WO2020103836A1 - Ox40抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Ox40抗体及其制备方法和应用

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heavy chain
light chain
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辛文芳
曹艳云
徐辉
张瑜
夏珂
段清
杨达志
刘礼乐
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • TILs tumor infiltrating lymphocytes
  • each n is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9;
  • the number of added, deleted, modified and / or substituted amino acids is 1-5 (such as 1-3, preferably 1-2, more preferably 1).
  • the heavy chain constant region is a human antibody heavy chain IgG1 constant region
  • the light chain constant region is a human antibody light chain kappa constant region
  • VH-CDR1 shown in SEQ ID NO.3,
  • the heavy chain variable region includes the following three complementarity determining regions CDR:
  • the light chain variable region includes the following three complementarity determining regions CDR:
  • VH-CDR2 shown in SEQ ID NO. 34, and
  • VH-CDR3 shown in SEQ ID NO.35;
  • the antibody part and the coupling part are coupled by a chemical bond or a linker.
  • the immune cells are derived from human or non-human mammals (such as mice).
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • Figure 5 shows the results of ELISA detection of antibody titer of mouse serum after OX40ECD-hFc protein immunization.
  • Figure 12 shows the expression of NF-kB RE-luciferase in Jurkat-NF-kB Luc-hOX40 cells by luciferase method.
  • Fig. 16 shows the binding reaction between OX40 human-mouse chimeric antibody and CHOK1-hOX40 by FACS.
  • Figures 19a and 19b show changes in body weight of mice in each group after administration.
  • the antibody may be monospecific, bispecific, trispecific, or more multispecific.
  • the antibody is an anti-OX40 antibody.
  • the present invention provides a high specificity and high affinity antibody against OX40, which includes a heavy chain and a light chain, the heavy chain contains a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence, and the light chain contains a light chain variable Region (VL) amino acid sequence.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable Region
  • VL-CDR2 shown in SEQ ID NO.10n + 9, and
  • the preferred method of determining identity is to obtain the greatest match between the sequences tested.
  • the method of determining identity is compiled in a publicly available computer program.
  • Preferred computer program methods for determining the identity between two sequences include, but are not limited to: GCG package (Devereux, J. et al., 1984), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S, F. et al., 1990).
  • the BLASTX program is available to the public from NCBI and other sources (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et al., 1990).
  • the well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.
  • the single chain antibody is a conventional single chain antibody in the art, which includes a heavy chain variable region, a light chain variable region and a short peptide of 15-20 amino acids.
  • the antibody targeting OX40 is mab035.
  • the present invention also provides a recombinant protein comprising one or more of heavy chain CDR1 (VH-CDR1), heavy chain CDR2 (VH-CDR2) and heavy chain CDR3 (VH-CDR3) of OX40 antibody, and / or Or, one or more of the light chain CDR1 (VL-CDR1), light chain CDR2 (VL-CDR2) and light chain CDR3 (VL-CDR3) of the OX40 antibody,
  • VH-CDR3 shown in SEQ ID NO.10n + 5;
  • the recombinant protein is a conventional protein in the art, preferably, it is an antibody full-length protein, an antigen antibody binding domain protein fragment, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a single chain antibody (single chain antibody, scFv) ), Single domain antibody (single domain antibody, sdAb) and single domain antibody (Signle-domain antibody) one or more, and monoclonal antibody or polyclonal antibody prepared by the above antibody.
  • the monoclonal antibody can be developed in various ways and technologies, including hybridoma technology, phage display technology, single lymphocyte gene cloning technology, etc. The mainstream is to prepare monoclonal antibodies from wild-type or transgenic mice through hybridoma technology.
  • nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO. 102, 2, 12, or 22 of the Sequence Listing; and the nucleoside of the nucleic acid encoding the light chain variable region The acid sequence is shown in the sequence table SEQ ID NO. 104, 7, 17 or 27.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the above-mentioned protein may be appropriately substituted, deleted, altered, inserted, or added to provide a polynucleotide homolog.
  • the homologue of the polynucleotide in the present invention can be prepared by replacing, deleting, or adding one or more bases of the gene encoding the protein sequence within the range of maintaining antibody activity.
  • the invention also provides antibody-drug conjugate (ADC) based on the antibody of the invention.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Antibodies can be coupled to functional agents to form antibody-functional agent conjugates.
  • Functional agents eg drugs, detection reagents, stabilizers
  • the functional agent may be directly or indirectly linked to the antibody via a linker.
  • Useful drug classes include, for example, antitubulin drugs, DNA minor groove binding reagents, DNA replication inhibitors, alkylating agents, antibiotics, folic acid antagonists, antimetabolites, chemotherapy sensitizers, topoisomerase inhibitors , Vinca alkaloids, etc.
  • particularly useful cytotoxic drugs include, for example, DNA minor groove binding reagents, DNA alkylation reagents, and tubulin inhibitors
  • typical cytotoxic drugs include, for example, auristatins, camptothecin (camptothecins), dokamycin / duocarmycins, etoposides, maytansines and maytansinoids (e.g.
  • a safe and effective amount of an immunoconjugate is administered to a mammal, wherein the safe and effective amount is usually at least about 10 ⁇ g / kg body weight, and in most cases does not exceed about 50 mg / kg body weight, Preferably the dose is about 10 micrograms / kg body weight to about 20 mg / kg body weight.
  • the specific dosage should also consider factors such as the route of administration, the patient's health status, etc., which are within the skills of skilled physicians.
  • overexpression is conventional in the art, and refers to the overexpression of RNA or protein of the OX40 protein in the sample to be tested (due to increased transcription, post-transcriptional processing, translation, post-translational processing, and protein degradation changes), and due to protein Changes in delivery mode (increased nuclear localization) result in local overexpression and increased functional activity (eg in the case of increased enzymatic hydrolysis of the substrate).
  • OX40L recombinant protein (purchased from R & D) was diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS, added to ELISA microplate at 100 ⁇ l / well, and incubated overnight at 4 ° C; with ELISA blocking solution (PBS phosphate buffer containing 1% BSA, pH 7.4) , The percentage is the mass percentage)
  • OX40ECD-hFc i.e., immunogen A
  • goat anti-human IgG labeled with horseradish peroxidase (Purchased from Sigma, A8667), after incubation at 37 ° C for 30 minutes; add 100 ⁇ L / well TMB color developing solution (purchased from Huzhou Yingchuang, EL0009), after incubation at room temperature for 15 minutes, add 50 ⁇ L 1N hydrochloric acid to stop the color reaction, use
  • nucleotide sequence encoding the full-length amino acid sequence of human OX40 (sequence from Uniprot database, protein sequence number P43489) was cloned into pLVX-IRES-Puro vector and a plasmid (herein referred to as pLVX-hOX40-IRES-Puro) was prepared ).
