WO2004060919A1 - ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体 - Google Patents

ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体 Download PDF

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WO2004060919A1
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antibody
variable region
amino acid
acid sequence
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Tetsuo Kojima
Chiaki Senoo
Osamu Natori
Keiko Kasutani
Shinya Ishii
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to an agonist antibody against a heteroreceptor, and a pharmaceutical composition containing the antibody as an active ingredient.
  • Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and no antigenicity.
  • bispecific antibodies capable of simultaneously recognizing two types of antigens have been proposed for a long time, but at present, only two types of antigens are simply connected.
  • an antibody binds to a specific epitope in an antigen, it is considered that by selecting an appropriate combination of antibodies, a bispecific antibody can coordinate two antigens at a desired distance and angle.
  • Many cytokine receptors are thought to be capable of transmitting signals into cells by changing the distance and angle between chains forming a dimer by binding of a ligand. That is, a suitable anti-receptor antibody can mimic receptor dimerization by a ligand and can be an agonist antibody.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide an antibody having an agonist action on a receptor containing a hetero chain.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • screening agonist antibodies it is necessary to select a large number of antibodies (H, / 3) for each of the two types of chains (A, B) that constitute the receptor, and perform an individual test for each combination of ⁇ and ⁇ 3.
  • production of bispecific antibodies requires fusion of antibody-producing hybridomas or introduction of antibody expression vectors into cells.
  • the present inventors have succeeded in producing a bispecific antibody having an agonist effect on a receptor comprising a hetero chain, for example, by the following method. More specifically, it was performed as follows.
  • the agonist antibody against type I in-human receptor consisting of two types of AR1 and AR2 was successfully separated. That is, the present inventors succeeded in separating a bispecific antibody having an agonist effect on a receptor comprising a hetero chain for the first time, and completed the present invention.
  • the present invention relates to an antibody having an agonist effect on a receptor containing a hetero chain, more specifically, (1) an antibody having an agonist activity against a receptor containing a hetero chain,
  • the antibody of (4), wherein the type I in-human lipoprotein receptor comprises an AR1 chain and an AR2 chain;
  • the antibody according to (5) comprising a variable region of an anti-AR1 chain antibody and a variable region of an anti-AR2 chain antibody;
  • variable region comprising the amino acid sequence of (a) below in the anti-AR1 chain antibody
  • variable region of the H chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • variable region of the L chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23
  • the region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the H chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • the L chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • variable region comprising the amino acid sequence of (a) below in the anti-AR1 chain antibody and a variable region comprising the amino acid sequence of any of the following (bl) to (b3) in the anti-AR2 chain antibody
  • the antibody according to (9) is a variable region comprising the amino acid sequence of (a) below in the anti-AR1 chain antibody and a variable region comprising the amino acid sequence of any of the following (bl) to (b3) in the anti-AR2 chain antibody.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • variable region of the H chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9
  • variable region of the L chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • variable region of the H chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and the variable region of the L chain is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of [1] to [11] as an active ingredient.
  • the present invention provides an antibody having agonist activity against a receptor containing a hetero chain.
  • the term "receptor containing a hetero chain” means that the receptor (multimer) is composed of two or more different proteins (receptor chains).
  • the multimer is not limited by the number of its proteins (receptor chains), such as a dimer, a trimer and a tetramer, but is preferably a dimer.
  • a heteroreceptor indicates that the two constituent proteins (receptor chains) are not identical.
  • An antibody having an agonist activity refers to an antibody having an agonist action for a certain receptor.
  • an agonist ligand factor
  • the three-dimensional structure of the receptor protein is changed, and the receptor is activated (if the receptor is a membrane protein, it is usually a cell). It emits signals such as proliferation).
  • the receptor is of the type that forms a dimer
  • the agonist antibody can perform the same function as the ligand by dimerizing the receptor at an appropriate distance and angle. That is, a suitable anti-receptor antibody can mimic receptor dimerization with a ligand and become an agonist antibody.
  • Physiological activities whose changes are induced by agonist action include, for example, proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphorylated Z dephosphorylation activity, and redox activity. , Metastatic activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death inducing activity, apoptosis inducing activity, and the like, but are not limited thereto.
  • the receptor of the present invention includes a cytokine receptor.
  • Cytokine is usually used as a general term for bioactive proteins that control the proliferation and differentiation of various blood cells, but may also refer to growth factors and growth inhibitors of cells including non-immune cells. Therefore, cytokins are released from cells and are a generic term for proteinaceous factors that mediate cell-cell interactions such as immunity, control of inflammatory response, antiviral action, antitumor action, and regulation of cell proliferation and differentiation.
  • site force in include: In Yuichi Leukin 1-1, 15 Severe factors (G-CSF, M_CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN-, IFN-jS, IFN-a, etc.), chemokines, tumor necrosis factor (TNF), lymphotoxin, erythropoietin, epidermal growth factor, Fibroblast growth factor and the like can be mentioned, but interferon is preferred, and type I interferon is particularly preferred.
  • cytokine receptors include the interferon receptor family (IFN- receptor, IFN_i3 receptor, IFN- ⁇ receptor, IL-10 receptor, etc.), interleukin receptor family 1 (IL-2 receptor Body, IL-3 receptor, IL-6 receptor, GM-CSF receptor, etc.), serine-threonine kinase type receptor family (BMP receptor, TGF- / 3 receptor, activin receptor, etc.), Tyrosine kinase type receptors (EGF receptor, PDGF receptor, VEGF receptor, c-kit receptor, c-ims receptor, etc.), immunoglobulin receptor family (IL-1 receptor, etc.), cells Death receptor family (TNF receptor, Fas receptor, NGF receptor, etc.), 7-transmembrane receptor family (IL-8 receptor, chemokine receptor, etc.), etc. Is an interface It is a body family, and more preferably a type I interface receptor.
  • Interferons include IFN-H, IFN_) 3, IFN-a, IFN-te and the like. Since IFN-human IFN- / 3 is highly homologous, these two IFNs can react through the same receptor. In addition, interferon ⁇ and interferon / 3 are classified as type I interferon.
  • Preferred examples of the type I interferon receptor include the AR1 chain (GenBank ACCESSION No: J0317K). Uze G, Lutfal la G, Gresser I. Genetic transfer of a functional human interferon [[alpha]] cloning and expression of its cDNA. Cel l (1990) 60, 225-234.) and AR2 chain
  • a polyspecific antibody refers to an antibody that can specifically bind to a variety of different antigens. That is, a multispecific antibody is an antibody that has specificity for at least two different antigens (e.g., where the antigen is a heteroreceptor, the multispecific antibody is a different antibody that forms a heteroreceptor). Recognize domains). Usually, such molecules bind to two antigens (a bispecific antibody), but have specificity for more (eg, three) antigens. May be.
  • the antibody against the hetero receptor of the present invention is not particularly limited, but is preferably a monoclonal antibody. Further, it is preferable that the antibody is a recombinant antibody produced using a gene recombination technique. (See, for example, Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, JW., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them from hybridomas or antibody-producing cells, such as sensitized lymphocytes, that produce the antibodies, inserting the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host to produce it. Obtainable.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment, a modified antibody, a low molecular weight antibody, or the like.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fv and the like.
  • the “Fv” fragment is the smallest antibody fragment and contains a complete antigen recognition and binding site.
  • This region is a dimer in which the variable regions of one heavy and light chain are tightly linked by a non-covalent bond (VH-VL dimer).
  • VH-VL dimer non-covalent bond
  • the three CDRs of each variable region interact to form an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer.
  • Six CDRs add antigen-binding sites to antibodies Has been granted. However, even a single variable region (or half of an Fv containing only three antigen-specific CDRs) has a lower affinity than the entire binding site, but still has the ability to recognize and bind to the antigen. Have.
  • the Fab fragment (also called F (ab)) further contains a light chain constant region and a heavy chain constant region (CH1).
  • Fab 'fragments differ from Fab fragments by having additional few residues from the carboxy terminus of the heavy chain CH1 region including one or more cysteines from the antibody hinge region.
  • Fab'-SH refers to Fab 'in which one or more cysteine residues in the constant region have a free thiol group.
  • F (ab ') 2 fragments are produced by cleavage of disulfide bonds in cysteines at the hinge of F (ab') 2 pepsin digest. Other antibody fragments which are chemically linked are known to those skilled in the art.
  • the minibodies include single chain Fv (scFv), diabody, linear antibody, single chain antibody molecule and the like.
  • Diapod (Db) refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). ), EP404, 097, W093 / 11161, etc.). Diapody is a dimer composed of two polypeptide chains, each of which is in a position where the light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) cannot bind to each other in the same chain. It is linked by a short linker, for example, about 5 residues.
  • VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain V region fragment due to the short linker between them and form a dimer, diapody has two antigen-binding sites. Will have. At this time, if VL and VH for two different antigens (a, b) combined with VLa-VHb and VLb-VHa with a linker of about 5 residues are expressed simultaneously, bispecific Db is obtained. Secreted.
  • ScFv or scFv antibody fragments contain the VH and VL regions of the antibody, which regions are present in a single polypeptide chain (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883) 0
  • scFv polypeptides further include a polypeptide linker between the V H and V L regions, which allows the scFv to bind to antigen binding.
  • the linker in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of the antibody variable regions linked to both ends.
  • These antibody fragments and low-molecular-weight antibodies can be obtained by treating the antibody with an enzyme, for example, papain or pepsin, to generate an antibody fragment, or by constructing a gene that encodes these antibody fragments.
  • an enzyme for example, papain or pepsin
  • expression is performed in a suitable host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods).
  • modified antibody examples include an antibody conjugated to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) and an antibody conjugated to a cytotoxic substance, endotoxin, a radioactive substance, and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the origin of the antibody of the present invention is not limited, such as a human antibody, a mouse antibody, and a rat antibody.
  • a genetically modified antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody may be used.
  • Methods for obtaining human antibodies are already known, for example, by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a target antigen.
  • -1 o-human antibody can be obtained (see International Patent Application Publication Numbers W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735) .
  • a chimeric antibody is an antibody comprising the variable regions of the heavy and light chains of an antibody of an immunized animal and the constant regions of the heavy and light chains of a human antibody.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal to DNA encoding the constant region of a human antibody, inserting the DNA into an expression vector, and introducing into a host to produce the antibody. it can.
