KR20240007927A - 이중 특이성 항체 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중 특이성 항체 및 이의 응용을 제안하며, 상기 재조합 항체는 CD3 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~6; 및 B7H6 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 7~12; 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 의해 제조된 재조합 항체는 CD3과 B7H6을 동시에 표적할 수 있고, 반감기가 현저히 연장되며, 단일 표적 항체에 비해 더 강한 종양 억제 능력을 나타낸다.

Description

이중 특이성 항체 및 이의 응용
본원 발명은 2021년 12월 07일 중국 국가재산권국에 제출한 출원번호 202111485404.0인 특허 출원의 우선권 및 권익을 주장하는 바, 그 모든 내용은 참조로서 본원 발명에 인용된다.
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 이중 특이성 항체 및 이의 응용에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 재조합 항체, 면역 세포, 핵산, 발현 벡터, 재조합 세포, 조성물, 약물 제조에 있어서 상기 물질의 용도, 키트에 관한 것이다.
이중 특이성 항체는 동시에 두 개의 항원 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 종양 치료를 위한 이중 특이성 항체는 그 작용 기전에 따라 세 가지 범주, 즉 효과기 세포의 재지향; 면역 조절; 종양 세포 수용체 이중 결합 표적화로 나눌 수 있다. 그 중 재지향 기능에 사용되는 항체가 대부분을 차지하며, 현재 시판되고 있는 2종의 종양 치료용 항체 역시 T세포 재지향을 기반으로 한다. 이중 특이성 항체의 특성에 따르면, 이중 면역 조절 또는 동일한 세포막의 두 분자를 표적으로 하는 다른 치료 시스템에도 잘 적용될 수 있다.
B7H6은 2 개의 면역글로불린 도메인을 포함하는 B7 패밀리에 속하는 I형 막관통 단백질이다. B7H6은 또한 NK 세포 활성화 수용체 NKp30에 대한 리간드이다. B7H6은 다양한 종양 세포에서 모두 발현되지만, B7H6의 mRNA는 인간 정상 조직 및 건강한 말초 혈액 단핵구에서 검출되지 않았다. 염증 환경에서, IL-1β 및 TNF와 같은 일부 전염증성 사이토카인은 CD14+와 CD16+ 단핵구 및 호중구를 자극하여 B7H6의 발현을 상향 조절할 수 있다. B7H6의 종양 발현 프로파일은 백혈병, 림프종, 대장암, 비소세포폐암, 유방암, 난소암, 위암 및 간암 등을 포함하여 매우 광범위하다. B7H6의 발현은 일부 암의 전이와도 관련이 있지만 대부분의 종양에서 B7H6의 작용은 현재까지는 명확하지 않다. 현재 B7H6은 다양한 종양에서 발현되고 있지만 이 분자에 대한 종양 치료 수단은 많지 않다. 일부 연구자들은 B7H6에 대한 이중 특이성 항체를 개발했는데, 그 구축 형태는 BiTE로, 이러한 형태는 천연 항체의 불변 영역을 포함하지 않기 때문에 이러한 분자의 생체 내 반감기는 매우 짧은 것으로 결정되어 사용이 크게 제한된다.
T세포 재지향에 기반한 이중 특이성 항체에서, CD3의 표적은 매우 중요하다. 면역 체크포인트 차단 항체와 달리 CD3 관련 이중 특이성 항체는 TCR 및 펩티드-주조직 적합성 복합체(pMHC)를 우회하여 T세포 활성화를 매개할 수 있지만, 시냅스에서 분자 작용 발휘 과정은 전형적인 TCR-pMHC 상호 작용과 매우 유사하다. 이중 특이성 항체의 활성은 CD3 친화력의 영향을 받는데, CD3 고친화력 이중 특이성 항체는 시험관 내 실험에서 더 우수한 살상 촉진 효과를 나타내지만, 생체 내에서는 키메라 항원 수용체(CAR) T세포 독성과 매우 유사한 치명적인 사이토카인 방출 증후군 독성이 있다. 동시에 연구를 통해 친화력이 매우 낮은 CD3 항체 서열은 또한 이중 특이성 항체 구축 후 T세포 활성화를 효과적으로 자극할 수 있음을 발견하였다. CD3 항체 친화력이 적절한 범위(200±78nM)에 있고 또한 종양 표적 관련 항체가 고친화력을 갖는 경우, 이중 특이성 항체는 전신 활성화를 피하면서 T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진한다. 따라서, 표적성이 강한 이중 특이성 항체의 개발은 종양의 예방 및 치료에 큰 가치가 있다.
본원 발명은 아래 사실 및 문제점에 대한 발명인의 발견 및 이해를 기반으로 한다.
본 발명에서, 발명인은 CD3, B7H6 항원 결합 단편을 다양하게 조합하고 스크리닝하여 CD3 및 B7H6에 특이적으로 결합할 수 있는 재조합 이중 특이성 항체를 설계하고, 나아가 B7H6 분자를 종양 세포 근처로 표적화하며, 종양 세포 상의 B7H6 분자와 결합시켜 CD3+ 림프구와 종양 세포가 면역 시냅스를 형성하도록 촉진함으로써, 림프구가 B7H6+ 종양 세포를 활성화하고 살상시킬 수 있도록 하므로, 상기 재조합 이중 특이성 항체는 높은 CD3 및 B7H6 결합 활성을 가지며, 항종양 활성이 높다.
따라서, 본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 CD3 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~6; 및 B7H6 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 7~12; 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
RASQDIRNYLN(SEQ ID NO: 1).
YTSRLES(SEQ ID NO: 2).
QQGNTLPWT(SEQ ID NO: 3).
GYTMN(SEQ ID NO: 4).
LINPYKGVSTYNQKFKD(SEQ ID NO: 5).
SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO: 6).
KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO: 7).
AASTLHS(SEQ ID NO: 8).
QQSKEDPRT(SEQ ID NO: 9).
DYNMD(SEQ ID NO: 10).
DINPNNGGTLYNQKFRG(SEQ ID NO: 11).
SEVFYGNYADY(SEQ ID NO: 12).
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, SEQ ID NO: 49 및 63으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 49).
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 63).
