CN114181296B - 一种高亲和力的pd-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高亲和力的PD‑1膜外区突变体，所述PD‑1膜外区突变体由选自SEQ ID NO.5的氨基酸序列组成。本发明进一步提供了所述高亲和力的PD‑1膜外区突变体的融合蛋白及其应用。本发明创造性的合成了高亲和力的PD‑1膜外区突变体或其融合蛋白，所述融合蛋白与野生型PD‑1相比具有更高的结合人PD‑L1或PD‑L2的亲和力、更大的效力。本发明的融合蛋白为肿瘤的免疫治疗提供了更加广阔的途径。

Description

一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合 物和用途
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合物和用途。
背景技术
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的，肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中热点之一，临床试验中也取得了显著的治疗效果。PD-1及其配体PD-L1/L2介导了对T细胞的抑制“耗竭”以及诱导免疫耐受的作用，肿瘤细胞表面高表达的PD-L1/L2与PD-1相互作用导致肿瘤细胞的免疫逃逸，因此抑制PD1～PD-L1/L2信号通路，重新激活被抑制的免疫系统成为最近免疫治疗的热点。
程序性死亡受体1(PD-1，也称PDCD1和CD279)，由日本京都大学本庶佑(HonjoTasuku)教授于1992年发现。PD-1分为胞外区、跨膜区和胞质区三个部分，含有288个氨基酸的蛋白，分子量约为50～55kD。胞外区含一个IgV样结构域，是与PD-1的配体结合并进而诱导免疫应答功能的区域，该区域含有4个N糖基化位点；胞质区含有1个ITIM(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，也即免疫受体酪氨酸抑制基序)，和1个ITSM(Immunoreceptor tyrosine-based switch motif，也即免疫受体酪氨酸转化基序)，其中，ITSM的激活与效应性T细胞免疫应答密切相关。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞及髓系细胞上，主要在维持T细胞耗竭中发挥重要作用，具有抑制T细胞的效应功能,因而慢性病原体和肿瘤细胞利用PD-1通路逃避免疫应答。
PD-L1蛋白：华裔科学家陈列平教授于1999年发现B7-H1，该蛋白随后在2000年被证实能够特异性结合PD-1，并命名为PD-L1，即程序性死亡分子配体-1(programmed deathligand 1,也称CD274和B7-H1)；PD-L1分为胞外区、跨膜区疏水区和胞质区三个部分，由290个氨基酸亚基组成；其中胞外区包含两个免疫球蛋白恒定区IgC和IgV样结构域，胞质区是由30个氨基酸组成。PD-L1主要表达于成熟的CD4+、CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞；同时PD-L1常常高表达于多种肿瘤细胞表面，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌等，同时，肿瘤细胞PD-L1的高表达与肿瘤患者较差的预后、肿瘤的复发有关，并且与肿瘤大小、淋巴结受累、分级、总生存期也相关。
PD-L2蛋白：PD-1的另一个配体PD-L2即程序性死亡分子配体-2(programmeddeath ligand2,也称CD273和B7-DC)是2001年被发现，PD-L2由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，PD-L2与PD-L1有很高的相似性，PD-L2与PD-1相互作用能够抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和T细胞溶解作用，但PD-L2与PD-1的亲和力是PD-L1的2～6倍。PD-L2在巨噬细胞、树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达，同时多种方法检测到PD-L2在肿瘤细胞中的表达，而其中一些样本中并未检测到PD-L1的表达。因此能够同时高效阻断PD-1～PD-L1以及PD-1～PD-L2的药物有待进一步开放。
2005年，日本小野制药和美国Medarex制药共同合作开发PD-1抗体药物Nivolumab，并于2009年被百时美施贵宝收入囊中。2009年默沙东收购先灵葆雅，获得PD-1抗体药物Pembrolizumab的后续开发权。2014年，百时美施贵宝的Nivolumab和默沙东的Pembrolizumab相继获得上市批准。
2016年，基因泰克的PD-L1抗体Atezolizumab获得FDA批准上市；2017年辉瑞与默沙东的PD-1抗体药物Bavencio和阿斯利康的PD-1抗体药物Imfinzi相继上市。多家大公司将这个肿瘤免疫治疗药物视为未来几年立足肿瘤免疫治疗领域的重磅产品。
尽管目前已有多个PD-1和PD-L1抗体的药物上市，但基于PD-1的融合蛋白的药物鲜有报道；而且能够同时高效阻断PD-1～PD-L1以及PD-1～PD-L2的药物也亟待开发，以更有效地阻断PD-l的信号通路。
肿瘤细胞表面高表达的PD-L1/L2与PD-1相互作用导致肿瘤细胞的免疫逃逸，用PD-1或PD-L1的抗体阻断该通路可激活免疫系统，进而杀伤肿瘤细胞。而由于相关PD-L1/L2和PD-1在免疫细胞上同样也有表达，考虑到PD-1/PD-L1抗体如果具有太强的ADCC、CDC、ADCP等活性会杀伤自体的免疫细胞，因而PD-1/PD-L1抗体大多设计为阻断性的抗体，而不具有ADCC、CDC等作用。如百时美施贵宝的Nivolumab和默沙东的Pembrolizumab等PD-1抗体均采用弱ADCC活性的IgG4亚型；基因泰克的PD-L1抗体Atezolizumab采用去掉糖基化位点IgG1亚型，基本不具有ADCC活性；阿斯利康的Imfinzi则通过突变了IgG1的三个氨基酸(L234F,L235E,P331S)去除ADCC活性。
而辉瑞/默克的Avelumab却采用了具有ADCC、CDC等活性的IgG1亚型，因PD-L1在肿瘤细胞显著高表达上，强ADCC活性的PD-L1抗体也有其优势，那就是解除癌细胞免疫逃逸的同时，也可以结合ADCC作用介导NK细胞杀伤癌细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高亲和力的PD-1膜外区突变体、以及包含该高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白。
本发明的目的还在于提供包含上述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白药的物组合物及其用途。
为实现上述目的，本发明首先提供一种高亲和力的PD-1膜外区突变体，所述PD-1膜外区突变体由选自SEQ ID NO.5的氨基酸序列组成。在一实施例中PD-1膜外区突变体是M2C5，其具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M3H6，其具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M4B3，其具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列；在一实施例中PD-1膜外区突变体是M5G8，其具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
进一步地，本发明还提供了一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白，所述融合蛋白包括PD-1膜外区突变体和Fc片段/6×His，所述PD-1膜外区突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述融合蛋白与PD-L1的亲和力与野生型PD-1相比提高至少50倍；在一实施例中，本发明的融合蛋白与PD-L1的亲和力与野生型PD-1相比提高1000倍以上；所述融合蛋白与PD-L2的亲和力与野生型PD-1相比提高至少10倍；在一实施例中，本发明的融合蛋白与PD-L2的亲和力与野生型PD-1相比提高300倍以上。