  • a humanized antibody is a modified antibody, also called a reshaped human antibody.
  • a humanized antibody is constructed by grafting the CDR of an antibody derived from an immunized animal to the complementarity determining region of a human antibody. Its general gene recombination technique is also known. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR region of a mouse antibody to the framework region (FR) of a human antibody was constructed using several oligos made to have overlapping portions at the ends. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporated into an expression vector, and then introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No.
  • the method for obtaining the agonist antibody of the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method.
  • an agonist antibody against a hetero-receptor consisting of two types of chains (A and B chains) immunizing an immunized animal with each of the two types of chains (A and B) constituting the receptor, Obtain anti-A chain antibody and multiple anti-B chain antibodies.
  • a bispecific antibody containing the H chain and L chain of the anti-A chain antibody and the H chain and L chain of the anti-B chain antibody is prepared.
  • an antibody having agonist activity is selected.
  • the antibodies of the invention are bispecific antibodies.
  • Production of bispecific antibodies can be performed by a known method such as fusion of antibody-producing hybridomas or introduction of cells into an antibody expression vector. For example, immunize an animal with each of the A and B chains of the receptor. MRNA is extracted from spleen cells of this animal, and the variable regions of the L and H chains are recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable region containing the CDR. A single-stranded Fv (scFv) is synthesized by assembly PCR, and a phage library is constructed.
  • scFv single-stranded Fv
  • the antigen-binding antibody clone is enriched and cloned by panning, and the single-chain variable region (scFv) is inserted between the signal sequence for animal cells and CHI-hinge-CH2-CH3, and the scFv-CHl-Fc expression vector Is prepared.
  • scFv single-chain variable region
  • a bispecific antibody can be obtained by introducing a vector encoding an anti-A chain antibody and a vector encoding an anti-B chain antibody into the same cell and expressing the antibody.
  • Selection of an antibody having an agonist activity can be performed, for example, by the following method.
  • an index is used to determine whether or not the cell grows similarly to the factor.
  • the test multispecific antibody is determined to have an agonist effect.
  • An indicator of whether or not a factor-like response is obtained by adding it during culture of a cell line showing the original activity (not necessarily proliferation) of the factor.
  • An antibody is determined to have an agonist action when it shows a response similar to that of a factor.
  • the above-mentioned cells usually express a receptor on which the antibody of the present invention can act as an agonist on the cell surface, and emits a signal when bound to a ligand of the receptor (eg, an agonist antibody). Therefore, cells used in the above method are cells capable of proliferating in a receptor ligand (factor) -dependent manner (factor-dependent proliferation cells). Vesicle). In addition, it is preferable that the receptor usually emits a cell proliferation signal by binding to a ligand. However, when the receptor is of a type that does not emit a cell proliferation signal, the receptor is fused with a receptor of a type that emits a cell proliferation signal to form a so-called chimeric receptor.
  • the chimeric receptor emits a cell proliferation signal by binding to a ligand.
  • the receptor suitable for constructing a chimeric receptor by fusion with the receptor is not particularly limited as long as it is a type of receptor that emits a cell proliferation signal, but is usually a membrane protein, and more preferably a receptor.
  • the receptor is such that the outside of the cell is the ligand receptor chain and the inside of the cell is the receptor chain. Specific examples include G-CSF receptor, immediate 1, neu, GM-CSF receptor, EP0 receptor, c-Kit, FLT-3 and the like.
  • factor-dependent proliferating cells in the present invention include, specifically, a factor-dependent proliferating cell expressing a chimeric receptor having a ligand receptor chain outside and a G-CSF receptor chain inside the cell.
  • Proliferating cells BaF3 can be shown.
  • Other cells that can be used in the above method include, for example, NFS60, FDCP-K, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, KT-3 and the like.
  • examples of a method for selecting an antibody having an agonist activity include a method using various quantitative and / or qualitative changes as an index.
  • an index for a cell-free system (cell free assay), an index for a cell system (elt based assay), an index for a tissue system, and an index for a biological system can be used.
  • an enzymatic reaction or quantitative and Z- or qualitative changes in protein, DNA, and NA can be used.
  • the enzyme reaction for example, an amino acid transfer reaction, a sugar transfer reaction, a dehydration reaction, a dehydrogenation reaction, a substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, etc., and amplification, cleavage, and extension of DNA and RNA can be used.
  • phosphorylation of a protein existing downstream of the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Indicators of cell lines include changes in cell phenotype, such as Alternatively, a qualitative change, a change in proliferation activity, a change in cell number, a change in morphology, a change in characteristics, or the like can be used.
  • a qualitative change, a change in proliferation activity, a change in cell number, a change in morphology, a change in characteristics, or the like can be used.
  • secretory proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like can be used.
  • Changes in morphology include projection formation and changes in the number of Z or projections, changes in flatness, changes in elongation Z, changes in aspect ratio, changes in cell size, changes in internal structure, and changes in cell populations. Uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by observation under a microscope.
  • scaffold dependence As the change in properties, scaffold dependence, site force-in response, hormone dependence, drug resistance, cell motility, cell migration activity, pulsatility, changes in intracellular substances, and the like can be used.
  • Cell motility includes cell infiltration activity and cell migration activity.
  • an enzyme activity As the change of the intracellular substance, for example, an enzyme activity, an mRNA amount, an intracellular signal transmitting substance such as Ca 2+ and cAMP, an intracellular protein amount, and the like can be used.
  • a change in cell proliferation activity induced by stimulation of the receptor can be used as an index.
  • a change in function according to the organization to be used can be used as a detection index.
  • Indices of biological systems include changes in tissue weight, changes in the blood system, such as changes in the number of blood cells, changes in protein levels, enzyme activities, changes in electrolytic mass, and changes in the circulatory system, such as changes in blood pressure and heart rate Etc. can be used.
  • the method for measuring these detection indices is not particularly limited, and includes light absorption, luminescence, coloring, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light scattering, Fluorescence resonance energy transfer, etc. can be used. These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the absorption spectrum can be measured with a generally used photometer or plate reader
  • the luminescence can be measured with a luminometer
  • the fluorescence can be measured with a fluorometer.
  • Mass can be measured using a mass spectrometer.
  • the radioactivity is measured using a measuring device such as a gamma counter according to the type of radiation.
  • the surface plasmon resonance signal can be measured by BIAC0RE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer, etc. can be measured by ARV0.
  • a flow cytometer or the like can be used for the measurement.
  • two or more types of detection indices may be measured by one measurement method, and if simple, two or more types of measurement can be measured simultaneously and / or consecutively to achieve a larger number of detection indices. It is also possible to measure an index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with fluorometry.
  • Antibodies to the receptor can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by immunizing an immunized animal with an antigen. Antigens that immunize animals include complete immunogenic antigens and incomplete non-immunogenic antigens (including haptens).
  • a receptor whose agonist antibody of the present invention is considered to act as a ligand is used as the antigen (immunogen).
  • the receptor in the present invention is not particularly limited, but is preferably a heterodimer.
  • an animal to be immunized for example, a mouse, a hamster, or a rhesus monkey can be used. Immunization of these animals with an antigen can be performed by a person skilled in the art by a well-known method. For example, as a general method, the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified. Thereafter, the mammal is administered several times every 4 to 21 days. After immunizing the mammal in this way and confirming that the level of the desired antibody in the serum increases, immune cells are collected from the mammal.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • variable regions of the L chain and H chain of the antibody are recovered from the immunized animal or cells of the animal.
  • This operation can be performed by those skilled in the art using generally known techniques. Animals immunized with the antigen express antibodies specifically to the antigen in spleen cells. Therefore, for example, mMA is prepared from spleen cells of an immunized animal, and primers corresponding to the CDR of the animal are used.
  • the variable regions of the L chain and the ⁇ chain can be recovered by RT-PCR.
  • CDR refers to three regions (CDR1, CDR2, CDR3) that exist in a hypervariable region in the variable region of an antibody and that directly bind to an antigen in a complementary manner.
  • a primer corresponding to the CDR for example, a primer corresponding to a framework having a lower diversity than the CDR, or a primer corresponding to the signal sequence and the CH1 and CL portions can be used. It can also immunize lymphocytes in. Thereafter, DNA encoding the antibody contained in the spleen or lymphocytes of the immunized animal can be subjected to a conventional method, for example, a nucleotide probe capable of specifically binding to the genes encoding the antibody heavy and light chains. And the like.
  • the receptor to be used as an immunogen may be the whole protein constituting the receptor or a partial peptide of the protein.
  • an antigen which can be an antigen in some cases can be bound to another molecule to be a soluble antigen, and a fragment thereof can be used in some cases.
  • a transmembrane molecule such as a receptor
  • cells expressing the transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen.
  • Such cells may be of natural origin (such as a tumor cell line) or cells that have been constructed to express transmembrane molecules by recombinant techniques.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. can be appropriately selected and combined to separate and purify antibodies. (Ant ibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
  • Columns used for affinity mouth chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
  • the antibody of the present invention is, for example, an antibody having an agonist activity against a type I interferon receptor containing an AR1 chain and an AR2 chain
  • the antibody include, but are not limited to, an antibody containing any of the following variable regions of an anti-AR1 chain antibody and any of the following variable regions of an anti-AR2 chain antibody: Can be
  • the partner anti-AR2 chain antibody is preferably AR2-13, AR2-31 or AR2-44, and when the anti-AR1 chain antibody is AR41, the part
  • the primary anti-AR2 chain antibody is AR2-1K AR2-13, AR2-14, AR2-22, AR2-33, AR2-37, A2-40, AR2-43, AR2-44, or AR2- Preferably it is 45.
  • AR2-13 and AR2-44 are capable of partnering with both AR41 and ⁇ -24 antibodies. Antibodies that form such pairs are also included in the present invention.
  • the antibody containing the above variable region does not necessarily have to have the full length sequence of the variable region, and if the CDR sequence is preserved, the FR sequence can be used to convert the antibody into a human. It may be changed as appropriate. Therefore, the present invention includes an antibody having an amino acid sequence corresponding to a CDR in the above variable region.
  • Table 2 shows the amino acid numbers corresponding to the CDRs in the sequence numbers of the above variable regions.
  • the constant region Is not particularly limited, and a constant region known to those skilled in the art can be used.
  • a constant region known to those skilled in the art can be used.
