TW201946655A - 新型抗體分子、其製備方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種新型的經人工設計的抗體分子，其包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)和(ii)分別結合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽。
和位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
本發明還提供了編碼所述抗體分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、包含所述多核苷酸或載體的宿主細胞、包含所述抗體分子的免疫綴合物和藥物組合物、以及所述抗體分子在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。

Description

新型抗體分子、其製備方法及其用途
本發明總體上涉及免疫學和抗體工程領域。具體而言，本發明涉及多種新型的經人工設計的抗體分子、編碼所述抗體分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、包含所述多核苷酸或載體的宿主細胞、包含所述抗體分子的免疫綴合物和藥物組合物、以及所述抗體分子在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。
抗體分子能夠與其相應的抗原發生靶向性的特異性結合，正日益成為針對各種疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治療劑、預防劑和/或診斷劑。但是，僅針對一種靶點的單特異性抗體在臨床應用上存在一些局限性。患者在接受單特異性抗體治療後可能產生耐藥性或無應答。隨著對癌症和其他多種疾病的研究，認識到了往往有多種信號轉導通路參與疾病的發生和發展，單一靶點的免疫療法在許多疾病中通常並不足以發揮對疾病的治療作用。
由於多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)能夠特異性結合不同抗原，當一種抗原位於特定的免疫細胞上，另一種抗原位於疾病細胞上時，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)可以將特定的免疫細胞重新定向至疾病細胞，以 增強免疫細胞對疾病細胞的殺傷力。另外，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)也能夠設計為同時作用於兩種或多種不同介質的信號轉導通路。這些優勢特性為多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)開闢了廣闊的應用前景。
已經藉由抗體工程開發了大量富於想像力的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)樣式並且研究了它們在疾病應用上的適用性(Brinkmann U.和Kontermann R.E.,The making of bispecific antibodies，Mabs,2017,9(2)：182-212)。目前，批准上市的2個雙特異性抗體產品分別是Micromet公司和Amgen公司開發的Blinatumomab以及Trion Pharma公司開發的Catumaxomab。Blinatumomab是第1個在美國獲批上市的用於治療B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B前體急性淋巴細胞白血病(ALL)的一種分子量約55KDa的單鏈雙特異性抗體，由分別針對CD19分子和針對CD3分子的兩種單鏈Fv分子藉由柔性連接肽融合而成，其利用幾乎在所有的B淋巴細胞腫瘤中都表達的CD19和在T細胞上表達的CD3，使T細胞與靶向細胞(腫瘤細胞)緊密聯結在一起，T細胞釋放穿孔素和粒端酶進入突觸間隙，引起腫瘤細胞發生一系列化學反應，從而消滅腫瘤細胞(Nagorsen D.和Baeuerle P.A.,Immunomodulatory therapy of cancer with T cell-engaging BiTE antibody blinatumomab，Exp Cell Res，2011，317：1255-1260)。Catumaxomab是由兩個分別源自親本小鼠IgG2a同種型和大鼠IgG2b同種型的半抗體組成的嵌合體，其中每個半抗體具有一條輕鏈和一條重鏈，抗CD3大鼠IgG2b半抗體用於T細胞識別，抗腫瘤細胞表面抗原EpCAM(上皮細胞黏附分子)的小鼠IgG2a半抗體用於腫瘤細胞識別(Chelius D等人，Structural and functional characterization of the trifunctional antibody catumaxomab，MAbs，2010，2： 309-319)。Catumaxomab(Removab®)於2009年4月在歐洲獲准用於治療由EpCAM陽性上皮源性轉移瘤所引起的惡性腹水。
多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)根據不同的組成部分以及構建方式，可以分為許多種類。例如，根據多特異性抗體結構的左右基本上對稱性，可分為對稱結構和不對稱結構；根據多特異性抗體有無IgG的Fc區，可分為有Fc區的抗體樣式和無Fc區的抗體樣式；根據多特異性抗體中抗原結合位點的數量可分為二價、三價、四價或更多價的抗體等。
現有技術中的多特異性抗體樣式在製備和應用中各有利弊，例如，雖然Blinatumomab可以藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行大規模培養生產，但是容易形成聚集物、在體內半衰期很短，實際使用的時候需要額外配備連續輸液裝置；Catumaxomab生產工藝複雜且鼠異源抗體比較容易在人體產生免疫原性問題。
因此，本領域仍然需要可供選擇的具有改善性能的多特異性抗體樣式。本發明提供了一種新的多特異性抗體樣式，所述抗體樣式藉由使用分子量較小且穩定性高的單結構域抗原結合位點作為一種構建模塊，與Fab片段的N端或C端連接，將所得的連接物再連接Fc區後，易於在體外的培養細胞中有效表達，不需要複雜的生產工藝；另外，在本發明抗體樣式中Fc區的存在使得在培養細胞中表達本發明的抗體後，使用單步親和層析即可獲得經純化的抗體，並且本發明的抗體在體內具有較長的血清半壽期並能引發效應子功能，諸如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)和補體依賴的細胞毒作用(CDC)。本發明的多特異性抗體樣式能夠保持該多特異性抗體中的各抗原結合位點與相應的不同表位結合的親和力，且在結合不同表位的時 候互相之間不會產生空間位阻的干擾，具有好的成藥性。進一步地，本發明的多特異性抗體樣式是物理穩定的和生物學穩定的，這允許該抗體具有更好的生產性和可發展性。
本文公開了藉由抗體工程方法構建的一種新型的抗體分子。所述抗體分子能夠以高親和力和高特異性與一種或多種抗原結合，較佳地，與兩種以上的抗原結合。本發明還提供了編碼所述抗體分子的核酸分子、用於產生所述抗體分子的表達載體、宿主細胞和方法。本發明還提供了包含本發明抗體分子的免疫綴合物和藥物組合物。本文公開的抗體分子可以單獨或與其他藥物或其他治療模式聯合用來治療、預防和/或診斷疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤等。
因此，在一個方面，本發明提供了具有以下一個或多個特性的抗體分子：(a)以高親和力，例如以至少約107M-1、較佳地約108M-1和更較佳地約109M-1或更強的親和力常數與一種或多種抗原特異性結合；(b)易於在體外的培養細胞中表達，且抗體分子的各條鏈之間能夠正確偶合或配對；(c)具有良好的物理穩定性，特別地，具有良好的長期熱穩定性；且能長時間保持生物學活性；和(d)在與一種或多種抗原特異性結合後，藉由調節(例如，抑制或者激活)各抗原所參與的信號傳導通路來發揮生物學功能；(e)在與一種或多種抗原特異性結合後，藉由Fc區發揮效應子功能。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)和(ii)分別結合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽；以及位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含至少四個抗原結合位點，分別是至少兩個單結構域抗原結合位點和至少兩個Fab片段中的抗原結合位點，結合至少四種、三種、兩種不同抗原，或者結合一種相同抗原。對於所結合的每一種抗原而言，本發明抗體分子中的抗原結合位點結合的是抗原分子中的相同或不同表位。在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含四個抗原結合位點，其中兩個單結構域抗原結合位點結合第一抗原中的相同或不同表位，兩個Fab片段結合第二抗原中的相同或不同表位，所述第一抗原不同於所述第二抗原。
在一個實施方案中，本發明抗體分子中的(i)和(ii)之間具有單獨或組合使用的甘胺酸和/或絲胺酸殘基作為連接肽，例如，所述連接肽包含胺基酸序列(Gly4Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數，例如，n是2，3，4，5，6。
在一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點選自重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、天然缺乏輕鏈的抗體的重鏈可變結構域(例如，駱駝科(Camelidae)物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域)、魚類中稱為新型抗原受體(new antigen receptor,NAR)的免疫球蛋白(如鯊 魚血清中天然存在的IgNAR)中的VH樣單結構域、和衍生自它們的經重組的單結構域抗原結合位點(例如，駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域)。在一個較佳的實施方案中，本發明抗體分子中的所述單結構域抗原結合位點選自駱駝科物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。將從天然缺乏輕鏈的重鏈抗體衍生的重鏈可變結構域在本文中也簡稱為VHH，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以衍生自駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)中產生的抗體。除駱駝科之外的其他物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，這類VHH也處於本發明的範圍內。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈以及位於所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)的N端的單結構域抗原結合位點，例如VHH；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈以及位於所述免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)的C端的單結構域抗原結合位點，例如VHH；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈以及位於所述免疫球蛋白重鏈N端的單結構域抗原結合位點，例如VHH。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更較佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變區、免疫球蛋白CH1結構域、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)和單結構域抗原結合位 點(例如VHH)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1結構域、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫 球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1結構域和單結構域抗原結合位點(例如VHH)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3 和任選地CH4結構域。較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更較佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。
在本發明提供的包含四條多肽鏈的抗體分子中，發明人還設計了能夠穩定抗體分子結構和有利於各條鏈之間的正確偶合或配對的胺基酸殘基。例如，在抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈的Fc結構域中包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，從而所述第二多肽鏈和第四多肽鏈彼此藉由所述鉸鏈區處胺基酸殘基之間形成的二硫鍵穩定締合。在一個實施方案中，本發明抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈在各自的Fc結構域中分別包含Y349C和S354C或者分別包含S354C和Y349C(根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引進行編號，下文中稱為“EU編號”)，由此，第二多肽鏈和第四多肽鏈在Fc區進一步形成鏈間二硫鍵，以穩定第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗體分子的第二多肽鏈和/或第四多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，所述效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，所述胺基酸突變存在於Fc區的CH2結構域，例如，所述抗體分子包含在第二多肽鏈和/或第四多肽鏈第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是L234A和L235A(下文中稱為“LALA突變”)。
在一個實施方案中，本發明抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含凸起(“結(knob)”)或空穴(“扣(hole)”)，並且第二多肽 鏈Fc結構域中的所述凸起或空穴可分別置於第四多肽鏈Fc結構域中的所述空穴或凸起中，由此所述第二多肽鏈和第四多肽鏈彼此形成“結入扣(knob-in-hole)”的穩定締合。在一個實施方案中，在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗體分子的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CL結構域和CH1結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的所述凸起或空穴可分別置於CL結構域中的所述空穴或凸起中，從而所述第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。同樣地，本發明抗體分子的第三多肽鏈和第四多肽鏈的免疫球蛋白CL結構域和CH1結構域中也分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的所述凸起或空穴可分別置於CL結構域中的所述空穴或凸起中，從而所述第三多肽鏈和第四多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。
在一個實施方案中，本發明抗體分子中的兩個單結構域抗原結合位點結合第一抗原中的相同表位，兩個Fab片段結合第二抗原中的相同表位，由此，所述抗體分子是針對第一抗原和第二抗原的雙特異性抗體。
不特別地限制本發明的抗體分子特異性結合的抗原類型，抗原可以是例如細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。在一個實施方案中，本發明的抗體分子特異性結合的抗原選自腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子、血管新生誘導因子、腫瘤壞死因子受體超家族成員和免疫系統中的共刺激分子，以及這些分子的配體和/或受體，例 如，OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。
本發明例示了如下所述的幾種雙特異性抗體。
i)在一個實施方案中，本發明的抗體分子是抗OX40/PD-L1雙特異性抗體，所述抗體能夠以至少約107M-1、較佳地約108M-1和更佳地約109M-1或更強的親和力常數與表達在淋巴細胞表面的腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員OX40結合，由此活化T細胞，例如增強效應T細胞的免疫刺激/效應功能和/或使這些細胞增殖和/或下調調節性T細胞的免疫抑制功能；並以至少約107M-1、較佳地約108M-1和更佳地約109M-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的PD-L1結合，由此抑制T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面PD-L1的結合，誘導T細胞活化並發揮抗腫瘤作用。
在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中在左半部分的2條多肽鏈和右半部分的2條多肽鏈中，均包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)、(ii)分別結合OX40或PD-L1，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽；以及位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的單結構域抗原結合位點是特異性結合PD-L1的VHH，Fab片段是特異性結合OX40的抗OX40抗體Fab片段。
在一個較佳的實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合PD-L1的VHH包含SEQ ID NO：3所示的CDR1、SEQ ID NO：4所示的CDR2和SEQ ID NO：5所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合OX40的抗OX40抗體Fab片段包含衍生自抗OX40抗體ADI-20112的SEQ ID NO：11/7所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
又在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合PD-L1的VHH包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列；本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合OX40的抗OX40抗體Fab片段包含衍生自抗OX40抗體ADI-20112的SEQ ID NO：11/7所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。
又在一個較佳的實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的 第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
ii)在一個實施方案中，本發明的抗體分子是抗VEGF/GITR雙特異性抗體，所述抗體能夠以至少約107M-1、較佳地約108M-1和更佳地約109M-1或更強的親和力常數與血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor；VEGF)結合，從而阻斷VEGF與其受體VEGFR的結合，使VEGFR無法活化，由此發揮抗血管生成的作用，例如，發揮抗腫瘤血管形成的作用，抑制腫瘤生長；並以至少約107M-1、較佳地約108M-1和更佳地約109M-1或更強的親和力常數與CD4+和CD8+T細胞上的糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)結合，由此逆轉調節性T細胞(Treg)的抑制作用並共刺激和活化效應T細胞來發揮抗腫瘤作用。
在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中在左半部分的2條多肽鏈和右半部分的2條多肽鏈中，均包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或 者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)、(ii)分別結合VEGF或GITR，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽；以及位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的單結構域抗原結合位點是特異性結合GITR的VHH，Fab片段是特異性結合VEGF的抗VEGF抗體Fab片段。
