CN114057876A - Cd47抗体及其应用 - Google Patents

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CN114057876A CN202110868387.2A CN202110868387A CN114057876A CN 114057876 A CN114057876 A CN 114057876A CN 202110868387 A CN202110868387 A CN 202110868387A CN 114057876 A CN114057876 A CN 114057876A
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Abstract

本发明涉及CD47抗体及其应用，特别涉及识别CD47的单克隆抗体，更具体地涉及不引起显著水平的血红细胞凝集、血红细胞减少及血小板减少的CD47抗体，涉及制备这些抗体的方法以及使用这些单克隆抗体在制备治疗癌症或感染的药物中的应用。

Description

CD47抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种全人源抗CD47的IgG抗体、更具体地涉及不引起显著的人血红细胞血凝反应、血红蛋白减少、贫血和/或血小板减少的CD47抗体、制备这些抗体的方法以及使用这些单克隆抗体在制备药物中的应用。
背景技术
CD47，又称整合素相关蛋白(Integrin-associated protein,IAP)，是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族(Johansen and Brown,J.Biol.Chem.2007)。CD47与其配体信号调节蛋白α(Signal regulatory proteina,SIRPα)相结合从而抑制巨噬细胞的吞噬作用(MatozakiT,et al.,Trends Cell Biol.2009)。已有研究证实，CD47在许多恶性肿瘤中，如急性髓细胞性白血病(AML)、B细胞和T细胞急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等，均呈过表达状态，向巨噬细胞传递“别吃我”(“Don’t eat me”)的信号，借以逃避免疫监视，且CD47高表达与临床预后差有关(Willingham et al.Proc NatlAcad Sci USA.2012)。
美国专利申请2009/0191202披露了斯坦福大学的Weissman教授团队通过对原位免疫缺陷性小鼠异种移植动物模型的实验发现，抗CD47单克隆抗体的施用能够抑制大型肿瘤的生长和转移，而对于小型肿瘤则可以治愈。美国专利申请2016/0251435披露了抗CD47单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用。专利申请WO2013056352描述了人源化的抗人SIRPα的全长单克隆抗体及其衍生的抗体片段用于血液性肿瘤，尤其是白血病的治疗。阻断CD47-SIRPα信号通路可促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，为肿瘤免疫治疗提供新的手段。
发明内容
本发明提供了识别并结合CD47的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体能够识别并结合人CD47。本发明的抗体能够阻止CD47与SIRPα相互作用，并且不会导致血红细胞出现显著的血凝反应。本发明所提供的抗体统称为“CD47抗体”。
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体表现出多种需要的特性，如通过非限制性实施例的方案特异性识别人或猕猴CD47，有效的阻断CD47与其配体SIRPα的相互作用，同时不导致显著的红细胞血凝反应，以及具有有效的抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人整合素相关蛋白(CD47)并且包含1、2、3、4、5或6个如下所述VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
(a)VH CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14的变体，其在SEQ ID NO:14序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(b)VH CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:17的变体，其在SEQ ID NO:17序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(c)VH CDR3包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:23的变体，其在SEQ ID NO:23序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(d)VL CDR1包含如SEQ ID NO:30-31所示的任一氨基酸序列；
(e)VL CDR2包含如SEQ ID NO:32-33所示的任一氨基酸序列；和
(f)VL CDR3包含如SEQ ID NO:34-35所示的任一氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人整合素相关蛋白(CD47)并且包含1、2、3、4、5或6个如下所述VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
(a)VH CDR1包含如SEQ ID NO:14-16所示的任一氨基酸序列；
(b)VH CDR2包含如SEQ ID NO:17-22所示的任一氨基酸序列；
(c)VH CDR3包含如SEQ ID NO:23-29所示的任一氨基酸序列；
(d)VL CDR1包含如SEQ ID NO:30-31所示的任一氨基酸序列；
(e)VL CDR2包含如SEQ ID NO:32-33所示的任一氨基酸序列；和
(f)VL CDR3包含如SEQ ID NO:34-35所示的任一氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人整合素相关蛋白(CD47)并且包含1、2、3、4、5或6个如下序列：
(a)如SEQ ID NO:14所示的VH CDR1，或SEQ ID NO:14的变体，其在SEQ ID NO:14序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(b)如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2，或SEQ ID NO:17的变体，其在SEQ IDNO:17序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(c)如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3，或SEQ ID NO:23的变体，其在SEQ ID NO:23序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(d)如SEQ ID NO:30-31所示的任一VL CDR1；
(e)如SEQ ID NO:32-33所示的任一VL CDR2；或
(f)如SEQ ID NO:34-35所示的任一VL CDR3。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人整合素相关蛋白(CD47)并且包含：
(a)如SEQ ID NO:14-16所示的任一VH CDR1；
(b)如SEQ ID NO:17-22所示的任一VH CDR2；
(c)如SEQ ID NO:23-29所示的任一VH CDR3；
(d)如SEQ ID NO:30-31所示的任一VL CDR1；
(e)如SEQ ID NO:32-33所示的任一VL CDR2；或
(f)如SEQ ID NO:34-35所示的任一VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自SEQ ID NO:11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区VL，所述VL包含选自SEQ ID NO:12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人整合素相关蛋白(CD47)并且包含如SEQ ID NO:14所示的VH CDR1，如SEQID NO:17所示的VH CDR2，如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3，如SEQ ID NO:30所示的VLCDR1，如SEQ ID NO:32所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自以下组中一个或多个根据Kabat编号的氨基酸残基突变：
(a)R81K，和
(b)R82aS。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自SEQ ID NO:11和50中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11和50中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区VL，所述VL包含选自SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:11或50所示的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:13或65所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文CD47抗体特异性识别结合人或猕猴CD47，所述抗体包含选自SEQ ID NO:11、36-44、50中任一的氨基酸序列的重链可变区和/或选自SEQ ID NO:12、13、45-49、51-55、65中任一的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链H和轻链L；所述重链H包含选自SEQ ID NO:60和62-63中任一的氨基酸序列，所述轻链L包含选自SEQ ID NO:61和64中任一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与不存在CD47抗体时，CD47与SIRPα之间的相互作用水平相比，本发明的CD47抗体阻断了CD47与SIRPα之间至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％或至少99％的相互作用。
在一些实施方案中，所述抗体包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区包含选自SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含选自SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
IgG1重链恒定区序列(SEQ ID NO:3)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG4重链恒定区序列(SEQ ID NO:4)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
轻链恒定区序列(SEQ ID NO:5)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体不会导致显著的细胞凝集，例如本发明的CD47抗体不会导致显著的血红细胞血凝反应。在一些实施方案中，如果与现有CD47抗体Hu5F9-G4存在时的凝集水平相比，本发明的CD47抗体存在时的凝集水平下降了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％，则说明本发明的CD47抗体未导致显著的凝集水平。在一些实施方案中，在抗体浓度介于400pM和800nM之间时，本发明的CD47抗体不会导致显著的细胞凝集。
在一些实施方案中，与本领域已知的抗体相比，本发明的抗体在肿瘤模型中也显著有效。例如，本发明的CD47抗体存在时，巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力升高了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是一种IgG同种型，所述IgG同种型选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4同种型组成的组。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是选自IgG4P和IgG4PE的IgG同种型。其中IgG4P指对IgG4铰链区Ser228位点突变为Pro，防止链交换；IgG4PE指对IgG4铰链区Ser228位点突变为Pro，防止链交换；对恒定区内的Leu235突变为Glu，改变Fc受体相互作用。
在一些实施方案中，所述抗体是嵌合、人源化或全人源的。在一些实施方案中，所述抗体结合人CD47。
