CN114920844B - 一种增强car-t功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强CAR‑T功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用，所述抗体包括OX40 BC3‑1、OX40 BC3‑4、OX40 BC3‑6和OX40 BC3‑7中的至少一种序列，所述纳米抗体能够特异性结合OX40抗原，且具有很高的亲和力和显著的抗肿瘤作用，并且还可以增强CAR‑T的功能。

Description

一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种可以增强嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)的功能的抗OX40合成纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
免疫治疗目前被认为是癌症治疗的主要替代方法之一。特别是，免疫疗法通过抑制或激活一些免疫检查点，例如PD-1/PD-L1通路(程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡1配体1，CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)，LAG-3(淋巴细胞活化基因)、OX40、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)和TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)来逆转肿瘤的免疫逃逸。
OX40，又称CD134、TNFRSF4或ACT35，是一种在CD4+和CD8+T细胞以及中性粒细胞和NK细胞中表达的膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子超家族成员，编码一种50kDd的I型跨膜糖蛋白。胞外区有191个氨基酸，包含了三个完整的以及一个稍短的富含半胱氨酸结构域(CRDs)。OX40是T细胞表面的正性共刺激分子，不表达于静止的T细胞表面，而在T细胞活化24-72小时有较高的表达，与其配体OX40L(又称CD252或TNFSF4)结合传递共刺激信号。OX40/OX40L信号在T细胞的活化、增值以及抑制凋亡过程中发挥着非常重要的作用。有研究表明，OX40通过各种信号途径，如NF-κB途径，引起细胞因子的大量产生，并产生记忆和效应T细胞。在非小细胞肺癌、卵巢癌、进展期胃癌，晚期结直肠癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤中，肿瘤免疫浸润中OX40的高表达与良好的预后有关。OX40激动剂免疫治疗可提高胶质母细胞瘤小鼠的存活率，防止卵巢癌中的肿瘤生长，并增加CD8+细胞浸润结直肠癌的预后意义。与OX40对T效应细胞(Teff)的共刺激作用相反，OX40共刺激消除了组成性表达OX40的Foxp3+Treg细胞的抑制功能。在一些动物模型中，OX40衍生信号显著抑制活化T效应细胞诱导新的Foxp3+Treg细胞。因此，OX40可能是外周Foxp3+Treg细胞的一个强有力的负调节因子。
综上所述，OX40激活效应T细胞并抑制调节T细胞，正向调控刺激肿瘤免疫，基于这些特点，OX40受体被广泛认为是新型肿瘤免疫治疗最有希望的靶点之一。
除其配体OX40L外，目前已有多种激动剂抗体亦可介导OX40的激活，例如pogalizumab，一种人源化IgG1单克隆OX40抗体已在临床(NCT02410512)上与atezolizumab联合用于晚期实体瘤的治疗，初期结果显示出良好的依从性。此外，还有例如Medi0562，IBI101和BGB-A445等激动剂抗体也纷纷进入临床阶段用于各种肿瘤的治疗。
尽管CAR-T在治疗血液癌症方面取得了成功，但它并不那么容易消除实体瘤。实体瘤通常在高度免疫抑制的环境中发展并且难以靶向，原因之一是肿瘤为环境的免疫抑制，使得T细胞失活。
2017年，美国食品药品管理局(FDA)批准了涉及CAR-T的治疗方法：来自患者的T细胞经基因改造后识别癌细胞表面上的特定蛋白，然后将这些经过基因改造的T细胞灌注到相同的患者体内，它们会对癌细胞产生靶向性免疫反应。CAR-T细胞已经成功地用于治疗白血病和淋巴瘤等血癌，而且往往取得了显著的效果，然而，这些治疗方法对实体瘤的成功率很低。当CAR-T细胞进入实体瘤时，它们很快就会失去功能。这种称为“衰竭”的状态伴随着它们表面上的PD1等免疫抑制蛋白增加，并且无法产生如干扰素γ和肿瘤坏死因子，使得CAR-T失去对肿瘤杀伤的能力。找到一种防止CAR-T细胞衰竭的方法已经成为癌症研究的重要目标。
基于上述研究，该申请通过噬菌体表面展示合成抗体库技术，制备了抗OX40的激动剂纳米抗体，可结合细胞表面的OX40，有效促进T细胞的活化和增值，发挥较好的抗肿瘤活性。此外，激活型的OX40抗体也能够增强CAR-T的功能，有望作为肿瘤免疫细胞治疗CAR-T的联用药物。
发明内容：