在一個較佳的實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合GITR的VHH包含GFAFGSS(SEQ ID NO：25)所示的CDR1、SGGGFGD(SEQ ID NO：26)所示的CDR2和ATDWRKP(SEQ ID NO：27)所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合VEGF的抗VEGF抗體Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體Avastin的SEQ ID NO：22/20所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
又在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合GITR的VHH包含衍生自SEQ ID NO：24所示的抗GITR VHH胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列；本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合VEGF的抗VEGF抗體Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體Avastin的SEQ ID NO：22/20所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與 所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。
又在一個較佳的實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
在第二方面，本發明提供了編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的多核苷酸。
在第三方面，本發明提供了包含編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的多核苷酸的載體，較佳地表達載體。
在第四方面，本發明提供了包含本發明多核苷酸或載體的宿主細胞。例如，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，較佳地是CHO細胞、HEK293細胞；所述宿主細胞是原核細胞，較佳地是大腸桿菌細胞。
在第五方面，本發明提供了用於產生本發明抗體分子的方法，所述方法包括步驟(i)在適於表達所述抗體分子的條件下培養本發明的宿主細胞，和(ii)從所述宿主細胞或所述培養基回收所述抗體分子。
在第六方面，本發明提供了包含本發明抗體分子的免疫綴合物和藥物組合物。本文公開的抗體分子可以單獨或與其他藥物或其他治療模式聯合用來治療、預防和/或診斷疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤等。
在第七方面，本發明提供了本發明的抗體分子、免疫綴合物和藥物組合物的用途，用作在個體中治療和/或預防疾病的藥物或用作疾病的診斷工具。較佳地，所述個體是哺乳動物，更佳地是人。在一個實施方案中，所述疾病是自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤。
除非另外限定，否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。此外，本文中所述的材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及圖式並且從後附的權利要求書中顯而易見。
結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。
第1A圖至第1D圖例示了本發明雙特異性抗體的4種結構。
第2A圖至第2D圖分別顯示了利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測的本發明製備的4種結構的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-110-112HC、Bi-113-112HC、Bi-119-112LC和Bi-122-112LC的純度。
第3圖顯示了藉由FACS檢測的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC、以及作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體與過量表達PD-L1的CHO細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。
第4圖顯示了藉由FACS檢測的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC、以及作為陽性對照的抗OX40抗體ADI-20112與過量表達OX40的CHO細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。
第5圖顯示了抗OX40/PD-L1雙特異性抗體對過量表達OX40的CHO細胞和過量表達PD-L1的CHO細胞的同時結合作用。
第6圖顯示了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體對人PD-1與PD-L1結合的作用，證明本發明的雙特異性抗體Bi-119-112LC阻斷人PD-1與PD-L1的結合。還檢測了作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG1的作用。
第7圖顯示了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC有效解除PD1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的阻斷效應，進而獲得了螢光信號。還檢測了作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG1的作用。
第8圖顯示了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC對PD-L1依賴的OX40介導的信號通路的作用。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20112、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20112和IgG1的作用。
第9圖顯示了差示掃描螢光法(DSF)測定的本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC的Tm值的結果。
第10圖顯示了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC對人T細胞的激活作用。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20112和IgG1的作用。
第11A圖至第11B圖例示了本發明雙特異性抗體的2種結構。
第12A圖第12B圖分別顯示了利用SEC檢測的本發明製備的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51的純度。
第13圖顯示了藉由FACS檢測的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51與過量表達GITR的CHO細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。
發明詳述
I．定義
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。
術語“抗體”在本文中以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、完整抗體和抗體片段。
術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基 端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。
術語“抗原結合片段”是比完整或完全抗體的胺基酸殘基數要少的完整或完全抗體的一部分或一段，其能結合抗原或與完整抗體(即與抗原結合片段所來源的完整抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(sdAb)。所述Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體產生F(ab')2，其為Fab’的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，由此將F(ab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段(其它抗體片段的更詳細的描述請參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。所述Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性連接肽連接，在所述單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單鏈Fv。可以藉由化學方法、重組DNA方法或蛋白酶消化法獲得所述抗體片段。
術語“單結構域抗體”(sdAb)或“單可變結構域(SVD)抗體”通常指這樣的抗體，其中單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH)或輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、衍生自魚類IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR))即可賦予抗原結合。即，該單個可變結構域不需要與另一 可變結構域相互作用以識別靶抗原。單結構域抗體的實例包括源自駱駝科(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的單結構域抗體(WO 2005/035572)。
術語“駱駝化的人VH結構域”是指將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上導致人VH結構域不再需要與VL結構域配對來識別靶抗原，經駱駝化的人VH結構域單獨即可賦予抗原結合特異性。
如本文所用的術語“結合位點”或“抗原結合位點”表示抗體分子中與抗原實際結合的區域，包括由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR)、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體分子包含至少四個抗原結合位點，例如，包含兩個單結構域抗原結合位點(例如，VHH)和兩個Fab片段中VH/VL對形成的抗原結合位點。
術語“單結構域抗原結合位點”表示抗體分子的以單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的v-NAR、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域、和它們的經重組的單結構域)與抗原實際結合的區域。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體分子包含兩個單結構域抗原結合位點，分別結合相同或不同的抗原。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體分子包含兩個單結構域抗原結合位點，分別結合相同或不同的抗原表位。
如本文所用，術語“單特異性”抗體指具有一個或多個結合位點的抗體，所述位點中的每一個位點與相同抗原的相同表位結合。
如本文所用，術語“多特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。本文提供的抗體通常是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同抗原表位具有結合特異性的抗體。在一個實施方案中，本文提供了這樣的雙特異性抗體，其具有針對第一抗原和第二抗原的結合特異性。
術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和一個Fc結構域組成。
術語“Fc結構域”或“Fc區”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域 和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明，否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號。
術語“效應子功能”指隨免疫球蛋白同種型變動的歸因於免疫球蛋白Fc區的那些生物學活性。免疫球蛋白效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。
術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的抗原性。
“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並且抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，恆定區以及可變區中不參與結合的部分為人類抗體的相應部分)來實現。參 見，例如Padlan,Anatomy of the antibody molecule，Mol.Immun.,1994，31：169-217。人類抗體工程化技術的其他例子包括但不限於US 5,766,886中公開的Xoma技術。
術語“...價”抗體指抗體分子中存在的抗原結合位點的數目。“二價”、“三價”和“四價”抗體指抗體分子中分別存在2個抗原結合位點、3個結合位點和4個結合位點。在一個實施方案中，本文中報道的雙特異性抗體是“四價的”。
術語“由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成”的抗體是指抗體分子由4條多肽鏈組成，包括抗體分子左邊的2條多肽鏈和右邊的2條多肽鏈，且抗體分子左邊的2條多肽鏈的序列和右邊的2條多肽鏈的序列具有100%同一性或至少95%或至少99%同一性。
術語“柔性連接肽”或“連接肽”是指由胺基酸組成的連接肽，例如單獨或組合使用的甘胺酸和/或絲胺酸殘基，以連接抗體中的各個可變結構域。在一個實施方案中，柔性連接肽是Gly/Ser連接肽，包括胺基酸序列(Gly4Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數。在一個實施方案中，所述柔性連接肽是(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：9)。還包括在本發明範圍內的是WO2012/138475中描述的連接肽，其藉由引用併入本文。
如本文所用，術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法測定。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(KD)代表， 解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是kdis和kon)的比例。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。技術人員將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。在本文的一些實施方案中，第一抗原、第二抗原、第三抗原是三種不同的抗原。
術語“腫瘤相關抗原”或“癌症抗原”可互換地指與正常細胞相比，較佳在癌細胞表面完全或作為片段(例如，MHC/肽)表達的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)，並且所述分子可用在藥劑對癌細胞的優先靶向中。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是與正常細胞相比在腫瘤細胞中過表達的細胞表面分子，例如與正常細胞相比1倍過量表達、2倍過量表達、3倍過量表達或更多倍過量表達。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是在腫瘤細胞中不適當地合成的細胞表面分子，例如與正常細胞上表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原僅在腫瘤細胞的細胞表面完整表達或作為片段表達，並且不在正常細胞的表面上合成或表達。現有技術中公開了諸多腫瘤相關抗原，例如，表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)、腫瘤相關的糖蛋白72(TAG72)、癌胚抗原(CEA)、上皮細胞粘附分子(EPCAM)、白介素11受體α(IL-11Ra)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、表皮生長因子受體(EGFR)、神經細胞粘附分子(NCAM)、胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)、黑素瘤相關抗原1(MAGE-A1)、CD72、CD47等。
術語“免疫檢查點”意指免疫系統中存在的一類抑制性信號分子，藉由調節外周組織中免疫反應的持續性和強度避免組織損傷，並參與維持對於自身抗原的耐受(Pardoll DM.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer,2012,12(4)：252-264)。研究發現，腫瘤細胞能夠逃避體內免疫系統而失控增殖的原因之一是利用了免疫檢查點的抑制性信號通路，由此抑制了T淋巴細胞活性，使得T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)：130-146)。免疫檢查點分子包括但不限於程序性死亡1(PD-1)、PD-L1、PD-L2、細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、LAG-3和TIM-3。
術語“共刺激分子”是指T細胞上的與共刺激配體特異性結合從而介導T細胞的共刺激反應(例如但不限於增殖)的相應結合配偶體。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的有助於有效免疫應答的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK細胞受體、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些實施方案中，“共刺激分子”是OX40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。
術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子、白介素(IL)，諸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本文中使用的，術語細胞因子包括來自天然來源 或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物，包括藉由人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。
“免疫綴合物”是與一個或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)綴合的抗體。
如本文所用，術語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞功能和/或造成細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化療藥或藥物(例如，甲胺蝶呤、阿黴素、長春鹼類生物鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如細菌源、真菌源、植物源或動物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；和下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
胺基酸序列的“同一性百分數(%)”是指將候選序列與本說明書中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，候選序列中與本說明書中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。
對於多肽序列，“保守性修飾”包括對多肽序列的置換、缺失或添加，它們導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾的變體相對於本發明的多態性變體、物種間同源物和等位基因而言是附加的並且不排斥它們。以下8組含有互為保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參閱例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些實施方案中，術語“保守序列修飾”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
術語“N端”指N端的最末胺基酸，術語“C端”指C端的最末胺基酸。
