本發明人通過廣泛而深入的研究，採用免疫小鼠/雜交瘤技術，意外地獲得高活性的與人淋巴細胞活化基因(LAG-3)相結合的特異性單克隆抗體(鼠源抗體)。實驗結果表明，本發明抗體(鼠-人嵌合抗體)與抗原蛋白具有高度親和力(例如405B8H3的K
D
為1.96E-09M)，能夠結合LAG-3受體的胞外區並能夠在蛋白水準和細胞水準有效封閉LAG-3與配體MHC class II、LSECtin的結合；抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗證明所得LAG-3抗體具有良好的生物活性。本發明抗體的用途，包括但不限於抑制LAG-3/MHC II和/或LAG-3/LSECtin介導的信號通路的負調控，啟動腫瘤特異免疫反應，單獨或與抗PD-1，CTLA-4單克隆抗體或其它抗腫瘤藥物聯合應用於用於腫瘤免疫治療。
本發明抗體可變區與人源抗體恆定區組合為鼠-人嵌合抗體分子，或者通過人源化技術轉變為人源化抗體分子，或者根據特定用途構建成其它分子形式如雙特異性抗體、多特異性抗體、單鏈抗體、單片段抗體等。
本發明中的抗體可以是全長蛋白(如IgG1, IgG2a, IgG2b或者IgG2c)，也可以是包含抗原抗體結合域的蛋白片段(例如Fab, F(ab’), sdAb, ScFv片段)。本發明中的抗體可以是野生型蛋白，也可以是經過特定突變已達到某種特定效果的突變型蛋白，例如利用突變消除抗體的效應子功能。
在此基礎上完成了本發明。
術語 LAG-3
淋巴細胞啟動基因(LAG-3, CD223)是一種有525個胺基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點(Immune Checkpoint)之一。LAG-3主要表現在啟動的T淋巴細胞，NK細胞以及樹突細胞。LAG-3在結構上屬於免疫球蛋白超家族，它的胞外具有4個IgG樣結構域，它與CD4類似，都需要和它們的配體-II類主要組織相容性複合體(MHC class II)結合發揮其生物學活性，但其與MHC II結合能力強於CD4。LAG-3與其配體MHC class II結合可以抑制CD4+T淋巴細胞的活化與增殖，進而下調相關的體內細胞免疫反應。在體外的抗原特異性T細胞反應研究中，加入抗LAG-3抗體阻斷LAG-3/MHC II信號通路的負調控作用，可以導致T細胞增殖以及促進細胞因數的分泌，啟動免疫系統。另外LAG-3 還表現在調節性T細胞(Treg)上，通過促進Treg細胞活性。進而負調節T細胞活化和增殖以及樹突狀細胞(DC細胞)的成熟(Workman et al, 2005, Immunol, 174:688-695)。
抗體
如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成介面。
如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, 卷I, 647-669頁(1991))。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定區的胺基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是本領域人員所熟知的。
一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為可變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。
在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，包括人的和非人的部分，可以通過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單克隆抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利 4,816,397, 在此通過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補決定區(CDRs)和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此通過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單克隆抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。
在本發明中，抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
本發明提供一種針對LAG-3的高特異性和高親和力的抗體，其包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區(VH)胺基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
優選地，重鏈可變區(VH)包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO:2所示的CDR1，
SEQ ID NO:3所示的CDR2，和
SEQ ID NO:4所示的CDR3；
輕鏈可變區(VL)包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO:6所示的CDR1'，
SEQ ID NO:7或SEQ ID NO.84所示的CDR2'，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3'；
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留LAG-3結合親和力的衍生序列。
在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選為同源性或序列相同性為至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少為90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
本領域普通技術人員公知的測定序列同源性或相同性的方法包括但不限於：電腦分子生物學(Computational Molecular Biology), Lesk, A.M.編，牛津大學出版社，紐約，1988；生物計算：資訊學和基因組專案(Biocomputing: Informatics and Genome Projects), Smith, D.W.編，學術出版社，紐約，1993；序列資料的電腦分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin, A.M.和Griffin, H.G.編，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje, G.,學術出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov, M.與Devereux，J.編M Stockton Press，紐約，1991和Carillo，H.與Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)。測定相同性的優選方法要在測試的序列之間得到最大的匹配。測定相同性的方法編譯在公眾可獲得的電腦程式中。優選的測定兩條序列之間相同性的電腦程式方法包括但不限於：GCG套裝程式(Devereux, J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul, S, F.等，1990)。公眾可從NCBI和其它來源得到BLASTX程式(BLAST手冊，Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S.等，1990)。熟知的Smith Waterman演算法也可用於測定相同性。
本發明的抗體可以是雙鏈或單鏈抗體，並且可以是選自動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，更優選為人源化抗體、人-動物嵌合抗體，更優選為全人源化抗體。
本發明所述抗體衍生物可以是單鏈抗體、和/或抗體片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或該領域內其他已知的抗體衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗體或其他亞型的抗體中的任意一種或幾種。
其中，所述動物優選為哺乳動物，如鼠。
本發明抗體可以是靶向人LAG-3的嵌合抗體、人源化抗體、CDR嫁接和/或修飾的抗體。
本發明上述內容中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，優選為不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，更優選為不超過35%，更優選為1-33%，更優選為5-30%，更優選為10-25%，更優選為15-20%。
本發明上述內容中，更優選地，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，可以是1-7個，更優選為1-5個，更優選為1-3個，更優選為1-2個。
在另一優選例中，所述靶向LAG-3的抗體為405B8H3、556F6B8、105F1E10、409B11E12、409D4E10或553G8G8。
在另一優選例中，所述的抗體選自下組：405B8H3-1 (D→E)、405B8H3-1、405B8H3-2、405B8H3-6、405B8H3-7、556F6B8-3、556F6B8-7、556F6B8-3(D→E)。
在另一優選例中，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO.64、SEQ ID NO. 66、SEQ ID NO.68、 SEQ ID NO.70、SEQ ID NO. 72所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述重鏈可變區具有SEQ ID No.87、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區具有SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80或SEQ ID NO.82所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區具有SEQ ID No.89、SEQ ID No.95所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述抗體405B8H3的重鏈可變區(VH)胺基酸序列為如SEQ ID NO.:1所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述抗體405B8H3的輕鏈可變區胺基酸序列為如SEQ ID NO.: 5所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述抗體405B8H3-1(D→E)的重鏈可變區(VH)胺基酸序列為如SEQ ID NO.64所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述抗體405B8H3-1(D→E)的輕鏈可變區(VH)胺基酸序列為如SEQ ID NO.74所示的胺基酸序列。
抗體的製備
本發明抗體或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組文庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼所述的本發明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。優選的動物細胞包括(但並不限於)：CHO-S、HEK-293細胞。