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 핵산은 제1 양태에 따른 재조합 항체를 코딩한다. 본 발명의 실시예에 따른 핵산에 의해 코딩된 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터는 제3 양태에 따른 핵산 분자를 보유한다. 상기 발현 벡터는 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되는 선택적 제어 서열을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 실시예에서 제안된 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 재조합 항체를 고효율적으로 대량으로 발현시킬 수 있어 종양, 특히 B7H6을 발현하는 종양의 특이성 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터 또는 제1 양태에 따른 재조합 항체를 보유한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환하여 얻는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적절한 조건 하에 상기 재조합 항체를 고효율적으로 대량으로 발현시킬 수 있고, 상기 재조합 세포는 종양, 특히 B7H6을 발현하는 종양의 특이성 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터 또는 제5 양태에 따른 재조합 세포를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD3 또는 B7H6 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있고, T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진하여 전신 활성화를 피하며, 상기 재조합 항체를 포함하는 약물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터, 제5 양태에 따른 재조합 세포 또는 제6 양태에 따른 조성물의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약물은 종양을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD3 및 B7H6 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 이에 상응한 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 약물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터, 제5 양태에 따른 재조합 세포 또는 제6 양태에 따른 조성물을 포함하고, 상기 약물은 암의 치료 또는 예방에 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD3 및 B7H6 단백질에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 이에 상응한 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 키트를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 항체는 CD3 및 B7H6 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 특이적으로 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있으므로, 상기 재조합 항체는 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 진단 또는 검출하기 위한 키트를 제조하는 데 사용될 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 CD3 및/또는 B7H6 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학 연구에 사용될 수 있다.
본 발명의 부가적 양태 및 이점 중 일부는 아래 설명에서 설명될 것이며, 일부는 아래 설명으로부터 자명해지거나 본 발명의 실천을 통해 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 및/또는 부가적 양태 및 이점은 하기 도면과 함께 실시예의 설명으로부터 명백해지고 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 여기서,
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 이중 특이성 항체의 구조 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 실시예에 따른 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 인간 B7H6 단백질의 결합 분석 결과도이다.
도 2b는 본 발명의 실시예에 따른 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 인간 CD3단백질의 결합 분석 결과도이다.
도 2c는 본 발명의 실시예에 따른 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 B7H6 및 인간 CD3 이중 항원의 ELISA 검출 결과도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 T세포의 시험관 내 세포 독성 실험 분석 결과도이다.
도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 LoVo 세포에 따른 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 T세포의 시험관 내 세포 독성 실험 분석 결과도이다.
도 3c는 본 발명의 실시예에 따른 Hep G2 세포에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 T세포의 시험관 내 세포 독성 실험 결과도이다.
도 3d는 본 발명의 실시예에 따른 SK-BR-3 세포에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체와 T세포의 시험관 내 세포 독성 실험 결과도이다.
도 4a는 본 발명의 실시예에 따른 T세포와 루시페라제 과발현 Ho8910 세포를 혼합한 후, 구배 농도로 CD3×B7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자를 첨가하고, 24시간 후 기질을 첨가하여 반응 후 검출된 화학 발광값의 분석 결과도이다.
도 4b는 본 발명의 실시예에 따른 T세포와 루시페라제 과발현 K562 세포를 혼합한 후, 구배 농도로 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자를 첨가하고, 24시간 후 기질을 첨가하여 반응 후 검출된 화학 발광값의 분석 결과도이다.
도 5a는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포 증식에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 5b는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포 증식에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 통계 분석도이다.
도 6a는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 CD4+ 및 CD8+T세포 활성화에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 6b는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 CD4+ 및 CD8+T세포 탈과립 수준에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 7a는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포에 의한 IFN-γ 분비에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 7b는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포에 의한 IL-2 분비에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 7c는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포에 의한 IL-10 분비에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 7d는 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포 존재 하에 T세포에 의한 IL-17A 분비에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자 영향의 결과도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 HCT-15 세포에 대한 CD3ХB7H6 재조합 이중 특이성 항체 분자의 생체 내 항종양 활성 결과도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하고, 상기 실시예의 예시를 도면에 도시한다. 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 설명하는 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안 된다.
이 밖에, 용어 "제1", "제2"는 설명의 목적으로만 사용될 뿐 상대적 중요성을 지시하거나 암시하거나 지시된 기술적 특징의 수를 암시적으로 지정하는 것으로 이해해서는 안된다. 따라서 "제1" 및 "제2"로 한정된 특징은 이러한 특징 중 적어도 하나를 명시적으로 또는 암시적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 설명에서, "복수"는 별도로 명확히 구체적으로 한정하지 않는 한 2개, 3개 등 적어도 2개를 의미한다.
재조합 항체
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 B7H6에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 T세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, T세포 및 종양 세포와 동시에 결합함으로써 두 세포가 세포 시냅스를 형성하여 항종양 효과가 현저하다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 또한 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 항체는 CD3 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~6; 및 B7H6 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 7~12; 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
RASQDIRNYLN(SEQ ID NO: 1).
YTSRLES(SEQ ID NO: 2).
QQGNTLPWT(SEQ ID NO: 3).
GYTMN(SEQ ID NO: 4).
LINPYKGVSTYNQKFKD(SEQ ID NO: 5).
SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO: 6).
KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO: 7).
AASTLHS(SEQ ID NO: 8).
QQSKEDPRT(SEQ ID NO: 9).
DYNMD(SEQ ID NO: 10).
DINPNNGGTLYNQKFRG(SEQ ID NO: 11).
SEVFYGNYADY(SEQ ID NO: 12).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, CD3 항체의 가변 영역을 포함하고, 상기 CD3 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14로 표시되는 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO: 13).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 14).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 항체는 B7H6 항체의 가변 영역을 포함하고, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 20).
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 23).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 15).
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 16).
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 17).
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 18).
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 19).
EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 21).
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 22).
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 24).
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 25).
EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 26).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 연결 펩티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 연결 펩티드는 SEQ ID NO: 46으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 46).
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 연결 펩티드의 N-말단은 상기 CD3 항체 경쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되고, 상기 연결 펩티드의 C-말단은 상기 CD3 항체 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 상기 연결 펩티드의 N-말단은 상기 B7H6 경쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되고, 상기 연결 펩티드의 C-말단은 상기 B7H6 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 더 포함하고, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린 항체, 인간 항체, 영장류 항체 또는 이들의 돌연변이체 중 적어도 하나로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG 또는 이의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG1 또는 이의 돌연변이체로부터 유래된다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제1 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 S384C 돌연변이 및 T396W 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제2 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 Y380C 돌연변이, T397S 돌연변이, L399A 돌연변이 및 Y408V 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제1 항체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 제2 항체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 47).
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 48).
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 재조합 항체를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, SEQ ID NO: 49 및 63으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 49).
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 63).
예방 또는 치료용 조성물
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 핵산을 제안하며, 상기 핵산은 전술한 재조합 항체를 코딩한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따른 핵산에 의해 코딩된 재조합 항체는 CD3, B7H6에 효과적으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 생체 외에서 강한 결합 활성 및 긴 생체 내 반감기를 가지며, 항종양 효과가 현저하다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 69로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO: 70~87로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 갖는다.