術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統，包括真核細胞，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞；和原核細胞，例如，大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。
術語“表達載體”是指包含重組多核苷酸的載體，其包含有效連接要表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可以由宿主細胞提供或在體外表達系統中。表達載體包括本領域已知的所有那些，包括被摻入重組多核苷酸的粘粒、質粒(例如，裸的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。
術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的抗體分子用來延緩疾病發展或用來減慢疾病的進展。
術語“抗腫瘤作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和液體腫瘤。
術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌症的例子包括但不限於癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體例子包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，黑素瘤，淺表擴散性黑素瘤，惡性雀斑樣痣黑素瘤，肢端黑素瘤，結節性黑素瘤，多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，毛細胞性白血病，慢性成髓細胞性白血病，和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)，水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖，腦瘤和腦癌，以及頭頸癌，及相關轉移。在某些實施方案中， 適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括肺癌(例如非小細胞肺癌)、肝癌、胃癌或結腸癌，包括那些癌症的轉移性形式。
術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
術語“感染性疾病”是指病原體引發的疾病，包括例如病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染或真菌感染。
II.本發明的抗體分子
本發明提供了一種新型的抗體分子，其能夠用於多種疾病的免疫治療、預防和/或診斷。本發明的抗體分子至少包含4個抗原結合位點，其能夠作為單特異性抗體或多特異性(例如雙特異性)抗體發揮作用，較佳地，其能夠作為多特異性(例如雙特異性)抗體發揮作用。
在產生具有多條多肽鏈的單特異性或多特異性(例如雙特異性)抗體時，通常會發生不希望的鏈間錯配、抗體親和力降低、穩定性降低等問題。本申請構建的抗體分子能夠避免這些常見問題。
本申請所構建的抗體分子平臺包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)和(ii)分別結合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽；以及位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
在一個實施方案中，本發明抗體分子具有4條多肽鏈，其包含2個單結構域抗原結合位點和2個Fab片段以及Fc區。
在另一個實施方案中，本發明抗體分子的單結構域抗原結合位點和Fab片段之間不具有連接肽。
又在一個實施方案中，本發明抗體分子的單結構域抗原結合位點和Fab片段之間具有連接肽。不特別地限制所述連接肽的類型。在實施方案中，所述連接肽是具有1至100個、特別地1至50個、更特別地1至20個胺基酸長度的胺基酸序列的肽。在一些實施方案中，所述肽連接肽是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸並且x=1-4中的任一整數，n=1-7中的任一整數，以及m=0-3中的任一整數。在一個具體實施方案中，所述連接肽是(G4S)2(SEQ ID NO：9)。
本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點是能夠以較高親和力特異性結合靶抗原表位的單個可變結構域，例如，重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的v-NAR、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域、和它們的經重組的單結構域。在一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點是衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和/或人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。
現有技術中已經對從駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)獲得的抗體蛋白的大小、結構和針對人類受試者的抗原性進行了表徵。在自然界中來自駱駝科哺乳動物家族的某些IgG抗體缺少輕鏈，並且因此在結 構上區別於來自其他動物的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的常見四鏈抗體結構。參見PCT/EP 93/02214(1994年3月3日公佈的WO 94/04678)。
可以藉由基因工程方法獲得駱駝科重鏈抗體的對靶抗原具有高親和力的重鏈可變結構域(該區域也稱為VHH)。參見1998年6月2日授予的美國專利號5,759,808。與其他非人源抗體片段一樣，駱駝科VHH的胺基酸序列可以重組地改變以獲得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低駱駝科VHH對人類的抗原性。另外，也可以將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上，獲得駱駝化的人VH結構域。在本發明的一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點是針對PD-L1的人源化VHH，其具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。在本發明的另一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點是針對GITR的VHH，其具有SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
VHH的分子量是人IgG分子的分子量的十分之一，並且具有僅數納米的物理直徑。VHH本身具有極高的熱穩定性、對極端pH和蛋白酶解消化穩定和抗原性低，因此，在本發明抗體分子的一個實施方案中，包含VHH作為構建模塊對本發明抗體分子的穩定性、對人受試者的低抗原性做出了貢獻。
本發明抗體分子中的Fab片段能夠以較高親和力特異性結合靶抗原表位。在一個實施方案中，所述Fab片段是免疫球蛋白的Fab片段，其包含由免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)組成的肽；且包含由免疫球蛋白重鏈可變區(VH)和免疫球蛋白重鏈恆定區1(CH1)組成的肽；其中所述CL區和CH1區任選地藉由二硫鍵共價連接而異源二聚化Fab片段。在一個實施方案中，所述Fab片段是免疫球蛋白Fab片段的輕鏈可變區(VL)和輕鏈可變 區(VL)交換後的Fab片段，其包含由免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)和重鏈恆定區(CH1)組成的肽；且包含由免疫球蛋白重鏈可變區(VH)和輕鏈恆定區(CL)組成的肽；其中所述CL區和CH1區任選地藉由二硫鍵共價連接而異源二聚化Fab片段。又在一個實施方案中，所述Fab片段是免疫球蛋白Fab片段的輕鏈恆定區(CL)和重鏈恆定區(CH1)交換後的Fab片段，其包含由免疫球蛋白重鏈可變區(VH)和輕鏈恆定區(CL)組成的肽；且包含由免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)和重鏈恆定區(CH1)組成的肽；其中所述CL區和CH1區任選地藉由二硫鍵共價連接而異源二聚化Fab片段。
如本領域技術人員所認識到的，Fab片段的CL區和CH1區之間的二硫鍵是較佳的，但對於功能不是必需的(Orcutt KD等人，A modular IgG-scFv bispecific antibody topology，Protein Eng Des Sel.2010，23(4)：221-228)。因此，在一些實施方案中，本發明抗體分子中的Fab片段不包含二硫鍵。在這方面，Fab片段的兩條鏈可以以這樣的方式進行改造，從而在無需二硫鍵的情況下穩定地相互作用。例如，在一些實施方案中，可改造Fab片段的兩條鏈以去除半胱胺酸殘基，並且Fab片段的兩條鏈仍然穩定地相互作用並如Fab一樣發揮功能。在一個實施方案中，對Fab片段的兩條鏈進行突變以促進這兩條鏈之間穩定的相互作用。例如，可用“結入扣”遺傳改造策略(參見例如John B.B.Ridgway等人，‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Engineering,1996.9(7)：p.617-21；Shane Atwell等人，Stable heterodimers form remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library.J.Mol.Biol,1997.270：p.26-35)來促進Fab片段的兩條鏈之間的異二聚化。利用該策略，藉由在相互作用結構域之間的界面處用較大的胺基 酸側鏈取代小的胺基酸側鏈來產生“結”結構。相應地，藉由在相互作用分子之間的界面處用小的側鏈替代大的側鏈來實現“扣”結構。因此，還考慮用於本文的是出於特定目的而設計變異Fab片段，例如在CH1和/或CL的恆定結構域中的胺基酸改變，以及二硫鍵的去除等。
在一些實施方案中，本發明抗體分子中的Fab片段來源於單株抗體並且可來源於任何類型的抗體，包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE及其亞型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈結構域可來源於κ鏈或λ鏈。另外，本文所用的Fab片段也可藉由重組製備。在一些實施方案中，本發明抗體分子的Fab片段中的CH1結構域、CL結構域均來自人免疫球蛋白的相應部分或具有與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
本發明抗體分子中的免疫球蛋白Fc結構域能夠延長本發明抗體的體內半壽期和提供效應子功能。參見，例如，國際公開號WO98/23289；國際公開號WO97/34631；和美國專利號6 277 375。
在一個具體實施方案中，在本發明抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，本發明抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，這也促成了本發明的抗體分子的第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子的免疫球蛋白Fc結構域也使用了“結入扣”技術，該技術可在本發明抗體分子的不同鏈之間改造界面，以促進本發明抗體分子的各條鏈正確締合。通常，該技術涉及在一條鏈的界面引 入“凸起”，在欲與之配對的另一條鏈的界面引入相應的“空穴”，使得凸起可置於空穴中。第一個較佳的界面包含一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域和欲與之配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域。可藉由將來自一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面的小胺基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)來構建凸起。藉由將大胺基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)，在欲配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面構建與凸起相同或相似大小的補償性空穴。第二個較佳的界面是上文所述Fab片段的包含輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域，藉由構建凸起-空穴相互作用促進Fab片段的兩條鏈之間發生正確的異二聚化。
在一個實施方案中，本發明抗體分子的Fc區包含對Fc受體的結合親和力的修飾。在一個實施方案中，所述Fc受體是Fcγ受體，特別地是人Fcγ受體。在一個實施方案中，所述Fc受體是活化性Fc受體。在一個實施方案中，所述修飾減少本發明抗體分子的的效應子功能。在一個具體實施方案中，所述效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，所述修飾在所述免疫球蛋白分子Fc區內，特別地在其CH2區內。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重鏈第329位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是P329G。在一個實施方案中，本發明抗體分子包含在免疫球蛋白重鏈第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是L234A和L235A(LALA突變)(Armour KL等人，Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.Eur J Immunol,1999.29(8)：2613-24)。在一個實施方案中，本發明抗體分子包含在免疫球蛋白重鏈第234、 235和329位置處(EU編號)的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重鏈中的胺基酸置換L234A、L235A和P329G(EU編號)。
本發明抗體分子中的至少一個單結構域抗原結合位點(例如，兩個單結構域抗原結合位點)和至少一個Fab片段能夠特異地結合至少一種抗原。較佳地，本發明的抗體分子結合兩種或兩種以上的抗原，由此，本發明的抗體分子是多特異性抗體分子，例如，雙特異性抗體分子。所述抗原包括但不限於細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子抑制多種(例如兩種)免疫檢查點分子的信號傳導通路，例如，本發明的抗體分子是具有針對PD-L1的第一結合特異性和針對TIM-3、LAG-3、PD-1或PD-L2的第二結合特異性的雙特異性抗體分子，藉由抑制所述免疫檢查點分子的信號傳導通路發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子抑制免疫檢查點分子的信號傳導通路和激動共刺激分子的信號傳導通路，例如，本發明的抗體分子是具有針對PD-L1、TIM-3、LAG-3、PD-1或PD-L2的第一結合特異性和針對OX40、GITR、4-1BB、CD27或CD28的第二結合特異性的雙特異性抗體分子，藉由抑制所述免疫檢查點分子的信號傳導通路和藉由激動所述共刺激分子的信號傳導通路而發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子抑制免疫檢查點分子的信號傳導通路和抑制異常血管生成，例如，本發明的抗體分子是具有針對PD-L1、TIM-3、LAG-3、PD-1或PD-L2的第一結合特異性和針對VEGF或VEGF受體 的第二結合特異性的雙特異性抗體分子，藉由抑制所述免疫檢查點分子的信號傳導通路和藉由抑制VEGF、VEGF受體的信號傳導通路而發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子激動多種(例如兩種)共刺激分子的信號傳導通路，例如，本發明的抗體分子是具有針對OX40的第一結合特異性和針對GITR、4-1BB、CD27或CD28的第二結合特異性的雙特異性抗體分子，藉由激動所述共刺激分子的信號傳導通路發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子激動共刺激分子的信號傳導通路和抑制異常血管生成，例如，本發明的抗體分子是具有針對OX40、GITR、4-1BB、CD27或CD28的第一結合特異性和針對VEGF或VEGF受體的第二結合特異性的雙特異性抗體分子，藉由激動所述共刺激分子的信號傳導通路和藉由抑制VEGF、VEGF受體的信號傳導通路而發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子抑制異常血管生成、抑制免疫檢查點分子的信號傳導通路和激動共刺激分子的信號傳導通路，例如，本發明的抗體分子是具有針對VEGF或VEGF受體的第一結合特異性、針對PD-L1、TIM-3、LAG-3、PD-1或PD-L2的第二結合特異性和針對OX40、GITR、4-1BB、CD27或CD28的第三結合特異性的三特異性抗體分子，藉由抑制VEGF、VEGF受體的信號傳導通路、抑制所述免疫檢查點分子的信號傳導通路和藉由激動所述共刺激分子的信號傳導通路而發揮作用。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子具有說明書第1A圖至第1D圖中例示的任一結構。
如第1A圖中的示意圖所示，本發明的示例性抗體分子是四鏈抗體分子，包含2個Fab片段、分別位於每一Fab片段輕鏈恆定區(CL)C端的單結 構域抗原結合位點、以及作為本發明抗體分子C端的免疫球蛋白Fc結構域，其中在Fab片段輕鏈恆定區(CL)C端和單結構域抗原結合位點之間具有或者不具有連接肽。
如第1B圖中的示意圖所示，本發明的示例性抗體分子是四鏈抗體分子，包含2個Fab片段、分別位於每一Fab片段輕鏈可變結構域(VL)N端的單結構域抗原結合位點、以及作為本發明抗體分子C端的免疫球蛋白Fc結構域，其中在Fab片段輕鏈可變結構域(VL)N端和單結構域抗原結合位點之間具有或者不具有連接肽。
如第1C圖中的示意圖所示，本發明的示例性抗體分子是四鏈抗體分子，包含2個Fab片段、分別位於每一Fab片段CH1結構域C端的單結構域抗原結合位點、以及作為本發明抗體分子C端的免疫球蛋白Fc結構域，其中在Fab片段CH1結構域C端和單結構域抗原結合位點之間具有或者不具有連接肽。
如第1D圖中的示意圖所示，本發明的示例性抗體分子是四鏈抗體分子，包含2個Fab片段、分別位於每一Fab片段重鏈可變結構域(VH)N端的單結構域抗原結合位點、以及作為本發明抗體分子C端的免疫球蛋白Fc結構域，其中在Fab片段重鏈可變結構域(VH)N端和單結構域抗原結合位點之間具有或者不具有連接肽。
下面例示一些本發明的抗體分子和本發明的抗體分子對其特異性結合的抗原所參與的信號傳導通路的調節作用。
i)在一個實施方案中，本發明的抗體分子是抗OX40/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體。
OX40(也稱為CD134、TNFRSF4和ACT35)是細胞表面糖蛋白和腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員，在T淋巴細胞上表達並且為活化的T細胞的增殖和存活提供共刺激信號。OX40最初被描述為大鼠CD4 T細胞上的T細胞激活標誌物(Paterson DJ等人，Antigens of activated rat T lymphocytes including a molecule of 50,000 Mr detected only on CD4 positive T blasts.Mol Immunol.1987；24：1281-1290)並且隨後顯示為在TCR招募中被上調(Mallett S.等人，Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4positive T lymphocytes--a molecule related to nerve growth factor receptor.EMBO J.1990；9：1063-1068)。已在CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、NKT細胞和嗜中性粒細胞上鑒定到OX40(Paterson D.J.等人，Antigens of activated Rat T lymphocytes including a molecule of 50,000 M(r)detected only on CD4 positive T blasts,Molecular Immunology,1987，24(12)：1281-1290)。OX40信號傳導能夠促進對T細胞的共刺激信號，導致增強的細胞增殖、存活、效應子功能和遷移(Gramaglia I等人，Ox-40 ligand：a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses.J Immunol.1998；161：6510-6517；Gramaglia I等人，The OX40 costimulatory receptor determines the development of CD4 memory by regulating primary clonal expansion.J Immunol.2000；165：3043-3050)。