通常，在適合本發明抗體表現的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的抗體。
所得單克隆抗體可用常規手段來鑑定。比如，單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉澱或體外結合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來測定。單克隆抗體的結合親和力例如可用Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)的Scatchard分析來測定。
本發明的抗體可在細胞內、或在細胞膜上表現、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的複性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
應用
本發明還提供了本發明抗體的用途，例如用於製備診斷製劑、或製備用於預防和/或治療LAG-3相關的疾病的藥物。所述LAG-3相關的疾病包括相關的疾病包括腫瘤發生、生長和/或轉移相關疾病等。
本發明抗體的用途，包括(但並不限於)：
(i)診斷、預防和/或治療黑色素瘤(如轉移性惡性黑色素瘤)，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，結腸癌，肺癌(如非小細胞肺癌)，子宮癌，卵巢癌，直腸癌，胃癌，食道癌，小腸癌，肝癌，膀胱癌，口腔癌，腦癌，睾丸癌，皮膚癌，內分泌系統癌症，輸卵管癌，慢性或急性白血病(包括急性或慢性髓樣白血病、急性或慢性淋巴細胞性白血病)、淋巴細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、T細胞淋巴瘤，晚期實體瘤。
藥物組合物
本發明還提供了一種組合物。在優選例中，所述的組合物是藥物組合物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。
本發明所述抗體也可以是由核苷酸序列在細胞內表現用於的細胞治療，比如，所述抗體用於嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)等。
本發明的藥物組合物可直接用於結合LAG-3蛋白分子，因而可用於預防和治療腫瘤等疾病。此外，還可同時使用其他治療劑。
本發明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的單克隆抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約20毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明的主要優點在於：
(1)本發明抗體具有一系列的優異特徵：
①可變區序列與現有抗體不同(同源性＜92%)；
②與BMS986016結合的抗原表位不同；
③本發明抗體與LAG-3具有較強的親和力(例如405B8H3的KD值為1.96nM)；
④本發明抗體具有很好的刺激T細胞啟動活性。
(2)本發明採用雜交瘤技術獲得抗體，與噬菌體庫獲得的抗體相比，抗體親和力高，序列表現良好。
(3)本發明獲得了序列不同的抗體，能夠與LAG-3抗體特異性結合，其結合活性低於納摩爾，並且能夠阻斷LAG-3與其配體MHCII/LSECtin的結合，通過逆轉LAG-3對T細胞啟動活性的抑制，從而啟動T細胞分泌IL-2，各項活性比較好。
(4)本發明抗體結合細胞表面的猴(例如中國猴)LAG-3蛋白能力強於對照抗體。本發明抗體與猴抗原具有交叉結合反應，可應用於進行靈長類動物的體內實驗，用於進行臨床前毒理學研究和臨床前藥代動力學研究。
下面結合具體實施例，進一步詳陳本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如美國Sambrook. J等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件(例如商品說明書)。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售管道獲得。
通用方法
本發明採用傳統的雜交瘤技術製備單克隆抗體。傳統的雜交瘤製備技術由Kohler and Milstein在40年前建立，現在已廣泛應用於科研、診斷、治療等許多相關的單克隆抗體的製備和生產之中。其基本方法雖然延用至今，但在許多方面都有所變化、改進和創新，包括不同品系動物如轉基因動物的使用、電融合技術的引入、高效篩選技術設備的應用如ClonePix設備等，使雜交瘤技術的應用更多樣化和高效化。常規動物如小鼠等製備的單抗，可以通過常規分子生物學方法克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區基因，可變區基因可以嫁接到人源抗體恆定區基因從而形成人鼠嵌合抗體，以大大降低人體使用時的免疫原性。此外，鼠源抗體可變區的CDR結構域可以嫁接到人源抗體架構上，從而使鼠源抗體成分降低到5%以下，大大增加了抗體在人體內使用的安全性。這一途徑得到抗體稱為人源化抗體，並且是目前抗體藥物市場的主要產品。根據目前最新的單抗技術進展，本發明採用優化的雜交瘤技術來製備所需的抗LAG-3抗體。
實施例 1 LAG-3 特異性抗體的製備
製備包括胞外區LAG-3蛋白、LAG-3重組細胞株、LAG-3DNA載體的表現質體等免疫原。
免疫原1)，將人源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列23-450(如序列表SEQ ID No.61所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體(購自Invitrogen，V044-50)並按已建立的標準分子生物學方法製備質體，具體方法參見Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)。對HEK293細胞(購自Invitrogen)進行暫態轉染(PEI，Polysciences)並使用FreeStyle
TM
293(Invitrogen)在37℃下進行擴大培養。4天後收集細胞培養液，離心去除細胞成分，得含LAG-3蛋白胞外區的培養上清液。將培養上清液上樣到蛋白A親和層析柱(Mabselect Sure，購自GE Healthcare)，同時用紫外(UV)檢測儀監測紫外吸收值(A280nm)的變化。上樣後用PBS磷酸鹽緩衝液(pH7.2)清洗蛋白親和層析柱直到紫外吸收值回到基線，然後用0.1M甘胺酸鹽酸(pH2.5)洗脫，收集從蛋白A親和層析柱上洗脫下來的帶hFc標籤的LAG-3蛋白(LAG-3-hFc)，用PBS磷酸鹽緩衝液(pH7.2)在4℃冰箱透析過夜。透析後的蛋白經0.22微米無菌過濾後分裝於-80℃保存，即獲得純化的免疫原人LAG-3-hFc蛋白。免疫原LAG-3-hFc蛋白在使用前需要進行一系列質控檢測，如檢測其蛋白濃度、純度、分子量和生物活性等。
其中，免疫原LAG-3-hFc與MHC II的結合活性採用FACS檢測，具體為：
將表現MHC II的Raji細胞在T-175細胞培養瓶中擴大培養至75-90%匯合度，離心棄去培養基，用PBS緩衝液洗滌細胞1-2次，進行細胞計數後將細胞用封閉液(PBS，2%胎牛血清)稀釋至1-2×10
6
細胞每毫升，冰上孵育20-30分鐘，然後用封閉液(PBS，2%胎牛血清)洗滌2次。將收集的細胞用封閉液(PBS，2%胎牛血清)懸浮至2×10
6
細胞/ml，按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中(每孔2×10
5
細胞)，離心棄去培養基，將帶hFc標籤的LAG-3蛋白梯度稀釋,然後按照每孔100微升加入Raji細胞中，冰上孵育1-2小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗，冰上孵育0.5-1.0小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2-3次，加入每孔100微升PBS懸浮細胞，用FACS(FACSVerse, BD)檢測和分析結果。
其中，免疫原LAG-3-hFc與LSECtin的結合活性採用ELISA檢測，具體為：
將帶hFc標籤的LAG-3蛋白(LAG-3-hFc，即免疫原)，用PBS稀釋至1μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育過夜。用ELISA封閉液(含1%BSA，pH7.4的PBS磷酸緩衝液，所述百分比為質量百分比)37℃封閉兩小時後，再加入梯度稀釋的LSECtin-His標籤，37℃溫育1小時。所述LSECtin-His購自R&D system，商品號2947-CL。加入抗His標籤的辣根過氧化物酶(購自GenScript商品號A00612)，室溫孵育30分鐘後加入100微升/孔TMB顯色液。室溫孵育15分鐘後，加入50微升1N鹽酸終止顯色反應，用ELISA讀板機讀取OD450nm讀數。每個步驟之後都需要洗板。
結果如圖1、圖2和表1、表2所示。
結果表明，LAG-3與MHCII在細胞水準的結合隨LAG-3-hFC的濃度變化而變化，LAG-3與LSECtin在蛋白水準的結合隨LAG-3-hFC的濃度變化而變化，其中對照蛋白為非LAG-3融合蛋白。表現的配體和受體蛋白有正確的構象，適合進行免疫、建立受體-配體結合阻斷檢測方法及進行抗體活性鑑定。
LAG-3蛋白免疫採用6-8周齡BabL/C 和SJL小鼠(上海斯萊克動物中心繁殖提供)，小鼠接收後在SPF條件下飼養。初次免疫LAG-3蛋白用福氏完全佐劑乳化後腹腔注射0.25毫升，50微克蛋白每只小鼠。加強免疫LAG-3蛋白用福氏不完全佐劑乳化後腹腔注射0.25毫升，50微克蛋白每只小鼠。初次免疫與第一次加強免疫之間隔2周，以後每次免疫間隔3周。每次加強免疫7天後采血，用ELISA和FACS檢測血清中抗體效價和特異性。
免疫原2)，人源LAG-3全長胺基酸序列克隆到pIRES載體(購自Clontech)並製備質體。對HEK293細胞系和CHOK1細胞系(均購自Invitrogen)進行質體轉染(轉染使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，購自Roche公司，貨號Cat #06 366 236 001，並按說明書操作)後，在含0.5 μg/ml嘌呤黴素的含10%(w/w)FBS的DMEM培養基中選擇性培養2周，用有限稀釋法在96孔培養板中進行亞克隆，並置於37℃，5%(v/v)CO
2
培養。大約2周後選擇部分單克隆孔擴增到6孔板中。對擴增後的克隆用已知的LAG-3抗體染色，經流式細胞分析法進行篩選。選擇長勢較好、螢光強度較高、單克隆的細胞系繼續擴大培養並液氮凍存，即獲得免疫原LAG-3重組細胞株。具體選擇結果如表3和圖3所示，表3中陽性細胞(%)指陽性細胞占總細胞數目的百分比，MFI是所測細胞群的平均螢光強度值。
結果表明，HEK293細胞有較高水準LAG-3的表現，適合用做免疫原和進行抗體結合活性鑑定。
LAG-3細胞免疫採用6-8周齡BabL/C和SJL小鼠(上海斯萊克動物中心繁殖提供)，小鼠接收後在SPF條件下飼養。人LAG-3轉染的HEK293穩定細胞系在T-75細胞培養瓶中擴大培養至75-90%匯合度，吸盡培養基，用DMEM基礎培養基洗滌1-2次，然後用無酶細胞解離液處理和收集細胞。用DMEM基礎培養基洗滌1-2次,進行細胞計數後將細胞用PBS稀釋至1-2x10
7
細胞每毫升。每只小鼠每次免疫時腹腔注射0.5毫升細胞懸液。第一次與第二次免疫之間隔2周，以後每次免疫間隔3周。每次加強免疫7天後采血，用FACS檢測血清中抗體效價和特異性。
