CN110799640A - 表达嵌合抗原受体的t细胞 - Google Patents

Abstract

本文描述了产生和利用包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的方法，该嵌合抗原受体包含与CD79b结合或与CD79b和CD19结合的细胞外结构域。进一步地，本发明涉及治疗癌症、浆细胞疾病或障碍、或者自身免疫疾病或障碍的方法。

Description

表达嵌合抗原受体的T细胞

技术领域

本文所述的技术涉及免疫疗法。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)提供了一种将细胞毒性T细胞应答指向表达所选靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方法。CAR是对T细胞受体的适应，其中抗原结合结构域被特异性结合靶抗原的抗体的抗原结合结构域取代。由在T细胞上表达的CAR(“CAR T细胞”)与靶细胞表面上的靶抗原接合促进靶细胞的杀伤。

套细胞淋巴瘤(MCL)的特征为进展型临床病程(aggressive clinical coursew)，许多患者对当前可用疗法具有高耐受性。尽管最近在治疗方面具有优势，但MCL仍是无法治愈的疾病。利用经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继免疫疗法已显示出治疗CD19⁺B细胞恶性肿瘤的巨大潜力。然而，已经描述了接受CD19 CAR疗法的患者由于抗原逃逸(antigen-escape)而导致治疗失败。

治疗B细胞恶性肿瘤(包括MCL)的新方法将是有益的。

发明内容

CAR T细胞是前沿疗法，在治疗癌症方面显示出巨大的希望。该技术被证明对各种非实体癌症(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)特别有效。CAR T疗法设计中遇到的一个问题是，通过由CAR识别的靶抗原或肿瘤相关因子的缺失，从而肿瘤逃逸。当肿瘤下调或以其他方式缺失靶抗原或因子的细胞表面表达时，它将不再被设计为靶向该抗原或因子的CAR T细胞有效地攻击。例如，在靶向B细胞成熟抗原(BCMA)(其在例如B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中表达)的CAR T疗法中观察到了这一点。也已经在靶向CD19的CAR T疗法中观察到了这一点。

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)多肽，其各自包括细胞外结构域，该细胞外结构域包括与CD79b特异性结合的序列，例如，针对CD79b的抗体的抗原结合区。在某些实施例中，抗原结合区是针对CD79b的单链抗体(scFv)，其任选地包括轻链和重链。该轻链可以在该重链的N末端，或该重链可以在该轻链的N末端。

该CAR多肽可以进一步包括铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的一个、多个或全部。在多个实施例中，该铰链和跨膜结构域是CD8铰链结构域和跨膜结构域；该共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域；和/或该信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。因此，在一个实施例中，本发明的CAR包括抗CD79b scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、和CD3ζ信号传导结构域。

在多个实施例中，CAR多肽的细胞外结构域进一步包括与CD19特异性结合的序列，例如，针对CD19的抗体的抗原结合区。在某些实施例中，与CD19结合的序列包括针对CD19的单链抗体(scFv)。该scFv可以任选地包括轻链和重链。该轻链可以在该重链的N末端，或该重链可以在该轻链的N末端。在多个进一步的实施例中，与CD79b结合的序列的在与CD19结合的序列的N末端，而在其他实施例中，与CD19结合的序列在与CD79b结合的序列的N末端。

在多个实施例中，该CAR多肽包括SEQ ID NO:1、2、10或11的序列或其变体，其中该序列任选地删除SEQ ID NO:3的CD8前导序列。

在某些实施例中，该CAR多肽包括SEQ ID NO:3的CD8前导序列或其变体；SEQ IDNO:4的抗CD79b轻链序列或其变体；SEQ ID NO:6的抗CD79b重链序列或其变体；SEQ ID NO:5的接头序列或其变体；SEQ ID NO:7的CD8跨膜和铰链序列或其变体；SEQ ID NO:8的4-1BBICD序列或其变体；SEQ ID NO:9的CD3ζICD序列或其变体；和/或SEQ ID NO:13的抗CD19scFv序列或其变体。包括这些序列的所有组合的CAR均包括在本发明中。

本发明还提供了核酸分子，其各自包括编码如本文所述的CAR多肽的序列，以及包括此类核酸分子的载体。此外，本发明包括细胞(例如，T细胞，如原代T细胞(例如，人T细胞，其可以是自体的或同种异体的))，该细胞包括如本文所述的CAR多肽，或如本文所述的核酸分子或载体。本发明进一步包括药物组合物，该药物组合物包括如本文所述的CAR多肽、核酸分子、载体、或细胞。

本发明还提供了通过向受试者施用如本文所述的药物组合物治疗患有癌症或处于癌症风险(例如，B细胞恶性肿瘤)的受试者的方法。在多个实施例，该癌症是淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤，如例如，套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；也参见下文)。本发明进一步包括如本文所述的药物组合物在治疗受试者(例如，如本文所述的患有癌症或处于癌症风险的受试者)中的用途。

本发明另外提供了通过向受试者施用如本文所述的药物组合物治疗在接受CD19CAR疗法后复发CD19阴性淋巴瘤的受试者的方法。本发明进一步包括如本文所述的药物组合物在治疗这种受试者中的用途。

本发明进一步提供了制备表达CD79b特异的或CD79b和CD19特异的CAR多肽的CART细胞的方法。该方法包括将如本文所述的将核酸分子或载体引入T细胞(例如，原代T细胞，如人原代T细胞，其可以是自体的或同种异体的)。

如本文所定义，在本发明内容和本文其他地方提及的CAR组分各自可以任选地具有实例2或实例3中列出的各自组分的序列，或为其变体。

定义

为方便起见，下文提供了说明书、实例和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定实施例，并且不旨在限制所要求保护的技术，因为本技术的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。若本领域术语的使用与本文提供的定义之间存在明显差异，则以本说明书中提供的定义为准。

免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下中找到：The Merck Manualof Diagnosis and Therapy[默克诊断和治疗手册],第19版,Merck Sharp&Dohme Corp.[默沙东公司],2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编),TheEncyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine[分子细胞生物学和分子医学百科全书],由Blackwell Science Ltd.[布莱克威尔科学有限公司]出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；及Robert A.Meyers(编),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference[分子生物学和生物技术：全面的案头参考],由VCH Publishers,Inc.[VCH出版社有限公司]出版,1995(ISBN1-56081-569-8)；Werner Luttmann,Immunology[免疫学],由Elsevier[爱思唯尔]出版,2006；Janeway’sImmunobiology[詹韦免疫生物学],Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编),Taylor&Francis Limited(泰勒与弗朗西斯有限公司),2014(ISBN0815345305,9780815345305)；Lewin’s Genes XI[勒温基因XI],由Jones&Bartlett Publishers[琼斯和巴特利特出版社]出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约州,美国(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology[分子生物学的基本方法],Elsevier Science Publishing,Inc.[爱思唯尔科学出版有限公司],纽约,美国(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA[酶学的实验室方法：DNA],Jon Lorsch(编),Elsevier[爱思唯尔],2013(ISBN 0124199542)；CurrentProtocols in Molecular Biology(CPMB)[分子生物学的最新方案(CPMB)],FrederickM.Ausubel(编),John Wiley and Sons[约翰威利父子公司],2014(ISBN 047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS)[蛋白科学的最新方案(CPPS)],John E.Coligan(编),John Wiley and Sons,Inc.[约翰威利父子公司],2005；和Current Protocols in Immunology(CPI)[免疫学的最新方案(CPI)](John E.Coligan等人(编),John Wiley and Sons,Inc.[约翰威利父子公司],2003(ISBN 0471142735,9780471142737)，其各自的内容通过援引以其全文并入本文。

术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中均用于表示降低统计学上显著的量。在一些实施例中，“减少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”通常表示与参考水平相比降低至少10％(例如，没有既定治疗或药物)和可以包括，例如，降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“减少(reduction)”或“抑制(inhibition)”不涵盖与参考水平相比完全抑制或减少。“完全抑制”是与参考水平相比100％抑制。在适用的情况下，降低可以降至无既定障碍的个体在正常范围内接受的水平。

术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于表示增加统计学上显著的量。在一些实施例中，术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”可意指与参考水平相比增加至少10％，例如，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达且包括100％的增加，或者与参考水平相比10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍与10倍之间或更多的任何增加。在标志物或症状的背景下，“增加(increase)”是这种水平的统计学上的显著增加。

如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括，例如，黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如，恒河猴)。啮齿动物包括，例如，小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、家兔和仓鼠。家畜和野生动物包括，例如，牛、马、猪、鹿、野牛、水牛，猫科动物(例如，家猫)、犬科动物(例如犬)、狐狸、狼、禽类(例如，鸡)、鸸鹋、鸵鸟以及鱼类(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。本文中术语“个体”、“患者”和“受试者”可互换使用。

在多个实施例中，受试者是哺乳动物。该哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的受试者。受试者可以是男性或女性，其可以是成人、儿童或婴儿。

受试者可以是先前已被诊断为或被识别为经受或患有需要治疗的病症(例如，淋巴瘤、白血病或除此之外的另一类型的癌症)或与该病症有关的一种或多种并发症的受试者，并且任选地，已对该病症或与该病症有关的一种或多种并发症进行了治疗。可替代地，受试者也可以是先前未被诊断为患有这种病症或相关并发症的受试者。例如，受试者可以是展现出该病症一种或多种风险因素或与该病症相关的一种或多种并发症的受试者，或未展现出风险因素的受试者。