現有技術中公開了作為OX40激動劑的抗OX40抗體。例如，WO 2012/027328中公開了抗OX40抗體mAb 106-222和人源化106-222(Hu106)的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列；抗OX40抗體mAb 119-122和人源化119-122(Hu119)的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。美國專利號7,959,925、PCT公開號WO 2006/121810和中國專利申請號201710185399.9中也 公開了作為OX40激動劑的抗OX40抗體。所述抗OX40抗體能夠活化OX40，從而誘導效應T淋巴細胞增殖，促進針對表達腫瘤相關抗原(TAA)的腫瘤細胞的免疫應答。
PD-L1(也稱作分化抗原簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1))，是40kDa I型跨膜蛋白。PD-L1與活化的T細胞上存在的其受體PD-1結合，下調T細胞活化(Latchman等人，2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。已經在許多癌中發現了PD-L1表達，包括人肺癌、卵巢癌、結腸癌和多種骨髓瘤等，並且PD-L1表達經常與癌的預後不良相關(Iwai等人(2002)PNAS 99：12293-7；Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res 11：2947-53；Okazaki等人(2007)Intern.Immun.19：813-24；Thompson等人(2006)Cancer Res.66：3381-5)。已經提出藉由抑制PD1與PD-L1的局部相互作用可以在一部分腫瘤患者中逆轉免疫抑制。
羅氏(Roche)研發的抗PD-L1抗體Atezolizumab、德國默克(Merck KGaA)和美國輝瑞(Pfizer)合作開發的抗PD-L1抗體Avelumab、阿斯利康研發的Durvalumab顯示了對部分腫瘤患者的治療效果。其它抗PD-L1抗體包括YW243.55.S70(重鏈和輕鏈可變區顯示在WO2010/077634中的SEQ ID NOs 20和21中)和WO2007/005874中公開的抗PD-L1抗體等。
本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體至少同時靶向OX40和PD-L1，其Fab片段和單結構域抗原結合位點分別結合OX40或PD-L1分子，能夠阻斷抑制性PD-1/PD-L1信號傳導途徑且活化T細胞和自然殺傷(NK)細胞中的OX40/OX40配體信號傳導途徑，促進針對疾病的免疫應答。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點和特異性結合OX40的Fab片段。在一個實施方案中，本 發明的抗體分子包含特異性結合OX40的單結構域抗原結合位點和特異性結合PD-L1的Fab片段。
對於所述特異性結合PD-L1或OX40的Fab片段，其包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體(例如，上文中例舉的抗PD-L1抗體)和將來研發出的抗PD-L1抗體VH/VL對的6個CDR或與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗OX40抗體(例如，上文中例舉的抗OX40抗體)和將來研發出的抗OX40抗體VH/VL對的6個CDR或與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。在一個實施方案中，抗OX40抗體是ADI-20112，其具有SEQ ID NO：10所示的重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：15所示的輕鏈胺基酸序列。
對於所述特異性結合PD-L1或OX40的單結構域抗原結合位點，其包含特異性結合PD-L1或OX40的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、來自駱駝科血清的天然不含輕鏈的僅由兩條重鏈組成的駱駝抗體中的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。
在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體包含兩個特異性結合OX40的Fab片段以及兩個特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點(例如，VHH)，分別具有第1A圖至第1D圖中例示的任一結構。所述兩個特異性結合OX40的Fab片段特異性結合OX40分子上的相同表位或者不同表位；所述兩個特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點特異性結合PD-L1分子上的相同表位或者不同表位。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合OX40的Fab片段包含衍生自抗OX40抗體ADI-20112的SEQ ID NO：11/7的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合OX40的Fab片段包含衍生自抗OX40抗體ADI-20112的SEQ ID NO：11/7的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。
在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點包含SEQ ID NO：3所示的CDR1、SEQ ID NO：4所示的CDR2和SEQ ID NO：5所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
又在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中的所述特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
不特別地限制本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體中重鏈恆定區CH1結構域和Fc區(包含CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域)的類 型，較佳地是衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白重鏈恆定區的相應結構域，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更較佳地，所述重鏈恆定區CH1結構域和Fc區衍生自人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區。在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體包含IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區。又在一個實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的CH1結構域和IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的Fc區；或者包含IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的CH1結構域和IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的Fc區。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，從而本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈和/或第四多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是LALA突變。
在又一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體包含κ輕鏈恆定區和/或λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區和/或人λ輕鏈恆定 區。在一個實施方案中，輕鏈恆定區包含在SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈在各自的Fc結構域中分別包含“結入扣”的穩定締合。在一個實施方案中，在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的所述凸起或空穴可分別置於CL結構域中的所述空穴或凸起中，從而本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。
在具體的實施方案中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半 部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體能夠同時與PD-L1和OX40蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷PD-1/PD-L1信號傳導途徑且活化T細胞和自然殺傷(NK)細胞中的OX40/OX40配體信號傳導途徑。本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體能夠用於與所述信號傳導途徑相關的疾病的治療、預防或診斷。
ii)在一個實施方案中，本發明的抗體分子是抗VEGF/GITR雙特異性抗體或多特異性抗體。
血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)最初稱為血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)(Senger,DR等人，Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid，Science，1983,219(4587)：983-985)，是由刺激血管形成的細胞產生的信號蛋白。VEGF是生長因子的亞家族，其是一類參與血管生成的重要信號傳導蛋白。在正常組織中血管內皮生長因子和血管內皮細胞生長抑制因子同時存在，且保持相對平衡，這種平衡使得人體血管可以正常地生成和分化。但是，在疾病例如腫瘤生長過程中，VEGF家族分子數量激增，與血管生成抑制因子之間的調節失衡，由此，極大地促進了血管內皮細胞的分裂增殖和遷移、提高了血管 通透性、抑制腫瘤細胞凋亡，為腫瘤的生長和轉移提供了良好的微環境(Lapeyre-Prost A等人，Immunomodulatory Activity of VEGF in Cancer，Int Rev Cell Mol Biol.2017；330：295-342)。VEGF家族包含六種密切相關的多肽，分別是高度保守的同源二聚體糖蛋白，有六個亞型：VEGF-A、-B、-C、-D、-E、和胎盤生長因子(placental growth factor(PLGF))，分子量從35至44kDa不等。VEGF-A(包括其剪接物如VEGF165)的表達與一些實體瘤的微血管密度具有相關性，並且組織中VEGF-A的濃度與乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結腸癌等實體瘤的預後有關。每個VEGF家族成員的生物學活性藉由細胞表面VEGF受體(VEGFR)家族中的一種或多種介導，所述VEGFR家族包括VEGFR1(也稱為Flt-1)、VEGFR2(也稱為KDR、Flk-1)、VEGFR3(也稱為Flt-4)等，其中VEGFR1、VEGFR2與血管的生成關係密切，VEGF-C/D/VEGFR3則與淋巴管生成密切相關。
臨床研究顯示利用抗VEGF單株抗體能夠阻斷VEGF與其受體的結合。基因泰克(Genentech)公司研發的貝伐單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是一種重組的人鼠嵌合抗VEGF抗體，可藉由阻斷VEGF-A與VEGFR的結合，使VEGFR無法活化，由此發揮抗血管生成的作用。貝伐單抗目前用於一線治療轉移性結直腸癌，將來有可能用於轉移性肺癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌等疾病的治療。貝伐單抗也是開發較為成功的抗體藥物之一。
糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor，GITR，亦稱作TNFRSF18、活化誘導型TNFR家族成員(AITR)、CD357及GITR-D)，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族的第18個成員。最初在經地塞米松(dexamethasone)處理的鼠類T細胞系中鑒定出(Nocentini G等人，A new member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor family inhibits T cell receptor-induced apoptosis，Proc Natl Acad Sci USA.1997；94(12)：6216-21)。TNF受體超家族的其他相關成員包括CD40、CD27、4-1BB和OX40。儘管GITR的表達在原初CD4+及CD8+細胞中較低，但其在調節性T細胞中組成型表達(Tone M等人，Mouse glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand is costimulatory for T cells，Proc Natl Acad Sci U S A.2003；100(25)：15059-64)。但是，一旦在效應T細胞上誘導GITR表達，則促進效應T細胞活化、增殖及細胞因子產生。關於CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)，Shimizu使用混合培養物阻抑分析報導GITR激活會阻抑Treg的功能(Shimizu J等人，Stimulation of CD25(+)CD4(+)regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance，Nature Immunology 2002；3：135-42)。在多種腫瘤模型中，抗GITR抗體DTA-1介導的GITR刺激促進抗腫瘤免疫(Cohen AD等人，Agonist anti-GITR monoclonal antibody induces melanoma tumor immunity in mice by altering regulatory T cell stability and intra-tumor accumulation，PLoS One.2010；5(5)：e10436；Coe D等人，Depletion of regulatory T cells by anti-GITR mAb as a novel mechanism for cancer immunotherapy，Cancer Immunol Immunother，2010；59(9)：1367-77)。
GITR與GITR配體(GITRL)結合後活化，所述配體主要在APC上表達，GITR活化後能夠增加對腫瘤和病毒感染的抗性，參與自身免疫過程/炎症性過程，並調節白細胞外滲(Cohen AD等人，同上；和Cuzzocrea S等人，Genetic and pharmacological inhibition of GITR-GITRL interaction reduces chronic lung injury induced by bleomycin instillation，FASEB J.2007，21(1)：117-129)。
以下文獻中描述了抗GITR抗體：美國專利號7,025,962、歐洲專利號1947183B1、美國專利號7,812,135、美國專利號8,388,967、美國專利號8,591,886、歐洲專利號EP 1866339、PCT公開號WO 2011/028683、美國專利號8,709,424、PCT公開號WO 2013/039954、國際公開號WO 2013/039954、美國公開號US 2014/0072566、國際公開號WO 2015/026684、PCT公開號WO 2005/007190、PCT公開號WO 2007/133822、PCT公開號WO 2005/055808、PCT公開號WO 99/40196、PCT公開號WO 2001/03720、PCT公開號WO 99/20758、美國專利號6,689,607、PCT公開號WO 2006/083289、PCT公開號WO 2005/115451、美國專利號7,618,632、PCT公開號WO 2011/051726、國際公開號WO 2004060319和國際公開號WO2014012479。
本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體或多特異性抗體至少同時靶向VEGF和GITR，其Fab片段和單結構域抗原結合位點分別結合VEGF或GITR分子，能夠阻斷VEGF家族信號傳導途徑以及活化效應T細胞和阻抑Treg的功能。
在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點和特異性結合VEGF的Fab片段。在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含特異性結合VEGF的單結構域抗原結合位點和特異性結合GITR的Fab片段。
對於所述特異性結合GITR或VEGF的Fab片段，其包含衍生自任何現有技術中報導的抗GITR抗體(例如，上文中例舉的抗GITR抗體)和將來研發出的抗GITR抗體VH/VL對的6個CDR或與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗VEGF抗 體(例如，上文中例舉的抗VEGF抗體)和將來研發出的抗VEGF抗體VH/VL對的6個CDR或與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。在一個實施方案中，抗VEGF抗體是Avastin，其具有SEQ ID NO：19所示的重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：18所示的輕鏈胺基酸序列。
對於所述特異性結合GITR或VEGF的單結構域抗原結合位點，其包含特異性結合GITR或VEGF的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、來自駱駝科血清的天然不含輕鏈的僅由兩條重鏈組成的駱駝抗體中的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。
在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體包含兩個特異性結合VEGF的Fab片段以及兩個特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點(例如，VHH)，分別具有第1A圖、第1B圖、第1D圖、第11A圖和第11B圖中例示的任一結構。所述兩個特異性結合VEGF的Fab片段特異性結合VEGF分子上的相同表位或者不同表位；所述兩個特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點特異性結合GITR分子上的相同表位或者不同表位。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合VEGF的Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體Avastin的SEQ ID NO：22/20的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合VEGF的Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體Avastin的SEQ ID NO：22/20的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。
在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點包含GFAFGSS(SEQ ID NO：25)所示的CDR1、SGGGFGD(SEQ ID NO：26)所示的CDR2和ATDWRKP(SEQ ID NO：27)所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。
又在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體中的所述特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
