細胞死の誘導
いくつかの可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂは、腫瘍細胞上のＣＤ４７に結合すると細胞死プログラムを開始し、その結果、ミトコンドリア膜電位崩壊、ＡＴＰ生成能力の喪失、ホスホファチジルセリンの細胞表面発現の増大（アネキシンＶについての染色増加により検出される）及びカスパーゼの参加若しくはＤＮＡの断片化なしでの細胞死を引き起こす。このような可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂは、様々な固形及び血液癌を治療する可能性がある。いくつかの可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂが、腫瘍細胞死を誘導することがわかっており、例えば、ＭＡＢＬ－１，ＭＡＢＬ－２及びその断片（米国特許第８，１０１，７１９号明細書；Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．１７：１１８９－９４，２００７；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４），Ａｄ２２（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７０３１－７０４０，１９９９；Ｌａｍｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３９１５－２３９２１，２００３）、並びに１Ｆ７（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－３５５３，２００３；Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１０２６－１０３６，２００４）が挙げられる。ＭＡＢＬ－１、ＭＡＢＬ－２及びそれらの断片、Ａｄ２２及び１Ｆ７の以前の分析では、関連する手法を用いて、これらの抗ＣＤ４７ｍＡｂにより誘導されたアポトーシス及び細胞死を決定した。ＭＡＢＬ ｓｃＦＶ－１５二量体がＣＤ４７陽性細胞のアポトーシスを誘導したことを実証するために、フローサイトメトリーにより、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色が、いずれも早期（アネキシンＶ＋、ＰＩ－）及び後期（アネキシンＶ＋、ＰＩ＋）に評価された（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４）。Ａｄ２２が、アポトーシス（アネキシンＶ＋、ＰＩ－）及び死滅（アネキシンＶ＋、ＰＩ＋）細胞双方の増加を誘導したことを証明するために、同様の手法が使用された（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６２：７０３１－７０４０，１９９９）。１Ｆ７によるアポトーシスの誘導は、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ＋細胞を分析することによって評価された（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－３５５３，２００３；Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１０２６－１０３６，２００４）。本明細書に記載される本開示の抗ＣＤ４７ｍＡｂのいくつかは、ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する。
アポトーシスの間、原形質膜の外葉に対するホスファチジルセリン曝露が広く観察されるため、これが、アポトーシス細胞死を検出するためのアネキシンＶ結合アッセイの根拠である。一部の系では、ホスファチジルセリン曝露及びアネキシンＶ陽性は、可逆性である；即ち、一部のアネキシンＶ＋細胞は生存可能であり、増殖を再開して、リン脂質対称を再構築し得ることに留意すべきである（Ｈａｍｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５１：１６－２１，１９９９）。７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）は、ＤＮＡとの結合時にスペクトルシフトを被る蛍光インターカレータである。生存細胞は、７－ＡＡＤを排除するインタクトな膜を有するが、死滅又はアポトーシス細胞は、７－ＡＡＤを排除しない。
用語「細胞死を誘導する（こと）」又は「殺傷する」などは、本明細書では置き換え可能に使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する」は、抗ＣＤ４７ｍＡｂによる処置に応答して、増大したアネキシンＶの結合（カルシウムの存在下で）及び増大した７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）又はヨウ化プロピジウム取り込みを指す。これらの特徴は、３つの細胞集団：アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）及びアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）においてフローサイトメトリーにより定量され得る。細胞死の誘導は、負の対照抗体、（ヒト化、アイソタイプ適合抗体）又は非処置細胞で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによりもたらされる、ヒト腫瘍細胞における上記細胞集団の各々の２倍を超える増加によって定義される。
細胞死の別の指標は、いくつかの入手可能な尺度（ＤｉＯ－Ｃ６若しくはＪＣ１などの電位差測定蛍光色素又はＭＴＴ若しくはＷＳＴ－１などのホルマザンベースアッセイ）の１つによって検定される腫瘍細胞によるミトコンドリア機能及び膜電位の喪失である。
本明細書で使用されるとき、用語「ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす」とは、負の対照抗体、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによるミトコンドリア膜電位の統計的に有意な（ｐ＜０．０５以上）低下を意味する。
細胞死の誘導とは、本明細書に開示される可溶性抗ＣＤ４７抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はその抗原結合断片（並びに競合抗体及びその抗原結合断片）のいくつかが、補体又は他の細胞、例えば、限定されないが、Ｔ細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、若しくは樹状細胞の参加なしに、細胞自律機構を介して癌細胞を殺傷する能力を指す。
本開示のヒト化又はキメラｍＡｂのうち、ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導するものは、抗ＣＤ４７ｍＡｂＡｄ２２（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４９３１－４９４２，２００１；Ｌａｍｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３９１５－２３９２１，２００３）；１Ｆ７（Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－３５５３，２００３；Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：１０２６－１０３６，２００４）；並びにＭＡＢＬ－１及び２（米国特許第７，５３１，６４３Ｂ２号明細書；米国特許第７，６９６，３２５Ｂ２号明細書；米国特許第８，１０１７１９Ｂ２号明細書）について報告されている知見と同様に、アネキシンＶ結合の増加をもたらす。
細胞生存能アッセイは、ＮＣＩ／ＮＩＨガイダンスマニュアルに記載されており、これは、ＣＤ４７抗体によって引き起こされる細胞死の誘導を評価するために使用することができる多様な細胞ベースのアッセイを記載している：“Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ”，Ｔｅｒｒｙ Ｌ Ｒｉｓｓ，ＰｈＤ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ Ｍｏｒａｖｅｃ，ＢＳ，Ａｎｄｒｅｗ Ｌ Ｎｉｌｅｓ，ＭＳ，Ｈｅｌｅｎｅ Ａ Ｂｅｎｉｎｋ，ＰｈＤ，Ｔｒａｃｙ Ｊ Ｗｏｒｚｅｌｌａ，ＭＳ，ａｎｄ Ｌｉｓａ Ｍｉｎｏｒ，ＰｈＤ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２０１３年５月１日出版。
ｈＲＢＣとの結合
ＣＤ４７は、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に発現される（Ｂｒｏｗｎ．Ｊ ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１１：２７８５－２７９４，１９９０；Ａｖｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，（１９８８）２５１：４９９－５０５；Ｋｎａｐｐ．Ｂｌｏｏｄ，（１９８９）Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．４，１４４８－１４５０；Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８１８：４８１－４９０，２０１２；Ｐｅｔｒｏｖａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１）。抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＲＢＣに結合することがわかっており、そうしたものとして、以下：Ｂ６Ｈ１２（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８１８：４８１－４９０，２０１２，Ｐｅｔｒｏｖａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１）、ＢＲＩＣ１２５（Ａｖｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，（１９８８）２５１：４９９－５０５）、ＢＲＩＣ１２６（Ａｖｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，（１９８８）２５１：４９９－５０５；Ｐｅｔｒｏｖａ Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１）、５Ｆ９（Ｕｇｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；７４（１９ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ５０１１，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｓｅｐ ２１；１０（９）：ｅ０１３７３４５；Ｓｉｋｉｃ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；３４（ｓｕｐｐｌ； ａｂｓｔｒａｃｔ ３０１９））、米国特許出願公開第２０１４／０１６１７９９号明細書、国際公開第２０１４／０９３６７８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３６３４４２号明細書に開示される抗ＣＤ４７抗体、並びにＣＣ２Ｃ６（Ｐｅｔｒｏｖａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１，Ｕｇｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；７４（１９ Ｓｕｐｐｌ：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ５０１１；Ｐｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３：１０６８－１０７９，２０１７）が挙げられる。また、ヒトＣＤ４７に結合するＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質は、他のヒト細胞と比較して、ヒトＲＢＣには低い結合を有することもわかっている（Ｕｇｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；７４（１９ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ５０１１）。ＲＢＣとの結合は、ただ１つのＣＤ４７結合アームを有する二重特異性抗体の作製によって低減することができる（Ｍａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ２４８２）。一部の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、カニクイザルに投与すると、ＲＢＣの減少を引き起こすことが判明したため（Ｍｏｕｎｈｏ－Ｚａｍｏｒａ Ｂ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｓｔ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５；１４４（１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ５９６：１２７，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｓｅｐ ２１；１０（９）：ｅ０１３７３４５；Ｐｉｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ２４７０）、ＣＤ４７発現ＲＢＣに結合しない抗ＣＤ４７ｍＡｂを同定することが極めて望ましい。
本明細書で使用されるとき、用語「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ（ｓ））」及び「赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ（ｓ））」は同意語であり、本明細書では置き換え可能に使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「ｈＲＢＣに対する低い結合」は、ヒト腫瘍細胞に関する見かけＫｄに比して１０倍以上の、ｈＲＢＣに対する抗ＣＤ４７ｍＡｂ結合の見かけＫｄを指し、ここで、腫瘍細胞は、ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞（ヒトＣＤ４７を発現するヒトＯＶ１０卵巣癌細胞株）である。
本明細書で使用されるとき、用語「結合がない」又は「ＮＢ」は、５０μｇ／ｍｌ以下の抗ＣＤ４７ｍＡｂ濃度でｈＲＢＣに対する測定可能な結合がないことを指す。
本明細書に記載される開示以前に、ＣＤ４７を発現するヒトＲＢＣに結合しない抗ＣＤ４７ｍＡｂは、報告されていない。
本明細書に開示される抗ＣＤ４７ｍＡｂの中には、ヒトＲＢＣへの結合が低いか、又は検出可能な結合がないものもある。
ヒト内皮細胞及び他の正常ヒト細胞に対する結合
大部分の血液悪性疾患及び固形腫瘍上での発現／過剰発現（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１２）以外にも、ＣＤ４７は、全てではないが多くの正常細胞型によっても発現され、そうしたものとして、限定されないが、ＲＢＣ（前セクションを参照）、リンパ球及び単核細胞、内皮細胞、及び脳、肝、筋肉細胞並びに／又は組織が挙げられる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１９９５；Ｍａｔｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２００９；Ｓｔｅｆａｎｉｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００８；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１５）。この発現のために、一部の抗ＣＤ４７ｍＡｂは、治療標的である癌細胞以外に、これらの正常細胞型／組織にも結合すると考えられる。従って、これらの正常細胞の一部に結合しないか、又はそれらに対する結合が低いか、何れかの抗ＣＤ４７ｍＡｂを見出すことにより、これらの正常細胞に対する不要な潜在的作用を低減すると共に、より多くの利用可能な抗体を腫瘍細胞と結合させることが望ましい。
本明細書で使用されるとき、用語「限定はされないが、内皮細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、末梢血単核細胞又はＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、正常ヒト細胞に対する低い結合」は、ヒト腫瘍細胞に対する抗ＣＤ４７ｍＡｂ結合の見かけＫｄよりも１０倍以上高い、これらの細胞に対する抗ＣＤ４７ｍＡｂ結合の見かけＫｄを指し、ここで、腫瘍細胞は、ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞である。
本明細書で使用されるとき、用語「結合がない」又は「ＮＢ」とは、限定はされないが、３０μｇ／ｍｌ以下の抗ＣＤ４７ｍＡｂ濃度で、内皮細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、末梢血単核細胞又はＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、正常ヒト細胞に対する測定可能な結合がないことを意味する。
ＲＢＣの凝集
赤血球（ＲＢＣ）凝集又は血球凝集は、ＲＢＣが、ＲＢＣ抗原に対する抗体及びＣＤ４７などの細胞表面タンパク質をはじめとする様々な物質とのインキュベーション後に、凝集する、又は互いに凝集するとき起こる同型相互作用である。多くの抗ＣＤ４７抗体は、濃度依存的に、単離されたヒトＲＢＣの血球凝集をインビトロで引き起こすことが報告されており、例えば、Ｂ６Ｈ１２、ＢＲＩＣ１２６、ＭＡＢＬ－１、ＭＡＢＬ－２、ＣＣ２Ｃ６、及び５Ｆ９（Ｕｇｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；７４（１９ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ５０１１、米国特許第９，０４５，５４１号明細書、Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．１７：１１８９－９４，２００７；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４；Ｓｉｋｉｃ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；３４（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒａｃｔ ３０１９））が含まれる。この機能的効果は、インタクトな二価抗体によるＲＢＣへの結合を必要とし、抗体断片、すなわち、Ｆ（ａｂ’）又はｓｖＦｖの何れか（Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．１７：１１８９－９４，２００７；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４）又はただ１つのＣＤ４７結合アームを有する二重特異性抗体（Ｍａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５； ７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ２４８２）を作製することにより低減若しくは排除することができる。細胞殺傷をはじめとするこれらの断片の他の機能的特性は、これらの断片において低下するか、又は保持されるかの何れかであることがわかっている（Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．１７：１１８９－９４，２００７；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４）。マウス抗体２Ｄ３は、赤血球上のＣＤ４７に結合する抗ＣＤ４７抗体の一例であるが、血球凝集を引き起こさない（米国特許第９，０４５，５４１号明細書、Ｐｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１）。
血球凝集は、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質を用いて、他の細胞ではなく、選択的にヒトＲＢＣとの結合を低減することにより、低減／排除されることが立証されている（Ｕｇｅｒ Ｒ． ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２（２１）：３９３５）。さらに、マウス抗ＣＤ４７ｍＡｂ２Ａ１及び２Ａ１のヒト化バージョンは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαを阻止することが報告されているが、血球凝集活性を呈示しない（米国特許第９，０４５，５４１号明細書）。マウス抗ヒトＣＤ４７抗体の集団のうち少数（２３のうち３つ）は、ヒトＲＢＣの血球凝集を引き起こさないことが報告された（Ｐｉｅｔｓｃｈ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ２４７０）。従って、本明細書に記載される開示以前に、ＳＩＲＰαＤ４７結合を阻止し、ＲＢＣに対する検出可能な結合がないか、若しくは低く、且つ／又は血球凝集を引き起こさないＣＤ４７ｍＡｂを同定する必要があった。用語「凝集」は、細胞の凝集を指すが、用語「血球凝集」は、特定の細胞のサブセット、すなわち、ＲＢＣの凝集を指す。このように、血球凝集は、１タイプの凝集である。
本明細書で使用されるとき、用語「少ない血球凝集」は、洗浄したＲＢＣアッセイにて１．８５μｇ／ｍｌ超の抗ＣＤ４７ｍＡｂ濃度での測定可能なｈＲＢＣの凝集活性、及び１．８５μｇ／ｍｌ以下の濃度で測定可能な活性がないことを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能な血球凝集がない」は、洗浄したＲＢＣアッセイにて０．３ｐｇ／ｍＬ以上で、５０μｇ／ｍＬ以下の抗ＣＤ４７ｍＡｂ濃度でｈＲＢＣの測定可能な凝集活性がないことを指す。
本明細書に記載される抗ＣＤ４７の一部は、ヒトＲＢＣの少ない血球凝集を引き起こすか、又は検出可能な血球凝集を引き起こさない。
免疫原性細胞死
免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の概念は、近年出現した。この形態の細胞死は、非免疫原性細胞死とは異なり、癌細胞由来の抗原に対する免疫応答を刺激する。ＩＣＤは、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン及びミトキサントロン）並びにオキサリプラチンなどの特定の化学療法薬により誘導されるが、シスプラチンやその他の化学療法薬では誘導されない。ＩＣＤはまた、ボルテゾミブ、強心性配糖体、光線力学療法及び放射線によっても誘導される（Ｇａｌｌｕｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７： ９７－１１１，２０１６）。腫瘍細胞のＩＣＤに特有の特徴は、以下の通り、腫瘍細胞表面からの特定のリガンドの放出又は腫瘍細胞表面での曝露である：１）カルレティキュリンのアポトーシス促進性細胞表面曝露、２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の分泌、３）高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出、４）アネキシンＡ１放出、５）１型インターフェロン放出及び６）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出。これらのリガンドは、内在性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）であり、細胞死関連分子（ＣＤＡＭ）を含む（Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：５１－７２，２０１３）。重要なことには、ＩＣＤの間に誘導されるこれらのリガンドの各々が、パターン認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれる特定の受容体に結合し、これらが、抗腫瘍免疫応答に寄与する。ＡＴＰは、樹状細胞上のプリン受容体：ＰＹ２、Ｇタンパク質結合、２（Ｐ２ＲＹ２）及びＰＸ２、リガンド依存性イオンチャネル、７（Ｐ２ＲＸ７）に結合して、それぞれ樹状細胞動員及び活性化を引き起こす。アネキシンＡ１は、樹状細胞上のホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）に結合して、樹状細胞ホーミングを引き起こす。腫瘍細胞の表面上に発現されるカルレティキュリンは、樹状細胞上のＬＲＰ１（ＣＤ９１）に結合して、樹状細胞による抗原取り込みを促進する。ＨＭＧＢ１は、樹状細胞上のトール様受容体４（ＴＬＲ４）に結合して、樹状細胞成熟を引き起こす。ＩＣＤの構成要素として、腫瘍細胞は、Ｉ型インターフェロンを放出して、Ｉ型インターフェロン受容体を介したシグナル伝達、並びにエフェクターＣＸＣＬ３＋Ｔ細胞の動員を促進するＣＸＣＬ１０の放出をもたらす。総合すると、それぞれの受容体に対するこれらのリガンドの作用は、腫瘍中へのＤＣの動員、ＤＣによる腫瘍抗原の貪食及びＴ細胞に対する最適な抗原提示を促進する。Ｋｒｏｅｍｅｒらは、ＩＣＤにより誘発される前述のＣＤＡＭの正確な組合せが、抗腫瘍免疫応答の活性化を通常妨げている機構を解消し得ると提唱している（Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：５１－７２，２０１３；Ｇａｌｌｕｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：９７－１１１，２０１６）。ＩＣＤ誘導様式によりインビトロで処置したマウス腫瘍細胞を同系マウスにインビボで投与すれば、これらは、メモリーを含め、抗腫瘍適応免疫応答をもたらす有効なワクチン接種を提供する。このワクチン接種効果は、これらの試験で使用されるマウスには完全な免疫系が欠如しているため、異種移植腫瘍モデルでは試験することができない。入手可能なデータは、化学療法薬又は放射線により誘導されるＩＣＤ効果が、癌患者において適応抗腫瘍免疫応答を促進するであろうことを示している。以下にＩＣＤの構成要素についてさらに詳しく説明する。