  • the antibody of the present invention Since the antibody of the present invention has an agonist action, it is expected to be an effective drug for diseases caused by a decrease in the activity (function) of the receptor on which the antibody acts. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention when the antibody of the present invention is an antibody having agonist activity for a cytokine receptor, it is considered that the antibody has a cytodynamic effect. Therefore, the antibody is expected to be a drug (pharmaceutical composition) having an antiviral action, an antitumor action, a cell growth and differentiation regulating action.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention used as an active ingredient for therapeutic or prophylactic purposes may be mixed, if necessary, with a suitable pharmaceutically acceptable carrier, medium or the like which is inactive against them. It can be formulated. For example, sterile water or saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG , Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • polypeptides such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, sugars such as polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates such as mannitol sorbitol, and the like.
  • Sugar alcohol may be included.
  • an aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, for example, D-Sorbi!
  • ⁇ -I, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride may be used in combination with a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, PEG), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80, HC0-50), etc. .
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, PEG
  • nonionic surfactant eg, Polysorbate 80, HC0-50
  • the antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules of hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid], etc.) Colloidal drug delivery systems (ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules, etc.) can also be used (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Oslo Ed. (1980), etc.). ). Furthermore, a method of converting a drug into a sustained-release drug is also known and can be applied to the antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982); U.S.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is ultimately appropriately determined by the judgment of a physician in consideration of the type of the dosage form, the administration method, the age and weight of the patient, the symptoms of the patient, the degree of progress, etc. In general, for adults, 0.1 to 2000 mg per day can be orally administered in one or several divided doses. More preferably, it is 1 to 1000 mgZ days, still more preferably 50 to 500 nig / day, most preferably 100 to 300 mg_day. These dosages vary depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select appropriate dosages.
  • the administration period is also preferably determined appropriately according to the healing process of the patient.
  • the administration methods include direct administration using naked plasmid, packaging in liposome, etc., retrovirus vector, adenovirus vector, vaccinia virus vector, box virus vector, adenovirus-related vector, HVJ Vectors or other viral vectors (see Adolph “Virus Genome Method”, CRC Press, Florid (1996)), or coated on bead carriers such as colloidal gold particles (W093 / 17706, etc.) for administration be able to.
  • the antibody may be administered by any method as long as the antibody is expressed in vivo and its action can be exerted.
  • injection, infusion, or gas-induced particle bombardment e.g., via intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, adipose tissue, adipose tissue, mammary tissue, inhalation or intramuscular routes
  • a sufficient amount is administered by a method via the membrane route).
  • liposomal transfusion, particle bombardment (U.S. Pat.No. 4,945,050), or viral infection is used to administer blood cells and bone marrow-derived cells, etc.
  • the gene encoding the antibody of the present invention may be administered by re-introduction.
  • FIG. 1 shows the growth inhibitory activity of the antibody on Daudi cells. A dose-dependent agonist activity was confirmed.
  • FIG. 2 shows the ability of an antibody against pISRE-Luc-transfected K562 cells to activate ISRE.
  • 4 shows the results of measuring the luciferase activity of AR1-41 / M2-13. Mouth indicates IFN-o; 2a, ⁇ indicates AIU-41 / AR2-13 bispecific antibody.
  • FIG. 3 shows the ability of the antibody to activate ISRE against pISRE-Luc-transfected 562 cells.
  • the results of luciferase activity measurement of AR1-41 / AR2-13 are shown. Mouth indicates IFN-o; 2a, Hata indicates AR1-41 / AR2-14 bispecific antibody.
  • FIG. 4 shows the ability of an antibody against pISRE-Luc-transfected K562 cells to activate ISRE.
  • the result of the luciferase activity measurement of AR41 / AR2-13 is shown.
  • the mouth indicates IFN-a2a, and the square indicates AM-24 / AR2_13 bispecific antibody.
  • FIG. 5 shows the ability of the antibody against pISRE-Luc-transfected K562 cells to activate ISRE.
  • the result of luciferase activity measurement of AR41 / AR2-13 is shown.
  • the mouth indicates IFN-a2a, and the reference indicates AR24 / AR2-31 bispecific antibody.
  • helper phage VCSM13 was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes for infection.
  • 450 mL 2xYTAG and 25 L lmol / L IPTG were added and cultured at 26 for 10 hours.
  • the culture supernatant was recovered by centrifugation, mixed with 100 mL PEG-NaCl (10% polyethylene glycol 8000, 2.5 mol / L NaCl), and allowed to stand for 4 and 60 minutes.
  • the phage was precipitated by centrifugation at 10, 800 xg for 30 minutes, the precipitate was suspended in 40 mL of water, mixed with 8 mL PEG-NaCl, and allowed to stand at 4 ° C for 20 minutes.
  • the phage was precipitated by centrifugation at 10, 800 xg for 30 minutes and suspended in 5 mL PBS.
  • AR1FLAG and AR2FLAG were labeled with biotin using No-Weigh Premeasured NHS-PE04-Biotin in Microtubes (Pierce).
  • 100 pmol of a biotin-labeled AR1FLAG or AR2FLAG was added to the phage library and contacted with the antigen for 60 minutes. Streptavid in MagneSphere (Promega) 600 washed with 5% M-PBS (PBS containing 5% skim milk) was added and allowed to bind for 15 minutes.
  • the beads were washed three times each with 1 mL of PBST (PBS containing 0.1% Tween-20) and PBS. Suspend the beads in 0.8 mL of 0.1 mol / L glycine / HC1 (pH 2.) for 5 minutes, The phage was eluted. Add 45 x L 2 mol / L Tris to the collected phage solution, neutralize, add to 10 mL of logarithmic growth phase (0D 600 0.4-0.5) XL, and incubate at 37 ° C for 30 minutes. I let it. This was spread on a 2xYTAG plate and cultured at 30 ° C.
  • the colonies were collected, inoculated into 2xYTAG, and cultured at 37 ° C until 0D 600 0.4 to 0.5. 5 / iL lfflol / L IPTG and 10 "piu helper phage (VCSM13) were added to 10 mL of the culture solution, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes. After centrifugal collection, the cells were added to 2xYTAG lOOmL containing 25 ⁇ g / mL kanamycin. The cells were resuspended and cultured for 10 hours at 30 ° C.
  • the culture supernatant was recovered by centrifugation, mixed with 20 mL PEG-NaCl, and allowed to stand at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the phage was precipitated by centrifugation, and the suspension in mL PBS was used for the next panning In the second panning, the beads were washed five times with PBST and PBS, respectively.
  • a clone producing an AR-binding phage from E. coli was selected by ELISA.
  • the single colony described above was inoculated into 150 / xL 2xYTAG and cultured at 30 ° C. After inoculating this 5 L into 500 / iL 2xYTAG and culturing at 37 ° C for 2 hours, helper phage 2.5 x
  • the cells were coated overnight with 100 ⁇ l of PBS containing AR2FLAG. After washing with PBST to remove the antigen, the cells were blocked overnight with 200 xL of 2% M-PBS. After removing 2% M-PBS, the culture supernatant was added thereto and allowed to stand for 40 minutes to bind the antibody. After washing, the bound phage were diluted with 2% M-PBS and diluted with HRP-conjugated anti-M13 antibody (Amersham Pharmacia Biotech) and BM blue POD substrate.
  • PCR reaction solution containing 20 L of phage solution, 10 X KOD Dash buffer 2 XL, 0.5 L of 10 xmol / L primer, and 0.3 L of KOD Dash polymerase (T0Y0B0, 2.5 U / iL) Amplification was performed on a Perkin Elmer 9700 at 96 ° C, 10 seconds, 55 ° C, 10 seconds, 72 ° C, 30 seconds, 30 cycles. After PCR, 3 L of ExoSAP-IT (Amersham) was added to 5 L of the reaction solution, and the mixture was incubated at 37 ° C for 20 minutes and then at 80 ° C for 15 minutes.
  • Expression vector pCAGGss-g4CH that allows scFv to be inserted via the Sfil site between human intron-CHl-Fc (human IgG4 cDNA) and a human sidanal sequence driven by a CAGG open mouth motor for expression as scFv-CHl-Fc Hetero IgG4 was constructed.
  • Type A is a substitution of Y349C and T366W.
  • Type B is a substitution of E356C, T366S, L368A, Y407V.
  • the replacement (-ppcpScp- ⁇ -ppcpPcp-) was introduced in both hinges.
  • a type was constructed using the signal sequence of human IL-3
  • B type was constructed using the signal sequence of human IL-6 (pCAGG-IL3ss-g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb).
  • the PCR product of the scFv region of the clone selected from the nucleotide sequence was treated with Siil, and the anti-AR1 clone was subcloned into pCAGG-IL3ss-g4CHPa, and the anti-AR2 clone was subcloned into pCAGG-IL3ss-g4CHPb.
  • Anti-AR1 and anti-AR2 clones 45x45 Total 2025 combinations of expression vectors ribofected into HEK293 cells Transfection was carried out using PAMINE 2000, and the culture supernatant after 3 days was collected.
  • BaF3-ARG was established by introducing an expression vector for a chimeric molecule of the extracellular regions of AR1 and AR2 and the intracellular region of the G-CSF receptor into BaF3, a mouse IL-3-dependent proliferating cell.
  • BaF3- ARG grew depending on IFNo !.
  • a 96-well plate was seeded with 0.1 mL of medium containing 1 ⁇ 10 s cells / sample per well washed three times. After culturing for 4 days, 10 / L of viable cell count reagent SF (nacalai tesQue) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours, and A450 was measured.
  • Daudi cells are a human B cell line that is highly sensitive to IFN. 6.25xl0 3 cells / well were seeded in a 96-well plate in 0.1 mL of medium containing the sample. After 4 days of culture, 10 / xL of viable cell count reagent SF (nacalai tesque) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours, and then A450 was measured.
  • amino acid sequences of the variable regions of the antibodies selected in the above screening are shown in SEQ ID NOs: 1 to 26.
  • the relationship between the name of each antibody and the sequence number is shown in Table 1 above.
  • the concentration of bispecific scFv-CH in the culture supernatant of HEK293 transfected with antibody gene was adjusted to 12.5 ng / mL in terms of IgG, and a 5-fold dilution series was prepared. This is used to derive the reporter plasmid.
  • the cells were added at 30 ⁇ L / wel 1.