对特定病症的治疗“有需要的受试者”可以是患有该病症、被诊断为患有该病症或有患该病症的风险的受试者。

“疾病”是动物(例如，人)的健康状态，其中动物无法维持体内平衡，并且其中如果疾病未有得到改善，则动物的健康状态将继续恶化。相反，动物中的“障碍”是如下健康状态，在这种状态中动物能够维持体内平衡，但在这种状态中动物的健康状况不如没有该障碍时的健康状态。如果不及时治疗，障碍不一定会导致动物健康状态进一步下降。

如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌抗原”可互换使用，是指由癌细胞差异化表达的抗原，并且从而可加以利用以靶向癌细胞。癌抗原是可以潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些被正常细胞编码，但不一定被正常细胞表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常是沉默的(即，不表达的)那些抗原、仅在某些分化阶段表达的那些抗原以及暂时表达的那些抗原(如胚胎和胎儿抗原)。其他癌抗原由突变型细胞基因编码，如癌基因(例如，活化的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变型p53)和由内部缺失或染色体易位导致的融合蛋白。仍其他的癌抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。已经从多种实体肿瘤角度定义了许多肿瘤抗原：MAGE 1、2和3，按免疫力定义；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，已经显示病毒蛋白(如乙型肝炎病毒(HBV)、埃巴病毒(EBV)和人乳头瘤病毒(HPV)编码的一些病毒蛋白)分别在肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展中是重要的。

如本文所用，术语“嵌合”是指至少两种或更多种不同多核苷酸分子的部分融合的产物。在一个实施例中，术语“嵌合”是指通过操纵已知元件或其他多核苷酸分子产生的基因表达元件。

在一些实施例中，“活化”可以指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。在一些实施例中，活化可以指诱导的细胞因子产生。在其他实施例中，活化可以指可检测的效应子功能。至少，如本文所用的“活化的T细胞”是增殖性T细胞。

如本文所用，术语“特异性结合”(“specific binding”和“specifically bind”)是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一个实体与第二个实体(即靶标)的结合比其与非靶标的第三个实体的结合具有更大的特异性和亲和力。在一些实施例中，特异性结合可以指第一个实体对第二个实体(即靶标)的亲和力，该亲和力超过在相同条件下与第三个实体(非靶标)的亲和力的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。给定靶标的特异性试剂是在所用测定条件下对该靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性实例包括识别同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白并与之结合的抗体或配体。

如本文所用，“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(APC，例如，巨噬细胞、树突细胞、B细胞、人工APC等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”或“共刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次应答(包括但不限于增殖、活化、免疫应答的启动等)的配体。刺激配体在本领域中是熟知的，并尤其是涵盖负载肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。

本文使用的术语“刺激分子”意指T细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的分子。

本文使用的术语“共刺激配体”包括APC上的分子，该分子特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合提供的原始信号之外的信号，并介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于4-1BBL、OX40L、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll样受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还可包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。

例如，4-1BBL是属于TNFR/TNF配体超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL是与T细胞上表达的受体4-1BB(CD137)结合的共刺激配体。4-1BBL在专职性APC上表达，该专职性APC包括树突状细胞、巨噬细胞和活化的B细胞。4-1BBL序列对于许多物种是已知的，例如人4-1BBL，也称为TNFSF9(NCBI基因ID：8744)多肽(例如，NCBI参考序列NP_003802.1)和mRNA(例如，NCBI参考序列NM_003811.3)。4-1BBL可以指人4-1BBL，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施例中，例如在兽医应用中，4-1BBL可以指，例如犬、猫、牛、马、猪等的4-1BBL。本领域技术人员可以容易地鉴定人4-1BBL的同源物和/或直系同源物，例如，使用NCBI直系同源物搜索功能或搜索给定物种的与参考4-1BBL序列相似的序列的可用序列数据。

“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll样受体、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和CD83。

在一个实施例中，如本文所用的术语“工程化的”及其语法等同物可以指核酸(例如，生物体基因组内的核酸)的一种或多种人类设计的改变。在另一实施例中，工程化可以指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化的细胞”可以指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用的术语“细胞”或“工程化的细胞”及其语法等同物可以指人或非人动物来源的细胞。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一多核苷酸分子，例如启动子，其与第二可转录的多核苷酸分子(如目的基因)连接，其中这些多核苷酸分子被安排以使第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。这两个多核苷酸分子可以是或可以不是单个连续多核苷酸分子的一部分，并且可以相邻或不相邻。例如，如果一个启动子调节或介导细胞中目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。

在如本文所述的多个实施例中，进一步预期涵盖所述的任何特定多肽的变体(天然存在或其他方式)、等位基因、同源基因、保守修饰的变体和/或保守取代变体。关于氨基酸序列，普通技术人员将认识到改变编码序列中单个氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中这种改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代并保留所需的多肽活性。此类保守修饰的变体补充而不排除与本公开文本一致的多态变体、种间同源基因和等位基因。本文提供的序列的变体(参见，例如，实例2和实例3)包括在本发明中。

既定氨基酸可以被具有相似生理化学特性的残基取代，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(如Ile、Val、Leu或Ala)，或用一个极性残基取代另一个(如Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其他这样的保守取代，例如，具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是熟知的。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽，以确认保留了所需活性，例如，原生或参考多肽的配体介导的受体活性和特异性。

氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(参见A.L.Lehninger,Biochemistry[生物化学],第二版,第73-75页,Worth Publishers[沃思出版公司],纽约(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可替代地，基于共同的侧链特性可将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Gln；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代将需要将这些类别之一的一个成员与另一个类别交换。特定的保守性取代包括，例如：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。

在一些实施例中，本文所述的多肽(或编码这种多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能片段。如本文所用，“功能片段”是根据本领域已知或本文下文所述的测定保留至少50％的野生型参考多肽活性的肽的片段或部分。功能片段可包含本文披露的序列的保守取代。

在一些实施例中，本文所述的多肽可以是本文所述的多肽或分子的变体(参见，例如，实例2和实例3中的序列)。在一些实施例中，该变体是保守性修饰的变体。例如，可以通过原生核苷酸序列的突变获得保守取代变体。如本文所提及的“变体”是与原生或参考多肽基本上同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与原生或参考多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的DNA序列包括与原生或参考DNA序列相比包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是编码保留非变体多肽活性的变体蛋白或其片段的序列。多种基于PCR的位点特异性诱变方法是本领域已知的，并且可由普通技术人员应用。

变体氨基酸或DNA序列与原生或参考序列(参见，例如，实例2的序列)可以为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高比例同一。可以确定原生序列和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)，例如，通过使用在万维网上通常用于此目的的可免费获取的计算机程序(例如，BLASTp或BLASTn，默认设置)比较这两个序列。

原生氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的许多技术中的任何一种来完成。例如，通过合成含有突变序列的寡核苷酸，可以在特定基因座处引入突变，该突变序列的侧翼是允许连接原生序列的片段的限制性位点。连接后，得到的重构序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可替代地，可以采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变程序来提供改变的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。进行此类改变的技术已经很成熟，包括，例如，由以下所披露的：Walder等人(Gene[基因]42:133,1986)；Bauer等人(Gene[基因]37:73,1985)；Craik(BioTechniques[生物技术],1985年1月,12-19)；Smith等人(Genetic Engineering:Principles andMethods[基因工程：原理与方法],Plenum Press[普莱纽姆出版社],1981)；和美国专利号4,518,584和4,737,462，这些各自通过援引以其全文并入本文。任何不参与维持多肽的正确构象的半胱氨酸残基也可以被取代，通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到多肽中以改善其稳定性或促进寡聚化。

如本文所用，术语“DNA”的定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中与“核酸”可互换使用，指示核苷的聚合物。典型地，多核苷酸由天然存在于通过磷酸二酯键连接的DNA或RNA(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)中的核苷组成。然而，该术语包括含有核苷或核苷类似物的分子，所述核苷或核苷类似物含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且这些分子对于某些应用可能是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应理解，提供DNA和RNA两者，并且在每种情况下均提供单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另有指示，否则本文给出的多核苷酸序列以5’至3’方向呈现。

如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。本文中术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。肽是相对较短的多肽，典型地长度为约2至60个氨基酸。本文使用的多肽典型地含有氨基酸，如蛋白质中最常见的20L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其他氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体，如碳水化合物基团，磷酸基团，脂肪酸基团，用于缀合、官能化等的接头。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生或通过化学方法(如常规固相肽合成等)合成。本文所用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指该多肽材料本身和/或生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的一连串字母或三个字母代码)。除非另有指示，否则本文给出的多肽序列以N末端至C末端方向呈现。

在一些实施例中，编码本文所述多肽的核酸(例如CAR多肽)由载体组成。在本文所述的一些方面中，编码如本文所述的给定多肽或其任何模块的核酸序列与载体可操作地连接。如本文所用，术语“载体”是指设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移到细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒子等。

如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含其他元件，例如，该表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其维持在两种生物体中，例如，在人细胞中进行表达，并在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白质以及适当情况下分泌蛋白质的细胞过程，包括在适用的情况下，但不限于，例如，转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以及通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时，在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。该基因可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如，5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“尾随”序列，以及单个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所用，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一个病毒来源的元件并且具有包装入病毒载体颗粒的能力。该病毒载体可含有编码本文所述多肽(代替非必需病毒基因)的核酸。该载体和/或颗粒可用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。

“重组载体”是指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应当理解，在一些实施例中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在某些实施例中，该载体是附加型的。使用合适的附加型载体提供了维持受试者高拷贝数染色体外DNA中目的核苷酸的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。

如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或终止与疾病或障碍(例如，急性淋巴细胞白血病或其他癌症)相关的病症、疾病或障碍的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓解病症、疾病或障碍的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减慢或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与没有治疗时的预期相比，症状进展或恶化的停止或至少是减缓。有益的或所希望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定化状态(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、缓解(无论是部分还是全部)和/或降低的死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。疾病的术语“治疗”还包括提供减轻疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。

