CN115960231A - 抗cd138的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种抗CD138的抗体及其应用,该抗体包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列:重链可变区CDR序列:SEQ ID NO:1‑3,轻链可变区CDR序列:SEQIN NO:4‑6。本发明实施例的抗体能够与CD138进行结合,能够有效治疗和/或预防CD138介导的相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种抗CD138的抗体及应用。
背景技术
肿瘤学疾病是全球第二大常见的死亡原因。目前全球针对肿瘤抗原靶点的单克隆抗体已经上市了大约10种,例如利妥昔单抗(针对CD20靶点),曲妥珠单抗(针对HER2),贝伐珠单抗(针对VEGF)和西妥昔单抗(针对EGFR)。目前,针对CD138分子还没有上市药物。
CD138也被称为Syndecan-1,它通常表达于上皮细胞和白细胞。Syndecan家族总共有4个成员,这些蛋白都包含一个胞内的C端,跨膜区和胞外的N端,这些分子胞外拥有大量的多糖分支。CD138蛋白含有288个氨基酸,是syndecan家族第二长的蛋白。
在大多数肿瘤和其它上皮恶性肿瘤中,CD138的表达会表现出异常,例如在膀胱癌病人中有超过60%病理样本中显示CD138的表达上升。一些研究也表明在乳腺癌病人中CD138的高表达与病人的不良预后有关。此外,在一些卵巢癌病人肿瘤上皮和基质细胞中可以检测到CD138表达,但是在正常卵巢穿刺样本中不表达。CD138的表达与肿瘤细胞的侵入性生长和转移性倾向等功能有关。这些临床结果也说明了CD138可以很好地作为临床治疗的靶点。
当前,针对CD138的鼠源抗体或者嵌合抗体(如BB4)被用于临床研究,但是这些抗体由于免疫原性的问题,很容易被人体免疫系统识别而被清楚。同时,处于对非临床研究的需要,能与猴CD138结合也是抗体选择考量的因素。之前已知的发明中的抗体(BT062)无法与猴CD138结合,同时该抗体需要与毒素偶联来达到杀伤肿瘤细胞的作用。
因此,仍需继续研究,开发一种更加有效且安全性高的靶向CD138的抗体药物。
发明内容
本申请是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的:
CD138蛋白在多种肿瘤组织中上调表达,其表达与肿瘤细胞的侵入性生长和转移性倾向等功能有关。目前,针对CD138的鼠源抗体或者嵌合抗体(如BB4)被用于临床研究,但是这些抗体仍存在高免疫原性的问题,同时,由于对非临床研究的需要,能与猴CD138结合也是抗体选择考量的因素。
本申请的发明人成功地筛选到一种鼠源抗CD138单克隆抗体,该单克隆抗体与人或猴CD138蛋白具有较高的结合活性,此外,发明人对上述单克隆抗体的翻译后修饰(PTM)位点进行突变,并将突变后获得的鼠源抗体的恒定区进行人源化,保留鼠源抗CD138单克隆抗体的CDR,以获得嵌合抗体,更进一步地,将所述嵌合抗体的轻链可变区或重链可变区中的框架区进行人源化,得到抗CD138的完全人源化抗体,所述人源化抗体不仅能够特异性的靶向结合人CD138蛋白和猴CD138蛋白,而且具有免疫原性低的特点,能够有效治疗和/或预防CD138介导的相关疾病,如肿瘤。
因此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例,包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列:重链可变区CDR序列:DYTIH(SEQ ID NO:1),WFYPGSDNIKYNEKFKD(SEQ ID NO:2),HERGYSTPGDV(SEQ ID NO:3),轻链可变区CDR序列:RSX1QSLLHSNX2NTYLH(SEQ ID NO:4),RVSNRFS(SEQ IDNO:5),SQSSRIPWT(SEQ ID NO:6),其中,X1选自N或Q,X2选自G或A。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD138蛋白进行结合,有效治疗或预防CD138介导的相关疾病,且具有更高的安全性。
在本发明的第二方面,本发明提供了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子编码的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD138蛋白进行结合,有效治疗或预防CD138介导的相关疾病,且具有更高的安全性。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例,携带第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可以包括可选的控制序列,所述控制序列与所述核酸分子进行可操作地连接。其中,所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述抗体或抗原结合片段。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种制备第一方面所述的抗体或抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例,包括:将第三方面所述的表达载体引入到细胞中;将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养,以便获得所述抗体或抗原结合片段。根据本发明实施例所提出的方法可以有效体外大量获得所述抗体或抗原结合片段。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例,所述重组细胞携带第二方面所述的核酸,或第三方面所述的表达载体,或能够表达第一方面所述的抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例,所述重组细胞在合适条件下可高效并大量表达上述抗体或抗原结合片段。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种免疫缀合物。根据本发明的实施例,所述免疫缀合物包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段,和治疗剂。如前所述,本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效CD138蛋白进行结合,如肿瘤细胞表面的CD138蛋白,因此,包含所述抗体或抗原结合片段的免疫缀合物同样能够与人或猴的CD138蛋白进行结合,所述免疫缀合物具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例,包括前面所述的抗体、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述,本发明实施例的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含上述物质的组合物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例,所述药物包括前面所述的抗体核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物。如前所述,本发明实施例的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含上述物质的药物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种检测CD138的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒含有前面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述,本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含所述抗体或抗原结合片段的试剂盒能够有效的对CD138蛋白进行定性或定量检测。所述试剂盒可用于科学研究,如定性或定量检测生物样本中的VEGF和/或ANG-2,也可以用于对个体状态进行判断,如获得所述个体的VEGF和/或ANG-2水平后,判断其VEGF和/或ANG-2水平是否过高于或低于正常水平,所述生物样本可以为细胞、组织、尿液、粪便等。
在本发明的第十方面,本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或治疗CD138相关疾病。如前所述,本发明实施例的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含上述物质的药物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