免疫原3)，LAG-3全長胺基酸序列cDNA被克隆到pCDNA3.1載體並包被到1.0um金膠體子彈上，用Helios基因槍(Bio-rad)免疫。詳細方法根據Helios基因槍說明書進行制定。
6-8周齡BabL/C 和SJL小鼠(上海斯萊克動物中心繁殖提供)接收後在SPF條件下飼養。所有小鼠經腹部用基因槍免疫3-4次，每次3-4槍，每槍1.0微克cDNA量。初次免疫與第一次加強免疫之間隔2周，以後每次免疫間隔3周。每次加強免疫7天後采血，用ELISA檢測血清中抗體效價。通常大部分小鼠經2-3次免疫後ELISA效價可達到1:1000以上。表4和圖4為LAG-3-hFC蛋白免疫血清，用ELISA進行抗體效價檢測的結果。
結果表明：以免疫原進行免疫，大部分小鼠經3次免疫後ELISA效價可達到1:100000以上，說明小鼠對免疫原產生較好的體液免疫反應，其脾細胞可以用來進行雜交瘤細胞製備。
效價符合要求的小鼠可選擇進行細胞融合和雜交瘤製備。細胞融合前，小鼠最後一次免疫用每只50-100微克純化的LAG-3-hFc腹腔注射。3-5天後處死小鼠，收集脾細胞。用DMEM基礎培養基1000轉每分鐘離心清洗細胞3次，然後按活細胞數目5:1比率與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0混合(購自ATCC)，採用高效電融合或PEG方法(參見METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220)進行細胞融合。融合後的細胞稀釋到含20%胎牛血清、1×HAT的DMEM培養基中，所述百分比為質量百分比。然後按1×10
5
/200微升每孔加入到96孔細胞培養板中，放入5% CO
2
、37℃培養箱中，所述百分比為體積百分比。14天後用ELISA和Acumen(微孔板細胞檢測法)篩選細胞融合板上清，將ELISA中OD
450nm
＞1.0和Acumen中MFI值＞100的陽性克隆擴增到24孔板，在含10%(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培養基中，在37℃，5%(v/v)CO
2
條件下擴大培養。培養3天後取24孔板中擴大培養的培養液進行離心，收集上清液，對上清液進行抗體亞型分析。用ELISA、FACS確定對LAG-3蛋白和LAG-3陽性細胞的結合活性，配體受體結合實驗確定抗體樣品對LAG-3受體的封閉活性。
根據24孔板篩選結果，挑選ELISA實驗中OD
450nm
＞1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對LAG-3受體的封閉抑制率達到60%的雜交瘤細胞為符合條件的陽性克隆。選擇符合條件的雜交瘤細胞用有限稀釋法在96孔板進行亞克隆，在含10%(w/w)FBS的DMEM培養基中(購自Invitrogen)37℃，5%(v/v)CO
2
條件下培養。亞克隆後10天用ELISA和Acumen進行初步篩選，挑選陽性單克隆擴增到24孔板繼續培養。3天後用FACS確定抗原結合陽性並用LAG-3受體配體結合實驗評估生物活性(評估標準為ELISA實驗中OD
450nm
＞1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對MHCII配體的封閉抑制率達到60%)。
根據24孔板樣品檢測結果，陽性克隆在含10%(w/w) FBS的DMEM(購自Invitrogen)培養基中，在37℃，5%(v/v) CO
2
條件下進行擴大培養，細胞懸浮於凍存液[含有20% (w/w)FBS和10%(w/w)DMSO的DMEM]中，按常規方法液氮凍存即得本發明雜交瘤細胞，並可用於後續的抗體生產、純化和胺基酸序列測定。
實施例 2 純化抗體的鑑定
(一) 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與LAG-3表現細胞的結合
將實施例1製備免疫原2中所述含有編碼人源LAG-3全長核苷酸序列的pIRES質體轉染293F細胞株得含人LAG-3的293F穩轉細胞株(此處稱為HEK293-hLAG-3穩定細胞株)，將帶有猴源全長基因的pIRES質體，轉染HEK293細胞株構建含猴LAG-3的HEK293穩轉細胞株(此處稱為HEK293-cLAG-3穩定細胞株)。將HEK293-hLAG-3穩定細胞株和HEK293-cLAG-3穩定細胞株在T-75細胞培養瓶中擴大培養至90%匯合度，吸盡培養基，用HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 洗滌1-2次，然後用無酶細胞解離液(Versene solution: Life technology)處理和收集細胞。用HBSS緩衝液洗滌細胞1-2次,進行細胞計數後將細胞用HBSS 稀釋至1-2x10
6
細胞每毫升，加入1%山羊血清封閉液，冰上孵育20-30分鐘，然後用HBSS離心洗滌2次。將收集的細胞用FACS緩衝液(HBSS+1%BSA)懸浮至2x10
6
細胞/ml,按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中，加入待測抗體樣品每孔100微升，冰上孵育1-2小時。用FACS緩衝液離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗，冰上孵育0.5-1.0小時。用FACS緩衝液離心洗滌2-3次，加入每孔100微升固定液(4% Paraformaldehyde)懸浮細胞，5-10分鐘後用FACS緩衝液離心洗滌1-2次。用100微升FACS緩衝液懸浮細胞，用FACS(FACSCalibur, BD)檢測和分析結果。結果如表5和表6、圖5a、圖5b和圖6a、圖6b所示，待測抗體可結合細胞表面的人或猴LAG-3蛋白，各抗體活性相當，表明抗體與LAG-3結合能力較強。其中IgG對照為鼠源IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
(二) LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II的結合
將表現MHC II的Raji細胞在T-175細胞培養瓶中擴大培養至75-90%匯合度，離心棄去培養基，用PBS緩衝液洗滌細胞1-2次,進行細胞計數後將細胞用封閉液(PBS，2%胎牛血清)稀釋至1-2×10
6
細胞每毫升，按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中(每孔1×10
5
細胞)，冰上孵育20-30分鐘，將待測抗體樣品與1ug/ml的LAG-3-hFc蛋白等體積混合，並在室溫孵育30分鐘後，將孵育Raji細胞的FACS反應板離心棄掉上清，按照每孔100微升將上述的混合物加入Raji細胞中，冰上孵育1-2小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗，冰上孵育1.0小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2-3次，加入每孔100微升PBS懸浮細胞，用FACS(FACS Calibur, BD)檢測和分析結果。結果如表7和圖7a、圖7b所示，其中IgG對照為鼠源IgG，表中的資料為抑制率(%)。
結果表明，所得抗體可不同程度的抑制LAG-3蛋白與其配體MHCII的結合，所測抗體活性相當。
(三)抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與MHC II 的結合從而解除對T淋巴細胞活性的抑制，從而刺激T細胞的增殖。
1.抗原特異性T淋巴細胞的獲得，首先，使用小鼠CD4分離試劑盒,利用免疫磁珠技術和聯合抗體，從OVA轉基因小鼠的淋巴細胞樣品中陰性篩選CD4+ T細胞，分離出抗原特異性的CD4+ T淋巴細胞。將獲得的T細胞與小鼠胸腺瘤細胞系BW5147.G.1.4按5:1的比率混合，採用聚乙二醇(PEG)細胞融合方法進行細胞融合。融合後的細胞用1×HAT含次黃嘌呤、氨基蝶啶和胸苷的培養基進行選擇性培養，將獲得的單克隆擴增到24孔板擴大培養，2-3天後對單克隆進行篩選。用體外抗原提呈實驗篩選克隆，用同品系普通C57BL/6小鼠的脾細胞混合特異性抗原OVA323-339的混合物加入到單克隆細胞的培養基中，孵育單克隆細胞過夜收集上清(具體方法參見David H等，Methods Mol Biol, 2013, 960: 297-307)。酶聯免疫吸附檢測檢測上清中的小鼠白介素2(mouse IL2，mIL2)的含量，挑選細胞生長狀態良好、傳代(至少十幾代)穩定，且分泌mIL-2量高的最優單克隆進行擴大培養、液氮凍存。最終選擇T淋巴細胞雜交瘤(8B2)為最優克隆。
過表現免疫抑制因數穩定細胞株的構建，將人LAG-3的全長基因序列克隆到pIRES表現載體上，並包裝成慢病毒(上海吉瑪)。對T淋巴細胞雜交瘤細胞株8B2進行慢病毒感染，轉染後的細胞在含抗生素的培養基中選擇性培養，2周後，用有限稀釋法在96孔培養板中亞克隆。待克隆長大後，將單克隆孔細胞擴增到6孔板中或培養瓶中。對擴增後的克隆用抗LAG-3特異性抗體經流式細胞分析法進行篩選。選擇長勢較好、螢光強度較高、單克隆的細胞系繼續擴大培養並液氮凍存。最終選擇T淋巴細胞雜交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)為最優克隆。
2.抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗，將T淋巴細胞雜交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)在T-175細胞培養瓶中培養至75-90%匯合度，棄去培養基，用PBS洗滌1-2次；計數後將細胞以1-2E5個細胞50微升每孔鋪至96 孔細胞培養板，然後將兩倍於終濃度的待測抗體稀釋液加入培養板，室溫孵育30min，同時用同品系普通C57BL/6小鼠的脾細胞與特異性抗原OVA
323-339
混合室溫孵育30min，最後將其混合物50微升每孔加入到培養板，保證每個反應孔200 ul體積，將反應板於37℃5% CO2培養箱培養過夜後收集上清，低於 -20°凍存待測。
3.細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測。
細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測使用R&D system相關檢測試劑盒Mouse IL-2 DuoSet ELISA (DY402)，並按照說明書操作。除檢測抗體外的所有檢測試劑均由檢測試劑盒提供。
測定細胞上清中細胞因數白介素IL-2含量的酶聯免疫吸附檢測採用雙抗夾心ELISA試劑盒(購自R&D Systems，IL-2 Cat # DY402)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書要求，所有檢測試劑均由試劑盒提供。具體實驗簡述如下：將IL-2多克隆抗體包被於ELISA微孔板上，用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封閉液室溫封閉1-2小時。用洗板液洗板4次，將步驟2. 獲得的細胞上清液作為待測樣品，加入標準品和待測樣品室溫孵育2小時。每孔加入400微升洗液，重複洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根過氧化物酶標抗體，室溫孵育2小時，與微孔板上的IL-2形成免疫複合物，清洗微孔；加入底物顯色，避光室溫30分鐘，最終加入終止液，用酶標儀測定A450nm吸光度。
檢測LAG-3抗體在步驟2.所述抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗中對IL-2分泌的影響。結果如圖8a、圖8b)，和表8所示，其中mIgG對照為鼠IgG，表中的資料為IL-2值(pg/mL)。
