CN115611985A - 抗cd3的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种抗CD3的抗体及其应用，该抗体包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1‑3，轻链可变区CDR序列：SEQINNO:4‑6。本发明实施例的抗体能够与人和猴CD3蛋白进行结合，且利用该抗体制备的双特异性抗体具有较高的人和猴CD3结合活性，均能够有效治疗和/或预防CD3介导的相关疾病。

Description

抗CD3的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种抗CD3的抗体及应用。
背景技术
T淋巴细胞在适应性免疫应答和免疫应答的精确调控过程中起着非常重要的作用。T细胞表面T细胞受体(TCR)以α和β或者γ和δ的异二聚体形式存在。T细胞在接受抗原递呈细胞的抗原肽信号后，TCR并不能直接介导细胞内信号，它需要和CD3分子形成复合物。不仅α和βTCR与CD3形成复合物，γ和δTCR也与CD3形成复合物。TCR或CD3基因的缺失均可导致TCR-CD3复合物从T细胞表面消失。CD3分子是由5条肽链形成的3对肽链组合而成，90％的CD3是由γε、δε和ζη的方式组合，而另外10％的CD3由γε、δε和ζζ的方式组合。CD3各条肽链胞内区的免疫受体酪氨酸活化基序，经由T细胞内酪氨酸蛋白激酶p56磷酸化，募集和结合ZAP-70等酪氨酸激酶后，参与介导TCR活化信号。
在基于T细胞再导向的双特异性抗体中，CD3这个靶点被广泛选择。与免疫卡控点阻断抗体不同的是，CD3相关的双特异性抗体可以越过TCR和肽-主要组织相容性复合物(pMHC)来介导T细胞活化，但在突触中的分子发挥作用过程与经典TCR-pMHC的相互作用很相似。双特异性抗体的活性受CD3亲和力的影响，CD3高亲和力双特异性抗体在体外实验中有着更好的促杀伤效果，但是在体内存在较高的释放因子综合征风险。同时有研究发现非常低亲和力的CD3抗体序列在构建双特异性抗体后也可以有效地刺激T细胞活化。当CD3抗体亲和力在合适范围且肿瘤靶点相关抗体是高亲和力时，双特异性抗体会促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化。
已知的很多CD3抗体为物种特异性的，例如UCHT-1、OKT3和L2K等克隆都只与黑猩猩CD3反应但不与其他灵长类如食蟹猴和恒河猴CD3或鼠CD3反应。由于新药开发必需经过严格的非临床试验才能进行临床研究，因此临床前的安全性评价找到相关种属十分必要。而使用黑猩猩进行药物安全性测试是被高度限制的。目前已知的具有人猴交叉的CD3抗体中，SP34抗体在构成单链抗体后亲和力会呈现数量级下降。
因此，开发出与其他非人灵长类有特异性交叉的CD3抗体具有较大的实际应用价值。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一：
本申请的发明人成功地筛选到一种鼠源抗CD3单克隆抗体，该单克隆抗体与人或猴CD3蛋白具有较高的结合活性，此外，发明人将获得的鼠源抗体的恒定区进行部分人源化，保留鼠源抗CD3单克隆抗体的CDR，以获得嵌合抗体，更进一步地，将所述嵌合抗体的轻链可变区或重链可变区中的框架区进行人源化，得到抗CD3的完全人源化抗体，所述嵌合抗体和人源化抗体不仅能够特异性的靶向结合人CD3蛋白和猴CD3蛋白，而且具有免疫原性低的特点，能够有效治疗和/或预防CD3介导的相关疾病，如自身免疫病。
利用所述抗CD3抗体制备的双特异性抗体(双抗)或者多特异性抗体(多抗)同样能够特异性的靶向结合人CD3蛋白和猴CD3蛋白，且通常地，基于双抗或者多抗体的特异性，所述双抗或者多抗体能够把T细胞靶向到其它抗原，通过T细胞介导的细胞杀伤作用来消除产生这种抗原的细胞，从而治疗多种疾病，如肿瘤。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD3蛋白进行结合，有效治疗或预防CD3介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和/或分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，SEQ IDNO:6所示的轻链可变区CDR3。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：重链FR区和轻链FR区中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述重链FR区和轻链FR区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：分别如SEQ ID NO:7～10所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；或分别如SEQ ID NO:15～18所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：分别如SEQ ID NO:11～14所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一；或分别如SEQ ID NO:19～22所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：分别如SEQ ID NO:7～10所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；分别如SEQ ID NO:11～14所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一；或者分别如SEQ ID NO:15～18所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；分别如SEQ ID NO:19～22所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:27所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:28所示的轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：1)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区；或2)如SEQ ID NO:27所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:28所示的轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:29或33所示氨基酸序列的重链恒定区和/或如SEQ ID NO:30或34所示氨基酸序列的轻链恒定区。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:35、37和39任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:36、38和40任一项所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链；所述抗体或抗原结合片段具有SEQ IDNO:37所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链；或所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗。
根据本发明的实施例，所述单抗包括全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种双抗。根据本发明的实施例，包括第一结合区，所述第一结合区包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段；和第二结合区，所述第二结合区具有BCMA或B7H6结合活性。根据本发明实施例的双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，可以将其应用于科学研究，或有效治疗或预防CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病。
本领域技术人员可以理解，所述第二结合区的结合活性并不受特别限制，也可以具有其它结合活性，只要所述双抗具有第一方面所述的抗体或抗原结合片段，且所述抗体或抗原结合片段和所述第二结合区均能够有效发挥功能即可。此外，也可以利用本申请所述的抗体或抗原结合片段制备更多特异性抗体，如三特异性、四特异性、五特异性，基于所述抗体的多特异性，本发明的抗体或抗原结合片段能够把T细胞靶向到其它抗原，通过T细胞介导的细胞杀伤作用来消除产生这种抗原的细胞。
根据本发明的实施例，上述双抗还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述双抗包括对称双抗或不对称双抗。
根据本发明的实施例，所述双抗为对称双抗。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段为抗CD3单链抗体。
根据本发明的实施例，所述第二结合区包括具有BCMA或B7H6结合活性的全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。本领域技术人员可以理解，所述第二结合区的具体组成不受特别限制，只要具有BCMA或B7H6结合活性即可，可以是完整的全长抗体，也可以是抗体片段(抗原结合片段)。
根据本发明的实施例，所述第二结合区包括抗BCMA单链抗体或抗B7H6单链抗体。