CD3 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
CAGGCCGTGGTGACCCAGGAGCCCTCCCTGACCGTGTCCCCCGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGGTCCTCCACCGGCGCCGTGACCACCTCCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGGGCCTGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCCTGGACCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTGCTGGGCGGCAAGGCCGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCCTGTGGTACTCCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGCGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGGATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGACAGGTTCACCATCTCCAGGGACGACTCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGAGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACGTGTCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 69).
B7H6-1 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCATGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 70).
B7H6-2 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 71).
B7H6-3 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 72).
B7H6-4 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 73).
B7H6-5 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCATGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 74).
B7H6-6 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 75).
B7H6-7 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO: 76).
B7H6-8 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-9 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-10 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-11 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-12 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-13 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-14 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-15 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-17 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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B7H6-18 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
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본 발명의 명세서 및 특허청구범위에 언급된 핵산에 대해 당업자는 실제로 상보적인 이중 가닥 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것으로 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 편의상, 본 명세서 및 특허청구범위에서는 대부분의 경우 하나의 가닥만 제시하지만, 실제로는 이와 상보적인 또 다른 가닥이 개시되어 있다. 또한, 본원 발명에서 핵산 서열은 DNA 형태 또는 RNA 형태를 포함하며, 이들 중 하나를 개시한다는 것은 다른 하나도 개시한다는 것을 의미한다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 발현 벡터를 제안하며, 상기 발현 벡터는 전술한 핵산 분자를 보유한다. 상기 발현 벡터는 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되는 선택적 제어 서열을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제어 서열은 숙주에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열이다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에서 제안된 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 상기 재조합 항체를 교효율적으로 발현시킬 수 있어 종양, 특히 B7H6을 발현하는 종양의 특이성 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제안하며, 상기 재조합 세포는 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터 또는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체를 보유한다. 상기 재조합 세포는 상기 발현 벡터를 형질감염 또는 형질전환하여 얻는다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 재조합 세포는 적절한 조건 하에 상기 재조합 항체를 고효율적으로 발현시킬 수 있고, 상기 재조합 세포는 종양, 특히 B7H6을 발현하는 종양의 특이성 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
본원 발명의 명세서에서 언급된 "적합한 조건"은 본원 발명에 따른 재조합 항체 발현에 적합한 조건을 의미함에 유의해야 한다. 당업자는 재조합 항체 발현에 적합한 조건이 적절한 형질전환 또는 형질감염 방식, 적절한 형질전환 또는 형질감염 조건, 건강한 숙주 세포 상태, 적절한 숙주 세포 밀도, 적합한 세포 배양 환경, 적합한 세포 배양 시간을 포함하나 이에 한정되지 않음을 쉽게 이해할 것이다. "적합한 조건"은 특별히 한정되지 않으며, 당업자는 실험실의 구체적인 환경에 따라 상기 재조합 항체의 발현에 가장 적합한 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 조성물을 제안하며, 이는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터 또는 제5 양태에 따른 재조합 세포를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD3 또는 B7H6 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있고, T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진하여 전신 활성화를 피하며, 상기 재조합 항체 및 식품 조성물 또는 약학적 조성물과 같은 상응한 일련의 물질을 포함하는 조성물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 약물을 제안하며, 이는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터, 제5 양태에 따른 재조합 세포 또는 제6 양태에 따른 조성물을 포함하고, 상기 약물은 암의 치료 또는 예방에 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 재조합 항체는 CD3 또는 B7H6 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있고, T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진하여, 전신 활성화를 피하며, 상기 재조합 항체의 일련의 물질을 포함하는 약물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따라 제공되는 약물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 유효량의 상기 항체 활성 성분을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "유효 용량"은 인간 및/또는 동물에서 기능 또는 활성을 나타낼 수 있고 인간 및/또는 동물이 수용할 수 있는 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한" 성분은 과도한 거부 부반응(예: 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 포유동물에 사용하기에 적합한 물질, 즉 합당한 이익/위험 비율을 갖는 물질이다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 다양한 부형제 및 희석제를 포함하는 치료제의 투여를 위한 담체를 의미한다.
본 발명의 약물은 안전하고 유효한 양의 본 발명의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 약물 제제는 투여 방식과 매칭되어야 하며, 본 발명의 약물 제형은 주사제, 경구 제제(정제, 캡슐제, 드링크제), 경피제, 서방제이다. 예를 들어, 생리 식염수 또는 포도당 및 다른 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 상기 약물은 바람직하게는 멸균 조건 하에 제조된다.
본 발명에 따른 활성 성분의 유효량은 투여 모드, 치료할 질병의 중증도 등에 따라 변화할 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 다양한 요인(예를 들어, 임상 시험을 통해)에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 요인에는 생체 이용률, 대사, 반감기 등과 같은 활성 성분의 약동학 파라미터; 환자가 치료하고자 하는 진환의 중증도, 환자의 체중, 환자의 면역 상황, 트여 경로 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황의 긴급성 요구에 따라 매일 여러 회 분할 투여하거나 용량을 비례적으로 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 식염수, 리포좀, 지질, 단백질, 단백질-항체 접합체, 펩티드계 물질, 셀룰로오스, 나노겔, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 담체의 선택은 당업자에게 잘 알려진 투여 방식과 매칭되어야 한다.
용도
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 약물의 제조에 있어서 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체, 제3 양태에 따른 핵산 분자, 제4 양태에 따른 발현 벡터, 제5 양태에 따른 재조합 세포 또는 제6 양태에 따른 조성물의 용도를 제안하며, 상기 약물은 종양을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 일부 구체적인 실시예에서 제공되는 재조합 항체는 CD3 및 B7H6 단백질에 효과적으로 결합할 수 있고, 상기 B7H6을 특이적으로 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있으며, 상기 재조합 항체 및 이에 상응한 일련의 물질을 이용하여 제조된 약물도 마찬가지로 B7H6을 발현하는 종양의 치료 또는 예방에 현저한 작용이 있고, 안전성이 더 높으며, 부작용이 더 적다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 용도는 또한 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 종양은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함한다.
키트
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 키트를 제안하며, 이는 제1 양태 또는 제2 양태에 따른 재조합 항체를 포함한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에서 제공되는 상기 재조합 항체는 B7H6 단백질에 결합할 수 있으므로, 상기 재조합 항체를 포함하는 키트는 상기 B7H6 단백질을 높게 발현하는 종양의 효과적인 진단 또는 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 키트는 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 진단 또는 검출하는 데 사용된다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에서 제공되는 재조합 항체는 CD3 및 B7H6 단백질 분자에 효과적으로 결합할 수 있어 상기 B7H6을 특이적으로 높게 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식할 수 있으므로, 상기 재조합 항체는 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 진단 또는 검출하기 위한 키트를 제조하는 데 사용될 수 있고, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 CD3 및/또는 B7H6 단백질 분자의 정성적 또는 정량적 검출과 같은 과학 연구에 사용될 수 있다.