优选地，所述融合蛋白还包括Fc片段，所述Fc片段选自人IgG1或IgG4的Fc及其突变型，其中人IgG1 Fc的N298A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中人IgG4Fc的S228P突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述融合蛋白还包括6×His，所述6×His的氨基酸序列如SEQ ID NO.20。
优选地，所述PD-1膜外区突变体通过Linker与Fc片段、6×His连接成融合蛋白，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的DNA序列的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或试剂盒，如所述试剂盒用于检测PD-L1或(和)PD-L2的存在或其水平。
进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白；可选的，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明所述的载体为药学上可以接受的载体，其指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
优选的，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选的，所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
进一步地，本发明还提供了所述高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白在制备如下药物中的用途:
(1)阻断PD-1与PD-L1结合的药物；
(2)阻断PD-1与PD-L2结合的药物；
(3)同时阻断PD-1与PD-L1以及PD-1与PD-L2结合的药物；
(4)调节PD-L1或/和PD-L2活性或水平的药物；
(5)解除PD-1对机体免疫抑制的药物；或者
(6)提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物。
进一步地，本发明还提供了所述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞性肺癌、结肠直肠癌、肾肿瘤、膀肮癌、胃肠道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌和白血病。
更进一步地，本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白，所述试剂盒用于检测PD-L1或/和PD-L2的存在或其水平。
有益效果
本发明创造性的合成了高亲和力的PD-1膜外区突变体或其融合蛋白，所述融合蛋白与野生型PD-1相比具有更高的结合人PD-L1或PD-L2的亲和力、更大的效力。本发明的融合蛋白为肿瘤的免疫治疗提供了更加广阔的途径。
附图说明
图1本发明制备的PD-1及其变体序列对比图；
图2本发明制备的PD-1及其突变体融合蛋白结构示意图；
图3本发明制备的PD-1及其突变体融合蛋白编码DNA结构示意图；
图4本发明应用的PTT5载体图谱；
图5本发明制备的PD-1及其突变体-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L1结合ELISA测定；A:M2C5-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L1的结合活性；B:M3H6-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L1的结合活性；C:M4B3-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L1的结合活性；D:M5G8-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L1的结合活性；
图6本发明制备的PD-1及其突变体融合蛋白与PD-L2结合ELISA测定；A:M2C5-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L2的结合活性；B:M3H6-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L2的结合活性；C:M4B3-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L2的结合活性；D:M5G8-IgG1-Fc融合蛋白与PD-L2的结合活性；
图7本发明制备的PD-1变体融合蛋白与PD-1/Fc-Biotin竞争结合PD-L1的活性测定；A:M2C5-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L1的活性；B:M3H6-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L1的活性；C:M4B3-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L1的活性；D:M5G8-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L1的活性；
图8本发明制备PD-1变体融合蛋白与PD-1/Fc-Biotin竞争结合PD-L2的活性测定；A:M2C5-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L2的活性；B:M3H6-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L2的活性；C:M4B3-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L2的活性；D:M5G8-IgG1-Fc融合蛋白竞争结合PD-L2的活性；
图9本发明制备的PD-1变体融合蛋白激活PBMC活性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中提到的简称PD-1膜外区突变体、PD-1变体都是指高亲和力的PD-1膜外区突变体；本发明的变体融合蛋白是指高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白。
本发明用的野生型的PD-1序列来自数据库UniProtKB中Q15116的胞外区序列。
实施例1：PD-1变体-Fc融合蛋白的表达载体构建
本发明制备的野生型PD-1及其高亲和力的PD-1膜外区4个突变体的氨基酸序列及突变位点如图1所示，PD-1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；变体M2C5的氨基酸序列为SEQ IDNO.2；变体M3H6氨基酸的序列为SEQ ID NO.3；变体M4B3氨基酸的序列为SEQ ID NO.4；变体M5G8的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
PD-1及其变体通过linker(氨基酸序列：SEQ ID NO.6)与IgG1 Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.8)、IgG4 Fc(氨基酸序列：SEQ ID NO.9)或6×His(氨基酸序列：SEQ ID NO.20)等连接形成融合蛋白，其蛋白结构示意图如图2所示。
为在哺乳动物细胞中分泌表达PD-1及其变体，在构建表达载体时需在其N段加上分泌表达的信号肽(氨基酸序列：SEQ ID NO.7)，其编码DNA结构如图3所示。采用pTT5作为表达载体(图4)，分别合成PD-1及其突变体融合蛋白编码的DNA序列(SEQ ID NO.10～SEQID NO.22，如表1所示)。通过常规PCR在5’端引入EcoRI酶切位点，在3’端引入NotI酶切位点，插入到PTT5载体的EcoRI和NotI之间，构建获得真核表达载体。
表1 PD-1及其变体融合蛋白的氨基酸和DNA序列表
Figure BDA0003391685930000071
Figure BDA0003391685930000081
实施例2：PD-1及其变体融合蛋白的表达和纯化
通过293E细胞(Invitrogen公司购买)的瞬时转染来表达重组PD-1及其变体融合蛋白。将处于对数生长期的293E细胞以4×105/mL密度接种于摇瓶中，置37℃、5％的CO2摇床125r/min培养24小时后进行转染。