本发明的目的在于，解决上述现有技术的不足，利用噬菌体展示技术，合成噬菌体纳米抗体库，制备出一种靶向OX40的人源化纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性结合OX40抗原，且具有很高的亲和力和显著的抗肿瘤作用，并且还可以增强CAR-T的功能。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体，具体序列如下：
抗体号 VHH序列
OX40 BC3-1 SEQ ID NO.1
OX40 BC3-4 SEQ ID NO.2
OX40 BC3-6 SEQ ID NO.3
OX40 BC3-7 SEQ ID NO.4
本发明还公开了一种制备所述增强CAR-T功能的合成纳米抗体的方法，包括以下具体步骤：
1.噬菌体展示合成纳米抗体库的筛选：
(1)将OX40-mFc蛋白包被于96孔Nunc Maxisorp免疫板上，4℃过夜；优选OX40-mFc蛋白的浓度为30ug/mL，溶剂为磷酸盐缓冲生理盐水，100μL/孔，4孔/文库；
(2)用质量比为2％的脱脂牛奶(在磷酸盐缓冲生理盐水中)室温封闭2小时后，磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液清洗2-4次；
(3)每个文库取约1013个噬菌体(溶解于2％脱脂牛奶，溶剂为磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液)，加入至4个包被孔中，室温震荡孵育2小时；
(4)用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液清洗包被板10次，然后每孔加入100μL100mMHCl，室温震荡洗脱5分钟后，吸出洗脱液至EP管中，并加入1/8体积的1.0M Tris-HCl(pH 11)进行中和；
(5)用洗脱的噬菌体侵染3mL处于对数生长期的大肠杆菌SS320(OD600不超过1.0)，37℃，220rpm培养30分钟后取出200μL侵染产物保存，向剩余菌液加入M13KO7辅助噬菌体(终浓度至1010个/mL)继续培养1小时；
(6)将上述培养液转移接种至50mL 2YT培养基(Carb+，Kan+)中，37℃，220rpm过夜培养。
(7)重复步骤(1)至步骤(6)进行第二轮和第三轮的筛选
2.阳性克隆的分离与鉴定
(1)三轮筛选后将第二、三轮的侵染产物分别涂布到LB/Carb+平板上37℃过夜培养；
(2)次日挑菌至2YT/Carb+/辅助噬菌体(1010个/mL)中过夜培养；
(3)用ELISA方法鉴定单克隆培养上清中噬菌体与OX40-mFc的结合力强弱，挑选阳性克隆进行Sanger测序。
3.VHH-Fc抗体表达和纯化
用PCR方法将步骤2中得到的阳性克隆VHH基因从噬菌体上清中扩增出来，用Takara In-Fusion克隆试剂盒融合至带有linker+hIgG1的细胞表达载体上，将构建好的质粒转染ExpiCHO细胞，进行分泌表达。收获的细胞上清用蛋白A柱子进行亲和纯化得到带有Fc端的VHH-Fc完整纳米抗体。较佳的，上述载体中的linker序列为SEQ ID NO.5。
本发明还公开了所述增强CAR-T功能的合成纳米抗体的应用方法，包括以下具体步骤：
1.OX40 VHH-Fc抗体与OX40稳转细胞株的特异性结合：
(1)表达OX40蛋白的稳定细胞株的构建；
(2)流式特异性结合试验(FACS)检测抗体与L929细胞株稳定表达OX40蛋白的结合；
(3)流式特异性结合试验(FACS)检测抗体与Jurkat细胞株稳定表达OX40蛋白的结合。
2.OX40VHH-Fc抗体对NF-kB信号通路的有效激活：
(1)Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40稳定细胞系的构建；
(2)L929-CD32b稳定细胞系的构建；
(3)NF-kB报告基因实验。
3.通过表面等离子共振(SPR)分析抗OX40抗体与hOX40的动力学亲和力常数；
4.抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；
(1)通过报告基因法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；
(2)通过流式检测法(FACS)检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用。
本发明的优点是：1.本发明以有效展示所获得的OX40抗体与OX40抗原，OX40L及相关稳转细胞系的特异性结合作用，验证其对NF-kB信号通路的激活效果，证明本发明所获得的OX40VHH-Fc纳米抗体具有皮摩尔级别的亲和力和显著的抗肿瘤等作用活性，最高能增强约60％的CAR-T活性。
附图说明：
图1为L929-hOX40细胞株的人OX40表达的FACS分析结果；
图2为Jurkat-hOX40细胞株的人OX40表达的FACS分析结果；
图3为FACS检测抗OX40纳米抗体与L929-hOX40细胞株的结合反应的结果；
图4为FACS检测抗OX40纳米抗体与Jurkat-hOX40细胞株的结合反应的结果；
图5为使用荧光素酶方法检测Jurkat/NFkB-Luc-hOX40稳转细胞株经PMA/Ionomycin刺激后NFkB RE-Luciferase的表达水平的结果；