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段为分离的CD47抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段为单克隆抗体或其片段。
在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段可应用在制备治疗癌症或感染的药物中。在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段可应用在制备治疗固体瘤或者血液瘤的药物中。在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段可应用在制备治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌的药物中。在一些实施方案中，本发明的CD47抗体或抗原结合片段可应用在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤或者滤泡型淋巴瘤的药物中。
在一些实施方案中，本文所述CD47抗体可用于治疗、延缓癌症或其他肿瘤病症的进展、避免其复发或缓解其症状。例如，本文所述CD47抗体可用于治疗血液恶性肿瘤和/或肿瘤，例如血液恶性肿瘤和/或肿瘤。例如，本文所述CD47抗体可用于治疗CD47+肿瘤。作为非限制性实施例，本文所述CD47抗体可用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤等。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。例如，本文所述CD47抗体可用于治疗弥漫大B细胞淋巴瘤或者滤泡型淋巴瘤。
在本文中，“血液癌症”包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。“白血病”表示一种血液癌症，其制造了过多无法有效对抗感染的白细胞，从而排挤组成血液的其他组分，如血小板和血红细胞。白血病的病例可分为急性或慢性。作为非限制性实施例，白血病可包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓性增生疾病/肿瘤(MPDS)、和脊髓发育不良综合征。“淋巴瘤”可包括霍奇金淋巴瘤，无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯-琼斯骨髓瘤。
本发明的示例性单克隆抗体包括例如本文所述抗体。示例性抗体包括具有选自SEQ ID NO:11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:12、13、45-49、51-55、65中任一的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。所述抗体还包括具有与SEQ IDNO:11、36-44、50和56中的至少一个序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:12、13、45-49、51-55、65中的至少一个序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的轻链可变区的抗体。这些抗体显示出对人CD47的特异性，且其能够阻止CD47与SIRPα相互作用，同时不会导致血红细胞出现显著的血凝反应。
在一些实施方案中，本发明还提供一种生物材料，为
(1)一种多聚核苷酸，其编码本发明所述抗体或抗原结合片段；或，
(2)一种表达载体，其包含编码本发明所述抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸；或，
(3)一种细胞，其包含编码本发明所述抗体或抗原结合片段的一种或多种多聚核苷酸。
本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药学上可接受的载体。这些药物组合物可包括于试剂盒中，如诊断试剂盒。
本发明还提供了通过给予对象其所需的一种或多种结合CD47或其免疫活性片段的单克隆抗体从而缓解癌症或其他肿瘤病症症状的方法，所述抗体在给药后不会导致显著的血红细胞血凝反应。所述抗体的给药剂量应足够缓解对象中癌症或其他肿瘤病症症状。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述抗体或其免疫活性片段阻止CD47与SIRPα相互作用。
在一些实施方案中，本文所述CD47抗体与一种或多种其它试剂组合联用。合适的其它试剂包括现有的用于特定应用(如癌症)的药物和/或手术疗法。例如，所述CD47抗体与一种或多种其它化疗或抗肿瘤试剂联用。或者，其它化疗剂是放射疗法。在一些实施方案中，所述化疗剂是细胞死亡诱导剂。在一些实施方案中，所述化疗剂诱导跨质膜的磷脂不对称缺失，例如引起磷脂酰丝氨酸(PS)的细胞表面暴露。在一些实施方案中，所述化疗剂诱导内质网(ER)应激。在一些实施方案中，所述化疗剂是蛋白酶体抑制剂。在一些实施方案中，所述化疗剂诱导ER蛋白移位至细胞表面。在一些实施方案中，所述化疗剂诱导钙网蛋白的移位和细胞表面暴露。
在一些实施方案中，所述CD47抗体和其它试剂被制备为单个治疗组合物，并同时给予所述CD47抗体和其它试剂。或者，所述CD47抗体和其它试剂彼此独立，例如分别制备为独立的治疗组合物，并同时给予所述CD47抗体和其它试剂，或在治疗方案期间在不同时间给予所述CD47抗体和其它试剂。例如，在给予其它试剂前给予所述CD47抗体，在给予其它试剂后给予所述CD47抗体，或在以交替的方案给予所述CD47抗体和其它试剂。本文中，以单个剂量或多个剂量给予所述CD47抗体和其它试剂。
在一些实施方案中，提供本发明抗体或抗原结合片段、组合物、生物材料在制备治疗癌症或感染的药物中的应用。
本领域技术人员应理解本发明的抗体有多种用途。例如，本发明的抗体可用作治疗剂、用作诊断试剂盒中的试剂或用作诊断工具、或用作竞争实验中的试剂以生成治疗剂。
附图说明
图1为组图，描述了抗体17-ScFv与细胞表面CD47结合的能力，分别使用CHO-CD47细胞(图1A)或Jurkat细胞(图1B)。
图2显示了使用流式细胞术分析抗体17-ScFv与配体SIRPα竞争CHO表面CD47的结合的能力。
图3为组图，图3A-3E显示了由竞争ELISA评估CD47抗体阻断SIRPα与CD47抗原结合的能力。
图4为组图，图4A-4E显示了CD47抗体导致的血红细胞(RBC)血凝反应，外观显示红细胞团流成一条线的为不引起血凝反应，轻微凝聚的为一个点，凝集明显的为整个孔模糊一团；图4A显示抗体11有明显凝聚现象，图4B显示抗体L12不会引起血凝反应，图4C显示抗体L12-6不会引起血凝反应，图4D显示抗体17、Hu5F9-G4有明显血凝现象，AB6.12-G1、SIRPα不会引起血凝反应，图4E显示抗体6Y-G4不会引起血凝反应。
图5为组图，图5A-5B显示由ELISA法评估CD47抗体与人CD47或猕猴CD47的结合。
图6为组图，图6A-6B显示由流式细胞术评估CD47抗体促进RAW264.7吞噬Raji的能力。
图7为组图，图7A-7D在食蟹猴体内分析了抗体6Y-G1对红细胞、血小板的影响；图7A-7B显示抗体6Y-G1会引起血红蛋白及红细胞减少，大概2周后开始逐渐恢复，反应程度与抗体AB6.12-G1、Hu5F9-G4类似；图7C显示每次给予抗体6Y-G1后，血小板呈波动性变化，给药结束后恢复；图7D显示每次给予抗体6Y-G1后，网织红细胞数量上升，并且上升幅度大于抗体AB6.12-G1、Hu5F9-G4给药组。
图8显示了抗体L12在人血液瘤MV4-11系统瘤模型中的抗肿瘤作用，使用抗体AB6.12-G1、Hu5F9-G4作为阳性对照。均使用200μg抗体剂量处理小鼠，一周三次。
图9分析了拉吉肿瘤模型中6Y-G4抗体的抗肿瘤效果；使用100μg抗体剂量处理小鼠，一周三次。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合CD47的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合人CD47。本文中，这些抗体被统称作CD47抗体。除非本文中另外说明，否则抗体可变区和恒定区中的氨基酸残基按照Kabat编号(Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest中的EU索引)。
本文所述抗体的一些特性包括：a)与CD47(如人CD47和猕猴CD47)特异性结合；b)阻断CD47与SIRPα的相互作用；c)不具有显著的血细胞凝集活性；d)能够促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬；和/或e)在人类癌症的小鼠模型中显示有效的抗肿瘤活性。
因此，本文所述抗体在治疗多种癌症中占据重要地位。
许多现有的CD47抗体阻断SIRPα；然而现有的阻断SIRPα抗体会导致不需要的血凝反应副作用。其他现有的抗体(如2D3)不会引起血凝反应，但这些抗体也不阻断SIRPα，使得其无法有效地促进吞噬作用。因此，细胞的凝集是使用现有的全IgG抗体治疗性靶向CD47的主要限制。因此，人们迫切需要得到能够阻断SIRPα同时不导致细胞凝集的CD47抗体。
本发明的CD47抗体避免了不需要的血凝反应，从而增加治疗性靶向CD47的效果，并维持阻断CD47与SIRPα相互作用的能力，从而促进对表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，本发明的CD47抗体(例如抗体L12及抗体L12-6等)不会以显著水平凝集细胞。例如，本发明的CD47抗体不会以显著水平凝集RBC。
本发明的CD47抗体结合人CD47并阻断其与SIRPα的相互作用(图3A-3E)。这些抗体不引起显著的人红细胞血凝反应(图4A-4E)。这些抗体能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞(图6A-6B)。此外，这些CD47抗体在人Raji淋巴瘤的小鼠模型中显示出有效的抗肿瘤活性(图9)。因此，本发明的CD47抗体克服了用于治疗性靶向CD47的一个主要限制因素。因此，本发明的CD47抗体在治疗大量癌症方面至关重要。
本发明的抗体与CD47表位结合的平衡解离常数(KD)小于等于1μM，例如小于等于100nM，如小于等于10nM，小于等于1nM。例如，本文所提供的CD47抗体表现出小于1nM的KD值。
本发明的CD47抗体用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰广泛分布的CD47的功能活性。CD47的功能活性包括例如通过与SIRPα的相互作用传导信号、在细胞粘附至细胞外基质后调节(如增加)细胞内钙离子浓度、与血小板反应蛋白的C端细胞结合结构域相互作用、与血纤蛋白原相互作用以及与多种整联蛋白相互作用。例如，CD47抗体通过部分或完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰CD47与SIRPα的结合从而完全或部分地抑制CD47的功能活性。
定义
除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学以及蛋白质纯化使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和细胞培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(1989))。
如本公开中所用，除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：术语“血红细胞”和“红细胞”是同义词并可互换使用。
术语“凝聚”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。在本文所述的血细胞凝集测定中，红细胞在给定孔中形成可为“纽扣”、“晕圈”或介于两者之间的中间体的形式。术语“一条线”是指将96孔板倾斜45°后红细胞团流成一条线状。术语“显著的血细胞凝集活性”是指在加入本文所述的抗体时孔中存在任何晕圈形式。
本文所用术语“抗体”指免疫球蛋白(Ig)分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“发生免疫反应”或“针对”是指抗体与目标抗原的一个或多个抗原决定簇反应且不与其它多肽反应，或者以很低亲和力(KD>10-6g/ml)与其它多肽结合。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab-和F(ab’)2片段、Fv和Fab表达库。
已知基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体(或称为“全抗”)由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分限定了一个恒定区，主要负责效应子功能。一般来讲，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG1、IgG2、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指一群这样的抗体分子：其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸的连接短肽(linker)连接而成的抗体。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。该抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中三个高度分化的分支(被称作“高变区”)位于较保守的分支(被称作“框架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”表示免疫球蛋白中在天然情况下存在于高变区之间或邻近高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。每个结构域氨基酸的比对可与Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health(1987和1991))或Chothia和Lesk的文章(J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等，Nature 342:878-883(1989))的定义一致。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
