TW202208426A - Cd47抗體及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明涉及CD47抗體及其應用，特別涉及識別CD47的單克隆抗體，更具體地涉及不引起顯著水準的血紅血球凝集、血紅血球減少及血小板減少的CD47抗體，涉及製備這些抗體的方法以及使用這些單克隆抗體在製備治療癌症或感染的藥物中的應用。

Description

CD47抗體及其應用

本發明涉及生物免疫技術領域，尤其涉及一種全人源抗CD47的IgG抗體、更具體地涉及不引起顯著的人血紅血球血凝反應、血紅蛋白減少、貧血和/或血小板減少的CD47抗體、製備這些抗體的方法以及使用這些單克隆抗體在製備藥物中的應用。

CD47，又稱整合素相關蛋白（Integrin-associated protein, IAP），是一種廣泛表達於細胞表面的跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族（Johansen and Brown, J. Biol. Chem. 2007）。CD47與其配體信號調節蛋白α（Signal regulatory proteina, SIRPα）相結合從而抑制巨噬細胞的吞噬作用（MatozakiT, et al., Trends Cell Biol. 2009）。已有研究證實，CD47在許多惡性腫瘤中，如急性髓細胞性白血病（AML）、B細胞和T細胞急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等，均呈過表達狀態，向巨噬細胞傳遞「別吃我」（「Don’t eat me」）的信號，藉以逃避免疫監視，且CD47高表達與臨床預後差有關（Willingham et al. Proc Natl Acad Sci USA.2012）。

美國專利申請2009/0191202披露了斯坦福大學的Weissman教授團隊通過對原位免疫缺陷性小鼠異種移植動物模型的實驗發現，抗CD47單克隆抗體的施用能夠抑制大型腫瘤的生長和轉移，而對於小型腫瘤則可以治癒。美國專利申請2016/0251435披露了抗CD47單克隆抗體在腫瘤治療中的應用。專利申請WO2013056352描述了人源化的抗人SIRPα的全長單克隆抗體及其衍生的抗體片段用於血液性腫瘤，尤其是白血病的治療。阻斷CD47-SIRPα信號通路可促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，為腫瘤免疫治療提供新的手段。

本發明提供了識別並結合CD47的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體能夠識別並結合人CD47。本發明的抗體能夠阻止CD47與SIRPα相互作用，並且不會導致血紅血球出現顯著的血凝反應。本發明所提供的抗體統稱為「CD47抗體」。

在一些實施方案中，本發明的CD47抗體表現出多種需要的特性，如通過非限制性實施例的方案特異性識別人或獼猴CD47，有效的阻斷CD47與其配體SIRPα的相互作用，同時不導致顯著的紅血球血凝反應，以及具有有效的抗腫瘤活性。

在一些實施方案中，本發明提供一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合人整合素相關蛋白（CD47）並且包含1、2、3、4、5或6個如下所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中： （a）VH CDR1包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 14的變體，其在SEQ ID NO:14序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （b）VH CDR2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 17的變體，其在SEQ ID NO: 17序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （c）VH CDR3包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 23的變體，其在SEQ ID NO: 23序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （d）VL CDR1包含如SEQ ID NO: 30-31所示的任一氨基酸序列； （e）VL CDR2包含如SEQ ID NO: 32-33所示的任一氨基酸序列；和 （f）VL CDR3包含如SEQ ID NO: 34-35所示的任一氨基酸序列。

在一些實施方案中，本發明提供一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合人整合素相關蛋白（CD47）並且包含1、2、3、4、5或6個如下所述VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中： （a）VH CDR1包含如SEQ ID NO: 14-16所示的任一氨基酸序列； （b）VH CDR2包含如SEQ ID NO: 17-22所示的任一氨基酸序列； （c）VH CDR3包含如SEQ ID NO: 23-29所示的任一氨基酸序列； （d）VL CDR1包含如SEQ ID NO: 30-31所示的任一氨基酸序列； （e）VL CDR2包含如SEQ ID NO: 32-33所示的任一氨基酸序列；和 （f）VL CDR3包含如SEQ ID NO: 34-35所示的任一氨基酸序列。

在一些實施方案中，本發明提供一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合人整合素相關蛋白（CD47）並且包含1、2、3、4、5或6個如下序列： （a）如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR1，或SEQ ID NO: 14的變體，其在SEQ ID NO: 14序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （b）如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2，或SEQ ID NO: 17的變體，其在SEQ ID NO: 17序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （c）如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR3，或SEQ ID NO: 23的變體，其在SEQ ID NO: 23序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （d）如SEQ ID NO: 30-31所示的任一VL CDR1； （e）如SEQ ID NO: 32-33所示的任一VL CDR2；或 （f）如SEQ ID NO: 34-35所示的任一VL CDR3。