如本文所用，术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如，制药行业中通常使用的载体)组合的活性剂。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是除水之外的载体。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是乳膏、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏。在任何方面的一些实施例中，药学上可接受的载体可以是人工或工程化的载体，例如，其中不会发现天然存在的活性成分的载体。

如本文所用，术语“施用”是指通过导致制剂在预期部位的至少部分递送的方法或途径将如本文所披露的疗法疗或药物组合物置于受试者体内。包含本文披露的制剂的药物组合物可以通过导致受试者有效治疗的任何适当途径施用。

术语“统计学上显著的”或“显著的”是指统计学显著性，并且通常意指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。

除了在操作实例中或另有指示的情况，本文所用的表示成分量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以表示±1％。

如本文所用，术语“包含”意指除了所给出的限定元素之外还可以存在其他元素。“包含”的使用指示包括而不是限制。

术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除该实施例的说明中没有描述的任何元件。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需的那些元件。该术语允许存在不会实质上影响本技术实施例的一个或多个基本和新颖或功能特征的附加元件。

除非上下文中另外明确指示，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物。类似地，词语“或”旨在包括“和”(并且反之亦然)，除非上下文另外明确指示。尽管与本公开文本的实践或测试中可使用与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料，下文描述了适宜的方法和材料。缩写词“例如(e.g.)”衍生自拉丁语“exempli gratia”，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”同义。

在任何方面的一些实施例中，本文所述的公开内容不涉及用于克隆人类的过程、用于修饰人类的种系遗传同一性的过程、人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性的过程，这些过程可能导致它们对人或动物以及由这些过程产生的动物没有任何实质性医疗益处。

在以下技术的各个方面和实施例的描述中定义了其他术语。

附图说明

图1描绘了MCL细胞系Jeko-1上的CD79b、CD79a、CD19、CD37、BCMA、TACI、Fas、CD38和CD138的表面表达。

图2描绘了编码(i)CD79b和(ii)CD79b和CD19构建体的构建体。

图3是显示所示CAR分子在原代T细胞(n＝3)中的转导效率的图。

图4是未转导的(UTD)细胞和所示CAR转导的细胞的生长曲线。

图5是显示CAR转导的细胞的活化水平的图。

图6是显示CAR转导的T细胞对Jeko-1细胞(n＝2)的体外细胞毒性功效的图。CD19(H/L)CAR-黑圆；CD79b(L/H)CAR-五边形；CD79b(H/L)-三角形；UTC-开圆。

图7是显示由CAR转导的细胞产生的效应细胞因子水平的图。

图8A是接受Jeko-1细胞然后是CAR T细胞后的异种移植模型小鼠的时间线。

图8B是显示以FLUX测量的CAR T细胞对Jeko-1细胞的细胞毒性功效的图。

图8C是显示注射后14天血液中存在的CAR T细胞数量的图。

图9A是接受MCL PDX细胞然后是CAR T细胞后的异种移植模型小鼠的时间线。

图9B是显示以FLUX测量的CAR T细胞对PDX肿瘤的细胞毒性功效的图。

图10是显示由表达CD19和CD79b的细胞(n＝3)活化的双特异性CAR的活化百分比的图。

具体实施方式

本文描述了针对CD79b的CAR分子，如本文所述，其可用于预防和治疗癌症(例如，淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤(MCL))和其他非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL))。

还描述了针对CD79b和CD19的双特异性CAR。本文所述的双特异性CAR可以有利地用于减少由于靶抗原的缺失而使肿瘤逃逸的可能性。特别地，如果一种或另一种抗原或因子被靶细胞下调，则与两种不同的肿瘤相关的抗原或因子(例如，CD79b和CD19)结合的CAR将不会失去有效性。类似地，CD79b CAR可以有利地用于治疗先前已用CD19 CAR治疗但出现CD19阴性复发的受试者。

本文所述的技术的实施例涉及发现CD79b在癌细胞(包括淋巴瘤细胞)上表达。因此，针对CD79b(以及任选地，CD19)的CAR是治疗癌症(例如，淋巴瘤(例如，MCL)和其他NHL(如DLBCL、PMBCL、CLL和SLL))的有效疗法。

因此，本文所述的本发明的一方面涉及CAR多肽，该CAR多肽包含(a)细胞外结构域，该细胞外结构域包含(i)与CD79b特异性结合的序列或(ii)与CD79b特异性结合的序列和与CD19特异性结合的序列(例如，单链抗体序列；scFv)，(b)铰链和跨膜结构域，以及(c)细胞内信号传导结构域。任选地，该CAR多肽还包括共刺激结构域(如本文所述)。

以下描述了制备和使用技术的这些以及其他方面时要考虑的注意事项。

嵌合抗原受体

本文所述的技术提供用于免疫疗法的改善的CAR。以下讨论CAR和各种改善。

本文所用的术语“嵌合抗原受体”或一个或多个“CAR”是指工程化的T细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到T细胞上(例如，幼稚T细胞、中枢记忆性T细胞、效应记忆性T细胞或其组合)。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。

CAR放置嵌合细胞外靶标结合结构域，该结构域特异性结合在待靶向的细胞表面上表达的靶标(例如多肽)，以使T细胞应答到包含T细胞受体分子的跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域(包括信号传导结构域)的构建体上。在一个实施例中，该嵌合细胞外靶标结合结构域包含抗体的一个或多个抗原结合结构域，所述抗体与在待靶向的细胞上表达以产生T细胞应答的抗原特异性结合。在另一实施例中，该嵌合细胞外靶标结合结构域包含第一抗体的一个或多个抗原结合结构域(该第一抗体与T细胞应答靶向的细胞上表达的第一抗原特异性结合)，还包含第二抗体的一个或多个抗原结合结构域(该第二抗体与T细胞应答靶向的细胞上表达的第二抗原特异性结合)。CAR的一个或多个细胞内信号传导结构域的特性可以如本领域已知的和本文披露的那样变化，但是当该靶标/抗原结合结构域与靶标细胞表面上的靶标/抗原结合时，该嵌合靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导活化敏感。

关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”CAR包括在抗原结合时仅提供CD3ζ(CD3zeta)信号的那些CAR。所谓的“第二代”CAR包括提供共刺激(例如，CD28或CD137)和活化(CD3ζ)结构域的那些CAR，并且所谓的“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如，CD28和CD137)结构域和活化结构域(例如，CD3ζ)的那些CAR。在多个实施例中，选择CAR以对靶标/抗原具有高亲和力或亲合力。例如，与天然存在的T细胞受体相比，抗体衍生的靶标或抗原结合结构域通常对靶抗原具有更高的亲和力和/或亲合力。这一特性与可以选择的抗体的高特异性相结合，提供了CAR T细胞的高度特异性T细胞寻靶。

如本文所用，“CAR T细胞”或“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时，CAR具有以非MHC限制性方式利用单克隆抗体的抗原结合特性将T细胞特异性和反应性重定向到选定靶标的能力。非MHC限制性抗原识别使得表达CAR的T细胞能够识别独立于抗原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。

如本文所用，术语“细胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的足够促进与靶标结合的多肽。细胞外靶标结合结构域将与其结合配偶体特异性结合。通常，细胞外靶标结合结构域可以包括识别并结合同源结合配偶体蛋白的抗体或配体的抗原结合结构域。在本文中，配体是与蛋白和/或受体的一部分特异性结合的分子。可用于本文所述方法和组合物的配体的同源结合配偶体通常可在细胞表面上找到。配体：同源配偶体结合可以导致带有配体的受体的改变，或活化生理应答，例如，活化信号通路或级联反应。在一个实施例中，该配体可以是非基因组原生的。任选地，该配体在至少两个物种上具有保守的功能。

抗体试剂

在各种实施例中，本文所述的CAR包含抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶标结合结构域。

如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并且与给定抗原特异性结合的多肽。抗体试剂可包含抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施例中，抗体试剂可包含单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文中简称VL)。在另一个实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见，例如，deWildt等人,Eur J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]26(3):629-639,1996；将其通过援引以其全文并入本文)，以及完整的抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM的结构特征(以及亚型及其组合)。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)和灵长类化抗体。抗体还包括中间抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。可以使用本领域普通技术人员已知的方法从例如噬菌体展示文库中选择完全人抗体结合结构域。

VH和VL区可以进一步细分为高可变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，其间穿插有称为“框架区”(“FR”)的更为保守的区。框架区和CDR的范围已被准确定义(参见，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition[免疫学关注的蛋白序列，第五版],U.S.Department of Health and Human Services[美国卫生与公共服务部],NIH出版号91-3242，和Chothia等人,J.Mol.Biol[分子生物学杂志]196:901-917,1987；将其通过援引以其全文并入本文)。每个VH和VL通常由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

在一个实施例中，该抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂(即，该抗体或抗体试剂是小鼠)，但已经人源化。“人源化抗体或抗体试剂”是指在蛋白质序列水平上被修饰以增加其与人类天然产生的抗体或抗体试剂变体的相似性的非人抗体或抗体试剂。人源化抗体的一种方法采用将鼠或其他非人CDR移植到人抗体框架上。

在一个实施例中，CAR的细胞外靶标结合结构域包含或基本上由单链Fv(scFv)片段组成，该片段是通过柔性接头肽融合抗体(通常是单克隆抗体)的VH和VL结构域而产生。在各种实施例中，该scFv与跨膜结构域和T细胞受体细胞内信号传导结构域融合，例如，本文所述的工程化细胞内信号传导结构域。