２００５年、アントラサイクリン化学療法薬にインビトロで応答して死滅した腫瘍細胞は、アジュバントの非存在下、インビボで投与されると有効な抗腫瘍免疫応答を引き起こしたと報告された（Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：１６９１１７０１，２００５）。この免疫応答は、同じ腫瘍の生存細胞による後の再攻撃からマウスを防御し、定着腫瘍の退縮を引き起こした。アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシン）並びにミトマイシンＣは、カスパーゼ活性化により腫瘍細胞のアポトーシスを誘導したが、アントラサイクリンによって誘導されるアポトーシスだけが、免疫原性細胞死を招いた。カスパーゼの阻害は、ドキソルビシンによって誘導される細胞死を阻害しなかったが、ドキソルビシンに応答して死滅する腫瘍細胞の免疫原性を抑制した。ドキソルビシンで処置されたアポトーシス腫瘍細胞により誘発される免疫応答における樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な役割は、これらの細胞が欠失すると、免疫応答がインビボで消失したことの実証により証明された。
カルレティキュリンは、小胞体（ＥＲ）中の最も豊富なタンパク質の１つである。カルレティキュリンは、アントラサイクリンをはじめとする複数のＩＣＤ誘導剤に応答して高速でＥＲ内腔から癌細胞表面へとアポトーシス促進的に移動することが明らかにされた（Ｏｂｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１３：５４－６１，２００７；Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：５１－７２，２０１３）。カルレティキュリンの遮断又はノックダウンは、樹状細胞によるアントラサイクリン処置腫瘍細胞の食作用を抑制し、マウスにおけるそれらの免疫原性を消失させた。アントラサイクリン又はオキサリプラチンによりもたらされるカルレティキュリンの曝露は、ＥＲストレス応答により活性化され、この応答は、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼによる真核翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を伴う。カルレティキュリンは、「イートミー（ｅａｔ－ｍｅ）」シグナル（Ｇａｒｄａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １２３：３２１－３３４，２００５）としての重要な機能を有し、樹状細胞及びマクロファージ上のＬＲＰ１（ＣＤ９１）に結合して、カルレティキュリン発現細胞が、ＣＤ４７など、ドントイートミー（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）シグナルを発現しない限り、カルレティキュリン発現細胞の食作用を引き起こす。カルレティキュリンはまた、抗原提示細胞上のＣＤ９１を介してシグナル伝達を行うことにより、炎症性サイトカインの放出を起こすと共に、Ｔｈ１７細胞応答をプログラムする。要約すると、免疫原性細胞死の一部として発現されるカルレティキュリンは、抗原提示細胞を刺激して、死滅細胞を貪食し、それらの抗原をプロセシングして、免疫応答をプライミングする。
カルレティキュリンのほかに、Ｅｒｐ５７とも呼ばれるタンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）も、ミトキサントロン、オキサリプラチンによる処置、及びＵＶＣ光線の照射後、ＥＲから腫瘍細胞の表面に移動することがわかっている（Ｐａｎａｒｅｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１５：１４９９－１５０９，２００８；Ｐａｎａｒｅｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＬ Ｊ．２８：５７８－５９０，２００９）。アントラサイクリン、ドキソルビシン及びイダルビシンによる処置後、ヒト卵巣癌細胞株、原発性卵巣癌細胞、及びヒト前立腺癌細胞株は、細胞表面カルレティキュリン、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０を発現した（Ｆｕｃｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：４８２１－４８３３，２０１１）。ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０は、抗原提示細胞上のＰＲＲ ＬＲＰ１に結合し；ＰＤＩＡ３が結合するＰＲＲは見出されていない（Ｇａｌｌｕｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：９７－１１１，２０１６）。
ＴＬＲ４は、死滅腫瘍細胞のクロスプレゼンテーションのために必要であり、腫瘍抗原プロセシング及び提示を制御することが明らかにされた。ＴＬＲ４に結合して、これを刺激することがわかっているタンパク質の中でも、ＨＭＧＢ１は、放射線照射又はドキソルビシンによりＩＣＤが誘導されたマウス腫瘍細胞によって唯一放出された（Ａｐｅｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：１０５０－１０５９，２００７）。マウス腫瘍細胞のドキソルビシン処置によるインビボ抗腫瘍免疫の極めて効率的な誘導は、ＨＭＧＢ１の阻害及びノックアウトＴＬＲ４による免疫応答の無効化によって実証される通り、ＨＭＧＢ１及びＴＬＲ４の存在を必要とした。これらの前臨床知見は、臨床的に意義がある。ＴＬＲ４機能喪失型対立遺伝子を有する乳癌患者は、放射線療法及び化学療法の後、正常ＴＬＲ４対立遺伝子を有する患者よりも急速に再発する。
Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉらは、オキサリプラチン、ドキソルビシン及びミトキサントロンによりインビトロで処置されたマウス腫瘍細胞が、ＡＴＰを放出したこと、並びにＡＴＰが、樹状細胞上のプリン受容体：ＰＹ２、Ｇタンパク質結合、２（Ｐ２ＲＹ２）及びＰＸ２、リガンド依存性イオンチャネル、７（Ｐ２ＲＸ７）に結合することを証明した（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １５：１１７０－１１７８，２００９）。ＡＴＰがＤＣ上のＰ２ＲＸ７に結合すると、ＮＯＤ様受容体ファミリー、ピリンドメイン含有３タンパク質（ＮＬＲＰ３）依存性カスパーゼ－１活性化複合体（インフラマソーム）をトリガーして、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）の分泌を可能にするが、これは、死滅腫瘍細胞によるインターフェロンγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングに不可欠である。従って、ＤＣによるＡＴＰ誘発性ＩＬ－１β産生は、免疫系が、免疫原性因子として特定の化学療法薬により誘導された細胞死を認識するための重要な因子の１つであると思われる。この論文はまた、ＴＬＲ４アゴニストにおけるＨＭＧＢ１もまた、ＤＣ中のＮＬＲＰ３インフラマソームの刺激、及びＩＬ－１βの分泌に寄与することを報告している。これらの前臨床結果は、臨床関連性を有することが証明されており；乳癌コホートにおいて、Ｐ２ＲＸ７機能喪失型対立遺伝子の存在は、無転移生存率に有意なマイナスの予後影響を有した。ＡＴＰがＰ２ＲＹ２に結合すると、腫瘍微小環境への骨髄細胞の動員を引き起こす（Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１１１８６００，２０１６）。
Ｍｉｃｈａｕｄらは、化学療法誘導細胞死の免疫原性のためにオートファジーが必要であることを実証した（Ｍｉｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４：１５７３－１５７７，２０１１）。死滅腫瘍細胞からのＡＴＰの放出は、オートファジーを必要とし、オートファジーコンピテントであるが、オートファジー欠失ではないマウス腫瘍は、ＩＣＤを誘導する化学療法に応答して、樹状細胞及びＴリンパ球を腫瘍微小環境中に誘引した。
Ｍａらは、どのようにして化学療法誘導細胞死が、Ｔ細胞への効果的な抗原提示をもたらすのかという疑問に取り組んだ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８：７２９－７４１，２０１３）。彼らは、特定の種類の腫瘍浸潤リンパ球で、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ細胞が、アントラサイクリンによる抗癌免疫応答の誘導のために特に重要であることを見いだした。死滅癌細胞により放出されたＡＴＰは、骨髄細胞を腫瘍中に動員して、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ細胞の局所分化を刺激した。これらの細胞は、腫瘍細胞抗原を捕捉し、呈示すると共に、ナイーブマウスへの養子免疫伝達後に、同じ細胞株の生存腫瘍細胞による攻撃に対して防御を付与する上で特に効果的であることが証明された。
アントラサイクリンは、ＴＬＲ３の活性化後の腫瘍細胞によるＩ型インターフェロンの迅速な産生を刺激することがわかっている（Ｓｉｓｔｕｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０：１３０１－１３０９，２０１４）。Ｉ型インターフェロンは、癌細胞上のＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β受容体に結合して、オートクリン及びパラクリンシグナル伝達経路をトリガーし、これによりＣＸＣＬ１０放出をもたらす。Ｔｌｒ３又はＩｆｎａｒが欠如した腫瘍は、それぞれＩ型ＩＦＮ又はＣＸＣＬ１０が供給されない限り、化学療法に応答することはできなかった。これらの前臨床知見は、臨床的意義を有する。Ｉ型ＩＦＮ遺伝子発現シグネチャーにより、乳癌患者の独立したコホートにおいてアントラサイクリンベースの化学療法に対する臨床応答が予測された。
化学療法誘導性抗癌免疫応答に関与する樹状細胞上の別の受容体：ホルミルペプチド受容体－１が近年見出され、これは、アネキシンＡ１に結合する（Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：９７２－９７８，２０１５）。Ｖａｃｃｈｅｌｌｉらは、化学療法に対する応答にマイナスに作用する候補遺伝子異常を見出すためのスクリーンを設計した。彼らは、アジュバント化学療法を受けている乳癌及び大腸癌患者において低い無転移生存率及び全生存率と関連するホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）をコードする遺伝子の機能喪失型対立遺伝子を見出した。アントラサイクリンの治療効果は、抗腫瘍免疫障害のために腫瘍担持Ｆｐｒ１－／－マウスでは無効化された。ＦＰＲ１－欠失ＤＣは、死滅腫瘍細胞に接近しなかったため、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を誘発することができなかった。２つのアントラサイクリン、即ち、ドキソルビシンとミトキサントロンは、ＦＰＲ１の４つの既知リガンドの１つであるアネキシンＡ１の分泌を刺激した。ＦＰＲ１とアネキシンＡ１は、死滅癌細胞とヒト又はマウス白血球同士の安定した相互作用を促進した。
アントラサイクリン、及びオキサリプラチン以外に、他の薬物が、免疫原性細胞死を誘導することが明らかにされている。臨床で使用されるジゴキシン及びジギトキシンを含む強心性配糖体も、腫瘍細胞の免疫原性細胞死の効果的な誘導剤であることが判明した（Ｍｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４：１４３ｒａ９９，２０１２）。ＤＡＭＰ発現又は放出を誘導することが報告されている他の化学療法薬及び癌治療薬は、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、パクリタキセル、ボリニスタット及びシスプラチンである（Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８８：１－２４，２０１５；Ｍｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４：１４３ｒａ９９，２０１２；Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３０：１１４７－１１５８，２０１１）。重要なことに、これらの結果は臨床的意義を有する。化学療法の間にジゴキシンを投与すると、乳癌、大腸癌、頭部及び頸部癌、並びに肝細胞癌を有する患者の全生存率に有意にプラスの影響をもたらしたが、肺癌及び前立腺癌患者の全生存率を改善することはできなかった。
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブは、多様なＢ細胞悪性疾患の転帰を改善した。リツキシマブ（Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂと呼ばれる）の成功は、オビヌツズマブ及びトシツモマブをはじめとするＩＩ型ＣＤ２０ｍＡｂの開発につながった。Ｃｈｅａｄｌｅらは、抗ＣＤ２０ｍＡｂによる免疫原性細胞死の誘導を検証した（Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１６２：８４２－８６２，２０１３）。彼らは、オビヌツズマブ及びトシツモマブにより誘導される細胞死が、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ９０及びＡＴＰの放出を特徴とする免疫原性細胞死の１形態であることを見出した。Ｉ型抗ＣＤ２０ｍＡｂは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ９０及びＡＴＰの放出を起こさなかった。オビヌツズマブで処置したヒト腫瘍細胞株からの上清のインキュベーションは、ヒト樹状細胞の成熟をもたらしたが、これは、樹状細胞に対するＨＭＧＢ１及びＡＴＰの以前記載されている作用と一致する。Ｃｈｅａｄｌｅらにより報告された結果とは対照的に、Ｚｈａｏらは、Ｉ及びＩＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂの両方が、ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株からのＨＭＧＢ１放出を増大したが、ＡＴＰの放出又はカルレティキュリンの細胞表面発現は引き起こさなかったと報告した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６：２７８１７－２７８３１，２０１５）。
抗ＣＤ４７ｍＡｂに応答した、ＤＡＭＰカルレティキュリン、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、アネキシンＡ１、Ｉ型インターフェロン放出、ＣＸＣＬ１０、ＰＤＩＡ３、ＨＳＰ７０及び／又はＨＳＰ９０の腫瘍細胞表面からの放出又は腫瘍細胞表面上の曝露は報告されていない。本明細書に開示されるように、抗ＣＤ４７ｍＡｂは、上に挙げたＤＡＭＰ（ＩＣＤの特徴）の腫瘍細胞表面からの放出又は腫瘍細胞表面上の曝露を引き起こし、これは予想外の結果である。これらのＤＡＭＰは、治療に有益な適応抗腫瘍免疫応答を促進することが予想される。ＤＡＭＰ放出／発現を引き起こす抗ＣＤ４７ｍＡｂと、免疫原性細胞死効果をもたらす化学療法薬との組合せによって、何れか単独での場合よりも優れた治療利益が達成され得る。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞による細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす」とは、負の対照抗体、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによるカルレティキュリン発現の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、用語「の放出」は、分泌と同義であり、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、アネキシンＡ１、Ｉ型インターフェロン及びＣＸＣＬ１０の細胞外出現として定義される。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸の放出の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによって引き起こされる上清中のＡＴＰの統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１の放出の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによって引き起こされる上清中のＨＭＧＢ１の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロンの放出の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによって引き起こされる上清中のＩ型インターフェロン又はＩ型インターフェロンｍＲＮＡの統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）の放出の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによって引き起こされる上清中のＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１０ｍＲＮＡの統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞による細胞表面ＰＤＩＡ３発現の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによるＰＤＩＡ３発現の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞による細胞表面ＨＳＰ７０発現の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによるＨＳＰ７０発現の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
本明細書で開示されるように、「ヒト腫瘍細胞による細胞表面ＨＳＰ９０発現の増大を引き起こす」とは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体又は非処置で得られたバックグラウンドと比較して、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによるＨＳＰ９０発現の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０５以上）を意味する。
抗ＣＤ４７ｍＡｂ結合のｐＨ依存性
特に血液コンパートメント中で、正常細胞に対するほとんどの抗体結合は、生理的ｐＨ（ｐＨ７．２～７．４）で起こる。従って、治療ｍＡｂの結合親和性は、通常、生理的ｐＨのインビトロで評価される。しかし、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、本質的により酸性であり、ｐＨ値は７．０未満である。これは、乳酸の生成及びＡＴＰの加水分解を招く低酸素症、嫌気的解糖を含むいくつかの違いに起因すると思われる（Ｔａｎｎｏｃｋ ａｎｄ Ｒｏｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００６；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｐａｇｅｌ，Ａｄｖａｎ Ｒａｄｉｏｌ ２０１５）。酸性ｐＨは、侵入性、転移挙動、長期的オートファジー、化学療法薬に対する耐性並びに腫瘍微小環境における免疫細胞の効力低下を促進することにより、腫瘍に利点をもたらし得る（Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１３；Ｗｏｊｔｋｏｗｉａｋ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６；Ｂａｒａｒ，ＢｉｏＩｍｐａｃｔｓ，２０１２）。しかし、酸性ｐＨで高い結合親和性の特性を有する抗ＣＤ４７抗体を同定すれば、正常細胞と比較して酸性のＴＭＥ内の腫瘍細胞上のＣＤ４７との結合を高めるという治療利点がもたらされるであろう。ｐＨ依存性を有する抗体は、抗体再利用を目的として、作製されている。しかし、酸性ｐＨでの結合を増大するという特性を呈示するのとは対照的に、これらは、生理的ｐＨでそれらの標的抗原と高い親和性で結合するが、酸性ｐＨではその標的を放出する（Ｂｏｎｖｉｎ ｅｔ ａｌ，ｍＡｂｓ ２０１５；Ｉｇａｗａ ａｎｄ Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１４）。
本明細書で開示されるように、「生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨでＣＤ４７に対し高い親和性を有する」とは、生理的ｐＨ（７．２～７．４）と比較してより酸性ｐＨ（＜７．２）で５倍以上増大した見かけＫｄを指す。
機能的特性の組合せ
本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体のいくつかの実施形態は、さらに、ヒトの治療での使用に提案される従来技術の抗ＣＤ４７抗体により呈示されない特性の組合せも特徴とする。従って、本明細書に記載される抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないこと
を特徴とする。
本明細書に記載されるさらに別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の少ない凝集を引き起こすこと
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に特異的に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導すると共に；
ｅ．低いｈＲＢＣ結合を有すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないと共に；
ｅ．ｈＲＢＣに対して最小結合を有すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、以下：
ａ．ヒトＣＤ４７に特異的に結合し、
ｂ．ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し、
ｃ．ヒト腫瘍細胞の食作用を増大し、
ｄ．ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないと共に；
ｅ．低いｈＲＢＣ結合を有すること
を特徴とする。
本明細書に記載される別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、及びラットＣＤ４７に結合する。
本明細書に記載されるまた別の実施形態では、モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、非ヒト霊長類ＣＤ４７にも特異的に結合し、ここで、非ヒト霊長類としては、限定されないが、カニクイザル、ミドリザル、アカゲザル及びリスザルが挙げられる。
本明細書に記載される一実施形態では、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、以下に挙げる特性の１つ又は複数をさらに有し得る：１）ＣＤ４７の１種若しくは複数種のホモログと交差反応性を示す；２）ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰα同士の相互作用を阻止する；３）ヒト腫瘍細胞の食作用を増大する；４）感受性ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導する；５）ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導しない；６）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して低い結合、若しくは最小結合を有さない；７）ｈＲＢＣに対して低い結合を有する；８）ｈＲＢＣに対して最小結合を有する；９）ｈＲＢＣの低い凝集を起こす；１０）ｈＲＢＣの検出可能な凝集を引き起こさない；１１）一酸化窒素（ＮＯ）経路のＴＳＰ１阻害を逆転させる；１２）ＮＯ経路のＴＳＰ１阻害を逆転させない；１３）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす；１４）ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こさない；１５）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす；１６）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こさない；１７）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こす；１８）ヒト腫瘍細胞によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出の増大を引き起こさない；１９）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こす；２０）ヒト腫瘍細胞による高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）放出の増大を引き起こさない；２１）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こす；２２）ヒト腫瘍細胞によるＩ型インターフェロン放出の増大を引き起こさない；２３）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こす；２４）ヒト腫瘍細胞によるＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）放出の増大を引き起こさない；２５）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす；２６）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼＡ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こさない；２７）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こす；２８）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現の増大を引き起こさない；２９）ヒト腫瘍細胞上の細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こす；３０）ヒト腫瘍細胞上での細胞表面熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）発現の増大を引き起こさない；３１）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有する；３２）限定はされないが、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、及び末梢血単核細胞（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、及びヒト末梢血単核細胞）を含む、正常ヒト細胞に対して低い結合を有さない；３３）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有する；３４）生理的ｐＨと比較して酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対し、より高い親和性を有さない；並びに３５）ヒト腫瘍細胞によるアネキシンＡ１放出の増大を引き起こす。