如本文所用，术语“特异性结合”是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中较小的KD代表较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知方法进行定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同等影响该速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)两者可通过计算浓度和实际的缔合和解离速率测定。(参见Nature 361:186-87(1993))。koff/kon比率能够消除所有与亲和力无关的参数，并且等于平衡解离常数KD。(通常参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。特异性结合可由放射性配体结合测定、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术结合测定、或本领域技术人员已知的类似测定所测，当平衡解离常数(KD)≦1μM(例如小于等于100nM、小于等于10nM，又如小于等于1nM)时，本公开的抗体与CD47特异性结合。
“分离的”抗体是从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是将妨碍抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素、以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述抗体纯化到以下程度：(1)所述抗体按重量百分比计大于95％，如大于99％，如由Lowry方法所测；(2)通过使用转杯式测序仪可以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基；或者(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE，使用考马斯蓝或银染色测出具有同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。通常，分离的抗体将通过至少一个或多个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的抗体的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
本文所用术语“多肽”是一个普通术语，表示天然蛋白质、片段或多肽序列的类似物，因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属中的一种。
术语“序列同一性”或“序列同源性”指的是：在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即基于核苷酸对核苷酸或残基对残基是相同的)。术语“序列同一性百分比”通过如下方式计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即窗口尺寸)，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland 7Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。常规(或天然)氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
类似地，除非另外指明，否则单链多核苷酸序列的左手末端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。新生的RNA转录物的5’至3’的添加方向被称为转录方向；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物5’端5’的序列区被称为“上游序列”；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物3’端3’的序列区被称为“下游序列”。当应用于多肽时，术语“基本上相同”是指两个肽序列在诸如通过GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置区别在于保守氨基酸取代。
抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的同一性保持至少75％、如至少80％、90％、95％并又如99％。在一些实施方案中，变化为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的取代。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸，且对所得分子的结合或特性不会有重要影响，特别是该置换不涉及结合位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。所述测定在本文进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。
在一些实施方案中，氨基酸取代具有如下效果：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction toProtein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。
本文所用术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。
术语“药剂”或“药物”是指适当施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
本文所用术语“抗肿瘤药”是指具有抑制肿瘤在人体中发展或累进的功能特性的试剂，尤其是恶性(癌性)病变，诸如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移在很多情况下是抗肿瘤药的特性。
本文中的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(《麦格劳-希尔化学术语词典》)(Parker,S.编，格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，旧金山(1985))。
CD47抗体
本发明的抗体具有结合CD47的能力，以抑制SIRPα与CD47的结合，减少CD47-SIRPα介导的信号传递，促进吞噬作用并抑制肿瘤生长和/或转移。例如，可使用本文实施例中描述的细胞实验确定抑制作用。
本发明的示例性抗体包括抗体17、抗体L12、抗体6Y-G1和抗体6Y-G4等，以及其他的类似的具有相同或者相似CDR区域的抗体。
抗体17的VH CDR有SEQ ID NO:14(VH CDR1)、SEQ ID NO:17(VH CDR2)和SEQ IDNO:23(VH CDR3)，VL CDR有SEQ ID NO:31(VL CDR1)、SEQ ID NO:33(VL CDR2)和SEQ IDNO:35(VL CDR3)。VH CDR为重链高变区，VL CDR为轻链高变区。
在一些实施方案中，本发明在抗体17的基础上，对其VH CDR1、VH CDR2和/或VHCDR3中一个或多个氨基酸位点进行取代。在一些实施方案中VH CDR1、VH CDR2和/或VHCDR3的可取代位点(亲本)及可被用于取代的氨基酸见表1中的一个或多个。表1中的“位置”表示SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列从左至右数的氨基酸位点；如，位置30，表示SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列从左至右数第30位氨基酸“D”。
表1：重链CDR氨基酸取代
Figure BDA0003188100870000111
Figure BDA0003188100870000121
抗体L12和抗体L12-6的VH CDR有SEQ ID NO:14(VH CDR1)、SEQ ID NO:17(VHCDR2)和SEQ ID NO:23(VH CDR3)，VL CDR有SEQ ID NO:30(VL CDR1)、SEQ ID NO:32(VLCDR2)和SEQ ID NO:34(VL CDR3)。
经实验验证，VH CDR1序列还可以是SEQ ID NO:15或16。VH CDR2序列还可以是SEQID NO:18、19、20、21或22。VH CDR3序列还可以是SEQ ID NO:24、25、26、27、28或29。其他CDR序列可以通过表1所示的氨基酸替代实现。在一些实施方案中，有1个，2个，或者3个氨基酸被取代。
除了CDR的变化外，框架区的氨基酸也可以有适当的改变。比如，相对于抗体L12的重链的框架区经过两个突变(R81K和R82aS)后产生的L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-8-VH或L12-9-VH也是合适的重链可变区。在一些实施方案中，CD47抗体的重链可变区可以在81位是个K，或者在82a位是个S(根据Kabat编号)。其他的框架区突变也在不同的抗体序列中体现。因此，本发明提供具有R81K和/或R82aS(根据Kabat编号)突变的重链框架区。
本发明的示例性抗体包括含有序列选自SEQ ID NO:11、36-44、50或56的重链可变区和序列选自SEQ ID NO:12-13、45-49、51-55、65的轻链可变区的抗体。特别地，示例性抗体包括抗体17、抗体3-3、抗体3-6、抗体3、抗体6、抗体10、抗体11、抗体16、抗体18、抗体24、抗体25、抗体L1、抗体L2、抗体L5、抗体L12-1-1、抗体L12、抗体L24、抗体L26、抗体L12-1、抗体L12-2、抗体L12-3、抗体L12-4、抗体L12-5、抗体L12-6-1、抗体L12-6、抗体L12-7、抗体L12-8、抗体L12-9、抗体L12-10、抗体L12-11，还有与上述抗体的序列有合适的序列同一性的抗体。比如共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。在有些实施例里面，这些有同一性的序列至少CDR不会变。
在一些实施方案中，对抗体L12进行人框架适应。在一些实施方案中，抗体L12的VH的框架突变见表3中L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-8-VH或L12-9-VH标记下划线的氨基酸。在一些实施方案中，抗体L12的VL框架突变见表3中L12-1-1-VL、L12-1-VL、L12-2-VL、L12-3-VL、L12-4-VL、L12-5-VL、L12-6-1-VL、L12-7-VL、L12-8-VL、L12-9-VL、L12-10-VL或L12-11-VL标记下划线的氨基酸。
本发明还包括与本文所述CD47抗体结合同一表位的抗体。例如，本发明的抗体特异性结合包括人CD47上一个或多个氨基酸残基的表位(参见例如GenBank登录号Q08722.1)。
下面提供了一种示例性人CD47的ECD氨基酸序列SEQ ID NO:1(GenBank登录号Q08722.1(GI:1171879)，其通过引用纳入本文)。信号序列(氨基酸1-18)用下划线表示。
SEQ ID NO:1
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSP
本文所述抗体调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式妨碍CD47-和/或CD47/SIRPα介导的信号传导的能力可通过包括在本文所述的一种或多种抗体存在下测量CD47-和/或CD47/SIRPα介导的信号传导等方法评估。这些测定可包括竞争结合测定法或者可测量生物示值读数，例如促进表达CD47的细胞被巨噬细胞吞噬的能力(如实施例3所述)。
本文所述抗体可使用本领域内已知的各种方法产生(例如，Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow E和Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，以引用方式并入本文)。完全人抗体是轻链和重链两者的整个序列(包括CDR)来源于人基因的抗体分子。此类抗体在本文被称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可通过使用trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983Immunol Today 4:72)，以及EBV杂交瘤技术来制备以产生人单克隆抗体(参见Cole等人，1985.In:Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)产生。可利用人单克隆抗体并且其可通过使用人杂交瘤(参见Cote等人，1983.ProcNatl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过用在体外用巴尔病毒(Epstein BarrVirus)转化人B细胞(参见Cole等人，1985.In:Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页)产生。