每100mL的293E细胞，取5mL的OPTI-MEM加入200μg的质粒，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取5mL的OPTI-MEM加入600μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％的CO2摇床125r/min培养，第4、6天流加补料,第8天收获上清。以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。采用AKTA(GE公司)进行分离纯化，表达的Fc融合蛋白过Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)，pH在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调pH值至6.0，超滤浓缩后获得PD-1及其突变体的融合蛋白；表达的6×His融合蛋白过镍柱(HisTrap HP)，通过200mM咪唑洗脱，超滤置换缓冲液并浓缩后获得的6×His融合蛋白。
实施例3：PD-1及其变体融合蛋白与PD-L1结合活性分析
包被液稀释PD-L1/His抗原(购买于Sino Biological，货号10084-H08H)至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1×PBS稀释PD-1及其突变体的融合蛋白至15μg/mL，并以3倍梯度稀释后，以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人Fc-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利用Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC50。
结果：PD-1及其突变体与IgG1-Fc的融合蛋白与PD-L1的ELISA结合活性如图5所示，PD-1变体(M2C5、M3H6、M4B3和M5G8)与PD-L1结合活性远高于野生型的PD-1(>1000倍)；与PD-L1抗体Atezolizumab相比，结合活性在同一数量级，其中M3H6和M4B3的结合活性略高于Atezolizumab。
实施例4：PD-1及其突变体融合蛋白与PD-L2结合活性分析
包被液稀释PD-L2/His抗原(购买于Sino Biological，货号10292-H08H)至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1×PBS稀释PD-1(463)至15μg/mL，并以3倍梯度稀释后，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人Fc-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利用Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC50。
结果：PD-1及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白与PD-L2的ELISA结合活性如图6所示，PD-1变体(M2C5、M3H6、M4B3和M5G8)与PD-L2结合活性远高于野生型的PD-1(>300倍)；而PD-L1抗体Atezolizumab基本不与PD-L2相结合。
实施例5竞争结合PD-L1的活性
包被液稀释PD-L1/Fc抗原(购买于Sino Biological，货号10084-H02H)至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1×PBS稀释PD-1/Fc-Biotin至1.25μg/mL，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度100μg/mL，并进行2倍稀释共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制结合曲线。
结果：PD-1及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白与PD-1/Fc-Biotin竞争结合PD-L1，其竞争ELISA结合活性如图7所示，PD-1变体(M2C5、M3H6、M4B3和M5G8)的竞争活性远高于野生型的PD-1。
实施例6竞争结合PD-L2的活性
包被液稀释PD-L2/Fc抗原(购买于Sino Biological，货号10292-H02H)至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1×PBS稀释PD-1/Fc-Biotin至5μg/mL，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度100μg/mL，并进行2倍稀释共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2NH2SO4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制结合曲线。
结果：PD-1及其变体与IgG1-Fc的融合蛋白与PD-1/Fc-Biotin竞争结合PD-L2，其竞争ELISA结合活性如图8所示，PD-1变体(M2C5、M3H6、M4B3和M5G8)的竞争活性远高于野生型的PD-1。
实施例7亲和力检测
使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与PD-L1和PD-L2抗原的结合动力学和亲合力。除非另有说明，可以从GE公司购买所有试剂和材料，并且可以在25℃下进行测量。亲和力分析通过SPR(Biacore T200)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗人IgG Fc的抗体，将各待测抗体在以30μL/min的流速流入，用偶联于芯片上的抗人IgG Fc的抗体捕获待测抗体；分析物(PD-L1或PD-L2)梯度稀释后(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM和0nM)，以流速30μL/min的流速流入，待测抗体与分析物结合时间120s，解离时间1200s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，芯片用10mM甘氨酸HCl、pH 2.1溶液60秒脉冲进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定平衡解离常数KD。
结果:PD-1及其变体的平衡解离常数KD测定结果见下表2，PD-1变体(M2C5、M3H6、M4B3和M5G8)与PD-L1和PD-L2的亲和力都远高于野生型的PD-1。
表2 PD-1变体亲和力测定值
Figure BDA0003391685930000111
实施例8PBMC激活实验
取5名健康志愿者全血混合，利用人淋巴细胞分离液(购买于Solarbio|货号：P8610)分离人外周血单核细胞PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells)细胞，生理盐水洗细胞2遍，10％FBS 1640培养基重悬细胞并计数，以1×105/孔接种于96孔板中，每孔接种50μL。10％FBS 1640培养基配置最适抗体刺激浓度(anti-CD3/CD28终浓度为1ug/ml)以及PD-L1抑制浓度(终浓度为10μg/ml)加入相应的孔中。配制PD1变体及Atezolizumab的样品终浓度至0μg/mL、0.625μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、40μg/mL加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。
结果表明，如图9所示，PD1变体激活PBMC以及释放IFN-γ的活性优于或与PD-L1抗体Atezolizumab基本一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏东抗生物医药科技有限公司
<120> 一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白及其药物组合物和用途
<130> P210260
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> PD-1
<400> 1
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
20 25 30
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