結果表明，在抗原特異性T淋巴細胞刺激試驗中待測抗體可使T淋巴細胞的IL-2分泌增強，並且啟動作用呈濃度梯度依賴性，其中405B8H3活性率優於其它抗體。
(四)抗原表位預測
在人LAG-3蛋白胞外區的包含一具有以下胺基酸序列的暴露的外環(eatra loop)：GPPAAAPGHPLAPGPHP AAPSSWGPRPRRY。為了檢驗純化抗體與這一區域的結合並預測每個抗體所結合的表位，在整個這一區域內進行肽掃描實驗。
製備了包括外環序列的全長在內的15種重疊肽並將在C 端偶聯生物素。用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體與這些肽段的結合，鏈黴親和素(sigma, Cat#M5432)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/ml，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2次，加入封閉液(PBS+0.01% Tween20+1%BSA)室溫封閉1-2小時。倒掉封閉液，加入生物素化的肽段，終濃度1ug/ml，以每孔100ul加到96孔ELISA板，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01% Tween20)洗板2-3次。然後將待測抗體樣品100µl每孔，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育15-30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl)100µl每孔。用ELISA讀板機(TiterMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值。肽掃描實驗的結果總結如下表9所示。
基於上述表9的結果，可確定553G8G8和556F6B8不識別該外環序列，405B8H3、409B11E12和409D4E10識別在包括胺基酸序列SSWGPRPR的外環內的一區域，105F1E10識別包括胺基酸序列APSSWGPR的外環內的一區域。
結果表明：本發明抗體與BMS的LAG-3抗體BMS986016結合的表位不一致，本發明抗體不會對BMS的專利CN102176921A所保護的抗原表位HPAAPSSW造成侵權。
實施例 3 輕重鏈可變區胺基酸序列測定
總RNA分離：亞克隆培養的上清檢驗過抗原結合後，通過離心搜集1-5×10
7
雜交瘤細胞。加入1mL Trizol混勻並轉移到1.5ml離心管中，室溫靜置5min；加0.2ml氯仿，振盪15s，靜置2min後於4℃離心，12000g×5min，取上清轉移到新的1.5ml離心管中；加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min後於4℃離心，12000g×15min，棄上清；加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉澱。4℃，12000g×5min，棄上清並晾乾，加入適量的DEPC H
2
O溶解(55℃水浴促溶10min)。
逆轉錄與PCR：取1μg tRNA，配置20ul體系，加入逆轉錄酶後於42℃反應60min，於70℃反應10min終止反應。配置50μl PCR體系，包括1μl cDNA、每種引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的緩衝體系、250μmol dNTPs；設置PCR程式，預變性95℃ 3min，變性95℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 35s，35個迴圈後再額外於72℃延伸5min。注：延伸溫度可根據實際情況有所調整。
克隆與測序：取5μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測陽性樣品使用柱回收試劑盒純化；進行連接反應：樣品50ng，T載體50ng，連接酶0.5μl，緩衝液1μl，反應體系10μl，於16℃反應半小時；取5μl連接產物加入100μl的感受態細胞中，冰浴5min，而後於42℃水浴熱激1min，放回冰上1min後加入650μl無抗生素SOC培養基，於37℃搖床上以200RPM的速度復蘇30min，取出200μl塗布於含抗生素的LB固體培養基上於37℃孵箱過夜培養；次日，使用T載體上引物M13F和M13R配置30μl PCR體系，進行菌落PCR，用移液器槍頭蘸取菌落於PCR反應體系中吹吸，並吸出0.5μl點於另一塊含抗生素的LB固體培養皿上以保存菌株；PCR反應結束後，取出5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品進行測序。其中，測序的步驟參見Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。
測序結果：本發明抗體產品的重鏈可變區蛋白和基因(DNA)序列、輕鏈可變區蛋白和基因序列如下：
抗體105F1E10見圖9a、圖9b；抗體405B8H3見圖10a、圖10b；抗體556F6B8見圖11a、圖11b；抗體409B11E12見圖12a、圖12b；抗體409D4E10見圖13a、圖13b；抗體553G8G8見圖14a、圖14b。
實施例 4 鼠 - 人嵌合抗體構建、以及抗體的生產和純化
質體構建與準備：將雜交瘤抗體重鏈可變區序列克隆到包含信號肽和人源重鏈抗體IgG4恆定區的pCP表現載體當中，將輕鏈可變區重組到包含信號肽和人源抗體輕鏈kappa(lambda)恆定區的表現pCP載體當中，並經測序驗證。使用鹼裂解法試劑盒中量抽提高純度質體，經0.22μm濾膜過濾，供轉染使用。
細胞轉染：使用Freestyle 293F細胞，培養基為Freestyle 293表現培養基(Freestyle 293 expression medium)，使用時添加10% F68指終濃度0.1%。轉染時將細胞密度培養至每毫升1-1.5×10
6
細胞；搖床設置為37℃，130RPM，8% CO
2
濃度。取5毫升培養基和PEI混勻(200μg/ml)，取5毫升培養基和一定量質體混勻(質體用量為100μg/ml)，5min後合併混勻，靜置15分鐘；緩緩加到細胞中，邊加邊振盪，避免PEI過度集中，放入搖床培養；第二天加入蛋白腖(sigma)至終濃度為0.5%；第5~7天，測培養液抗體效價，第6~7天，離心(3500RPM，30min)、過濾收集上清以供純化。
抗體純化：對於連續生產的無內毒素的層析柱和Protein A填料，使用0.1M NaOH處理30min或者5個柱體積0.5M NaOH沖洗；對於長期未使用的柱料和層析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用無內毒的水沖洗至中性，用10倍柱體積的1%Triton X100對柱料清洗。使用5個柱體積的PBS進行平衡，將過濾好的細胞上清上柱，必要時收集流穿液。上柱完成後，使用5倍柱體積PBS清洗。用5倍柱體積的0.1M pH3.0的Glycine-HCl進行洗脫，收集洗脫液，並用1/10體積的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收穫抗體後，在1×PBS中透析過夜，避免內毒素污染。透析結束後，使用分光光度或試劑盒測定濃度，使用HPLC-SEC測定抗體純度，使用內毒素檢測試劑盒檢測抗體內毒素含量。
實施例 5 鼠 - 人嵌合抗體的鑑定
(一) 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體與LAG-3蛋白的結合
將實施例1製備免疫原1中所述的人源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列23-450(如序列表SEQ ID No.61所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的人LAG-3蛋白(此處稱為hLAG-3-hFc蛋白)；將猴源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列18-449(如序列表SEQ ID No.62所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的猴LAG-3蛋白(此處稱為cLAG-3-hFc蛋白)；將鼠源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列24-442(如序列表SEQ ID No.63所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的鼠LAG-3蛋白(此處稱為mLAG-3-hFc蛋白)。純化的人、猴、鼠LAG-3胞外區蛋白(hLAG-3-hFc、cLAG-3-hFc、mLAG-3-hFc)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/ml，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2次，加入封閉液(PBS+0.01% Tween20+1%BSA)室溫封閉1-2小時。倒掉封閉液，加入待測抗體樣品50-100µl每孔，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育15-30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl)100µl每孔。用ELISA讀板機(TiterMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值。結果如圖15，圖16和圖17，表10，表11和表12所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體可結合人和猴LAG-3胞外區蛋白，且各抗體活性接近；不能結合鼠LAG-3蛋白。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為A450nm數值。
(二)流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與LAG-3表現細胞的結合
實驗方法見實施例2(一)，對所獲鼠-人嵌合LAG-3抗體與細胞表現LAG-3的結合活性進行鑑定,結果如圖18和圖19，表13和表14所示。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體可結合細胞表面的人和猴LAG-3蛋白。並且本發明抗體結合細胞表面的猴LAG-3蛋白能力強於對照抗體(BMS986016)。
實驗中猴LAG-3的序列是從中國猴的組織樣品中得到的。本發明抗體與猴抗原具有交叉結合反應，將來可進行靈長類動物的體內實驗，用於進行臨床前毒理學研究和臨床前藥代動力學研究。
(三)：LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II 和LSECtin的結合
(1)LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II 的結合
實驗方法見實施例2(二)，對所獲鼠-人嵌合LAG-3抗體進行阻斷活性鑑定，檢測結果分別如圖20和表15所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體能夠不同程度地阻斷LAG-3與配體MHCII的結合。
(2)LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體LSECtin的結合