图6为FACS检测Jurkat/NFkB-Luc-hOX40稳转细胞株hOX40的表达水平的结果；
图7为FACS检测L929-hCD32b稳转细胞株hCD32b的表达水平的结果；
图8为NFkB报告基因实验检测抗OX40纳米抗体对NFkB信号通路的激活作用的结果；
图9为使用NFkB报告基因方法，检测Jurkat/NFkB-Luc-hOX40稳转细胞株中抗OX40纳米抗体与hOX40L竞争结合人OX40蛋白的结果；
图10为FACS检测L929-OX40细胞株中OX40纳米抗体与hOX40L竞争结合人OX40蛋白的结果；
图11为OX40纳米抗体增加CAR-T对N87细胞杀伤的结果：靶细胞(N87-Luc)效靶比＝1∶5，48小时。
具体实施方式：
实施例1：OX40 VHH-Fc纳米抗体的制备
1.噬菌体抗体库的筛选
(1)将OX40-mFc蛋白(30ug/mLin磷酸盐缓冲生理盐水，100μL/孔，4孔/文库)包被于96孔Nunc Maxisorp免疫板上，4℃过夜；
(2)用2％脱脂牛奶(in磷酸盐缓冲生理盐水)室温封闭2小时后，磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液清洗2-4次；
(3)每个文库取约1013个噬菌体(溶解于2％脱脂牛奶in磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液)，加入至4个包被孔中，室温震荡孵育2小时。
(4)用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤液清洗包被板10次，然后每孔加入100μL100mMHCl，室温震荡洗脱5分钟后，吸出洗脱液至EP管中，并加入1/8体积的1.0M Tris-HCl(pH 11)进行中和；
(5)用洗脱的噬菌体侵染3mL处于对数生长期的SS320(OD600不超过1.0)，37℃，220rpm培养30分钟后取出200μL侵染产物保存，向剩余菌液加入M13KO7辅助噬菌体(终浓度至1010个/mL)继续培养1小时。
(6)将上述培养液转移接种至50mL 2YT培养基(Carb+，Kan+)中，37℃，220rpm过夜培养。
(7)重复步骤(1)至步骤(6)进行第二轮和第三轮的筛选。
(8)三轮筛选后将第二、三轮的侵染产物分别涂布到LB/Carb+平板上37℃过夜培养；
(9)次日挑菌至2YT/Carb+/辅助噬菌体(1010个/mL)中过夜培养。
(10)用ELISA方法鉴定单克隆培养上清中噬菌体与OX40-mFc的结合力强弱，挑选阳性克隆进行Sanger测序。
通过三个批次的重复筛选(每个批次筛选3轮)，共得到4个不同的阳性克隆序列(见表1)。
表1
2.VHH-Fc抗体表达纯化
用PCR方法将20个阳性克隆VHH基因从噬菌体上清中扩增出来，用Takara In-Fusion克隆试剂盒融合至带有linker+hIgG1的细胞表达载体上。将构建好的质粒转染ExpiCHO细胞，进行分泌表达。
收获的细胞上清用蛋白A柱子进行亲和纯化，得到上述20种靶向OX40的人源化纳米抗体。
实施例2：OX40 VHH-Fc抗体与OX40稳转细胞株的特异性结合
1.表达OX40蛋白的稳定细胞株的构建：
将编码人源OX40全长氨基酸序列的核苷酸序列克隆到质粒载体并进行质粒制备。对L929和Jurkat细胞系分别进行hOX40质粒转染，分别在含500ug/mL潮霉素(Hygromycin)的DMEM+10％FBS和RPMI1640+10％FBS培养液中选择性培养，一周后挑取存活的细胞，用有限稀释法在96孔培养板中进行克隆，大约2周后选择部分单克隆扩增至24孔板中，并在大约3～4天后扩增至6孔板中。对扩增后的单克隆用抗人OX40抗体经流式检测进行筛选。选择长势较好，荧光强度较高，单克隆的细胞系继续扩大培养(潮霉素减半)并液氮冻存，最终得到表达人OX40蛋白的L929和Jurkat稳定细胞株(此处称L929-hOX40和Jurkat-hOX40稳定细胞株)。图1和图2表明，已经筛选得到稳定表达人OX40的L929和Jurkat稳定细胞株。
2.流式特异性结合试验(FACS)检测抗体与L929细胞株稳定表达OX40蛋白的结合
将上述构建的L929-hOX40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)洗涤后，用0.25％Trypsin(购自Thermofisher)消化至单个细胞悬液，用含10％FBS培养液进行中和后，进行计数。1000rpm离心5分钟后用FACS缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水+1％FBS)重悬至2×106细胞/mL，按照每孔200μL加入96孔FACS培养板中，1000rpm离心5分钟后去上清，加入一系列浓度梯度的抗人OX40纯化待测抗体，每孔200μL，4℃避光孵育1小时，1000rpm离心5分钟后加入每孔200μLPE荧光标记的anti-human FC二抗(购自Invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤2次，加入每孔200μL含1％多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水缓冲液重悬细胞，用FACS仪器(BD Accuri C6)进行检测和分析。结果如图3所示，抗人OX40待测抗体可特异性结合细胞表面的hOX40蛋白。其中Isotype为抗体亚型人源对照IgG，图中的MFI为所测细胞群的平均荧光强度值。表2为抗体与L929细胞株稳定表达OX40蛋白的结合。