一部の実施形態では、以下：ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片が提供され、ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、細胞上のＣＤ４７に対してｐＨ依存的結合を呈示する。他の実施形態では、本開示は、以下：ヒトＣＤ４７に結合し；ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止し；ヒト腫瘍細胞の食作用を増大すると共に；ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片が提供され、ここで、前記モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、正常細胞に対して低い結合を呈示する。一部の実施形態では、こうした抗体が結合し得る細胞は、本明細書に記載する任意の細胞型であってよい。他の実施形態では、本明細書に記載するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、本開示に記載される特徴の任意の組合せを呈示しうる。例えば、モノクローナル抗体は、ｐＨ依存的結合及び細胞に対する低い結合の両方を呈示し得る。これらの細胞は、内皮細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、ＰＢＭＣ又はＲＢＣ（例えば、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト尿細管上皮細胞、ヒト末梢血ＣＤ３＋細胞、ヒト末梢血単核細胞若しくはヒトＲＢＣ）であってよい。こうした特徴は、個別に、又は本明細書に記載される任意の組合せで呈示されてもよい。本明細書で使用されるとき、本開示の抗体のｐＨ依存的結合とは、抗体に対し特定のｐＨで改変された結合、例えば、酸性ｐＨで高い結合親和性を呈示する抗体を指す。
ＣＤ４７抗体
多くのヒトの癌は、ＣＤ４７の細胞表面発現を上方調節するため、最も高いレベルのＣＤ４７を発現する癌が、最も攻撃的で、患者の致死率が最も高いと思われる。増大したＣＤ４７発現は、ＣＤ４７担持細胞の食作用を妨げる阻害受容体であるＳＩＲＰαを介してマクロファージに「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルを送ることにより、食作用によるクリアランスから癌細胞を保護すると考えられる（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：２０５１－２０５４，２０００；Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ １３８（２）：２７１－８５ｌ；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（６３）：６３ｒａ９４）。従って、多くの癌によるＣＤ４７発現の増大は、癌に「利己主義」の口実を与え、これが、マクロファージ及び樹状細胞による食作用によるそれらのクリアランスを遅らせる。
ＣＤ４７を阻止し、ＳＩＲＰαとの結合を妨げる抗体は、マウス（異種移植片）腫瘍モデル中のヒト腫瘍において効果を示している。この特性を呈示するこうした阻止抗ＣＤ４７ｍＡｂは、マクロファージによる癌細胞の食作用を増大し、これによって、腫瘍負荷を低減することができる（Ｍａｊｅｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ １３８（２）：２８６－９９；米国特許第９，０４５，５４１号明細書；Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９（１７）：６６６２－６６６７；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６０：３０２－３０９；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １４２：６９９－７１３；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２６：２５３８－２５４５）。
抗ＣＤ４７ｍＡｂはまた、インビボで腫瘍に対する適応免疫応答を促進することも明らかにされている（Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＮＡＳ １１０（２７）：１１１０３－１１１０８；Ｓｏｔｏ－Ｐａｎｔｏｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（２３）：６７７１－６７８３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．２１（１０）：１２０９－１２１５）。
しかしながら、抗ＣＤ４７ｍＡｂが形質転換細胞を攻撃することができる機構があり、それらは、癌の治療にまだ利用されていない。多くのグループが、特定の抗ヒトＣＤ４７ｍＡｂがヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導することを明らかにしている。抗ＣＤ４７ｍＡｂ Ａｄ２２は、複数のヒト腫瘍細胞株の細胞死を誘導する（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４９３１－４９４２，２００１；Ｌａｍｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３９１５－２３９２１，２００３）。ＡＤ２２は、早期のホスファチジルセリン曝露及びミトコンドリア膜電位の降下によって、急速なミトコンドリア不全及び急速な細胞死を誘導することがわかっている（Ｌａｍｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３９１５－２３９２１，２００３）。抗ＣＤ４７ｍＡｂ ＭＡＢＬ－２及びその断片は、インビトロで、ヒト白血病細胞株の細胞死を誘導するが、正常細胞の細胞死は誘導せず、インビボ異種移植片モデルでは、抗腫瘍効果を有した（Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００７）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１７ （５）：１１８９－９４）。抗ヒトＣＤ４７ｍＡｂ １Ｆ７は、ヒトＴ細胞白血病（Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－５３）及び複数の乳癌（Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４（３）：１０２６－３６）の細胞死を誘導する。１Ｆ７は、補体の作用、又はＮＫ細胞、Ｔ細胞、若しくはマクロファージによる細胞媒介性殺傷なしで、ＣＤ４７担持腫瘍細胞を殺傷する。その代わり、抗ＣＤ４７ｍＡｂ １Ｆ７は、ミトコンドリアへの直接のＣＤ４７依存的攻撃を伴う非アポトーシス機構を介して作用し、その膜電位を放出させ、細胞のＡＴＰ生成能力を破壊することにより、急速な細胞死を引き起こす。抗ＣＤ４７ｍＡｂ １Ｆ７が、やはりＣＤ４７を発現する静止白血球を殺傷せず、形質転換により「活性化」される細胞だけを殺傷することは注目に値する。このように、正常な循環細胞（その多くが、ＣＤ４７を発現する）は、殺傷を免れるが、癌細胞は、腫瘍傷害性ＣＤ４７ｍＡｂにより選択的に殺傷される（Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－５３）。この機構は、単にＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合を阻止することによって食作用を起こす受動的機構とは対照的に、腫瘍細胞に対する率先した、選択的且つ直接的攻撃として考えることができる。重要なことには、ｍＡｂ １Ｆ７は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合も阻止する（Ｒｅｂｒｅｓ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５：１８２－１９３，２００５）ことから、２つの機構：（１）直接の腫瘍毒性、及び（２）癌細胞の食作用の発生によって作用することができる。両方の機能を達成することができる単一ｍＡｂは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合だけを阻止するものより優れていると考えられる。
癌の治療に抗ＣＤ４７ｍＡｂを利用することができる別の機構は、抗腫瘍免疫応答の促進によるものである。抗ＣＤ４７ｍＡｂが、腫瘍細胞にＤＡＭＰを放出させ、これが、ＤＣの成熟、活性化及びホーミング、並びにＴ細胞の誘引を引き起こすという発見は、抗ＣＤ４７ｍＡｂ治療を、治療に望ましい抗腫瘍免疫応答の発生と関係付けるものである。抗ＣＤ４７ｍＡｂは、これまでに、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、アネキシンＡ１、Ｉ型インターフェロン及びＣＸＣＬ１０の腫瘍細胞放出、並びにカルレティキュリン、ＰＤＩＡ３、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０の腫瘍細胞発現を引き起こすことが明らかにされている。
組織虚血期間の後、血流の開始は、「虚血再灌流傷害」若しくは「ＩＲＩ」と呼ばれる損傷を引き起こす。ＩＲＩは、一定の時間にわたり血流を停止する必要があったためにＩＲＩが起こる様々な外科的処置において、治療介入により血流が止められ、後に回復される外傷の様々な形態／原因において、並びに臓器移植、心臓／肺バイパス手術、切断身体部分の再付着、再建及び美容手術、並びに血流の停止及び再開を伴う他の状況などに必要な処置において、予後不良に寄与する。虚血自体は、様々な生理学的変化を引き起こし、それ自体で、最終的には細胞及び組織壊死、ひいては死を招く。再灌流は、活性酸素種の発生、血栓症、炎症及びサイトカイン媒介性損傷をはじめとする、それ自体の一連の損傷事象を引き起こす。ＴＳＰ１－ＣＤ４７系により制限される経路は、ＮＯ経路をはじめとする、ＩＲＩの損傷に取り組む上でまさに最も有益なものである。このように、本明細書に開示される抗体を用いるなどしてＴＳＰ１－ＣＤ４７経路を阻止すれば、これらの内在性保護経路のより頑健な機能状態がもたらされるであろう。抗ＣＤ４７ｍＡｂは、腎温虚血（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２３：１５３８－１５５０，２０１２）、肝虚血再灌流傷害（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４４：７５２－７６１，２００８）、腎移植（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．９８：３９４－４０１，２０１４；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒａｎｔｉｏｎａｌ．９０：３３４－３４７，２０１６））及び脂肪肝をはじめとする肝移植（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ．２１：４６８－４７７，２０１５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１００：１４８０－１４８９，２０１６）のげっ歯類モデルにおいて臓器損傷を軽減することが立証されている。さらに、抗ＣＤ４７ｍＡｂは、肺動脈高血圧のモノクロタリンモデルにおいて、右心室収縮期圧及び右心室肥大の有意な軽減をもたらした（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．９３：６８２－６９３，２０１２）。皮膚弁モデルの研究は、抗ＣＤ４７ｍＡｂを用いるなどしたＣＤ４７のモジュレーションが、ＴＳＰ１媒介性ＣＤ４７シグナル伝達を阻害することを証明した。これによって、ＮＯ経路の活性が増大し、ＩＲＩの軽減をもたらした（Ｍａｘｈｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ．１２４：１８８０－１８８９，２００９；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２７：２５８２－２５８８，２００７；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．９：８３３－８４１，２００８；Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ．２４７：１８０－１９０，２００８）
また、抗ＣＤ４７ｍＡｂは、他の心血管疾患のモデルにおいて効果的であることもわかっている。圧負荷左心室心不全のマウス大動脈縮窄モデルにおいて、抗ＣＤ４７ｍＡｂは、心筋肥大を軽減し、左心室線維症を低減し、左心室重量の増加を予防し、心室硬度を低下させると共に、圧容積ループプロフィールの変化を正常化した（Ｓｈａｒｉｆｉ－Ｓａｎｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．，２０１４）。抗ＣＤ４７ｍＡｂは、複数のマウスモデルにおいて動脈硬化を改善した（Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．，２０１６）。
癌適用
限定されないが、下記を含む感受性血液癌及び固形腫瘍を有する患者に好ましくは非経口的に投与することができる癌治療薬として有効な抗ＣＤ４７ｍＡｂ及びその抗原結合断片が本明細書に開示される：全身性肥満細胞症、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍、単球性白血病、及びプラズマ細胞白血病をはじめとする白血病；多発性骨髄腫（ＭＭ）；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）；ホジキンリンパ腫、並びに例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）ＮＨＬなどの非ホジキンリンパ腫をはじめとする、組織球性リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫；卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌（大腸癌）、直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌（非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、気管支癌、骨癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌（肝臓癌、肝癌）、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、腎細胞癌、甲状腺癌、頭部及び頚部の扁平上皮癌（頭部及び頚部癌）、精巣癌、内分泌腺癌、副腎腺癌、脳下垂体癌、皮膚癌、軟組織の癌、血管の癌、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌、中咽頭癌、下咽頭癌、子宮頸癌、及び子宮癌、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽細胞腫、骨髄異形成症候群などの固形腫瘍、並びに限定されないが、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、及び軟骨肉腫などの肉腫；並びに黒色腫。
癌の治療
当業者には公知のように、単剤療法又は処置が、疾患若しくは病状を治療する、又は治癒させる上で十分でない場合もあることから、癌治療には往々にして併用療法が使用される。従来の癌治療は、多くの場合、相加若しくは相乗効果を達成するための手術、放射線治療、細胞傷害性薬物の組合せの投与、並びにこれらのアプローチの何れか若しくは全部の組合せを含む。特に有用な化学療法及び生物学的療法の併用では、様々な作用機構を介して機能する薬物を使用して、癌細胞の制御若しくは殺傷を増大し、癌細胞の成長を制御する免疫系の能力を増大し、療法中の薬物耐性の可能性を低減すると共に、個々の薬物の低用量の使用を可能にすることによって、考えられる毒性の重複を最小限にする。
本方法に包含される併用療法に有用な抗癌、抗腫瘍、及び抗新生物薬のクラスは、例えば、以下：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｌ．Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｂ．Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ，ａｎｄ Ｂ．Ｃ．Ｋｎｏｌｌｍａｎｎ Ｅｄｓ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，“Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ６０－６３，ｐｐ．１６６５－１７７０，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹに開示されており、例えば、アントラサイクリン、白金、タキソール、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、及びアルキル化剤、天然産物、多種多様な薬剤、ホルモン及びアンタゴニスト、標的薬、モノクローナル抗体並びにその他のタンパク質治療薬が挙げられる。
上記に加えて、本開示の方法は、癌適用の治療に関し、手術、放射線により、及び／又は限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸治療薬をはじめとする、腫瘍状態を治療するために通常使用されているか、若しくは現在開発中の化学小分子又は生物学的製剤を有効量で、そうした治療が必要な患者に投与することによって、患者を治療することをさらに含む。これは、本明細書に開示されるもの以外に、抗体及び抗原結合断片、サイトカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡが挙げられる。
本明細書に開示され、請求される治療法は、本明細書に開示される抗体を単独で、及び／又は互いに組み合わせて、及び／又はＣＤ４７に結合する本開示のその抗原結合断片と一緒に、及び／又は適切な生物／治療活性を呈示する競合抗体と一緒に使用すること、並びに例えば最大の治療効果を達成するためのこれらの抗体化合物のあらゆる組合せの使用を含む。
さらに、本開示の治療方法は、これらの抗体、その抗原結合断片、競合抗体及びそれらの組合せと、具体的な適用について所望の治療効果を達成するために適切に組み合わせた（１）手術、放射線、抗腫瘍薬、抗悪性腫瘍薬、抗癌剤及びこれらの何れかの組合せから選択される何れか１種若しくは複数種の抗腫瘍薬治療、又は（２）何れか１種若しくは複数種の抗腫瘍生物剤、又は（３）当業者には明らかな（１）若しくは（２）の何れかの同等物との併用も包含する。
腫瘍抗原に対するＴ細胞応答に影響を与える共刺激若しくは阻害相互作用をモジュレートすることによって癌への免疫応答を増大する抗体及び小分子薬物（免疫チェックポイントの阻害剤及び共刺激分子のモジュレータなど）もまた、本開示に包含される併用療法に関して特に有利であり、このようなものとして、限定されないが、他の抗ＣＤ４７抗体がある。ＣＤ４７タンパク質に結合する治療薬、例えば、ＣＤ４７に結合して、ＣＤ４７及びＳＩＲＰα同士の相互作用を防止する抗体又は小分子の投与を患者に投与すると、食作用による癌細胞のクリアランスが起こる。ＣＤ４７タンパク質に結合する治療薬は、限定はされないが、以下：ＣＤ７０（クラスター分類７０）、ＣＤ２００（ＯＸ－２膜糖タンパク質、クラスター分類２００）、ＣＤ１５４（クラスター分類１５４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、クラスター分類４０リガンド）、ＣＤ２２３（リンパ球活性化遺伝子３、ＬＡＧ３、クラスター分類２２３）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質、活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体、ＡＩＴＲ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８）、ＣＤ２８（クラスター分類２８）、ＣＤ４０（クラスター分類４０、Ｂｐ５０、ＣＤＷ４０、ＴＮＦＲＳＦ５、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５、ｐ５０）、ＣＤ８６（Ｂ７－２、クラスター分類８６）、ＣＤ１６０（クラスター分類１６０、ＢＹ５５、ＮＫ１、ＮＫ２８）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ、クラスター分類２５８、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１４、ＴＮＦＳＦ１４、ＨＶＥＭＬ、ＨＶＥＭリガンド、ヘルペスウイルスエントリーメディエータリガンド、ＬＴｇ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４、ヘルペスウイルスエントリーメディエータ、クラスター分類２７０、ＬＩＧＨＴＲ、ＨＶＥＡ）、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳリガンド、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド、クラスター分類２７５）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７ホモログ３、クラスター分類２７６）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）、Ｂ７－Ｈ４（Ｂ７ホモログ４、ＶＴＣＮ１、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１）、ＧＩＴＲＬ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体－リガンド、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲリガンド）、４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド）、ＣＤ３（クラスター分類３、Ｔ３Ｄ）、ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα、クラスター分類２５、インターロイキン－２受容体α鎖、ＩＬ－２受容体α鎖）、ＣＤ４８（クラスター分類４８、Ｂリンパ球活性化マーカ、ＢＬＡＳＴ－１、シグナル伝達リンパ球活性化分子２、ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ６６ａ（Ｃｅａｃａｍ－１、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１、胆汁糖タンパク質、ＢＧＰ、ＢＧＰ１、ＢＧＰＩ、クラスター分類６６ａ）、ＣＤ８０（Ｂ７－１、クラスター分類８０）、ＣＤ９４（クラスター分類９４）、ＮＫＧ２Ａ（ナチュラルキラー群２Ａ、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＤメンバー１、ＫＬＲＤ１）、ＣＤ９６（クラスター分類９６、ＴＡｃｔＩＬＥ、Ｔ細胞活性化増大後期発現）、ＣＤ１１２（ＰＶＲＬ２、ネクチン、ポリオウイルス受容体関連２、ヘルペスウイルスエントリーメディエータＢ、ＨＶＥＢ、ネクチン－２、クラスター分類１１２）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ、コロニー刺激因子１受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、Ｍ－ＣＳＦＲ、クラスター分類１１５）、ＣＤ２０５（ＤＥＣ－２０５、ＬＹ７５、リンパ球抗原７５、クラスター分類２０５）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１、クラスター分類２２６、ＤＮＡＸ補助分子－１、ＰＴＡ１、血小板及びＴ細胞活性化抗原１）、ＣＤ２４４（クラスター分類２４４、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、ＣＤ２６２（ＤＲ５、ＴｒａｉｌＲ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、クラスター分類２６２、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２、ＴＲＩＣＫＢ、ＺＴＮＦＲ９、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫ２Ｂ）、ＣＤ２８４（トール様受容体－４、ＴＬＲ４、クラスター分類２８４）、ＣＤ２８８（トール様受容体－８、ＴＬＲ８、クラスター分類２８８）、ＴＮＦＳＦ１５（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１５、血管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＩ、ＴＬ１Ａ）、ＴＤＯ２（トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ、ＴＰＨ２、ＴＲＰＯ）、ＩＧＦ－１Ｒ（１型インスリン様増殖因子）、ＧＤ２（ジシアロガングリオシド２）、ＴＭＩＧＤ２（貫膜及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＲＧＭＢ（ＲＧＭドメインファミリー、メンバーＢ）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶ－ドメイン免疫グロブリン含有抑制物質、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７ホモログ５）、ＢＴＮＬ２（ブチロフィリン様タンパク質２）、Ｂｔｎ（ブチロフィリンファミリー）、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭ）、シグレック（Ｓｉｇｌｅｃ）（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）、ニューロフィリン（Ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ）、ＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＩＬＴファミリー（ＬＩＲ、免疫グロブリン様転写物ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体）、ＮＫＧファミリー（ナチュラルキラー群ファミリー、Ｃ型レクチン貫膜受容体）、ＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ）、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）、ＳＴＩＮＧ経路（インターフェロン遺伝子経路の刺激因子）、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）（アルギニンアミジナーゼ、カナバナーゼ、Ｌ－アルギナーゼ、アルギニントランスアミジナーゼ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ）、及びＨＨＬＡ２（Ｂ７－Ｈ７、Ｂ７ｙ、ＨＥＲＶ－Ｈ ＬＴＲ結合タンパク質２、Ｂ７ホモログ７）のうち１つ又は複数の別の細胞標的に対する本明細書に開示の抗体、化学小分子若しくは生物学的製剤などの治療薬と併用され、また、以下：ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１、ＰＤ－１、ＣＤ２７９、クラスター分類２７９）、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７ホモログ１、プログラム細胞死リガンド１、ＣＤ２７４、クラスター分類２７４）、ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、プログラム細胞死１リガンド２、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＣＤ２７３、クラスター分類２７３）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、ＣＤ１５２、クラスター分類１５２）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータ、ＣＤ２７２、クラスター分類２７２）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ、ＩＤＯ１）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３、ＫＩＭ－３、肝障害分子３、ＴＩＭＤ－３、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－ドメイン３）、Ａ２Ａアデノシン受容体（ＡＤＯ受容体）、ＣＤ３９（細胞外ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、クラスター分類３９、ＥＮＴＰＤ１）、並びにＣＤ７３（細胞外５’－ヌクレオチダーゼ、５’－ヌクレオチダーゼ、５’－ＮＴ、クラスター分類７３）、ＣＤ２７（クラスター分類２７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８、クラスター分類２７８、誘導性Ｔ細胞共刺激因子）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、クラスター分類１３７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４、クラスター分類１３４）、並びにＴＮＦＳＦ２５（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２５）の阻害剤も、抗体、小分子、及びアゴニストを含め、本発明で特に考慮される。さらに別の薬剤として、ＩＬ－１０（インターロイキン－１０、ヒトサイトカイン合成阻害因子、ＣＳＩＦ）及びガレクチンがある。
ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、承認された抗ＣＴＬＡ－４抗体の一例である。
ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、承認された抗ＰＤ－１抗体の一例である。
ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）（アテゾリズマブ；Ｒｏｃｈｅ）は、承認された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一例である。
ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）（アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ），Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｐｆｉｚｅｒ，ａｎｄ Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、承認された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一例である。
ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）（デュルバルマブ：Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）とＰＤ－１及びＣＤ８０（Ｂ７．１）分子との相互作用を阻止する承認されたモノクローナル抗体の一例である。
実施例１
アミノ酸配列
Figure 0007170331000001
Figure 0007170331000002
マウス軽鎖可変ドメイン
Figure 0007170331000003
マウス重鎖可変ドメイン
Figure 0007170331000004
ヒト軽鎖可変ドメイン
Figure 0007170331000005
ヒト重鎖可変ドメイン
Figure 0007170331000006
Figure 0007170331000007
Figure 0007170331000008
ヒトＩｇＧ－Ｆｃ
Figure 0007170331000009
Figure 0007170331000010
Figure 0007170331000011
ウサギＩｇＧ－Ｆｃ
Figure 0007170331000012
キメラ及びヒト軽鎖
Figure 0007170331000013
Figure 0007170331000014
Figure 0007170331000015
キメラ及びヒト重鎖
Figure 0007170331000016
Figure 0007170331000017
Figure 0007170331000018
Figure 0007170331000019
Figure 0007170331000020
Figure 0007170331000021
Figure 0007170331000022
Figure 0007170331000023
実施例２
ＣＤ４７抗体の生成
本明細書に開示されるキメラ抗体は、ヒトκ又はヒトＦｃＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、及びＩｇＧ４ ＰＥ定常ドメインとそれぞれ組み合わせた、マウス重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。これらは、分泌シグナルを組み込むように設計し、哺乳類発現系にクローニングした後、キメラ（マウス－ヒト）抗体を産生するようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。キメラ変異体は、完全長ＩｇＧ分子として発現させ、培地に分泌させた後、プロテインＡを用いて精製した。
抗体をヒト化する複数の方法が当業者には周知である。本明細書に使用されるようなこうした方法の１つは、これまでに記載されている（Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｋａｓｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｕａｎ Ｃａｒｌｏｓ Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２０１３）。このように、本明細書に開示されるヒト化抗体は、ヒトゲノムに由来するフレームワークを含む。この集団は、ヒト生殖細胞系配列に見出される多様性を含み、インビボで機能的に発現される抗体を産生する。マウス及びキメラ（マウス－ヒト）の軽鎖及び重鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）が本明細書に記載されており、これらは、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ ａｎｄ Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２００１））に開示されている一般に認められた法則により決定した。次に、ヒト軽鎖可変ドメインを設計した。続いて、ヒト化可変ドメインを分泌シグナル並びにヒトκ及びヒトＦｃＩｇＧ１、ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びＩｇＧ４ ＰＥ定常ドメインと組み合わせて、哺乳類発現系にクローニングした後、ヒト化ｍＡｂを産生するようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ヒト化変異体は、完全長ＩｇＧ分子として発現させ、培地に分泌させた後、プロテインＡを用いて精製した。
アスパラギンをグルタミンに変更する重鎖２９７位の部位指定突然変異誘発によって、非グリコシル化バージョン（ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ）を作出した（ヒトＦｃＩｇＧ１－Ｎ２９７Ｑ、配列番号５４）。セリンをプロリンに変更し、これによりインビボＦａｂアーム交換を防止するように、２２８位での部位指定突然変異誘発によって、ＩｇＧ４変異体を作出した。Ｆａｂアーム交換を妨げると共に、Ｆｃエフェクター機能をさらに低減するように、２２８位（セリンからプロリン）及び２３５位（ロイシンからグルタミン）での部位指定突然変異誘発によってＩｇＧ４二重突然変異体を作出した。ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、及びＩｇＧ４ＰＥ定常ドメインと同じフレーム内で重鎖可変ドメインをクローニングすることによって、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、及びＩｇＧ４ＰＥアイソタイプを構築した（ヒトＦｃ－ＩｇＧ２、配列番号５６；ヒトＦｃ－ＩｇＧ３、配列番号５７；ヒトＦｃ－ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、配列番号５９；ヒトＦｃ－ＩｇＧ４ＰＥ、配列番号６０）。
実施例３
ＣＤ４７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合
本開示のキメラ（マウス－ヒト）及びヒト化抗体の結合は、ヒトＣＤ４７でトランスフェクトしたＯＶ１０細胞（ＯＶ１０ｈＣＤ４７）又は新しく単離したヒト赤血球（ｈＲＢＣ）（その表面にＣＤ４７を展示する）を用いたＥＬＩＳＡにより決定した（Ｋａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．８（４）：２６０－２６６）。
細胞表面ヒトＣＤ４７を発現するヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞によるセルベースＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９キメラ（ｘｉ）並びにヒト化ｍＡｂの結合活性を決定した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；Ｓ０１５２０）を含有するＩＭＤＭ培地中で、ＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞を増殖させた。アッセイの１日前に、３×１０４個の細胞を９６ウェルセルバインドプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ♯３３００，ＶＷＲ ♯６６０２５－６２６）にプレーティングして、アッセイ時に９５～１００％密集とした。細胞を洗浄し、様々な濃度の精製抗体を９５％Ｏ２／５％ＣＯ２下、３７℃で１時間ＩＭＤＭ中に添加しインキュベートした。次に、細胞を培地で洗浄し、培地で１／２５００倍希釈したＨＲＰ標識二次抗ヒト抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に３７℃でさらに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを添加した（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｔ４４４４）。０．７ＮまでのＨＣｌの添加によって反応を停止させた後、ＴｅｃａｎモデルＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダを用いて、４５０ｎＭでの吸光度を決定する。ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞に対するこれらのクローンの見かけ結合親和性を、非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）によって決定した。
また、ｈＲＢＣ上のヒトＣＤ４７に対するキメラ及びヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ｍＡｂの結合活性も、フローサイトメトリーを用いて決定した。健常なボランティアから血液を採取し、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳ＋Ｅ）を含有するリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２で、ＲＢＣを３回洗浄した。ＰＢＳ＋Ｅ中の様々な濃度のキメラ又はヒト化抗体と一緒に、ｈＲＢＣを３７℃で６０分間インキュベートした。次に、細胞を常温ＰＢＳ＋Ｅで洗浄してから、ＰＢＳ＋Ｅ中のＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；Ｃａｔａｌｏｇｕｅ♯７０９－０９６－１４９）と一緒に氷上でさらに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋Ｅで洗浄し、Ｃ６ Ａｃｃｕｒｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて抗体結合を分析し、様々な抗体濃度で、蛍光強度中央値の非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）によって見かけ結合親和性を決定した。
ＶＬＸ４キメラ（マウス－ヒト）ｍＡｂは全て、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモル（ｐＭ）範囲の見かけ親和性で結合した（表１）。
同様に、ヒト化ＶＬＸ４ｍＡｂは、濃度依存的様式で（図１Ａ及び図１Ｂ）ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモルから低ナノモル範囲の見かけ結合親和性で結合した（表２）。
キメラＶＬＸ４ｍＡｂは全て、ヒトＲＢＣと、ピコモル範囲の見かけＫｄ値で結合し、これらは、ＥＬＩＳＡによりＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞について得られたＫｄ値と類似していた（表１）。
ヒト化ＶＬＸ４ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥは、ＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞について得られた値と類似するＫｄ値で、ヒトＲＢＣと結合したが、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥは、ｈＲＢＣに対して低い結合を示した（図２Ａ、図２Ｂ、及び表２）。ＶＬＸ４ ＩｇＧ４ＰＥキメラｍＡｂは、腫瘍及びＲＢＣ ＣＤ４７の双方と、同様の見かけＫｄ値で結合した（表１）ため、腫瘍細胞及びＲＢＣに対するヒト化ｍＡｂの結合の差は予想外であった。
表１に示すように、ＶＬＸ８キメラｍＡｂは全て、濃度依存的様式で、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモル（ｐＭ）範囲の見かけ親和性で結合した。
同様に、ヒト化ＶＬＸ８ｍＡｂは、濃度依存的様式で（図３Ａ及び図３Ｂ）ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモル範囲の見かけ親和性で結合した（表２）。
ＶＬＸ８キメラｍＡｂは全て、ｈＲＢＣと、ピコモル範囲の見かけＫｄ値で結合し、これらの値は、ＥＬＩＳＡによりＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞について得られた見かけＫｄ値と類似していた（表１）。
ＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０５ ＩｇＧ４ ＰＥ、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８並びにＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２ ＩｇＧ２は、ＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞について得られた値と類似するＫｄ値で、ヒトＲＢＣと結合したが、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥは、ｈＲＢＣに対し、より低い結合を示した（図４Ａ、図４Ｂ、及び表２）。ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥキメラｍＡｂは、腫瘍細胞及びＲＢＣ ＣＤ４７の両方と、同様の見かけＫｄ値で結合した（表１）ため、腫瘍細胞及びＲＢＣに対するヒト化ｍＡｂの結合の差は予想外であった。
表１は、ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７細胞及びヒトＲＢＣに対するＶＬＸ９キメラｍＡｂの見かけ結合親和性を示す。キメラｍＡｂは全て、ＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモル範囲の見かけ結合定数で結合した。同様に、ヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂは、濃度依存的様式で（図５Ａ及び図５Ｂ）ヒトＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞と、ピコモルからナノモル範囲の見かけ親和性で結合した（表２）。
ＶＬＸ９キメラｍＡｂは全て、ｈＲＢＣと、ピコモル範囲の見かけＫｄ値で結合し、これらは、ＥＬＩＳＡによりＯＶ１０ｈＣＤ４７腫瘍細胞について得られた見かけＫｄ値と類似していた（表１）。キメラｍＡｂとは対照的に、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２は、ヒトＲＢＣに対して低い結合を示した（図７、表２）。対照的に、ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０５ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ２は、５，０００ｐＭ以下のＲＢＣに対して測定可能な結合を全く示さなかった（表２）。ＶＬＸ９ ＩｇＧ２キメラｍＡｂは全て、腫瘍及びＲＢＣ ＣＤ４７の両方と、同様の見かけＫｄ値で結合した（表１）ため、腫瘍細胞及びＲＢＣに対するヒト化ｍＡｂの結合の差は予想外であった。
Ｊｕｒｋａｔ野生型及びＪｕｒｋａｔＣＤ４７ノックアウト（ＫＯ）細胞を用いて、ＣＤ４７ヒト化ｍＡｂの特異的な結合が実証された。Ｊｕｒｋａｔ野生型及びＪｕｒｋａｔＣＤ４７ ＫＯ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；Ｓ０１５２０）を含有するＲＰＭＩ培地中で増殖させた。細胞を洗浄してから、１×１０４個の細胞を培地に再懸濁させ、５％ＣＯ２下、様々な濃度の抗体と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄してから、５％ＣＯ２下、３７℃で１時間かけて、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ標識、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，１０９－０９５－００３）中に１：１０００で再懸濁させた。次に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄してから、１×ＰＢＳ中に再懸濁させた。フローサイトメトリーにより蛍光強度中央値を決定し、非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）によって見かけ結合親和性を決定した。
図６に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ（図６Ａ）及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２（図６Ｂ）は、ＣＤ４７を発現するＪｕｒｋａｔ細胞と結合したが、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ４７ＫＯ細胞との結合は観察されない。
Figure 0007170331000024
Figure 0007170331000025
Figure 0007170331000026
フローサイトメトリーを用いて、ヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ｍＡｂの異種間結合を決定した。リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳ＋Ｅ）の溶液中の様々な濃度のヒト化抗体と一緒に、マウス、ラット、ウサギ又はカニクイザルＲＢＣを３７℃で６０分間インキュベートした。次に、細胞を常温ＰＢＳ＋Ｅで洗浄してから、ＰＢＳ＋Ｅ中のＦＩＴＣ標識ロバ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；カタログ＃７０９－０９６－１４９）と一緒に氷上でさらに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋Ｅで洗浄し、Ｃ６ Ａｃｃｕｒｉ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて抗体結合を分析した。
表３は、様々な抗体濃度で、蛍光強度中央値の非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）によって決定したマウス、ラット、及びカニクイザル由来のＲＢＣに対するヒト化ＶＬＸ４及びＶＬＸ８ｍＡｂの見かけ結合親和性を示す。このデータは、ヒト化ＶＬＸ４及びＶＬＸ８ｍＡｂが、マウス、ラット、ウサギ（データを示していない）又はカニクイザルＲＢＣと、ピコモルからナノモル範囲の見かけＫｄ値で結合することを明らかにしている。
Figure 0007170331000027
実施例４
表面プラズモン共鳴によって決定されるヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂの結合
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上の表面プラズモン共鳴により、組換えヒトＨｉｓ－ＣＤ４７に対する可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂの結合をインビトロで測定した。抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、フローセル１及び２上のＣＭ５チップに連結したアミンである。ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動バッファー（ｐＨ７．２）で希釈したヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２又はＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２をフローセル２上で捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動バッファー（ｐＨ７．２）で希釈した０～１０００ｎＭＨｉｓタグ付きヒトＣＤ４７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、接触時間１８０秒及び解離時間３００秒でマルチサイクルカイネティクスを測定した。結合曲線の速度論的解析のために、１：１結合モデルを使用した。ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２についての結合速度、解離速度及び解離定数を表４に示す。
Figure 0007170331000028
実施例５
抗ＣＤ４７ｍＡｂの異なる結合
本明細書に記載する一部の可溶性ＣＤ４７抗体は、正常細胞に対し結合が異なることが明らかにされている。この選択性結合の更なる特性は、等しい親和性で正常細胞及び腫瘍細胞と結合するｍＡｂと比較して、利点を有することが予想される。このような低い結合を有する抗ＣＤ４７ｍＡｂは、記載されていない。
可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによる結合をインビトロで測定する。ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂの結合活性は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）、ヒト骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｌ）、ヒト尿細管上皮細胞（ＲＴＥＣ）、ＣＤ３＋細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について、フローサイトメトリーによる結合アッセイを用いて決定した。ＨＡＥＣ、ＳｋＭＣ、ＨＭＶＥＣ－Ｌ及びＲＴＥＣ細胞は、Ｌｏｎｚａから購入し、製造者の推奨事項に従って培養した。アクターゼを用いて、付着細胞を培養フラスコから除去し、推奨培地に再懸濁させ、１×１０４個の細胞を様々な濃度の抗体と一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。非付着細胞の場合、１×１０４個の細胞を推奨培地に再懸濁させ、様々な濃度の抗体と一緒に３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄してから、３７℃、５％ＣＯ２で１時間かけて、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＦＩＴＣ標識、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，１０９－０９５－００３）中に１：１０００で再懸濁させた。