  • FIG. 5 and 6 show that the sera of mice immunized with OX40ECD-hFc have different levels of binding to the immunogen.
  • the serum antibody titer of ELISA detection is above 1: 100,000
  • the serum antibody titer of FACS detection is above 1: 1000.
  • TB2 refers to the serum of mice seven days after the second booster immunization
  • PB refers to the serum of mice before the first immunization.
  • the data in the graph are the OD450nm value and the average fluorescence intensity (MFI value).
  • the cells were washed by centrifugation with DMEM basal medium for 3 times, and then mixed with mouse myeloma cells SP2 / 0 at a ratio of 5: 1 viable cells, and the cell fusion was performed by PEG method (see METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220).
  • the fused cells were diluted into DMEM medium containing 20% fetal bovine serum and 1 ⁇ HAT (purchased from Invitrogen). Then press 1 ⁇ 10 5 / 200 ⁇ L per well in 96-well cell culture plate, the plate was incubated 5% CO 2, 37 °C medium.
  • the supernatant in the 24-well plate was taken for secondary screening with ELISA and FACS, the binding activity of the antibody in the supernatant to the OX40 protein was measured, and the activation of the NF-kB signaling pathway by the antibody in the supernatant was detected by a reporter gene experiment Action (see Example 3.2.2 for the method).
  • the monoclonal antibody in the culture supernatant of the clarified hybridoma cells was purified with a protein A column (purchased from GE Healthcare).
  • the protein A column was first equilibrated with PBS phosphate buffer, and then the clarified culture supernatant was loaded onto the protein A column. After loading the sample, wash the protein A column (0.1M Tris-HCl, pH 8.0) with equilibration buffer.
  • the OX40 antibody bound to the Protein A column was eluted with an eluent (0.1M sodium citrate buffer, pH 4.5 for IgG1, and pH 3.5 for other IgG subtypes).
  • the CHOK1-hOX40 stable cell line and the CHOK1-cOX40 stable cell line constructed in Example 1.4 were expanded and cultured to 90% confluence in a cell culture dish, the culture medium was drained, washed with PBS phosphate buffer, and then cell digested. TrypLE (purchased from Invitrogen) processes and collects cells.
  • Figure 11 shows the results of FACS detection, indicating that the selected Jurkat-NF-kB Luc-hOX40 cell line stably expresses hOX40.
  • Figure 12 shows the results of the NF-kB reporter gene experiment, indicating that the screened Jurkat-NF-kB Luc-hOX40 cell line stably expresses NF-kB RE-luciferase (luciferase).
  • Freshly obtained human whole blood was diluted with phosphate buffered saline PBS at a volume ratio of 1: 1 to obtain diluted whole blood, and the diluted whole blood was gently spread on the Ficoll liquid surface with a sterile pipette (purchased from GE Healthcare ), The volume ratio of Ficoll to diluted whole blood is 3: 4, avoid shaking and mixing, centrifuge at 400g at room temperature and 20 ° C gradient for 30 minutes, the centrifuge tube after centrifugation is divided into four layers, the second layer from top to bottom The milky white layer is the mononuclear lymphocyte.
  • Purified memory CD4 + T cells were isolated from human peripheral blood mononuclear lymphocyte PBMC obtained in step 3.3.1 using a human memory CD4 + T cell extraction kit (purchased from Stem Cell, Catalog No. 19157). Refer to the kit instructions for the extraction method.
  • ligation reaction insert 20-40ng, digested expression vector 60-100ng, recombinant enzyme Exnase (purchased from Vazyme, Catalog No. C112-01 / 02) 1 ⁇ L, buffer 2 ⁇ L, reaction system 10 ⁇ L was reacted at 37 ° C for half an hour to obtain the ligation product, that is, the constructed recombinant vector.
  • the monoclonal antibody bound to the MabSelect TM SuRe TM column was eluted with an eluent (0.1M glycine hydrochloric acid buffer, pH 3.0). The eluted antibody was collected and added to 10% (v / v) 1.0M Tris-HCl buffer to neutralize the pH. Then immediately dialyzed against PBS phosphate buffer overnight. The monoclonal antibody after dialysis was collected, sterile filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and stored aseptically to obtain purified OX40 humanized antibody. The obtained antibody was analyzed for protein concentration and purity.