表2
No. Sample ID Max Value EC50(pM)
1 Isotype Control 8957 /
2 BC3-1 284630 488.2
3 BC3-4 307936 861.9
4 BC3-6 198371 545.2
5 BC3-7 327102 692.6
6 MoxR-0916 453233 570.0
3.流式特异性结合试验(FACS)检测抗体与Jurkat细胞株稳定表达OX40蛋白的结合
将1中构建的Jurkat-hOX40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养，取对数生长期的细胞进行计数。1000rpm离心5分钟后用FACS缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水+1％FBS)重悬至2×106细胞/mL，按照每孔200μL加入96孔FACS培养板中，1000rpm离心5分钟后去上清，加入一系列浓度梯度的抗人OX40纯化待测抗体，每孔200μL，4℃避光孵育1小时，1000rpm离心5分钟后加入每孔200μLPE荧光标记的抗人FC二抗(购自Invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤2次，加入每孔200μL含1％多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水缓冲液重悬细胞，用FACS仪器(BD Accuri C6)进行检测和分析。结果如图4所示，抗人OX40待测抗体可特异性结合细胞表面的hOX40蛋白。其中Isotype为抗体亚型人源对照IgG，图中的MFI为所测细胞群的平均荧光强度值。表3为抗体与Jurkat细胞株稳定表达OX40蛋白的结合。
表3
No. Sample ID Max Value EC50(pM)
1 Isotype Control 998.7 /
2 BC3-1 17457 256.5
3 BC3-4 23969 394.7
4 BC3-6 12806 682.8
5 BC3-7 24120 548.4
6 MoxR-0916 30215 298.5
实施例3：OX40 VHH-Fc抗体有效激活NF-kB信号通路
1.Jurkat/NFkB-Luc-hOX40稳定细胞系的构建
将pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro]质粒(购自Promega)转染至Jurkat细tu得到稳定表达NF-kB-RE-Luc的Jurkat细胞株(此处称为Jurkat/NF-kB-Luc)。
构建OX40慢病毒质粒，包装慢病毒后感染Jurkat-NF-kB-Luc细胞，同时用含潮霉素(Hygromycin)和10％FBS的RPMI1640培养液进行培养，筛选得到稳定表达NF-kB-RE-Luc和OX40的Jurkat细胞株(此处称为Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40)。图5为NF-Kb报告基因的实验结果，表明筛选得到的Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40细胞株稳定表达NF-kB-RE荧光素酶(Luciferase)。图6为FACS检测结果，表明筛选得到的Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40细胞株稳定表达hOX40。
2.L929-CD32b稳定细胞系的构建
对L929细胞系进行hCD32b质粒转染，在含600ug/ml潮霉素(Hygromycin)的DMEM+10％FBS培养基中选择性培养，挑取存活的细胞进行克隆，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，大约2周后选择部分单克隆扩增至24孔板中，并在大约3～4天后扩增至6孔板中。对扩增后的克隆用CD32b抗体(购自Stemcell)经流式检测进行筛选。图7为FACS检测结果，表明筛选得到的L929-hCD32b细胞株稳定表达hCD32b。
3.NF-kB报告基因实验
将步骤2中筛选得到的L929-hCD32b细胞扩大培养，收集后用含10％FBS的DMEM培养液重悬，将细胞以2×104/孔的密度接种于96孔培养板中。过夜后弃去上清，以5×104/孔的细胞密度加入实例3.1筛选得到的Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40细胞，再加入一系列浓度梯度的抗人OX40待测抗体，放入CO2细胞培养箱中继续培养5小时。用ONE-Glo荧光素酶检测系统(购自Promega)测定荧光素酶的含量。结果如图8所示，表明所述抗人OX40待测抗体能显著激活NF-kB信号通路。表4为抗人OX40待测抗体激活NF-kB信号通路。