질병 치료 용도 및 방법
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 있어서 전술한 재조합 항체, 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포, 조성물 또는 약물의 용도를 제안한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD3 및/또는 B7H6 단백질을 특이적으로 인식할 수 있고, CD3 항체 친화력이 적절한 범위에 있고 또한 종양 표적 관련 항체가 고친화력을 갖는 경우, 이중 특이성 항체는 T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진하여 전신 활성화를 피하면서 암을 효과적으로 치료 및 예방하므로, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 항체, 상기 재조합 항체를 포함하는 조성물, 약물 및 적절한 조건 하에 발현되어 상기 재조합 항체를 얻을 수 있는 일련의 물질, 예를 들어 상기 핵산 분자, 발현 벡터, 재조합 세포 등은 모두 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 제11 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방 방법을 제안한다. 본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 1) 전술한 재조합 항체; 2) 전술한 핵산 분자; 3)전술한 발현 벡터; 4) 전술한 재조합 세포; 또는 5) 전술한 조성물; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 재조합 항체는 상기 CD3 및/또는 B7H6 단백질을 특이적으로 인식할 수 있고, CD3 항체 친화력이 적절한 범위에 있고 또한 종양 표적 관련 항체가 고친화력을 갖는 경우, 이중 특이성 항체는 T세포가 말초에서 순환하는 대신 국소 종양에 선택적으로 위치결정되도록 촉진하여 전신 활성화를 피하면서 암을 효과적으로 치료 및 예방하므로, 본 발명의 실시예에 따른 방법은 암을 효과적으로 치료 또는 예방하고, 전신 T세포 활성화를 피할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함한다.
이하, 실시예를 구체적으로 소개한다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 표시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 설명된 기술 또는 조건 또는 제품 사양에 따라 수행된다. 제조사 표시 없이 사용되는 시약이나 기구는 모두 시중에서 구할 수 있는 재래품이다.
실시예 1: CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자의 설계 및 구축
본 실시예에서, 발명인은 다양한 구성을 스크리닝함으로써, scFv-Fc로 구성된 이중 특이성 항체를 결정하였으며, 이러한 이중 특이성 항체는 CD3ХB7H6으로 명명된다. 상기 항체는 2 개의 1가 단위를 포함하는데, 그 중 하나의 1가 단위는 항-CD3의 ScFv-Fc 형태이고, 다른 1가 단위는 항-B7H6의 ScFv-Fc 형태이며, 한 가닥의 연결 펩티드를 사용하여 상기 CD3 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 연결하고, 상기와 동일한 한 가닥의 연결 펩티드를 사용하여 상기 B7H6 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 연결하되, 연결된 펩티드는 SEQ ID NO: 46으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 CD3 항체는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14로 표시되는 중쇄 가변 영역을 가지며, 상기 B7H6 항체는 SEQ ID NO: 15~20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 21~26으로 표시되는 중쇄 가변 영역을 갖는다. 여기서, 발명인은 B7H6 항체 가변 영역과 CD3 항체의 가변 영역의 상이한 조합을 스크리닝하여 총 18 개의 CD3ХB7H6 재조합 항체 분자를 구축하였으며; 또한 1가 단위의 Fc 모두에 대해 아미노산 돌연변이 개선을 수행하였는데, 항-CD3의 Fc 영역 아미노산을 384번 위치에서 시스테인(S384C)으로, 396번 위치에서 트립토판(T396W)으로 변경하고, 항-B7H6의 Fc 영역 아미노산을 380번 위치에서 시스테인(Y380C)으로, 397번 위치에서 세린(T397S)으로, 399번 위치에서 알라닌(L399A)으로, 408번 위치에서 발린(Y408V)으로 변경하여 동종 이량체를 형성하기는 어려우나 이종 이량체를 형성하기 쉽도록 한다. 상기 이종 이량체는 바로 이중 특이성 항체 CD3ХB7H6으로, 그 구체적 구조는 도 1에 도시된 바와 같으며, 상기 18 개의 CD3ХB7H6 재조합 항체 분자는 SEQ ID NO: 27로 표시되는 CD3 단일 사슬 항체, SEQ ID NO: 28-45로 표시되는 B7H6 단일 사슬 항체를 갖고, SEQ ID NO: 47로 표시되는 제1 항체 Fc 영역과 SEQ ID NO: 48로 표시되는 제2 항체 Fc 영역은 상기 돌연변이 후에 knob-into-hole 구조로 연결된다.
일반적인 분자 생물학 기술을 사용하여 CD3 및 B7H6(1-18)의 1가 단위의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 서열을 각각 발현 벡터 pTT5(Youbao Biology, 제품 번호 VT2202)에 클로닝하였으며, 구체적인 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 69 및 SEQ ID NO: 70~87로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나이다. 아울러 이를 CHO 세포에서 고효율적으로 발현시켜 배지로 분비시키기 위해, 뮤린 항체 kappa 사슬의 리더 펩티드를 분비 신호 펩티드로 선택하여 발현 벡터에 삽입하되, 신호 펩티드는 항체 가변 영역의 N-말단에 위치하며, 이의 아미노산 서열은 METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO: 68)이고, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 88로 표시된다.
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCTCCACCGGC(SEQ ID NO: 88).
CD3 단일 사슬 항체
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 27).
B7H6-1 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 28).
B7H6-2 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 29).
B7H6-3 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 30).
B7H6-4 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 31).
B7H6-5 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 32).
B7H6-6 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 33).
B7H6-7 단일 사슬 항체
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 34).
B7H6-8 단일 사슬 항체
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B7H6-9 단일 사슬 항체
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 36).
B7H6-10 단일 사슬 항체
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B7H6-11 단일 사슬 항체
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B7H6-12 단일 사슬 항체
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B7H-13 단일 사슬 항체
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 40).
B7H6-14 단일 사슬 항체
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 41).
B7H6-15 단일 사슬 항체
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 42).
B7H6-16 단일 사슬 항체
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 43).
B7H6-17 단일 사슬 항체
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 44).
B7H6-18 단일 사슬 항체
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 45).
제1 Fc 영역의 아미노산 서열
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 47).
제2 Fc 영역의 아미노산 서열
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 48).