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Abstract

本发明公开了一种靶向OX40的鼠源或人鼠嵌合抗体及其制备方法，所述抗体结合OX40抗原，具有抗肿瘤等活性。

Description

OX40抗体及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种OX40抗体及其制备方法和应用。
背景技术
OX40(又称CD134、TNFRSF4或ACT35)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员，是I型跨膜糖蛋白。OX40主要表达在活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤细胞(NK)。OX40在体内的配体为OX40L(又称CD152或TNFSF4)，以三聚体形式存在。OX40/OX40L信号在T细胞的活化和增殖中发挥着非常重要的作用。研究表明，OX40抗体能够有效促进T细胞的活化和增殖，阻断Treg细胞的免疫抑制作用，激活免疫系统。
临床样本研究发现，OX40在乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌和结肠癌等的肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs)中均有表达。
在CT26结肠癌、N2C乳腺癌、A20淋巴癌、B16-F10黑色素瘤等小鼠肿瘤模型中，小鼠OX40抗体(OX86)均能有效的控制肿瘤的增长，提高小鼠的存活率。此外，OX40抗体与其他免疫检查点相关抗体，如4-1BB抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体等联用，均具有较好的抗肿瘤活性，能显著提高存活率。因此，OX40抗体的开发具有十分重要的临床意义。
目前，还没有较佳的OX40抗体恰当地发挥调节免疫系统的作用而应用于肿瘤免疫疗法中，并达到抗体效价高且毒副作用小的效果。因此亟待解决上述的问题。
发明内容
为了克服目前缺少较优的OX40抗体的不足，本发明提供一种亲和力高、特异性强的OX40抗体及其制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.101或10n+1所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.101所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.103或10n+6所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.103所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与OX40结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与OX40结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与OX40结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(b)抑制肿瘤生长。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure PCTCN2019119515-appb-000001
Figure PCTCN2019119515-appb-000002
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.5所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.13所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.14所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.15所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.18所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.19所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.20所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.23所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.24所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.25所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.28所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.29所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.30所示的VL-CDR3；
或
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.33所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.34所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.35所示的VH-CDR3；
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.38所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.39所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.40所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
Figure PCTCN2019119515-appb-000003
Figure PCTCN2019119515-appb-000004
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)选自下组的抗体，
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1 Humab035-24 101 103
2 mab035 1 6
3 mab053 11 16
4 mab041 21 26
5 mab058 31 36
6 mab034 41 46
7 mab049 51 56
8 mab064 61 66
9 mab033 71 76
10 mab047 81 86
11 mab055 91 96
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.102、2、12、22、32、42、52、62、72、82或92所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.104、7、17、27、37、47、57、67、77、87或97所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
Figure PCTCN2019119515-appb-000005
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明本发明的第七方面中任一项所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第五方面 所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第十三方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述OX40表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中OX40蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的OX40蛋白；和/或
(3)检测表达OX40蛋白的肿瘤细胞；
而所述药物用于预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病，所述与OX40表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断OX40相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中OX40蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品 中OX40蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在OX40蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中OX40蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十九方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联 物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第二十方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗OX40表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体。
在本发明的第二十一方面，提供了一种治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与OX40表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：PD-1抗体、CTLA4抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为OX40ECD-hFc与OX40L蛋白的结合活性。其中X轴表示OX40L蛋白的浓度，Y轴表示OD450nm值。
图2为HEK293-hOX40细胞株的FACS分析结果。
图3为CHOK1-hOX40细胞株的FACS分析结果。
图4为CHOK1-cOX40细胞株的FACS分析结果。
图5为ELISA检测OX40ECD-hFc蛋白免疫后小鼠血清抗体效价的结果。
图6为FACS检测OX40ECD-hFc蛋白免疫后小鼠血清抗体效价的结果。
图7为FACS检测HEK293-hOX40细胞免疫后小鼠血清抗体效价的结果。
图8为FACS检测pCP-hOX40质粒免疫后小鼠血清抗体效价的结果。
图9a和9b为FACS检测OX40抗体与CHOK1-hOX40的结合反应。
图10a和10b为FACS检测OX40抗体与CHOK1-cOX40的结合反应。
图11为FACS检测Jurkat-NF-kB Luc-hOX40细胞hOX40的表达情况。
图12为荧光素酶法检测Jurkat-NF-kB Luc-hOX40细胞NF-kB RE-luciferase的表达情况。
图13a和13b为NF-kB报告基因实验检测OX40抗体对NF-kB信号通路的激活作用，其中，blank为空白对照；Ionomycin为离子霉素。
图14为CHOK1-hOX40L细胞株的FACS分析结果。
图15a和15b为FACS检测OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用。
图16为FACS检测OX40人鼠嵌合抗体与CHOK1-hOX40的结合反应。
图17为FACS检测OX40人鼠嵌合抗体与CHOK1-cOX40的结合反应。
图18为NF-kB报告基因实验检测OX40人鼠嵌合抗体对NF-kB信号通路的激活作用。
图19a和19b为给药后各组小鼠体重变化。
图20为给药后各组小鼠肿瘤体积变化。
图21为给药后各组小鼠生存曲线。
图22为FACS检测OX40人源化抗体与CHOK1-hOX40的结合反应。
图23为NF-kB报告基因实验检测OX40人源化抗体对NF-kB信号通路的激 活作用。
图24为T细胞激活实验检测OX40人源化抗体对记忆性CD4阳性T细胞的活化作用。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以人源OX40蛋白、稳定表达OX40蛋白的细胞株以及包含编码OX40蛋白cDNA的质粒作为免疫原，采用杂交瘤技术，意外地获得一组具有全新氨基酸序列的鼠源或人鼠嵌合的OX40抗体(例如mab035、mab053、mab041以及mab058)。本发明所述的OX40抗体是一种具有优异的生物特性的OX40激动型抗体，与人源OX40蛋白具有高度亲和力，与猴源OX40蛋白有相似的结合能力；能激活NF-kB信号通路；能显著增加记忆性CD4+T细胞IFN gamma表达量，激活免疫系统，延长肿瘤小鼠的生存周期，因此能够运用于治疗肿瘤中。本发明抗体能够运用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等药物的制备中。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的 可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗 体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure PCTCN2019119515-appb-000006