根据本发明的实施例，所述抗CD3单链抗体包括抗CD3抗体轻链可变区和抗CD3抗体重链可变区，所述抗CD3抗体重链可变区具有SEQ ID NO:23或27所示的氨基酸序列，所述抗CD3抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO:24或28所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗CD3单链抗体进一步包括连接肽1，其中，所述连接肽1的N端与所述抗CD3抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述抗CD3抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽1的N端与所述抗CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述抗CD3抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述抗BCMA单链抗体包括抗BCMA抗体轻链可变区和抗BCMA抗体重链可变区，所述抗BCMA抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，所述抗BCMA抗体重链可变区具有如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗BCMA单链抗体进一步包括连接肽2，其中，所述连接肽2的N端与所述抗BCMA抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述抗BCMA抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽2的N端与所述抗BCMA抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述抗BCMA抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述抗B7H6单链抗体包括抗B7H6抗体轻链可变区和抗B7H6抗体重链可变区，所述抗B7H6抗体重链可变区具有SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，所述抗B7H6抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗B7H6单链抗体进一步包括连接肽3，其中，所述连接肽3的N端与所述抗B7H6抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述抗B7H6抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽3的N端与所述抗B7H6抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述抗B7H6抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的实施例，所述连接肽1具有氨基酸序列(GGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
根据本发明的实施例，所述连接肽2和连接肽3中的至少之一具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本领域技术人员可以理解，本文中所述的连接肽1、2、3不受特别限制，本领域常规连接肽均可使用，如常规的柔性氨基酸片段或刚性氨基酸片段。
根据本发明的实施例，所述连接肽1具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述连接肽2和3具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗CD3单链抗体具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗BCMA单链抗体具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗B7H6单链抗体具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区进一步包括第一Fc肽段，所述第一Fc肽段的N端与所述抗体或抗原结合片段的C端相连。
根据本发明的实施例，所述第二抗原结合区进一步包括第二Fc肽段，所述第二Fc肽段的N端与所述抗BCMA单链抗体或所述抗B7H6单链抗体的C端相连。
根据本发明的实施例，所述第一Fc肽段具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第二Fc肽段具有SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第一Fc肽段和所述第二Fc肽段通过knob-into-hole结构进行连接。本领域技术人员可以理解，所述第一Fc肽段和所述第二Fc肽段的氨基酸序列可以相同也可以不同，例如，具有相同的氨基酸序列时，所述第一Fc肽段和所述第二Fc肽段可以通过二硫键进行连接。
根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述第二抗原结合区具有SEQ ID NO:52或53所示的氨基酸序列。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段或者所述双抗的核酸在本发明的范围内，根据其氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列。
因此，在本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段或所述双抗。根据本发明一些具体实施方式中的核酸分子编码的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD3蛋白进行结合，有效治疗或预防CD3介导的相关疾病，所述核酸分子编码的双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，有效治疗或预防CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子进行可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述抗体或抗原结合片段。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本领域技术人员可以理解，用来编码抗体或抗原结合片段的核酸分子，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前面所述的抗体或抗原结合片段或双抗的方法，包括：将前面所述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述抗体或抗原结合片段或双抗。根据本发明一些具体实施方式所提出的方法可以有效体外大量获得所述抗体或抗原结合片段或所述双抗。
根据本发明的一些具体实施方式，上述制备前面所述的抗体或抗原结合片段或双抗的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的一些具体实施方式，所述细胞不受特别限制，原核细胞或真核细胞均可使用。
根据本发明的一些具体实施方式，所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施方式，所述真核细胞为哺乳动物细胞。根据本发明的一些具体实施例，当所述细胞为真核细胞，如哺乳动物细胞时所述重组抗体的表达效率较高。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞前面所述的核酸，或表达载体，或能够表达前面所述的抗体或抗原结合片段或所述双抗。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施方式，所述重组细胞在合适条件下可高效并大量表达上述抗体或抗原结合片段或所述双抗。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗体或抗原结合片段或双抗表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗体或抗原结合片段或双抗表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体或抗原结合片段或双抗表达的条件。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种免疫缀合物，包括前面所述的抗体或抗原结合片段或所述双抗，和治疗剂。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效CD3蛋白进行结合，所述双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，有效治疗或预防CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病，因此，包含所述抗体或抗原结合片段的免疫缀合物同样能够与人或猴的CD3蛋白进行结合，包含所述双抗的免疫缀合物同样能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，所述免疫缀合物具有良好的预防和/或治疗CD3介导的疾病，或者CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病效果。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种组合物，包括前面所述的抗体或抗原结合片段、双抗、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD3蛋白进行结合，所述双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，并有效抑制肿瘤细胞的增殖，因此，包含上述物质的组合物同样可以有效与人或猴CD3蛋白，或者与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD3介导的疾病，或者CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病效果，其中，所述组合物的种类不受特别限制，可以为食品组合物或药物组合物。