表4
No. Sample ID Max Value EC50(pM)
1 Isotype Control 2650 /
2 BC3-1 53365 209.2
3 BC3-4 55747 175.1
4 BC3-6 50273 162.4
5 BC3-7 48390 129.8
6 MoxR-0916 29821 216.9
实施例4：通过表面等离子共振(SPR)分析抗OX40抗体与hOX40的动力学亲和力常数
抗人OX40抗体对针对重组的人OX40的结合动力学通过表面等离子共振(surface/plasmon resonance，SPR)方法，使用Biacore 8K仪器(序列号29327020-2473040，GE)实时检测反应信号，以获得结合和解离曲线。蛋白A芯片(目录号29127556，GE)偶联人his标签OX40抗原，将抗人OX40待测抗体用runningbuffer稀释至90-5.62nM，二倍梯度稀释共5个浓度点。进样时间为180秒，解离时间为1800s，再生时间为60秒，缓冲液为HBS-EP+，再生buffer为10nM glycine-HCl(pH1.5)。使用简单一对一Languir结合模型(Biacore评价软件3.0版InsightEvaluation Software v3.0)计算结合速率(Kon)和解离速率(Koff)。平衡解离常数(kD)以比率koff/kon计算。结果请详见表5。表5为抗人OX40待测抗体与hOX40结合动力学检测。
表5
NO. Sample ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1 MoxR-0916 5.41E+5 1.30E-4 2.40E-10
2 BC3-1 NA NA NA
3 BC3-4 2.87E+5 2.38E-2 8.29E-08
4 BC3-6 NA NA NA
5 BC3-7 3.27E+5 3.59E-3 1.10E-08
实施例5：抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用
1.通过报告基因法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用
取实施例3步骤1中构建的筛选得到的Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40细胞，以5×104/孔的细胞密度加入96孔细胞培养板中，稀释人OX40L蛋白至0.3ug/ml浓度和一系列梯度稀释的抗人OX40待测抗体同时加入细胞，在CO2培养箱中孵育5小时后进行荧光素酶含量测定。结果如图9所示，表明抗人OX40待测抗体可在不同程度上抑制OX40L与OX40的结合，进一步表明待测抗体与OX40L存在表位竞争关系。
2.通过流式检测法(FACS)检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用
将实施例2步骤1中构建的L929-hOX40稳定细胞株在细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，磷酸盐缓冲生理盐水磷酸盐缓冲液洗涤后，用0.25％Trypsin(购自Thermofisher)消化至单个细胞悬液，用含10％FBS培养液进行中和后，并进行计数。1000rpm离心5分钟后用FACS缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水+1％FBS)重悬至2×106细胞/mL，按照每孔200μL加入96孔FACS培养板中，1000rpm离心5分钟后弃上清，同时加入0.5ug/ml浓度的抗人OX40待测抗体和一系列梯度稀释的OX40L蛋白，4℃避光孵育1小时，1000rpm离心5分钟后加入每孔200μLPE荧光标记的抗人FC二抗(购自Invitrogen)，4℃避光孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤2次，每孔加入200μL含1％多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水缓冲液重悬细胞，用FACS仪器(BD Accuri C6)进行检测和分析。
结果如图10所示，表明抗人OX40待测抗体和OX40L竞争与OX40的结合，结合报告基因OX40抑制实验验证抗OX40的待测抗体与OX40L存在表位竞争关系。
实施例6：抗人OX40抗体对CAR-T毒性的增强作用
我们接下来研究OX40抗体对CAR-T功能的影响。将N87靶向的CAR-T细胞与N87乳腺癌细胞共培养48小时(效靶比1∶5)，同时加入磷酸盐缓冲生理盐水或10nM的OX40抗体(BC3-1，BC3-4，BC3-6，BC3-7)。然后用磷酸盐缓冲生理盐水将T细胞从板中洗出，使用Cell TiterGlo测定法(Promega)测量剩余的活N87细胞检测CAR-T的细胞毒性。我们发现OX40抗体可以增强CAR-T对N87细胞的毒性(图11)。
序列表
<110> 上海润诺生物科技有限公司