Figure PCTCN2019119515-appb-000007
抗OX40的抗体
本发明中，所述抗体为抗OX40的抗体。本发明提供一种针对OX40的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
优选地，重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1或2；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克 隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向OX40(例如人OX40)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列，和/或，轻链可变区氨基酸序列如下表2所示：
表2
抗体编号 VH序列编号 VL序列编号
1 101 103
2 1 6
3 11 16
4 21 26
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为Humab035-24、mab035、mab053、mab041、mab058、mab034、mab049、mab064、mab033、mab047、mab055。
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为Humab035-24、mab035、mab053、mab041。
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为Humab035-24
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为mab035。
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为mab053。
在另一优选例中，所述靶向OX40的抗体为mab041。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括OX40抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，OX40抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，
所述重链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，
SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
所述轻链CDR1-3的序列如下：
SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；较佳地n为0或1；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺 失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括OX40抗体的重链可变区和/或OX40抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括OX40抗体的重链可变区和OX40抗体的轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO.101或10n+1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.103或10n+6所示的氨基酸序列，其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括OX40抗体的重链可变区和OX40抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表3所示：
表3 重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号
Figure PCTCN2019119515-appb-000008
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗 体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗OX40的抗体)或重组蛋白或抗OX40的抗体的重链可变区或轻链可变区。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.102、2、12、22、32、42、52、62、72、82或92所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.104、7、17、27、37、47、57、67、77、87或97所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.102、2、12或22所示；且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.104、7、17或27所示。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli  BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定 (ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降 解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca  alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure PCTCN2019119515-appb-000009
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与OX40表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与OX40表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与OX40表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫性疾病。
本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。本发明中，所述自身免疫性疾病为本领域常规的自身免疫性疾病，较佳地为类风湿关节炎、炎性过度增生性皮肤病、多发性硬化症、炎性肠病、哮喘、自身免疫性心肌炎、系统性红斑狼疮。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，尤其是OX40高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：乳腺癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌。
(ii)诊断、预防和/或治疗自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病包括(但并不限于)：类风湿关节炎、炎性过度增生性皮肤病、多发性硬化症、炎性肠病、哮喘、自身免疫性心肌炎、系统性红斑狼疮。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合OX40蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外， 本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与OX40表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫性疾病。
检测样品中OX40蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中OX40蛋白(例如检测过表达OX40细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指OX40蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的 检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中OX40蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所述的蛋白质是OX40抗体，与人源OX40蛋白具有高度亲和力，并与猴源OX40蛋白具有相似的结合能力，能够激活NF-kB信号通路，并且能够显著增加记忆性CD4+T细胞IFN gamma的表达。
(2)本发明所述的部分OX40抗体，与目前已研发的抗体相比，具有不同的抗原表位。
(3)本发明所述的部分OX40抗体，与目前已研发的抗体相比，能更好地激活NF-kB信号通路和T细胞的功能，并且延长MC38肿瘤小鼠的生存周期。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
若无特别说明，实施例中所述的PBS为PBS磷酸缓冲液，pH7.4。
实施例1 OX40抗体的制备
1.1免疫原A的制备
将含有编码人源OX40蛋白胞外区氨基酸序列Leu29-Ala216(人源OX40蛋 白序列来源于Uniprot数据库，蛋白序列号为P43489)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pTT5载体并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将制备好的质粒对HEK293细胞进行瞬时转染(聚醚酰亚胺(PEI)，购自Polysciences)并进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含OX40蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(购自GE Healthcare)，同时用紫外检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的OX40蛋白胞外区(OX40ECD-hFc)，用PBS在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22μm无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原A。免疫原A在使用前进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量、生物活性等，结果如图1所示。图1说明OX40与OX40L在蛋白水平的结合随OX40的浓度变化而变化，图中的数据为OD450nm值。
其中，免疫原A生物活性采用ELISA检测，具体为：
将OX40L重组蛋白(购自R&D)用PBS稀释至1μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育过夜；用ELISA封闭液(含1％BSA，pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后，再加入梯度稀释的OX40ECD-hFc(即免疫原A)，37℃温育1小时；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(购自Sigma，A8667)，37℃温育30分钟后；加入100μL/孔TMB显色液(购自湖州英创，EL0009)，室温孵育15分钟后，加入50μL 1N盐酸终止显色反应，用ELISA读板机读取OD450nm值。
1.2免疫原B的制备
将编码人源OX40全长氨基酸序列(序列来源于Uniprot数据库，蛋白序列号为P43489)的核苷酸序列克隆到pLVX-IRES-Puro载体并制备质粒(此处称为pLVX-hOX40-IRES-Puro)。对HEK293细胞系进行质粒转染后，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，在含0.5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的含10％胎 牛血清的DMEM培养基中选择性培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到24孔板中，并在大约3-4天后扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用OX40抗体(购自R&D)经流式细胞法(FACS)进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原B(HEK293-hOX40细胞)。FACS结果如图2所示。图2说明已经筛选得到稳定表达OX40的HEK293细胞系。
1.3免疫原C的制备
将编码人源OX40全长氨基酸序列(序列来源于Uniprot数据库，蛋白序列号为P43489)的cDNA克隆到pCP载体(pCP-hOX40质粒)并包被到1.0μm金胶体子弹(购自Bio-rad)，即得免疫原C。用Helios基因枪免疫(Helios Gene Gun System，Bio-rad，货号165-2431)。其中，包被到1.0μm金胶体子弹和免疫的方法参见Helios基因枪说明书。
1.4表达OX40蛋白的稳定细胞株的构建