LAG-3胞外區蛋白(LAG-3-hFc)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/mL，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封閉液[含0.01%(v/v)Tween20和1%(w/w)BSA的PBS]室溫封閉2小時。倒掉封閉液，先加入實施例2所得的純化的LAG-3抗體待測樣品50µl每孔，後加入LSECtin蛋白(LSECtin-His)，每孔50微升，混勻後37℃孵育。2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入抗His標籤的HRP(辣根過氧化物酶)稀釋液(購自GenScript)每孔100微升，37℃孵育2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl) 100µl每孔。用ELISA讀板機(SpectraMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值。檢測結果分別如圖21和表16所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體能夠不同程度地阻斷LAG-3與配體LSECtin的結合。
(四)：抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，結果見表17和圖22，其中IgG對照為人IgG(hIgG)，表中的資料為鼠IL-2濃度。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體在抗原特異性T淋巴細胞刺激試驗中能夠刺激IL-2分泌，並且該活性具有濃度梯度依賴效應，表明LAG-3抗體能夠逆轉LAG-3對T細胞啟動的抑制作用，從所測結果可以看出，本發明所得抗體活性水準相當。
(五)淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3蛋白與其受體MHC II的結合從而解除其對T淋巴細胞活性的抑制，從而刺激T細胞的增殖。
1. Ficoll分離全血獲取外周血單核淋巴細胞PBMC
將新鮮獲取的全血用磷酸緩衝液PBS以1:1的體積比例稀釋得稀釋後的全血，用無菌吸管輕輕將稀釋後的全血鋪平在Ficoll液面(購自GE Healthcare)，Ficoll與稀釋後的全血的體積比為3:4，避免震盪混勻，以400g轉速室溫20℃梯度離心30分鐘，離心後的離心管分為三層，上層為血漿，中間乳白色分層即為單核淋巴細胞。用無菌吸管輕輕吸取中間層細胞，收集至新的離心管，用PBS磷酸緩衝液稀釋至三倍體積，100g轉速室溫離心10分鐘，棄上清。將淋巴細胞用PBS磷酸緩衝液重懸至10mL，重複前面步驟取出血小板。最後將淋巴細胞重懸至10mL含有10%胎牛血清的多組份RPMI1640培養基(購自Invitrogen)備用，即為外周血單核淋巴細胞PBMC，所述百分比為質量百分比。
2. SEB依賴的PBMC刺激實驗
試驗前，配製等體積比稀釋的待測的鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體，得待測樣品溶液。
將獲得的外周血單核淋巴細胞PBMC以1×10
5
個細胞100微升每孔鋪至96孔細胞培養板，然後將所述的待測樣品溶液加入培養板，室溫培養30分鐘。最後加入超抗原SEB，每反應孔中含有50微升400ng/ml SEB，保證每個反應孔200 μL體積，將反應板於37℃、5%CO
2
培養箱培養72小時後收集上清，得細胞上清液，於-20℃凍存，所述百分比為體積百分比。
3. 細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測
細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測使用R&D system相關檢測試劑盒human IL-2 DuoSet ELISA (DY202)，並按照說明書操作。除檢測抗體外的所有檢測試劑均由檢測試劑盒提供。
測定細胞上清中細胞因數白介素IL-2含量的酶聯免疫吸附檢測採用雙抗夾心ELISA試劑盒(購自R&D Systems，IL-2 Cat # DY202)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書要求，所有檢測試劑均由試劑盒提供。具體實驗簡述如下：將IL-2多克隆抗體包被於ELISA微孔板上，用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封閉液室溫封閉1-2小時。用洗板液洗板4次，將步驟2. 獲得的細胞上清液作為待測樣品，加入標準品和待測樣品室溫孵育2小時。每孔加入400微升洗液，重複洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根過氧化物酶標抗體，室溫孵育2小時，與微孔板上的IL-2形成免疫複合物，清洗微孔；加入底物顯色，避光室溫30分鐘，最終加入終止液，用酶標儀測定A450nm吸光度。
檢測LAG-3抗體在步驟2.所述SEB依賴的PBMC刺激實驗中對IL-2分泌的影響。結果如圖23，和表18所示。
結果表明，在SEB依賴的PBMC淋巴細胞刺激試驗中，本發明所得抗體可使PBMC的IL-2分泌增強，並且該活性具有濃度梯度依賴效應，表明LAG-3抗體能夠逆轉LAG-3對T細胞啟動的抑制作用，從所測結果可以看出，本發明所得抗體活性水準相當。其中hIgG對照為人IgG，表中的資料為IL-2值(pg/mL)。
(六)抗體親和力檢測試驗
首先，準備用氨基偶聯方法將anti-human Fc IgG固定在CM5晶片表面至6000-10000 RU，FC1作為參比通道。偶聯過程如下：用新鮮配置的1:1的50 mM NHS和200 mM EDC的混合物活化7分鐘，然後注入10-50 ug/ml稀釋在10mM醋酸納ph5.0緩衝液中的anti-human Fc IgG。剩餘的活化位點用1M乙醇胺封閉。然後，用HBS-EP+緩衝液將待測抗體稀釋至5ug/ml(可根據捕獲水準適當調整)，以10ul/min的流速捕獲到晶片上，得到大約100~300RU的回應值。接著將抗原蛋白稀釋至100nM(最高濃度暫定100nM)，以30ul/min的流速流經晶片表面。若得到足夠的信號值，然後將抗原蛋白倍比稀釋幾個濃度梯度，分別流經晶片表面。在每個迴圈結束後，晶片表面用10mM，PH 1.5的Glycine 進行再生。動力學速率常數需減去空白對照，用global fit分析方法1:1結合模型進行資料擬合。解離平衡速率常數(KD)用以下公式計算：KD=kd/ka。結果見表19。
結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，且與工具抗體相當，表明這些抗體對人LAG-3 ECD均有較好的親和力，其中，405B8H3抗體對人LAG-3 ECD的親和力最好。
實施例 6 人源化抗體的製備、鑑定和熱點突變
(一)人源化抗體的製備
將克隆405B8H3和556F6B8的重鏈，輕鏈可變區作為人源化範本。
通過序列比對(NCBI-Igblast)選擇與候選抗體405B8H3重鏈可變區，輕鏈可變區同源性最高的胚系基因序列作為可變區移植骨架：IGHV1-46*01和IGKV1-16*01。在選定人抗體骨架後，通過同源建模，預測在鼠抗恆定區中可能決定結構的關鍵胺基酸，對嫁接的骨架區進行回復突變設計。
根據以上原則，分別設計4個重鏈可變區序列(405B8H3 VH_g0，405B8H3 VH_g1，405B8H3 VH_g2，405B8H3 VH_g3)(見表20)和3個輕鏈可變區序列(405B8H3 VL_g0，405B8H3 VL_g1，405B8H3 VL_g2)(見表21)，隨後做交叉組合進行表現，共12種表現組合，見表22。
通過序列比對(NCBI-Igblast)選擇與候選抗體556F6B8重鏈可變區，輕鏈可變區同源性最高的胚系基因序列作為可變區移植骨架：IGHV4-59*01和IGKV1-9*01。在選定人抗體骨架後，通過同源建模，預測在鼠抗恆定區中可能決定結構的關鍵胺基酸,對嫁接的骨架區進行回復突變設計。
根據以上原則，分別設計4個重鏈可變區序列(556F6B8 VH_g0，556F6B8 VH_g1，556F6B8 VH_g2，556F6B8 VH_g3)(見表23)和3個輕鏈可變區序列(556F6B8 VL_g0，556F6B8 VL_g1，556F6B8 VL_g2)(見表24)，隨後做交叉組合進行表現，共12種表現組合，見表25。
載體構建：實驗方法見實施例4，將重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列克隆到包含信號肽和人源抗體IgG4恆定區的pCP表現載體當中，並經測序驗證。
人源化抗體的製備：
細胞轉染：實驗方法見實施例4，使用Freestyle 293F細胞，將構建的質體轉染到細胞中，培養6-7天，過濾收集上清以供純化。
抗體純化：實驗方法見實施例4，用無內毒素的Protein A層析柱純化細胞培養上清液，收穫抗體。然後在1×PBS中透析過夜，避免內毒素污染。
將所得抗體進行蛋白濃度、純度檢測分析。所有抗體的產量，純度分析均表現正常。
(二)人源化抗體的鑑定
A ．流式細胞實驗 (FACS) 檢測抗體與 LAG-3 表現細胞的結合，方法同實施例 5 。
結果如表26和圖24以及表27和圖25所示，所得抗體均可結合細胞表面的人LAG-3。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
B．LAG-3抗體親和常數的測定，方法同實施例5。
對人源化改造後抗體的親和力進行評估，結果見表28。結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，人源化改造後抗體與對應的鼠-人嵌合抗體的親和力相當。
(三)人源化抗體的熱點突變
對抗體405B8H3-1熱點進行點突變。405B8H3-1抗體有1個可突變位點，輕鏈的第56位天冬醯胺D突變成谷胺酸E。
熱點突變抗體的載體構建和製備，方法同實施例6中人源化抗體的載體構建和製備。將所得的熱點突變抗體進行蛋白濃度、純度檢測分析。所有抗體的產量，純度分析均表現正常。
熱點突變抗體的活性鑑定
A. 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與LAG-3表現細胞的結合
方法同實施例5。結果如表29和圖26，熱點突變抗體和嵌合抗體均可結合細胞表面的人LAG-3。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
B. LAG-3受體配體結合實驗檢測抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II的結合
實驗方法見實施例2(二)，檢測結果分別如表30和圖27所示。結果表明：熱點突變後抗體和鼠-人嵌合抗體均能夠阻斷LAG-3與配體MHCII的結合，且活性相當。
C. 抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，結果見表31和圖28，其中IgG對照為人IgG(hIgG)，表中的資料為鼠IL-2濃度。
結果表明：熱點突變的人源化抗體與對應的鼠-人嵌合抗體均在抗原特異性T淋巴細胞刺激試驗中能夠刺激IL-2分泌，且具有濃度梯度依賴效應，活性相當。
D. LAG-3抗體親和常數的測定
方法同實施例5。對熱點突變抗體的親和力進行評估，結果見表32。
結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，熱點突變的人源化抗體405B8H3-1(D→E)與對應的鼠-人嵌合抗體405B8H3的親和力提高1.5倍(3.11/2.03=1.5)，而同時將人源化抗體556F6B8-3進行熱點突變(重鏈的第100位天冬醯胺D突變成谷胺酸E)，與對應的鼠-人嵌合抗體405B8H3相比，親和力降低，降低為原來的1/12.5 (33.5/2.68=12.5)。