抗体可通过公知的技术纯化，例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，其主要提供了免疫血清中的IgG级分。另外，可将免疫球蛋白所靶向的特异抗原或其表位固定于柱上，以通过免疫亲和色谱来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考D.Wilkinson的文章(The Scientist，由The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28页)。
本公开的CD47抗体可以为单克隆抗体。调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式妨碍CD47-和/或CD47/SIRPα介导的细胞信号传导的单克隆抗体例如通过用如膜结合的和/或可溶的CD47(例如，人CD47或其免疫原性片段、衍生物或变体)免疫动物来产生。另选地，用经包含编码CD47的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，由此使得CD47被表达并与转染细胞的表面相关联。另选地，通过筛选包含抗体或抗原结合结构域序列的库获得抗体以用于与CD47结合。该库如下制备：在噬菌体中，将与噬菌体外壳蛋白融合的蛋白质或肽的融合体表达于组装的噬菌体颗粒表面上，并且将编码的DNA序列整合于噬菌体颗粒之内(即，“噬菌体展示库”)。然后通过与CD47的结合反应进行筛选。
使用例如杂交瘤方法来制备单克隆抗体，诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)所述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫剂的抗体。另选地，可将淋巴细胞在体外免疫。
免疫剂通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白。通常，如果需要人源细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在适当的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。
单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中所述的那些。编码本文所述单克隆抗体的DNA可使用常规方法来分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本文所述杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离后，可以将DNA置入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、猿COS细胞、PER.NS0细胞、SP2/0、YB2/0、或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。DNA也可通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利No.4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价地连接进行修饰。此类非免疫球蛋白多肽能够取代本文所述抗体的恒定结构域，或者能够取代本文所述抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
通过使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technologyfor Production of Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in Reference Module in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
在一些实施方案中，编码本发明的CD47抗体的DNA序列，可以通过抗体的氨基酸序列结合本领域常规的方法获得。在一些实施方案中，编码抗体6Y-G4的重链的DNA序列如SEQID NO:57所示，其中，下划线部分编码VH CDR；编码的抗体6Y-G4重链的氨基酸序列如SEQID NO:60所示。
SEQ ID NO:57如下：
caggtgcagctgcaggagtccggccctggcctggtgaagccttccgagaccctgtccctgacctgtaccgtgagcggcggcagcctggataactattactggagctggatccggcagcctcctggcaagggcctggagtggatcggctacatctactattccggcaacaccaattacaacccttccctgaagagccgggtgaccatctccgtggacaccagcaagaaccagtttagcctgaagctgtcctccgtgaccgccgctgataccgccgtgtactactgtgccaggggcgg ccggttcctggagagatattggggccagggtaccctcgtgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccttccgtgttccccctggccccctgtagccggtccacctctgagagcaccgctgctctgggctgtctggtgaaggattactttcccgaaccggtgaccgtgtcatggaactccggggctctgacatccggtgtccacacttttcctgcagtgctgcagtcatccggcctgtacagcctgagctctgtggtcacagtcccaagttcatccctgggaaccaagacatatacttgcaacgtggatcataaacccagcaatactaaggtcgacaaacgagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagcacctgagttcctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcctaaagataccctgatgatcagtcggactcccgaggtcacctgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccctgaagtccagttcaactggtacgtggacggcgtcgaagtgcacaatgctaagacaaaacctcgagaggaacagtttaactccacataccgtgtcgtgagcgtcctgactgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaggagtataagtgcaaagtgagcaataagggactgccaagctctatcgagaaaactatttctaaggctaaaggacagcctagggaaccacaggtgtacaccctgccccctagtcaggaggaaatgactaagaaccaggtctcactgacctgtctggtgaaagggttctatccttcagatattgcagtggagtgggaatccaatggtcagccagagaacaattacaagacaactccacccgtgctggacagcgatgggtctttctttctgtattctagactgaccgtggacaaaagtcgctggcaggagggtaatgtcttttcttgtagtgtgatgcacgaagccctgcacaaccactacactcagaaaagcctgtcactgtccctgggtaaa
SEQ ID NO:60：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在一些实施方案中，编码抗体6Y-G4的轻链的DNA序列如SEQ ID NO:58所示，其中，下划线部分编码VL CDR；编码的抗体6Y-G4轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示。
SEQ ID NO:58如下：
gagatcgtgctgacccagtccccctccagcctgagcgccagcgtgggagaccgggtgaccatcccctgccgggcttccctgtccatcggcagcttcctgaactggtatcagcagaggcctggcgaggcccctaagctgctgatctttgccgcttccagcctgcggagcggcgtgcctagcaggttctccggcagcggctccggcaccgatttcaccctgaccatcagcggcctgcagcccgaggatttcgccacctactactgccagcagacctacaccaccccttacacctttggccagggcaccaaggtggacatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga
SEQ ID NO:61：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，抗体6Y-G1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示。
SEQ ID NO:62：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些实施方案中，抗体6Y-G1轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示。
在一些实施方案中，抗体17重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。
SEQ ID NO:63：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些实施方案中，抗体17轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。
SEQ ID NO:64：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTISCRANQAIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，抗体L12重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。在一些实施方案中，抗体L12轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示。
人抗体和人源化抗体
本文所述抗体包括完全人抗体或人源化抗体。这些抗体适用于给人施用，而不会造成人对所施用的免疫球蛋白产生免疫应答。
CD47抗体例如通过噬菌体展示方法使用仅包含人序列的抗体来产生。此类方法在本领域中为人们所熟知，例如WO92/01047和美国专利No.6,521,404。在该方法中，使用天然或重组CD47来源或其片段来筛选携带有随机的轻链和重链对的噬菌体的组合库。在另一种方法中，CD47抗体可通过这样的方法产生：至少一个方法步骤包括用人CD47蛋白质免疫转基因非人动物。在此类方法中，一些转基因的非人动物的内源性重链和/或k轻链基因座中已失效，并且不能发生产生编码响应于抗原的免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已被稳定转染到动物中。因此，响应于所施用的抗原，人基因座重排以提供编码对抗原具有免疫特异性的人可变区的基因。因此，在免疫时，转基因鼠产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。
免疫原性降低的抗体的产生也使用适当的库经由人源化技术、嵌合化技术和展示技术来实现。应当理解，鼠抗体或来自于其它物种的抗体可使用本领域熟知的技术人源化或灵长类源化。参见例如Winter和Harris Immunol Today 14:43 46(1993)以及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992)。所关注的抗体可通过重组DNA技术进行工程化改造，以用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或骨架结构域(参见WO92102190和美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；和5,777,085)。将Ig cDNA用于构建嵌合免疫球蛋白基因也为本领域已知的(Liu等人P.N.A.S.84:3439(1987)和J.Immunol.139:3521(1987))。mRNA从产生抗体的杂交瘤或其它细胞中分离出并用于产生cDNA。所关注的cDNA可使用特异性引物通过聚合酶链反应来扩增(美国专利4,683,195和4,683,202)。另选地，构建并筛选库以分离所关注的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人恒定区基因的序列可见于Kabat等人发表的Sequences of Proteins of immunological Interest(N.I.H.publication no.91-3242(1991))。人C区基因可容易地从已知克隆中获得。同种型的选择将根据所期望的效应子功能，例如补体结合或抗体依赖性细胞毒性的活性来指导。优选的同种型为IgG1和IgG2。可使用任一种人轻链恒定区，即k或λ，然后通过常规方法表达嵌合人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体片段如Fv、F(ab’)2和Fab可通过裂解完整的蛋白质来制备，例如通过蛋白酶或者化学裂解。包括但不限于：(i)用胃蛋白酶消化抗体分子得到F(ab’)2片段；(ii)通过还原F(ab’)2片段的二硫键得到Fab片段；(iii)用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成Fab片段，以及(iv)Fv片段。