将实施例1.2中的pLVX-hOX40-IRES-Puro质粒转染CHOK1细胞株，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，在含6μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的含10％胎牛血清的F12K培养基中选择性培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到24孔板中，并在大约3-4天后扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用OX40抗体(购自R&D)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，得到表达人OX40蛋白的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-hOX40稳定细胞株)。图3表明，已经筛选得到稳定表达人OX40的CHOK1稳定细胞株。
将编码猴源OX40全长氨基酸序列(猴源OX40序列来源于NCBI数据库，序列号为XP_005545179.1)的核苷酸序列克隆到pLVX-IRES-Puro载体并制备质粒(此处称为pLVX-cOX40-IRES-Puro)。将pLVX-cOX40-IRES-Puro质粒转染CHOK1细胞株，筛选得到表达猴OX40的CHOK1稳定细胞株(此处称为CHOK1-cOX40稳定细胞株)。图4表明，已经筛选得到稳定表达猴OX40的CHOK1稳定细胞株。
1.5杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
A、免疫原A免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克)，小鼠接收在SPF条件下饲养。初次免疫时，免疫原A蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射50μg。加强免疫时，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射25μg。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性，结果如图5和图6所示。图5和图6说明，经OX40ECD-hFc免疫的小鼠血清对免疫原均有不同程度的结合，ELISA检测血清抗体效价达1:100,000以上，FACS检测血清抗体效价达1:1000以上。其中TB2指第二次加强免疫后七天的小鼠血清，PB指初次免疫前小鼠血清，图中的数据分别为OD450nm值和平均荧光强度(MFI值)。
B、免疫原B免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。实施例1步骤(二)中筛选得到的稳定表达人源OX40蛋白的HEK293细胞(HEK293-hOX40)在细胞培养皿中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS洗涤后，加入细胞消化液TrypLE(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用PBS洗涤2次，进行细胞计数后用PBS重悬至1-2×10 7细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5ml细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用流式细胞法(FACS)检测血清中抗体效价和特异性。结果如图7所示。图7说明，在第二次加强免疫后，FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上。其中TB2指第二次加强免疫后七天的小鼠血清，PB指初次免疫前小鼠血清，图中的数据为平均荧光强度(MFI)。
C、免疫原C免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克)，小鼠接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用Helios基因枪免疫4次，每次4枪，每枪1.0μg cDNA。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次加强免疫间隔2周。每次加强免疫1周后采血，用FACS检测血清中抗体效价。结果如图8所示。图8说明，在第三次加强免疫后，FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上。其中TB3指第三次加强免疫后七天的小鼠血清，PB指初次免疫前小鼠血清，图中的数据为平均荧光强度(MFI)。
A～C步骤完成后，选择血清抗体效价较好的小鼠进行融合。针对免疫原A和免疫原C进行免疫反应的小鼠，在融合前腹腔注射25μg免疫原A(OX40ECD-hFc重组蛋白)进行加强免疫；针对免疫原B进行免疫反应的小鼠，在融合前腹腔注射免疫原B(0.5-1×10 7HEK293-hOX40细胞)进行加强免疫。5天后处死小鼠，收集脾细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，采用PEG法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT(购自Invitrogen)的DMEM培养基中。然后按1×10 5/200μL每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO 2、37℃培养箱中。10-14天后用ELISA或Acumen(微孔板细胞检测法)测定细胞融合板上清对OX40蛋白的结合活性，挑选ELISA中OD450nm值较高或者Acumen中平均荧光强度(MFI)较高的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％胎牛血清，1×HT(购自Invitrogen)的DMEM培养基中扩大培养。培养3天后取24孔板中的上清，用ELISA和FACS进行二次筛选，测定上清中抗体对OX40蛋白的结合活性，并用报告基因实验检测上清中抗体对NF-kB信号通路的激活作用(其方法参见实施例3.2.2)。
根据24孔板筛选结果，挑选ELISA和FACS实验中具有抗原抗体结合活性，并能激活NF-kB信号通路的阳性克隆，用有限稀释法在96孔板中进行亚克隆，在含10％FBS的DMEM培养基中37℃，5％CO 2条件下培养。亚克隆后7天用ELISA或Acumen进行初步筛选，挑选4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用ELISA和FACS确定结合活性。
根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，于含10％FBS的DMEM培养基中在37℃，5％CO 2条件下进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。
实施例2 先导抗体的生产和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅0.1-10μg/mL，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5mg)抗体生产 纯化。
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶，用含10％FBS的DMEM培养基进行扩大培养。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶，用含2.5％FBS(Low IgG)的生产培养基(Hybridoma serum free medium，购自Invitrogen公司)。每个2L的培养转瓶中加入500mL生产培养基，接种细胞密度为1.0×10 5/mL。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，用0.22μm的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。
将澄清的杂交瘤细胞的培养上清液中的单克隆抗体用蛋白A柱(购自GE Healthcare)纯化。蛋白A柱先用PBS磷酸缓冲液平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱(0.1M Tris-HCl,pH 8.0)。用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，IgG1用pH 4.5，其他IgG亚型用pH 3.5)洗脱结合在蛋白A柱上的OX40抗体。收集洗脱的抗体，加入1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的OX40抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的OX40抗体。
将纯化的OX40抗体进行蛋白浓度、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表4所示。
表4 纯化的OX40抗体检测分析
Figure PCTCN2019119515-appb-000010
Figure PCTCN2019119515-appb-000011
实施例3 先导抗体的检定
3.1流式细胞实验(FACS)检测抗体与稳定表达OX40蛋白的细胞的结合
将实施例1.4中构建的CHOK1-hOX40稳定细胞株和CHOK1-cOX40稳定细胞株在细胞培养皿中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后用细胞消化液TrypLE(购自Invitrogen)处理和收集细胞。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞，进行细胞计数后将细胞用FACS缓冲液重悬至3×10 6个细胞每毫升，按每孔100μL加入到96孔FACS反应板中，300g离心5分钟后去上清，加入一系列浓度梯度的实施例2所得的OX40纯化抗体每孔100μL，4℃孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100μL荧光(Alexa 488)标记的二抗(购自Invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100μL PBS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。结果如图9a,图9b和图10a，图10b所示，待测抗体可结合细胞表面的OX40蛋白。其中mIgG为抗体亚型对照小鼠IgG，图中的数据MFI为所测细胞群的平均荧光强度值。
3.2 NF-kB报告基因实验检测OX40抗体对NF-kB信号通路的激活
3.2.1 Jurkat-NF-kB Luc-hOX40稳定细胞系的构建
将pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]质粒(购自Promega)转染至Jurkat细胞，用含潮霉素(hygromycin)和10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养，筛选得到稳定表达NF-kB RE-luciferase的Jurkat细胞株(此处称为Jurkat-NF-kB Luc)。
将实施例1.2中的pLVX-hOX40-IRES质粒转染至Jurkat-NF-kB Luc细胞，用同时含有潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)和10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养，筛选得到稳定表达NF-kB RE-luciferase和OX40的Jurkat细胞株(此处称为Jurkat-NF-kB Luc-hOX40)。
图11为FACS检测结果，表明筛选得到的Jurkat-NF-kB Luc-hOX40细胞株稳定表达hOX40。图12为NF-kB报告基因实验结果，表明筛选得到的Jurkat-NF-kB  Luc-hOX40细胞株稳定表达NF-kB RE-荧光素酶(luciferase)。
3.2.2 NF-kB报告基因实验
预先用1ug/ml anti-CD3抗体包被96孔板(购自Perkin Elmer)，4℃孵育过夜。使用前用PBS清洗三次。
将3.2.1中筛选得到的Jurkat-NF-kB Luc-hOX40细胞扩大培养，收集后用含1％FBS的RPMI1640培养基重悬，将细胞以1×10 5/孔的密度接种于包被有anti-CD3抗体的96孔板中。同时加入1×10 5/孔的Raji细胞作为Fc gamma受体的表达细胞。再加入一系列浓度梯度的OX40抗体，放入细胞培养箱中继续培养5h。用One-Glo荧光素酶检测系统(购自Promega)测定荧光素酶的含量。
结果如图13a，图13b所示，结果表明，所述抗体能显著激活NF-kB信号通路。
3.3 T细胞激活实验检测OX40抗体对T细胞的活化
3.3.1从人全血中分离外周血单核淋巴细胞PBMC
将新鲜获取的人全血用磷酸缓冲液PBS以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在Ficoll液面(购自GE Healthcare)，Ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温20℃梯度离心30分钟，离心后的离心管分为四层，从上至下第二层乳白色分层即为单核淋巴细胞，用无菌吸管轻轻吸取该层细胞，收集至新的离心管，用PBS磷酸缓冲液稀释至三倍体积，200g转速室温离心10分钟，弃上清。将淋巴细胞用PBS磷酸缓冲液重悬至10mL，重复前面步骤，清洗2次，得到外周血单核淋巴细胞PBMC。