不特別地限制本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體中重鏈恆定區CH1結構域和Fc區(包含CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域)的類型，較佳地是衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白重鏈恆定區的相應結構域，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更較佳地，所述重鏈恆定區CH1結構域和Fc區衍生自人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區。在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體包含IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的CH1結構域和Fc區。又在一個實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的CH1結構域和IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的Fc區；或者包含IgG1(例如，人IgG1)重鏈恆定區的CH1結構域和IgG4(例如，人IgG4)重鏈恆定區的Fc區。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的第二多肽鏈和/或第四多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是LALA突變。
在又一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體包含κ輕鏈恆定區和/或λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區和/或人λ輕鏈恆定區。在一個實施方案中，輕鏈恆定區包含在SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的第二多肽鏈和第四多肽鏈在各自的Fc結構域中分別包含“結入扣”的穩定締合。在一 個實施方案中，在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在所述第二多肽鏈和第四多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第二多肽鏈和第四多肽鏈的正確配對。
在一個實施方案中，本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的所述凸起或空穴可分別置於CL結構域中的所述空穴或凸起中，從而本發明抗VEGF/GITR雙特異性抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。
在具體的實施方案中，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體能夠同時與GITR和VEGF蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷VEGF家族信號傳導途徑以及活化效應T細胞和自然殺傷(NK)細胞中的GITR/GITR配體 信號傳導途徑。本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體能夠用於與所述信號傳導途徑相關的疾病的治療、預防或診斷。
III．本發明的抗體分子變體
在某些實施方案中，構思了本文例示的雙特異性抗體的胺基酸序列變體。例如，可能想要改善雙特異性抗體的結合親和力和/或其他生物學特性。可以藉由向編碼雙特異性抗體的核苷酸序列引入適宜修飾或藉由肽合成製備雙特異性抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如從抗體的胺基酸序列內部缺失殘基和/或將殘基插入所述胺基酸序列中和/或置換所述胺基酸序列中的殘基。可以產生缺失、插入和置換的任意組合以獲得最終構建體，只要所述最終構建體擁有想要的特徵，例如抗原結合作用。
表1中在“保守性置換”標題下顯示保守性置換。表1中在“示例性置換”標題下顯示並且參考胺基酸側鏈類別如下文進一步描述更明顯的變化。可以將胺基酸置換引入目的抗體中並且對產物篩選所需的活性，例如，保留/改善的抗原結合作用或降低的免疫原性。
胺基酸可以根據常見的側鏈特性分組：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；(2)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置換將使這些分類之一的成員交換為另一個分類的成員。
IV．免疫綴合物
本發明的抗體分子能夠重組融合於或化學綴合(包括共價和非共價綴合)至異源蛋白或多肽以產生融合蛋白。蛋白質、多肽或肽與抗體融合或綴合的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利號5,336,603、5,622,929和EP 367,166。
另外，本發明的抗體分子可以與標記序列(如肽)融合以促進純化。在較佳的實施方案中，標記胺基酸序列是六組胺酸肽，如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)等中提供的標簽，它們中的許多是可商業獲得的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六組胺酸提供融合蛋白的便利純化。用於純化的其他肽標簽包括但不限於血凝素(“HA”)標簽，其對應於源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)和“flag”標簽。
在其他實施方案中，本發明的抗體分子與診斷劑或可檢測劑綴合。這類抗體可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測物質偶聯實現這類診斷和檢測，所述可檢測物質包括但不限於多種酶，如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，如但不限於鏈黴親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，如但不限於傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質，如但不限於魯米諾；生物發光物質，如但不限於螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；放射性物質，如但不限於碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In和111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；和用於各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。
本發明還包括與治療性部分綴合的抗體分子的用途。抗體分子可綴合到治療性部分，如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或細胞殺傷劑)，治療劑或放射性金屬離子，例如α發射體。術語“細胞毒素”或“細胞毒性劑”包括有害於細胞的任何物質。
另外，本發明的抗體分子可以與調節給定生物學反應的治療性部分或藥物部分綴合。治療性部分或藥物部分不得解釋為限於經典的化學治療藥。例如，藥物部分可以是擁有所需生物學活性的蛋白質、肽或多肽。這類蛋白質可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、霍 亂毒素、或白喉毒素；蛋白質如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活物、凋亡劑、抗血管生成劑或生物學反應調節物，例如淋巴因子。
另外，本發明的抗體分子可以綴合至治療性部分如放射性金屬離子，如α-發射體如213Bi或可用於使放射金屬離子(包括但不限於131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)綴合至多肽的大環螯合劑。在某些實施方案中，大環螯合劑是1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(DOTA)，其可藉由接頭分子附著到抗體上。這類接頭分子是本領域公知的並且在Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90中描述，所述文獻每篇藉由引用的方式完整併入。
用於治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的，參見，例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編著)，第243-256頁(Alan R.Liss,Inc.1985)。
抗體也可以連接至固相支持物，所述支持物特別可用於免疫測定法或靶抗原的純化。此類固相支持物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
V．本發明的抗體分子的生產和純化
本發明的抗體分子可以例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組生產獲得。為了重組生產，將編碼所述抗體分子的任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈的多核苷酸分離並插入一個或多個載體中以便進一步在宿主細胞中選殖和/或表達。使用常規方法，可以輕易地分離所述多核苷酸並將其測 序。在一個實施方案中，提供了包含本發明的一種或多種多核苷酸的載體，較佳地表達載體。
可以使用本領域技術人員熟知的方法來構建表達載體。表達載體包括但不限於病毒、質粒、粘粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。
一旦已經製備了用於表達的包含本發明的一種或多種多核苷酸的表達載體，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質體的轉染或其他常規技術。
在一個實施方案中，提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了包含本發明表達載體的宿主細胞。如本文所用，術語“宿主細胞”指可以工程化以產生本發明的抗體分子的任何種類的細胞系統。適於複製和支持本發明的抗體分子表達的宿主細胞是本領域熟知的。根據需要，這類細胞可以用特定表達載體轉染或轉導，並且可以培育大量含有載體的細胞用於接種大規模發酵器以獲得足夠量的本發明抗體分子用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌，真核微生物如絲狀真菌或酵母，或各種真核細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞等。可以使用適於懸浮培養的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK 293或293F細胞)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(Hep G2)、CHO細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編著，Humana Press，Totowa， NJ)，第255-268頁(2003)。在一個較佳的實施方案中，所述宿主細胞是CHO、HEK293或NSO細胞。
本領域已知在這些宿主細胞系統中表達外源基因的標準技術。在一個實施方案中，提供了產生本發明的抗體分子的方法，其中所述方法包括在適於表達所述抗體分子的條件下培養如本文中提供的宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼所述抗體分子的多核苷酸，並且從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體分子。
如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於如淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對本領域技術人員是顯而易見的。
可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，所述熟知分析方法包括大小排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。可以藉由本領域已知的多種測定法，鑒定、篩選或表徵本文提供的抗體分子的物理/化學特性和/或生物學活性。
VI.藥物組合物和試劑盒
在另一個方面，本發明提供了組合物，例如，藥物組合物，所述組合物包含與可藥用載體配製在一起的本文所述的抗體分子。如本文所用，“可藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。本發明的藥物組合物適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如，藉由注射或輸注)。
本文中還公開了本文所述的抗體分子與一種以上治療劑組合後獲得的組合物，所述治療劑選自以下類別(i)-(iii)中的一個、兩個或全部類別：(i) 增強抗原呈遞(例如，腫瘤抗原呈遞)的藥物；(ii)增強效應細胞反應(例如，B細胞和/或T細胞活化和/或動員)的藥物；或(iii)減少免疫抑制的藥物。
本發明的組合物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、分散體劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的較佳組合物處於可注射用溶液劑或可輸注溶液劑形式。較佳的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內)注射。在一個較佳實施方案中，藉由靜脈內輸注或注射施用抗體分子。在另一個較佳實施方案中，藉由肌內、腹腔或皮下注射施用抗體分子。
如本文所用的短語“腸胃外施用“和“腸胃外方式施用”意指除了腸施用和局部施用之外的施用模式，通常藉由注射施用，並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、皮內、腹腔、經氣管、皮下注射和輸注。
治療性組合物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組合物配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或凍幹形式。可以藉由將活性化合物(即抗體分子)以要求的量加入適宜的溶劑中，隨後過濾消毒，製備無菌可注射溶液劑。通常，藉由將所述活性化合物併入無菌溶媒中來製備分散體，所述無菌溶媒含有基礎分散介質和其他成分。可以使用包衣劑如卵磷脂等。在分散體的情況下，可以藉由使用表面活性劑來維持溶液劑的適宜流動性。可以藉由在組合物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鹽和明膠而引起可注射組合物的延長吸收。
在某些實施方案中，可以口服施用本發明的抗體分子，例如隨惰性稀釋劑或可食用載體一起經口施用。本發明的抗體分子也可以封閉在硬殼或 軟殼明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接摻入受試者的膳食中。對於口服治療施用，所述化合物可以隨賦形劑一起摻入並且以可攝取的片劑、頰用片劑、錠劑(troche)、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)等形式使用。為了藉由非腸胃外施用方法施用本發明的抗體分子，可能需要將所述抗體分子與防止其失活的材料包衣或隨這種材料共施用。還可以用本領域已知的醫療裝置施用治療組合物。
本發明的藥物組合物可以包含“治療有效量”或“預防有效量”的本發明所述抗體分子。“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量等變動治療有效量。治療有效量是任何有毒或有害作用不及治療有益作用的量。相對於未治療的受試者，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更較佳地至少約40%、甚至更較佳地至少約60%和仍更較佳地至少約80%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價本發明的抗體分子抑制可度量參數(例如，腫瘤體積)的能力。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在受試者中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量小於治療有效量。
包含本文所述抗體分子的試劑盒也處於本發明的範圍內。試劑盒可以包含一個或多個其他要素，例如包括：使用說明書；其他試劑，例如標記物或用於偶聯的試劑；可藥用載體；和用於施用至受試者的裝置或其他材料。
VII.抗體分子的用途
本文公開的抗體分子具有體外和體內診斷用途以及治療性和預防性用途。例如，可以將這些分子施用至體外或離體的培養細胞或施用至受試者，例如，人類受試者，以治療、預防和/或診斷多種抗原相關的疾病，例如癌症、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)。
在一個方面，本發明提供了體外或體內檢測生物樣品，例如血清、精液或尿或組織活檢樣品(例如，來自過度增生性或癌性病灶)中存在相關抗原的診斷方法。該診斷方法包括：(i)在允許相互作用發生的條件下使樣品(和任選地，對照樣品)與如本文所述的抗體分子接觸或向受試者施用所述抗體分子和(ii)檢測所述抗體分子和樣品(和任選地，對照樣品)之間複合物的形成。複合物的形成表示存在相關抗原，並且可以顯示本文所述治療和/或預防的適用性或需求。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測相關抗原。可以使用的檢測方法包括免疫組織化學、免疫細胞化學、FACS、ELISA測定、PCR技術(例如，RT-PCR)或體內成像技術。一般地，體內和體外檢測方法中所用的抗體分子直接或間接地用可檢測物質標記以促進檢測結合的或未結合的結合物。合適的可檢測物質包括多種生物學活性酶、輔基、螢光物質、發光物質、順磁(例如，核磁共振活性)物質和放射性物質。
在一些實施方案中，體內確定相關抗原的水平和/或分佈，例如，以非侵入方式確定(例如，藉由使用合適的成像技術(例如，正電子發射斷層攝影術(PET)掃描)檢測可檢測物標記的本發明抗體分子。在一個實施方案中，例如， 藉由檢測用PET試劑(例如，18F-氟脫氧葡萄糖(FDG))以可檢測方式標記的本發明抗體分子，體內測定相關抗原的水平和/或分佈。
在一個實施方案中，本發明提供了包含本文所述抗體分子和使用說明書的診斷試劑盒。
在另一個方面，本發明涉及使用本發明的抗體分子體內用來治療或預防需要在受試者中調節免疫應答的疾病，從而抑制或減少相關疾病如癌性腫瘤、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)的出現或復發。可以單獨使用本發明的抗體分子。備選地，抗體分子可以與其他癌症治療劑/預防劑組合施用。當本發明的抗體分子與一種或多種其他藥物組合施用時，這種組合可以按任何順序施用或者同時施用。
因此，在一個實施方案中，本發明提供一種調節受試者中免疫應答的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的抗體分子。在另一個實施方案中，本發明提供一種防止受試者中疾病出現或者復發的方法，所述方法包括向受試者施用預防有效量的本文所述的抗體分子。
在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的癌包括但不限於實體瘤、血液學癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多發性骨髓瘤)及轉移性病灶。在一個實施方案中，癌是實體瘤。實體瘤的例子包括惡性腫瘤，例如，多個器官系統的肉瘤和癌，如侵襲肺、乳房、卵巢、淋巴樣、胃腸道的(例如，結腸)、肛門、生殖器和生殖泌尿道(例如，腎、膀胱上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽、CNS(例如，腦、神經的或神經膠質細胞)、頭和頸、皮膚(例如，黑素瘤)、鼻咽(例如，分化或未分化的轉移性或局部復發性鼻咽癌)和胰的那些癌、 以及腺癌，包括惡性腫瘤，如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。
在一些實施方案中，癌選自黑素瘤、乳腺癌、結腸癌、食管癌、胃腸道間質腫瘤(GIST)、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤、胃癌、血液學惡性病(例如，淋巴瘤)。
在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原體或常規疫苗對其未及完全有效的病原體。這些包括但不限於HIV、(甲型、乙型和丙型)肝炎、流感、皰疹、賈弟鞭毛蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。本發明例示的抗體分子對PD-L1阻斷作用特別可用來對抗隨感染過程推移出現變異抗原的病原體(如HIV)所建立的感染。這些變異抗原在施用抗人PD-L1抗體時能夠被視為外來抗原，由此，本發明例示的抗體分子能夠藉由PD-L1激發不受負向信號抑制的強烈T細胞反應。
在一些實施方案中，用本發明的抗體分子治療和/或預防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，來下調免疫系統。可以藉由施用本發明抗體分子治療和/或預防的自身免疫疾病的例子包括但不限於斑禿、僵直性脊柱炎、自身免疫性肝炎節段性回腸炎、紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎等。可以藉由施用本發明抗體分子治療和/或預防的炎性疾病的例子包括但不限於哮喘、腦炎、炎性腸病、過敏性疾病、敗血性休克、肺纖維化、關節炎和因慢性病毒性或細菌性感染產生的慢性炎症。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