在本发明的第十一方面,本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例,所述试剂盒用于检测CD138。如前所述,本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,所述抗体或抗原结合片段既能够表达获得所述抗体或抗原结合片段的物质可以用于制备检测人或猴CD138蛋白的试剂盒,所述试剂盒能够有效的对CD138蛋白进行定性或定量检测。所述试剂盒可用于科学研究,如定性或定量检测生物样本中的CD138,也可以用于对个体状态进行判断,如获得所述个体的CD138水平后,判断其CD138水平是否过高于或低于正常水平。
本发明的有益效果:
1)本发明获得的所述鼠源的抗CD138的单克隆抗体较现有CD138单克隆抗体具有更高的CD138蛋白结合活性,且所述CD138蛋白包括人CD138蛋白和猴CD138蛋白。
2)将所述鼠源抗CD138单克隆抗体进行PTM位点突变、人源化后获得的所述人源化抗体同样较较现有CD138单克隆抗体具有更高的CD138蛋白结合活性,所述CD138蛋白包括人CD138蛋白和猴CD138蛋白,且所述人源化抗体具有较低的免疫原性,安全性更高,效力更加持久。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1A为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体(47A11)结合人CD138蛋白的ELISA检测结果图;
图1B为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合食蟹猴CD138蛋白的ELISA检测结果图;
图2A为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合NCI-H929细胞的检测结果图;
图2B为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合PANC-1细胞的检测结果图;
图2C为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合MDA-MB-231细胞的检测结果图;
图2D为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合NCI-H929细胞的检测结果图;
图2E为根据本发明实施例的不同浓度的鼠源CD138抗体结合过表达食蟹猴CD138蛋白的食蟹猴CHO-K1细胞的检测结果图;
图3为根据本发明实施例的人源化CD138抗体(h47A11)结合人CD138蛋白和食蟹猴CD138蛋白的ELISA检测结果图;
图4为根据本发明实施例的人源化CD138抗体(h47A11)结合NCI-H929细胞的检测结果图;
图5为根据本发明实施例的人源化CD138(h47A11)对MM.1S细胞增殖抑制的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明所述的抗体或抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列,本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR,DNA人工合成等,具体的方法可参见J.萨姆布鲁克,《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式,可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
在本文中,术语“突变体”或“变体”可以指包含对任何天然存在的或工程化的分子进行包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变获得的分子。
术语“互补决定区”或“CDR”或“CDR序列”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸序列,例如,通常包括:轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近,和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991));和/或来自“高变环”(例如,轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3),和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
在本文中,术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时,采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比,例如参见,Ausubel等,编著(1995),Current Protocols inMolecular Biology,第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York);和ALIGN程序(Dayhoff(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法,包括,Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法;Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444的相似性搜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997);和BLASTP,BLASTN,和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或者WU-BLAST-2(Altschul等,Meth.Enzym.,266:460-480(1996));或者GAP,BESTFIT,BLAST Altschul等,上文,FASTA,和TFASTA,在Genetics Computing Group(GCG)包,8版,Madison,Wisconsin,USA中可获得;和Intelligenetics,Mountain View,California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95%的活性)的前提下,本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
如前所述,本发明的抗体可以是全长的(例如,IgG1或IgG4抗体)或可仅包含其功能性片段(例如,Fab、F(ab’)2或scFv片段),或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CD138抗体。在一些应用中,进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的,或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中,可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv,双抗体,线性抗体,单链抗体分子或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段,所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇,如聚乙二醇(“聚乙二醇化,PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇),所述片段具有CD138结合活性。优选地,所述功能性片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们,所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力,对于CD138,优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100,在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少3个氨基酸,优选其来源的抗体序列的5、10、15、25、50和100个连续氨基酸。
在本发明中,在未作相反说明的情况下,使用的术语“抗原结合片段”通常是指抗原结合性抗体片段,可以包括完整抗体的一部分,一般是抗原结合区或可变区,示例性的,如包括CDR移植抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv,双抗体,线性抗体,单链抗体分子等。
在本文中,术语“CDR移植抗体”是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如,可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区,以便替代人源抗体CDR,使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性,同时减少其异源性。