3.3.2人记忆性CD4+T细胞的分离
用人记忆性CD4+T细胞提取试剂盒(购自Stem Cell，货号19157)从步骤3.3.1所得的人外周血单核淋巴细胞PBMC中分离得到纯化的记忆性CD4+T细胞。提取方法参考试剂盒说明书。
3.3.3 T细胞激活实验
预先用1ug/ml anti-CD3抗体和2.2ug/ml AffiniPure F(ab') 2Fragment Goat  Anti-Mouse IgG(购自Jaskson Immunoresearch)同时包被96孔板，4℃孵育过夜。使用前用PBS清洗三次。
将待测样品溶液用含有10％FBS的多组分RPMI1640培养基(购自Invitrogen)稀释后以100uL毎孔加入提前包被的96孔版中。再将步骤3.3.2获得的记忆性CD4+T细胞以1×10 5个细胞100uL毎孔铺至预包被的96孔板。将反应板于37℃、5％CO 2培养箱培养72小时后收集上清，保存于-20℃，用于IFN gamma含量的测定。
3.3.4细胞上清中细胞因子IFN gamma含量的检测
细胞上清中细胞因子IFN gamma含量的检测采用R&D system检测试剂盒Human IFN-gamma DuoSet ELISA(DY285)，并按照说明书操作。
检测OX40抗体在实施例3.3.2所述T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响。结果如表5～9所示，在T细胞激活实验中待测抗体可使记忆性CD4+T细胞的IFN gamma分泌增强。其中mIgG1为抗体亚型对照，表中的数据为IFN gamma值(pg/mL)。
表5 OX40抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响(PBMC供体-1)
Figure PCTCN2019119515-appb-000012
表6 OX40抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响(PBMC供体-2)
Figure PCTCN2019119515-appb-000013
表7 OX40抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响(PBMC供体 -3)
Figure PCTCN2019119515-appb-000014
表8 OX40抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响(PBMC供体-4)
Figure PCTCN2019119515-appb-000015
表9 OX40抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响(PBMC供体-5)
Figure PCTCN2019119515-appb-000016
3.4 OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用
3.4.1稳定表达OX40L的细胞株的构建
将编码人源OX40L全长氨基酸序列(人源OX40L蛋白在Uniprot数据库的蛋白序列号为P23510)的核苷酸序列克隆到pLVX-IRES-Puro载体并制备质粒(此处称为pLVX-hOX40L-IRES-Puro)。对CHOK1细胞系进行质粒转染后，用有限 稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，在含10μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的含10％胎牛血清的F12K培养基中选择性培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到24孔板中，并在大约3-4天后扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用OX40L抗体(购自R&D)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得稳定表达OX40L的细胞株(此处称为CHOK1-hOX40L细胞)。
FACS检测结果如图14所示。结果表明筛选得到的细胞株能高表达hOX40L。
3.4.2 OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用
将实施例3.4.1中构建的CHOK1-hOX40L稳定细胞株在细胞培养皿中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS洗涤后用细胞消化液TrypLE(购自Invitrogen)处理和收集细胞。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞，进行细胞计数后将细胞用FACS缓冲液重悬至3×10 6/mL，按每孔100μL加入到96孔FACS反应板中，300g离心5分钟后去上清，加入一系列浓度梯度的实施例2所得的OX40纯化抗体每孔50μL，同时加入生物素标记的OX40ECD-Fc蛋白毎孔50μL，4℃孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100μL荧光(Alexa488)标记的链霉亲和素(购自Invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100μL PBS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。
结果如图15a，图15b所示。结果表明，本发明大部分抗体能抑制OX40和OX40L蛋白的结合。
实施例4 轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例3的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×10 7个杂交瘤细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g 离心15分钟，弃上清；加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H 2O溶解(55℃水浴促进溶剂10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μL体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μL PCR体系，包括1μL cDNA、每种引物25pmol、1μL DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置PCR程序，95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μL，缓冲液1μL，反应体系10μL，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells,购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μL无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200rpm的速度复苏30分钟，取出200μL涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μL PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]。
测序结果见附录中本发明的序列信息。
实施例5 OX40抗体的表位鉴定
根据已发表专利中的序列，我们制备了四种对照抗体，分别为对照抗体1(MOXR0916)，对照抗体2(PF-04518600)，对照抗体3(MEDI0562)，以及对照抗 体4(BMS-986178)。将实施例1中得到的OX40抗体与这四种对照抗体分别进行竞争性ELISA实验，结果如表10所示，表中百分比为竞争百分比，竞争百分比越高，说明两个抗体的抗原表位越接近。其中mAb007，mAb021，mAb024，mAb041，mAb058与四种对照抗体具有不同的表位。
表10 竞争性ELISA实验
抗体名称 与MOXR0916竞争 与PF-04518600竞争 与MEDI0562竞争 与BMS-986178竞争
mAb010 56％ -19％ 96％ -6％
mAb049 90％ -2％ 97％ 0％
mAb064 90％ 4％ 96％ 1％
mAb069 73％ -1％ 96％ 1％
mAb004 -2％ -12％ 92％ -8％
mAb026 3％ -13％ 63％ 11％
mAb035 3％ -5％ 59％ 90％
mAb047 -3％ -2％ 97％ 0％
mAb003 -2％ 94％ -3％ 5％
mAb053 -2％ 93％ 11％ 2％
mAb054 -2％ 95％ 11％ 18％
mAb055 -3％ 95％ 16％ 3％
mAb020 -4％ -15％ -3％ 50％
mAb033 -1％ -7％ 7％ 81％
mAb034 0％ 5％ 13％ 93％
mAb007 -2％ 16％ -3％ -6％
mAb021 -2％ -10％ 3％ 7％
mAb024 -1％ -7％ 9％ -2％
mAb041 1％ -8％ 2％ -6％
mAb058 -3％ 11％ 26％ -4％
实施例6 OX40人鼠嵌合抗体制备和鉴定
6.1质粒构建与准备
实施例2已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的OX40抗体，并根据实施例4的测序结果明确了OX40抗体的重链可变区和轻链可变区序列。将OX40抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体中，将OX40抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中，得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例4中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millipore)过滤，供转染使用。
6.2细胞转染
在培养基Freestyle 293 expression medium(购自Invitrogen)中培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM，8％CO 2(v/v)浓度。
Freestyle 293 expression medium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得到含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。
取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg/mL步骤6.1所得的重组质粒混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293 expression medium中至293E的细胞密度为1.5×10 6/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价，第6～7天，离心(3500rpm，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得过滤的细胞上清液，以供纯化。
6.3抗体纯化和鉴定
对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用0.1M NaOH处理30分钟或者5倍柱体积的0.5M NaOH冲洗；对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1小时，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％Triton×100对柱料清洗。使用5倍柱体积的PBS(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)进行平衡，将步骤6.2所得过滤的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用0.5倍柱体积洗脱液的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和，收获OX40人鼠嵌合抗体。在1×PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。并对所获OX40人鼠嵌合抗体进行特性鉴定(同实施例3)。
检测结果分别如图16、图17、图18和表11所示，其中MOXR0916为阳性对照抗体，hIgG1为抗体亚型对照。
表11 OX40人鼠嵌合抗体在T细胞激活实验中对IFN gamma分泌的影响
Figure PCTCN2019119515-appb-000017
Figure PCTCN2019119515-appb-000018
结果表明：所得OX40人鼠嵌合抗体能与人OX40和猴OX40都有很好的结合，能激活NF-kB信号通路并能显著增加记忆性CD4+T细胞IFN gamma表达量。与阳性对照抗体MOXR0916相比，mab035xhIgG1具有更好地激活T细胞的效果。
实施例7 OX40抗体的体内药效实验