실시예 2: CD3ХB7H6 이중 특이성 항체의 발현 및 정제
2.1 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자 발현
CD3ХB7H6 사슬을 코딩하는 유전자를 보유한 pTT5 벡터를 사용하여 ExpiCHO-S 세포(Gibco, 제품 번호 A29127)를 일시적으로 형질감염시켜 CD3 및 B7H6에 결합하는 이중 특이성 분자를 제조하되, 18 개의 CD3ХB7H6 사슬을 코딩하는 유전자는 각각 SEQ ID NO: 49로 표시되는 항-CD3의 ScFv-Fc, 및 SEQ ID NO: 50~67로 표시되는 항-B7H6의 ScFv-Fc를 갖는다. 구체적인 실험 조작은 다음과 같다. 형질감염 전날, ExpiCHO-S 세포의 세포 밀도를 (3-4)Х106/mL로 조절하고, 37
Figure pct00001
, 8% CO2, 120 rpm에서 진탕하면서 밤새 배양하였다. 형질감염 당일에 세포는 7Х106-1Х107/mL로 성장하고, 생존율이 95%를 초과하면 형질감염을 준비하며, 새로 예열된 ExpiCHO 배지(Gibco, 제품 번호 A2910002)를 사용하여 세포를 6Х106/mL로 희석한 후, CD3폴리펩티드 사슬과 B7H6폴리펩티드 사슬을 포함하는 플라스미드을 질량비 1: 1로 취하고, ExpiFectamine CHO형질감염 시약(Gibco, 제품 번호 A29129)을 사용하여 ExpiCHO-S 세포에 형질감염시켰으며, 37
Figure pct00002
, 8% CO2, 120 rpm에서 진탕하면서 배양하였다. 형질감염 18~22 h 후, ExpiFectamine CHO Enhancer 와 ExpiCHO Feed를 잘 혼합한 후 즉시 형질감염된 세포를 첨가하고, 잘 혼합하여 32
Figure pct00003
, 5% CO2, 120 rpm에서 진탕하면서 배양하였다. 형질감염 5일째에 8 mL ExpiCHO Feed를 세포에 추가하고, 잘 혼합한 후 계속해서 배양하였다. 세포 수와 세포 생존율 변화를 매일 관찰하고, 세포 생존율이 80% 이하로 떨어지거나 배양 10~14일 후 원심분리하여 세포를 수확하였으며, 상층액을 취하여 정제하거나 -80
Figure pct00004
에서 냉동하여 준비해 두었다.
2.2 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자의 정제
2.1 실험에서 얻은 상층액을 0.22μm 필터 멤브레인으로 여과하고, Mabselect prism A 친화성 크로마토그래피 컬럼(GE사, 제품 번호 17549854)을 이용하여 발현 상층액에서 Fc 도메인을 갖는 항체를 포획하였으며, pH 7.2인 인산염 완충액으로 크로마토그래피 컬럼을 평형화한 후, 상층액을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고, 용출 완충액(100mM 시트르산, pH 2.7)으로 용출하였으며, 마지막으로 PBS 완충액으로 농축하여 교체한 후, 정제된 항체는 SDS-PAGE로 순도 95% 이상으로 동정하였다.
CD3 ScFv-Fc 아미노산 서열
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 49).
B7H6-1ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 50).
B7H6-2 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 51).
B7H6-3 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 52).
B7H6-4 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 53).
B7H6-5 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 54).
B7H6-6 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 55).
B7H6-7 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 56).
B7H6-8 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 57).
B7H6-9 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 58).
B7H6-10 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 59).
B7H6-11 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 60).
B7H6-12 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 61).
B7H6-13 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 62).
B7H6-14 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 63).
B7H6-15 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 64).
B7H6-16 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 65).
B7H6-17 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 66).
B7H6-18 ScFv-Fc 아미노산 서열
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 67).
실시예 3: CD3ХB7H6 이중 특이성 항체와 항원의 결합 활성 검출(ELISA)
본 실시예에서는 상기 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체와 단일 항원(B7H6 항원 또는 CD3 항원)의 결합 활성, 및 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 및 이중 항원(B7H6 항원, CD3 항원)에 동시에 결합하는 결합 활성을 각각 검출하였으며, 구체적인 실험 조작은 다음과 같다.
3.1 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체와 단일 항원의 결합 활성 측정
인간 B7H6(ACRO biosystems, 제품 번호 B76-H52H8), 인간 CD3 항원(ACRO biosystems, 제품 번호 CDD-H52W1)을 각각 코팅 완충액(35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9.6)으로 2 μg/mL로 희석하고, 효소 연결 플레이트의 각 웰에 100 μL를 첨가하여 4
Figure pct00005
에서 밤새 두었다. 이후 PBST(0.05% Tween 20-PBS, pH 7.2)로 3회 세척하였다. 플레이트에 300 μL의 블로킹 완충액(1% BSA, 0.05% Tween20-PBS, pH 7.2)을 첨가하고, 실온에서 2h 동안 방치하였다. 그런 다음 PBST로 3회 세척하였다. 각 웰에 상응한 이중 특이성 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 완충액으로 희석한 HRP-토끼 항-인간 IgG 2차 항체(boster, 제품 번호 BA1070) 100μL를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하였다, 각 웰에 TMB를 첨가하여 실온에서 2~5분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후, 각 웰에 2M 황산으로 반응을 멈추고, 마지막으로 ELIASA로 OD450값을 읽었다.
구체적인 실험 결과를 도 2a에 나타내었는 바, 도 2a는 상이한 B7H6 서열과 CD3 서열로 구성된 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자와 B7H6 항원의 결합 상황을 나타낸 것으로, 이러한 이중 특이성 항체 분자는 모두 B7H6 항원에 결합할 수 있음을 보아낼 수 있고, 여기서, CD3ХB7H6-14의 결합 활성이 가장 강하므로, 후속 실험은 주로 CD3ХB7H6-14를 중심으로 진행되었으며; 도 2b는 CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체 분자가 CD3 항원에 결합할 수 있음을 보여준다.