  • a 5-fold dilution series of IFN-2a was dispensed into the positive control wel 1 at 30 ⁇ L / well.
  • Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega) was added at 50 zL / mL, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, luciferase activity was measured by Analyst HT (UL) (Fig. Figure 2, Figure 3, Figure 4).
  • an antibody having an agonist effect on a receptor containing a hetero chain Since the antibody of the present invention is considered to have high stability in blood and no antigenicity, it is generally expected to be a drug.

Abstract

動物に受容体のA鎖、B鎖それぞれを免疫した後、この動物の脾細胞からmRNAを抽出し、CDRを含む可変領域に対応するプライマーを用いてRT-PCRにてL鎖、H鎖の可変領域を回収した。assembly PCRにて一本鎖Fvを合成し、ファージライブラリーを構築した。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、その一本鎖可変領域を動物細胞用のシグナル配列とCH1-hinge-CH2-CH3の間に挿入し、scFv-CH1-Fc発現ベクターを作製した。様々な組み合わせで細胞に導入、抗体を発現させ、リガンド同様の活性を示す抗体クローンを選択した。

Description

明細書 ヘテロ受容体に対するァゴニスト抗体 技術分野
本発明は、 ヘテロ受容体に対するァゴニスト抗体、 および該抗体を有効成分と して含有する医薬組成物に関する。 背景技術
抗体は血中での安定性が高く、 抗原性もないことから医薬品として注目されて いる。 その中でも二種類の抗原を同時に認識できる二種特異性抗体が提唱されて 久しいが、 現状では二種類の抗原を単に繋ぐのみである。 しかし抗体は抗原中の 特定のェピトープに結合するため、 適当な抗体の組み合わせを選べば二種特異性 抗体によって 2つの抗原を望む距離 ·角度に配位することが出来ると考えられる。 多くのサイトカイン受容体はリガンドが結合することによつて二量体を形成す る鎖間の距離 ·角度が変化して細胞内にシグナルを伝え得るようになると考えら れている。 つまり適切な抗受容体抗体はリガンドによる受容体の二量体化を模倣 でき、 ァゴニスト抗体となりうる。 既にホモ二量体から成る MPL (米国特許出願公 開第 98/17364号明細書、 および文献 ( rBloodj 、 1998年、 Vol. 92、 No. 6、 p. 1981-1988) 参照） 、 EP0受容体、 GH受容体に対してァゴニスト作用を示すモノ クローナル抗体が報告されている。
しかしながら、 ヘテロ二量体を形成する受容体の場合は、 二種の受容体鎖の複 合体を形成させる必要があるため一般的な抗体ではァゴニスト作用を期待できな レ^ この目的には二種類の抗原を二本の腕でそれぞれ認識出来る上記の二種特異 性抗体が適すると考えられるが、 報告例は未だなかった。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 ヘテロ 鎖を含む受容体に対してァゴニスト作用を有する抗体を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った。 ァゴニスト抗体のス クリーニングでは、 受容体を構成する二種の鎖 (A, B)それぞれに対する抗体 （ひ、 /3 ) を多数選択し、 α、 ι3の組み合わせについてひとつひとつ検定を行う必要が ある。 また二種特異性抗体の産生には、 抗体産生ハイブリド一マ同士の融合、 も しくは抗体の発現ベクターを細胞へ導入しなければならない。 本発明者らは、 例 えば、 以下のような方法によって、 ヘテロ鎖からなる受容体に対してァゴニスト 作用を有する二種特異性抗体を作製することに成功した。 より具体的には、 以下 のようにして行った。
動物に受容体の Α鎖、 B鎖それぞれを免疫した。 この動物の脾細胞から mR Aを抽 出し、 抗体の相補性決定領域（CM; co即 lementari ty determining region)を含む 可変領域に対応するプライマーを用いて RT-PCRにて L鎖、 H鎖の可変領域を回収し た。 assembly PCRにて一本鎖 Fv (scFv)を合成し、 ファージライブラリーを構築し た。 パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮 'クローン化し、 その一本 鎖可変領域 (scFv)を動物細胞用のシグナル配列と Cm-hinge- CH2-CH3の間に挿入し、 scFv- CHI- Fc発現ベクターを作製した。 様々な組み合わせで細胞に導入、 抗体を発 現させた。 この培養上清を目的のリガンドに反応する細胞に添加し、 リガンド同 様の活性を示す抗体クローンを選択した。
上記方法により、 AR1， AR2の二種の鎖から成る I型ィン夕一フエ口ン受容体に対 するァゴニスト抗体の分離に成功した。 即ち本発明者らは、 ヘテロ鎖からなる受 容体に対してァゴニスト作用を有する二種特異性抗体を初めて分離することに成 功し、 本発明を完成させた。
本発明は、 ヘテロ鎖を含む受容体に対してァゴニスト作用を有する抗体に関し、 より具体的には、 ' 〔 1〕 ヘテロ鎖を含む受容伴に対してァゴニスト活性を有する抗体、
〔2〕'受容体がサイト力イン受容体である 〔1〕 に記載の抗体、
〔3〕 サイト力イン受容体がインターフェロン受容体である 〔2〕 に記載の抗体、 〔4〕 インターフェロン受容体が I型インターフェロン受容体である 〔3〕 に記載 の抗体、
〔5〕 I型イン夕一フエ口ン受容体が AR1鎖及び AR2鎖を含んでいることを特徴と する 〔4〕 に記載の抗体、
〔6〕 受容体が多量体である 〔1〕 に記載の抗体、
〔7〕 多量体が二量体である 〔6〕 に記載の抗体、
〔8〕 二種特異性抗体である 〔1〕 〜 〔7〕 のいずれかに記載の抗体、
〔9〕 抗 AR1鎖抗体の可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の可変領域とを含む、 〔5〕 に記 載の抗体、
〔10〕 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗
AR2鎖抗体における下記 （b l) 〜 （b l O) のいずれかに記載のァミノ 酸配列からなる可変領域とを含む、 〔9〕 に記載の抗体、
(a) H鎖可変領域が配列番号： 1に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列
(b l) H鎖可変領域が配列番号： 7に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 8に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 19に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 20に記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖可変領域が配列番号： 13に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 14に記載のアミノ酸配列
(b 5) H鎖可変領域が配列番号： 23に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 24に記載のアミノ酸配列
(b 6) H鎖可変領域が配列番号： 5に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 6に記載のアミノ酸配列
(b 7) H鎖可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 18に記載のアミノ酸配列
(b 8) H鎖可変領域が配列番号： 15に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列
(b 9) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
(b 10) H鎖可変領域が配列番号： 11に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列
〔11〕 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b l) 〜 （b 3) のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなる可変領域とを含む、 〔9〕 に記載の抗体、
(a) H鎖可変領域が配列番号： 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 4に記載のアミノ酸配列
(b l) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 25に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 26に記載のアミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
〔12〕 〔1〕 〜 〔1 1〕 のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医 薬組成物、 を提供するものである。
本発明は、 ヘテロ鎖を含む受容体に対してァゴニスト活性を有する抗体を提供 する。 本発明においてへテロ鎖を含む受容体とは、 受容体 （多量体） が異なる 2つ以上 のタンパク質 （受容体鎖） で構成されていることをいう。 多量体は二量体、 三量' 体、 四量体など、 そのタンパク質 （受容体鎖） 数により限定はされないが、 好ま しくは二量体である。 例えば、 受容体が二量体の場合には、 ヘテロ受容体は 2つの 構成タンパク質 （受容体鎖） が同一でないことを表す。
ァゴニスト活性を有する抗体とは、 ある受容体に対して、 ァゴニスト作用を有 する抗体を指す。 一般的に、 ァゴニストであるリガンド （因子） が受容体と結合 すると、 受容体タンパク質の立体構造が変化し、 受容体が活性化 （受容体が膜夕 ンパク質である場合には、 通常、 細胞増殖などのシグナルを発する） される。 二 量体を形成するタイプの受容体である場合には、 ァゴニスト抗体は適切な距離、 角度で受容体を二量体化させることにより、 リガンドと同様の働きをすることが できる。 つまり、 適当な抗受容体抗体はリガンドにより受容体の二量体化を模倣 でさ、 ァゴニスト抗体となり得る。
ァゴニスト作用によって変化が誘導される生理的活性としては、 例えば、 増殖 活性、 生存活性、 分化活性、 転写活性、 膜輸送活性、 結合活性、 蛋白質分解活性、 リン酸化 Z脱リン酸化活性、 酸化還元活性、 転移活性、 核酸分解活性、 脱水活性、 細胞死誘導活性、 アポトーシス誘導活性、 などを挙げることができるが、 これら に限定されるわけではない。
本発明の好ましい態様においては、 本発明の受容体としてサイトカイン受容体 を挙げることができる。 サイト力インは、 通常、 各種の血球細胞の増殖と分化を 制御する生理活性タンパク質の総称として用いられるが、 非免疫系細胞を含む細 胞の増殖因子及び増殖抑制因子を指すこともある。 従って、 サイト力インは細胞 から放出され、 免疫、 炎症反応の制御作用、 抗ウィルス作用、 抗腫瘍作用、 細胞 増殖 ·分化の調節作用など細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子の総称で ある。
サイト力インの具体的な例としては、 イン夕一ロイキン 1〜1 5、 コロニー刺 激因子 （G- CSF、 M_CSF、 GM- CSFなど） 、 インターフェロン （IFN- 、 IFN- jS、 IFN-ァ、 など） 、 ケモカイン、 腫瘍壊死因子 （TNF) 、 リンホトキシン、 エリス口 ポェチン、 上皮増殖因子、 繊維芽細胞増殖因子などを挙げることができるが、 好 ましくはインターフェロンであり、 特に好ましくは I型ィンタ一フエロンである。 サイトカイン受容体の具体的な例として、 インターフェロン受容体ファミリー (IFN- 受容体、 IFN_i3受容体、 IFN-ァ受容体、 IL- 10受容体、 など） 、 インター ロイキン受容体ファミリ一 （IL- 2受容体、 IL-3受容体、 IL-6受容体、 GM- CSF受容 体、 など） 、 セリンートレオニンキナーゼ型受容体ファミリー （BMP受容体、 TGF - /3受容体、 ァクチビン受容体、 など） 、 チロシンキナーゼ型受容体 （EGF受容体、 PDGF受容体、 VEGF受容体、 c- ki t受容体、 c- ims受容体、 など） 、 免疫グロブリン 受容体ファミリー （IL- 1受容体、 など） 、 細胞死受容体ファミリー （TNF受容体、 Fas受容体、 NGF受容体、 など） 、 7回膜貫通型受容体ファミリー （IL- 8受容体、 ケモカイン受容体、 など） などを挙げることができるが、 好ましくはインターフ ェ口ン受容体フアミリーであり、 さらに好ましくは I型インタ一フエ口ン受容体 である。