本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合给药，例如，与化疗剂组合给药。因此，所述组合物还可以含有化疗剂。本发明的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物还可以与第二治疗剂组合，所述第二治疗剂的示例性试剂包括但不限于抑制CD3活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰CD3上游或下游信号转导的试剂。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种药物，包括前面所述的抗体或抗原结合片段、双抗、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD3蛋白进行结合，所述双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，因此，包含有效量的所述抗体或抗原结合片段或者所述双抗的活性成分或其一系列物质的药物同样可以有效与人或猴CD3蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD3介导的疾病，或者CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病效果。
根据本发明的实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物还可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的抗体或抗原结合片段或所述双抗的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，其中，给药的方式可以为口服给药、经鼻给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药或静脉给药或腹腔内给药，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。所述抗体或抗原结合片段或双抗可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然，本文中的抗CD3单抗或双抗还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒含有前面所述抗体或其抗原结合片段、双抗、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述，本发明一些具体实施方式的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD3蛋白进行结合，所述双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，因此，包含所述抗体或抗原结合片段的试剂盒能够有效的对人或猴的CD3蛋白进行定性或定量检测，包含所述双抗的试剂盒能够有效的对人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白，或者人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行定性或定量检测。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用人或猴CD3和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗CD3抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗CD3抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括CD3相关疾病，例如癌症，其中，所述癌症包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少一种。当然本文提供的抗体或抗原结合片段也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。针对于上述应用场景，所述双抗同样适用，此处不再累述。
所述试剂盒还可以包括常规用于检测CD3，或者CD3和BCMA，或者CD3和B7H6的试剂，如包被液等。
在本发明的第十一方面，本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD3介导的相关疾病。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD3蛋白进行结合，因此，包含有效量的所述抗体或抗原结合片段或其一系列物质的药物同样可以有效与人或猴CD3蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD3介导的相关疾病效果。
根据本发明的实施例，上述制备药物的用途还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
在本发明的第十二方面，本发明提出了前面所述的双抗、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病。如前所述，本发明一些具体实施方式的所述双抗能够与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，因此，包含有效量的所述双抗的活性成分或其一系列物质的药物同样可以有效与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，具有良好的预防和/或治疗CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病效果。
根据本发明的实施例，上述制备药物的用途还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第十三方面，本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段、核酸分子、表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3。如前所述，本发明一些具体实施方式的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD3蛋白进行结合，并阻断所述CD3蛋白与其受体进行结合，因此，所述抗体或抗原结合片段可以用于制备检测CD3蛋白的试剂盒，所述试剂盒能够有效的对人或猴的CD3蛋白进行定性或定量检测。
在本发明的第十四方面，本发明提出了前面所述的双抗、核酸分子、表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6。如前所述，本发明一些具体实施方式的双抗能够有效与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，因此，所述双抗可以用于制备检测CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6的试剂盒，所述试剂盒能够有效的对人或猴的CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6进行定性或定量检测。
在本发明的第十五方面，本发明提出了一种治疗或预防CD3，或者CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向受试者施用以下中的至少之一：1)前面所述的抗体或抗原结合片段；2)前面所述的双抗；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；5)前面所述的重组细胞；6)前面所述的组合物；和7)前面所述的药物。如前所述，所述双抗能够有效与人或猴CD3蛋白和BCMA蛋白进行结合，或者与人或猴CD3蛋白和B7H6蛋白进行结合，所述抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD3蛋白进行结合，能够有效治疗或预防CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病，例如：自身免疫性疾病或者癌症，因此，根据本发明实施例的方法能够有效治疗或预防CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病，优选为自身免疫性疾病或者癌症。
根据本发明的实施例，上述治疗或预防疾病的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第十六方面，本发明提出了一种诊断CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6进行检测：1)前面所述的抗体或抗原结合片段；2)前面所述的双抗；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6的检测结果，确定所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6的含量。本申请提出的所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD3蛋白进行结合，所述双抗，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的双抗均可以有效与CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量，并可以对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6引起的相关疾病进行有效诊断。
根据本发明的实施例，上述诊断疾病的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量不低于患病的最低标准是待测样品来源于患有CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6引起的相关疾病的患者的指示。所述最低标准的值可以通过对大量患有所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量进行差异比较分析、以及验证，而确定下来。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、唾液、汗液、组织、细胞、血液、血清、血浆、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第十七方面，本发明提出了一种对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病进行分期的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6进行检测：1)前面所述的抗体或抗原结合片段；2)前面所述的双抗；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的检测结果，确定所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量。本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的双抗均可以有效与人或猴的CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴的CD3蛋白进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6含量，并基于所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6含量对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6引起的相关疾病所处的时期进行评估。