在本文中,术语“Fab抗体”通常是指仅含Fab分子的抗体,其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成,轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中,术语“单域抗体”(纳米抗体或VHH抗体),其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”;Nature 363,446-448(1993)),只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区,其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中,术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体,是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种抗体或抗原结合片段,包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列:重链可变区CDR序列:DYTIH(SEQ ID NO:1),WFYPGSDNIKYNEKFKD(SEQ ID NO:2),HERGYSTPGDV(SEQ ID NO:3),轻链可变区CDR序列:RSX1QSLLHSNX2NTYLH(SEQ ID NO:4),RVSNRFS(SEQ ID NO:5),SQSSRIPWT(SEQID NO:6),其中,X1选自N或Q,X2选自G或A。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD138蛋白进行结合,有效治疗或预防CD138介导的相关疾病,且具有更高的安全性。
根据本发明的一些具体实施例,上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,包括:分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列;和/或分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与4、5和6具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的一些具体实施例,包括:如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,SEQ IDNO:4所示的轻链可变区CDR1,SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
根据本发明的一些具体实施例,包括:如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,如SEQID NO:7所示的轻链可变区CDR1,SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
根据本发明的一些具体实施例,包括:如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,如SEQID NO:8所示的轻链可变区CDR1,SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
根据本发明的一些具体实施例,包括:重链FR区和轻链FR区中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述重链FR区和轻链FR区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,包括下列中的至少之一:分别如SEQ ID NO:9-12所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:17-20所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:13-16所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一;和分别如SEQ ID NO:21-24所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,包括:分别如SEQ ID NO:9-12所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:13-16所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一;或者分别如SEQ ID NO:17-20所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:21-24所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,包括:如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27所示的重链可变区;和/或如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:2843所示的轻链可变区。
根据本发明的一些具体实施例,包括:1)如SEQ ID NO:25所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:26或43所示的轻链可变区;或2)如SEQ ID NO:27所示的重链可变区,和如SEQID NO:28所示的轻链可变区。
根据本发明的一些具体实施例,所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例,所述抗体具有如SEQ ID NO:29或31所示氨基酸序列的重链恒定区和/或如SEQ ID NO:30或32所示氨基酸序列的轻链恒定区。
根据本发明的一些具体实施例,具有SEQ ID NO:33和35任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:34、36和44任一项所示氨基酸序列的轻链。根据本发明的一些具体实施例,未进行PTM位点突变的鼠源抗CD138抗体由SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链组成,具有PTM位点突变的鼠源抗CD138抗体由SEQ IDNO:33所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链组成,人源化抗CD138抗体中具有所述PTM位点突变,所述人源化抗CD138抗体由SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链组成。
根据本发明的一些具体实施例,所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、多抗、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:37或38所示的氨基酸序列。
编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸在本发明的范围内,根据重链和/或轻链的氨基酸序列,本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列。
因此,在本发明的另一方面,本发明提供了一种核酸分子,所述核酸分子编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段。根据本发明一些具体实施方式中的核酸分子编码的抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD138蛋白进行结合,有效治疗或预防CD138介导的相关疾病,且具有更高的安全性。
根据本发明的一些具体实施方式,上述核酸分子还可以包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施方式,所述核酸分子为DNA。
根据本发明的一些具体实施方式,所述核酸分子具有如SEQ ID NO:39、40和45-46任一项所示核苷酸序列。根据本发明的一些具体实施例,编码未发生PTM位点突变的鼠源CD138抗体的核苷酸序列由SEQ ID NO:46所示的编码其重链的核苷酸序列和SEQ ID NO:47所示的编码其轻链的核苷酸序列组成,编码发生PTM位点突变的鼠源CD138抗体的核苷酸序列由SEQ ID NO:46所示的编码其重链的核苷酸序列和SEQ ID NO:45所示的编码其轻链的核苷酸序列组成,编码人源化的CD138抗体的核苷酸序列由SEQ ID NO:39所示的编码其重链的核苷酸序列和SEQ ID NO:40所示的编码其轻链的核苷酸序列组成。