インターフェロンには IFN-ひ、 IFN_)3、 IFN -ァ、 IFN -てなどが含まれる。 IFN- ひと IFN- /3は相同性が高い為、 これら 2つの IFNは同一のレセプ夕一を介して反応 することができる。 又、 インターフェロン αとインターフェロン /3は I型インタ 一フエロンに分類される。
I型インターフェロン受容体の好ましい例として、 AR1鎖 （GenBank ACCESSION No ： J0317K 文献： Uze G, Lutfal la G, Gresser I. Genet ic transfer of a funct ional human interferon [ [alpha] ] receptor into mouse cel ls : cloning and expression of i ts cDNA. Cel l (1990) 60, 225-234. ) および AR2鎖
(GenBank ACCESSION No ： U29584, 文献： Domanski P, Wi t te M, Kel lum M, Rubinstein M, Hacket t R, Pi tha P, et al. Cloning and expression of a long form of the [ [beta] ] subuni t of the interferon [ [alpha] ] / [ [beta] ] receptor that is re uired for signal l ing. J Biol C em (1995) 270, 21606- 21611. ； Lut faUa G, Hol land SJ, Cinato E, Monneron -D. , Reboul J, Rogers NC, et al. Mutant U5A cel ls are complemented by an interferon- ab receptor subuni t generated by al ternat ive process ing of a new member of a cytokine receptor gene cluster. EMBO J (1995) 14, 5100-5108. ) を有する受 容体を挙げることができる。
多種特異性抗体とは、 異なる多種の抗原と特異的に結合し得る抗体を言う。 つ まり、 多種特異性抗体は少なくとも 2種類の異なる抗原に対して特異性を有する 抗体である （例えば、 抗原がヘテロ受容体の場合には、 多種特異性抗体はへテロ 受容体を構成する異なるドメインを認識する） 。 通常、 このような分子は 2個の 抗原と結合するものであるが （二種特異性抗体： bispec i f ic抗体） 、 それ以上の (例えば、 3種類の） 抗原に対して特異性を有していてもよい。
本発明のへテロ受容体に対する抗体は、 特に制限されないが、 モノクローナル 抗体であることが好ましい。 また、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え 型抗体であることが好ましい。 （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J W. , THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the Uni ted Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 。 組換え型抗体は、 それをコードする DNAをハイプリドーマ、 または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞から クローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させる ことにより得ることができる。
さらに、 本発明の抗体は、 その抗体断片や抗体修飾物、 低分子化抗体などであ つてよい。 たとえば、 抗体断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv等が挙げられる。 こ こで、 「Fv」 断片は最小の抗体断片であり、 完全な抗原認識部位と結合部位を含 む。 この領域は 1つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結され たダイマーである （VH- VLダイマー） 。 各可変領域の 3つの CDRが相互作用し、 VH - VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を 付与している。 しかしながら、 1つの可変領域 （または、 抗原に特異的な 3つの CDR のみを含む Fvの半分） であっても、 全結合部位よりも親和性は低いが、 抗原を認 識し、 結合する能力を有する。
また、 Fab断片 （F (ab)とも呼ばれる） はさらに、 軽鎖の定常領域および重鎖の 定常領域 （CH1) を含む。 Fab'断片は、 抗体のヒンジ領域からの 1またはそれ以上 のシスティンを含む重鎖 CH1領域のカルポキシ末端由来の数個の残基を付加的に有 する点で Fab断片と異なっている。 Fab' -SHとは、 定常領域の 1またはそれ以上のシ スティン残基が遊離のチオール基を有する Fab'を示すものである。 F (ab' )断片は、 F (ab' ) 2ペプシン消化物のヒンジ部のシスティンにおけるジスルフィド結合の切断 により製造される。 化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られて いる。
低分子化抗体としては 一本鎖 Fv (scFv) 、 ダイアポディ （diabody)、 線状抗体、 一本鎖抗体分子などが含まれる。
ダイアポディ (diabody; Db)は、 遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の 抗体断片を指す (P. Hol l iger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 6444-6448 (1993)、 EP404， 097号、 W093/11161号等）。 ダイアポディは、 2本のポリペプチド鎖 から構成されるダイマーであり、 ポリペプチド鎖は各々、 同じ鎖中で軽鎖可変領 域 (VL)及び重鎖可変領域 (VH)が、 互いに結合できない位に短い、 例えば、 5残基程 度のリンカ一により結合されている。 同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、 その間のリンカ一が短いため単鎖 V領域フラグメントを形成することが出 来ず二量体を形成するため、 ダイアポディは 2つの抗原結合部位を有することとな る。 このとき 2つの異なる抗原 (a、 b)に対する VLと VHを VLa- VHbと VLb- VHaの組合わ せで 5残基程度のリンカ一で結んだものを同時に発現させると二種特異性 Dbとして 分泌される。
scFvまたは scFv抗体断片には、 抗体の VHおよび VL領域が含まれ、 これらの領域 は単一のポリペプチド鎖中に存在する （Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1988) 85, 5879-5883) 0 一般に、 scFvポリペプチドはさらに VHおよび VL領域の間にポリペプチドリンカ一を含んでおり、 これにより scFvは、 抗 原結合のために必要な構造を形成することができる （scFvの総説については、 Pluckthun 『The Pharmacology of Monoclonal Ant ibodies』 Vol. 113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp. 269-315, 1994) を参照） 。 本発 明におけるリンカ一は、 その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するも のでなければ特に限定されない。
これら、 抗体断片や低分子化抗体は、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ぺプシ ンで処理し抗体断片を生成させることによって、 または、 これら抗体断片をコ一 ドする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発 現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； Bet ter, M. and Horwi tz, A. H. , Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al. , Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照） 。
抗体修飾物としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と 結合した抗体や、 細胞障害性物質、 エンドトキシン、 放射性物質などと結合した 抗体を挙げることができる。 本発明の抗体修飾物においては、 結合される物質は 限定されない。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立されて いる。
本発明の抗体は、 ヒト抗体、 マウス抗体、 ラット抗体など、 その由来は限定さ れない。 またキメラ抗体ゃヒト型化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、 例えば、 ヒト抗体遺伝子の全てのレ パートリーを有するトランスジエニック動物を目的の抗原で免疫することで目的 - 1 o - のヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照） 。
遺伝子改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。 具体的には、 たとえばキメラ抗体は、 免疫動物の抗体の重鎖、 および軽鎖の可変領域と、 ヒト 抗体の重鎖および軽鎖の定常領域からなる抗体である。 免疫動物由来の抗体の可 変領域をコードする DNAを、 ヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 これ を発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、 キメラ抗体 を得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称される改変抗体である。 ヒト型化抗体は、 免疫動物由来の抗体の CDRを、 ヒト抗体の相補性決定領域へ移植 することによって構築される。 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （framework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末端部にオーバーラップする 部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、 次いで発現べクタ一 に組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州特許出 願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576参照） 。 CDRを介して連 結されるヒ卜抗体の FRは、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するもの が選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ卜抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合 部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換し てもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
本発明のァゴニスト抗体を得る方法は特に制限されず、 どのような方法で取得 されてもよい。 例えば、 二種の鎖 （A鎖， B鎖） からなるヘテロ受容体に対するァ ゴニスト抗体を得る場合、 受容体を構成する二種の鎖 (A, B)それぞれで免疫動物 を免疫し、 複数の抗 A鎖抗体及び複数の抗 B鎖抗体を取得する。 その後、 抗 A鎖抗体 の H鎖と L鎖及び抗 B鎖抗体の H鎖と L鎖を含む二種特異性抗体を作製する。 ここで、 抗 A鎖抗体と抗 B鎖抗体はそれぞれ複数種得られているので、 なるべく多くの組み 合わせの二種特異性抗体を作製することが好ましい。 二種特異性抗体を作製後、 ァゴニスト活性を有する抗体を選択する。
本発明の一つの態様においては、 本発明の抗体は二種特異性抗体である。 二種 特性抗体の作製は、 抗体産生ハイプリドーマ同士の融合、 もしくは抗体の発現べ クタ一の細胞導入などの公知の方法により行うことができる。 例えば、 動物に受 容体の A鎖、 B鎖それぞれを免疫する。 この動物の脾細胞から mRNAを抽出し、 CDRを 含む可変領域に対応するプライマーを用いて RT- PCRにて L鎖、 H鎖の可変領域を回 収する。 assembly PCRにて一本鎖 Fv (scFv)を合成し、 ファージライブラリーを構 築する。 パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮 ·クローン化し、 その 一本鎖可変領域（scFv)を動物細胞用のシグナル配列と CHI-hinge- CH2- CH3の間に挿 入し、 scFv-CHl-Fc発現ベクターを作製する。 抗 A鎖抗体をコードするベクターと 抗 B鎖抗体をコードするべクタ一を同一の細胞に導入し、 抗体を発現させることに より二種特異性抗体を得ることができる。