重链和轻链的一致性序列J区可用于设计用作引物的寡核苷酸，以便在J区内引入有用的限制性位点，用于随后将V区片段连接于人C区片段。C区cDNA可通过定点诱变修饰，以在人序列的类似位置放置一个限制性位点。
本文所述CD47抗体可以由包含编码上述抗体的DNA片段的载体表达。表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。合适的载体通常是这样一种载体，它编码功能完整的人的重链恒定区(CH)或轻链恒定区(CL)免疫球蛋白序列，并带有适当的限制性位点，使得任何VH或VL序列可以被容易地插入和表达。在此类载体中，剪接通常发生在被插入的J区中的剪接供体位点与人C区域前面的剪接受体位点之间，并且还发生在人CH外显子内存在的剪接区域处。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点处。所得的嵌合抗体可以连接于任何强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等人Mol.Cell.Bio.3:280(1983))、劳氏(Rous)肉瘤病毒LTR(Gorman等人P.N.A.S.79:6777(1982))和莫洛尼氏(moloney)鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人Cell41:885(1985))。另外，可使用天然Ig启动子等。
Fc修饰
本文所述抗体的有关效应子功能可以被修饰，以提高例如抗体在治疗与异常CD47信号传导相关的疾病和障碍中的有效性。例如，可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而沉默效应子功能，由此减小杀死正常细胞的可能。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，对人IgG1恒定区上的氨基酸Asn297(Kabat编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)。在一些实施方案中，对抗体恒定区上的氨基酸Leu235(Kabat编号)进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在一些实施方案中，对抗体恒定区上的氨基酸Leu234(Kabat编号)进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在一些实施方案中，对抗体恒定区上的氨基酸234和235同时进行修饰，例如Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)(Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest中的EU索引)。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG4同种型，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，对人IgG4恒定区内的铰链区进行修饰以避免或减少链交换，例如Ser228Pro(S228P)。在其他实施方案中，对人IgG4恒定区上的氨基酸235进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在一些实施方案中，对人IgG4恒定区内的铰链区和氨基酸235进行修饰，例如Ser228Pro和Leu235Glu(S228P/L235E)。在一些实施方案中，对人IgG4恒定区上的氨基酸Asn297(加框，Kabat编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)。在一些实施方案中，对人IgG4恒定区上的氨基酸Ser228、Leu235和Asn297进行修饰(例如S228P/L235E/N297A)。
针对CD47的抗体的使用
在一些实施方案中，包括本发明的CD47抗体可用于诊断、预后、监控、治疗、缓和和/或预防对象中异常CD47表达、活性和/或信号转导相关的疾病或病变。通过使用标准方法鉴定患有异常CD47表达、活性和/或信号转导相关的疾病或病症(如癌症或其他肿瘤病症)，或有疾病发展风险的对象(如人类患者)，可实施治疗方案。在一些实施方案中，提供治疗涉及异常的CD47表达、活性和/或信号转导的疾病或病症的方法，包括给予需要治疗该疾病或病症的对象有效量的一种本文所述抗体或其制剂。抗体的给药可消除或抑制或干扰靶标(如CD47)的表达、活性和/或信号转导功能。抗体的给药可消除或抑制或干扰靶标(如CD47)与其天然状态下结合的内源性配体(如SIRPα)的结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或干扰CD47的表达、活性和/或信号转导。
在一些实施方案中，涉及异常的CD47表达、活性和/或信号转导的疾病或病症包括血液癌症和/或固体肿瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些实施方案中，白血病的某些形式包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓性增生疾病/肿瘤(MPDS)；和脊髓发育不良综合征。在一些实施方案中，淋巴瘤的某些形式包括霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。在一些实施方案中，骨髓瘤的某些形式包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯-琼斯骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
癌症和其他肿瘤病症相关的症状包括例如炎症、发热、全身不适、发热、疼痛、局部区域经常性发炎(often localized to the inflamed area)、食欲下降、体重下降、水肿、头痛、疲劳、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和腹部症状(例如腹痛、腹泻或便秘)。
本发明的抗体的治疗有效量通常涉及达到治疗目标所需的量。给药所需的量取决于抗体对其特异抗原的结合亲和力，疾病、紊乱或病症的严重程度、给药途径、在接受给药的对象中给予的抗体从自由体积耗尽的速率等。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围为从约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg、约100mg/kg或更高或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)的剂量将本发明的抗体给予对象。常见的剂量频率范围是例如每天一次至每周一次。
在另一些实施方案中，针对CD47的抗体可用于本领域中已知的与CD47定位和/或定量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的CD47和/或CD47和SIRPα两者的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。在一个给定实施方案中，对CD47或其衍生物、片段、类似物或同系物具有特异性的、包含源于抗体的抗原结合结构域的抗体，被用作药物学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
在另一些实施方案中，可通过标准技术例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，使用对CD47具有特异性的抗体来分离CD47多肽。针对CD47蛋白质的抗体(或其片段)可用于检测生物样品中的蛋白质。在一些实施方案中，在生物样品中可检测CD47作为临床测试过程的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可有利于检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白，并且合适放射性材料的示例包括125I、131I、35S或3H。
在另一些实施方案中，本公开的抗体可用作检测样品中CD47和/或CD47和SIRPα蛋白质两者(或其蛋白质片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测标记。抗体为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。使用完整的抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab')2)。所述实施方案的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，分析物mRNA体外检测技术包括Norhtern杂交和原位杂交。分析物蛋白质体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光。分析物基因组DNA体外检测技术包括Southern杂交。(ELISA:Theory and Practice:Methods inMolecular Biology，第42卷，J.R.Crowther Human Press,Totowa,N.J.,1995；Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1996；Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,P.Tijssen,ElsevierScience Publishers,Amsterdam,1985)。此外，分析物蛋白质的体内检测技术包括向受试者体内导入标记的抗分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标记标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受试者体内该放射性标记物的存在和位置。
CD47抗体的治疗性施用和制剂
可将本文所述抗体和其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences:The Science And Practice OfPharmacy,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；Peptide And Protein Drug Delivery,Advances In ParenteralSciences,第4卷,1991,M.Dekker,New York。
此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，使用抗体片段为与靶蛋白结合结构域特异性结合的最小抑制片段。如，基于抗体的可变区序列并保留结合靶蛋白质序列能力的肽。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、稳定剂、缓冲剂、分散介质、包衣、抑菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中。此类载体或稀释剂可选择包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。
待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
所述实施方案的药物组合物通常与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。药物组合物可包括以下组分中的一种或多种：注射用无菌稀释剂，例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抑菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；渗透压调节剂，例如氯化钠或右旋糖；稳定剂，例如精氨酸、甲硫氨酸、海藻糖、蔗糖、山梨醇；表面活性剂，例如吐温20、吐温80。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将药物组合物包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。在一些实施方案中，适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。使用时，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