需要说明的是,对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种表达载体,所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列,所述控制序列与所述核酸分子进行可操作地连接。其中,所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述抗体或抗原结合片段。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上,使得载体内的控制元件,例如转录控制序列和翻译控制序列等等,能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。在将上述核酸分子连接到载体上时,可以将核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连,只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身,也可以是外源性的,即并非来自于载体本身。本领域技术人员可以理解,用来编码抗体或抗原结合片段的核酸分子,可以分别独立的插入到不同的载体上,常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种制备前面所述的抗体或抗原结合片段的方法,包括:将前面所述的表达载体引入到细胞中;将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养,以便获得所述抗体或抗原结合片段。根据本发明一些具体实施方式所提出的方法可以有效体外大量获得所述抗体或抗原结合片段。
根据本发明的一些具体实施方式,上述制备前面所述的抗体或抗原结合片段的方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施方式,所述细胞不受特别限制,原核细胞或真核细胞均可使用。
根据本发明的一些具体实施方式,所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施方式,所述真核细胞为哺乳动物细胞。根据本发明的一些具体实施例,所当所述细胞为真核细胞,如哺乳动物细胞时所述重组抗体的表达效率较高。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种重组细胞,所述重组细胞前面所述的核酸,或表达载体,或能够表达前面所述的抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施方式,所述重组细胞在合适条件下可高效并大量表达上述抗体或抗原结合片段。
需要注意的是,本发明所述重组细胞不受特别限制,可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌,草地粘虫等昆虫细胞,烟草等植物细胞,BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中,本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞,包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞,且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是,本申请说明书中所述的“适合条件”,是指适合本申请所述抗体或抗原结合片段表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合抗体或抗原结合片段表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化最适的所述抗体或抗原结合片段表达的条件。
在本发明的再一方面,本发明提出了一种免疫缀合物,包括前面所述的抗体或抗原结合片段,和治疗剂。如前所述,本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效CD138蛋白进行结合,并阻断CD138蛋白与其受体进行结合,因此,包含所述抗体或抗原结合片段的免疫缀合物同样能够与人或猴的CD138蛋白进行结合,所述免疫缀合物具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种组合物,包括前面所述的抗体、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述,本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,并有效抑制肿瘤细胞的增殖,因此,包含上述物质的组合物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果,所述组合物的种类不受特别限制,可以为食品组合物或药物组合物。
本发明的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合给药,例如,与化疗剂组合给药。因此,所述组合物还可以含有化疗剂。本发明的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物还可以与第二治疗剂组合,所述第二治疗剂的示例性试剂包括但不限于抑制CD138活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰CD138上游或下游信号转导的试剂。
需要注意的是,所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合,只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如,所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者,或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时,各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种药物,包括前面所述的抗体核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物。如前所述,本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含有效量的所述抗体活性成分或其一系列物质的药物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
根据本发明的一些具体实施方式,上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施方式,所述药物还可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的抗体或抗原结合片段的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,其中,给药的方式可以为口服给药、经鼻给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药或静脉给药或腹腔内给药,本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。所述抗体或抗原结合片段可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然,本文中的抗CD138抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种检测CD138的试剂盒,所述试剂盒含有前面所述抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体或重组细胞。如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含所述抗体或抗原结合片段的试剂盒能够有效的对人或猴的CD138蛋白进行定性或定量检测。应用本发明提供的试剂盒,例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用人或猴CD138和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种:拮抗剂、抗CD138抗体或者药物参照材料;蛋白纯化柱;免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂;细胞的测定稀释剂;说明书或者文献等。抗CD138抗体可被用于不同类型的诊断测试,例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测,用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括CD138相关疾病,例如癌症,其中,所述癌症包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。当然本文提供的抗体或抗原结合片段也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。
所述试剂盒还可以包括常规用于检测CD138的试剂,如包被液等。