ァゴニス卜活性を有する抗体の選択は、 例えば、 以下のような方法により行う ことができる。
( 1 ) 因子依存的に増殖する細胞の培養時に抗体を添加することによって、 因子 同様に細胞が増殖するか否かを指標とする。 細胞が増殖する場合に、 被験 多種特異性抗体は、 ァゴニスト作用を有するものと判定する。
( 2 ) 因子の本来の活性 （増殖とは限らない） を示す細胞株の培養時に加えるこ とによって、 因子同様の反応を示すか否かを指標とする。 因子同様の反応 を示す場合に、 抗体は、 ァゴニスト作用を有するものと判定する。
上記細胞は、 通常、 本発明の抗体がァゴニストとして作用し得る受容体を、 細 胞表面において発現しており、 該受容体のリガンド （例えば、 ァゴニスト抗体） と結合することにより、 シグナルを発する。 従って上記方法において使用する細 胞は、 受容体のリガンド （因子） 依存的に増殖できる細胞 （因子依存性増殖細 胞） であることが好ましい。 また、 上記受容体は、 通常、 リガンドと結合するこ とにより、 細胞増殖シグナルを発するものであることが好ましい。 しかし、 上記 受容体が細胞増殖シグナルを出さないタイプのものである場合、 該受容体を、 細 胞増殖シグナルを発するタイプの受容体と融合させ、 所謂キメラ受容体とするこ とにより、 上記方法に使用することができる。 該キメラ受容体は、 リガンドと結 合することにより、 細胞増殖シグナルを発する。 受容体と融合させることにより キメラ受容体を構築するのに適した受容体は、 細胞増殖シグナルを発するタイプ の受容体であれば特に制限されないが、 通常、 膜タンパク質であり、 より好まし くは細胞外がリガンド受容体鎖であり細胞内が受容体鎖であるような受容体であ る。 具体的には、 G- CSF受容体、 即 1、 neu、 GM- CSF受容体、 EP0受容体、 c- Ki t、 FLT-3等を挙げることができる。 本発明における上記因子依存性増殖細胞の好適な 例として、 具体的には、 細胞外がリガンド受容体鎖であり細胞内が G-CSF受容体鎖 であるキメラ受容体を発現させた因子依存性増殖細胞 BaF3を示すことができる。 その他、 上記方法において使用できる細胞として、 例えば、 NFS60、 FDCP-K FDCP- 2、 CTLL- 2、 DA- 1、 KT - 3等を挙げることができる。
その他、 ァゴニスト活性を有する抗体の選択方法としては、 種々の量的及び 又は質的な変化を指標とした方法が挙げられる。 例えば、 無細胞系 (cel l free assay)の指標、 細胞系（eel卜 based assay)の指標、 組織系の指標、 生体系の指標 を用いることができる。
無細胞系の指標としては、 酵素反応やタンパク質、 DNA、 NAの量的及び Z又は 質的な変化を用いることができる。 酵素反応としては、 例えば、 アミノ酸転移反 応、 糖転移反応、 脱水反応、 脱水素反応、 基質切断反応等を用いることができる。 また、 タンパク質のリン酸化、 脱リン酸化、 二量化、 多量化、 分解、 乖離等や、 DNA、 RNAの増幅、 切断、 伸長を用いることができる。 例えばシグナル伝達経路の 下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。
細胞系の指標としては、 細胞の表現型の変化、 例えば、 産生物質の量的及び Z 又は質的変化、 増殖活性の変化、 細胞数の変化、 形態の変化、 特性の変化等を用 いることができる。 産生物質としては、 分泌タンパク質、 表面抗原、 細胞内タン パク質、 mRNA等を用いることができる。 形態の変化としては、 突起形成及び Z又 は突起の数の変化、 偏平度の変化、 伸長度 Z縦横比の変化、 細胞の大きさの変化、 内部構造の変化、 細胞集団としての異形性ノ均一性、 細胞密度の変化等を用いる ことができる。 これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。 特性の変化としては、 足場依存性、 サイ卜力イン依存応答性、 ホルモン依存性、 薬剤耐性、 細胞運動性、 細胞遊走活性、 拍動性、 細胞内物質の変化等を用いるこ とができる。 細胞運動性としては、 細胞浸潤活性、 細胞遊走活性がある。 また、 細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報 伝達物質量、 細胞内タンパク質量等を用いることができる。 また、 細胞膜受容体 の場合には、 受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とす ることができる。
組織系の指標としては、 使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすること ができる。 生体系の指標としては組織重量変化、 血液系の変化、 例えば血球細胞 数の変化、 タンパク質量や、 酵素活性、 電解質量の変化、 また、 循環器系の変化、 例えば、 血圧、 心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、 特に制限はなく、 吸光、 発光、 発 色、 蛍光、 放射活性、 蛍光偏光度、 表面プラズモン共鳴シグナル、 時間分解蛍光 度、 質量、 吸収スペクトル、 光散乱、 蛍光共鳴エネルギー移動、 等を用いること ができる。 これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、 目的に応じて、 適 宜選択することができる。
例えば、 吸収スぺクトルは一般的に用いられるフォ卜メータやプレートリーダ 等、 発光はルミノメ一夕等、 蛍光はフルォロメ一夕等で測定することができる。 質量は質量分析計を用いて測定することができる。 放射活性は、 放射線の種類に 応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、 蛍光偏光度は BEACON (宝酒 造） 、 表面プラズモン共鳴シグナルは BIAC0RE、 時間分解蛍光、 蛍光共鳴エネルギ 一移動などは ARV0などにより測定できる。 さらに、 フロ一サイトメータなども測 定に用いることができる。 これらの測定方法は、 一つの測定方法で 2種以上の検出 指標を測定しても良く、 簡便であれば、 2種以上の測定を同時及び/又は連続して 測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。 例えば、 蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルォロメ一夕で測定することができる。 受容体に対する抗体は、 当業者に公知の方法により得ることができる。 例えば、 免疫動物に対して抗原を免疫化することにより調製することができる。 動物を免 疫化する抗原としては、 免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を有さない不完 全抗原 （ハプテンを含む） が挙げられる。 本発明においては、 本発明のァゴニス ト抗体がリガンドとして作用すると考えられる受容体を、 上記抗原 （免疫原） と して使用する。 本発明における上記受容体は特に制限されないが、 好ましくはへ テロ二量体である。 免疫化する動物として、 例えば、 マウス、 ハムスター、 また はァカゲザル等を用いることができる。 これら動物に対して、 抗原を免疫化する ことは、 当業者においては、 周知の方法によって行うことができる。 例えば、 一 般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより 行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Sal ine) や生理食 塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により通常のアジュバント、 例えば フロイン卜完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎に数回 投与する。 このように哺乳動物を免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇する のを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取する。
本発明において好ましくは、 免疫化された動物または該動物の細胞から抗体の L 鎖および H鎖の可変領域の回収を行う。 この操作は、 当業者においては一般的に公 知の技術を用いて行うことができる。 抗原によって免疫化された動物は、 とりわ け脾臓細胞において該抗原に対する抗体を発現する。 従って、 例えば、 免疫化さ れた動物の脾臓細胞から mMAを調製し、 該動物の CDRに対応するプライマーを用い て、 RT-PCRにより L鎖および Ή鎖の可変領域の回収を行うことができる。 ここで、 CDRとは、 抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、 抗原と相補的に直接結合する 3つの領域 （CDR1、 CDR2, CDR3) を指す。 CDRに対応するプライマ一としては、 例 えば、 CDRよりも多様性の低いフレームワークに対応するプライマー、 あるいはシ グナル配列と CH1、 CL部分に対応するプライマーを用いることができる。 また、 in においてリンパ球を免疫化することもできる。 その後、 免疫化された動物の 脾臓またはリンパ球中に含まれる抗体をコードする DNAを、 慣用の方法、 例えば、 抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるヌクレオ チドプローブ等を用いる方法により単離する。
免疫原とする受容体は、 該受容体を構成するタンパク質全体、 もしくは該夕ン パク質の部分ペプチドであってもよい。 また、 動物を免疫するのに用いる免疫原 としては、 場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性抗原とするこ とも可能であり、 また、 場合によりそれらの断片を用いてもよい。 受容体のよう な膜貫通分子を抗原として用いる場合、 これらの断片 (例えば、 受容体の細胞外領 域）を用いるのが好ましい。 また、 膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫 原とすることもできる。 このような細胞は天然 (腫瘍セルライン等）由来、 または、 組換え技術により膜貫通分子を発現するように構成された細胞であってもよい。 得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 抗体の分離、 精製は通常 のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えばァフィ 二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外 濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適 宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製することができる（Ant ibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるものではない。 ァフィ二ティーク口 マトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン Aカラム、 プロテイン Gカラ ムが挙げられる。 例えばプロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。
本発明の抗体は、 例えば、 AR1鎖および AR2鎖を含む I型インターフェロン受容 体に対してァゴニスト活性を有する抗体である場合には、 好ましくは、 抗 AR1鎖抗 体における可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における可変領域とを含む構造を有する。 該 抗体としては、 特に制限されるものではないが、 例えば、 抗 AR1鎖抗体の下記のい ずれかの可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の下記のいずれかの可変領域とを含む抗体を挙 げることができる。
•抗 AR1鎖抗体の可変領域： AR卜 41、 AR1-24
•抗 2鎖抗体の可変領域： AR2- 37、 AR2-1 K AR2-13, AR2- 45、 AR2-22, AR2- 43、
AR2- 40、 AR2-14, AR2- 44、 AR2- 33、 AR2 - 31 上記のそれぞれの可変領域の VHおよび VLのアミノ酸配列を、 配列番号： 1〜2 6に示す （各可変領域の VHおよび VLと、 配列番号との関係を表 1に示す） 。
表 1
可変領域 配列番号
VH VL
AR1-41 1 2
AR1-24 3 4
AR2-37 5 6
AR2-11 7 8
AR2-13 9 1 0
AR2-45 1 1 1 2
AR2-22 1 3 1 4
AR2-43 1 5 1 6
AR2-40 1 7 1 8
AR2-14 1 9 2 0
AR2-44 2 1 2 2
AR2-33 2 3 2 4
AR2-31 2 5 2 6
抗 AR1鎖抗体が AR1- 24の場合、 パートナーとなる抗 AR2鎖抗体は、 AR2- 13、 AR2- 31、 あるいは AR2-44であることが好ましく、 抗 AR1鎖抗体が AR卜 41の場合、 パート ナ一となる抗 AR2鎖抗体は、 AR2-1 K AR2- 13、 AR2- 14、 AR2- 22、 AR2-33, AR2 - 37、 A 2-40, AR2- 43、 AR2- 44、 あるいは AR2-45であることが好ましい。 AR2- 13および AR2- 44は、 AR卜 41および Αΐ -24の両方の抗体に対してパートナーとなることが可 能である。 上記のような対を形成する抗体もまた、 本発明に含まれる。