85 90 95
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
100 105 110
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
115 120 125
Pro
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> M2C5
<400> 2
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
20 25 30
Leu Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Asn Gln Pro Ala Gln Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Ile Cys Gly Ala Ile Ser
85 90 95
Leu Ala Pro Lys Ser Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
100 105 110
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
115 120 125
Pro
<210> 3
<211> 129
<212> PRT
<213> M3H6
<400> 3
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
20 25 30
Leu Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Tyr Asn Gln Pro Val Gln Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Ile Cys Gly Ala Ile Ser
85 90 95
Leu Gly Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
100 105 110
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
115 120 125
Pro
<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> M4B3
<400> 4
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
20 25 30
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Asn Gln Pro Leu Gln Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Tyr
85 90 95
Leu Gly Pro Lys Val Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
100 105 110
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
115 120 125
Pro
<210> 5
<211> 129
<212> PRT
<213> M5G8
<400> 5
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
20 25 30
Leu Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Lys Asn Gln Pro Leu Gln Asp Cys Arg Phe
50 55 60
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Tyr
85 90 95
Leu Gly Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
100 105 110
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
115 120 125
Pro
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> signal peptide
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> IgG1 Fc
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 229
<212> PRT
<213> IgG4 Fc
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 10
<211> 1146
<212> DNA
<213> PD-1-IgG1 Fc DNA
<400> 10
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcgtgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg accggagcca gcccggccag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatcagcct ggcccccaag 360
gcccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgacaa gacccacacc 480
tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc 540
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 600
gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 660
aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag tacgccagca cctaccgggt ggtgagcgtg 720
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 780
aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag 840
ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgg gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 900
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 960
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1020
ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc 1080
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcccc 1140
ggcaag 1146
<210> 11
<211> 1146
<212> DNA
<213> M2C5-IgG1 DNA
<400> 11
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gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
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tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc 540
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ggcaag 1146
<210> 12
<211> 1146
<212> DNA
<213> M3H6-IgG1 DNA
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atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
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<210> 13
<211> 1146