ＰＢＭＣをフィコール勾配により単離し、ＰＢＳで希釈した様々な濃度の抗体の添加の直前に、製造者の推奨事項に従って、ＦｃＲ遮断剤（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と一緒に４℃で１０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と同時に添加したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ３抗体（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＣＤ３細胞を検出した。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、抗体結合をフローサイトメトリーにより評価した。
図８Ａに示すように、ＶＬＸ４及びＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂはＨＡＥＣ細胞と結合したが、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂは、腫瘍細胞と比較して、ＨＡＥＣに対する結合が低いか、又は最小であった（表５）。ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂはまた、腫瘍細胞に対する結合と比較して、ＳｋＭＣ細胞に対して低い結合（図８Ｂ）、ＨＭＶＥＣ－Ｌ細胞に対して低いか、又は最小の結合（図８Ｃ）、ＲＰＴＥＣ細胞に対して低い結合（図８Ｄ）を示した（表５）。ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂの低い結合はまた、腫瘍細胞と比較して、ＣＤ３＋細胞（図８Ｅ）及びＰＢＭＣ（図８Ｆ）に対しても観察された（表５）。この選択性結合は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
Figure 0007170331000029
実施例６
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂのｐＨ依存的及び非依存的結合
本明細書に記載する一部の可溶性ＣＤ４７抗体は、生理的ｐＨと比較して、高い親和性で酸性ｐＨの腫瘍細胞に結合することが明らかにされている。この付加的な特性は、一部には腫瘍微小環境の酸性性質のために、酸性及び生理的ｐＨのいずれでもＣＤ４７に同様の親和性で結合するｍＡｂと比較して、利点を有することが予想される（Ｔａｎｎｏｃｋ ａｎｄ Ｒｏｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００６；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｐａｇｅｌ，Ａｄｖａｎ Ｒａｄｉｏｌ ２０１５）。
固定化組換えヒトＣＤ４７及び細胞に発現されたヒトＣＤ４７に対する可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによる結合をインビトロで測定した。組換えＣＤ４７とのインビトロ結合のために、Ｈｉｓ－ＣＤ４７（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を高結合マイクロタイタープレートに４℃で一晩吸着させた。ウェルを洗浄し、ｐＨ６又はｐＨ８何れかのバッファーを含むウェルに様々な濃度の抗ＣＤ４７ｍＡｂを添加した。ウェルを洗浄し、ＨＲＰ標識二次抗体と一緒にｐＨ６又はｐＨ８で１時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質を添加した。非線形フィットモデル（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いて、見かけ親和性を計算した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を用いた表面プラズモン共鳴によるｐＨ依存的結合の分析のために、抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、フローセル１及び２上のＣＭ５チップに連結したアミンである。Ｆｃタグ付けヒトＣＤ４７（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ－ＥＰ＋泳動バッファー（ｐＨ７．５、６．５又は６．０）で希釈し、フローセル２上で捕捉した。ＰＢＳ－ＥＰ＋泳動バッファー（ｐＨ７．５、６．５又は６．０）で希釈した０～１００ｎＭのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１Ｆａｂ又はＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８Ｆａｂを用い、接触時間１８０秒及び解離時間３００秒でマルチサイクルカイネティクスを測定した。結合曲線の速度論的解析のために、１：１結合モデルを使用した。
ＣＤ４７を発現する細胞とのインビトロ結合のために、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；Ｓ０１５２０）を含有するＲＰＭＩ培地中でＪｕｒｋａｔ細胞を増殖させた。細胞を洗浄してから、２％ＦＢＳを添加したｐＨ７．４又はｐＨ６．５何れかのＰＢＳに、１×１０４個の細胞を再懸濁させ、様々な濃度の抗体と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄してから、３７℃で１時間かけて、ｐＨ６又はｐＨ８何れかの二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：１０００で再懸濁させた。次に、細胞を２回洗浄した後、フローサイトメトリーにより蛍光強度中央値を決定した。非線形フィット（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）によって見かけ結合親和性を決定した。
図９Ａ及び図９Ｂに示すように、可溶性ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２）は、ｐＨ８．０よりも酸性のｐＨ６．０において、より高い親和性でＨｉｓ－ＣＤ４７に結合した。ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ（図９Ｃ）又はＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ（図９Ｄ）のいずれも、ｐＨ依存的結合を示さなかった。加えて、マウスＶＬＸ９抗体、並びにアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ＰＥ由来のヒトＦｃを含むＶＬＸ９キメラ抗体は、ｐＨ依存性を示さなかった（表６）が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ＰＥの何れかとしてのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４は、酸性ｐＨで、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に対してより高い結合を示した（表７）。組換えヒトＣＤ４７に対する別のヒト化ｍＡｂの見かけ結合親和性を表８に示す。全てのヒト化ＶＬＸ９がｐＨ依存的結合を示したのに対して、ＶＬＸ４及びＶＬＸ８ヒト化ｍＡｂは示さなかった。結合速度、解離速度及び解離定数に対するｐＨの作用を決定するために、ｐＨ６、ｐＨ６．５及びｐＨ７．５で、ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１Ｆａｂ断片及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ＦａｂについてＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８Ｆａｂは、ｐＨが低下するにつれて増加するｐＨ依存的結合を示したが、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１Ｆａｂは示さなかった。ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１Ｆａｂ及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８Ｆａｂについての結合速度、解離速度及び解離定数を表９に示す。表１０は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されたＣＤ４７に対してＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２により呈示されるｐＨ依存的結合を示す。ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥによってｐＨ依存的結合は全く呈示されなかった。ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂのこのｐＨ依存性は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益をもたらす。
Figure 0007170331000030
Figure 0007170331000031
Figure 0007170331000032
Figure 0007170331000033
Figure 0007170331000034
実施例７
ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合を阻止する
インビトロでＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合に対するヒト化ＣＤ４７ｍＡｂの作用を評価するために、ＣＤ４７を発現するＪｕｒｋａｔ細胞への蛍光標識ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質の結合を用いて、次の方法を使用した。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２０１８６）を用いて製造者の明細書に従い、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ＃４５４６－ＳＡ）を標識した。１．５×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％培地を含有するＲＰＭＩ中のヒト化ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）、ヒト対照抗体、又は培地のみと一緒に３７℃で３０分インキュベートした。等量の蛍光標識ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合した標識ＳＩＲＰα－Ｆｃの量をフローサイトメトリーにより分析した。
図１０に示すように、ヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現されたＣＤ４７と可溶性ＳＩＲＰαの相互作用を阻止したが、ヒト対照抗体（ＣＤ４７と結合しない）又は培地のみは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止しなかった。
実施例８
ＣＤ４７抗体は、食作用を増大する
インビトロでマクロファージによる腫瘍細胞の食作用に対するキメラ（マウス－ヒト）及びヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ＣＤ４７ｍＡｂの作用を評価するために、フローサイトメトリーを用いて、次の方法を使用した（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（１７）：６６６２－７及びＴｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（２７）：１１１０３－８）。
ヒト由来のマクロファージを健常なヒト末梢血の白血球除去から取得し、ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に７～１０日にわたってインキュベートした。インビトロ食作用アッセイの場合、９６ウェルプレート内の１００ｕｌのＡＩＭ－Ｖ培地中にウェル当たり１×１０４細胞の濃度でマクロファージを再プレーティングし、２４時間にわたって付着させた。一旦エフェクターマクロファージが培養皿に付着したら、標的ヒト癌細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を１μＭの５（６）－カルボキシフルオレセイン二酢酸Ｎ－サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識してから、１ｍｌのＡＩＭ－Ｖ培地中に５×１０４細胞の濃度で（５：１の標的：エフェクター比）マクロファージ培養物に添加した。標的とエフェクター細胞の混合直後に、ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ＣＤ４７ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃で２～３時間インキュベートさせた。２～３時間後、全ての貪食されていない細胞を除去し、残った細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で３回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、微小遠心管中に収集して、１００ｎｇのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ＣＤ１４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３０分間インキュベートし、１回洗浄してから、完全な食作用を示すＣＦＳＥ＋でもあるＣＤ１４＋細胞のパーセンテージについてフローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
図１１に示すように、ＶＬＸ４キメラｍＡｂ：ＶＬＸ４ ＩｇＧ１ ｘｉ、ＶＬＸ４ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ、ＶＬＸ４ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ、及びＶＬＸ４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ ｘｉは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止することによってヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大したが、この増大した食作用は、Ｆｃ機能とは独立している。
同様に、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止することによってヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大した。この増大した食作用は、Ｆｃ機能とは独立している。
図１３Ａに示すように、ＶＬＸ８キメラｍＡｂ：ＶＬＸ８ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ及びＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止することによって、ヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大した。この増大した食作用は、Ｆｃ機能とは独立している。
同様に、図１３Ｂに示すように、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ４ＰＥ並びにキメラｍＡｂ：ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止することによってヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大した。
図１４Ａに示すように、ＶＬＸ９ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ、ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉ及びＶＬＸ９ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉキメラｍＡｂは全て、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用を阻止することによって、ヒトマクロファージによるＪｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大した。この増大した食作用は、Ｆｃエフェクター機能とは独立している。同様に、図１４Ｂに示すように、ヒト化ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１～＿１０ ＩｇＧ２）は全て、Ｊｕｒｋａｔ細胞の食作用を増大した。
実施例９
可溶性ＣＤ４７抗体による細胞死の誘導
一部の可溶性ＣＤ４７抗体は、腫瘍細胞の選択的細胞死を誘導することがわかっている。この癌細胞に対する選択的毒性という追加的特性は、ＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合を阻止するだけのｍＡｂと比較して、利点を有すると考えられる。
可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによる細胞死の誘導は、インビトロで測定される（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（７）：３５４４－５３，Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４），Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６２： ７０３１－７０４０，１９９９），Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１０２６－１０３６，２００４）。インビトロ細胞死アッセイのために、１×１０５個の形質転換ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を可溶性ヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ＣＤ４７ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞死が起こると、ミトコンドリア膜電位が低下し、細胞膜の内葉が反転して、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が曝露され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）が核ＤＮＡに組み込まれることが可能になる。これらの細胞の変化を検出するために、続いて、細胞を蛍光標識アネキシンＶ及びＰＩ又は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、シグナルを検出した。ＰＳ曝露の増加は、アネキシンＶシグナルの増加率（％）を測定することにより決定し、細胞死率（％）は、ＰＩ又は７－ＡＡＤシグナルの増加率（％）を測定することにより決定する。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）又はアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞は、細胞死の早期に観察され、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞は、死滅細胞である。治療目的のために重要なことに、これらのｍＡｂは、腫瘍細胞の細胞死を直接誘導し、殺傷のために補体又は他の細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、若しくはマクロファージ）の介入を必要としない。このように、この機構は、他の細胞及びＦｃエフェクター機能の両者から独立している。従って、これらのｍＡｂから作製される治療用抗体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどのＦｃエフェクター機能を低減し、それによって、インタクトなＦｃエフェクター機能を有するヒト化ｍＡｂに共通する副作用の可能性を制限するように操作することができる。
図１５Ａ～図１５Ｆに示すように、可溶性ＶＬＸ４ヒト化ｍＡｂは、アネキシンＶ＋（図１５Ａ及び図１５Ｄ）、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図１５Ｂ及び図１５Ｅ）、又はアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図１５Ｃ及び図１５Ｆ）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、ＰＳ曝露の増加及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を誘導した。ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ１、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿１２ ＩｇＧ４ＰＥ、及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１３ ＩｇＧ４ＰＥは、ＰＳ曝露及び細胞死の増加を引き起こした。対照的に、ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥは、ＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死の増加を引き起こさなかった。細胞死の誘導及び感受性癌細胞の食作用の促進は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
図１６Ａ～図１６Ｆに示すように、可溶性ＶＬＸ８キメラ及びヒト化ｍＡｂは、アネキシンＶ＋（図１６Ａ、図１６Ｄ）、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図１６Ｂ、図１６Ｅ）、又はアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図１６Ｃ、図１６Ｆ）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を誘導した。キメラｍＡｂであるＶＬＸ８ ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ ｘｉ及びＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ ｘｉ、並びにヒト化ｍＡｂであるＶＬＸ８ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥは、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を引き起こした。対照的に、ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ４ＰＥは、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を引き起こさなかった。細胞死の誘導及び感受性癌細胞の食作用の促進は、癌の治療において追加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
図１７Ａ～図１７Ｆに示すように、可溶性ＶＬＸ９キメラ抗体は、アネキシンＶ＋（図１７Ａ及び図１７Ｄ）、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図１７Ｂ及び図１７Ｅ）、又はアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図１７Ｃ及び図１７Ｆ）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を誘導した。キメラＶＬＸ９ ＩｇＧ２ｘｉｍＡｂ並びにヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ２は、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を誘導した。対照的に、ヒト化ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０４ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０５ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０１０ ＩｇＧ２は、増大したＰＳ曝露及びＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死を引き起こさなかった。細胞死の誘導及び感受性癌細胞の食作用の促進は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。重要なことには、腫瘍細胞の細胞死を引き起こすキメラ及びヒト化ｍＡｂは、正常細胞の細胞死を起こさない。
実施例１０
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂにより引き起こされるダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）発現及び放出、ミトコンドリア脱分極並びに細胞死
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、以前記載されている（Ｍａｎｎａ ａｎｄ Ｆｒａｚｉｅｒ，２０１４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０（７）：３５４４－３５５３）通り、腫瘍細胞のミトコンドリア膜電位の喪失を誘導する能力を呈示することを実証する。