また、 本発明において、 上記可変領域を含む抗体は、 必ずしも可変領域の全長 配列を有している必要はなく、 CDR配列が保存されていれば、 F R配列は抗体をヒ ト化等する際に適宜変更してよい。 従って、 本発明は、 上記可変領域において CDRに対応するアミノ酸配列を有する 抗体を含む。
上記可変領域の配列番号において、 CDRに対応するアミノ酸番号を表 2に示す。
表 2 配列番号 アミノ酸番号 配列番号 アミノ酸番号
VH CDR1 CDR2 CDR3 VL CDR1 CDR2 CDR3
AR1-41 1 31- -35 50-66 99- -109 2 24-34 50-56 89- -97
AR1-24 3 31- -35 50-66 99- -108 4 24-34 50-56 89- -97
AR2-37 5 31- -35 50-66 99- -106 6 24-39 55-61 94- -102
AR2-11 7 31- -35 50-66 99- -108 8 24-39 55-61 94- -102
AR2-13 9 31- -35 50-66 99- -107 10 24-39 55-61 94- -102
AR2-45 11 31- -35 50-66 99- -107 12 24-39 55-61 94- -102
AR2-22 13 31- -35 50-66 99- -106 14 24-39 55-61 94- -102
AR2-43 15 31- -35 50-66 99- -106 16 24-39 55-61 94- -102
AR2-40 17 31- -35 50-66 99- -106 18 24-39 55-61 94- •102
AR2-14 19 31- -35 50-66 99- -108 20 24-39 55-61 94- -102
AR2-44 21 31- -35 50-66 99- -108 22 24-39 55-61 94- -102
AR2-33 23 31- -35 50-66 99- -108 24 24-39 55-61 94- -102
AR2-31 25 31· -35 50-66 99 - -106 26 24-39 55-61 94- -102 また、 本発明で開示されている可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、 定 常領域は特に限定されず、 当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、 例えば、、 Seauences of proteins of immunological interest, (1991) , U. S. Department of Heal th and Human Services. Publ ic Heal th Service Nat ional Inst i tutes of Heal thや、 An ef f icient route to human bispeci f ic IgG,
(1998) . Nature Biotechnology vol. 16, 677- 681、 等に記載されている定常領域 を用いることができる。
本発明の抗体はァゴニスト作用を有することから、 該抗体が作用する受容体の 活性 （機能） 低下に起因する疾病に対して、 有効な薬剤となることが期待される。 即ち本発明は、 本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。 例えば、 本発明の抗体がサイトカイン受容体に対してァゴニスト活性を有する抗 体である場合には、 該抗体はサイト力イン様作用を有するものと考えられる。 従 つて該抗体は抗ウィルス作用、 抗腫瘍作用、 細胞増殖，分化調節作用を有する医 薬品 （医薬組成物） となることが期待される。
治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成 物は、 必要に応じて、 それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、 媒体等と混和して製剤化することができる。 例えば、 滅菌水や生理食塩水、 安定 剤、 賦形剤、 酸化防止剤（ァスコルビン酸等)、 緩衝剤（リン酸、 クェン酸、 他の有 機酸等)、 防腐剤、 界面活性剤 (PEG、 Tween等)、 キレート剤 (EDTA等)、 結合剤等を 挙げることができる。 また、 その他の低分子量のポリペプチド、 血清アルブミン、 ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、 グリシン、 グルタミン、 ァスパラギン、 アルギニン及びリシン等のアミノ酸、 多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、 マンニ トールゃソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。 注射用の水溶液と する場合には、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、 例 えば、 D-ソルビ! ^一ル、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリウムが挙げ られ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール (エタノール等)、 ポリアルコール（プ ロピレングリコール、 PEG等)、 非イオン性界面活性剤（ポリソルべ一ト 80、 HC0- 50)等と併用してもよい。
また、 必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロー ス、 ゼラチン、 ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、 コロイドドラッグデリバリーシステム（リボソーム、 アルブミンミクロスフエア、 マイクロエマルジヨン、 ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる (" Remington' s Pharmaceut ical Science 16th edi t ion" , Oslo Ed. (1980)等参 照)。 さらに、 薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、 本発明の抗体に適用 し得る（Langer et al.， J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167-277 (1981)； Langer, chem. Tech. 12 : 98-105 (1982)；米国特許第 3, 773, 919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58, 481号; Sid薩 et al. , Biopolymers 22 : 547-556 (1983) ;EP第 133， 988号）。 本発明の医薬組成物の投与量は、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体重、 患者の症状、 進行の程度等を考慮して、 最終的には医師の判断により適宜決定さ れるものであるが、 一般に大人では、 1日当たり、 0. l〜2000mgを 1〜数回に分けて 経口投与することができる。 より好ましくは l〜1000mgZ日、 更により好ましくは 50〜500nig/日、 最も好ましくは 100〜300mg_ 日である。 これらの投与量は患者の 体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者であれば適当な投与量を適 宜選択することが可能である。 投与期間も、 患者の治癒経過等に応じて適宜決定 することが好ましい。
また、 本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺 伝子治療を行うことも考えられる。 投与方法としては、 nakedプラスミドによる直 接投与の他、 リポソ一ム等にパッケージングするか、 レトロウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 ボックスウィルスべク タ一、 アデノウイルス関連ベクター、 HVJベクター等の各種ウィルスベクターとし て形成するか (Adolph 『ウィルスゲノム法』， CRC Press, Florid (1996)参照）、 または、 コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆 (W093/17706等）して投与すること ができる。 しかしながら、 生体内において抗体が発現され、 その作用を発揮でき る限りいかなる方法により投与してもよい。 好ましくは、 適当な非経口経路 (静脈 内、 腹腔内、 皮下、 皮内、 脂肪組織内、 乳腺組織内、 吸入または筋肉内の経路を 介して注射、 注入、 またはガス誘導性粒子衝撃法 (電子銃等による）、 添鼻薬等粘 膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。 ex r/raにおいてリポソ一 ムトランスフエクシヨン、 粒子衝撃法 (米国特許第 4, 945, 050号)、 またはウィルス 感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、 該細胞を動物に再導入 することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗体の Daud i細胞に対する増殖抑制活性を示したものである。 用量依存 的なァゴニスト活性を確認できた。
図 2は、 pISRE- Luc導入 K562細胞に対する抗体の ISRE活性化能を示したものであ る。 AR1-41/M2- 13のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。 口は IFN- o; 2a、 ·は AIU - 41/AR2- 13二種特異性抗体を示す。
図 3は、 pISRE-Luc導入 Κ562細胞に対する抗体の ISRE活性化能を示したものであ る。 AR1- 41/AR2- 13のルシフェラ一ゼ活性測定の結果を示す。 口は IFN- o; 2a、 秦は AR1- 41/AR2- 14二種特異性抗体を示す。
図 4は、 pISRE-Luc導入 K562細胞に対する抗体の ISRE活性化能を示したものであ る。 AR卜 41/AR2-13のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。 口は IFN- a 2a、 鲁は AM-24/AR2_ 13二種特異性抗体を示す。
図 5は、 pISRE- Luc導入 K562細胞に対する抗体の ISRE活性化能を示したものであ る。 AR卜 41/AR2- 13のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。 口は IFN- a 2a、 參は AR卜 24/AR2- 31二種特異性抗体を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
〔実施例 1〕 抗原および免疫
ヒト AR1及び AR2それぞれの細胞外領域の C末端に FLAGもしくは Hi s6のタグを付加 した可溶型受容体の発現ベクターを CHO細胞に導入し、 その培養上清からァフィ二 ティーカラムを用いて精製した。 マウスプロ B細胞株 BaF3にヒト AR1の細胞外領域 と G-CSF受容体とのキメラ分子の発現ベクターを導入し、 高発現細胞を樹立した。 同様にヒト AR2の細胞外領域と G- CSF受容体とのキヌラ分子の高発現細胞を樹立し た。 それぞれの細胞を BALB/cの腹腔に免疫した。 脾臓を摘出する 3日前に ARlHi sも しくは AR2Hi sを静注した。
〔実施例 2〕 scFv提示ライブラリーからの抗体分離
( a ) ファージライブラリーのパンニング
免疫マウスの脾臓より polyA W RNAを抽出し、 RT-PCRにて scFvを合成し、 scFvが Πファージの gene3との融合蛋白として発現するプラスミドライブラリーを構築し た Immun. Me thods, 201, (1997) , 35-55) 0 ライブラリーの大腸菌 （2 x 109cfu) を 50 mL 2xYTAG ( 100 /i g/mLアンピシリン、 ^グルコースを含む 2xTY) に 植菌し、 0D 600 0. 4〜0. 5まで 37°Cにて培養した。 4 x 1011のヘルパーファージ VCSM13を加え 37°C、 15分間静置して感染させた。 ここに 450 mL 2xYTAG、 25 L lmol/L IPTGを添加し、 26で 10時間培養した。 遠心分離にて培養上清を回収し、 lOOmL PEG-NaCl (10%ポリエチレングリコール 8000, 2. 5 mol/L NaCl) を混合後、 4 、 60分間静置した。 10, 800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、 沈殿物 を 40 mLの水に懸濁し、 8 mL PEG- NaClを混合後、 4°C、 20分間静置した。 10, 800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ 5 mL PBSに懸濁した。 AR1FLAGと AR2FLAGは No-We igh Premeasured NHS-PE04-Biot in Microtubes (Pierce) を用いてピオチン 標識した。 ファージライブラリーに 100 pmolのピオチン標識 AR1FLAGもしくは AR2FLAGを加え、 60分間抗原と接触させた。 5% M-PBS (5 %スキムミルクを含む PBS) で洗浄した Streptavid in MagneSphere (Promega) 600 を加え、 15分間結 合させた。 ビーズを 1 mLの PBST (0. 1% Tween- 20を含む PBS) と PBSにて 3回ずつ洗 浄した。 0. 8 mLの 0. 1 mol/L グリシン/ HC1 (pH2. ) 中にビーズを 5分間懸濁し、 ファージを溶出した。 回収したファージ溶液に 45 xL 2 mol/L Trisを添加して中 和し、 対数増殖期 (0D 600 0.4〜0.5) XLト Blue 10 mLに添加、 37°C、 30分間静置 することで感染させた。 これを 2xYTAGプレートに広げ、 30°Cで培養した。 コロニ 一を回収し、 2xYTAGに植菌、 0D 600 0.4〜0.5まで 37°Cにて培養した。 培養液 10 mLに 5/iL lfflol/L IPTG、 10" piuヘルパーファージ （VCSM13) を添加し 37°C 30分 間静置した。 遠心集菌後、 25^g/mLカナマイシンを含む 2xYTAG lOOmLに再懸濁し、 30°C, 10時間培養した。 遠心分離にて培養上清を回収し、 20 mL PEG-NaClを混合 後、 4°C、 20分間静置した。 10，800 x g、 30分間遠心にてファージを沈殿させ、 mL PBSに懸濁したものを次のパンエングに供した。 2回目のパンニングではビーズ を PBSTと PBSにて 5回ずつ洗浄した。 溶出したファージを感染させ得られた大腸菌 から AR結合ファージを産生するクローンを ELISAにて選択した。