討論
目前百時美施貴寶公司的LAG-3抗體BMS986016的臨床研究主要用於惡性實體瘤的治療，而且也主要集中於它和其他療法或靶點藥物的聯合使用，開發適應症廣的抗體從而擴大其適用的臨床症狀，包括不可切除的轉移性黑色素瘤、晚期實體癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌、復發性膠質母細胞瘤、頭頸癌、膀胱癌、轉移性直結腸癌、胃腸道間質腫瘤、腺泡細胞癌、高級惡性固體腫瘤、非小細胞肺癌等。
抗體本身的活性受可變區序列和恆定區結構的影響。抗體的可變區序列決定了識別抗原的決定簇、結合親和力及在體內代謝速率，都會影響其體內活性，甚至不同病患個人的臨床效果。
本領域亟待開發產量更高的LAG-3抗體以降低患者的治療成本，惠及更多患者。目前腫瘤免疫治療價格昂貴，急需發明並且生產新的抗體以降低成本。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附請求項書所限定的範圍。
本發明的序列資訊：
LAG-3
抗體的重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列和編碼所述重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的核苷酸序列，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'、CDR3'分別用底線標示出來：
405B8H3-2-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.76
405B8H3-2-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.77
405B8H3-6-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.66
405B8H3-6-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.67
405B8H3-7-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.78
405B8H3-7-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.79
405B8H3-1(D→E)-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.64
405B8H3-1(D→E)-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.65
556F6B8-7-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.72
556F6B8-7-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.73
556F6B8-3(D→E)-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.80
556F6B8-3(D→E)-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.81
其中VH為重鏈可變區，VL為輕鏈可變區。VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3分別為重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分別為輕鏈可變區CDR1'、CDR2'、CDR3'。
人LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.61
猴LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.62
鼠LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.63
結果表明，HEK293細胞有較高水準LAG-3的表現，適合用做免疫原和進行抗體結合活性鑑定。
LAG-3細胞免疫採用6-8周齡BabL/C和SJL小鼠(上海斯萊克動物中心繁殖提供)，小鼠接收後在SPF條件下飼養。人LAG-3轉染的HEK293穩定細胞系在T-75細胞培養瓶中擴大培養至75-90%匯合度，吸盡培養基，用DMEM基礎培養基洗滌1-2次，然後用無酶細胞解離液處理和收集細胞。用DMEM基礎培養基洗滌1-2次,進行細胞計數後將細胞用PBS稀釋至1-2x107
細胞每毫升。每只小鼠每次免疫時腹腔注射0.5毫升細胞懸液。第一次與第二次免疫之間隔2周，以後每次免疫間隔3周。每次加強免疫7天後采血，用FACS檢測血清中抗體效價和特異性。
免疫原3)，LAG-3全長胺基酸序列cDNA被克隆到pCDNA3.1載體並包被到1.0um金膠體子彈上，用Helios基因槍(Bio-rad)免疫。詳細方法根據Helios基因槍說明書進行制定。
6-8周齡BabL/C 和SJL小鼠(上海斯萊克動物中心繁殖提供)接收後在SPF條件下飼養。所有小鼠經腹部用基因槍免疫3-4次，每次3-4槍，每槍1.0微克cDNA量。初次免疫與第一次加強免疫之間隔2周，以後每次免疫間隔3周。每次加強免疫7天後采血，用ELISA檢測血清中抗體效價。通常大部分小鼠經2-3次免疫後ELISA效價可達到1:1000以上。表4和圖4為LAG-3-hFC蛋白免疫血清，用ELISA進行抗體效價檢測的結果。
結果表明：以免疫原進行免疫，大部分小鼠經3次免疫後ELISA效價可達到1:100000以上，說明小鼠對免疫原產生較好的體液免疫反應，其脾細胞可以用來進行雜交瘤細胞製備。
效價符合要求的小鼠可選擇進行細胞融合和雜交瘤製備。細胞融合前，小鼠最後一次免疫用每只50-100微克純化的LAG-3-hFc腹腔注射。3-5天後處死小鼠，收集脾細胞。用DMEM基礎培養基1000轉每分鐘離心清洗細胞3次，然後按活細胞數目5:1比率與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0混合(購自ATCC)，採用高效電融合或PEG方法(參見METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220)進行細胞融合。融合後的細胞稀釋到含20%胎牛血清、1×HAT的DMEM培養基中，所述百分比為質量百分比。然後按1×105
/200微升每孔加入到96孔細胞培養板中，放入5% CO2
、37℃培養箱中，所述百分比為體積百分比。14天後用ELISA和Acumen(微孔板細胞檢測法)篩選細胞融合板上清，將ELISA中OD450nm
＞1.0和Acumen中MFI值＞100的陽性克隆擴增到24孔板，在含10%(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培養基中，在37℃，5%(v/v)CO2
條件下擴大培養。培養3天後取24孔板中擴大培養的培養液進行離心，收集上清液，對上清液進行抗體亞型分析。用ELISA、FACS確定對LAG-3蛋白和LAG-3陽性細胞的結合活性，配體受體結合實驗確定抗體樣品對LAG-3受體的封閉活性。
根據24孔板篩選結果，挑選ELISA實驗中OD450nm
＞1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對LAG-3受體的封閉抑制率達到60%的雜交瘤細胞為符合條件的陽性克隆。選擇符合條件的雜交瘤細胞用有限稀釋法在96孔板進行亞克隆，在含10%(w/w)FBS的DMEM培養基中(購自Invitrogen)37℃，5%(v/v)CO2
條件下培養。亞克隆後10天用ELISA和Acumen進行初步篩選，挑選陽性單克隆擴增到24孔板繼續培養。3天後用FACS確定抗原結合陽性並用LAG-3受體配體結合實驗評估生物活性(評估標準為ELISA實驗中OD450nm
＞1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對MHCII配體的封閉抑制率達到60%)。
根據24孔板樣品檢測結果，陽性克隆在含10%(w/w) FBS的DMEM(購自Invitrogen)培養基中，在37℃，5%(v/v) CO2
條件下進行擴大培養，細胞懸浮於凍存液[含有20% (w/w)FBS和10%(w/w)DMSO的DMEM]中，按常規方法液氮凍存即得本發明雜交瘤細胞，並可用於後續的抗體生產、純化和胺基酸序列測定。實施例 2 純化抗體的鑑定
(一) 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與LAG-3表現細胞的結合
將實施例1製備免疫原2中所述含有編碼人源LAG-3全長核苷酸序列的pIRES質體轉染293F細胞株得含人LAG-3的293F穩轉細胞株(此處稱為HEK293-hLAG-3穩定細胞株)，將帶有猴源全長基因的pIRES質體，轉染HEK293細胞株構建含猴LAG-3的HEK293穩轉細胞株(此處稱為HEK293-cLAG-3穩定細胞株)。將HEK293-hLAG-3穩定細胞株和HEK293-cLAG-3穩定細胞株在T-75細胞培養瓶中擴大培養至90%匯合度，吸盡培養基，用HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 洗滌1-2次，然後用無酶細胞解離液(Versene solution: Life technology)處理和收集細胞。用HBSS緩衝液洗滌細胞1-2次,進行細胞計數後將細胞用HBSS 稀釋至1-2x106
細胞每毫升，加入1%山羊血清封閉液，冰上孵育20-30分鐘，然後用HBSS離心洗滌2次。將收集的細胞用FACS緩衝液(HBSS+1%BSA)懸浮至2x106
細胞/ml,按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中，加入待測抗體樣品每孔100微升，冰上孵育1-2小時。用FACS緩衝液離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗，冰上孵育0.5-1.0小時。用FACS緩衝液離心洗滌2-3次，加入每孔100微升固定液(4% Paraformaldehyde)懸浮細胞，5-10分鐘後用FACS緩衝液離心洗滌1-2次。用100微升FACS緩衝液懸浮細胞，用FACS(FACSCalibur, BD)檢測和分析結果。結果如表5和表6、圖5a、圖5b和圖6a、圖6b所示，待測抗體可結合細胞表面的人或猴LAG-3蛋白，各抗體活性相當，表明抗體與LAG-3結合能力較強。其中IgG對照為鼠源IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
(二) LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II的結合
將表現MHC II的Raji細胞在T-175細胞培養瓶中擴大培養至75-90%匯合度，離心棄去培養基，用PBS緩衝液洗滌細胞1-2次,進行細胞計數後將細胞用封閉液(PBS，2%胎牛血清)稀釋至1-2×106
細胞每毫升，按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中(每孔1×105
細胞)，冰上孵育20-30分鐘，將待測抗體樣品與1ug/ml的LAG-3-hFc蛋白等體積混合，並在室溫孵育30分鐘後，將孵育Raji細胞的FACS反應板離心棄掉上清，按照每孔100微升將上述的混合物加入Raji細胞中，冰上孵育1-2小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗，冰上孵育1.0小時。用封閉液(PBS，2%胎牛血清)離心洗滌2-3次，加入每孔100微升PBS懸浮細胞，用FACS(FACS Calibur, BD)檢測和分析結果。結果如表7和圖7a、圖7b所示，其中IgG對照為鼠源IgG，表中的資料為抑制率(%)。