在本发明的另一方面,本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或治疗CD138相关疾病。如前所述,本发明一些具体实施方式的所述抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,包含上述物质的药物同样可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,具有良好的预防和/或治疗CD138介导的疾病的效果。
根据本发明的一些具体实施方式,上述制备药物的用途还可以包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施方式,所述CD138相关疾病为癌症。
根据本发明的一些具体实施方式,所述癌症包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
在本发明的再一个方面,本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段、核酸分子、表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测CD138。如前所述,本发明一些具体实施方式的抗体或抗原结合片段能够有效与人或猴CD138蛋白进行结合,并阻断所述CD138蛋白与其受体进行结合,因此,所述抗体或抗原结合片段可以用于制备检测CD138蛋白的试剂盒,所述试剂盒能够有效的对人或猴的CD138蛋白进行定性或定量检测。
本发明还涉及一种预防和/或治疗CD138相关疾病的方法,该方法包括向受试者施用有效量下列中的至少之一:前面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、免疫缀合物、组合物和药物。如前所述,所述抗体或抗原结合片段能够有效的与人或猴的CD138蛋白进行结合,并有效抑制肿瘤细胞的增殖,因此,根据本发明实施例的方法能够有效的预防和/或治疗CD138介导的相关疾病。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种诊断CD138相关疾病的方法。根据本发明的实施例,包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD138进行检测:1)前面所述的抗体或抗原结合片段;2)前面所述的核酸分子;3)前面所述的表达载体;和4)前面所述的重组细胞,基于所述CD138的检测结果,确定所述待测样品中CD138的含量。本申请提出的所述抗体或抗原结合片段,或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD138的含量,并对CD138引起的相关疾病进行有效诊断。
根据本发明的一些具体实施例,上述诊断CD138相关疾病的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述待测样品中CD138的含量不低于患病的最低标准是待测样品来源于患有CD138引起的相关疾病的患者的指示。所述最低标准的值可以通过对大量所述患有CD138引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的CD138的含量的差异比较分析、以及验证,而确定下来。
根据本发明的一些具体实施例,所述待测样品包括下列中的至少之一:血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的一些具体实施例,所述血管生成引起的相关疾病包括肿瘤。
根据本发明的一些具体实施例,所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种评估CD138相关疾病分期的方法。根据本发明的实施例,包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD138进行检测:1)前面所述的抗体或抗原结合片段;2)前面所述的核酸分子;3)前面所述的表达载体;和4)前面所述的重组细胞,基于所述CD138的检测结果,确定所述待测样品中CD138的含量。本申请提出的所述抗体或抗原结合片段,或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD138蛋白进行结合,因此,采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD138含量,并基于所述CD138含量对CD138引起的血管生成相关疾病所处的时期进行评估。
根据本发明的实施例,上述评估CD138相关疾病分期的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品中CD138的含量不低于肿瘤IV期患病的最低水平是待测样品来源于患有肿瘤IV期的患者的指示,所述待测样品中CD138的含量位于肿瘤IV期和III期患病的水平之间是待测样品来源于患有肿瘤III期的患者的指示;所述待测样品中CD138的含量处于肿瘤III期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤II期的患者的指示;所述待测样品中CD138的含量处于I期和II期患病的标准水平之间是待测样品来源于患有肿瘤I期的患者的指示。本领域技术人员可以理解,所述的肿瘤I期、II期、III期、IV期患病时CD138的水平根据肿瘤种类的不同而变化,判断肿瘤所述时期,只要将所述待测样品中CD138的含量与该肿瘤阶段CD138的标准水平进行对比即可知晓,或将所述待测样品中CD138的含量与已知患病个体或群体来源的样品CD138的含量进行对比。所述各个阶段的最低水平的值可以通过对大量所述患有CD138引起的相关疾病的个体和大量健康个体的待测样本中的CD138的含量的差异比较分析、以及验证,而确定下来。
根据本发明的实施例,所述待测样品包括下列中的至少之一:血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的实施例,所述CD138相关疾病包括肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
在本发明的再一方面,本发明提出了一种评估CD138相关疾病预后的方法。根据本发明的实施例,包括使用下列中的至少之一对待测样品中的CD138进行检测:1)前面所述的抗体或抗原结合片段;2)前面所述的核酸分子;3)前面所述的表达载体;和4)前面所述的重组细胞,基于所述CD138的检测结果,确定所述待测样品中CD138的含量。如前所述,CD138蛋白在多种肿瘤组织中表达上调,对肿瘤的侵入性生长和转移性倾向具有重要影响,患有CD138蛋白介导的相关疾病的个体进行治疗后,通过监测其组织或排泄物,如外周血、尿液等中的CD138的含量可以有效评估该类疾病的预后,例如,将治疗前后的受试者体内CD138的含量进行比较,或将治疗后的受试者体内CD138的含量与正常个体或患病个体的CD138水平进行比较等方式,本申请提出的所述抗体或抗原结合片段,或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与CD138进行结合,因此,采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD138的含量,并基于所述CD138的含量对CD138引起的相关疾病的预后进行评估。
根据本发明的实施例,上述评估CD138相关疾病预后的方法还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品来源于治疗前或治疗后的患有CD138相关疾病的患者。
根据本发明的实施例,基于所述治疗前或治疗后的患有CD138相关疾病的患者的待测样品中的CD138的含量,确定CD138相关疾病的预后效果。
根据本发明的实施例,治疗后的患有CD138相关疾病的患者的待测样品中的CD138的含量下降是患者预后良好的指示。
根据本发明的实施例,所述待测样品包括下列中的至少之一:血液、组织、细胞、粪便和尿液。
根据本发明的实施例,所述CD138相关疾病包括肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
在本发明的一个方面,本发明提出了本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段,核酸分子,表达载体、重组细胞,组合物或药物在治疗或预防CD138相关疾病中的用途。如前所述,所述抗体或抗原结合片段能够与人或猴CD138蛋白进行有效结合,能够有效治疗或预防CD138介导的相关疾病。
根据本发明的实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述CD138相关疾病包括肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