为研究OX40抗体的体内抗肿瘤作用，建立了OX40人源化小鼠结肠癌MC-38皮下瘤模型。OX40人源化小鼠购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司，雌性，5－6周龄。将含1x10 6个MC-38肿瘤细胞的100μL细胞悬液(细胞悬于base DMEM培液中)接种于小鼠右侧皮下。肿瘤体积达到30mm 3～80mm 3的动物将被引入实验并根据肿瘤体积随机分为不同的受试组。动物实验分组和给药方案如下表12所示。
表12 动物实验分组和给药方案
Figure PCTCN2019119515-appb-000019
给药后，每周2-3次记录小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝a×b 2/2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。每只小鼠达到实验终点(体重降低大于20％；或瘤体积超过2,000mm 3)实施安乐死并记录生存期，Kaplan-Meier生存曲线。体重和肿瘤体积变化采用Two-way ANOVA分析，Kaplan-Meier生存曲线采用Log-Rank分析，P<0.05认为有显著性差异。实验结果如图19a，图19b，图20，图21所示，与溶剂对照(Vehicle)组相比，OX40抗体能显著抑制肿瘤生长，其中mab035xhIgG1延长小鼠生存周期的效果最优。
实施例8 人源化抗体的制备
经过序列分析，候选抗体mAb035重链可变区和轻链可变区均无重要的hotspot。通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体mAb035重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：IGHV1-46*03(61.2％)和IGKV1-12*01(67.4％)。在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸，对嫁接的骨架区进行回复突变设计。
根据以上原则，设计10个重链可变区序列(mab035VH.g0，mab035VH.g1，mab035VH.g2，mab035VH.g3，mab035VH.g4,mab035VH.g5,mab035VH.g6,mab035VH.g7,mab035VH.g8,mab035VH.g9)和5个轻链可变区序列(mab035VL.g0,mab035VL.g1，mab035VL.g2,mab035VL.g3,mab035VL.g4)。随后做交叉组合进行表达，共得到下列28个人源化抗体，见表13。
表13 人源化抗体表达组合
  mab035VL.g0 mab035VL.g1 mab035VL.g2 mab035VL.g3 mab035VL.g4
mab035VH.g0 Humab035-1 Humab035-2 Humab035-3 Humab035-4  
mab035VH.g1 Humab035-5 Humab035-6 Humab035-7 Humab035-8  
mab035VH.g2 Humab035-9 Humab035-10 Humab035-11 Humab035-12  
mab035VH.g3 Humab035-13 Humab035-14 Humab035-15 Hu mab035-16  
mab035VH.g4   Hu mab035-17     Hu mab035-23
mab035VH.g5   Hu mab035-18     Hu mab035-24
mab035VH.g6   Hu mab035-19     Hu mab035-25
mab035VH.g7   Hu mab035-20     Hu mab035-26
mab035VH.g8   Hu mab035-21     Hu mab035-27
mab035VH.g9   Hu mab035-22     Hu mab035-28
载体构建：扩增引物由Genewiz合成，随后通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括50-100ng的重链可变区，轻链可变区、正向反向引物各1ul、1ul pfxD酶(购自invitrogen，12344-012)、10*pfx缓冲液5ul(供应商同pfx同酶)以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸10min，得到PCR产物。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为PureLink Quick Gel extraction kit，购自Qiagen，货号28706。
人源化抗体的制备：进行连接反应：插入片段20-40ng，酶切过的表达载体60-100ng，重组酶Exnase(购自Vazyme，货号C112-01/02)1μL，缓冲液2μL，反应体系10μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG4(S228P)恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，42℃水浴热激60秒，放回冰上3分钟，取出80μL涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pEF1A和pSV40，配置30μL PCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，15μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至30μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出4.5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。
将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染 FreeStyle TM 293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.2×10 6个/mL，100mL细胞需要100μg上述已构建好的重组载体和200μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到5mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO 2培养箱中以130rpm的转速培养。每天采取培养上清和细胞沉淀检测抗体的表达。5天后，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1mL MabSelect TMSuRe TMcolumn(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。MabSelect TMSuRe TMcolumn先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡。上样完毕后用平衡缓冲液清洗MabSelect TMSuRe TMcolumn，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在MabSelect TMSuRe TMcolumn上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的OX40人源化抗体。将所得抗体进行蛋白浓度、纯度检测分析。
结果如下表14所示，结果显示，人源化抗体的产量和纯度分析均表现正常。
表14 人源化抗体表达和纯化结果
Figure PCTCN2019119515-appb-000020
Figure PCTCN2019119515-appb-000021
人源化抗体的活性鉴定(方法同实施例3)
A.流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达人源OX40细胞的结合。结果如图22所示，所得抗体均可结合细胞表面的人源OX40。其中同型对照为人IgG1，图中的数据为所测细胞群的平均荧光强度值(MFI)。
B.NF-kB报告基因实验检测抗体对NF-kB信号通路的激活作用。结果如图23所示,检测抗体可激活NF-kB信号通路。其中同型对照为人IgG1，图中的数据为发光强度(Luminescence)。
C.T细胞激活实验检测抗体对T细胞的活化作用。结果如图24所示，检测抗体能显著增加记忆性CD4+T细胞IFN gamma表达量，激活T细胞。其中同型对照为人IgG1，图中数据为上清中IFN gamma含量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
附录 本发明的序列信息
mAb035-H
SEQ ID NO.1 Amino Acid Sequence(116aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000022
SEQ ID NO.2 >3626-mAb035-13-68A8G10-H(348bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000023
Figure PCTCN2019119515-appb-000024
mAb035-L
SEQ ID NO.6 Amino Acid Sequence:(107aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000025
SEQ ID NO.7 >3626-mAb035-13-68A8G10-L(321bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000026
Figure PCTCN2019119515-appb-000027
mAb053-H
SEQ ID NO.11 Amino Acid Sequence:(112aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000028
SEQ ID NO.12 >3626-mAb053-22-82G5B7-H(339bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000029
Figure PCTCN2019119515-appb-000030
Figure PCTCN2019119515-appb-000031
mAb053-L
SEQ ID NO.16 Amino Acid Sequence:(107aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000032
SEQ ID NO.17>3626-mAb053-22-82G5B7-L (321bp)
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Figure PCTCN2019119515-appb-000034
mAb041-H
SEQ ID NO.21 Amino Acid Sequence:(112aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000035
SEQ ID NO.22>3626-mAb041-17-45E5G11-H(339bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000036
Figure PCTCN2019119515-appb-000037
Figure PCTCN2019119515-appb-000038
mAb041-L
SEQ ID NO.26 Amino Acid Sequence:(111aa)
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Figure PCTCN2019119515-appb-000040
Figure PCTCN2019119515-appb-000041
mAb058-H
SEQ ID NO.31 Amino Acid Sequence:(116aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000042
SEQ ID NO.32 >3626-mAb058-25-71F5C6-H(348bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000043
Figure PCTCN2019119515-appb-000044
mAb058-L
SEQ ID NO.36 Amino Acid Sequence:(112aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000045
Figure PCTCN2019119515-appb-000046
SEQ ID NO.37 >3626-mAb058-25-71F5C6-L(336bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000047
Figure PCTCN2019119515-appb-000048
mAb034-H
SEQ ID NO.41 Amino Acid Sequence(119aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000049
SEQ ID NO.42 >3626-mAb034-12-68E3A9-H(357bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000050
Figure PCTCN2019119515-appb-000051