<120> 一种增强CAR-T 功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Pro Phe Asp Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ala Glu Tyr Pro Gly Glu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asn Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Tyr Leu Gly Tyr Glu Asn Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Ser Tyr Asp Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Val Phe Asn Trp Tyr Pro Tyr Glu Ala Gln Glu Gly Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Asp Phe Asp
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Phe Gly Val Leu Glu Ser Val Ala Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (2)

1.一种靶向 OX40 的合成纳米抗体，其特征在于，包括以下序列中的一种： SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4。
2.如权利要求1所述的一种靶向 OX40 的合成纳米抗体，其性能参数的测试方法包括以下具体步骤：
a. OX40 VHH-Fc抗体与OX40稳转细胞株的特异性结合:
（1）表达OX40蛋白的稳定细胞株的构建；
（2）流式特异性结合试验检测抗体与L929细胞株稳定表达OX40蛋白的结合；
（3）流式特异性结合试验检测抗体与Jurkat细胞株稳定表达OX40蛋白的结合;
b. OX40 VHH-Fc抗体对NF-kB信号通路的有效激活:
（1）Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40稳定细胞系的构建；
（2）L929-CD32b稳定细胞系的构建；
（3）NF-kB报告基因实验；
c 通过表面等离子共振分析抗OX40抗体与hOX40的动力学亲和力常数;
d. 抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；
（1）通过报告基因法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；
（2）通过流式检测法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341388A (zh) * 2013-10-16 2015-02-11 上海润诺生物科技有限公司 芳香族酰胺类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
WO2020103836A1 (zh) * 2018-11-20 2020-05-28 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
CN112794907A (zh) * 2020-12-03 2021-05-14 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体
CN114656564A (zh) * 2021-12-20 2022-06-24 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341388A (zh) * 2013-10-16 2015-02-11 上海润诺生物科技有限公司 芳香族酰胺类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
WO2020103836A1 (zh) * 2018-11-20 2020-05-28 上海开拓者生物医药有限公司 Ox40抗体及其制备方法和应用
CN112794907A (zh) * 2020-12-03 2021-05-14 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体
CN114656564A (zh) * 2021-12-20 2022-06-24 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OX40/OX40L在免疫应答中的作用及与疾病关系的研究进展;许香广;;中国实用医药(第14期);第145-147页 *
一株抗人OX40激发型单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究;毛辉等;《现代免疫学》;第30卷(第3期);第195-201页 *

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