在本发明的再一方面,本发明提出了本发明提出了前面所述的抗体或抗原结合片段,核酸分子,表达载体或重组细胞在诊断CD138相关疾病、评估CD138相关疾病分期或评估CD138相关疾病预后中的用途。如前所述,本申请提出的所述抗体或抗原结合片段,或核酸分子、表达载体、重组细胞表达的抗体或抗原结合片段均可以有效与人或猴CD138进行结合,因此,采用本申请所述的方法可以有效检测来源于受试个体的待测样品中CD138的含量,并可以对CD138引起的相关疾病进行有效诊断、疾病分期和疾病预后评估。
根据本发明的实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述CD138相关疾病包括肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
本发明中涉及的“受试者”或“个体”一般指哺乳动物,如灵长类动物和/或啮齿类动物,特别是人、猴或鼠。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1:
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例或测试例中,未注明具体条件的实验方法的,均按照常规条件进行。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建过表达人和食蟹猴CD138的CHO-K1细胞
在T150培养瓶内将HEK293T细胞铺板,用DMEM完全培养基培养。培养过夜后,取无内毒素的psPAX2,pMD2.G和pCDH-CMV-syndecan-1-IRES-puro(pCDH-CMV-MCS-IRES-puro载体多克隆位点之间插入有人CD138蛋白的编码序列(SEQ ID NO:41))或者食蟹猴蛋白的编码序列(SEQ ID NO:42)载体按照7:3:10的比例加入到1.5mL Opti-MEM(Gibco,货号31985070)培养基中,再加入100μLP3000转染试剂。取100μL Lipofectamine 3000(thermo,货号L3000008)转染试剂加入到1.5mL Opti-MEM培养基中,充分混匀。将DNA稀释液和脂质体稀释液按体积比1:1混匀,室温孵育5-10min后加入到293T细胞中,培养48小时后收获病毒上清。将病毒上清于4℃,2000g离心10min,取上清,用0.45μm滤器过滤后加入PEG8000溶液(上海生工),充分混匀,4℃放置过夜。然后,于2200g离心90min,离心管底部有白色沉淀,用无菌PBS缓冲液重悬病毒。
向DME/F12培养基中加入polybrene(sigma,TR-1003)(终浓度8μg/mL),混匀后再加入适量病毒溶液。取2E5个CHO-K1细胞于24孔板中,加入带有病毒的培养基,放入培养箱8小时后更换新鲜培养。培养48小时后通过流式细胞仪检测CHO-K1细胞表面的CD138表达水平,出现阳性群细胞后再进行有限稀释,即把细胞消化后稀释密度为每毫升4个细胞,再接种于96孔平底板中,每孔加入200μL,培养2周待细胞明显成为单个细胞团后,再通过流式细胞术检测每个克隆细胞表面CD138的表达水平,全阳性细胞即为满足需要的过表达人CD138蛋白(SEQ ID NO:37)或者食蟹猴CD138蛋白(SEQ ID NO:38)的CHO-K1细胞。
实施例2抗人CD138杂交瘤单克隆抗体的制备
本发明中,抗人CD138单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用C57BL/6小鼠,雌性,6周龄(江苏集萃药康生物科技有限公司),免疫抗原为实施例1获得的过表达人CD138的CHO-K1细胞,每只小鼠免疫细胞数为5E6。细胞用丝裂霉素预先处理4小时后腹腔注射到小鼠体内,首免后每两周免疫一次,共免疫5次。取免疫后的小鼠血清进行抗体滴度ELISA检测,其操作方法为本领域常规方法。
根据抗体滴度的检测结果,选择血清中抗体滴度高小鼠进行脾细胞融合,融合前72小时冲刺免疫所选小鼠,每只小鼠冲刺免疫细胞个数为5E6个细胞,腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(ATCC,CRL-8287)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬,分装于96孔细胞培养板中,于37℃、5%CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基,50μL/孔。融合后第7天~8天,根据细胞生长密度,全换液,培养基为HT完全培养基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基),200μL/孔。
融合后第10-11天,根据细胞生长密度,进行流式细胞术结合检测。阳性孔换液,并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选为阳性的进行保种,并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性的进行保种和蛋白表达。其中,亚克隆和保种操作均为本领域常规技术操作,通过无血清细胞培养法进一步制备抗体,通过protein G亲和层析纯化鼠源抗体,用于后续功能活性检测。
实施例3鼠源CD138抗体ELISA结合实验
ELISA实验用于检测鼠源CD138抗体47A11的结合特性。将人CD138蛋白(ACRObiosystems,SY1-H5225)或食蟹猴CD138蛋白(义翘神州,90938-C02H)分别用包被缓冲液(35mM NaHCO3,15mM Na2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL,向酶联板中每孔加入100μL,4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05%Tween 20-PBS,pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1%BSA,0.05%Tween20-PBS,pH7.2),室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入鼠源抗体47A11或者对照抗体BT062(WO2009080832)、鼠IgG抗体(购自biolegend,货号400153),室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-羊抗鼠IgG二抗(boster,货号BA1051),室温孵育1小时。用PBST清洗3遍,每孔加入TMB,室温避光反应2-5分钟,每孔再用2M硫酸终止反应,最后用酶标仪读取OD450数值。其中,图1A表明本发明的鼠源47A11抗体可以结合人CD138,图1B表明本发明的鼠源47A11抗体也可以结合食蟹猴CD138。
实施例4鼠源CD138抗体流式细胞术结合实验
用PBS将多发性骨髓瘤NCI-H929细胞,胰腺癌PANC-1细胞,乳腺癌MDA-MB-231细胞,肺癌NCI-H292细胞(购买自上海细胞库)或者实施例1获得的过表达食蟹猴CD138的CHO-K1细胞稀释为2×106个/mL,以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中,向其中加入10μL/管山羊血清,于4℃封闭30min。加入实施例2获得的梯度浓度的CD138抗体,于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS,于4℃,3500rpm×5min离心,弃尽上清,再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清,用100μL/管PBS重悬细胞,向其中加入0.1μL/管Alexa 647标记的山羊抗小鼠抗体二抗(Invitrogen),4℃避光孵育30min。孵育结束后,用PBS洗两遍,离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测,其中,以BT062抗体为对照抗体。图2A、2B、2C、2D、2E的实验结果表明鼠源47A11抗体可以结合多发性骨髓瘤NCI-H929细胞,胰腺癌PANC-1细胞,乳腺癌MDA-MB-231细胞,肺癌NCI-H292细胞和过表达食蟹猴CD138的CHO-K1细胞,说明鼠源CD138抗体可以结合细胞表面的CD138蛋白。
实施例5杂交瘤测序
通过实施例3和实施例4结合实验筛选到的47A11抗体杂交瘤,将候选杂交瘤细胞总数量培养到106个,于800rpm离心10分钟收集细胞,并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA;以总RNA为模板,逆转录合成cDNA文库(Invitrogen),又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(Larrick,J.W.,et al.,(1990)Scand.J.Immunol.,32,121 128和Coloma,J.J.et al.,(1991)BioTechniques,11,152 156)。其中,PCR扩增反应在50μL反应体系中进行,分别加入上述cDNA 2μL,10×PCR缓冲液5μL,上游及下游引物2μL(5μM),dNTP 2μL,Taq酶1μL(Takara,Ex Taq),H2O 38μL;于95℃预变性5min,进入温度循环,进行PCR扩增。反应条件为:94℃变性30S,58℃退火45S,72℃延伸50S,共32个循环,然后72℃延长7min。将扩增产物测序后,得到鼠单抗的重链可变区(氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)和轻链可变区序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示)。