根据本发明的实施例，上述对疾病进行分期的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量不低于肿瘤IV期患病的标准水平是待测样品来源于患有肿瘤IV期的患者的指示，所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量位于肿瘤IV期和III期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤III期的患者的指示；所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量处于肿瘤III期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤II期的患者的指示；所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量处于I期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤I期的患者的指示。本领域技术人员可以理解，所述的肿瘤I期、II期、III期、IV期患病时CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的水平根据肿瘤种类的不同而变化，判断肿瘤所述时期，只要将所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量与对应的该肿瘤阶段CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的标准水平进行对比即可知晓，或将所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量与已知患病时期的个体或群体来源的样品CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量进行对比。所述肿瘤I期、II期、III期、IV期标准水平的值可以通过对大量所述患有血管生成引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量的差异进行比较分析、以及验证，而确定下来。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、唾液、汗液、组织、细胞、血液、血清、血浆、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第十八方面，本发明提出了一种评估CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病预后的方法。根据本发明的实施例，包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6进行检测：2)前面所述的双抗；2)前面所述的抗体或抗原结合片段；3)前面所述的核酸分子；4)前面所述的表达载体；和5)前面所述的重组细胞，基于所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的检测结果，确定所述待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量。如前所述，CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量对癌症具有重要影响，患有相关疾病个体进行治疗后，通过监测其组织或排泄物，如外周血、尿液等中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量可以有效评估该类疾病的预后，例如，将治疗前后的受试者体内CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量进行比较，或将治疗后的受试者体内CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量与正常个体或患病个体的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6水平进行比较等方式，本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体或重组细胞表达的双抗均可以有效与CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD3进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量，并基于所述CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6引起的相关疾病的预后进行评估。
根据本发明的实施例，上述评估疾病预后的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品来源于治疗前或治疗后的患有CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病的患者。
根据本发明的实施例，所述待测样品包括下列中的至少之一：血液、唾液、汗液、组织、细胞、血液、血清、血浆、粪便和尿液。
根据本发明的实施例，基于所述治疗前或治疗后的患有CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病的患者的待测样品中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量，确定CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病的预后效果。
根据本发明的实施例，治疗后的患有CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6介导的相关疾病的患者的待测样品中的CD3，或者CD3和/或BCMA，或者CD3和/或B7H6的含量下降是患者预后良好的指示。
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第十九方面，本发明提出了本发明提出了前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体、重组细胞，组合物或药物在治疗或预防CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病中的用途。如前所述，所述双抗与CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6均具有较高的结合活性，所述抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD3进行有效结合，能够有效治疗或预防CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
在本发明的第二十方面，本发明提出了前面所述的双抗，抗体或抗原结合片段，核酸分子，表达载体或重组细胞在诊断CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病、对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病进行分期或评估CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病预后中的用途。如前所述，本申请提出的所述双抗，或核酸分子、表达载体或重组细胞表达的双抗均可以有效与CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6进行结合，所述抗体或抗原结合片段，或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD3进行结合，因此，采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6含量，并可以对CD3，或者CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6介导的相关疾病进行有效诊断、疾病分期和疾病预后评估。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病。
根据本发明的实施例，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
根据本发明的实施例，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
本发明中涉及的“受试者”或“个体”一般指哺乳动物，如灵长类动物和/或啮齿类动物，特别是人、猴或鼠。
本发明的有益效果：
1)本发明获得的所述鼠源的抗CD3的单克隆抗体较现有CD3单克隆抗体具有更高的CD3蛋白结合活性，且所述CD3蛋白包括人CD3蛋白和猴CD3蛋白。
2)将所述鼠源抗CD3单克隆抗体进行人源化后获得的所述人源化抗体同样较现有CD3单克隆抗体具有更高的CD3蛋白结合活性，所述CD3蛋白包括人CD3蛋白和猴CD3蛋白，且所述人源化抗体具有较低的免疫原性，安全性更高，效力更加持久。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1A为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD3抗体(m47B5)结合人CD3EG蛋白的ELISA检测结果图；