腫瘍細胞のミトコンドリア膜電位の喪失は、ＪＣ－１色素（Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ＃Ｍ３４１５２）を用いて決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用する。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイの場合、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中でラージ細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ミトコンドリア膜電位喪失の正の対照として、細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、前述したＪＣ－１色素と一緒に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１：２０００希釈した。３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより、その蛍光発光を赤から緑にシフトする細胞のパーセントについて分析した（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、腫瘍細胞においてミトコンドリア膜電位の喪失を誘導する。図１８に示すように、抗ＣＤ４７ｍＡｂで処置した全培養物において、ミトコンドリア膜脱分極を有する細胞のパーセントは、アイソタイプ対照と比較して、有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ミトコンドリア膜脱分極のこのような増加は、抗ＣＤ４７キメラ又はヒト化抗体が、ヒト腫瘍細胞の細胞死を招くミトコンドリア脱分極を誘導することを実証している。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、例えば、Ｏｂｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３（１）：５４－６１によって開示される通り、ドキソルビシン及びミトキサントロンなどの化学療法薬アントラサイクリンを用いて、これまでに記載されているように、腫瘍細胞の表面上に小胞体常在シャペロンであるカルレティキュリンを曝露する能力を呈示することを実証する。
カルレティキュリンの細胞表面曝露は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｂｃａｍ；カタログ♯ａｂ１９６１５９）に結合したカルレティキュリンに対するウサギモノクローナル抗体を用いて決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用する。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。カルレティキュリン曝露の正の対照として、細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、前述した抗カルレティキュリン抗体と一緒に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１：２００希釈した。３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより、抗カルレティキュリン抗体シグナルの平均蛍光強度、並びに細胞表面カルレティキュリンに対して陽性染色する細胞のパーセントについて分析した（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
図１９に示すように、ヒト化抗体は、腫瘍細胞表面上のカルレティキュリンのアポトーシス促進性曝露を誘導した。全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物中のカルレティキュリン陽性細胞のパーセントは、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上でのカルレティキュリン曝露のこの増加は、ヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導し、これが、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証している。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、タンパク質ジスルフィド－イソメラーゼ３（ＰＤＩＡ３）発現の増大を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、例えば、Ｐａｎａｒｅｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １５：１４９９－１５０９によって開示される通り、ドキソルビシン及びミトキサントロンなどの化学療法薬アントラサイクリンを用いて、以前記載されているように、腫瘍細胞の表面上に小胞体常在シャペロンであるＰＤＩＡ３を曝露する能力を呈示することを実証する。
ＰＤＩＡ３の細胞表面曝露は、ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ；カタログ♯ａｂ１８３３９６）に結合したＰＤＩＡ３に対するマウスモノクローナル抗体を用いて決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ，カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ＰＤＩＡ３曝露の正の対照として、細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。ラージ細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、前述した抗ＰＤＩＡ３抗体と一緒に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１：２００希釈した。３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより、抗ＰＤＩＡ３抗体シグナルの平均蛍光強度、並びに細胞表面カルレティキュリンに対して陽性染色する細胞のパーセントについて分析した（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、腫瘍細胞表面上のＰＤＩＡ３のアポトーシス促進性曝露を誘導する。図２０に示すように、全ての可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物中のＰＤＩＡ３陽性細胞のパーセントは、負の対照、ヒト化アイソタイプ適合抗体を用いて得られたバックグラウンドと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上でのＰＤＩＡ３曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導し、これが、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証している。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面ＨＳＰ７０発現の増大を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、例えば、Ｆｕｃｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１（１４）：４８２１－４８３３によって開示される通り、ドキソルビシン及びミトキサントロンなどの化学療法薬アントラサイクリンを用いて、これまでに記載されているように、腫瘍細胞の表面上に小胞体常在シャペロンであるＨＳＰ７０を曝露する能力を呈示することを実証する。
ＨＳＰ７０の細胞表面曝露は、フィコエリスリン（Ａｂｃａｍ；カタログ♯ａｂ６５１７４）に結合したＨＳＰ７０に対するマウスモノクローナル抗体を用いて決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ＨＳＰ７０曝露の正の対照として、ラージ細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、前述した抗ＨＳＰ７０抗体と一緒に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１：２００希釈した。３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより、抗ＨＳＰ７０抗体シグナルの平均蛍光強度、並びに細胞表面カルレティキュリンについて陽性染色する細胞のパーセントについて分析した（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、腫瘍細胞表面上のＨＳＰ７０のアポトーシス促進性曝露を誘導した。図２１に示すように、全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物中のＨＳＰ７０陽性細胞のパーセントは、アイソタイプ対照処置培養物で認められたものと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上でのＨＳＰ７０曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導し、これが、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証している。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面ＨＳＰ９０発現の増大を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、例えば、Ｆｕｃｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１（１４）：４８２１－４８３３によって開示される通り、ドキソルビシン及びミトキサントロンなどの化学療法薬アントラサイクリンを用いて、これまでに記載されているように、腫瘍細胞の表面上に小胞体常在シャペロンであるＨＳＰ７０を曝露することを実証する。
ＨＳＰ９０の細胞表面曝露は、フィコエリスリン（Ａｂｃａｍ；カタログ♯ａｂ６５１７４）に結合したＨＳＰ７０に対するマウスモノクローナル抗体を用いて決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイの場合、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ＨＳＰ９０曝露の正の対照として、細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。ラージ細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄してから、前述した抗ＨＳＰ７０抗体と一緒に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で１：２００希釈した。３０分後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより、抗ＨＳＰ７０抗体シグナルの平均蛍光強度、並びに細胞表面カルレティキュリンに対して陽性染色する細胞のパーセントについて分析した（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、腫瘍細胞表面上のＨＳＰ９０のアポトーシス促進性曝露を誘導した。図２２に示すように、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物中のＨＳＰ９０陽性細胞のパーセントは、ＶＬＸｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２及びＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ（ｎｓ、有意ではない）を除き、負の対照である、ヒト化アイソタイプ適合抗体を用いて得られたバックグラウンドと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上でのＨＳＰ９０曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導し、これが、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証している。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＡＴＰ放出の増大を引き起こす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、アントラサイクリン化学療法薬を用いて、これまでに記載されている（Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２１：７９－９１）ように、腫瘍細胞からのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の放出増大を誘導することを実証する。
腫瘍細胞からのＡＴＰの放出は、定量的生物発光アッセイにより、製造者による記載（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；カタログ＃Ａ２２０６６）の通りに決定する。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３）、並びに対照キメラ抗体は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ＡＴＰ放出の正の対照として、細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、無細胞上清を収集し、－８０℃で保存した。全てのサンプルを収集した後、１０μｌの各サンプルを前述したＡＴＰ定量キットにより検定した。実験値を標準曲線と比較することにより最終濃度を決定し、抗体処置に応答して腫瘍細胞により放出されるＡＴＰの濃度（μＭ）として表示した。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
ヒト化抗体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの放出を増大した。図２３に示すように、全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物において放出されたＡＴＰの量は、アイソタイプ対照と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＡＴＰ放出のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からのＡＴＰの放出を誘導し、これが、そのコグネイトプリン受容体を介して樹状細胞の遊走を招き得ることを実証する。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＨＭＧＢ１放出を引き起こす
これらの実験では、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、化学療法薬、例えば、オキサリプラチン（Ｔｅｓｎｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２９：４８２－４９１）及びミトキサントロン（Ｍｉｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４：１５７３－１５７７）を用いて、これまでに記載されているように、腫瘍細胞からの非ヒストンクロマチンタンパク質高移動群ボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出を増大することを実証するものである。
腫瘍細胞からのＨＭＧＢ１タンパク質の放出は、酵素イムノアッセイにより、製造者による記載（ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ＃ＳＴ５１０１１）の通りに決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイの場合、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
続いて、前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加する。ＨＭＧＢ放出の正の対照として、ラージ細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、無細胞上清を収集し、－８０℃で保存した。全てのサンプルを収集した後、１０μｌの各サンプルを前述したＨＭＧＢ１ ＥＬＩＳＡにより検定した。実験値を標準曲線と比較することにより最終濃度を決定し、抗体処置に応答して腫瘍細胞により放出されるＨＭＧＢ１の濃度（ｎｇ／ｍｌ）として記録した。結果は平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６により、ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性について解析した。
図２４に示すように、ヒト化抗体は、腫瘍細胞からのＨＭＧＢ１タンパク質の放出を増大した。全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物において放出されたＨＭＧＢ１タンパク質の量は、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２（ｎｓ、有意ではない）を除き、アイソタイプ対照と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＨＭＧＢ１放出のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からのＤＡＭＰの放出を誘導し、これが、樹状細胞の活性化を招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＣＸＣＬ１０放出を引き起こす
これらの実験では、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、アントラサイクリン化学療法薬（Ｓｉｓｔｉｇｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（１１）：１３０１－１３０９）を用いて、これまでに記載されているように、ヒト腫瘍細胞からのケモカインリガンドＣＸＣＬ１０の産生及び放出を増大することを実証する。
腫瘍細胞からのＣＸＣＬ１０の放出は、酵素イムノアッセイにより、製造者による記載（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ＤＩＰ１００）の通りに決定した。ヒトラージ（Ｒａｊｉ）リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＣＬ－８６）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイの場合、９６ウェル組織培養プレートにおいて、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で平板培養した。
前述したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）、並びに対照キメラ抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ＣＸＣＬ１０放出の正の対照として、ラージ細胞を１μＭの化学療法薬アントラサイクリンのミトキサントロンで処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、無細胞上清を収集し、－８０℃で保存した。全てのサンプルを収集した後、１０μｌの各サンプルを前述したＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡにより検定した。実験値を標準曲線と比較することにより最終濃度を決定し、抗体処置に応答して腫瘍細胞により放出されるＣＸＣＬ１０の濃度（ｐｇ／ｍｌ）として表示した。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、ヒト腫瘍細胞からのＣＸＣＬ１０の放出を誘導する。図２５に示すように、全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物において放出されたＣＸＣＬ１０の量は、アイソタイプ対照と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＣＸＣＬ１０放出のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からのＣＸＣＬ１０の放出を誘導することを実証し、腫瘍に対する免疫細胞の動員における役割を示唆している。
実施例１１
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂにより引き起こされるダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）発現及び放出、ミトコンドリア脱分極及び細胞死
これらの試験は、ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ ＡＬＬ細胞株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＴＩＢ－１５２）を用いた以外は、実施例１０に記載する通りに実施した。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こす
図２６に示すように、ヒト化ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）は、アイソタイプ対照と比較して、ミトコンドリア膜脱分極を有する細胞のパーセントの有意な増加（ｐ＜０．０５）を引き起こした。ミトコンドリア膜脱分極のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部がヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導することを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面カルレティキュリン発現の増大を引き起こす
図２７に示すように、ヒト化抗体（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）は、腫瘍細胞表面上のカルレティキュリンのアポトーシス促進性曝露を誘導した。全ての抗ＣＤ４７ｍＡｂ処置培養物中のカルレティキュリン陽性細胞のパーセントは、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２（ｎｓ）を除き、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上のカルレティキュリン曝露のこの増加は、ヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導して、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面ＰＤＩＡ３発現の増大を引き起こす
図２８に示すように、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）で処置した培養物中のＰＤＩＡ３陽性細胞のパーセントは、負の対照のヒト化アイソタイプ適合抗体を用いて得られたバックグラウンドと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上のＰＤＩＡ３曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導して、自然免疫細胞による腫瘍細胞の食作用及び腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面ＨＳＰ７０発現の増大を引き起こす
図２９に示すように、抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）で処置した培養物中のＨＳＰ７０陽性細胞のパーセントは、アイソタイプ対照で処置した培養物で認められたものと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。抗ＣＤ４７ｍＡｂの各々は、ＨＳＰ７０発現の統計的に有意な増大をもたらしたが、ミトキサントロンはもたらさなかった。細胞表面上のＨＳＰ７０曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導して、腫瘍細胞の食作用及び自然免疫細胞による腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、細胞表面ＨＳＰ９０発現の増大を引き起こす
図３０に示すように、可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）で処置した培養物中のＨＳＰ９０陽性細胞のパーセントは、負の対照のヒト化アイソタイプ適合抗体を用いて得られたバックグラウンドと比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。細胞表面上でのＨＳＰ９０曝露のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導して、腫瘍細胞の食作用及び自然免疫細胞による腫瘍抗原のプロセシングを招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＡＴＰ放出の増大を引き起こす
図３１に示すように、ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）処置培養物中の放出されたＡＴＰの量は、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。抗ＣＤ４７ｍＡｂの各々は、ＨＳＰ７０発現の統計的に有意な増大をもたらしたが、ミトキサントロンはもたらさなかった（ｎｓ）。ＡＴＰ放出のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からのＡＴＰの放出を誘導して、そのコグネイトプリン受容体を介した樹状細胞遊走を招き得ることを実証するものである。
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂは、ＨＭＧＢ１放出の増大を引き起こす
図３２に示すように、抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ２）処置培養物中の放出されたＨＭＧＢ１タンパク質のパーセントは、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ（ｎｓ）を除き、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＨＭＧＢ１放出のこの増加は、キメラ又はヒト化抗体の一部が、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導し、樹状細胞の活性化を招き得ることを実証するものである。
実施例１２