3.2 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체와 이중 항원의 결합 활성 측정
인간 B7H6(ACRO biosystems, 제품 번호 B76-H82Wb)을 코팅 완충액(35 mM NaHCO3, 15 mM Na2CO3, pH 9.6)으로 2μg/mL로 희석하고, 효소 연결 플레이트의 각 웰에 100 μL를 첨가하여 4
Figure pct00006
에서 밤새 두었다. 이후 PBST로 3회 세척하였다(0.05% Tween 20-PBS, pH 7.2). 플레이트에 300μL의 블로킹 완충액(1% BSA, 0.05% Tween20-PBS, pH 7.2)을 첨가하고, 실온에서 2h 동안 방치하였다. 그런 다음 PBST로 3회 세척하였다. 각 웰에 상응한 이중 특이성 항체를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 완충액으로 희석한 인간 CD3 항원(ACRO biosystems, 제품 번호 CDD-H52W1) 100μL를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 PBST로 3회 세척하였다. 블로킹 완충액으로 희석한 HRP-항-His 태그 2차 항체(Genscript, 제품 번호 A00612) 100μL를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 각 웰에 TMB를 첨가하여 실온에서 2~5분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후, 각 웰에 2M 황산으로 반응을 멈추고, 마지막으로 ELIASA로 OD450값을 읽었다. 구체적인 결과를 도 2c에 나타내었는 바, 결과는 CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체 분자의 농도가 증가함에 따라 OD450 판독값이 점차 증가함을 나타내며, 이는 상기 이중 특이성 항체 분자가 인간 CD3 및 B7H6에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 이중 특이성 항체 분자의 시험관 내 살상 검출
4.1 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리
항응고 인간 말초 혈액을 동일한 부피의 멸균 PBS에 넣고, 50 mL 멸균 원심분리관을 취하여 희석한 말초 혈액 25 mL를 15 mL 림프분리액(GE healthcare, 제품 번호 17144003)에 부드럽게 넣되, 전체 과정 동안 인터페이스를 흔들림 없이 깨끗이 유지하고, 21
Figure pct00007
, 400 g에서 30 min 동안 원심분리하였으며, 원심분리기의 속도를 1로 높이고, 0으로 감속하였다. 원심분리 후 관 내부를 3층으로 나누되, 중간층은 림프구층이고, 가운데 버피 코트를 새로운 50 mL 원심분리관에 흡인하였으며, 흡인 후 PBS로 50 mL까지 채우고, 500 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, PBS 1 mL를 넣고 부드럽게 잘 불어주었으며, PBS로 40 mL까지 채우고, 250 g에서 10 min 동안 원심분리하였다.
원심분리 후 상층액을 버리고, MACS 완충액(0.5%BSA, 2.5mM EDTA-PBS) 1 mL로 재현탁한 후 희석하고 계수하였다.
4.2 정제된 T세포의 분리
자기 비드 분류(Miltenyi사, 제품 번호 130096535) 방법으로 인간 T세포를 말초 혈액으로부터 분리하였다. PBMC를 수집한 후 상층액을 버리고, 107 개의 세포마다 MACS buffer 40 μL를 첨가하여 세포를 재현탁한 후, T Cell Biotin-Antibody Cocktail 10 μL를 첨가하여 잘 혼합하고, 4
Figure pct00008
에서 10min 동안 인큐베이션하였다. 107 개의 세포마다 재차 MACS buffer 30 μL 및 T Cell MicroBead Cocktail 20 μL를 첨가하여 잘 혼합하고, 4
Figure pct00009
에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. LS 분리 컬럼을 자기장에 넣고 분리 컬럼을 3 mL의 MACS buffer로 적셨으며, 세포 현탁액을 분리 컬럼에 첨가하고, 1 mL MACS buffer로 원심분리관을 헹군 후, 분리 컬럼을 첨가하였으며, 유출액을 수집하였다. 3 mL MACS buffer로 분리 컬럼을 세척하고, 유출액을 수집하였다. 잘 혼합한 후, 세포를 계수하였다. 세포 현탁액을 300 g, 4
Figure pct00010
에서 10 min 동안 원심분리 후 배지로 재현탁하였다.
4.3 부착성 종양 세포의 시험관 내 살상 검출
부착 배양된 종양 세포를 분해하여 계수하고, 세포 밀도를 2Х105/mL로 조절하였다. RTCA 기기(Agilent)를 켜고, 기기 유형 DP를 선택하였으며, 실험 모드를 선택하고, 세포 정보 및 약물 정보를 입력하였다. Schedule에 진입하여 실험 단계를 설정하고, 플레이트를 50μL의 신선한 배지(89% RPMI 1640배지+10% 태아소혈청+1% 페니실린 스트렙토마이신)에 넣은 후 기기에 넣고, 닫은 후 제1 단계를 클릭하여 시작하였다. Done 완료 후 플레이트를 꺼내고, 100 μL의 세포 현탁액을 첨가하여 실온에서 15~30min 동안 방지하여 가장자리 효과를 방지하고, 기기에 넣고 시작을 클릭하였다. 로그 단계로 성장한 후, 일시 중지하고 50μL의 정제된 T세포(1Х106/mL)를 첨가하였으며, 구배 농도로 이중 특이성 항체를 첨가하여 시작을 클릭하고, 일정 시간 후에 분석하였다.
구체적인 실험 결과를 도면에 나타내었는 바, 여기서, CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체의 농도가 증가함에 따라 HCT-15 세포(도 3a), LoVo 세포(도 3b), Hep G2 세포(도 3c) 및 SK-BR-3 세포(도 3d)에 대한 T세포의 살상 효율이 점차 증가하였는 바, 이는 CD3ХB7H6-14가 B7H6+ 종양 세포를 살상하는 T세포를 잘 촉진할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 루시페라제 반응법에 의해 검출된 현탁 세포의 시험관 내 살상 실험
루시페라제 과발현 종양 세포를 수집한 후 세포 밀도를 2Х105/mL로 조절하고, 실시예 4.1 및 4.2에 기재된 바와 같이 분리, 정제, 수집하였으며, 정제된 T세포의 세포 밀도를 5Х105/mL로 조절하였다. 50μL 종양 세포 및 정제된 T세포를 각각 96웰 편평 바닥 플레이트에 취하고, 구배 농도로 이중 특이성 항체를 첨가하여 잘 혼합하였다. 37
Figure pct00011
, 5% CO2에서 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 각 웰에 100 μL(15mg/mL)의 플루오레세인 칼륨염 용액(Goldbio사, 제품 번호 LUCK-1G)을 첨가하여 빠르게 잘 혼합하고, ELIASA로 화학 발광값을 검출하였다.
구체적인 실험 결과를 도면에 나타내었는 바, CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체의 첨가 농도가 증가함에 따라 검출되는 Ho8910 및 K562의 화학 발광값이 점차 감소하였는데, 이는 생존한 종양 세포가 적음을 보여주며, 즉 CD3ХB7H6-14는 Ho8910 세포(도 4a) 및 K562 세포(도 4b)를 살상하는 T세포를 현저히 촉진할 수 있다.