基於上述表9的結果，可確定553G8G8和556F6B8不識別該外環序列，405B8H3、409B11E12和409D4E10識別在包括胺基酸序列SSWGPRPR的外環內的一區域，105F1E10識別包括胺基酸序列APSSWGPR的外環內的一區域。
結果表明：本發明抗體與BMS的LAG-3抗體BMS986016結合的表位不一致，本發明抗體不會對BMS的專利CN102176921A所保護的抗原表位HPAAPSSW造成侵權。實施例 3 輕重鏈可變區胺基酸序列測定
總RNA分離：亞克隆培養的上清檢驗過抗原結合後，通過離心搜集1-5×107
雜交瘤細胞。加入1mL Trizol混勻並轉移到1.5ml離心管中，室溫靜置5min；加0.2ml氯仿，振盪15s，靜置2min後於4℃離心，12000g×5min，取上清轉移到新的1.5ml離心管中；加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min後於4℃離心，12000g×15min，棄上清；加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉澱。4℃，12000g×5min，棄上清並晾乾，加入適量的DEPC H2
O溶解(55℃水浴促溶10min)。
逆轉錄與PCR：取1μg tRNA，配置20ul體系，加入逆轉錄酶後於42℃反應60min，於70℃反應10min終止反應。配置50μl PCR體系，包括1μl cDNA、每種引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的緩衝體系、250μmol dNTPs；設置PCR程式，預變性95℃ 3min，變性95℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 35s，35個迴圈後再額外於72℃延伸5min。注：延伸溫度可根據實際情況有所調整。
克隆與測序：取5μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測陽性樣品使用柱回收試劑盒純化；進行連接反應：樣品50ng，T載體50ng，連接酶0.5μl，緩衝液1μl，反應體系10μl，於16℃反應半小時；取5μl連接產物加入100μl的感受態細胞中，冰浴5min，而後於42℃水浴熱激1min，放回冰上1min後加入650μl無抗生素SOC培養基，於37℃搖床上以200RPM的速度復蘇30min，取出200μl塗布於含抗生素的LB固體培養基上於37℃孵箱過夜培養；次日，使用T載體上引物M13F和M13R配置30μl PCR體系，進行菌落PCR，用移液器槍頭蘸取菌落於PCR反應體系中吹吸，並吸出0.5μl點於另一塊含抗生素的LB固體培養皿上以保存菌株；PCR反應結束後，取出5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品進行測序。其中，測序的步驟參見Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。
測序結果：本發明抗體產品的重鏈可變區蛋白和基因(DNA)序列、輕鏈可變區蛋白和基因序列如下：
抗體105F1E10見圖9a、圖9b；抗體405B8H3見圖10a、圖10b；抗體556F6B8見圖11a、圖11b；抗體409B11E12見圖12a、圖12b；抗體409D4E10見圖13a、圖13b；抗體553G8G8見圖14a、圖14b。實施例 4 鼠 - 人嵌合抗體構建、以及抗體的生產和純化
質體構建與準備：將雜交瘤抗體重鏈可變區序列克隆到包含信號肽和人源重鏈抗體IgG4恆定區的pCP表現載體當中，將輕鏈可變區重組到包含信號肽和人源抗體輕鏈kappa(lambda)恆定區的表現pCP載體當中，並經測序驗證。使用鹼裂解法試劑盒中量抽提高純度質體，經0.22μm濾膜過濾，供轉染使用。
細胞轉染：使用Freestyle 293F細胞，培養基為Freestyle 293表現培養基(Freestyle 293 expression medium)，使用時添加10% F68指終濃度0.1%。轉染時將細胞密度培養至每毫升1-1.5×106
細胞；搖床設置為37℃，130RPM，8% CO2
濃度。取5毫升培養基和PEI混勻(200μg/ml)，取5毫升培養基和一定量質體混勻(質體用量為100μg/ml)，5min後合併混勻，靜置15分鐘；緩緩加到細胞中，邊加邊振盪，避免PEI過度集中，放入搖床培養；第二天加入蛋白腖(sigma)至終濃度為0.5%；第5~7天，測培養液抗體效價，第6~7天，離心(3500RPM，30min)、過濾收集上清以供純化。
抗體純化：對於連續生產的無內毒素的層析柱和Protein A填料，使用0.1M NaOH處理30min或者5個柱體積0.5M NaOH沖洗；對於長期未使用的柱料和層析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用無內毒的水沖洗至中性，用10倍柱體積的1%Triton X100對柱料清洗。使用5個柱體積的PBS進行平衡，將過濾好的細胞上清上柱，必要時收集流穿液。上柱完成後，使用5倍柱體積PBS清洗。用5倍柱體積的0.1M pH3.0的Glycine-HCl進行洗脫，收集洗脫液，並用1/10體積的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收穫抗體後，在1×PBS中透析過夜，避免內毒素污染。透析結束後，使用分光光度或試劑盒測定濃度，使用HPLC-SEC測定抗體純度，使用內毒素檢測試劑盒檢測抗體內毒素含量。實施例 5 鼠 - 人嵌合抗體的鑑定
(一) 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測抗體與LAG-3蛋白的結合
將實施例1製備免疫原1中所述的人源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列23-450(如序列表SEQ ID No.61所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的人LAG-3蛋白(此處稱為hLAG-3-hFc蛋白)；將猴源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列18-449(如序列表SEQ ID No.62所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的猴LAG-3蛋白(此處稱為cLAG-3-hFc蛋白)；將鼠源LAG-3蛋白胞外區胺基酸序列24-442(如序列表SEQ ID No.63所示)克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體，轉染HEK293細胞，收集細胞培養液，純化得到帶hFc標籤的鼠LAG-3蛋白(此處稱為mLAG-3-hFc蛋白)。純化的人、猴、鼠LAG-3胞外區蛋白(hLAG-3-hFc、cLAG-3-hFc、mLAG-3-hFc)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/ml，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2次，加入封閉液(PBS+0.01% Tween20+1%BSA)室溫封閉1-2小時。倒掉封閉液，加入待測抗體樣品50-100µl每孔，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗，37℃孵育1-2小時後，用洗板液(PBS+0.01%Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育15-30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl)100µl每孔。用ELISA讀板機(TiterMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值。結果如圖15，圖16和圖17，表10，表11和表12所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體可結合細胞表面的人和猴LAG-3蛋白。並且本發明抗體結合細胞表面的猴LAG-3蛋白能力強於對照抗體(BMS986016)。
實驗中猴LAG-3的序列是從中國猴的組織樣品中得到的。本發明抗體與猴抗原具有交叉結合反應，將來可進行靈長類動物的體內實驗，用於進行臨床前毒理學研究和臨床前藥代動力學研究。
(三)：LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II 和LSECtin的結合
(1)LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II 的結合
實驗方法見實施例2(二)，對所獲鼠-人嵌合LAG-3抗體進行阻斷活性鑑定，檢測結果分別如圖20和表15所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體能夠不同程度地阻斷LAG-3與配體MHCII的結合。
(2)LAG-3受體配體結合實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3與其配體LSECtin的結合
LAG-3胞外區蛋白(LAG-3-hFc)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/mL，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封閉液[含0.01%(v/v)Tween20和1%(w/w)BSA的PBS]室溫封閉2小時。倒掉封閉液，先加入實施例2所得的純化的LAG-3抗體待測樣品50µl每孔，後加入LSECtin蛋白(LSECtin-His)，每孔50微升，混勻後37℃孵育。2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入抗His標籤的HRP(辣根過氧化物酶)稀釋液(購自GenScript)每孔100微升，37℃孵育2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl) 100µl每孔。用ELISA讀板機(SpectraMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值。檢測結果分別如圖21和表16所示。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體能夠不同程度地阻斷LAG-3與配體LSECtin的結合。
(四)：抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，結果見表17和圖22，其中IgG對照為人IgG(hIgG)，表中的資料為鼠IL-2濃度。
結果表明：本發明所得鼠-人嵌合抗體在抗原特異性T淋巴細胞刺激試驗中能夠刺激IL-2分泌，並且該活性具有濃度梯度依賴效應，表明LAG-3抗體能夠逆轉LAG-3對T細胞啟動的抑制作用，從所測結果可以看出，本發明所得抗體活性水準相當。
(五)淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體阻斷LAG-3蛋白與其受體MHC II的結合從而解除其對T淋巴細胞活性的抑制，從而刺激T細胞的增殖。
1. Ficoll分離全血獲取外周血單核淋巴細胞PBMC