图1B为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD3抗体结合人CD3ED蛋白的ELISA检测结果图；
图1C为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD3抗体结合猴CD3EG蛋白的ELISA检测结果图；
图1D为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD3抗体结合猴CD3ED蛋白的ELISA检测结果图；
图2A为根据本发明实施例的不同浓度的人-鼠嵌合CD3抗体ch47B5结合人PBMC细胞的检测结果图；
图2B为根据本发明实施例的不同浓度的人-鼠嵌合CD3抗体ch47B5结合猴PBMC细胞的检测结果图；
图3A为根据本发明实施例的不同浓度的人源化CD3抗体结合人CD3蛋白的检测结果图；
图3B为根据本发明实施例的不同浓度的人源化CD3抗体结合猴CD3蛋白的检测结果图；
图4A为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×BCMA双特异性抗体结合人CD3蛋白的检测结果图；
图4B为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×BCMA双特异性抗体结合人BCMA蛋白的检测结果图；
图5为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×BCMA双特异性抗体对NCI-H929细胞的杀伤检测结果图；
图6A为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×B7H6双特异性抗体结合人CD3蛋白的检测结果图；
图6B为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×BCMA双特异性抗体结合人B7H6蛋白的检测结果图；以及
图7为根据本发明实施例的不同浓度的CD3×BCMA双特异性抗体对HCT-15细胞的杀伤检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明所述的抗体或抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。其中，所述抗体或抗原片段是采用Kabat编号系统进行编号和定义的。
本文中，所述“单抗”是指具有单一抗原结合位点的抗体。
本文中，所述“双抗”是指具有两个不同抗原结合位点的抗体。
在本文中，术语“突变体”或“变体”可以指包含对任何天然存在的或工程化的分子进行包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变获得的分子。
术语“互补决定区”或“CDR”或“CDR序列”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸序列，例如，通常包括：轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))；和/或来自“高变环”(例如，轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
在本文中，术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第19章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLASTAltschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，MountainView，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
如前所述，本发明的单抗可以是全长抗体或可仅包含其功能性片段，或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CD3抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在本文中，所述“全长抗体”是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构，如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白E(IgE)。
本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如CDR移植抗体、Fab、F(ab’)2、Fv或scFv，纳米抗体、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇，如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有CD3结合活性。优选地，所述功能性片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于CD3，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少3个氨基酸，优选其来源的抗体序列的5、10、15、25、50和100个连续氨基酸。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗原结合片段”通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，示例性的，如包括CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，纳米抗体等。
在本文中，术语“CDR移植抗体”是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
在本文中，术语“Fab抗体”或“Fab”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“F(ab’)2抗体”或“F(ab’)2”具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分。
在本文中，术语“纳米抗体”(单域抗体或VHH抗体)，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的片段。
在本文中，“knob into hole结构”为在抗体重链恒定区的CH3区形成钮(Knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体，例如，本申请中，通过突变人IgG1重链恒定区CH3结构域中氨基酸(一条链中为T366S、L368A、Y407V、Y349C突变，即“hole”；另一链中为T366W、S354C突变，即“knob”)实现。其中，此处的氨基酸编号为根据Kabat编号系统进行编号，例如，所述“T366S”是指按照Kabat编号系统编号第366位的T氨基酸被S氨基酸替代。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1：
Figure BDA0003912393960000111
Figure BDA0003912393960000121
Figure BDA0003912393960000131
Figure BDA0003912393960000141
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Figure BDA0003912393960000161
Figure BDA0003912393960000171
Figure BDA0003912393960000181
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例或测试例中，未注明具体条件的实验方法的，均按照常规条件进行。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗人CD3杂交瘤单克隆抗体的制备
本发明中，抗人CD3单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用C57BL/6小鼠，雌性，6周龄(江苏集萃药康生物科技有限公司)，免疫抗原为人CD3E&D，人CD3E&G，猴CD3E&D，猴CD3E&G胞外段蛋白(ACRO)，首次免疫用弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)与抗原混合乳化后腹腔免疫，每只小鼠腹腔注射100μg，后续免疫用Ribi佐剂系统(Sigma，S6322)与抗原混合后腹腔免疫，其中，首免后每隔2周免疫一次，共免疫3次。取免疫后的小鼠血清进行抗体滴度ELISA检测，其操作方法为本领域常规方法。
根据抗体滴度的检测结果，选择血清中抗体滴度高小鼠进行脾细胞融合，融合前72小时冲刺免疫所选小鼠，使用Ribi佐剂系统和上述抗原的混合物腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(ATCC，CRL-8287)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20％FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬，分装于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基，50μL/孔。融合后第7天～8天，根据细胞生长密度，全换液，培养基为HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，200μL/孔。
融合后第10-11天，根据细胞生长密度，进行流式细胞术结合检测。阳性孔换液，并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选为阳性的进行保种，并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性的进行保种和蛋白表达。其中，亚克隆和保种操作均为本领域常规技术操作，通过无血清细胞培养法进一步制备抗体，通过protein G亲和层析纯化鼠源抗体，用于后续功能活性检测。