<212> DNA
<213> M4B3-IgG1 DNA
<400> 13
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gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
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aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 600
gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 660
aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag tacgccagca cctaccgggt ggtgagcgtg 720
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 780
aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag 840
ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgg gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 900
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 960
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1020
ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc 1080
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcccc 1140
ggcaag 1146
<210> 14
<211> 1146
<212> DNA
<213> M5G8-IgG1 DNA
<400> 14
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcctgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg acaagaacca gcccctgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatctacct gggccccaag 360
gcccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgacaa gacccacacc 480
tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc 540
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 600
gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 660
aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag tacgccagca cctaccgggt ggtgagcgtg 720
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 780
aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag 840
ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgg gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 900
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 960
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1020
ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc 1080
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcccc 1140
ggcaag 1146
<210> 15
<211> 1152
<212> DNA
<213> PD-1-IgG4
<400> 15
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcgtgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg accggagcca gcccggccag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatcagcct ggcccccaag 360
gcccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgagag caagtacggc 480
cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc 540
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 600
gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 660
gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtg 720
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 780
agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc 840
cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg 900
agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 960
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggacag cgacggcagc 1020
ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaggg caacgtgttc 1080
agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1140
agcctgggca ag 1152
<210> 16
<211> 1152
<212> DNA
<213> M2C5-IgG4
<400> 16
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcctgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg accggaacca gcccgcccag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac atctgcggcg ccatcagcct ggcccccaag 360
agccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgagag caagtacggc 480
cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc 540
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 600
gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 660
gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtg 720
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 780
agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc 840
cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg 900
agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 960
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggacag cgacggcagc 1020
ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaggg caacgtgttc 1080
agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1140
agcctgggca ag 1152
<210> 17
<211> 1152
<212> DNA
<213> M3H6-IgG4
<400> 17
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcctgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg actacaacca gcccgtgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac atctgcggcg ccatcagcct gggccccaag 360
atccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgagag caagtacggc 480
cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc 540
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 600
gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 660
gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtg 720
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 780
agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc 840
cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg 900
agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 960
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggacag cgacggcagc 1020
ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaggg caacgtgttc 1080
agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1140
agcctgggca ag 1152
<210> 18
<211> 1152
<212> DNA
<213> M4B3-IgG4
<400> 18
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcgtgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg accggaacca gcccctgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatctacct gggccccaag 360
gtgcagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgagag caagtacggc 480
cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc 540
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 600
gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 660
gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtg 720
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 780
agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc 840
cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg 900
agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 960
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggacag cgacggcagc 1020
ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaggg caacgtgttc 1080
agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1140
agcctgggca ag 1152
<210> 19
<211> 1152
<212> DNA
<213> M5G8-IgG4
<400> 19
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcctgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg acaagaacca gcccctgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatctacct gggccccaag 360
gcccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagcgagag caagtacggc 480
cccccctgcc ccccctgccc cgcccccgag ttcctgggcg gccccagcgt gttcctgttc 540
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg 600
gtggacgtga gccaggagga ccccgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 660
gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtg 720
agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 780
agcaacaagg gcctgcccag cagcatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggccagccc 840
cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc agccaggagg agatgaccaa gaaccaggtg 900
agcctgacct gcctggtgaa gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 960
aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggacag cgacggcagc 1020
ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaggg caacgtgttc 1080
agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1140
agcctgggca ag 1152
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 6×His
<400> 20
His His His His His His
1 5
<210> 21
<211> 483
<212> DNA
<213> M4B3-6×His
<400> 21