抗体结合结构域以及选择和克隆它们的方式是本领域普通技术人员所熟知的。

在一个实施例中，CAR多肽的细胞外结构域包含抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶标结合结构域，该细胞外靶标结合结构域针对CD79b。在另一实施例中，该CAR多肽的细胞外结构域包含(i)抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶标结合结构域，该细胞外靶标结合结构域针对CD79b，以及(ii)抗体试剂或其抗原结合结构域作为细胞外靶标结合结构域，该细胞外靶标结合结构域针对CD19。

因此，例如，在一个实施例中，该CAR多肽的细胞外结构域包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:4的轻链序列和/或SEQ ID NO:6的重链序列，或者包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的一个或多个序列。该轻链和重链序列可以是任一顺序，例如，轻链序列可以在重链序列的N末端、或者重链序列可以再轻链序列的N末端。在多个实施例中，该轻链和重链序列通过接头序列(例如，富含甘氨酸的序列；例如，SEQ ID NO:5)彼此分离。

在另一实例中，该CAR多肽的细胞外结构域包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(i)包含针对CD79b的scFv的序列(SEQ ID NO:12)，该序列包括轻链(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和重链(SEQ ID NO:6)，(ii)任选的接头(SEQ ID NO:5)，以及(iii)包含针对CD19的scFv的序列(SEQ ID NO:13)。该CAR多肽的细胞外结构域可以任选地具有与这些序列中的一种或多种具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的一个或多个序列。此外，该轻链和重链的顺序(例如，在CD79b scFv中)可以处于相反的位置。

在一个实施例中，该CAR多肽在其编码区内包含一个或多个突变，以产生如本文所述的变体序列。本领域技术人员将能够使用标准技术将突变引入基因或基因产物的核酸序列中。例如，可以通过定点诱变(PCR技术)引入点突变。定点诱变试剂盒可商购获得，例如，通过新英格兰实验室(New England Biolabs)；伊普斯威奇，马萨诸塞州。将点突变引入基因或基因产物的核酸序列的可替代方法的非限制性实例包括盒式诱变(cassettemutagenesis)或全质粒诱变(whole plasmid mutagenesis)。

在一个实施例中，在本文所述的技术中有用的CAR在细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域中包含至少两个抗原特异性靶向区(例如，SEQ ID NO:12和/或13)。在这类实施例中，这种双特异性CAR的两个或更多个抗原特异性靶向区靶向至少两种不同的抗原，并且可以串联排列并被接头序列(例如SEQ ID NO:5)分离。

靶标/抗原

通常，CAR可以靶向任何细胞表面部分。最常见的是，该靶标将是在希望靶向以产生T细胞应答的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。在这方面，肿瘤抗原或肿瘤相关抗原提供有吸引力的靶标，提供靶向肿瘤细胞同时避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损伤的手段。本文描述了针对CD79b、或CD79b和CD19两者的CAR。其他肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CEA、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6和E7、BING-4、钙活化的氯离子通道2、细胞周期蛋白B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、生存素、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、BRCA1/2、CDK4、MART-2、p53、Ras、MUC1以及TGF-βRII。针对一种或多种这些抗原的CAR可以与针对CD79b、或CD79b和CD19的CAR组合使用，如本文所述，如本领域技术人员确定合适。

铰链和TM结构域

如本文所述的CAR各自可以包括将细胞外靶标结合结构域与T细胞膜分离的铰链结构域。

如本文所用，“铰链结构域”是指允许结合部分和T细胞膜分离和产生柔性的氨基酸区域。柔性铰链的长度还允许与相对难以接近的表位更好地结合，例如，更长的铰链区允许最佳结合。本领域技术人员将能够确定给定CAR靶标的合适铰链。在一个实施例中，本文所述的任何CAR多肽的跨膜结构域或其片段包含CD8或4-1BB铰链结构域。

如本文所述的每个CAR包括将细胞外靶标结合结构域连接至细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。

如本文所用，“跨膜结构域”(TM结构域)是指CAR的通常疏水性的区域，其穿过细胞的质膜。该TM结构域可以是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或其他跨膜蛋白)的跨膜区域或其片段、人工疏水序列或其组合。尽管本文提供了具体实例并在实例中使用，但其他跨膜结构域对本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以与该技术的替代实施例结合使用。选择的跨膜区或其片段优选地不会干扰CAR的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指足以将蛋白质锚定或附接于细胞表面的跨膜结构域的一部分。

在一个实施例中，本文所述的任何CAR多肽的跨膜结构域或其片段包含选自CD8或4-1BB的跨膜结构域的跨膜结构域。在任何方面的可替代实施例中，本文所述的CAR的跨膜结构域或其片段包含选自以下项的α、β或ζ链的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和/或NKG2C。

CD8是优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并充当T细胞共同受体。CD8由α(CD8a)和β(CD8b)链组成。已知许多物种的CD8a序列，例如，人CD8a(NCBI基因ID：925)多肽(NCBI参考序列NP_001139345.1)和mRNA(例如，NCBI参考序列NM_000002.12)。CD8可以指人CD8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任何方面的一些实施例中，例如在兽医应用中，CD8可以指，例如犬、猫、牛、马、猪等的CD8。本领域技术人员可以容易地鉴定人CD8的同源物和/或直系同源物，例如，使用NCBI直系同源物搜索功能或搜索给定物种的与参考CD8序列相似的序列的可用序列数据。

在一个实施例中，CD8铰链和跨膜序列包含SEQ ID NO:7的序列；或包含与SEQ IDNO:7的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。

共刺激结构域

本文所述的CAR各自可以任选地包含共刺激分子的一个或多个细胞内结构域或共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其提供在与抗原结合后有效活化和T淋巴细胞的功能所需的第二信号。这种共刺激分子的说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。在一个实施例中，该细胞内结构域是4-1BB的细胞内结构域。

因此，在一个实施例中，该CAR多肽进一步包含细胞内结构域。如本文所用，“细胞内结构域”是指完全包含在细胞内的序列。在一个实施例中，该细胞内结构域是指受体的细胞内结构域。细胞内结构域可以与细胞的内部相互作用。关于受体的细胞内结构域，该细胞内结构域可以起到传达信号传导的作用。受体的细胞内结构域可以包含酶活性。

在一个实施例中，该细胞内结构域是4-1BB的细胞内结构域(ICD)。在一个实施例中，4-1BB细胞内结构域包含SEQ ID NO:8的序列；或包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。

细胞内信号传导结构域

如本文所述的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR多肽的一部分，其参与将与靶抗原结合的有效CAR的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性因子释放到已与CAR结合的靶细胞，或抗原与细胞外CAR结构域结合后引发的其他细胞应答。

CD3是T细胞共同受体，其在同时参与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)时促进T淋巴细胞活化。CD3复合物由4个不同的链组成；哺乳动物CD3由一个CD3γ链、一个CD3δ链和两个CD3ε链组成。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和CD3ζ结合，在T淋巴细胞中生成活化信号。完整的TCR复合物包含TCR、CD3ζ和完整的CD3复合物。

在任何方面的一些实施例中，本文所述的CAR多肽包含细胞内信号传导结构域，其包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序或来自CD3ζ(CD3 zeta)的ITAM。在任何方面的一些实施例中，该ITAM包括CD3ζ(ITAM3)的ITAM的三个基序。在任何方面的一些实施方案中，CD3ζ的ITAM的三个基序被突变。

ITAMS被称为初级信号传导结构域，其以刺激或抑制的方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序，这些信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在该技术中特别使用的含有细胞内信号传导结构域的ITAM的非限制性实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

本领域技术人员将能够使用标准技术将突变引入基因或基因产物(例如，ITAM)的核酸序列中。例如，可以通过定点诱变(PCR技术)引入点突变。定点诱变试剂盒可商购获得，例如，通过新英格兰实验室(New England Biolabs)；伊普斯威奇，马萨诸塞州。将点突变引入基因或基因产物的核酸序列的可替代方法的非限制性实例包括盒式诱变或全质粒诱变。

在一个实施例中，CAR中使用的ITAM是基于CD3ζ的可替代物，包括从CD3ζ突变的ITAM(其含有3个ITAM基序)，CD3ζ的截短，及称为CD3ε、CD3θ的可替代剪接变体，以及工程化表达CD3ε或CD3θ与CD3ζ之间的融合蛋白的人工构建体

在一个实施例中，CD3ζ细胞内信号传导序列对应于SEQ ID NO:9的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO:9的序列；或包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。

CAR和CAR T细胞的更详细描述可以在以下中发现：Maus等人,Blood[血液]123:2624-2635,2014；Reardon等人,Neuro-Oncology[神经肿瘤学]16:1441-1458,2014；Hoyos等人,Haematologica[血液学]97:1622,2012；Byrd等人,J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]32:3039-3047,2014；Maher等人,Cancer Res.[癌症研究]69:4559-4562,2009；和Tamada等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症杂志]18:6436-6445,2012；将其各自通过援引以其全文并入本文。

在一个实施例中，该CAR多肽进一步包含CD8前导序列。如本文所用，“前导序列”，也称为前导RNA，是指直接在起始密码子上游的mRNA的区域。前导序列对于转录物翻译的调控可以是重要的。

在一个实施例中，CD8前导序列对应于SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或包含SEQ IDNO:3；或包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的序列。

在一个实施例中，该CAR还包含接头结构域。如本文所用，“接头结构域”是指长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将如本文所述的CAR的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施例中，接头可包括或由柔性残基如甘氨酸和丝氨酸组成，以使相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当希望确保两个相邻的结构域不在空间上彼此干扰时，可以使用更长的接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的实例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等同物及其组合。在一个实施例中，该接头区是衍生自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A。接头的非限制性实例包括衍生自脉扁刺蛾β四体病毒的接头、和衍生自内部核糖体进入位点(IRES)序列的接头。