实施例2鼠源CD3抗体ELISA结合实验
ELISA实验用于检测实施例1获得的鼠源CD3抗体m47B5的结合特性。将人CD3ED蛋白(ACRO biosystems，CDD-H52W1)，人CD3EG蛋白(ACRO biosystems，CDG-H52W5)，猴CD3ED蛋白(ACRO biosystems，CDD-C52W4)，猴CD3EG蛋白(ACRO biosystems，CDG-H52W6)分别用包被缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA,0.05％Tween20-PBS,pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入鼠源抗体m47B5，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-羊抗鼠IgG二抗(boster，货号BA1051)，室温孵育1小时。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2-5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。其中，图1A表明本发明的鼠源m47B5抗体可以结合人CD3EG，图1B表明本发明的鼠源m47B5抗体也可以结合人CD3ED，图1C表明本发明的鼠源m47B5抗体可以结合猴CD3EG，图1D表明本发明的鼠源m47B5抗体可以结合猴CD3ED。
实施例3杂交瘤细胞测序
将实施1和2筛选到的m47B5抗体候选杂交瘤细胞总数量培养到106，800rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA；以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库(Invitrogen)，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的m47B5抗体可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(具体序列参考Larrick，J.W.，et al.，(1990)Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991)BioTechniques，11，152-156)。PCR扩增在50μL反应体系中进行，分别加入cDNA 2μL，10×PCR缓冲液5μL，上游及下游引物2μL(5μM)，dNTP 2μL，Taq酶1μL(Takara，Ex Taq)，H2O 38μL；95℃预变性5min，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32个循环，然后于72℃延伸7min。将扩增产物进行测序后，得到鼠单抗m47B5的重链可变区(SEQ ID NO:23)和轻链可变区(SEQ ID NO:24)序列。
实施例4嵌合CD3抗体流式细胞术结合实验
利用上述鼠单抗m47B5构建人--鼠嵌合抗体(ch47B5)，其中，所述嵌合抗体中的重链恒定区使用人IgG1的重链恒定区。
用PBS将人外周血单个核细胞(PBMC)或者猴PBMC细胞稀释为2×106个/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，于4℃封闭30min。加梯度浓度(5倍稀释，终浓度最高10μg/mL)的上述人鼠嵌合抗体ch47B5，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃，3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入0.1μL/管Alexa-647标记的大鼠抗人抗体二抗(biolegend)，4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，然后用流式细胞仪进行检测，其中，以BT062抗体为对照抗体。图2A和图2B结果表明嵌合47B5抗体可以结合人PBMC和猴PBMC，说明嵌合CD3抗体可以结合细胞表面的CD3蛋白。
实施例5抗人CD3单克隆抗体的人源化
5.1CD3单克隆抗体可变区框架的选择与回复突变
在实施例4获得的嵌合抗体的基础上，通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与鼠源单克隆抗体m47B5同源性高的重链或轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源单克隆抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
为了保持CDR区构象，对于VL和VH结合界面上的残基，靠近CDR并且包埋于蛋白内部的残基，与CDR有直接相互作用的残基进行回复突变，以保证可变区的活性不会受影响。
5.2CD3人源化抗体的表达
对上述CD3单克隆抗体可变区框架进行选择与回复突变后，获得的人源化CD3抗体h47B5的重链可变区序列如SEQ ID NO:27所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:28所示。将带有编码人源化抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)和编码人源化抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)通过分子生物学技术分别重组到pTT5质粒上。
用上述携带有人源化抗人CD3抗体h47B5轻链和重链的pTT5载体瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco，货号A29127)来制备抗体。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3～4)×106/mL，37℃，8％CO2，120rpm摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7×106～1×107/mL，存活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco，货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL，将上述携带有人源化抗人CD3抗体h47B5轻链和重链的pTT5质粒和ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco，货号A29129)以2：1摩尔比转染到ExpiCHO-S细胞中，于37℃，8％CO2，120rpm摇动培养。转染后18-22h，将ExpiFectamine CHOEnhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃，5％CO2，120rpm摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10～14天后离心收获细胞。表达的上清用0.22μm滤膜过滤，利用Mabselect prism A亲和层析柱(GE公司，货号17549854)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH2.7)洗脱，最后用PBS缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95％以上，最终获得了人源化m47B5抗体(重链如SEQ ID NO:39所示，轻链如SEQ ID NO:40所示)。
5.3人源化抗体h47B5亲和力验证
用BIACORE测试人源化h47B5抗体与人CD3抗原的亲和力，得到的结果如表2所示，获得的人源化抗体与CD3抗原具有较好的亲和力。
表2
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
h47B5 人CD3 3.36E+05 1.84E-03 5.48E-09
实施例6人源化抗体h47B5的ELISA结合实验
ELISA实验用于检测人源化抗体h47B5的结合特性，其中，以野生型人源IgG1抗体为对照。将人CD3抗原(ACRO biosystems，CDD-H52W1)和猴CD3抗原(ACRO biosystems，CDD-C52W4)用包被缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA,0.05％Tween20-PBS,pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入梯度浓度的人源化抗人CD3抗体h47B5或人源IgG1抗体，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-山羊抗人IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，109-036-170))，室温孵育1小时。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2～5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。图3A和图3B表明本发明的人源化h47B5抗体可以结合人和猴的CD3抗原。
实施例7CD3×BCMA的双特异性抗体的制备及结合活性和细胞杀伤能力检测
基于实施例1-6的实验结果，发明人设计了一种双特异性抗体CD3×BCMA，并对该双特异性抗体的结合活性和细胞杀伤能力进行检测。
7.1CD3×BCMA的双特异性抗体的设计及制备
该抗体含有两个单价单元，其中一个单价单元为抗CD3 scFv-Fc形式，其重链和轻链可变区氨基酸序列来自本发明实施例6获得的人源化抗体h47B5的序列，另一个单价单元为抗BCMA的scFv-Fc形式(序列来自US009273141B2)，该双特异性抗体命名为CD3×BCMA。该双特异性抗体含有两条多肽链，分别是：含有CD3单链抗体scFv的重链(SEQ ID NO：51)，含有BCMA单链抗体scFv的重链(SEQ ID NO：52)，其中两条链的重链恒定区来自于人源抗体IgG1。由于该分子有特殊的非对称结构，为了减少同源二聚体的产生，所以在两条链的恒定区引入了不同的氨基酸突变，形成knob-in-hole结构。同时为了防止由Fcγ受体引起的交联活化，在重链恒定区也引入了(L234A/L235A)突变。