药物组合物以剂量单位形式配制，易于施用，剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。
所述药物组合物可放于容器或分配器中，并与给药说明书一起包装。
本文所述药物组合物还可根据要治疗的具体情况而包含其它活性成分，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。在一些实施方案中，组合物可包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类活性成分以对预期目的有效的量适当地联合存在。
在一个实施方案中，包括CD47抗体的一种或多种活性成分可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂等)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地、同时地或顺次地给予。在一些实施方案中，此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在一些实施方案中，本文所述抗体被用作针对自身免疫性障碍、炎性疾病等的疫苗佐剂。疫苗可以是各种各样的抗原。所述抗原来自于所靶向的自体抗原，即参与自身免疫的自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自体抗原，例如淀粉状肽蛋白、或移植抗原，例如同种抗原。抗原可包括衍生自蛋白质的肽或多肽以及以下任一项的片段：糖、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过敏原或其它大分子组分。在一些实施方案中，多于一种抗原被包含在抗原性组合物中。
本文对出版物和专利文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的在先技术，也并不表示承认其内容或日期。现在，本发明已以书面说明书方式描述，本领域技术人员应认识到可以多种实施方式实践本发明，而上文的说明书和下文的实施例旨在说明而非限制本发明的权利要求。本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请全部内容通过参考并入本文用于所有目的。
实施例
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径或已知方法得到。在以下实施例中，抗体L12-6与抗体6Y-G1为相同的抗体。
CHO-CD47细胞构建流程：设计HindIII/EcoRI窗口将编码CD47(序列见Uniprot，Q08722)的多聚核酸导入pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V790-20)质粒中，并通过PvuI单切转染CHO细胞(ATCC#CCL-61)，筛选获得稳定CHO-CD47细胞株。
Jurkat细胞购自中国科学院上海细胞库，货号为Clone E6-1。
IgG抗体购自BioXCell，货号为BE0297。
猕猴CD47-Fc购自CreativeBioMart，型号为CD47-745C。
实施例1：CD47抗原的制备
CD47抗原制备：在人CD47细胞外结构域(ECD)蛋白质(SEQ ID NO:1)C-末端添加6×HIS标签(HHHHHH,SEQ ID NO:2)或者人Fc(SEQ ID NO:3中带下划线部分)(参照R&D系统)构建成CD47重组蛋白。人CD47的ECD区分别与6×HIS或Fc通过基因合成并亚克隆到哺乳动物的表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V790-20)中。在瞬时转染HEK293F细胞之后，获得基于镍的固定化金属亲和层析纯化的His-标记的人CD47-ECD蛋白质(CD47-His)和经由固定化金属亲和层析(IMAC)使用proteinA柱(GE Healthcare)纯化分泌的Fc-标记的人CD47-ECD蛋白质(CD47-Fc)。
实施例2：CD47抗体的制备
30种单链抗体(scFv)的VH和VL的组合见表2，由VH的C端和VL的N端通过序列如SEQID NO:10所示(GGGGSGGGGSGGGGS)的连接短肽连接；抗体的重链可变区用抗体编号+“-VH”表示，如17-VH；抗体的轻链可变区用抗体编号+“-VL”表示，如17-VL；单链抗体(scFv)用抗体编号+“-ScFv”表示，如17-ScFv(由17-VH(如SED ID NO:11所示)的C端和17-VL(如SED IDNO:12所示)的N端通过如SEQ ID NO:10所示的连接短肽连接，得到17-ScFv)。
30种IgG1全抗的VH和VL的组合见表2；VH与CH组成抗体的重链，VL和CL组成抗体的轻链；CH的序列如SED ID NO:3，CL的序列如SED ID NO:5所示；抗体的重链可变区用抗体编号+“-VH”表示，如17-VH；抗体的轻链可变区用抗体编号+“-VL”表示，如17-VL；IgG1全抗用“抗体”+抗体编号表示，如抗体17(抗体重链由17-VH(如SED ID NO:11所示)和如SED IDNO:3所示的CH组成，抗体轻链由17-VL(如SED ID NO:12所示)和如SED ID NO:5所示的CL组成)。
抗体6Y-G4重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:61所示。
表2对应的VH和VL序列见表3，其中，重链CDR见表4，轻链CDR见表5。
采用常规的技术手段对质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V790-20)进行改造，使其载有编码上述氨基酸序列的DNA序列。再将质粒瞬时转染HEK293F细胞，使HEK293F细胞表达上述氨基酸序列的抗体。使用proteinA柱(GE Healthcare)经由固定化金属亲和层析(IMAC)纯化得到CD47抗体，测序后与预期序列一致，用于生物活性鉴定。
表2：抗体的可变区组合
Figure BDA0003188100870000221
Figure BDA0003188100870000231
表3：抗体可变区序列
Figure BDA0003188100870000232
Figure BDA0003188100870000241
Figure BDA0003188100870000251
Figure BDA0003188100870000261
表4：抗体VH CDR
Figure BDA0003188100870000262
Figure BDA0003188100870000271
注：L12X-VH代表L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-4-VH、L12-5-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-7-VH、L12-8-VH、L12-9-VH、L12-10-VH或L12-11-VH
表5：抗体VL CDR
Figure BDA0003188100870000272
注：X-VL代表3-3-VL、3-6-VL、3-VL、6-VL、10-VL、11-VL、16-VL、18-VL、24-VL或25-VL；L12X-VL代表L12-1-VL、L12-2-VL、L12-3-VL、L12-4-VL、L12-5-VL、L12-6-1-VL、L12-6-VL、L12-7-VL、L12-8-VL、L12-9-VL、L12-10-VL或L12-11-VL。
对于目标细胞清除而言，抗体(如CD47抗体)的主要Fc依赖性功能是C1q与Fc区结合起始的补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc区与免疫效应细胞(如NK细胞和嗜中性粒细胞)上的Fcγ受体(FcγR)主要FcγRIIIa相互作用介导的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)；以及由巨噬细胞经由FcγRI识别视蛋白化目标细胞进行的抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。各抗体亚类在介导Fc依赖性效应活性的能力方面具有差异。在人中，IgG1和IgG3亚类由于结合C1q而对CDC具有高效力。此外，IgG1亚类对FcγR具有最高亲和力且因此在ADCC和Fc依赖性ADCP方面最有效。IgG4亚类不具有C1q结合能力且具有大幅下降的FcγR结合亲和力且因此具有显著减弱的效应功能。
根据抗体6Y-G1制备具有突变S228P以稳定抗体的铰链区的IgG4P亚类抗体6Y-G4(将6Y-G1中如SEQ ID NO:3所示的CH替换成如SEQ ID NO:4所示的CH，其它序列不变)，进一步减弱抗体Fc效应。
将17-ScFv的制备作为一个示例，本发明制备ScFv的方法如下：
利用限制性内切酶Hind III/EcoRI将编码17-ScFv的核苷酸序列(如SEQ ID NO:59所示)连接至pcDNA3.1(+)质粒载体中。再将质粒载体瞬时转染HEK293F细胞，使HEK293F细胞表达上述氨基酸序列的抗体。使用proteinA柱经由固定化金属亲和层析(IMAC)纯化得到17-ScFv抗体，测序后与预期序列一致。
其它ScFv用类似方法制备纯化，测序后与预期序列一致。
SEQ ID NO:59的序列如下：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccctcgataattactactggagctggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattggatatatctattacagtgggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctcgttgaggctgaggtctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagaggagggcgatttttggaacgttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatctcttgtcgggcgaatcaggctattggcacttggttagcctggtatcagcaaaagccaggaaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatactactcccctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaa
实施例3：CD47抗体的生物活性
1、FACS检测17-ScFv的结合活性
验证17-ScFv与CHO-CD47或者Jurkat细胞表面的CD47结合的活性(图1A-1B)。结合的活性实验操作如下：
17-ScFv及Hu5F9-G4抗体(Hu5F9-G4的重链由如SEQ ID NO:8所示的可变区和如SEQ ID NO:4所示的恒定区组成，轻链由如SEQ ID NO:9所示的可变区和如SEQ ID NO:5所示的恒定区组成)用PBS稀释不同浓度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.02、0.01μg/ml)与CHO-CD47或Jurkat细胞表面CD47 4℃孵育30min，PBS洗一遍；加入Goat anti-human IgG Fc-PE(eBioscience，货号：2183639)荧光二抗，4℃孵育15min，PBS洗两遍；上流式机检测PE-A平均荧光信号值。图1A-1B表明17-ScFv能剂量依赖性地结合细胞表面CD47。
2、SIRP-α阻断活性
采用FACS技术检测17-ScFv阻断SIRPa结合CHO-CD47细胞表面CD47能力，17-ScFv抗体用PBS稀释不同浓度(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml)，Hu5F9-G4及IgG抗体(用PBS稀释不同浓度40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μg/ml)与CHO-CD47细胞表面CD47 4℃孵育30min，PBS洗一遍；加入SIRPα-Fc-Bio(6.5μg/ml)，4℃孵育15min，PBS洗一遍；再加入Streptavidin PE(eBioscience，货号：1992345)荧光二抗，4℃孵育15min，PBS洗两遍；上流式机检测PE-A平均荧光信号值。图2示出17-ScFv能剂量依赖性地抑制SIRPα结合细胞表面CD47。
采用ELISA竞争法，17-ScFv或者18种抗体(抗体3、抗体3-3、抗体3-6、抗体6、抗体10、抗体11、抗体16、抗体18、抗体24、抗体25、抗体L12、抗体L1、抗体L5、抗体L24、抗体L26、抗体17、抗体6Y-G1、抗体6Y-G4)、阳性对照(抗体Hu5F9-G4)和阴性对照(抗体IgG)用PBS稀释不同浓度(12、6、3、2、1.5、1.2、0.75、0.375、0.188、0.094μg/ml)与包被在ELISA板上的CD47-His(2μg/ml)抗原室温孵育1小时，PBST洗四遍，再加入SIRPα-Fc-Bio(0.1μg/ml)(参考Thermo Scientific
Figure BDA0003188100870000292