在一个实施例中，如本文所述的CAR还包含报告分子，例如，以允许非侵入性成像(例如，正电子发射断层摄影PET扫描)。在包含报告分子的双特异性CAR中，第一细胞外结合结构域和第二细胞外结合结构域可包括不同或相同的报告分子。在双特异性CAR T细胞中，第一CAR和第二CAR可以表达不同或相同的报告分子。在另一实施例中，本文所述的CAR进一步包含报告分子(例如，潮霉素磷酸转移酶(hph))，该报告分子可以单独成像，也可以与底物或化学品(例如，9-[4-[¹⁸F]氟-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤([¹⁸F]FHBG))。在另一实施例中，如本文所述的CAR还包含可以使用非侵入性技术(例如，用⁶⁴Cu²⁺功能化的金纳米颗粒(GNP))容易地成像的纳米颗粒。对用于非侵入性成像的CAR T细胞标记进行综述，例如，Bhatnagar等人,Integr.Biol.(Camb)[整合生物学(柬埔寨)]5(1):231-238,2013，和Keu等人,Sci.Transl.Med.[科学转化医学]9(373),2017，通过援引以其全文并入本文。

GFP和mCherry在本文中被证明是可用于对在T细胞(例如，CAR T细胞)上表达的CAR进行成像的荧光标签。预期基本上本领域已知的任何荧光蛋白均可用作此目的的荧光标签。对于临床应用，该CAR不需要包括荧光标签或荧光蛋白。

本发明的另一方面涉及CAR多肽，该CAR多肽包含与选自SEQ ID NO:1、2、10和11(任选地，其中省略了SEQ ID NO:3的CD8前导序列)的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。本发明的另一方面涉及CAR多肽，该CAR多肽包含选自SEQ ID NO:1、2、10和11(任选地，其中省略了SEQ ID NO:3的CD8前导序列)的序列。

本文所述的本发明的另一方面涉及多肽复合物，该多肽复合物包含本文所述的任何CAR多肽中的两种或更多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、或者十种或更多种)。在一个实施例中，该多肽复合物包含本文所述的任何CAR多肽中的三种。

本发明的另一方面涉及哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞包含本文所述的任何CAR多肽；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸。在一个实施例中，该哺乳动物细胞包含抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何CAR多肽、或编码该类抗体的核酸、抗体试剂、其抗原结合部分、或本文所述的任何CAR多肽。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、羊、马、山羊、犬或猫来源，但也可以使用任何其他哺乳动物细胞。在任何方面的优选实施例中，该哺乳动物细胞是人。

在一个实施例中，该细胞是T细胞。在任何方面的备选实施例中，该细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞具有造血来源，并且包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施例中，该细胞是T细胞；NK细胞；NKT细胞；淋巴细胞，如B细胞和T细胞；以及骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。

在一个实施例中，该细胞是从患有或被诊断患有癌症、浆细胞障碍或自身免疫疾病的个体获得的。

如本文所用，“癌症”可以是指细胞的过度增殖，其独特的特性-正常细胞控制缺失-导致生长失调、缺乏分化、局部组织浸润和转移，并且可以是，例如，淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤或实体瘤。在某些实例中，癌症是任何类型的B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、黏膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、HHV8相关的多中心卡斯特莱曼病引起的大B细胞淋巴瘤、和不可分类B细胞淋巴瘤。

白血病的非限制性实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一个实施例，该癌症是ALL或CLL。实体肿瘤的非限制性实例包括肾上腺皮质瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮癌、软骨肉瘤、结直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体肿瘤)、骨和软组织巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和威尔姆斯瘤。实体肿瘤可以在骨骼、肌肉或器官中找到，并且可以是肉瘤或上皮癌。预期本文所述的本发明的任何方面可用于治疗所有类型的癌症，包括在本申请中未列出的癌症。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长，例如，恶性类型或良性类型。

如本文所用，“自身免疫疾病或障碍”的特征在于一个人的免疫系统不能区分外来细胞和健康细胞。这导致一个人的免疫系统靶向其健康细胞以造成程序性细胞死亡。自身免疫性疾病或障碍的非限制性实例包括炎症性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症、银屑癣、炎症性肠病、SLE、和血管炎、过敏性炎症(如过敏性哮喘、特应性皮炎和接触性超敏反应)、类风湿关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮、格雷夫斯病(甲状腺功能亢进)、桥本甲状腺炎(甲状腺功能低下)、慢性移植物抗宿主病、血友病(具有凝血因子抗体)、乳糜泻、克罗恩病和溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、原发性胆汁性硬化/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺现象、硬皮病、干燥综合征、古德帕斯彻氏综合征、韦格纳肉芽肿、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、银屑癣、自身免疫性艾迪生病、强直性脊柱炎、急性弥漫性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、斜视眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、奥德甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、犬多发性关节炎、瑞特氏综合征、大动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿和纤维肌痛(FM)。

在一个实施例中，哺乳动物细胞是对患有导致免疫系统活动异常低下的免疫系统障碍、或免疫缺陷障碍(其阻碍人抵抗外来细胞(例如，病毒或细菌细胞)的能力)的患者获得的。

浆细胞是由B淋巴细胞产生的白细胞，其功能是生成和释放抗感染所需的抗体。如本文所用，“浆细胞障碍或疾病”的特征在于浆细胞的异常增殖。异常的浆细胞能够“排挤”健康的浆细胞，这导致对抗外来物体(如病毒或细菌细胞)的能力降低。浆细胞障碍的非限制性实例包括淀粉样变性病、华氏巨球蛋白血症、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和浆细胞骨髓瘤。

可以使用本领域已知的标准技术从受试者获得T细胞，例如，从取自患者的外周血中分离出T细胞。

细胞(例如，T细胞)，可以被工程化为包含本文所述的任何CAR多肽；或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸。在一个实施例中，本文所述的CAR多肽包含在慢病毒载体中。使用感染标准技术将慢病毒载体用于在细胞中表达CAR多肽。

逆转录病毒(如慢病毒)为递送编码基因或目的嵌合基因的核酸序列提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的核酸序列插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒并递送至细胞，例如，体外或离体。逆转录病毒系统是本领域所熟知的，如下所述，例如，美国专利号5,219,740；Kurth和Bannert(2010)“Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis[逆转录病毒：分子生物学、基因组学和发病机理]”Calster Academic Press[加州大学出版社](ISBN:978-1-90455-55-4)；以及Hu和Pathak Pharmacological Reviews[药理学综述]2000 52:493-512；将其通过援引以其全文并入本文。用于有效DNA递送的慢病毒系统可以购自傲锐基因公司(OriGene)；罗克维尔，马里兰州。在可替代的实施例中，本文所述的任何CAR的CAR多肽通过包含编码CAR的核酸的表达载体的转染或电穿孔而在哺乳动物细胞中表达。转染或电穿孔方法是本领域中己知的。

可以使用检测编码该CAR的核酸的mRNA、DNA或基因产物的标准测定来评估本文所述的任何CAR多肽的CAR多肽高效表达。例如，RT-PCR、FACS、RNA印迹、蛋白印迹、ELISA或免疫组织化学法。

在一个实施例中，本文所述的任何CAR多肽中的CAR多肽是组成型表达的。在一个实施例中，本文所述的任何CAR多肽中的CAR多肽由重组核酸序列编码的。

本文所述的本发明的一方面涉及治疗受试者的癌症、浆细胞障碍、淀粉样变性、或自身免疫性疾病的方法，该方法包括：工程化T细胞以在T细胞表面上包含本文所述的任何CAR多肽；将工程化的T细胞施用于该受试者。

本文所述的本发明的另一方面涉及治疗受试者的癌症、浆细胞障碍或自身免疫性疾病的方法，该方法包括施用本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸的细胞。

在一个实施例中，该方法进一步包括在向受试者施用该细胞前活化或刺激CAR-T，例如，根据本文其他地方所述的方法。

在一个实施例中，癌细胞包含肿瘤抗原CD79b、或肿瘤抗原CD79b和CD19两者。

施用

在一些实施例中，本文所述的方法涉及用包含本文所述的任何CAR多肽、或编码本文所述任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞治疗患有或被诊断患有癌症、浆细胞病或障碍或自身免疫疾病或障碍的受试者。如本文所用，“本文所述的CAR T细胞”是指包含本文所述的任何CAR多肽或编码本文所述的任何CAR多肽的核酸的哺乳动物细胞。如本文所用，“病症”是指癌症、浆细胞病或障碍、或自身免疫疾病或障碍。患有病症的受试者可以由医生使用现有诊断该病症的方法来鉴定。该病症的症状和/或并发症表征这些病症并有助于诊断，这些症状和/或并发症在本领域中是熟知的，包括但不限于疲劳、持续性感染和持续性出血。对于给定的病症，可有助于诊断(例如该病症)的测试包括但不限于血液筛查和骨髓测试，并且这些测试是本领域已知的。病症的家族史或暴露于病症的风险因素也可以帮助确定受试者是否可能患有该病症或帮助诊断该病症。

本文所述的组合物可以施用于患有或被诊断为患有病症的受试者。在一些实施例中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量的本文所述的活化的CAR T细胞，以缓解该病症的症状。如本文所用，“缓解该病症的症状”是改善与该病症相关的任何病症或症状。与同等的未治疗的对照相比，用任何标准技术测量的这种减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更高。用于向受试者施用本文所述组合物的多种方法是本领域技术人员已知的。在一个实施例中，本文所述的组合物是全身或局部施用的。在优选的实施例中，本文所述的组合物是静脉内施用的。在另一实施例中，将本文所述的组合物施用至肿瘤部位。