双特异性抗体的制备方法参考实施例6.2所述方法，并结合质粒配比(1：1或其他比例)并经过一步亲和纯化制备所述双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体CD3×BCMA的相关序列如表3所示。
表3
项目 CD3重链 BCMA重链
氨基酸序列 SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：52
核苷酸序列 SEQ ID NO：58 SEQ ID NO：59
7.2CD3×BCMA双特异性抗体与抗原的结合活性测定(ELISA)
将人BCMA(ACRO biosystems，BCA-H522y)或人CD3抗原(ACRO biosystems，CDD-H52W1)用包被缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，于4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA，0.05％Tween20-PBS，pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体，室温孵育1小时。再用PBST清洗沉淀3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-山羊抗人IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，109-036-170)，于室温孵育1小时。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2～5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。图4A和4B显示本发明CD3×BCMA可以结合CD3和BCMA这两种抗原。
7.3细胞杀伤实验
将多发性骨髓瘤NCI-H929细胞标记CellTrace Violet(thermo，C34557)，调整细胞密度为1×105/mL。PBMC调整细胞密度1×106/mL，将PBMC和标记后的NCI-H929细胞以1：1混合后加入到96孔圆底板中，再加入梯度浓度的上述双特异性抗体或人IgG抗体(对照组)，混合均匀。于37℃孵育24h后过200目尼龙网转入流式管，加入7AAD后10min进行检测，利用CTV+7AAD+细胞比例表征杀伤效率。图5结果显示随着CD3×BCMA双特异性抗体浓度增加，PBMC对NCI-H929多发性骨髓瘤细胞的杀伤效率逐渐增加。
实施例8CD3×B7H6的双特异性抗体的制备及结合活性和细胞杀伤能力检测
基于实施例1-6的实验结果，发明人设计了一种双特异性抗体CD3×B7H6，并对该双特异性抗体的结合活性和细胞杀伤能力进行检测。
8.1CD3×B7H6的双特异性抗体的设计及制备
该抗体含有两个单价单元，其中一个单价单元为抗CD3 scFv-Fc形式，CD3 scFv中的轻链和重链可变区来自本发明实施例6人源化后序列，另一个单价单元为抗B7H6 scFv-Fc形式(B7H6 scFv序列来自CN114395045A)，这个双特异性抗体命名为CD3×B7H6。该双特异性抗体含有两条多肽链，分别是：含有CD3单链抗体scFv的重链(SEQ ID NO：51)，含有B7H6单链抗体scFv的重链(SEQ ID NO：53)。由于该分子有特殊的非对称结构，为了减少同源二聚体的产生，所以在两条链的恒定区引入了不同的氨基酸突变，形成knob-in-hole结构。同时为了防止由Fcγ受体引起的交联活化，在重链恒定区也引入了(L234A/L235A)突变。
CD3×B7H6的双特异性抗体的制备方法参考实施例6.2，并结合质粒配比(1：1或其他比例)并经过一步亲和纯化制备CD3×B7H6双特异性抗体，所述双特异性抗体CD3×B7H6的相关序列如表4所示。
表4
项目 CD3重链 B7H6重链
氨基酸序列 SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：53
核苷酸序列 SEQ ID NO：58 SEQ ID NO：60
8.2双特异性抗体与抗原的结合活性测定(ELISA)
将人B7H6(ACRO biosystems，B76-H52H8)或人CD3抗原(ACRO biosystems，CDD-H52W)用包被缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，于4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA，0.05％Tween20-PBS，pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-山羊抗人IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，109-036-170)，于室温孵育1小时。孵育结束后，用PBST清洗沉淀3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2～5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。图6A和6B显示，本发明的双特异性抗体CD3×B7H6可以有效结合CD3和B7H6这两种抗原。
8.3细胞杀伤实验
将结直肠癌HCT-15细胞消化后计数，调整细胞密度为2×105/mL。打开RTCA仪器(安捷伦)，选择仪器类型DP，选择实验模式，填写细胞信息和药物信息。进入schedule设置实验步骤，将板子加入50μL新鲜培养基(89％RPMI 1640培养基+10％胎牛血清+1％青链霉素)后放入仪器中，关好，点击第一步开始。完成Done后取出板子，加入100μL细胞悬液，室温静置15-30min防止边缘效应，放入仪器，点击开始。待生长到对数期后，暂停，加入50μLPBMC(4×106/mL)，并加入梯度浓度的双特异性抗体CD3×B7H6，点击开始，一段时间后进行分析。图7结果显示，随着CD3×B7H6双特异性抗体浓度增加，PBMC对结直肠癌HCT-15细胞的杀伤效率逐渐增加，说明CD3×B7H6可以很好地促进PBMC特异性地杀伤B7H6+的肿瘤细胞。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (29)

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：
重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，
轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和/或
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：重链FR区和轻链FR区中的至少之一；
任选地，所述重链FR区和轻链FR区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
5.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：
分别如SEQ ID NO:7～10所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；或
分别如SEQ ID NO:15～18所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一。
6.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：
分别如SEQ ID NO:11～14所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一；或
分别如SEQ ID NO:19～22所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
7.根据权利要求5～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：分别如SEQ ID NO:7～10所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；分别如SEQID NO:11～14所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一；或者
分别如SEQ ID NO:15～18所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一；分别如SEQ ID NO:19～22所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27所示的重链可变区；和/或
如SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:28所示的轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
1)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区；或
2)如SEQ ID NO:27所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:28所示的轻链可变区。
10.根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一；
任选地，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体；
任选地，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体；
任选地，所述抗体具有如SEQ ID NO:29或33所示氨基酸序列的重链恒定区和/或如SEQID NO:30或34所示氨基酸序列的轻链恒定区。
11.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:35、37和39任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:36、38和40任一项所示氨基酸序列的轻链。