NHS-Biotin Reagents试剂盒制备)配体与CD47-His抗原室温孵育1小时，PBST洗四遍。结合的SIRPα-Fc-Bio与HRP-缀合的链霉亲和素二抗产生化学发光反应，并通过读板机检测OD450值，根据OD450值换算出抗体的IC50，从而判断抗体的SIRPα阻断活性。图3A-3E示出所测抗体都展示出SIRPα与CD47抗原结合的剂量依赖性抑制。
3、血红细胞凝集测定
检测CD47抗体的红细胞凝集反应。从健康人供体中采集5ml新鲜血液至含肝素钠的抗凝管中，先用淋巴细胞分离液分离PBMC(另作他用)，再取管底1ml红细胞至6ml生理盐水中，反复清洗，2000rpm，离心5min，清洗至上清无明显红色，然后用生理盐水重悬制成2％的红细胞悬浮液。在室温下，将50μl用PBS连续2倍稀释(最高浓度800nM，共12个梯度)的CD47抗体与50μl的2％的红细胞悬浮液混匀加至96孔U型板中孵育4小时，随后评估抗体红细胞凝集情况，将96孔U型板倾斜45°，观察红细胞团的流向，如果呈“一字型”，说明红细胞没有发生凝集。大部分测试的CD47抗体在高浓度情况下诱导红细胞凝集(抗体17会有明显的红细胞凝聚)，在6nM左右不会引起红细胞凝集，其中抗体L12、抗体6Y-G1(即抗体L12-6)、抗体6Y-G4不会引起任何的红细胞凝集反应(图4A-4E)。阳性对照抗体Hu5F9-G4会引起红细胞凝集，AB6.12-G1以及配体SIRPα不会引起红细胞凝集。AB6.12-G1的重链由如SEQ ID NO:6所示的可变区和如SEQ ID NO:3所示的恒定区组成，轻链由如SEQ ID NO:7所示的可变区和如SEQ ID NO:5所示的恒定区组成。Hu5F9-G4的重链由如SEQ ID NO:8所示的可变区和如SEQ ID NO:4所示的恒定区组成，轻链由如SEQ ID NO:9所示的可变区和如SEQ ID NO:5所示的恒定区组成。见表6。
表6：阳性抗体序列表
Figure BDA0003188100870000291
Figure BDA0003188100870000301
4、CD47结合测定(ELISA)：
通过ELISA法测定CD47抗体与人CD47及猕猴CD47的结合活性。抗体17、抗体L12、抗体6Y-G1、抗体6Y-G4及抗体Hu5F9-G4从5μg/ml开始用PBS 3倍稀释8个浓度后与包被在ELISA板上的人或猕猴CD47-Fc(2μg/ml)抗原室温孵育1小时，PBST洗四遍，再加入HRP-anti-kappa(1:10000，sigma)二抗与抗体室温孵育1小时，PBST洗四遍。结合的HRP-anti-kappa与TMB底物产生化学发光反应，并通过读板机检测OD450值，根据OD450值换算出抗体的EC50，从而判断抗体与人或猕猴CD47的结合活性。图5A-5B示出所测抗体都展示出抗体与CD47抗原结合的剂量依赖性结合，各参数如表7所示。
表7：CD47抗体结合人CD47和猕猴C47的亲和力
Figure BDA0003188100870000302
5、CD47结合测定(Fortebio)
通过Fortebio法测定11个抗体(抗体L12-1、抗体L12-2、抗体L12-3、抗体L12-4、抗体L12-5、抗体L12-6、抗体L12-7、抗体L12-9、抗体L12-10、抗体L12-11、抗体L12)以及Hu5F9-G4与人CD47结合活性。
Protein A传感器置于PBS中预湿10分钟备用，将待测抗体用pH为6.8的含有0.5％BSA的PBST(以下简称稀释缓冲液)稀释至10μg/mL，将PA传感器在抗体中固化至信号约为1.7nm。将CD47-His抗原用稀释缓冲液稀释至50、25、12.5、6.25nM。将稀释缓冲液、梯度浓度的抗原稀释液、再生缓冲液(pH为8.4的1M MgCl2)、中和缓冲液(PBST)依次加入96孔板相应列中，运行如下步骤：①Baseline：在稀释缓冲液中检测基线60秒；②Association：在抗原梯度稀释液及样品空白(稀释缓冲液)中结合100秒；③Dissociation：在稀释缓冲液中解离700秒；④Regeneration：在再生缓冲液中再生5秒；⑤Neutralization：在中和缓冲液中中和5秒；⑥Regeneration和Neutralization循环进行3次。
用Data Analysis 8.2对数据进行处理分析，样品数据经参比(样品空白)信号扣减后进行拟合，得到亲和常数KD。抗体的亲和力结果统计见表8。结果显示11个抗体与CD47抗原结合的亲和力差不多。
表8：抗体亲和力
Figure BDA0003188100870000303
Figure BDA0003188100870000311
6、吞噬作用
进行体外吞噬作用测定以评估CD47抗体是否增强巨噬细胞对表达CD47的靶细胞的吞噬。简而言之，在CD47抗体(0.7nM)的存在下，将RAW264.7巨噬细胞(2×105个/mL)(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，3111C0001CCC000146)与CFSE标记的Raji细胞(4×105个/mL)(Promega，JA1595)以1:2比率铺板到24-孔底板中，37℃下避光孵育2小时。孵育完成时，用PBS洗涤细胞两次并用胰酶消化RAW264.7细胞，将消化下来的巨噬细胞转移至1.5ml EP管，2000rpm,离心5分钟。去除上清，再每管加入100μl APC-F4/80荧光抗体(eBiosciences)，4摄氏度避光孵育30分钟，2000rpm,离心5分钟，PBS缓冲液洗涤两次。在BDC6流式细胞仪上获得细胞。分析吞噬指数，吞噬指数计算方式为：吞噬指数＝CFSE阳性的巨噬细胞数(即吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞数)/每5000个巨噬细胞。抗体6Y-G1、6Y-G4、17、L12和Hu5F9-G4显示出强劲的吞噬增强能力(图6A-6B)。图6B示出6Y-G4引起的细胞吞噬反应比6Y-G1稍微弱些，说明IgG4抗体的Fc效应更弱。
实施例4：CD47抗体对血液细胞的影响
本发明前，已知的阻断SIRPα且含有Fc结构域的CD47结合分子(例如CD47抗体和重组SIRPα-Fc融合蛋白)都不同程度的诱导红细胞、血小板减少。为此，在食蟹猴体内评估本发明的抗体对血液细胞的影响，挑选符合试验要求的食蟹猴共8只，普通级，雌性各半，雄性和雌性体重范围分别为3.70～5.30kg和2.75～3.55kg；按体重通过简单随机化方案分为4组，每组2只动物，雌雄各半。阴性对照组给予生理盐水，受试物为抗体6Y-G1(即抗体L12-6)和Hu5F9-G4、AB6.12-G1，静脉输注溶媒：生理盐水，静脉输注给药，一周一次，给5次药，每次按照1→10→10→30→30mg/kg的剂量给药，给药体积均为10ml/kg。给药结束后观察至第42天。图7A-7D示出，三个抗体给药后均导致血红蛋白、红细胞减少，大概两周降至低点随后逐渐恢复至正常水平；血小板含量均呈现给药前后上下波动现象，停药后恢复正常；网织红细胞数量给药后均有增加趋势，其中6Y-G1较其它两个抗体给药后网织红细胞数量上升更高。
实施例5：CD47抗体的Fc变体体内抗肿瘤活性
评价测试药抗体L12在人血液瘤MV4-11系统瘤模型中的抗肿瘤作用。NOD.SCID小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司，体重18g-22g，鼠龄6-8周)尾静脉接种MV4-11细胞(ATCC)，接种后约4周，建立人血液瘤MV4-11系统瘤模型。试验分为测试AB6.12-G1 0.2mg/只，Hu5F9-G4 0.2mg/只，抗体L12 0.2mg/只及溶媒(生理盐水)对照组，每组6只，腹腔注射给药，每周给药三次，共给药三周。根据生存期延长时间(ILS)进行疗效评价，根据给药期间动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。图8显示测试药物AB6.12-G1(0.2mg/只)，Hu5F9-G4(0.2mg/只)与溶媒对照组相比生存期均延长了7.4％和6.5％，统计学上均没有显著性差异(p＝1.000)，未能表现出显著的抗肿瘤作用。抗体L12(0.2mg/只)中位生存期均为69天，与对照组相比生存期均延长了27.8％，在统计学上呈现出显著性差异(p＝0.007)。
在淋巴瘤的拉吉模型中评估了抗体6Y-G4的抗肿瘤活性。将拉吉细胞植入NOD.SCID小鼠皮下，并随机分成3个组(每组8只小鼠，第0天)。第1组：溶媒对照(生理盐水)；第2组：Hu5F9-G4(阳性对照)；第3组：6Y-G4。在肿瘤可触摸时(50mm3，第4天)使用各抗体或载剂(仅缓冲液)治疗，在肿瘤体积达到约3000mm3时处死小鼠。每3天量次肿瘤体积。腹腔内(IP)给予抗体，每个剂量为100μg，每周3次共3周(每只小鼠共9次剂量)。治疗于第4天开始并于第21天结束。如图9所示，测试药6Y-G4和Hu5F9-G4治疗组在0.1mg/只的给药浓度下均产生了极显著的抗肿瘤效果，在开始给药后便明显抑制了肿瘤的生长，到开始给药后第17天(PG-D17)大部分小鼠肿瘤消失，6Y-G4(0.1mg/只)、Hu5F9-G4(0.1mg/只)治疗组平均肿瘤体积分别为4mm3(8只小鼠有7只肿瘤消失)、7mm3(8只小鼠有5只肿瘤消失)，相对肿瘤抑制率TGI分别为99.87％和99.76％，相对溶媒对照组统计学上均有显著性差异(p值均<0.001)。
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<130> DSP1F212397JW
<160> 65
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<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro
130 135
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His His His His His His
1 5
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 4
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ala Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Asn Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asn Asp Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Arg Ile Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Arg Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Arg Ile Tyr Gly Asp Ser Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Arg Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Gly Arg Ile Phe Gly Gly Tyr
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Gly Arg Ile Phe Ala Gly Tyr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gly Gly Arg Ile Leu Ala Gly Tyr
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gly Gly Arg Ile Phe Ser Gly Tyr
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gly Arg Gly Ile Phe Gly Tyr
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gly Gly Arg Ile Phe Gly His
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Arg Ala Asn Gln Ala Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 36
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Leu Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Leu Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Gly Ile Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asp Ser Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Ile Phe Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
caggtgcagc tgcaggagtc cggccctggc ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctg 60
acctgtaccg tgagcggcgg cagcctggat aactattact ggagctggat ccggcagcct 120
cctggcaagg gcctggagtg gatcggctac atctactatt ccggcaacac caattacaac 180