如本文所用的术语“有效量”是指缓解疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的活化的CAR T细胞的量，并且涉及足以提供所需效果的细胞制剂或组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用于典型受试者时足以提供特定抗病症效果的活化的CAR T细胞的量。在多种情况下，如本文所用的有效量还将包括足够延迟疾病症状的进展、改变症状疾病的进程(例如，但不限于，减慢病症进展)或逆转病症的症状的量。因此，通常不可能指定一个精确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，一个适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅仅使用常规实验来确定。

可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序评价有效量、毒性和治疗功效。该剂量可以取决于所采用的剂型以及使用的施用途径而变化。毒性与治疗功效之间的剂量比为治疗指数，并且可以被表示为比率LD50/ED50。展现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。此外，可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中或者在适当的动物模型测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的活化的CAR T细胞的浓度)。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。任何特定剂量的作用可以通过合适的生物测定来监测，例如，用于骨髓测试的测定等。剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。

在本发明的一方面，本文所述的技术涉及包含本文所述的活化的CAR T细胞和任选地药学上可接受的载体的药物组合物。该药物组合物的活性成分至少包含如本文所述的活化的CAR T细胞。在一些实施例中，该药物组合物的活性成分基本上由如本文所述的活化的CAR T细胞组成。在一些实施例中，药物组合物的活性成分由如本文所述的活化的CAR T细胞组成。用于基于细胞的治疗配制品的药学上可接受的载体包括盐水和水性缓冲溶液、林格氏溶液和血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL。如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。

在一些实施例中，该包含如本文所述的活化的CAR T细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的施用典型地绕过患者对污染物的天然防御，因此除了CAR T细胞本身之外的组分优选地是无菌的或能够在施用于患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于即用型注射溶液、随时可溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干燥产品，即用于注射的悬浮液和乳液。这些中的任何一种都可以在施用前添加到活化的CART细胞制剂中。

可用于提供如本文所披露的活化CAR T细胞的肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物包括但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；可与水混溶的媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

剂量

本文使用的术语“单位剂型”是指适合一次施用的剂量。举例来说，单位剂型可以是置于递送装置(例如，注射器或静脉内滴注袋)中的一定量的治疗剂。在一个实施例中，单位剂型以单次施用的形式施用。在另一个实施例中，可以同时施用多于一个单位剂型。

在一些实施例中，本文所述的活化的CAR T细胞作为单一疗法施用，即，与该病症的另一种治疗不同时施用于受试者。

包含本文所述T细胞的药物组合物通常能以10⁴到10⁹个细胞/kg体重的剂量施用，在一些情况下，10⁵到10⁶个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。如果需要，T细胞组合物也能以这些剂量多次施用。这些细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。

在某些方面，可能需要将活化的CAR T细胞施用于受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采术)，如本文所述从其中活化T细胞，并将这些活化的和扩增的T细胞重新输注给患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自l0cc至400cc抽血的T细胞活化。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或l00cc抽血的T细胞活化。

施用方式可包括，例如，静脉内(i.v.)注射或输注。本文所述的组合物可通过经动脉、肿瘤内、结节内或髓内施用于患者。在一些实施例中，T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在一个实施例中，将本文所述的组合物施用到体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊髓液)中。

在一个特定的示例性方面，受试者可进行白细胞去除术，其中白细胞被离体收集、富集或耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。这些T细胞分离物可以通过与人工抗原呈递细胞(aAPC)(例如，表达抗CD28和抗CD3 CDR的aAPC)接触而扩增，并且进行处理使得可引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生CAR T细胞。有需要的受试者随后可以进行高剂量化学疗法的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在移植之后或移植的同时，受试者可以接受扩增的CAR T细胞的输注。在一个实施例中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

在一些实施例中，在施用如本文所述的一种或多种CAR T细胞之前，对受试者进行淋巴细胞清除。在此类实施例中，该淋巴细胞清除可包括施用美法仑、环磷酰胺、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。

应施用于患者的上述治疗的剂量将因所治疗病症的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来进行人类施用剂量的缩放。

在一些实施例中，需要单一治疗方案。在其他实施例中，可以进行一种或多种后续剂量或治疗方案的施用。例如，在每两周一次的治疗持续三个月后，可以按每个月一次重复治疗，持续六个月或一年或更长。在一些实施例中，在初始治疗后不施用另外的治疗。

如本文所述的组合物的剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生典型地会监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否施用进一步的细胞、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案做出其他改变。剂量不应大到引起不良副作用，如细胞因子释放综合征。通常情况下，剂量将随患者的年龄、病症和性别而不同，并且可由本领域技术人员确定。在任何并发症的事件下，也可以由个别医师调整剂量。

组合疗法

本文所述的活化的CAR T细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。在一个实施例中，向受试者施用抗CD19疗法和抗CD79b疗法。在另一实施例中，进一步向受试者施用抗BCMA疗法。如本文所用，“组合”施用意指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断出患有该障碍后并且在该障碍被治愈或消除之前或治疗因其他原因停止治疗之前递送两种或更多种治疗。在一些实施例中，当第二次治疗的递送开始时仍在进行一种治疗的递送，从而在治疗施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时(simultaneous)”或“同时递送(concurrent delivery)”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施例中，治疗由于组合施用而更有效。例如，第二次治疗更有效，例如，与没有第一次治疗的情况下施用第二次治疗相比，更少的第二次治疗观察到等同的作用，或者第二次治疗在更大程度上减轻了症状，或者观察到与第一次治疗时类似的情况。在一些实施例中，递送使得症状减轻或与障碍相关的其他参数的减小大于在没有一种治疗时递送的另一种治疗所观察到的。这两种治疗的作用可以是部分相加、完全相加或大于相加的作用。该递送可以使得当递送第二次治疗时仍然可以检测到递送的第一次治疗的作用。本文所述的活化的CAR T细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时施用、在相同或分开的组合物中施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的CAR表达细胞，并且可以第二次施用另外的试剂，或者可以逆转施用顺序。可以在活动障碍期间、或在缓解期间或活动较少的疾病期间施用CAR T疗法和/或其他治疗剂、程序或方式。CAR T疗法可以在另一种治疗之前施用、与该治疗同时施用、治疗后施用或在障碍缓解期间施用。

当组合施用时，活化的CAR T细胞和另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)，或全部，能以与每种药剂单独使用(例如，作为单一疗法)的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，活化的CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)或全部的施用量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)单独使用的每种药剂的量或剂量。在其他实施例中，导致所需效果(例如，癌症治疗)的活化的CAR T细胞、另外的药剂(例如，第二或第三种药剂)或全部的量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)实现相同治疗效果所需的单独的每种药剂的量或剂量。在进一步的实施例中，治疗方案中本文所述的活化的CAR T细胞可以与手术、化疗、放疗、mTOR途径抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体)、或者其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子或肽疫苗组合使用，如Izumoto等人,J.Neurosurg.[神经外科杂志]108:963-971,2008所述。

在一个实施例中，本文所述的活化CAR T细胞可以与检查点抑制剂组合使用。示例性检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂(纳武单抗、MK-3475、派姆单抗、吡地利单抗、AMP-224、AMP-514)、抗CTLA4抑制剂(伊匹单抗和替西木单抗)、抗PDL1抑制剂(阿特珠单抗、阿威罗单抗(Avelomab)、MSB0010718C、MEDI4736和MPDL3280A)，以及抗TIM3抑制剂。

在一个实施例中，本文所述的活化CAR T细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、氮烯咪胺、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢药(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂(如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺))。考虑用于组合疗法的一般化疗药物包括阿那曲唑

比卡鲁胺

硫酸博来霉素

白消安白消安注射液

卡培他滨

N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥

顺铂

克拉屈滨

环磷酰胺(

或

)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷

阿糖胞苷脂质体注射液

达卡巴嗪

放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素

柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西紫杉醇盐酸多柔比星

依托泊苷

磷酸氟达拉滨

5-氟尿嘧啶

氟他胺

替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲

去甲氧柔红霉素

异环磷酰胺

伊立替康L-天冬酰胺酶

甲酰四氢叶酸钙、美法仑

6-巯基嘌呤

甲氨蝶呤

米托蒽醌

吉妥单抗、紫杉醇菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、卡莫司汀聚苯丙生20植入片

柠檬酸他莫西芬

替尼泊苷

6-硫代鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明

注射用托泊替康盐酸盐长春碱

长春新碱

和长春瑞滨

示例性的烷基化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil

Uracil nitrogen

)、盐酸氮芥

环磷酰胺(

Revimmune^TM)、异环磷酰胺

美法仑

苯丁酸氮芥

哌泊溴烷

三亚乙基三聚氰胺三亚乙基硫代磷胺、替莫唑胺

噻替哌

白消安

卡莫司汀洛莫司汀

链脲佐菌素

和达卡巴嗪

另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂

替莫唑胺(

和

)；更生霉素(也称为放线菌素-D，

)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶血素和苯丙氨酸氮芥、

)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

)；卡莫司汀

苯达莫司汀

白消安(和

)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU、

)；顺铂(也称为CDDP、

和

-AQ)；苯丁酸氮芥

环磷酰胺(

和

)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、

)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

)；异环磷酰胺

泼尼莫司汀(Prednumustine)；甲苄肼

二氯甲基二乙胺(也称氮芥、芥酸和盐酸甲氯乙胺、

)；链脲佐菌素噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、

)；环磷酰胺

和盐酸苯达莫司汀

示例性的mTOR抑制剂包括，例如，替西罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus，正式名称为deferolimus，(lR,2R,45)-4-[(2R)-2[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R)-l,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-ll,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04’9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸盐，也称为AP23573和MK8669，并描述于PCT公开号WO 03/064383)；依维莫司(