(b) ファージ ELISA
上記のシングルコロニーを 150/xL 2xYTAGに植菌し、 30°Cでー晚培養した。 この 5 Lを 500/iL 2xYTAGに植菌、 37°C、 2時間培養後、 ヘルパーファージ 2.5 x
pfuと 0.3 L lmol/L IPTGを含む 2xYTAGを 100/iL添加し 37°Cにて 30分間静置し た。 続いて 30 にて一晩培養し、 遠心上清を ELISAに供した。 StreptaWell 96マイ クロタイタープレート （Roche) を 1.0 xg/mLピオチン標識 AR1FLAGもしくは
AR2FLAGを含む PBS 100 _iLにて一晩コートした。 PBSTにて洗浄し抗原を除いた後、 2 % M-PBS 200 xLで一晩ブロッキングした。 2 % M- PBSを除き、 ここに培養上清を 加え 40分間静置し抗体を結合させた。 洗浄後、 結合ファージは 2 % M- PBSにて希釈 した HRP結合抗 M13抗体 （Amersham Pharmacia Biotech) と BM blue POD基質
(Roche) で検出し、 硫酸の添加により反応を停止した後、 A450の値を測定した。
(c) 配列決定とクローン選択
ELISAにて陽性であったクローンのファージ液からプライマー PBG3-F1 (5'- CAG CTATGAAATACCTATTGCC - 3' /配列番号： 27) と PBG3-R1 (5'- CTTTTCATAATCAAAAT CACCGG -3' Z配列番号： 28) を用いて PCRにて scFv領域を増幅し、 その塩基配列 決定した。 ファージ液 1 L、 10 X KOD Dash緩衝液 2 XL、 10 xmol/Lプライマーを 0. 5 Lづっ、 KOD Dashポリメラーゼ （T0Y0B0、 2.5 U/ iL) 0.3 Lを含む PCR反応液 2 0/iLを、 Perkin Elmer9700で 96°C、 10秒、 55°C、 10秒、 72°C、 30秒、 30サイクル の増幅を行なった。 PCR後、 5^Lの反応液に ExoSAP- IT (アマシャム） を 3 L添加 し、 37°C、 20分間、 引き続き 80°C、 15分間保温した。 このサンプルについて PBG3- F2 (5'- ATTGCCTACGGCAGCCGCT - 3' /配列番号： 29) あるいは PBG3 - R2 (5'- AAA TCACCGGAACCAGAGCC - 3' Z配列番号： 30) をプライマーとして BigDye Terminato r Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) にて反応を行ない、 Applied Bio systems PRISM 3700 DNA Seduencerで泳動した。 塩基配列から推定されるァミノ 酸配列の CDR3の異なるクローンを抗 AR1及び抗 AR2についてそれぞれ 45クローンず つ選択した。
〔実施例 3〕 二種特異性抗体の発現
s cFv-CHl-Fcとして発現させるために CAGGプ口モーターで駆動されるヒトシダナ ル配列とイントロン- CHl-Fc (ヒト IgG4 cDNA) の間に Sfilサイトを介して scFvを 挿入できる発現ベクター pCAGGss- g4CHヘテロ IgG4を構築した。 ヘテロ分子として 発現させるために IgGlの knobs- into- holes (Protein Engineering vol.9, 617- 621, 1996、 Nature Biotechnology vol.16, 677-681, 1998) を参考に IgG4の CH3 部分へのアミノ酸置換体を作成した。 Aタイプは Y349C、 T366Wの置換体である。 B タイプは E356C、 T366S、 L368A、 Y407Vの置換体である。 両者のヒンジ部分にも置 換 （-ppcpScp- →- ppcpPcp- ) を導入した。 また Aタイプにはヒト IL- 3のシグナル 配列を、 Bタイプにはヒト IL- 6のシグナル配列を用いて構築した （pCAGG-IL3ss - g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb) 。 塩基配列より選択したクローンの scFv領域の PCR 産物を Siil処理し、 抗 AR1クローンは pCAGG- IL3ss-g4CHPaに、 抗 AR2クローンは pCAGG-IL3ss- g4CHPbにサブクローニングした。 抗 AR1及び抗 AR2クローン 45 x 45の 合計 2025種類の全組み合わせについて発現ベクターを HEK293細胞にリボフェクト ァミン 2000を用いてトランスフエクシヨンし、 3日後の培養上清を回収した。
〔実施例 4〕 ァゴニストニ種特異性抗体の分離
(a) BaF3増殖アツセィ
BaF3-ARGはマウス IL- 3依存性増殖細胞 BaF3に AR1及び AR2の細胞外領域と G-CSF受 容体の細胞内領域とのキメラ分子の発現ベクターを導入して樹立した。 BaF3- ARG は IFNo!に依存して増殖した。 3度洗浄したゥエル当り 1x10s個の細胞およびサンプ ルを含む 0. lmLの培地で 96ゥエルプレートに播種した。 4日間培養後 10 /Lの生細胞 数測定試薬 SF (nacalai tesQue) を添加し、 2時間 37°C保温した後 A450を測定した。
(b) Daudi細胞増殖抑制アツセィ
Daudi細胞は IFNに対して高感受性を示すヒト B細胞株である。 サンプルを含む 0. lmLの培地でゥエル当り 6.25xl03個の細胞を 96ゥエルプレートに播種した。 4日 間培養後 10 /xLの生細胞数測定試薬 SF (nacalai tesque) を添加し、 2時間 37°C保 温した後、 A450を測定した。
(c) ァゴニストニ種特異性抗体の配列
上記スクリーニングにて選択された抗体の可変領域のアミノ酸配列を、 配列番 号： 1〜26に示す。 各抗体の名称および配列番号との関係は、 上記表 1に示す。
(d) ISREを用いたレポータージーンアツセィ
3 mLの OPTI-MEM Iに IOO Lの DMRIE- C (Invitrogen)を添加し攪拌したものに、 pISRE- Lucを 40/ig添加し、 攪拌の後室温にて 20分間静置した。 これを 8 x 106/2 mL 0PTI- MEM Iに調整したヒト細胞 K562に加え、 37でにて 4時間培養した後、 10 mLの 15%FCS- RPMI1640を添加し更に一晩培養した。 翌日、 遠心操作にて回収した K562を 10.5 mLの 10%FCS- RPMI1640で再度懸濁し 96well平底プレートに 70/xL/well で播種した。
抗体遺伝子導入 HEK293培養上清中の bispecific scFv- CHを IgG換算で 12.5 ng/mL に濃度調整し、 更に 5倍希釈系列を作製した。 これを、 レポータープラスミドを導 入した細胞に 30 ^L/wel 1で添加した。 陽性対照の wel 1には IFN - 2aの 5倍希釈列を 30 xL/well分注した。 37 にて 24時間培養後、 Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega)を 50 zL/mL添加し室温 10分静置した後、 Analyst HT (UL)にて ルシフェラ一ゼ活性を測定した （図 1、 図 2、 図 3、 図 4) 。 産業上の利用の可能性
本発明によりへテロ鎖を含む受容体に対してァゴニスト作用を有する抗体が提 供された。 本発明の抗体は、 血中での安定性が高く、 抗原性もないものと考えら れることから、 医薬品となるものと大ぃに期待される。

Claims

- 21 - 請求の範囲
1. ヘテロ鎖を含む受容体に対してァゴニスト活性を有する抗体。
2. 受容体がサイトカイン受容体である請求項 1に記載の抗体。
3. サイト力イン受容体がインターフェロン受容体である請求項 2に記載の抗体。
4. インタ一フエロン受容体が I型インターフェロン受容体である請求項 3に記載 の抗体。
5. I型インターフェロン受容体が AR1鎖及び AR2鎖を含んでいることを特徴とす る請求項 4に記載の抗体。
6. 受容体が多量体である請求項 1に記載の抗体。
7. 多量体が二量体である請求項 6に記載の抗体。
8. 二種特異性抗体である請求項 1〜 7のいずれかに記載の抗体。
9. 抗 AR1鎖抗体の可変領域と、 抗 AR2鎖抗体の可変領域とを含む、 請求項 5に記 載の抗体。
10. 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （bl) 〜 （b l O) のいずれかに記載のアミノ酸 配列からなる可変領域とを含む、 請求項 9に記載の抗体。
(a) H鎖可変領域が配列番号： 1に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列
(bl) H鎖可変領域が配列番号： 7に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 8に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 10に記載のァミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 19に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 20に記載のアミノ酸配列
(b4) H鎖可変領域が配列番号： 13に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 14に記載のアミノ酸配列
(b 5) H鎖可変領域が配列番号： 23に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 24に記載のアミノ酸配列
(b 6) H鎖可変領域が配列番号： 5に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 6に記載のァミノ酸配列
(b 7) H鎖可変領域が配列番号： 17に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 18に記載のアミノ酸配列
(b 8) H鎖可変領域が配列番号： 15に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 16に記載のアミノ酸配列
(b 9) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
(b 10) H鎖可変領域が配列番号： 11に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可 変領域が配列番号： 12に記載のアミノ酸配列
11. 抗 AR1鎖抗体における下記 （a) のアミノ酸配列からなる可変領域と、 抗 AR2鎖抗体における下記 （b l) 〜 （b 3) のいずれかに記載のアミノ酸配 列からなる可変領域とを含む、 請求項 9に記載の抗体。
(a) H鎖可変領域が配列番号： 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 4に記載のアミノ酸配列
(b l) H鎖可変領域が配列番号： 9に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領 域が配列番号： 10に記載のアミノ酸配列
(b 2) H鎖可変領域が配列番号： 25に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 26に記載のアミノ酸配列
(b 3) H鎖可変領域が配列番号： 21に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変 領域が配列番号： 22に記載のアミノ酸配列
12. 請求項 1〜11のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組 成物。
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