ccttccctga agagccgggt gaccatctcc gtggacacca gcaagaacca gtttagcctg 240
aagctgtcct ccgtgaccgc cgctgatacc gccgtgtact actgtgccag gggcggccgg 300
ttcctggaga gatattgggg ccagggtacc ctcgtgaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccttccg tgttccccct ggccccctgt agccggtcca cctctgagag caccgctgct 420
ctgggctgtc tggtgaagga ttactttccc gaaccggtga ccgtgtcatg gaactccggg 480
gctctgacat ccggtgtcca cacttttcct gcagtgctgc agtcatccgg cctgtacagc 540
ctgagctctg tggtcacagt cccaagttca tccctgggaa ccaagacata tacttgcaac 600
gtggatcata aacccagcaa tactaaggtc gacaaacgag tggagtctaa gtacggacca 660
ccttgcccac catgtccagc acctgagttc ctgggaggac caagcgtgtt cctgtttcct 720
ccaaagccta aagataccct gatgatcagt cggactcccg aggtcacctg cgtggtcgtg 780
gacgtgtccc aggaggaccc tgaagtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtcgaagtg 840
cacaatgcta agacaaaacc tcgagaggaa cagtttaact ccacataccg tgtcgtgagc 900
gtcctgactg tgctgcatca ggattggctg aacggcaagg agtataagtg caaagtgagc 960
aataagggac tgccaagctc tatcgagaaa actatttcta aggctaaagg acagcctagg 1020
gaaccacagg tgtacaccct gccccctagt caggaggaaa tgactaagaa ccaggtctca 1080
ctgacctgtc tggtgaaagg gttctatcct tcagatattg cagtggagtg ggaatccaat 1140
ggtcagccag agaacaatta caagacaact ccacccgtgc tggacagcga tgggtctttc 1200
tttctgtatt ctagactgac cgtggacaaa agtcgctggc aggagggtaa tgtcttttct 1260
tgtagtgtga tgcacgaagc cctgcacaac cactacactc agaaaagcct gtcactgtcc 1320
ctgggtaaa 1329
<210> 58
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gagatcgtgc tgacccagtc cccctccagc ctgagcgcca gcgtgggaga ccgggtgacc 60
atcccctgcc gggcttccct gtccatcggc agcttcctga actggtatca gcagaggcct 120
ggcgaggccc ctaagctgct gatctttgcc gcttccagcc tgcggagcgg cgtgcctagc 180
aggttctccg gcagcggctc cggcaccgat ttcaccctga ccatcagcgg cctgcagccc 240
gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag acctacacca ccccttacac ctttggccag 300
ggcaccaagg tggacatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 645
<210> 59
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccctcgat aattactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat atctattaca gtgggaacac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctcgttg 240
aggctgaggt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggagggcga 300
tttttggaac gttactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcggacatcc agatgaccca gtctccatct 420
tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc accatctctt gtcgggcgaa tcaggctatt 480
ggcacttggt tagcctggta tcagcaaaag ccaggaaaag cccctaagct cctgatctat 540
gcggcatcca ctttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca 600
gaattcactc tcaccatcag cagcctgcag gctgaagatg tggcagttta ttactgtcag 660
caatattata ctactcccct cactttcggc ggagggacca agctggagat caaa 714
<210> 60
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 62
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 63
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ala Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Gly Ser Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105

Claims (15)

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD47并且包含下述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个，其中：
(a)VH CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14的变体，其在SEQID NO:14序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(b)VH CDR2包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:17的变体，其在SEQID NO:17序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(c)VH CDR3包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:23的变体，其在SEQID NO:23序列有如表1所示的1～3个氨基酸取代；
(d)VL CDR1包含如SEQ ID NO:30-31所示的任一氨基酸序列；
(e)VL CDR2包含如SEQ ID NO:32-33所示的任一氨基酸序列；或
(f)VL CDR3包含如SEQ ID NO:34-35所示的任一氨基酸序列。
2.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD47并且包含下述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个，其中：
(a)VH CDR1包含如SEQ ID NO:14-16所示的任一氨基酸序列；
(b)VH CDR2包含如SEQ ID NO:17-22所示的任一氨基酸序列；
(c)VH CDR3包含如SEQ ID NO:23-29所示的任一氨基酸序列；
(d)VL CDR1包含如SEQ ID NO:30-31所示的任一氨基酸序列；
(e)VL CDR2包含如SEQ ID NO:32-33所示的任一氨基酸序列；或
(f)VL CDR3包含如SEQ ID NO:34-35所示的任一氨基酸序列。
3.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自SEQ ID NO:11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
4.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区VL，所述VL包含选自SEQ ID NO:12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
5.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合CD47并且包含如SEQ ID NO:14所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2，如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3，如SEQ ID NO:30所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:32所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
6.如权利要求1、2或5所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自以下组中一个或多个根据Kabat编号的氨基酸残基突变：
(a)R81K，和
(b)R82aS。
7.如权利要求1、2或5所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH包含选自SEQ ID NO:11或50所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:11或50所示的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
8.如权利要求1、2、5或7所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区VL，所述VL包含选自SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90％序列同源性的氨基酸序列。
9.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:11或50所示的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:13或65所示的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链H和轻链L；所述重链H包含选自SEQ ID NO:60和62-63中任一的氨基酸序列，所述轻链L包含选自SEQ ID NO:61或64所示的氨基酸序列。
11.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段是IgG同种型，其选自IgG1亚型、IgG2亚型、IgG3亚型、或者IgG4亚型。
12.如权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是IgG4P。
13.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。
14.一种生物材料，为(1)一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸编码如权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段；或，
(2)一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含编码如权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段的多聚核苷酸；或，
(3)一种细胞，其特征在于，所述细胞包含编码如权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段的一种或多种多聚核苷酸。
15.如权利要求1～12任一项所述的抗体或抗原结合片段、或如权利要求13所述的组合物、或如权利要求14所述的生物材料在制备治疗癌症或感染的药物中的应用。
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