实施例6抗人CD138抗体翻译后修饰(PTM)位点突变
抗体的翻译后修饰(PTM)指在真核细胞抗体表达过程中,一些特定的氨基酸经过修饰,这些修饰对于抗体的功能及表征方面可能起着重要的作用。在抗体的生产过程中,不同的理化因素产生各种翻译后修饰变异体,如糖基化、氧化、脱酰胺、异构化等,这些PTM可能引起抗体理化性质变化,还可能降低抗体稳定性、引起免疫原性等。发明人分析了鼠源抗体47A11的CDR序列,发现轻链CDR1序列(SEQ ID NO:7的CDR1)存在糖基化和脱酰胺位点。因此发明人设计了轻链CDR1突变序列(SEQ ID NO:8),突变后的轻链可变区序列为SEQ IDNO:43。
发明人构建了携带有编码鼠源抗人CD138抗体PTM突变的轻链可变区和人IgG1轻链恒定区的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:44),和编码含有重链可变区和IgG1重链恒定区的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)的pTT5载体,和携带有编码鼠源的未发生PTM突变的抗人CD138抗体的轻链可变区和人IgG1轻链恒定区的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:47),和编码含有重链可变区和IgG1重链恒定区的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)的pTT5载体,用上述pTT5载体瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco,货号A29127)来制备结合CD138蛋白的PTM突变嵌合抗体和原始嵌合抗体。转染前一天,将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3~4)×106/mL,于37℃,8%CO2,120rpm摇动培养过夜。转染当天,细胞生长到7×106–1×107个/mL,活率大于95%时准备转染,使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco,货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL,再取上述两种含有抗人CD138抗体的轻链和重链的质粒分别以摩尔数比2:1利用ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco,货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中,于37℃,8%CO2,120rpm摇动培养。转染后18-22h,将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHOFeed混匀后立即加入转染后细胞中,混匀,于32℃,5%CO2,120rpm摇动培养。转染后第5天,向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed,混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化,待细胞活率下降至80%以下或培养10-14天后离心收获细胞。
将上述离心收获细胞后的表达上清用0.22μm滤膜过滤,利用Mabselect prism A亲和层析柱(GE公司,货号17549854)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体,用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后,上清过亲和层析柱,用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸,pH2.7)洗脱,最后用PBS缓冲液浓缩置换,纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95%以上。
用BIACORE测试原始的47A11嵌合抗体和PTM突变后的47A11嵌合抗体与人CD138抗原的亲和力,结果如表2所示,说明PTM位点突变不影响47A11嵌合抗体与人CD138抗原结合。
表2:
实施例7抗人CD138单克隆抗体的人源化
在实施例5获得的嵌合抗体的基础上,通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件,分别挑选与鼠源抗体47A11同源性高的重链或轻链可变区种系基因作为模板,将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中,形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
为了保持CDR区构象,对于VL和VH结合界面上的残基,靠近CDR并且包埋于蛋白内部的残基,与CDR有直接相互作用的残基进行回复突变,以保证可变区的活性不会受影响。
人源化CD138抗体47A11的重链可变区序列如SEQ ID NO:27,轻链可变区序列如SEQ ID NO:28。将带有编码人源化抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:39)和编码人源化抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:40)通过分子生物学技术分别重组到pTT5质粒上,通过实施例5所示的蛋白表达和纯化方案进行人源化47A11的生产和纯化,最终获得了人源化47A11抗体(SEQ ID NO:35和36)。
用BIACORE测试人源化47A11抗体与人CD138抗原的亲和力,得到的结果如表3所示,获得的人源化抗体与CD138抗原具有较好的亲和力。
表3:
抗体 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
人源化h47A11 | 2.30E+06 | 1.58E-04 | 6.87E-10 |
实施例8人源化CD138抗体ELISA结合实验
ELISA实验用于检测人源化CD138抗体47A11的结合特性。将人CD138蛋白(ACRObiosystems,SY1-H5225)或食蟹猴CD138蛋白(义翘神州,90938-C02H)用包被缓冲液(35mMNaHCO3,15mM Na2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL,向酶联板中每孔加入100μL,4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05%Tween 20-PBS,pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1%BSA,0.05%Tween20-PBS,pH 7.2),室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入梯度浓度的人源化抗人CD138抗体47A11,室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-山羊抗人IgG(Fab特异性)二抗(Sigma,A0293),室温孵育1小时。用PBST清洗3遍,每孔加入TMB,室温避光反应2-5分钟,每孔再用2M硫酸终止反应,最后用酶标仪读取OD450数值。图3结果表明本发明的人源化47A11抗体可以结合人和猴的CD138抗原。
实施例9人源化CD138抗体流式细胞术结合实验
用PBS将多发性骨髓瘤NCI-H929细胞稀释为2×106/mL,以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中,向其中加入10μL/管小鼠血清,于4℃封闭30min。加入梯度浓度的人源化CD138抗体47A11,于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS,于4℃,3500rpm×5min离心,弃尽上清,再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清,用100μL/管PBS重悬细胞,向其中加入0.1μL/管Alexa 647标记的小鼠抗人IgG Fc抗体二抗(biolegend),于4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍,离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。图4结果表明人源化47A11抗体可以结合多发性骨髓瘤NCI-H929细胞。