實施例 實施例1.抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的構建、表達、純化及性質鑒定 實施例1.1.抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的構建
在本實施例中，構建了4種結構的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體，分別命名為(1)雙特異性抗體Bi-110-112HC，其結構示意圖如第1A圖所示；(2)雙特異性抗體Bi-113-112HC，其結構示意圖如第1B圖所示；(3)雙特異性抗體Bi-119-112LC，其結構示意圖如第1C圖所示；和(4)雙特異性抗體Bi-122-112LC，其結構示意圖如第1D圖所示。下面對這四種抗OX40/PD-L1雙特異性抗體分別進行描述。
(1)從第1A圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-110-112HC由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。具體而言，在SEQ ID NO：6所示的肽鏈#1中從N端至C端包含衍生自抗OX40抗體ADI-20112的SEQ ID NO：7所示的VL胺基酸序列、在所述VL胺基酸序列C端的SEQ ID NO：8所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列、在所述人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列C端的SEQ ID NO：9所示的連接肽胺基酸序列、以及在所述連接肽胺基酸序列C端的SEQ ID NO：2所示的抗PD-L1 VHH胺基酸序列。在SEQ ID NO：10所示的肽鏈#2中包含衍生自抗OX40單株抗體ADI-20112的SEQ ID NO：11所示的VH胺基酸序列、在所述VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：12所示的CH1胺基酸序列、以及在所述CH1胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：13所示的Fc區胺基酸序列。
(2)從第1B圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-113-112HC由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。具體而言，在SEQ ID NO：14所示的肽鏈#1中從N端至C端包含SEQ ID NO：2所示的抗PD-L1 VHH胺基酸序列、SEQ ID NO：9所示的連接肽胺基酸序列、SEQ ID NO：7所示的衍生自抗OX40抗體ADI-20112的VL胺基酸序列、以及SEQ ID NO：8所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列。肽鏈#2具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
(3)從第1C圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-119-112LC由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。具體而言，在SEQ ID NO：15所示的肽鏈#1中從N端至C端包含SEQ ID NO：7所示的衍生自抗OX40抗體ADI-20112的VL胺基酸序列和SEQ ID NO：8所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列。在SEQ ID NO：16所示的肽鏈#2中從N端至C端包含SEQ ID NO：11所示的衍生自抗OX40單株抗體ADI-20112的VH胺基酸序列、衍生自人IgG1的CH1胺基酸序列、SEQ ID NO：2所示的抗PD-L1 VHH胺基酸序列和SEQ ID NO：13所示的衍生自人IgG1 Fc區的胺基酸序列。
(4)從第1D圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-122-112LC由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，其中，所述肽鏈#2從N端至C端包含SEQ ID NO：2所示的抗PD-L1 VHH胺基酸序列、SEQ ID NO：9所示的連接肽胺基酸序列、SEQ ID NO：11所示的衍生自抗OX40 單株抗體ADI-20112的VH胺基酸序列、SEQ ID NO：12所示的衍生自人IgG1的CH1胺基酸序列、和SEQ ID NO：13所示的衍生自人IgG1 Fc區的胺基酸序列。
實施例1.2.抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的表達、純化和分析
在本實施例中，將編碼實施例1.1中構建的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的肽鏈#1、肽鏈#2的核苷酸序列分別藉由多選殖位點連接入市售的真核表達載體pTT5，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-110-112HC、Bi-113-112HC、Bi-119-112LC和Bi-122-112LC。具體操作如下。
委託蘇州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了雙特異性抗體Bi-110-112HC、Bi-113-112HC、Bi-119-112LC和Bi-122-112LC的上述各肽鏈的編碼核苷酸序列。使用合適的限制性內切酶和連接酶將所合成的編碼肽鏈的核苷酸序列分別連接入載體pTT5中，獲得了分別含有所述編碼肽鏈的核苷酸序列的重組載體。
所述重組載體經測序驗證正確後用於隨後的表達。
將HEK293細胞(購自Invitrogen公司)傳代培養於Expi293細胞培養液(購自Invitrogen公司)中。轉染前一天離心細胞培養物，獲得細胞沉澱，用新鮮的Expi293細胞培養液懸浮細胞，將細胞密度調整為1×106個細胞/ml。繼續培養HEK293細胞，使得轉染當天的培養物中細胞密度約為2×106個細胞/ml。取HEK293細胞懸浮液終體積1/10的F17培養基(購自Gibco公司，產品目錄號A13835-01)作為轉染緩衝液。向每毫升轉染緩衝液中加入200μg的1：1摩爾比率的上述製備的分別包含編碼肽鏈#1或肽鏈#2的核苷酸序列的重組質粒，混勻，再加入聚乙烯亞胺(polyethylenimine(PEI))(Polysciences，目錄號：23966)30μg， 混勻，室溫溫育10分鐘後，將PEI/DNA混合物輕柔倒入HEK293細胞懸浮液中。輕輕混勻，置於8%CO2、36.5℃過夜培養。
過夜培養後，向培養瓶中補加轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的FEED(Sigma，目錄號：H6784-100G)和轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的葡萄糖溶液，輕輕混勻，置於8%CO2、36.5℃繼續培養。20小時後，加入VPA(Gibco，目錄號：11140-050)至終濃度為2mM/L。連續培養至第7天或者細胞活力
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60%時，收集培養物，以7500轉/分鐘離心30分鐘，取細胞上清，使用SARTOPORE(Sartorius，目錄號：5441307H4)過濾後，在AKTApure系統(GE Healthcare)上藉由親和層析進行純化。
具體的親和層析純化操作步驟為：選用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目錄號：17-5438-03)親和層析柱，並置於AKTApure系統內。用0.1M NaOH對裝備有MabSelect SuRe親和層析柱的AKTApure系統過夜除內毒，然後用5倍柱體積的結合緩衝液(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH 7.2)清洗系統以及平衡柱子。將上述過濾後的細胞上清通過柱。用5至10倍柱體積的結合緩衝液再平衡，使用AKTApure系統配備的紫外檢測裝置監測至紫外走平。然後，用洗脫緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM，pH 3.5)洗脫抗體，根據紫外吸收值來收集樣品。每1ml的收集液加80μl的中和緩衝液(Tris-HCl 2M)中和備用。
利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測收集的各級分管中樣品的純度。SEC結果分別如第2A圖、第2B圖、第2C圖和第2D圖所示，雙特異性抗體Bi-110-112HC純度為71.40%，Bi-113-112HC純度為84.54%，Bi-119-112LC純度為99.43%，Bi-122-112LC純度為94.79%。
將純化後的雙特異性抗體溶液使用15ml超濾離心管，4500轉/分鐘離心30分鐘。使用PBS將蛋白稀釋後繼續離心，4500轉/分鐘離心30分鐘，重複該操作2次，以更換緩衝液。將更換緩衝液後的抗體合併，測抗體濃度。
在後續實驗中選取單體主峰純度為99.43%的雙特異性抗體Bi-119-112LC進行進一步的研究。
實施例1.3.測定抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的解離常數
使用Octet系統(ForteBio公司生產)藉由動力學結合測定法確定本發明的上述示例性抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC結合OX40和PD-L1的平衡解離常數(KD)。按照文獻中報導的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013，5(2)：p.270-278)進行ForteBio親和力測定。簡言之，在實驗開始前半個小時，將AHC傳感器(Pall，目錄號：1506091)浸泡於SD緩衝液(PBS 1×，BSA 0.1%，吐溫200.05%)中於室溫平衡。向96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner)的孔中分別加入100μl的SD緩衝液作為空白對照(用於扣除背景)、100μl 100nM純化的雙特異性抗體Bi-119-112LC和作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體(PCT/CN2017/095884)、抗OX40抗體ADI-20112(中國發明專利申請號201710185400.8)、100μl稀釋於SD緩衝液中作為抗原的人PD-L1-his(100nM)和人OX40-his(100nM)(Acrobiosystems)的溶液。將抗人IgGFc生物傳感器AHC浸沒於分別含所述抗體溶液的孔中，在室溫浸沒600秒上樣。隨後將傳感器在SD緩衝液中洗滌至達到基線，然後浸沒於含100μl抗原溶液的孔中，監測抗體與抗原的結合。隨後將傳感器轉移至含有100μl SD緩衝液的孔，監測抗體解離。 轉速為400轉/分鐘，溫度為30℃。藉由Octet分析軟件(ForteBio)擬合經背景校正的結合曲線和解離曲線，產生結合(kon)和解離(kdis)速率常數，它們隨後用來計算平衡解離常數(KD)。表1和表2中顯示了雙特異性抗體Bi-119-112LC與抗原OX40或PD-L1的kon、kdis和KD數據。
藉由以上數據可見，本發明的雙特異性抗體Bi-119-112LC能夠同時與溶液中的PD-L1和OX40蛋白結合，且維持了親本抗體ADI-20112和人源化Nb-Fc與各相應抗原的親和力常數。
實施例1.4.本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體與過量表達OX40或PD-L1的CHO細胞的結合分析
藉由FACS測量了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC與過量表達OX40或PD-L1的CHO細胞的結合。
簡而言之，使用ExpiCHOTM Expression System Kit(Invitrogen，目錄號：A29133)，根據製造商的說明書實施如下操作：將攜帶純株至多選殖位點MCS的人PD-L1 cDNA(Sino Biological Inc.)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)(Invitrogen)，產生過量表達人PD-L1的CHO細胞(CHO-PD-L1細胞)。將CHO-PD-L1細胞計數，用細胞培養基稀釋至1×106個細胞/ml，向U型底96孔板中以100μl/孔加入。在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。分別將100μl系列稀釋的本發明的雙特異性抗體Bi-119-112LC和作為對照的人源化Nb-Fc加入U型板並重懸細胞，冰上靜置30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清，藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的抗體。400g離心5分鐘，去除PBS。每孔加入100μl 1：200稀釋的PE綴合的抗人Fc抗體(SOUTHERN BIOTECH)，冰上避光培養30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清。藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的PE綴合的抗人Fc抗體。用100μl PBS重懸細胞，藉由FACS檢測抗體與細胞的結合。結果見第3圖。
由第3圖可見，本發明的雙特異性抗體Bi-119-112LC能夠與細胞表面表達的PD-L1相結合，結合EC50為2.654nM，與親本抗PD-L1抗體對細胞表面表達的PD-L1的結合能力(EC50為1.940nM)相似。
同樣地，藉由將攜帶純株至多選殖位點MCS的人OX40 cDNA(Sino Biological Inc.)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)(Invitrogen)，產生過量表達人OX40的CHO細胞(CHO-OX40細胞)。
對CHO-OX40實施FACS檢測，除了使用的細胞不同和使用ADI-20112抗體作為對照抗體之外，其餘實驗操作均與上述CHO-PD-L1細胞的FACS檢測一樣。
結果如第4圖所示。由第4圖可見，本發明的雙特異性抗體Bi-119-112LC能夠與細胞表面表達的OX40相結合，結合EC50為3.195nM，與親本抗OX40抗體對細胞表面表達的OX40的結合能力(EC50為2.193nM)相似。
實施例1.5.本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體同時結合過量表達OX40的CHO細胞和過量表達PD-L1的CHO細胞的分析-
為了驗證本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC是否可以同時與來自不同細胞上的靶抗原結合，本實施例利用流式細胞技術，檢測了所述雙特異性抗體誘導的不同細胞交聯情況。具體實驗過程如下。
1)如實施例1.4所述獲得CHO-PD-L1細胞和CHO-OX40細胞並培養。分別將含有CHO-PD-L1細胞和CHO-OX40細胞的培養物在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。用PBS洗一遍後，再用PBS重懸細胞。計數細胞，並調整細胞密度為2×106個細胞/ml。將CHO-PD-L1細胞和CHO-OX40細胞分別按照1：5000加入CellTrackerTM Deep Red(Thermo)和Cell Trace CFSE(Invitrogen)染料，於37℃放置30分鐘。在離心機上以400g離心5分鐘，去除上清液，用PBS洗一次細胞。
2)將梯度稀釋的樣品(抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體(PCT/CN2017/095884)、和抗OX40抗體ADI-20112(中國發明專利申請號201710185400.8))分別加入U型底96孔板中。加入上述1)的染色後CHO-PD-L1細胞，混合(細胞終密度為1.5×106個/ml)。將U型底96孔板4℃放置30分鐘後取出板，於400g離心5分鐘，然後用PBS洗四次，並用PBS重懸細胞。
3)向U型底96孔板的上述2)的細胞懸液中加入上述1)的染色後的CHO-OX40細胞，使得CHO-OX40細胞終密度為1×106個/ml，於室溫放置1小時後進行FACS檢測。通道2及通道4雙陽性細胞的比例可反映出由抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC引起的細胞交聯情況。
FACS檢測結果如第5圖所示，抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC能夠誘導CHO-PD-L1細胞和CHO-OX40細胞的交聯，由此表明本發明的雙特異性抗體能夠同時結合來自不同細胞表面的靶抗原。本實施例中使用的IgG1陰性對照的重鏈(HC)胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示；IgG1陰性對照的輕鏈(LC)胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示。
實施例1.6.本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體阻斷PD-1與過量表達PD-L1的CHO細胞的結合分析
為了驗證本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體是否可以阻斷PD-1與過量表達PD-L1的CHO細胞結合，本實施例利用流式細胞技術，檢測了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體阻斷PD-1蛋白與過量表達PD-L1的CHO細胞結合，詳細實驗過程如下：
1)如實施例1.4所述獲得CHO-PD-L1細胞並培養。將含有2.4×107個CHO-PD-L1細胞的培養物在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。用PBS洗一遍後，再用5ml PBS重懸細胞。
2)細胞鋪板：將1)中處理好的CHO-PD-L1細胞每孔50μl加入到96孔U底血凝板中備用。
3)梯度濃度樣品溶液配製：向5ml PBS中加入生物素化的人PD-1蛋白(AcroBiosystems,PD1-H82F2)200μl(人PD-1蛋白濃度0.2mg/ml)，混勻。用生物素化的人PD-1和PBS混合液將待測樣品稀釋為：以1000nM為起始濃度，後面11個濃度點3倍稀釋，共12個濃度點。
4)將配置好的梯度濃度樣品每孔50μl加入到2)中鋪好細胞的96孔U底血凝板中，混勻，4℃，培養30分鐘，400g，5min，離心，去除上清，每孔加入150μl PBS，400g，5min，離心，去除上清，反復重複三次。
5)每孔加入1：200稀釋的Streptavidin-R-phycoerythrin(SAPE)(THERMO，S21388)100μl，4℃，30min。
6)每孔加入150μl PBS，400g，5min，離心，去除上清，反復重複兩次，用100μl PBS重懸，流式細胞儀(BD Biosciences,ACCURIC6)檢測。
本實施例中使用的IgG1陰性對照同上述實施例1.5中使用的IgG1陰性對照。實驗結果如第6圖所示，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC可以有效阻斷PD-1與過量表達PD-L1的CHO細胞的結合，且阻斷活性與抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體相似(抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的IC50為3.522nM，抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體的IC50為4.906nM)。
實施例1.7.基於螢光素酶報告基因檢測抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的抗PD-L1活性
為了確定抗OX40/PD-L1雙特異性抗體是否可以解除PD-1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的抑制作用，本實施例使用螢光素酶報告基因檢測細胞株(Promega,CS187109)，藉由檢測螢光素酶的表達反應出雙特異性抗體對PD-1/PD-L1相互作用的抑制能力，詳細實驗過程如下：考慮到對抗體的探索應該建立在對其作用機制(mechanisms of action；MOA)的瞭解和生物學活性的基礎上，本實施例使用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay,Cell Propagation Model(Promega公司)，研究了本發明的雙特異性抗體的抗PD-L1生物學活性。