12.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链；
所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链；或
所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗；
任选地，所述单抗包括全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
14.一种双抗，其特征在于，包括：
第一结合区，所述第一结合区包含权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段；和
第二结合区，所述第二结合区具有BCMA或B7H6结合活性。
15.根据权利要求14所述的双抗，其特征在于，所述双抗包括对称双抗或不对称双抗；
任选地，所述双抗为非对称双抗。
16.根据权利要求14所述的双抗，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为抗CD3单链抗体；
任选地，所述第二结合区包括具有BCMA或B7H6结合活性的全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；
任选地，所述第二结合区包括抗BCMA单链抗体或抗B7H6单链抗体；
任选地，所述抗CD3单链抗体包括抗CD3抗体轻链可变区和抗CD3抗体重链可变区，所述抗CD3抗体重链可变区具有SEQ ID NO:23或27所示的氨基酸序列，所述抗CD3抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO:24或28所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗CD3单链抗体进一步包括连接肽1，其中，所述连接肽1的N端与所述抗CD3抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述抗CD3抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽1的N端与所述抗CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽1的C端与所述抗CD3抗体重链可变区的N端相连；
任选地，所述抗BCMA单链抗体包括抗BCMA抗体轻链可变区和抗BCMA抗体重链可变区，所述抗BCMA抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，所述抗BCMA抗体重链可变区具有如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗BCMA单链抗体进一步包括连接肽2，其中，所述连接肽2的N端与所述抗BCMA抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述抗BCMA抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽2的N端与所述抗BCMA抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽2的C端与所述抗BCMA抗体重链可变区的N端相连；
任选地，所述抗B7H6单链抗体包括抗B7H6抗体轻链可变区和抗B7H6抗体重链可变区，所述抗B7H6抗体重链可变区具有SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，所述抗B7H6抗体轻链可变区具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗B7H6单链抗体进一步包括连接肽3，其中，所述连接肽3的N端与所述抗B7H6抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述抗B7H6抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽3的N端与所述抗B7H6抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽3的C端与所述抗B7H6抗体重链可变区的N端相连；
任选地，所述连接肽1具有氨基酸序列(GGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述连接肽2和连接肽3具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述连接肽1具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；
任选地，所述连接肽2和连接肽3具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗CD3单链抗体具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗BCMA单链抗体具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；
任选地，所述抗B7H6单链抗体具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求14所述的双抗，其特征在于，所述第一抗原结合区进一步包括第一Fc肽段，所述第一Fc肽段的N端与所述抗体或抗原结合片段的C端相连；
任选地，所述第二抗原结合区进一步包括第二Fc肽段，所述第二Fc肽段的N端与所述抗BCMA单链抗体或所述抗B7H6单链抗体的C端相连；
任选地，所述第一Fc肽段具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二Fc肽段具有SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
任选地，所述第一Fc肽段和所述第二Fc肽段通过knob-into-hole结构进行连接。
18.根据权利要求17所述的双抗，其特征在于，所述第一抗原结合区具有SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述第二抗原结合区具有SEQ ID NO:52或53所示的氨基酸序列。
19.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求14～18任一项所述的双抗。
20.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求19所述的核酸分子。
21.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体或能够表达权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求14所述的双抗。
22.根据权利要求21所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求14所述的表达载体导入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
任选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
23.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求14～18任一项所述的双抗、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体或权利要求21～22任一项所述的重组细胞。
24.一种药物，其特征在于，包括权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求14～18任一项所述的双抗、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体、权利要求21～22任一项所述的重组细胞或权利要求23所述的组合物。
25.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求14～18任一项所述的双抗、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体或权利要求21～22任一项所述的重组细胞。
26.权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体、权利要求21～22任一项所述的重组细胞或权利要求23所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD3介导的相关疾病；
任选地，所述CD3介导的相关疾病包括自身免疫性疾病；
任选地，所述自身免疫性疾病包括下列中的至少之一：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
27.权利要求14～18任一项所述的双抗、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体、权利要求21～22任一项所述的重组细胞或权利要求23所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病；
任选地，所述CD3和BCMA，或者CD3和B7H6介导的相关疾病包括癌症；
任选地，所述癌症包括下列中的至少之一：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
28.权利要求1～13任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体或权利要求21～22任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3。
29.权利要求14～18任一项所述的双抗、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的表达载体或权利要求21～22任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD3和/或BCMA，或者，CD3和/或B7H6。
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