mAb034-L
SEQ ID NO.46 Amino Acid Sequence(111aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000052
SEQ ID NO.47 >3626-mAb034-12-68E3A9-L(333bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000053
Figure PCTCN2019119515-appb-000054
mAb049-H
SEQ ID NO.51 Amino Acid Sequence(117aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000055
SEQ ID NO.52 >3626-mAb049-20-80C8B1-H(351bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000056
Figure PCTCN2019119515-appb-000057
mAb049-L
SEQ ID NO.56 Amino Acid Sequence(106aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000058
SEQ ID NO.57 >3626-mAb049-20-80C8B1-L(321bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000059
Figure PCTCN2019119515-appb-000060
mAb064-H
SEQ ID NO.61 Amino Acid Sequence(116aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000061
SEQ ID NO.62 >3626-mAb064-27-80E5G2-H(348bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000062
Figure PCTCN2019119515-appb-000063
mAb064-L
SEQ ID NO.66 Amino Acid Sequence(107aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000064
SEQ ID NO.67 >3626-mAb064-27-80E5G2-L(321bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000065
Figure PCTCN2019119515-appb-000066
mAb033-H
SEQ ID NO.71 Amino Acid Sequence:(118aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000067
SEQ ID NO.72 >3626-mAb033-11-67G9A3-H(354bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000068
Figure PCTCN2019119515-appb-000069
Figure PCTCN2019119515-appb-000070
mAb033-L
SEQ ID NO.76 Amino Acid Sequence:(111aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000071
SEQ ID NO.77 >3626-mAb033-11-67G9A3-L(333bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000072
Figure PCTCN2019119515-appb-000073
mAb047-H
SEQ ID NO.81 Amino Acid Sequence:(117aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000074
SEQ ID NO.82 >3626-mAb047-19-76C9F6-H(351bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000075
Figure PCTCN2019119515-appb-000076
Figure PCTCN2019119515-appb-000077
mAb047-L
SEQ ID NO.86 Amino Acid Sequence:(105aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000078
SEQ ID NO.87 >3626-mAb047-19-76C9F6-L(321bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000079
Figure PCTCN2019119515-appb-000080
mAb055-H
SEQ ID NO.91 Amino Acid Sequence:(112aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000081
SEQ ID NO.92 >3626-mAb055-24-83D3H2-H(339bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000082
Figure PCTCN2019119515-appb-000083
mAb055-L
SEQ ID NO.96 Amino Acid Sequence:(107aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000084
SEQ ID NO.97 DNA Sequence:
Figure PCTCN2019119515-appb-000085
Figure PCTCN2019119515-appb-000086
Humab035-24-VH
SEQ ID NO.101 Amino Acid Sequence(116aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000087
SEQ ID NO.102 DNA Sequence(348bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000088
Humab035-24-VL
SEQ ID NO.103 Amino Acid Sequence(107aa)
Figure PCTCN2019119515-appb-000089
SEQ ID NO.104 DNA Sequence(321bp)
Figure PCTCN2019119515-appb-000090

Claims (18)

  1. 一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
    SEQ ID NO.10n+3所示的VH-CDR1，
    SEQ ID NO.10n+4所示的VH-CDR2，和
    SEQ ID NO.10n+5所示的VH-CDR3；
    其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
    其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
  2. 一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
  3. 一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
    SEQ ID NO.10n+8所示的VL-CDR1，
    SEQ ID NO.10n+9所示的VL-CDR2，和
    SEQ ID NO.10n+10所示的VL-CDR3；
    其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
    其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
  4. 一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
  5. 一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
    (1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
    (2)如权利要求3所述的轻链可变区；
    或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，
    其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
  6. 如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有如权利要求1所述的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区；
    其中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
    Figure PCTCN2019119515-appb-100001
    其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留OX40结合亲和力的衍生序列。
  7. 如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.101、1、11或21所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.103、6、16或26所示的氨基酸序列。
  8. 如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自下组：
    抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号 1 Humab035-24 101 103 2 mab035 1 6 3 mab053 11 16 4 mab041 21 26 5 mab058 31 36 6 mab034 41 46 7 mab049 51 56 8 mab064 61 66 9 mab033 71 76 10 mab047 81 86 11 mab055 91 96
    。
  9. 一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
    (i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
    (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
  10. 一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
    (1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体；以及
    (2)如权利要求9所述的重组蛋白。
  11. 如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.102、2、12、22、32、42、52、62、72、82或92所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO.104、7、17、27、37、47、57、67、77、87或97所示。
  12. 如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组：
    Figure PCTCN2019119515-appb-100002
  13. 一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
  14. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
  15. 一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
    (a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、 或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合；和
    (b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
  16. 一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
  17. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
    (i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合；以及
    (ii)药学上可接受的载体。
  18. 一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与OX40表达或功能异常相关的疾病的药物。
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