Promega公司的PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay是一種生物學相關的基於MOA的測定法，用於測定能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用的抗體的效力和穩定性。該測定法由兩種基因工程細胞系組成：
‧PD-1效應細胞：穩定表達人PD-1和由活化的T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells；NFAT)誘導表達螢光素酶的Jurkat T細胞。
‧PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞：穩定表達人PD-L1的CHO-K1細胞和以抗原非依賴性方式活化相應TCR的細胞表面蛋白。
PD-1與PD-L1結合可以阻斷NFAT下游信號的轉導，從而抑制螢光素酶的表達，當加入PD-1抗體或者PD-L1抗體時，這種阻斷效應被反轉，螢光素酶表達，從而檢測到螢光信號。該檢測法靈敏度、特異性、準確度都很好，且穩定性很好。
根據製造商的產品說明書進行檢測。
1)活性檢測前一天鋪PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞：棄培養上清，PBS清洗一次，加入胰酶(Gibco,25200072)，37℃，培養3-5min，用四倍體積的含10%FBS(HyClone,SH30084.03)的RPMI1640(Gibco,22400-071)培養基終止消化，收集細胞，取少量細胞混合液測定細胞濃度，取所需體積的細胞液，400g，離心10min，棄上清，用含10%FBS(HyClone,SH30084.03)的RPMI1640(Gibco,22400-071)培養基作為測定緩衝液(assay buffer)重懸細胞，使得細胞密度為4×105個細胞/ml。將細胞懸液加入96孔白色細胞培養板(Nunclon，136101)100μL/孔，96孔白色細胞培養板的邊孔加入PBS，200μl/孔。細胞於二氧化碳培養箱中37℃，5%CO2培養箱中培養過夜。
2)取無菌96孔板(Nunclon，442404)，用含10%FBS的RPMI1640培養基將待測樣品稀釋為：以200nM為起始濃度，第二個濃度點2至第12濃度點3倍稀釋，共12個濃度點。
3)取PD-1效應細胞，計數，400g，離心5min，用assay buffer重懸細胞，使得細胞濃度為1.25×106cells/ml。
4)從培養箱中取出白色細胞培養板，棄95μl/孔，依次加入2)中稀釋好的抗體40μl以及3)中處理好的細胞，每孔40μl Jurkat/PD-1細胞。
5)二氧化碳培養箱中37℃，5%CO2培養條件下培養6小時。
6)取出白色細胞培養板，室溫靜置5-10min。
7)將Bio-GloTM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-GloTM底物(Promega，G7940)，混勻。將所獲得的Bio-GloTM試劑以80μl/孔加入上述培養6小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘。
8)用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。
本實施例中使用的IgG1陰性對照同上述實施例1.5中使用的IgG1陰性對照。實驗結果如第7圖所示，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC可以有效解除PD1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的阻斷效應，且活性與抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體相似(抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的EC50為0.4585nM，抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體的EC50為0.3283nM)。
實施例1.8.基於螢光素酶報告基因檢測本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體介導PD-L1依賴的激活OX40介導的信號通路的檢測
為了檢測本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體在實施例1.4所述獲得CHO-PD-L1細胞存在的情況下，激活OX40介導的信號通路生物活性。本實施例使用信達生物製藥(蘇州)有限公司的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep穩定細胞株，測量OX40介導的轉錄活化來評估本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體是否具有抗OX40抗體的激活劑活性。用抗人CD3(BD Biosciences，目錄號：555329)、抗人CD28(BD Biosciences，目錄號：555725)加上溶液中的本發明的抗體來活化導入了人OX40構建體(購自Sino)和NFkB-螢光素酶構建體(NFkB啟動子-luc，Promega)並過量表達人OX40的Jurkat細胞(獲自美國ATCC)持續16小時，然後加入Bio-GloTM試劑顯色。具體實驗過程如下：溶液配製：分析緩衝液：RPIM-1640(90%)(Gibco，22400-071)，FBS(10%)(HyClone，SH30084.03)，抗人CD3(2μg/ml)(BD Biosciences，目錄號：555329)，抗人CD28(2μg/ml)(BD Biosciences，目錄號：555725)，現配現用。
實驗步驟：
1)取少量細胞懸液，用細胞計數板測定細胞密度，400g，離心10min，去掉上清，使用分析緩衝液溫和的重懸細胞，Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞密度為4×105個/ml；CHO-PD-L1細胞密度為4×105個/ml。
2)將細胞懸液移至加樣槽中，取96孔白色細胞培養板(NUNC，目錄號：136101)。每孔加入1)中處理好的50μL Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞和50μL CHO-PD-L1細胞懸液，加入待測樣品，樣品的起始濃度為100nM，第二個濃度點2至第13濃度點3倍稀釋，共13個濃度點，一式三份重複。
3)二氧化碳培養箱中37℃，5%CO2培養條件下培養16小時。
4)將Bio-GloTM緩衝液(Promega，目錄號：G7940)融化，加入Bio-GloTM底物(Promega，目錄號：G7940)，混勻。將所獲得的Bio-GloTM試劑以80μl/孔加入上述培養16小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。
本實施例中使用的IgG1陰性對照同上述實施例1.5中使用的IgG1陰性對照。實驗結果如第8圖所示，在有PD-L1表達的細胞體系中，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC具有顯著的NFkB信號通路的激活作用，而抗OX40抗體ADI-20112則檢測到較低的NFkB信號通路激活效應，抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體沒有NFkB信號通路激活效應。本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體顯示出了在PD-L1表達的細胞存在的情況下，能夠更好的激活OX40下游的NFkB信號通路。
實施例1.9.本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的熱穩定性檢測
差示掃描螢光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能夠根據蛋白質圖譜中的螢光變化過程提供有關蛋白質結構穩定性的信息，檢測蛋白的構型變化，獲得蛋白質的熔解溫度(Tm)。本實施例採用DSF法測定了本發明抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的Tm值。
將本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC抗體分別用PBS溶液稀釋至1mg/ml。
向4μl SYPRO Orange Protein Gel Stain(Gibco，目錄號：S6650)中加入196μl PBS，將SYPRO Orange Protein Gel Stain稀釋50倍。
向96孔PCR板(Nunc)中加入50μl的上述濃度為1mg/ml的雙特異性抗體，並加入10μl的上述50倍稀釋的SYPRO Orange Protein Gel Stain，然後加入40μl水。置於7500 Real Time PCR系統(Applied Biosystems,AB/7500)進行檢測。設置系統溫度為每分鐘升高0.5度，螢光曲線絕對值出現峰值時對應的溫度即為該蛋白質的Tm。
實驗結果如下表3和第9圖所示。本發明的雙特異性抗體Tm>60℃，因此，具有較好的熱穩定性。
實施例1.10本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體的熱穩定性檢測
為了進一步確認雙特異性抗體的穩定性，本實施例藉由檢測製備的一批抗體在40℃放置0、1、3、7、10、20、30天之後的純度的變化，從而評價了抗體的長期熱穩定性。經SEC檢測，所述製備的一批Bi-119-112LC抗體的初始純度為92.91%。實驗方法如下：濃縮抗體樣品至5mg/ml(溶於PBS中)，分裝於EP管中，200μl/管，避光置於40℃。在第0、1、3、7、10、20、30天各取一管利用SEC-HPLC測定其單體主峰純度。
實驗結果如表4所示。本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC在40℃放置30天，其單體主峰比例降低幅度僅為3.69%。結果表明，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體具有較好的熱穩定性。
實施例1.11.本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體對人CD4 +T細胞的激活作用檢測
本實施例檢測了在體外抗OX40/PD-L1雙特異性抗體對人CD4+T細胞的激活作用，詳細實驗過程如下：復蘇人的PBMC細胞(ALLCELLS，PB005F)，靜置3小時貼壁後的細胞即為單核細胞，添加10ml AIM V® Medium CTS(GIBCO，A3021002)培養基，加入IL4(20ng/ml)(R&D，204-IL)，GM-CSF(10ng/ml)(R&D，215-GM)誘導單核細胞分化為樹突狀細胞(即，DC細胞)，培養至第5天，添加誘導DC成熟的細胞因子TNFα(1000U/ml)(R&D，目錄號：210-TA)，RhIL-1β(5ng/ml)(R&D，目錄號：201-LB)，RhIL-6(10ng/ml)(R&D，目錄號：206-IL)，1μM PGE(Tocris，目錄號：2296)，二氧化碳培養箱中37℃，5%CO2培養條件下繼續培養2天，作為淋巴細胞混合反應(MLR)的成熟DC細胞(moDC)；復蘇人的PBMC細胞(ALLCELLS，目錄號：PB005F)，按照人CD4+T細胞富集試劑盒(STEMCELL，目錄號：19052)的說明書，實施CD4+T細胞分離。簡而言之，上述將PBMC靜置培養2小時後吸取的懸浮細胞液置於20ml離心管中，300g離心10分鐘，向細胞沉澱物中加入500μl分離液和100μl試劑盒中配備的純化抗體，4℃培養20分鐘，用分離液清洗一次，再加入500μl珠緩衝液培養15分鐘，磁場去除珠，用AIM V® Medium CTS(GIBCO，目錄號：A3021002)培養基洗一次，使用8ml AIM V® Medium CTS培養基培養獲得的CD4+T細胞。按照CD4+T細胞：抗CD3/CD28珠=1：1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(INVITROGEN，目錄號：11131D)中，二氧化碳培養箱中37℃，5%CO2培養條件下培養3天，對CD4+T細胞實施珠刺激；將上述分離的DC細胞與經珠刺激的CD4+T細胞混合，加入葡萄球菌腸毒素E超抗原(Toxin technology，目錄號：ET404)，終濃度1ng/ml，每孔體積200μl， DC細胞12000個，CD4+T細胞120000個，加入梯度稀釋的抗體，混合培養3天，使用Cisbio IL2檢測試劑盒(CISBIO，目錄號：62HIL02PEG)檢測每個樣品中的IL2表達量，不同抗體IL2表達量反應了該抗體對T細胞的激活能力。
結果如第10圖所示，本發明的抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC可以在體外有效激活人CD4+T細胞，其激活效果比抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、抗OX40抗體ADI-20112更強。
實施例2.抗VEGF/GITR雙特異性抗體的構建、表達、純化及性質鑒定 實施例2.1.抗VEGF/GITR雙特異性抗體的構建
在本實施例中，構建了2種結構的抗VEGF/GITR雙特異性抗體，分別命名為(1)雙特異性抗體Bi-2-50，其結構示意圖如第11A圖所示；和(2)雙特異性抗體Bi-2-51，其結構示意圖如第11B圖所示。下面對這兩種抗VEGF/GITR雙特異性抗體分別進行描述。
(1)從第11A圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-2-50由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。具體而言，在SEQ ID NO：18所示的肽鏈#1中包含衍生自抗VEGF抗體Avastin的SEQ ID NO：20所示的VL胺基酸序列和在所述VL胺基酸序列C端的SEQ ID NO：8所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列；在SEQ ID NO：21所示的肽鏈#2中包含衍生自抗VEGF單株抗體Avastin的SEQ ID NO：22所示的VH胺基酸序列、在所述VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：23所示的CH1胺基酸序列、在所述CH1胺基酸序列C端的SEQ ID NO：9所示的連接肽胺基酸序列和SEQ ID NO：24所示的抗GITR VHH胺基酸序列、以及SEQ ID NO：13所示的衍生自人IgG1的Fc區胺基酸序列。
(2)從第11B圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Bi-2-51由左右對稱的4條多肽鏈組成，其中左半部分的2條多肽鏈(即，肽鏈#1和肽鏈#2)從N端至C端分別具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。在SEQ ID NO：28所示的肽鏈#2中從N端至C端包含SEQ ID NO：22所示的衍生自抗VEGF單株抗體Avastin的VH胺基酸序列、SEQ ID NO：23所示的衍生自人IgG1的CH1胺基酸序列、SEQ ID NO：24所示的抗GITR VHH胺基酸序列、和SEQ ID NO：13所示的衍生自人IgG1 Fc區的胺基酸序列。
實施例2.2.抗VEGF/GITR雙特異性抗體的表達、純化和分析
在本實施例中，將編碼實施例2.1中構建的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51的肽鏈#1、肽鏈#2的核苷酸序列分別藉由多選殖位點連接入市售的真核表達載體pTT5，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51。
質粒轉染、抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51的表達和純化操作同上述實施例1.2。雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51的SEC結果分別如第12A圖和第12B圖所示。
經過純化後，抗VEGF/GITR雙特異性抗體均具有很好的純度，雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51的單體主峰純度分別為99.57%和99.48%。
實施例2.3.測定抗VEGF/GITR雙特異性抗體的解離常數
使用Octet系統(ForteBio公司生產)藉由動力學結合測定法確定本發明的上述示例性抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51結合VEGF和GITR的 平衡解離常數(KD)。除了使用的抗體和抗原不同之外，其他具體實驗過程同上述實施例1.3。檢測結果見下表5和表6。
作為針對GITR的親本單特異性抗體，使用了名為“hcIgG-10”的具有SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列的抗體，其從N端至C端包含SEQ ID NO：24所示的抗GITR VHH胺基酸序列、“DKTHT”肽段和SEQ ID NO：13所示的衍生自人IgG1的Fc區胺基酸序列。
藉由表5和表6中的數據可見，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51均能夠同時與溶液中的VEGF165(R&D，293-VE-500)和GITR(AcroBiosystems，GIR-H5228-1MG)蛋白結合，且維持了親本抗體Avastin或hcIgG-10的親和力常數。
實施例2.4.本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體與過量表達VEGF或GITR的CHO細胞的結合分析
藉由FACS測量了本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51與過量表達VEGF或GITR的CHO細胞的結合。除了使用的抗體和抗原不同之外，其他具體實驗操作同上述實施例1.4。本實施例中使用的IgG1陰性對照同上述實施例1.5中使用的IgG1陰性對照。結果如第13圖所示。
由第13圖可見，本發明的抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50和Bi-2-51均能夠與細胞表面表達的GITR結合，結合EC50分別為2.990nM和3.168nM。親本抗體hcIgG-10與細胞表面GITR結合的EC50為0.6061nM。
儘管已經出於說明本發明的目的顯示了某些代表性實施方案和細節，但是本領域技術人員顯而易見的是可以對它們進行多種變化和修改而不脫離主題發明的範圍。在這個方面，本發明範圍僅由以下申請專利範圍限定。
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司
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<130> P00007CN009
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<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)
<220>
<223> 抗PD-L1抗體的駱駝VHH
<400> 1
Figure TW201946655A_D0009
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1抗體的人源化VHH
<400> 2
Figure TW201946655A_D0010
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)
<220>
<223> 抗PD-L1抗體VH CDR1
<400> 3
Figure TW201946655A_D0011
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)
<220>
<223> 抗PD-L1抗體VH CDR2
<400> 4
Figure TW201946655A_D0012
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)
<220>
<223> 抗PD-L1抗體VH CDR3
<400> 5
Figure TW201946655A_D0013
<210> 6
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-110-112HC肽鏈#1的胺基酸序列
<400> 6
Figure TW201946655A_D0014
Figure TW201946655A_D0015
<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40抗體ADI-20112的VL胺基酸序列
<400> 7
Figure TW201946655A_D0016
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列
<400> 8
Figure TW201946655A_D0017