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂと化学療法薬の併用療法は、相加効果又は相乗効果をもたらす。
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、臨床的に関連する化学療法薬と組み合わせたとき、相加効果又は相乗効果をもたらして、ヒト腫瘍細胞の免疫原性細胞死を誘導することを実証する。
併用薬相加的／相乗的効果は、漸増濃度のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ及びドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ，ＰＨＲ１７８９）を組み合わせることによって決定した。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＴＩＢ－１５２）又は十分なレベルのＣＤ４７を発現する他の細胞型を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．３～１００ｎＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１０μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．３～１００ｎＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、細胞表面上のアネキシンＶ、７－ＡＡＤ、ＥＲストレスマーカカルレティキュリンを用いてホスファチジルセリンについて分析した。ＡＴＰ放出の分析のために、上清を採取した（前述した通り）。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図３３に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図３４に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、Ｖ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図３５に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、カルレティキュリン陽性細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図３６に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、ＡＴＰ放出量に、相加効果又は相乗効果をもたらす。
実施例１３
ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の血球凝集
Ｂ６Ｈ１２、ＢＲＩＣ１２６、ＭＡＢＬ１、ＭＡＢＬ２、ＣＣ２Ｃ６、５Ｆ９をはじめとする、多くのＣＤ４７抗体は、インビトロ又はインビボで洗浄済ＲＢＣの血球凝集（ＨＡ）を引き起こすことがわかっている（Ｐｅｔｒｏｖａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；７５（１５ Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ４２７１；米国特許第９，０４５，５４１号明細書；Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．１７：１１８９－９４，２００７；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：９１２－８，２００４；Ｓｉｋｉｃ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１６；３４（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒａｃｔ ３０１９））。原則的にＫｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ（２００４）３１５：９１２－９１８により記載されるように、様々な濃度のキメラ及びヒト化ＶＬＸ４、ＶＬＸ８、及びＶＬＸ９ｍＡｂと一緒にｈＲＢＣをインキュベートした後、ｈＲＢＣの血球凝集を評価した。健常なドナーから血液を採取し、ＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＢＳＡで希釈（１：５０）した後、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡで３回洗浄した。等量の抗体（各７５μｌ）と一緒にＵ底９６ウェルプレートにｈＲＢＣを添加し、３７℃で３時間、次に４℃で一晩インキュベートした。血球凝集を起こさない抗体の場合、堅いＲＢＣペレットが観察され、血球凝集をもたらす抗体では、拡散して不明瞭なパターンが観察される。
図３７Ａ並びに表１及び２に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ１は、明らかなｈＲＢＣの血球凝集を引き起こしたが、ヒト化ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ ｍＡｂは起こさなかった（ｍＡｂ濃度：５０μｇ／ｍｌ～０．３ｎｇ／ｍｌ）。ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥによる検出可能な血球凝集の欠如は、癌の治療において付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
図３７Ｂ並びに表１及び２に示すように、キメラ抗体ＶＬＸ８ ＩｇＧ４ＰＥ（ｘｉ）及びヒト化抗体ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０９ ＩｇＧ４ＰＥ、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥは、明らかなｈＲＢＣの血球凝集を引き起こしたが、ＶＬＸ８ヒト化Ａｂ：ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥは、起こさなかった（ｍＡｂ濃度：５０μｇ／ｍｌ～０．３ｎｇ／ｍｌ）。
ヒト化抗体：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０１ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０２ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿０３ ＩｇＧ４ＰＥ及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥによる検出可能な血球凝集の欠如は、癌の治療において付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
図３８Ａ及び図３８Ｂに示すように、キメラ抗体ＶＬＸ９ ＩｇＧ２ ｘｉは、ｈＲＢＣの明らかな血球凝集を引き起こしたが、ヒト化ＶＬＸ９ｍＡｂは、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ２を除いて、全て検出可能な血球凝集を引き起こさなかった（ｍＡｂ濃度：５０μｇ／ｍｌ～０．３ｐｇ／ｍｌ）。しかし、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０７によって引き起こされた検出可能な血球凝集の量は、ＶＬＸ９ ＩｇＧ２キメラｍＡｂと比較して低かった。この場合もまた、ＶＬＸ９ヒト化ｍＡｂによる検出可能な血球凝集の欠如は、癌の治療において付加的な望ましい抗体特性及び治療利益の可能性をもたらす。
実施例１４
インビボでの抗腫瘍活性
この実験の目的は、ＶＬＸ４＿０７ ＩｇＧ４ ＰＥ、ＶＬＸ８＿１０ ＩｇＧ４ ＰＥ及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２により例示されるＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化抗体が、リンパ腫のマウス移植片モデルにおける腫瘍負荷をインビボで低減することを証明することであった。
５％ＣＯ２雰囲気内の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｏｎｚａ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でラージ（Ｒａｊｉ）ヒトバーキットリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ♯ＣＣＬ－８６，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を維持した。培養物を組織培養フラスコ中で拡大した。
５～６週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ－Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から取得した。処置前に、マウスを順化させてから、特定の病原体フリー条件下でマイクロアイソレータケージ（Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）内に収容した。マウスにはＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ（登録商標）２９２０ｘ照射済実験動物試料（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｈａｒｌａｎ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を給餌し、オートクレーブ処理済の水を無制限に供給した。手順は全て、動物実験ガイドライン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って実施した。
５×１０６個のラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍細胞の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を雌ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下接種した。接種から５日後、デジタルカリバーを用いて、腫瘍の短径及び長径を測定した。式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ｂ」は、最小直径であり、「ａ」は、最大直径である）を使用して、腫瘍体積を計算した。３１～７４ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスをランダムに８～１０匹／グループに分け、この時点でＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、５ｍｇ／ｋｇの抗体５×／週の腹腔内注射により４週間にわたって処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。
図３９に示すように、ヒト化ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥによる処置は、ラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍の腫瘍成長を有意に抑制し（ｐ＜０．０５、二元ＡＮＯＶＡ）、インビボでの抗腫瘍効果を示している。
図４０に示すように、ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥによる処置は、ラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍の腫瘍成長を有意に抑制し（ｐ＜０．０００１、二元ＡＮＯＶＡ）、インビボでの抗腫瘍効果を示している。
図４１に示すように、ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２による処置は、ラージ（Ｒａｊｉ）腫瘍の腫瘍成長を有意に抑制し（ｐ＜０．０５、二元ＡＮＯＶＡ）、インビボでの抗腫瘍効果を示している。
実施例１５
循環赤血球パラメータに対する作用
この実験の目的は、ヒトＲＢＣにインビトロで結合しないＶＬＸ９ヒト化抗体（表２）（ｈｕｍ１０１７＿０８ＩｇＧ２により例示）が、カニクイザルへの投与後、ヘモグロビン（Ｈｇ）又は循環ＲＢＣのいずれにも減少を引き起こさないことを立証することである。
雌チャイニーズカニクイザル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）２．５～３ｋｇを動物実験ガイドライン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って使用した。ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２又はビヒクル（ＰＢＳ）を１日目に５ｍｇ／ｋｇの用量で、１８日目に１５ｍｇ／ｋｇの用量で、１時間の静脈内注入として投与した（３匹／グループ）。試験全体を通して、－７、－３（示していない）、投与前、３、８、１２、１８日目（投与前）、２０、２５、２９、３５及び４１日目に血液パラメータを測定し、対照動物の平均値と比較／正規化した。ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２グループにおける０日目の処置前ＲＢＣ及びＨｇ値は対照グループより低かった。何れかの用量のＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２での処置後、対照グループと比較して、Ｈｇ（図４２Ａ）又はＲＢＣ数（図４２Ｂ）にわずかな変化（＜１０％）があったが、これは、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ ＩｇＧ２が、カニクイザルに投与されると、ＲＢＣ血液パラメータにわずかな減少をもたらすことを示している。
実施例１６
ＣＤ４７に対する抗体は、一酸化窒素シグナル伝達を調節する
ＣＤ４７へのＴＳＰ１結合は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質Ｇｉを活性化し、これは、細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルの抑制をもたらす。さらに、ＴＰＳ１／ＣＤ４７経路は、あらゆる血管細胞中の一酸化窒素（ＮＯ）経路の有益な作用を妨害する。ＮＯ経路は、基質としてアルギニンを用いて生物活性ガスＮＯを生成する３つの一酸化窒素シンターゼ酵素（ＮＯＳＩ、ＮＯＳＩＩ及びＮＯＳＩＩＩ）の何れかから構成される。ＮＯは、それが生成される細胞内又は隣接細胞中で作用して、メッセンジャー分子環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を生成する酵素可溶性グアニリルシクラーゼを活性化することができる。ＮＯ／ｃＧＭＰ経路の適正な機能状態は、限定されないが、創傷、炎症、高血圧、代謝症候群、虚血、及び虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）から起こるストレスをはじめとするストレスから心血管系を保護する上で不可欠である。これらの細胞ストレスに関して、ＴＰＳ１／ＣＤ４７系によるＮＯ／ｃＧＭＰ経路の阻害は、ストレスの作用を悪化させる。これは、ｃＧＭＰ及びｃＡＭＰの両方が、重要な保護の役割を果たす心血管系に特有の問題である。虚血及び再灌流傷害が、疾患、外傷、及び外科的処置の予後不良を引き起こすか、又はそれに寄与する多くの事例がある。
これらの実験の目的は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、例えば、Ｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２６０６９－８０により開示されるようにＣＤ４７に対するマウスモノクローナル抗体を用いて以前記載されている通り、ＮＯ刺激ｃＧＭＰ合成のＴＳＰ１媒介性阻害、或いは、ＮＯシグナル伝達の他の下流マーカ又はＮＯシグナル伝達によって生じる作用、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５９：１５４２－１５４７により以前記載されているように平滑筋細胞弛緩若しくは血小板凝集を逆転させる能力を示すことを証明することであろう。
使用される方法は、製造者により記載される（ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ Ｃｙｃｌｉｃ－ＧＭＰ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ようにｃＧＭＰを測定するものであろう。Ｊｕｒｋａｔ ＪＥ６．１細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ＃ＴＩＢ－１５２）又は培養して増殖させるとＮＯ／ｃＧＭＰシグナル伝達経路を保持し、しかもＣＤ４７のＴＳＰ１連結に対する頑健且つ再生可能な阻害応答を呈示する他の細胞型が使用される。細胞は、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地中で細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させる。ｃＧＭＰアッセイの場合、９６ウェル組織培養プレートにおいて、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で２４時間にわたり増殖させた後、無血清培地に一晩移す。
実施例３に記載したＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションから精製した本明細書に開示のヒト化抗体、並びに対象キメラ抗体は、２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、その１５分後に、０又は１μｇ／ｍｌのヒトＴＳＰ１（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ，カタログ＃１６－２０－２０１３１９）を添加する。さらに１５分後、ＮＯ供与体であるジエチルアミン（ＤＥＡ）ＮＯＮＯａｔｅ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，Ｃａｔａｌｏｇ♯８２１００）を１μＭの最終濃度でウェルの半分に添加する。５分後、ｃＧＭＰキットに供給された緩衝液で細胞を溶解させ、各ウェルのアリコートをｃＧＭＰ含量についてアッセイする。
キメラ又はヒト化抗体の一部は、ｃＧＭＰのＴＳＰ１阻害を逆転することが予想される。逆転は、完全（＞８０％）又は中程度（２０％～８０％）であり得る。ｃＧＭＰのＴＳＰ１阻害のこの逆転は、それらがＮＯシグナル伝達を増大する能力を有することを示し、限定されないが、創傷、炎症、高血圧、代謝症候群、虚血、及び虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）に起因するものをはじめとするストレスから心血管系を保護する上での有用性を示唆する。また、別のアッセイ系、例えば、平滑筋細胞収縮も、キメラ又はヒト化抗体クローンの一部が、ＮＯシグナル伝達の活性化によって生じる下流効果に対するＴＳＰの阻害作用を逆転することを明らかにすると予想される。
実施例１７
可溶性ＣＤ４７抗体による細胞死及びＤＡＭＰ発現の誘導
一部の可溶性ＣＤ４７抗体は、腫瘍細胞の選択性細胞死を誘導することが明らかにされている。癌細胞に対する選択性傷害性というこの付加的な特性は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合だけを阻止するｍＡｂと比較して、利点を有すると考えられる。
可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂによる細胞死の誘導をインビトロで測定する（Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５４４－３５５３，２００３；Ｍａｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：１０２６－１０３６，２００４）。インビトロ細胞死アッセイのために、１×１０５個の形質転換ヒト卵巣細胞（ＯＶ９０細胞、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＣＲＬ－１１７３２）を、可溶性ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ（０．０３～３μｇ／ｍｌ）、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２ ＣＤ４７（１～１００μｇ／ｍｌ）、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ（０．０３～３μｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。細胞死が起こると、ミトコンドリア膜電位が低下し、細胞膜の内葉が反転して、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びカルレティキュリンを細胞表面上に曝露し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）が核ＤＮＡに組み込まれることが可能になる。これらの細胞の変化を検出するために、続いて、細胞を蛍光標識アネキシンＶ及びＰＩ又は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、カルレティキュリンに対するウサギモノクローナル抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７（Ａｂｃａｍ；カタログ＃ａｂ１９６１５９）に結合させ、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメータ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、シグナルを検出した。ＰＳ曝露の増加は、アネキシンＶシグナルの増加率（％）を測定することにより決定し、細胞死率（％）は、ＰＩ又は７－ＡＡＤシグナルの増加率（％）を測定することにより決定する。アネキシンＶ陽性（アネキシンＶ＋）又はアネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞は、細胞死の早期に観察され、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）細胞は、死滅細胞である。カルレティキュリン（ＣＲＴ）曝露は、ＰＩ又は７－ＡＡＤを取り込んでいないカルレティキュリン陽性細胞（カルレティキュリン＋／７－ＡＡＤ－）の増加率（％）を測定することにより決定される。治療目的のために重要なことは、これらのｍＡｂが、腫瘍細胞の細胞死を直接誘導するため、殺傷のために補体又は他の細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、若しくはマクロファージ）の介入を必要としないことである。このように、この機構は、他の細胞及びＦｃエフェクター機能の両者から独立している。従って、これらのｍＡｂから作製される治療用抗体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどのＦｃエフェクター機能を低減し、それによって、インタクトなＦｃエフェクター機能を有するヒト化ｍＡｂに共通する副作用の可能性を制限するように操作することができる。
図４３～図４５に示すように、可溶性ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図４３）及びアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図４４）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、ＰＳ曝露の増加及びＯＶ９０細胞の細胞死の増大を誘導した。抗ＣＤ４７抗体処置培養物中ＣＲＴ＋／７－ＡＡＤ－（図４５）である細胞のパーセントは、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５以上）。
図４６～図４８に示すように、可溶性ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２ヒト化ｍＡｂは、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図４６）及びアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図４７）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、ＰＳ曝露の増加及びＯＶ９０細胞の細胞死の増大を誘導した。抗ＣＤ４７抗体処置培養物中ＣＲＴ＋／７－ＡＡＤ－（図４８）である細胞のパーセントは、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５以上）。
図４９～図５１に示すように、可溶性ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化ｍＡｂは、アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－（図４９）及びアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋（図５０）である細胞の増加率（％）によって測定される通り、ＰＳ曝露の増加及びＯＶ９０細胞の細胞死の増大を誘導した。抗ＣＤ４７抗体処置培養物中ＣＲＴ＋／７－ＡＡＤ－（図５１）である細胞のパーセントは、アイソタイプ対照と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５以上）。
細胞死の誘導、ＤＡＭＰ発現、及び感受性癌細胞の食作用の促進は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益をもたらす。細胞表面上のカルレティキュリン曝露の増大は、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２、及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、腫瘍細胞からＤＡＭＰを誘導することを実証するものであり、このことは、腫瘍細胞の食作用及び自然免疫細胞による腫瘍抗原のプロセシングを刺激する上でのさらなる有用性を示唆している。
実施例１８
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ）と化学療法薬の併用療法は、相加効果又は相乗効果をもたらす
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、臨床的に関連する化学療法薬と組み合わせると、相加効果又は相乗効果をもたらして、ヒト腫瘍細胞の免疫原性細胞死を誘導することを実証する。