或RADOOl)；雷帕霉素(AY22989，

)；塞马莫德(CAS164301-51-3)；替西罗莫司，(5-{2,4-双[(35,)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[l,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-l-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基缩水甘油基-L-a-天冬氨酰L-丝氨酸，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)，以及XL765。示例性免疫调节剂包括，例如，阿伏珠单抗(可从获得)；培非格司亭

来那度胺(CC-5013，

)；沙利度胺

阿替米德(actimid)(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白细胞介素1、白细胞介素2和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可从IRX治疗公司(IRX Therapeutics)获得)。示例性的蒽环霉素包括，例如，多柔比星(

和

)；博莱霉素

柔红霉素(盐酸多柔比星、道诺霉素和盐酸鲁维多霉素，

)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，

)；米托蒽醌(DHAD，

)；表柔比星(Ellence^TM)；去甲氧柔红霉素(

Idamycin )；丝裂霉素C

格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；和去乙酰基拉维霉素。示例性的长春花生物碱包括，例如，长春瑞滨酒石酸盐

长春新碱

和长春地辛)；长春碱(也称为长春碱硫酸盐、长春花碱和VLB，

和

)；和长春瑞滨

示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米

卡非佐米(PX-171-007，(5)-4-甲基-N-((5)-l-(((5)-4-甲基-l-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-l-氧代戊-2-基)氨基)-l-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((5,)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；玛丽佐米(marizomib)(NPT0052)；柠檬酸艾沙佐米(MLN-9708)；地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(llS’)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-l-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如，参见Physicians’Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014[癌症化疗药物医生手册2014],Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&Bartlett Learning[琼斯和巴特利特学习]；Principlesof Cancer Therapy[癌症治疗原理],Harrison,Principles of Internal Medicine[内科原理]第85章,第18版；Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era of MolecularlyTargeted Agents and Cancer Pharmacology[癌细胞治疗靶向：分子靶向药物和癌症药理学时代],Abeloff,Clinical Oncology[临床肿瘤学]第28-29章,2013Elsevier[爱思唯尔]；以及Fischer D S(编):The Cancer Chemotherapy Handbook[癌症化疗手册],第4版St.Louis,Mosby-Year Book[年鉴],2003)。

在一个实施例中，将本文所述的活化的CAR T细胞与降低靶向GITR和/或调节GITR功能的分子的活性和/或水平的分子、减少Treg细胞群的分子、mTOR抑制剂、GITR激动剂、激酶抑制剂、非受体酪氨酸激酶抑制剂、CDK4抑制剂和/或BTK抑制剂组合施用于受试者。

功效

活化的CAR T细胞的功效，例如在本文所述病症的治疗中的功效，或诱导如本文所述的应答的功效(例如，癌细胞的减少)，可由技术熟练的临床医生确定。然而，如本文所用的治疗被认为是“有效治疗”的术语，是指本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益方式改变，其他临床上可接受的症状得到改善，或甚至是减轻，或者根据本文所述的方法治疗后诱导所需的应答，例如至少10％。例如，可以通过测量根据本文所述方法治疗的病症的标志物、指标、症状和/或发病率或任何其他适当的可测量参数来评估功效。根据本文所述的方法的治疗可以减少标志物的水平或病症的症状，例如，减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

通过住院、或医学干预的需要评估的个体恶化失败(即，疾病的进展停止)也可以测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述的。

治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性实例包括人或动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，预防症状恶化(例如，疼痛或炎症)；或(2)缓解疾病的严重程度，例如，引起症状消退。用于治疗疾病的有效量是指当施用于有需要的受试者时足以导致对该疾病如本文所定义的有效治疗时的量。可以通过评估病症或所需的应答的物理指标来确定药剂的功效。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测施用和/或治疗的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。可以在本文所述病症的动物模型中评估给定方法的功效，例如，如本文所述的治疗淋巴瘤。当使用实验动物模型时，当观察到统计学上显著的标志物改变时治疗的效果得到证明。

所有专利和其他公开；包括参考文献、已授权的专利、已公布的专利申请和共同未决的专利申请；在整个本申请中引用的内容通过援引明确地并入本文，用于描述和披露，例如，在这些公开中描述的方法，其可以与本文所述的技术结合使用。只提供在本申请的申请日之前披露的这些出版物。在这方面，不应解释为承认发明者由于在先发明或任何其他原因而无权提前公开该披露。关于日期或关于这些文件内容的表述的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

本公开文本的实施例的描述并不旨在是穷尽性的或旨在将本发明局限于披露的精确形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开文本的特定实施例和实例，但是正如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内可以进行各种等同性修改。例如，虽然以给定顺序呈现方法步骤或功能，但是替代实施例能以不同顺序执行功能，或者可以基本上同时执行功能。本文提供的本公开文本的传授内容可以适当地应用于其他程序或方法。可以将本文所述的不同实施例组合以提供进一步的实施例。如有必要，可以修改本公开文本的各方面，以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开文本的再进一步的实施例。此外，由于生物功能等效性考虑，可以在蛋白质结构中进行一些改变而不影响种类或数量的生物或化学作用。可以根据具体实施方式对本公开内容作出这些以及其他改变。所有这类修改旨在包括在所附权利要求书的范围内。

任何前述实施例的具体元件可以进行组合或取代其他实施例中的元件。此外，虽然已经在这些实施例的上下文中描述了与本公开文本的某些实施例相关联的优势，但是其他实施例也可以展现出这样的优势，并且并非所有实施例都必须表现出这些优势方可落入本公开内容的范围内。

通过以下实例进一步说明本文所述的技术，这些实例决不应该被解释为进一步的限制

实例

实例1

我们设计了靶向CD79b(B细胞受体(BCR)复合物的部分)的CAR。通过这种方法，我们增加了淋巴瘤患者(例如，CD19 CAR疗法后复发CD19阴性疾病的淋巴瘤患者)的治疗选择。我们还设计了靶向CD79b和CD19两者的双特异性CAR。

材料和方法

我们用基于scFv的抗CD79b通过CD8铰链和跨膜结构域与4-1BB和CD3ζ融合产生CAR构建体。用CD79b或CD19 CAR慢病毒转导人原代T细胞。针对MCL细胞系Jeko-1评估细胞毒性、T细胞活化和细胞因子产生。另外，在荷Jeko-1瘤小鼠以及荷MCL PDX瘤小鼠的异种移植实验中评估CD79b CAR与CD19 CAR相比的细胞毒性作用。

结果

图1显示了MCL细胞系Jeko-1关于CD79b和CD19以及CD79a、CD37、BCMA、TACI、Fas、CD38和CD138的细胞表面表达的表征结果。用表达CD19(H/L)CAR、CD79b(L/H)CAR和CD79b(H/L)CAR的慢病毒构建体(参见，例如，图2)有效转导人原代T细胞(图3)。图4显示了未转导的细胞以及CD79b(L/H)CAR和CD79b(H/L)CAR转导的细胞的生长曲线，而图5显示了与指示的表达CD19或CD79b的靶细胞孵育过夜后，用CD19或CD79b CAR转导的Jurkat NFAT luc报告子细胞的活化水平(n＝3)。

体外研究表明，CAR转导的T细胞与表达荧光素酶的Jeko-1细胞孵育过夜的细胞毒性作用(图6)。CD19(H/L)CAR和CD79b(L/H)CAR表现出相对较高的细胞毒性水平。与Jeko-1细胞过夜孵育(1:1比例)后，CD19、CD79b(L/H)和CD79b(H/L)CAR产生的效应细胞因子水平如图7所示。

然后在两个体内动物模型中测试CAR T细胞。图8A显示了小鼠异种移植模型的时间线，其中小鼠接受1e6 Jeko-1-Luc+细胞，随后7天后静脉内注射2e6 CAR T细胞。如通过FLUX测量的，与未转导的细胞相比，CAR T细胞(CD79b(L/H)和CD19 CAR)的细胞毒性作用如图8B所示，而使用TrueCount珠注射后14天血液中存在的CAR T细胞数量如图8C所示。图9A显示了小鼠异种移植模型的时间线，其中在肿瘤注射后39天，小鼠接受1e6 MCL PDX细胞和3e6 CAR T细胞。如通过FLUX测量的，CAR T细胞对PDX肿瘤细胞的细胞毒性作用如图9B所示。

图10显示双特异性CAR被表达CD19和CD79b两者的细胞活化(n＝3)。

结论

CD79b CAR在体外测定中显示出高肿瘤清除率、细胞因子产生、重复抗原刺激后扩增、和活化。在MCL的异种移植模型中评估肿瘤清除率表明，在多个健康T细胞供体中，用CD79b CAR完全清除肿瘤(与CD19 CAR相当)。此外，显示双特异性CAR被表达CD19和CD79b两者的细胞活化。

实例2

如下提供和描述了针对CD79b的本发明的两种CAR多肽的序列。

pMGH73包括以下结构域：CD8L、抗CD79b L/H(通过接头分离)、CD8 TM和铰链、4-1BB和CD3ζ，其序列如下所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)。

CD8前导序列的序列是：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:3)。

轻链的序列是：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。

接头的序列是：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)。

重链的序列是：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)。

CD8跨膜和铰链结构域的序列是：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:7)。

4-1BB ICD的序列是：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ IDNO:8)。

CD3ζICD的序列是：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。

pMGH74包括以下结构域：CD8L、抗CD79b H/L(通过接头分离)、CD8 TM和铰链、4-1BB以及CD3ζ，其序列如下所示

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:2)

CD8前导序列的序列是：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:3)。

重链的序列是：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)。

接头的序列是：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)。

轻链的序列是：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKR(SEQID NO:4)。

CD8跨膜和铰链结构域的序列是：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:7)。

4-1BB ICD的序列是：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ IDNO:8)。

CD3ζICD的序列是：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。

实例3

如下提供和描述了本发明的针对CD79b和CD19的两种CAR多肽的序列。

第一CAR包括以下结构域：CD8L、抗CD79b L/H(L和H被接头分离)、接头、抗CD19scFv(包括在重链和轻链之间的富含甘氨酸的接头)、CD8 TM和铰链、4-1BB以及CD3ζ，其序列如下所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:10)。