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接肽胺基酸序列
<400> 9
Figure TW201946655A_D0018
<210> 10
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-110-112HC肽鏈#2的胺基酸序列
<400> 10
Figure TW201946655A_D0019
Figure TW201946655A_D0020
<210> 11
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40單株抗體ADI-20112 VH胺基酸序列
<400> 11
Figure TW201946655A_D0021
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 CH1胺基酸序列
<400> 12
Figure TW201946655A_D0022
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc區胺基酸序列
<400> 13
Figure TW201946655A_D0023
Figure TW201946655A_D0024
<210> 14
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-113-112HC肽鏈#1的胺基酸序列
<400> 14
Figure TW201946655A_D0025
Figure TW201946655A_D0026
<210> 15
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC肽鏈#1的胺基酸序列
<400> 15
Figure TW201946655A_D0027
<210> 16
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-119-112LC肽鏈#2的胺基酸序列
<400> 16
Figure TW201946655A_D0028
Figure TW201946655A_D0029
Figure TW201946655A_D0030
<210> 17
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40/PD-L1雙特異性抗體Bi-122-112LC肽鏈#2的胺基酸序列
<400> 17
Figure TW201946655A_D0031
Figure TW201946655A_D0032
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50肽鏈#1的胺基酸序列
<400> 18
Figure TW201946655A_D0033
<210> 19
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF抗體Avastin重鏈胺基酸序列
<400> 19
Figure TW201946655A_D0034
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF抗體Avastin輕鏈胺基酸序列
<400> 20
Figure TW201946655A_D0035
<210> 21
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-50肽鏈#2的胺基酸序列
<400> 21
Figure TW201946655A_D0036
Figure TW201946655A_D0037
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF單株抗體Avastin VH胺基酸序列
<400> 22
Figure TW201946655A_D0038
<210> 23
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 CH1胺基酸序列
<400> 23
Figure TW201946655A_D0039
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GITR VHH胺基酸序列
<400> 24
Figure TW201946655A_D0040
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GITR VHH CDR1胺基酸序列
<400> 25
Figure TW201946655A_D0041
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GITR VHH CDR2胺基酸序列
<400> 26
Figure TW201946655A_D0042
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GITR VHH CDR3胺基酸序列
<400> 27
Figure TW201946655A_D0043
<210> 28
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF/GITR雙特異性抗體Bi-2-51肽鏈#2的胺基酸序列
<400> 28
Figure TW201946655A_D0044
Figure TW201946655A_D0045
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1重鏈(HC)胺基酸序列
<400> 29
Figure TW201946655A_D0046
Figure TW201946655A_D0047
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1輕鏈(LC)胺基酸序列
<400> 30
Figure TW201946655A_D0048
<210> 31
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GITR抗體hcIgG-10的重鏈(HC)胺基酸序列
<400> 31
Figure TW201946655A_D0049
Figure TW201946655A_D0050

Claims (24)

  1. 一種抗體分子，其包含(i)單結構域抗原結合位點；(ii)結合抗原的Fab片段；其中所述(i)位於所述(ii)的輕鏈可變結構域(VL)的N端或輕鏈恆定區(CL)的C端，或者所述(i)位於所述(ii)的重鏈可變結構域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1結構域的C端，且所述(i)和(ii)分別結合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之間具有或者不具有連接肽；以及位於所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc結構域。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的抗體分子，其中所述單結構域抗原結合位點選自重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、天然缺乏輕鏈的抗體的重鏈可變結構域(例如，駱駝科物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域)、魚類中稱為新型抗原受體(NAR)的免疫球蛋白(如鯊魚血清中天然存在的IgNAR)中的VH樣單結構域、和衍生自它們的經重組的單結構域抗原結合位點(例如，駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域)，例如，所述單結構域抗原結合位點選自駱駝科物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域(它們簡稱為“VHH”)。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體分子，其中所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，較佳地，所述免疫球蛋白是IgG1免疫球蛋白，更較佳地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白；所述免疫球蛋白的輕鏈型別是κ型或λ型，較佳地為κ型。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗體分子，其中所述Fc結構域包含免疫球蛋白恆定部分的鉸鏈區，並且所述抗體分子的重鏈彼此藉 由所述鉸鏈區處的二硫鍵穩定締合，例如，在所述抗體分子的重鏈的Fc結構域中包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，從而所述重鏈彼此藉由所述鉸鏈區處胺基酸殘基之間形成的二硫鍵穩定締合；較佳地，所述抗體分子的重鏈在各自的Fc結構域中還分別包含Y349C和S354C或者S354C和Y349C(根據Kabat的“EU編號”)，從而所述抗體分子的重鏈彼此在Fc區進一步形成鏈間二硫鍵。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的抗體分子，其中所述Fc結構域中還包含影響抗體效應子功能的突變，例如，LALA突變。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的抗體分子，其中所述抗體分子的重鏈在各自的Fc結構域中分別包含凸起或空穴，並且一條重鏈Fc結構域中的所述凸起或空穴可分別置於另一條重鏈Fc結構域中的所述空穴或凸起中，由此所述抗體分子的重鏈彼此形成“結入扣”的穩定締合。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的抗體分子，其中所述免疫球蛋白CH1結構域和輕鏈恆定結構域(CL)中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的所述凸起或空穴可分別置於CL結構域中的所述空穴或凸起中，由此所述抗體分子的重鏈和輕鏈彼此形成“結入扣”的穩定締合。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體分子，其中所述(i)和(ii)分別結合相同抗原上的表位或者不同抗原上的表位，例如，所述(i)結合第一抗原的表位，所述(ii)結合第二抗原上的表位，由此，所述抗體分子是針對第一抗原和第二抗原的雙特異性抗體。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子，其中所述連接肽是單獨或組合使用的甘胺酸和/或絲胺酸殘基，例如，所述連接肽包含胺 基酸序列(Gly 4Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數，例如，n是2。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體分子，其中所述抗原是細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的抗體分子，其中所述抗原選自腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子、血管新生誘導因子、腫瘤壞死因子受體超家族成員和免疫系統中的共刺激分子，以及這些分子的配體和/或受體。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的抗體分子，其中所述抗原選自OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗體分子，其是包含四條多肽鏈的抗體分子，其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈以及位於所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)的N端的單結構域抗原結合位點，例如VHH；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈以及位於所述免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)的C端的單結構域抗原結合位點，例如VHH；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白重鏈以及位於所述免疫球蛋白重鏈N端的單結構域抗原結合位點，例如VHH；或者 其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈包含免疫球蛋白輕鏈；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變區、免疫球蛋白CH1結構域、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)和單結構域抗原結合位點(例如VHH)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球 蛋白CH1結構域、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)、免疫球蛋白CH1結構域和單結構域抗原結合位點(例如VHH)；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域；或者其中第一多肽鏈和第三多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)和免疫球蛋白CH1結構域；第二多肽鏈和第四多肽鏈中的每一多肽鏈從N端至C端包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)、免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL)、單結構域抗原結合位點(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任選地CH4結構域。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體分子，其是抗OX40/PD-L1雙特異性抗體，且(i)單結構域抗原結合位點和(ii)結合抗原的Fab片段分別結合OX40或PD-L1分子，例如，所述抗體分子由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中在左半部分的2條多肽鏈和右半部分的2條多肽鏈中，均包含(i)特異性結合PD-L1的單結構域抗原結合位點；(ii)特異性結合OX40的Fab片段；較佳地，所述(i)單結構域抗原結合位點包含SEQ ID NO：3所示的CDR1、SEQ ID NO：4所示的CDR2和SEQ ID NO：5所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；所述(ii)結合抗原的Fab片段包含衍生自抗OX40抗體的SEQ ID NO：11/7所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；更佳地，所述(i)單結構域抗原結合位點包含衍生自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的抗PD-L1 VHH胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列；所述(ii)結合抗原的Fab片段包含衍生自抗OX40抗體的SEQ ID NO：11/7所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列； 最佳地，所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：6所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：10所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：16所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：15所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：17所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
  15. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體分子，其是抗VEGF/GITR雙特異性抗體，且(i)單結構域抗原結合位點和(ii)結合抗原的Fab片段分別結合VEGF或GITR分子，例如，所述抗體分子由左右基本上對稱的4條多肽鏈組成，其中在左半部分的2條多肽鏈和右半部分的2條多肽鏈中，均包含(i)特異性結合GITR的單結構域抗原結合位點；(ii)特異性結合VEGF的Fab片段；較佳地，所述(i)單結構域抗原結合位點包含SEQ ID NO：25所示的CDR1、SEQ ID NO：26所示的CDR2和SEQ ID NO：27所示的CDR3，或者與所述3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個 胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；所述(ii)結合抗原的Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體的SEQ ID NO：22/20所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與所述6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；更佳地，所述(i)單結構域抗原結合位點包含衍生自SEQ ID NO：24所示的抗GITRVHH胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列；所述(ii)結合抗原的Fab片段包含衍生自抗VEGF抗體的SEQ ID NO：22/20所示的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與所述成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列；最佳地，所述抗體分子的左半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第二多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第一多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第二多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列；相應地，其中所述抗體分子的右半部分的2條多肽鏈分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：21所示的第四多肽鏈；分別包含SEQ ID NO：18所示的第三多肽鏈和SEQ ID NO：28所示的第四多肽鏈；或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。
  16. 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈。
  17. 一種載體，較佳地表達載體，其包含如申請專利範圍第16項所述的多核苷酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第16項所述的多核苷酸或如申請專利範圍第17項所述的載體，例如，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，較佳地是CHO細胞、HEK293細胞；所述宿主細胞是原核細胞，較佳地是大腸桿菌細胞。
  19. 一種用於生產如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗體分子的方法，所述方法包括步驟(i)在適於表達所述抗體分子的條件下培養如申請專利範圍第18項所述的宿主細胞，和(ii)從所述宿主細胞或所述培養基回收所述抗體分子。
  20. 一種藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗體分子和可藥用載體。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的藥物組合物，其還包含至少一種其他有效成分。
  22. 一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗體分子和與所述抗體分子綴合的一個或多個異源分子，較佳地，所述一個或多個異源分子是細胞毒性劑。
  23. 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的抗體分子、如申請專利範圍第20或21項所述的藥物組合物、和如申請專利範圍第22項所述的免疫綴合物的用途，其用作在個體中治療和/或預防疾病的藥物或用作疾病的診斷工具，較佳地，所述個體是哺乳動物，更佳地是人。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，用於自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤的治療和/或預防或診斷。
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