실시예 6: B7H6 양성 종양 세포 존재 하에 T세포 증식 상황 검출
T세포의 증식을 측정하기 위해, 본 실시예는 T세포+PBS군, T세포+CD3ХB7H6-14군, HCT-15+T세포+PBS군, HCT-15+T세포+CD3ХB7H6-14군을 포함하는 2*2 이중 인자 실험으로 설정되고, 실시예 4.1 및 4.2에 기재된 바와 같이 T세포를 분리, 정제하였으며, 5μM의 세포 Trace CFSE(Invitrogen, 제품 번호 C34554)로 정제된 T세포를 표지하였다. 이어서 표지된 T세포를 인간 대장암 세포(HCT-15 세포)와 효과 대 표적 비율 2: 1로 혼합한 후, 여기에 PBS 또는 이중 특이성 항체를 첨가하고, 3일 후 세포를 수확하였으며, 유세포 분석기로 T세포 증식 상황을 검출하였다.
구체적인 실험 결과를 도면에 나타내었는 바, 여기서, CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체는 HCT-15의 존재 하에 T세포 증식을 현저히 촉진할 수 있었으며(도 5a), 이중 특이성 항체 CD3ХB7H6-14의 농도가 증가함에 따라 T세포 증식 촉진 효과가 더 분명하였다(도 5b).
실시예 7: B7H6 양성 종양 세포 존재 하에 T세포 활성화 및 탈과립 수준의 검출
실시예 4.1 및 4.2에 기재된 바와 같이 T세포를 분리, 정제하고, 실험은 총 2 개의 군을 설정하되, 그 중 대조군은 T세포군이고, 실험군은 T세포와 HCT-15 표적 세포를 효과 대 표적 비율 1: 1로 96웰 플레이트 내체 첨가한 후, 구배 농도로 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체를 첨가하여 잘 혼합하였다. 37
Figure pct00012
에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS로 세포를 재현탁하였으며, 마우스 혈청을 첨가하여 실온에서 15분 동안 블로킹한 후, 표면 분자를 검출하기 위한 유세포 분석 항체를 첨가하고, 4
Figure pct00013
에서 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션한 후 PBS로 세척하였으며, 그런 다음 고정 및 막관통 용액(invitrogen, 제품 번호 00512343)을 첨가하고, 실온에서 반시간 이상 고정하였다. 그런 다음 막관통 완충액(invitrogen, 제품 번호 00833356)을 첨가하여 세척하고, 마우스 혈청을 첨가하여 실온에서 15분 동안 블로킹한 후, 상응한 세포 내 분자 마커 항체를 첨가하여 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하고, 그런 다음 PBS를 첨가하여 2회 세척한 후 유세포 분석기로 검출하였다.
구체적인 실험 결과를 도 6a 및 6B에 나타내었는 바, 여기서, B7H6+세포(+HCT-15) 존재 하에 CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체의 농도가 증가함에 따라 CD4+T세포 및 CD8+T세포 표면에서 CD69 분자(도 6a) 발현 및 세포 내에서 CD107a(도 6b)의 발현 비율이 점차 증가한 반면, B7H6+종양 세포(-HCT-15)가 없는 경우, T세포는 이중 특이성 항체 인큐베이션 후 활성화 및 탈과립화 능력이 매우 제한적이였는데, 이는 상기 이중 특이성 항체가 T세포 및 B7H6+종양 세포를 특이적으로 표적화하고, T세포 활성화 및 탈과립을 촉진할 수 있음을 보여준다.
실시예 8: B7H6 양성 종양 세포 존재 하에 T세포에 의한 사이토카인 분비의 검출
실시예 4.1 및 4.2에 기재된 바와 같이 T세포를 분리, 정제하고, 대조군은 T세포뿐이고, 실험군은 T세포와 HCT-15 세포를 포함하였으며, 5Х105 개의 T세포, 5Х105 개의 T세포 및 5Х105 개의 HCT-15 세포를 각각 24웰 플레이트 내에 총 부피가 500μL에 달하도록 첨가한 후, 구배 농도로 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체(0, 100, 101, 102, 103)를 첨가하여 잘 혼합하였다. 37
Figure pct00014
에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하여 상층액을 수집하고, CBA 인간 Th1/Th2/Th17 사이토카인 검출 키트(BD, 제품 번호 560484)를 사용하여 상층액 내 다양한 사이토카인의 농도를 검출하였으며, 마지막으로 유세포 분석기로 검출하였다.
구체적인 실험 결과를 도 7a~7d에 나타내었는 바, 여기서 세포 동시 인큐베이션 상층액에서 IFN-γ, IL-2, IL-10 및 IL-17A 사이토카인의 농도를 나타내고, HCT-15 종양 세포의 존재 하에, CD3ХB7H6-14 항체의 농도가 증가함에 따라 T세포에서 분비되는 상기 4가지 사이토카인의 수준이 점차 증가하였는데, 이는 상기 이중 특이성 항체가 T세포의 활성화를 촉진하고 사이토카인을 분비할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 생체 내 이종 이식 효능 연구
HCT-15종양 세포에 대한 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체 분자의 생체 내 항종양 활성을 검출하기 위해, 본 실시예에서는 완충액군, 인간 면역글로불린(IGg)군 및 CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체 분자군을 포함한 3군을 설정하여 실험하였다. 실시예 4.1 및 4.2에 기재된 바와 같이 T세포를 분리, 정제한 후, T세포 확장 키트(gibco, 제품 번호 11131D)를 사용하여 T세포를 7일 동안 확장하였다. HCT-15 대장암 세포(1Х106)를 확장된 T세포(2Х106)와 혼합한 후 수컷 NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc 마우스의 피하에 주사(s.c.)하고, 접종 후, CD3ХB7H6 이중 특이성 항체(1mg/kg, PBS에 용해됨), IgG 대조군 항체(sigma, 제품 번호 I4506) 또는 완충액(대조군 용매)을 마우스에 2일 간격으로 총 3회 정맥 주사하였다. 외부 캘리퍼로 종양의 길이와 폭을 측정 및 검출하고 표준 공식으로 종양 부피를 계산하였다.
도 8은 HCT-15 세포에 대한 CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체 분자의 생체 내 항종양 활성을 나타낸다. CD3ХB7H6-14 이중 특이성 항체를 사용한 치료는 HCT-15 종양의 퇴행을 명백히 촉진할 수 있는 반면, 대조군 IgG 또는 대조군 용매의 사용은 치료 효과를 달성할 수 없었는데, 이는 CD3ХB7H6 이중 특이성 항체가 명백한 생체 내 항종양 활성을 가짐을 보여준다.
본 명세서의 설명에서, "일 실시예", "일부 실시예", "예", "구체적 예" 또는 "일부 예" 등의 용어를 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예와 관련하여 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어의 예시적 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예를 가리키는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성은 임의의 하나 이상의 실시예 또는 예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 상충되지 않는 범위에서 본 명세서에 기술된 상이한 실시예 또는 예 뿐만 아니라 상이한 실시예 또는 예의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예가 도시되고 설명되었지만, 상술한 실시예는 예시적인 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안되며, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예를 변화, 수정, 대체 및 변형시킬 수 있음을 이해할 수 있다.