CD8前导序列的序列是：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:3)。

抗CD79b(L/H)scFv的序列是：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)。

接头的序列是：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)。

抗CD19 scFv(包括分离重链和轻链的富含甘氨酸的接头)的序列是EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。

CD8跨膜和铰链结构域的序列是：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:7)。

4-1BB ICD的序列是：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ IDNO:8)。

CD3ζICD的序列是RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。

第二CAR包括以下结构域：CD8L、抗CD19 scFv(包括分离重链和轻链的富含甘氨酸的接头)、接头、抗CD79b L/H(L和H被接头分离)、CD8 TM和铰链、4-1BB以及CD3ζ，并且其序列如下所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:11)。

CD8前导序列的序列是：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:3)。

抗CD19 scFv(包括分离重链和轻链的富含甘氨酸的接头)的序列是EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。

接头的序列是：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)。

抗CD79b(L/H)scFv的序列是：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)。

CD8跨膜和铰链结构域的序列是：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:7)。

4-1BB ICD的序列是：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ IDNO:8)。

CD3ζICD的序列是RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:9)。

其他实施例在以下编号的段落的范围内。

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，该嵌合抗原受体多肽包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含与CD79b特异性结合的序列。

2.如段落1所述的CAR多肽，其中与CD79b特异性结合的序列包含针对CD79b的抗体的抗原结合区。

3.如段落1或2所述的CAR多肽，其中该与CD79b特异性结合的序列包含针对CD79b的单链抗体(scFv)。

4.如段落3所述的CAR多肽，其中该scFv包含轻链和重链。

5.如段落4所述的CAR多肽，其中该轻链在该重链的N末端。

6.如段落4所述的CAR多肽，其中该重链在该轻链的N末端。

7.如段落1至6中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽进一步包含铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的一个、多个或全部。

8.如段落7所述的CAR多肽，该CAR多肽包含所述铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、和信号传导结构域中的全部。

9.如段落7或8所述的CAR多肽，其中该铰链和跨膜结构域是CD8铰链和跨膜结构域。

10.如段落7至9中任一项所述的CAR多肽，其中该共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域。

11.如段落7至10中任一项所述的CAR多肽，其中该信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。

12.如段落1至11中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含抗CD79b scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、和CD3ζ信号传导结构域。

13.如段落1至12中任一项所述的CAR多肽，其中该细胞外结构域进一步包含与CD19特异性结合的序列。

14.如段落13所述的CAR多肽，其中该与CD19特异性结合的序列包含针对CD19的抗体的抗原结合区。

15.如段落13或14所述的CAR多肽，其中该与CD19特异性结合的序列包含针对CD19的单链抗体(scFv)。

16.如段落15所述的CAR多肽，其中该scFv包含轻链和重链。

17.如段落16所述的CAR多肽，其中该轻链在该重链的N末端。

18.如段落16所述的CAR多肽，其中该重链在该轻链的N末端。

19.如段落13至18中任一项所述的CAR多肽，其中与CD79b结合的序列在与CD19结合的序列的N末端。

20.如段落13至18中任一项所述的CAR多肽，其中所述与CD19结合的序列在与CD79b结合的序列的N末端。

21.如段落1至20中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:1、2、10或11的序列或其变体，其中该序列任选地省略SEQ ID NO:3的CD8前导序列。

22.如段落1至21中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:3的CD8前导序列或其变体。

23.如段落1至22中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:4的抗CD79b轻链序列或其变体。

24.如段落1至23中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:6的抗CD79b重链序列或其变体。

25.如段落1至24中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:5的接头序列或其变体。

26.如段落1至25中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:7的CD8跨膜和铰链序列或其变体。

27.如段落1至26中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:8的4-1BB ICD序列或其变体。

28.如段落1至27中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:9的CD3ζICD序列或其变体。

29.如段落13至20中任一项所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:13的抗CD19scFv序列或其变体。

30.一种核酸分子，该核酸分子包含编码如段落1至29中任一项所述的CAR多肽的序列。

31.一种载体，该载体包含如段落30所述的核酸分子。

32.一种细胞，该细胞包含如段落1至29中任一项所述的CAR多肽、如段落30所述的核酸分子、或如段落31所述的载体。

33.如段落32所述的细胞，其中该细胞是人原代T细胞。

34.一种药物组合物，该药物组合物包含如段落1至29中任一项所述的CAR多肽、如段落30所述的核酸分子、如段落31所述的载体、或者如段落32或33所述的细胞。

35.一种治疗患有癌症或处于发展癌症风险的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如段落34所述的药物组合物。

36.如段落35所述的方法，其中该癌症是淋巴瘤。

37.如段落36所述的方法，其中该淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。

38.如段落37所述的方法，其中该非霍奇金淋巴瘤选自由以下组成的组：套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。

39.一种治疗在接受CD19 CAR疗法后复发CD19阴性淋巴瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如段落34所述的药物组合物。

40.一种制备表达CD79b特异的CAR或CD79b和CD19特异的CAR的CAR T细胞的方法，该方法包括将如段落30所述的核酸分子或如段落31所述的载体引入T细胞。

41.如段落40所述的方法，其中该T细胞是人原代T细胞。

序列表

<110> 综合医院公司（The General Hospital Corporation）

南丹麦大学（University of Southern Denmark）

<120> 表达嵌合抗原受体的T细胞

<130> 51295-010WO3

<150> US 62/627,514

<151> 2018-02-07

<150> US 62/516,234

<151> 2017-06-07

<160> 13

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

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<212> PRT

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<223> 合成构建体

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65 70 75 80

Ser Ile Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr

180 185 190

Asn Glu Ile Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 13

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

145 150 155 160

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser

180 185 190

Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

195 200 205

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

210 215 220

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

Claims (41)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，该嵌合抗原受体多肽包含细胞外结构域，该细胞外结构域包含与CD79b特异性结合的序列。

2.如权利要求1所述的CAR多肽，其中该与CD79b特异性结合的序列包含针对CD79b的抗体的抗原结合区。

3.如权利要求1所述的CAR多肽，其中该与CD79b特异性结合的序列包含针对CD79b的单链抗体(scFv)。

4.如权利要求3所述的CAR多肽，其中该scFv包含轻链和重链。

5.如权利要求4所述的CAR多肽，其中该轻链在该重链的N末端。

6.如权利要求4所述的CAR多肽，其中该重链在该轻链的N末端。

7.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽进一步包含铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的一个、多个或全部。

8.如权利要求7所述的CAR多肽，该CAR多肽包含所述铰链、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的全部。

9.如权利要求7所述的CAR多肽，其中该铰链和跨膜结构域是CD8铰链和跨膜结构域。

10.如权利要求7所述的CAR多肽，其中该共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域。

11.如权利要求7所述的CAR多肽，其中该信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。

12.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含抗CD79b scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

13.如权利要求1所述的CAR多肽，其中该细胞外结构域进一步包含与CD19特异性结合的序列。

14.如权利要求13所述的CAR多肽，其中该与CD19特异性结合的序列包含针对CD19的抗体的抗原结合区。

15.如权利要求13所述的CAR多肽，其中该与CD19结合的序列包含针对CD19的单链抗体(scFv)。

16.如权利要求15所述的CAR多肽，其中该scFv包含轻链和重链。

17.如权利要求16所述的CAR多肽，其中该轻链在该重链的N末端。

18.如权利要求16所述的CAR多肽，其中该重链在该轻链的N末端。

19.如权利要求13所述的CAR多肽，其中与CD79b结合的序列在与CD19结合的序列的N末端。

20.如权利要求13所述的CAR多肽，其中所述与CD19结合的序列在与CD79b结合的序列的N末端。

21.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:1、2、10或11的序列或其变体，其中该序列任选地省略SEQ ID NO:3的CD8前导序列。

22.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:3的CD8前导序列或其变体。

23.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:4的抗CD79b轻链序列或其变体。

24.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:6的抗CD79b重链序列或其变体。

25.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:5的接头序列或其变体。

26.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:7的CD8跨膜和铰链序列或其变体。

27.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:8的4-1BB ICD序列或其变体。

28.如权利要求1所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:9的CD3ζICD序列或其变体。

29.如权利要求13所述的CAR多肽，该CAR多肽包含SEQ ID NO:13的抗CD19scFv序列或其变体。

30.一种核酸分子，该核酸分子包含编码如权利要求1所述的CAR多肽的序列。

31.一种载体，该载体包含如权利要求30所述的核酸分子。

32.一种细胞，该细胞包含如权利要求1所述的CAR多肽。

33.如权利要求32所述的细胞，其中该细胞是人原代T细胞。

34.一种药物组合物，该物组合物包含如权利要求1所述的CAR多肽。

35.一种治疗患有癌症或处于发展癌症风险的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求34所述的药物组合物。

36.如权利要求35所述的方法，其中该癌症是淋巴瘤。

37.如权利要求36所述的方法，其中该淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。

38.如权利要求37所述的方法，其中该非霍奇金淋巴瘤选自由以下组成的组：套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。

39.一种治疗在接受CD19 CAR疗法后复发CD19阴性淋巴瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求34所述的药物组合物。

40.一种制备表达CD79b特异的CAR或CD79b和CD19特异的CAR的CAR T细胞的方法，该方法包括引入如权利要求30所述的核酸分子。

41.如权利要求40所述的方法，其中该T细胞是人原代T细胞。

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