將新鮮獲取的全血用磷酸緩衝液PBS以1:1的體積比例稀釋得稀釋後的全血，用無菌吸管輕輕將稀釋後的全血鋪平在Ficoll液面(購自GE Healthcare)，Ficoll與稀釋後的全血的體積比為3:4，避免震盪混勻，以400g轉速室溫20℃梯度離心30分鐘，離心後的離心管分為三層，上層為血漿，中間乳白色分層即為單核淋巴細胞。用無菌吸管輕輕吸取中間層細胞，收集至新的離心管，用PBS磷酸緩衝液稀釋至三倍體積，100g轉速室溫離心10分鐘，棄上清。將淋巴細胞用PBS磷酸緩衝液重懸至10mL，重複前面步驟取出血小板。最後將淋巴細胞重懸至10mL含有10%胎牛血清的多組份RPMI1640培養基(購自Invitrogen)備用，即為外周血單核淋巴細胞PBMC，所述百分比為質量百分比。
2. SEB依賴的PBMC刺激實驗
試驗前，配製等體積比稀釋的待測的鼠-人嵌合抗體LAG-3抗體，得待測樣品溶液。
將獲得的外周血單核淋巴細胞PBMC以1×105
個細胞100微升每孔鋪至96孔細胞培養板，然後將所述的待測樣品溶液加入培養板，室溫培養30分鐘。最後加入超抗原SEB，每反應孔中含有50微升400ng/ml SEB，保證每個反應孔200 μL體積，將反應板於37℃、5%CO2
培養箱培養72小時後收集上清，得細胞上清液，於-20℃凍存，所述百分比為體積百分比。
3. 細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測
細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測使用R&D system相關檢測試劑盒human IL-2 DuoSet ELISA (DY202)，並按照說明書操作。除檢測抗體外的所有檢測試劑均由檢測試劑盒提供。
測定細胞上清中細胞因數白介素IL-2含量的酶聯免疫吸附檢測採用雙抗夾心ELISA試劑盒(購自R&D Systems，IL-2 Cat # DY202)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書要求，所有檢測試劑均由試劑盒提供。具體實驗簡述如下：將IL-2多克隆抗體包被於ELISA微孔板上，用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液洗板4次，加入封閉液室溫封閉1-2小時。用洗板液洗板4次，將步驟2. 獲得的細胞上清液作為待測樣品，加入標準品和待測樣品室溫孵育2小時。每孔加入400微升洗液，重複洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根過氧化物酶標抗體，室溫孵育2小時，與微孔板上的IL-2形成免疫複合物，清洗微孔；加入底物顯色，避光室溫30分鐘，最終加入終止液，用酶標儀測定A450nm吸光度。
檢測LAG-3抗體在步驟2.所述SEB依賴的PBMC刺激實驗中對IL-2分泌的影響。結果如圖23，和表18所示。
結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，且與工具抗體相當，表明這些抗體對人LAG-3 ECD均有較好的親和力，其中，405B8H3抗體對人LAG-3 ECD的親和力最好。實施例 6 人源化抗體的製備、鑑定和熱點突變
(一)人源化抗體的製備
將克隆405B8H3和556F6B8的重鏈，輕鏈可變區作為人源化範本。
通過序列比對(NCBI-Igblast)選擇與候選抗體405B8H3重鏈可變區，輕鏈可變區同源性最高的胚系基因序列作為可變區移植骨架：IGHV1-46*01和IGKV1-16*01。在選定人抗體骨架後，通過同源建模，預測在鼠抗恆定區中可能決定結構的關鍵胺基酸，對嫁接的骨架區進行回復突變設計。
根據以上原則，分別設計4個重鏈可變區序列(405B8H3 VH_g0，405B8H3 VH_g1，405B8H3 VH_g2，405B8H3 VH_g3)(見表20)和3個輕鏈可變區序列(405B8H3 VL_g0，405B8H3 VL_g1，405B8H3 VL_g2)(見表21)，隨後做交叉組合進行表現，共12種表現組合，見表22。
通過序列比對(NCBI-Igblast)選擇與候選抗體556F6B8重鏈可變區，輕鏈可變區同源性最高的胚系基因序列作為可變區移植骨架：IGHV4-59*01和IGKV1-9*01。在選定人抗體骨架後，通過同源建模，預測在鼠抗恆定區中可能決定結構的關鍵胺基酸,對嫁接的骨架區進行回復突變設計。
根據以上原則，分別設計4個重鏈可變區序列(556F6B8 VH_g0，556F6B8 VH_g1，556F6B8 VH_g2，556F6B8 VH_g3)(見表23)和3個輕鏈可變區序列(556F6B8 VL_g0，556F6B8 VL_g1，556F6B8 VL_g2)(見表24)，隨後做交叉組合進行表現，共12種表現組合，見表25。
載體構建：實驗方法見實施例4，將重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列克隆到包含信號肽和人源抗體IgG4恆定區的pCP表現載體當中，並經測序驗證。
人源化抗體的製備：
細胞轉染：實驗方法見實施例4，使用Freestyle 293F細胞，將構建的質體轉染到細胞中，培養6-7天，過濾收集上清以供純化。
抗體純化：實驗方法見實施例4，用無內毒素的Protein A層析柱純化細胞培養上清液，收穫抗體。然後在1×PBS中透析過夜，避免內毒素污染。
將所得抗體進行蛋白濃度、純度檢測分析。所有抗體的產量，純度分析均表現正常。
(二)人源化抗體的鑑定A ．流式細胞實驗 (FACS) 檢測抗體與 LAG-3 表現細胞的結合，方法同實施例 5 。
結果如表26和圖24以及表27和圖25所示，所得抗體均可結合細胞表面的人LAG-3。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
B．LAG-3抗體親和常數的測定，方法同實施例5。
對人源化改造後抗體的親和力進行評估，結果見表28。結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，人源化改造後抗體與對應的鼠-人嵌合抗體的親和力相當。
(三)人源化抗體的熱點突變
對抗體405B8H3-1熱點進行點突變。405B8H3-1抗體有1個可突變位點，輕鏈的第56位天冬醯胺D突變成谷胺酸E。
熱點突變抗體的載體構建和製備，方法同實施例6中人源化抗體的載體構建和製備。將所得的熱點突變抗體進行蛋白濃度、純度檢測分析。所有抗體的產量，純度分析均表現正常。熱點突變抗體的活性鑑定
A. 流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與LAG-3表現細胞的結合
方法同實施例5。結果如表29和圖26，熱點突變抗體和嵌合抗體均可結合細胞表面的人LAG-3。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。
B. LAG-3受體配體結合實驗檢測抗體阻斷LAG-3與其配體MHC II的結合
實驗方法見實施例2(二)，檢測結果分別如表30和圖27所示。結果表明：熱點突變後抗體和鼠-人嵌合抗體均能夠阻斷LAG-3與配體MHCII的結合，且活性相當。
C. 抗原特異性T淋巴細胞刺激實驗檢測LAG-3抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，結果見表31和圖28，其中IgG對照為人IgG(hIgG)，表中的資料為鼠IL-2濃度。
結果表明：熱點突變的人源化抗體與對應的鼠-人嵌合抗體均在抗原特異性T淋巴細胞刺激試驗中能夠刺激IL-2分泌，且具有濃度梯度依賴效應，活性相當。
D. LAG-3抗體親和常數的測定
方法同實施例5。對熱點突變抗體的親和力進行評估，結果見表32。
結果表明，本發明所得抗體的KD值均在納摩(nM)水準，熱點突變的人源化抗體405B8H3-1(D→E)與對應的鼠-人嵌合抗體405B8H3的親和力提高1.5倍(3.11/2.03=1.5)，而同時將人源化抗體556F6B8-3進行熱點突變(重鏈的第100位天冬醯胺D突變成谷胺酸E)，與對應的鼠-人嵌合抗體405B8H3相比，親和力降低，降低為原來的1/12.5 (33.5/2.68=12.5)。
討論
目前百時美施貴寶公司的LAG-3抗體BMS986016的臨床研究主要用於惡性實體瘤的治療，而且也主要集中於它和其他療法或靶點藥物的聯合使用，開發適應症廣的抗體從而擴大其適用的臨床症狀，包括不可切除的轉移性黑色素瘤、晚期實體癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌、復發性膠質母細胞瘤、頭頸癌、膀胱癌、轉移性直結腸癌、胃腸道間質腫瘤、腺泡細胞癌、高級惡性固體腫瘤、非小細胞肺癌等。
抗體本身的活性受可變區序列和恆定區結構的影響。抗體的可變區序列決定了識別抗原的決定簇、結合親和力及在體內代謝速率，都會影響其體內活性，甚至不同病患個人的臨床效果。
本領域亟待開發產量更高的LAG-3抗體以降低患者的治療成本，惠及更多患者。目前腫瘤免疫治療價格昂貴，急需發明並且生產新的抗體以降低成本。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附請求項書所限定的範圍。
本發明的序列資訊：LAG-3
抗體的重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列和編碼所述重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的核苷酸序列，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'、CDR3'分別用底線標示出來：
405B8H3-2-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.76
405B8H3-2-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.77
405B8H3-6-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.66
405B8H3-6-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.67
405B8H3-7-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.78
405B8H3-7-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.79
405B8H3-1(D→E)-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.64
405B8H3-1(D→E)-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.65
556F6B8-7-VH 胺基酸序列 SEQ ID No.72
556F6B8-7-VH 核苷酸序列 SEQ ID No.73
556F6B8-3(D→E)-VL 胺基酸序列 SEQ ID No.80
556F6B8-3(D→E)-VL 核苷酸序列 SEQ ID No.81
其中VH為重鏈可變區，VL為輕鏈可變區。VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3分別為重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分別為輕鏈可變區CDR1'、CDR2'、CDR3'。
人LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.61
猴LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.62
鼠LAG-3 蛋白胺基酸序列 SEQ ID No.63