<110> HEFEI TG IMMUNOPHARMA CO., LTD. <120> BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES OF THE SAME THEREOF <130> IPB231607CN <150> PCT/CN 2022/100475 <151> 2022-06-22 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 <400> 2 Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 <400> 3 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 <400> 4 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 <400> 5 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 <400> 6 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7 <400> 7 Lys 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Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14 <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15 <400> 15 Asp Ile Val Leu Thr Gln 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Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 17 <400> 17 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18 <400> 18 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Pro Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Ala Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 19 <400> 19 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20 <400> 20 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 21 <400> 21 Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Leu Ile Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Val 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tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 80 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 80 <400> 80 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcgtgcccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggccagggc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgac cgtggacaag 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 81 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 81 <400> 81 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcgtgcccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggcaagggc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgac cgtggacaag 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 82 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 82 <400> 82 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggccagggc ctggagtgga tgggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccatgac cgtggacacc 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 83 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 83 <400> 83 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggccagggc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgac cgtggacacc 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 84 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 84 <400> 84 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggccagggc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgac cgtggacaag 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 85 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85 <400> 85 gacatcgtgc tgacccagac ccccctgtcc ctgtccgtga cccccggcca gcccgcctcc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 ctgcagaagc ccggccagcc cccccagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg acaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaagatctcc 240 agggtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgcagctg gtgcagtccg gcgccgaggt gaagaagccc 420 ggcgcctccg tgaaggtgtc ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga ggcaggcccc cggcaagggc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgac cgtggacaag 600 tccatctcca ccgcctacat ggagctgtcc aggctgaggt ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accgtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 86 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 86 <400> 86 gacatcgtgc tgacccagtc ccccgtgtcc ctggccgtgc ccctgggcca gagggccacc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacggcg actcctacat gaactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg tgaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaacatccac 240 cccgtggagg aggaggacgc cgcctcctac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgctgctg cagcagtccg gccccgaggt ggtgaagccc 420 ggcgcctccg tgaagatcac ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga agcagtccca cggcaagtcc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacgccggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgat cgtggacaag 600 tcctcctcca ccgcctacat ggagctgagg tccctgacct ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accctgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 87 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 87 <400> 87 gacatcgtgc tgacccagtc ccccgtgtcc ctggccgtgc ccctgggcca gagggccacc 60 atctcctgca aggcctccca gtccgtggac tacgacgccg actcctacat gaactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgcctccac cctgcactcc 180 ggcatccccg tgaggttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaacatccac 240 cccgtggagg aggaggacgc cgcctcctac tactgccagc agtccaagga ggaccccagg 300 accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aagggaggcg gtggatcagg cggaggtggc 360 tcaggtggag gcggttctga ggtgctgctg cagcagtccg gccccgaggt ggtgaagccc 420 ggcgcctccg tgaagatcac ctgcaaggcc tccggctaca ccttcaccga ctacaacatg 480 gactgggtga agcagtccca cggcaagtcc ctggagtgga tcggcgacat caaccccaac 540 aacggcggca ccctgtacaa ccagaagttc aggggcaggg tgaccctgat cgtggacaag 600 tcctcctcca ccgcctacat ggagctgagg tccctgacct ccgacgacac cgccgtgtac 660 tactgcgcca ggtccgaggt gttctacggc aactacgccg actactgggg ccagggcacc 720 accctgaccg tgtcctccga gcccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 780 cccgcccccg aggccgccgg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 840 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 900 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 960 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 1020 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1080 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtgc 1140 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgtc ctgcgccgtg 1200 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1260 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ggtgtccaag 1320 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1380 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaa 1437 <210> 88 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 88 <400> 88 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccaccggc 60 60

Claims (26)

  1. 재조합 항체로서,
    CD3 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 1~6; 및
    B7H6 항체 가변 영역 CDR 서열: SEQ ID NO: 7~12; 중 적어도 하나로부터 선택된 CDR 서열 또는 이와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    CD3 항체의 가변 영역을 포함하고, 상기 CD3 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14로 표시되는 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 B7H6 항체의 가변 영역을 포함하고, 상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 25로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 B7H6 항체의 가변 영역은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    연결 펩티드를 추가로 포함하고;
    선택적으로, 상기 연결 펩티드는 SEQ ID NO: 46으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 연결 펩티드의 N-말단은 상기 CD3 항체 경쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되고, 상기 연결 펩티드의 C-말단은 상기 CD3 항체 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 연결 펩티드의 N-말단은 상기 B7H6 경쇄 가변 영역의 C-말단에 연결되고, 상기 연결 펩티드의 C-말단은 상기 B7H6 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  7. 제1항에 있어서,
    제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 더 포함하고, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 뮤린 항체, 인간 항체, 영장류 항체 또는 이들의 돌연변이체 중 적어도 하나로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG 또는 이의 돌연변이체로부터 유래되고;
    선택적으로, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 적어도 일부는 인간 IgG1 또는 이의 돌연변이체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 S384C 돌연변이 및 T396W 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 Fc 영역은 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 Y380C 돌연변이, T397S 돌연변이, L399A 돌연변이 및 Y408V 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 제2 항체 Fc 영역은 SEQ ID NO: 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  12. 재조합 항체로서,
    SEQ ID NO: 49 및 63으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  13. 핵산으로서,
    상기 핵산은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 제13항에 있어서,
    SEQ ID NO: 69로 표시되는 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 70~87로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자를 보유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 재조합 세포로서,
    상기 재조합 세포는 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 발현 벡터 또는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  17. 조성물로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 발현 벡터 또는 제16항에 따른 재조합 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 암의 치료 또는 예방용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 발현 벡터, 제16항에 따른 재조합 세포 또는 제17항에 따른 조성물의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  20. 약물로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 발현 벡터, 제16항에 따른 재조합 세포 또는 제17항에 따른 조성물을 포함하고, 상기 약물은 암의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 약물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  22. 키트로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 포함하고,
    제20항에 따른 키트로서,
    상기 키트는 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 진단하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 암의 치료 또는 예방에 있어서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 발현 벡터, 제16항에 따른 재조합 세포, 제17항에 따른 조성물 또는 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 약물의 용도.
  24. 제24항에 있어서,
    상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 암의 치료 또는 예방 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체;
    2) 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자;
    3) 제15항에 따른 발현 벡터;
    4) 제16항에 따른 재조합 세포;
    5) 제17항에 따른 조성물; 또는
    6) 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 약물; 중 적어도 하나를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제26항에 있어서,
    상기 암은 직장암, 비소세포폐암, 유방암 및 간암 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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