併用薬相加作用／相乗作用は、漸増濃度のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ，ＰＨＲ１７８９）、エピルビシン（Ｓｉｇｍａ，Ｅ９４０６）、ドセタキセル（Ｓｉｇｍａ，０１８８５）、ゲムシタビン（Ｓｉｇｍａ，１２８８４６３）、イリノテカン（Ｓｉｇｍａ，Ｉ１４０６）、オキサリプラチン（Ｓｉｇｍａ，ＰＨＲ１５２８）を組み合わせることによって決定した。ヒトＯＶ１０／３１５（Ｇａｏ ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６）を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．０５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．０５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、及び７－ＡＡＤによりＤＮＡ曝露について分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図５２に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図５３に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．０５～０．４２μＭのエピルビシン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．０５～０．４２μＭのエピルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、及び７－ＡＡＤによりＤＮＡ曝露について分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図５４に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとエピルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図５５に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとエピルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００２～０．１３５μＭのドセタキセル単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．００２～０．１３５μＭのドセタキセルの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、及び７－ＡＡＤによりＤＮＡ曝露について分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図５６に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドセタキセルの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図５７に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドセタキセルの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００３～０．３μＭのゲムシタビン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．００３～０．３μＭのゲムシタビンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、７－ＡＡＤ、細胞表面上のＥＲストレスマーカであるカルレティキュリンについて分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図５８に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとゲムシタビンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図５９に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとゲムシタビンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６０に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとゲムシタビンの一部の組合せは、カルレティキュリン陽性細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．６３～５１ｎＭのイリノテカン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．６３～５１ｎＭのイリノテカンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、７－ＡＡＤ、細胞表面上のＥＲストレスマーカであるカルレティキュリンについて分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図６１に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとイリノテカンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６２に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとイリノテカンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６３に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとイリノテカンの一部の組合せは、カルレティキュリン陽性細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
ＯＶ１０／３１５細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチン単独、又は０．０３～１μｇ／ｍｌのＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥと０．６５～５２．８μＭのオキサリプラチンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、及び７－ＡＡＤによりＤＮＡ曝露について分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図６４に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとオキサリプラチンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６５に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとオキサリプラチンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
実施例１９
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２）と化学療法薬の併用療法は、相加効果又は相乗効果をもたらす。
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、臨床的に関連する化学療法薬と組み合わせたとき、相加効果又は相乗効果をもたらして、ヒト腫瘍細胞の免疫原性細胞死を誘導することを実証する。
併用薬相加作用／相乗作用は、漸増濃度のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ：ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２と、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ，ＰＨＲ１７８９）を組み合わせることによって決定した。ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ ＡＬＬ細胞株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＴＩＢ－１５２）を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地中の１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は１～１００μｇ／ｍｌのＶＬＸ９ｈｕｍ＿０６ ＩｇＧ２と０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、７－ＡＡＤ、細胞表面上のＥＲストレスマーカであるカルレティキュリンについて分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図６６に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６７に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図６８に示すように、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０７ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、カルレティキュリン陽性細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。
実施例２０
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ（ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ）と化学療法薬の併用療法は、相加効果又は相乗効果をもたらす。
これらの実験は、本開示のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂが、臨床的に関連する化学療法薬と組み合わせたとき、相加的又は相乗的活性をもたらして、ヒト腫瘍細胞の免疫原性細胞死を誘導することを実証する。
併用薬の相加作用／相乗作用は、漸増濃度のヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂ：ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ，ＰＨＲ１７８９）を組み合わせることによって決定した。ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ ＡＬＬ細胞株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ♯ＴＩＢ－１５２）を使用した。１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；カタログ＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬ未満の密度で増殖させた。このアッセイのために、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ；カタログ＃Ｓ０１５２０）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；＃Ｐ４２２２）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で平板培養した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地中の０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥ単独、０．００５～０．４２μＭのドキソルビシン単独、又は０．０３～３μｇ／ｍｌのＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥと０．００５～０．４２μＭのドキソルビシンの組合せ用量応答マトリクスと一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を採取し、アネキシンＶを用いてホスファチジルセリンについて、７－ＡＡＤ、細胞表面上のＥＲストレスマーカであるカルレティキュリンについて分析し、細胞上清をＨＭＧＢ１放出について分析した。結果は、平均±ＳＥＭとして表示する。
図６９に示すように、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陰性（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図７０に示すように、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシの一部の組合せは、アネキシンＶ陽性／７－ＡＡＤ陽性（アネキシンＶ＋７－ＡＡＤ＋）死滅細胞のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図７１に示すように、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、カルレティキュリン陽性細胞（カルレティキュリン＋／７－ＡＡＤ－）のパーセントに、相加効果又は相乗効果をもたらす。図７２に示すように、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ ＩｇＧ４ＰＥとドキソルビシンの一部の組合せは、ＨＭＧＢ１放出の量に相加効果又は相乗効果をもたらす。
実施例２１
ヒト化抗ＣＤ４７ｍＡｂのｐＨ依存的及び非依存的結合
一部の可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂは、生理的ｐＨよりも高い親和性で、酸性ｐＨの腫瘍細胞に結合することが明らかにされている。この付加的特性は、腫瘍微小環境が酸性であることから、酸性及び生理的ｐＨの両方のＣＤ４７に同様の親和性で結合するｍＡｂと比較して、利点を有すると考えられる（Ｔａｎｎｏｃｋ ａｎｄ Ｒｏｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００６；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｐａｇｅｌ，Ａｄｖａｎ．Ｒａｄｉｏｌ．２０１５）。
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上の表面プラズモン共鳴により、組換えＦｃ－ＣＤ４７に対する可溶性抗ＣＤ４７ｍＡｂの結合をインビトロで測定した。抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、フローセル１及び２上のＣＭ５チップに連結したアミンである。ＰＢＳ－ＥＰ＋で希釈した組換えＦｃ－ＣＤ４７をフローセル１及び２上で捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動バッファー（ｐＨ７．５、７、６．５若しくは６）で希釈したヒト化ｍＡｂ０から１０００ｎＭ：ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ Ｆａｂ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ Ｆａｂ又はＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ Ｆａｂを用い、接触時間１８０秒及び解離時間３００秒でマルチサイクルカイネティクスを測定した。結合曲線の速度論的解析のために、１：１結合モデルを使用した。ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１ Ｆａｂ、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１ Ｆａｂ及びＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８ Ｆａｂについての結合速度、解離速度及び解離定数を表７に示すが、これは、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８が、ＣＤ４７へのｐＨ依存的結合を有するのに対し、ＶＬＸ４ｈｕｍ＿０１及びＶＬＸ８ｈｕｍ＿１１はそうではないことを実証するものである。このｐＨ依存性は、癌の治療に付加的な望ましい抗体特性及び治療利益を付与する。
Figure 0007170331000035
実施例２２
ヒト異種移植片モデルにおけるインビボでの抗腫瘍活性
この実験の目的は、ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ＰＥにより例示されるＶＬＸ４、ＶＬＸ８及びＶＬＸ９ヒト化抗体が、トリプルネガティブ乳癌のマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍負荷をインビボで低減することを実証することである。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１トリプルネガティブ乳癌細胞（（カタログ＃ＨＴＢ－２６（商標）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を、５％ＣＯ２雰囲気内で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｏｎｚａ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に維持した。培養物を組織培養フラスコ内で増殖させた。
雌ＮＳＧ（ＮＯＤ－Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を５～６週齢でＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。マウスを処置前に順応させ、特定の無菌条件下で、マイクロ隔離ケージ（Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）内に収容した。マウスには、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ（登録商標）２９２０ｘ放射線実験動物飼料（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｈａｒｌａｎ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を給餌し、オートクレーブ水を不断供給した。手順は全て、動物実験ガイドライン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って実施した。
雌ＮＳＧマウスに、２×１０７個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞の懸濁液を含む０．２ｍＬの７０％ＲＰＭＩ／３０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）混合物を乳腺脂肪体に同所接種した。接種から１９日後、５５～１７９ｍｍ３の触知可能な腫瘍体積を有する５０匹のマウスをランダム均衡化により１０匹ずつ５グループに分けた。式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ｂ」は、最小直径であり、「ａ」は、最大直径である）を使用して、腫瘍体積を計算した。この時点で、ＶＬＸ９ｈｕｍ＿０８又はＰＢＳ（対照）の投与を開始した。マウスは、腹腔内注射により１５ｍｇ／ｋｇの抗体５×／週で５週間にわたり処置した。腫瘍体積及び体重を週２回記録した。
図７３に示すように、ヒト化ＶＬＸ８ｈｕｍ＿１０ ＩｇＧ４ ＰＥによる処置は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の腫瘍成長を有意に抑制し（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）、インビボでの抗腫瘍効果を実証している。

Claims (11)

  1. 対象における癌の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、ヒト腫瘍細胞の表面上のヒトＣＤ４７に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、第２の抗癌剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含み、前記医薬組成物が、腫瘍細胞の免疫原性細胞死の増大を引き起こし、
    前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
    （ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
    （ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
    （ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
    （ｖ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；
    （ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；並びに
    （ｖｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
    からなる群から選択される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の組み合わせを含む ことを特徴とする医薬組成物。
  2. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、キメラ又はヒト化抗体であることを特徴とする医薬組成物。
  3. 請求項１又は２に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαの結合を阻止する、前記癌の腫瘍細胞の食作用を増大する、及び／又は前記癌の腫瘍細胞の死を誘導することを特徴とする医薬組成物。
  4. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）の検出可能な凝集を引き起こさないことを特徴とする医薬組成物。
  5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、最小限のｈＲＢＣ結合を有することを特徴とする医薬組成物。
  6. 請求項１乃至５の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、生理学的ｐＨと比較して、酸性ｐＨのヒトＣＤ４７に対して高い親和性を有することを特徴とする医薬組成物。
  7. 請求項１乃至６の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｉｖ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｖ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｖｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖；並びに
    （ｖｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖
    からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含むことを特徴とする医薬組成物。
  8. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記第２の抗癌剤が、アントラサイクリン、白金、タキソール、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、及びアルキル化剤からなる群から選択される化学療法薬であることを特徴とする医薬組成物。
  9. 請求項８に記載の医薬組成物において、前記化学療法薬が、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ミトキサントロン、５－ＦＵ、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、ペルメトレキセド、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びテムゾロミドから選択されることを特徴とする医薬組成物。
  10. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記第２の抗癌剤が、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブであることを特徴とする医薬組成物。
  11. 請求項１乃至１０の何れか１項に記載の医薬組成物において、前記癌が、白血病、リンパ腫、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌（結腸直腸癌）、直腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌（非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌）、気管支癌、骨癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、胆管癌、食道癌、腎細胞癌、甲状腺癌、頭部及び頚部の扁平上皮癌（頭部及び頚部癌）、精巣癌、内分泌腺癌、副腎腺癌、脳下垂体癌、皮膚癌、軟組織の癌、血管の癌、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌、中咽頭癌、下咽頭癌、子宮頸癌、及び子宮癌、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、並びに肉腫からなる群から選択され、前記白血病が、全身性肥満細胞症、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍、骨髄異形成症候群、単球性白血病、及びプラズマ細胞白血病病からなる群から選択され；前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、並びに例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）などの非ホジキンリンパ腫を含む、組織球性リンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択され；前記肉腫が、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、及び軟骨肉腫からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
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