实施例10人源化抗人CD138抗体抑制肿瘤细胞增殖
用培养基将多发性骨髓瘤MM.1S细胞稀释为1×105/mL,向96孔板内每孔加入100μL稀释后的多发性骨髓瘤MM.1S细胞。加入实施例6获得的梯度浓度的人源化抗人CD138抗体,于37℃,5%CO2孵育72小时。再加入总细胞检测试剂(promega,G9290),用多功能酶标仪读取荧光值,并计算相对细胞数。实验结果如图5所示,表明所述人源化的抗人CD138抗体可以有效抑制肿瘤细胞增殖。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (23)
1.一种抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列:
重链可变区CDR序列:
DYTIH(SEQ ID NO:1),
WFYPGSDNIKYNEKFKD(SEQ ID NO:2),
HERGYSTPGDV(SEQ ID NO:3),
轻链可变区CDR序列:
RSX1QSLLHSNX2NTYLH(SEQ ID NO:4),
RVSNRFS(SEQ ID NO:5),
SQSSRIPWT(SEQ ID NO:6),
其中,X1选自N或Q,X2选自G或A。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括:
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列;和/或
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与4、5和6具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括:
如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1,SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括:
如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区CDR1,SEQ IDNO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
5.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括:
如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列,如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3,如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区CDR1,SEQ IDNO:5所示的轻链可变区CDR2,SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3。
6.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括:重链FR区和轻链FR区中的至少之一;
任选地,所述重链FR区和轻链FR区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包括下列中的至少之一:
分别如SEQ ID NO:9-12所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;
分别如SEQ ID NO:17-20所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;
分别如SEQ ID NO:13-16所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一;和
分别如SEQ ID NO:21-24所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括:分别如SEQ IDNO:9-12所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:13-16所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一;或者
分别如SEQ ID NO:17-20所示的重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4序列中的至少之一;分别如SEQ ID NO:21-24所示的轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列中的至少之一。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括:
如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27所示的重链可变区;和/或
如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或43所示的轻链可变区。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括:
1)如SEQ ID NO:25所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:26或43所示的轻链可变区;或
2)如SEQ ID NO:27所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:28所示的轻链可变区。
11.根据权利要求1-10任一项所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
任选地,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体;
任选地,所述抗体具有如SEQ ID NO:29或31所示氨基酸序列的重链恒定区和/或如SEQID NO:30或32所示氨基酸序列的轻链恒定区。
12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,具有SEQ ID NO:33和35任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:34、36和44任一项所示氨基酸序列的轻链。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、多抗、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:37或38所示的氨基酸序列。
15.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1~14任一项所述的抗体或抗原结合片段。
16.一种表达载体,其特征在于,携带权利要求15所述的核酸分子。
17.一种重组细胞,其特征在于,携带权利要求15所述的核酸分子、权利要求16所述的表达载体或能够表达权利要求1-14任一项所述的抗体或抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞是通过将权利要求14所述的表达载体导入至宿主细胞中而获得的;
任选地,所述重组细胞为真核细胞;
任选地,所述重组细胞为哺乳动物细胞。
19.一种组合物,其特征在于,包括权利要求1~14任一项所述的抗体、权利要求15所述的核酸分子、权利要求16所述的表达载体或权利要求17-18任一项所述的重组细胞。
20.一种药物,其特征在于,包括权利要求1-14任一项所述的抗体、权利要求15所述的核酸分子、权利要求16所述的表达载体、权利要求17-18任一项所述的重组细胞或权利要求19所述的组合物。
21.一种检测CD138的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有权利要求1-14中任一项所述抗体或其抗原结合片段、权利要求15所述的核酸分子、权利要求16所述的表达载体或权利要求17-18任一项所述的重组细胞。
22.权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求15所述的核酸分子,权利要求16所述的表达载体,权利要求17-18任一项所述的重组细胞或权利要求19所述的组合物在制备药物中的用途,所述药物用于预防和/或治疗CD138相关疾病;
任选地,所述CD138相关疾病为癌症;
任选地,所述癌症包括多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中的至少一种。
23.权利要求1-14任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测CD138。
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