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcgtgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg accggaacca gcccctgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatctacct gggccccaag 360
gtgcagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagccacca ccaccaccac 480
cac 483
<210> 22
<211> 483
<212> DNA
<213> M5G8-6×His
<400> 22
atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60
tggaaccccc ccaccttcag ccccgccctg ctggtggtga ccgagggcga caacgccacc 120
ttcacctgca gcttcagcaa caccagcgag agcttcctgc tgaactggta ccggatgagc 180
cccagcaacc agaccgacaa gctggccgcc ttccccgagg acaagaacca gcccctgcag 240
gactgccggt tccgggtgac ccagctgccc aacggccggg acttccacat gagcgtggtg 300
cgggcccggc ggaacgacag cggcacctac ctgtgcggcg ccatctacct gggccccaag 360
gcccagatca aggagagcct gcgggccgag ctgcgggtga ccgagcggcg ggccgaggtg 420
cccaccgccc accccagccc cagccccggc ggcggcggcg gcagccacca ccaccaccac 480
cac 483

Claims (10)

1.一种高亲和力的PD-1膜外区突变体，所述PD-1膜外区突变体由选自SEQ ID NO.5的氨基酸序列组成。
2.一种高亲和力的PD-1膜外区突变体的融合蛋白，所述融合蛋白包括PD-1膜外区突变体和Fc片段，或所述融合蛋白包括PD-1膜外区突变体和6×His，所述PD-1膜外区突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段选自人IgG1或IgG4的Fc及其突变型，其中人IgG1 Fc的N298A突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8 所示，其中人IgG4Fc的S228P突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9 所示。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述6×His的氨基酸序列如SEQ IDNO.20所示。
5.如权利要求3或4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括Linker，所述PD-1膜外区突变体通过Linker与Fc片段、6×His连接成融合蛋白，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种编码权利要求2 至5中任一项所述融合蛋白的DNA序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料为载体或宿主细胞。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或权利要求2 至5中任一项所述的融合蛋白；其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.权利要求1所述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或权利要求2至5中任一项所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述的PD-1膜外区突变体或融合蛋白的作用机理为：
（1）阻断 PD-1与 PD-L1 结合；
（2）阻断 PD-1与 PD-L2 结合；
（3）同时阻断PD-1与 PD-L1 以及 PD-1与 PD-L2 结合；
（4）调节 PD-L1或/和 PD-L2 活性或水平；
（5）解除 PD-1 对机体免疫抑制；或者
（6）提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的高亲和力的PD-1膜外区突变体或权利要求2 至5中任一项所述的融合蛋白，所述试剂盒用于检测PD-L1或/和PD-L2的存在或其水平。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109293775B (zh) * 2018-11-16 2021-06-04 福州迈新生物技术开发有限公司 抗pd-1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
CN110590959B (zh) * 2019-09-19 2021-01-05 北京伟杰信生物科技有限公司 重组犬pd-1融合蛋白及其制备方法与应用
CN113480614B (zh) * 2021-08-13 2023-01-10 中国人民解放军总医院 一类靶向pd-l1的超高亲和力小蛋白及用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103261217A (zh) * 2010-11-11 2013-08-21 香港大学 可溶性 pd-1变体、融合构建体及其用途
CN106699888A (zh) * 2015-07-28 2017-05-24 钜川生物医药 一种pd-1抗体及其制备方法和应用
WO2018077189A1 (zh) * 2016-10-27 2018-05-03 广东香雪精准医疗技术有限公司 高亲和力的可溶性pd-1分子

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150368316A1 (en) * 2013-02-07 2015-12-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University A selective high-affinity immune stimulatory reagent and uses thereof
ES2792183T3 (es) * 2013-09-13 2020-11-10 Beigene Switzerland Gmbh Anticuerpos anti-PD1 y su uso como productos terapéuticos y de diagnóstico
US11352413B2 (en) * 2016-05-17 2022-06-07 Albert Einstein College Of Medicine Engineered PD-1 variants
CN107857819A (zh) * 2017-07-03 2018-03-30 江苏西迪尔生物技术有限公司 多功能融合蛋白及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103261217A (zh) * 2010-11-11 2013-08-21 香港大学 可溶性 pd-1变体、融合构建体及其用途
CN106699888A (zh) * 2015-07-28 2017-05-24 钜川生物医药 一种pd-1抗体及其制备方法和应用
WO2018077189A1 (zh) * 2016-10-27 2018-05-03 广东香雪精准医疗技术有限公司 高亲和力的可溶性pd-1分子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PD-1/PD-L1信号通路在结直肠癌中的研究进展;吴晶晶等;《华中科技大学学报(医学版)》(第01期);第127-131页 *
The role of PD-1 and PD-L1 in T-cell immune suppression in patients with hematological malignancies;Li Shi等;《Journal of Hematology & Oncology》;第6卷(第1期);第1-6页 *

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