在一些實施方案中，本發明提供一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合人整合素相關蛋白（CD47）並且包含： （a）如SEQ ID NO: 14-16所示的任一VH CDR1； （b）如SEQ ID NO: 17-22所示的任一VH CDR2； （c）如SEQ ID NO: 23-29所示的任一VH CDR3； （d）如SEQ ID NO: 30-31所示的任一VL CDR1； （e）如SEQ ID NO: 32-33所示的任一VL CDR2；或 （f）如SEQ ID NO: 34-35所示的任一VL CDR3。 在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11、36-44 、50和56中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 11、36-44 、50和56中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區VL，所述VL包含選自SEQ ID NO: 12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本發明提供一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合人整合素相關蛋白（CD47）並且包含如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR1，如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2，如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR3，如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR1，如SEQ ID NO: 32所示的VL CDR2和如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自以下組中一個或多個根據Kabat編號的氨基酸殘基突變： （a）R81K，和 （b）R82aS。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11和50中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 11和50中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區VL，所述VL包含選自SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO:13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11或50所示的氨基酸序列，所述VL包含選自SEQ ID NO: 13或65所示的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本文CD47抗體特異性識別結合人或獼猴CD47，所述抗體包含選自SEQ ID NO: 11、36-44、50中任一的氨基酸序列的重鏈可變區和/或選自SEQ ID NO: 12、13、45-49、51-55、65中任一的氨基酸序列的輕鏈可變區的抗體。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈H和輕鏈L；所述重鏈H包含選自SEQ ID NO: 60和62-63中任一的氨基酸序列，所述輕鏈L包含選自SEQ ID NO: 61和64中任一的氨基酸序列。

在一些實施方案中，與不存在CD47抗體時，CD47與SIRPα之間的相互作用水準相比，本發明的CD47抗體阻斷了CD47與SIRPα之間至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少99%的相互作用。

在一些實施方案中，所述抗體包含重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區，所述重鏈恒定區包含選自SEQ ID NO: 3或4所示的氨基酸序列，所述輕鏈恒定區包含選自SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

IgG1重鏈恒定區序列（SEQ ID NO: 3）： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

IgG4重鏈恒定區序列（SEQ ID NO: 4）： ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

輕鏈恒定區序列（SEQ ID NO: 5） RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在一些實施方案中，本發明的CD47抗體不會導致顯著的細胞凝集，例如本發明的CD47抗體不會導致顯著的血紅血球血凝反應。在一些實施方案中，如果與現有CD47抗體Hu5F9-G4存在時的凝集水準相比，本發明的CD47抗體存在時的凝集水準下降了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%，則說明本發明的CD47抗體未導致顯著的凝集水準。在一些實施方案中，在抗體濃度介於400pM和800nM之間時，本發明的CD47抗體不會導致顯著的細胞凝集。

在一些實施方案中，與本領域已知的抗體相比，本發明的抗體在腫瘤模型中也顯著有效。例如，本發明的CD47抗體存在時，巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力升高了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是一種IgG同種型，所述IgG同種型選自IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型和IgG4同種型組成的組。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是選自IgG4P和IgG4PE的IgG同種型。其中IgG4P指對IgG4鉸鏈區Ser228位點突變為Pro，防止鏈交換；IgG4PE指對IgG4鉸鏈區Ser228位點突變為Pro，防止鏈交換；對恒定區內的Leu235突變為Glu，改變Fc受體相互作用。

在一些實施方案中，所述抗體是嵌合、人源化或全人源的。在一些實施方案中，所述抗體結合人CD47。

在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段為分離的CD47抗體或抗原結合片段。

在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段為單克隆抗體或其片段。

在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段可應用在製備治療癌症或感染的藥物中。在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段可應用在製備治療固體瘤或者血液瘤的藥物中。在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段可應用在製備治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）、急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、慢性骨髓性白血病（CML）、多發性骨髓瘤（MM）、乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑素瘤、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、膠質瘤、成膠質細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和腎癌的藥物中。在一些實施方案中，本發明的CD47抗體或抗原結合片段可應用在製備治療彌漫大B細胞淋巴瘤或者濾泡型淋巴瘤的藥物中。

在一些實施方案中，本文所述CD47抗體可用於治療、延緩癌症或其他腫瘤病症的進展、避免其復發或緩解其症狀。例如，本文所述CD47抗體可用於治療血液惡性腫瘤和/或腫瘤，例如血液惡性腫瘤和/或腫瘤。例如，本文所述CD47抗體可用於治療CD47⁺ 腫瘤。作為非限制性實施例，本文所述CD47抗體可用於治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）、急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、慢性骨髓性白血病（CML）、多發性骨髓瘤（MM）、乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑素瘤、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、膠質瘤、成膠質細胞瘤等。實體瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和腎癌。例如，本文所述CD47抗體可用於治療彌漫大B細胞淋巴瘤或者濾泡型淋巴瘤。

在本文中，「血液癌症」包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。「白血病」表示一種血液癌症，其製造了過多無法有效對抗感染的白細胞，從而排擠組成血液的其他組分，如血小板和血紅血球。白血病的病例可分為急性或慢性。作為非限制性實施例，白血病可包括急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、慢性骨髓性白血病（CML）、骨髓性增生疾病/腫瘤（MPDS）、和脊髓發育不良綜合征。「淋巴瘤」可包括霍奇金淋巴瘤，無痛性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤（小細胞和大細胞）等。骨髓瘤可包括多發性骨髓瘤（MM）、巨細胞骨髓瘤、重鏈骨髓瘤和輕鏈或本斯-瓊斯骨髓瘤。

本發明的示例性單克隆抗體包括例如本文所述抗體。示例性抗體包括具有選自SEQ ID NO: 11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列的重鏈可變區和選自SEQ ID NO: 12、13、45-49、51-55、65中任一的氨基酸序列的輕鏈可變區的抗體。所述抗體還包括具有與SEQ ID NO: 11、36-44、50和56中的至少一個序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的重鏈可變區和與SEQ ID NO: 12、13、45-49、51-55、65中的至少一個序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的輕鏈可變區的抗體。這些抗體顯示出對人CD47的特異性，且其能夠阻止CD47與SIRPα相互作用，同時不會導致血紅血球出現顯著的血凝反應。

在一些實施方案中，本發明還提供一種生物材料，為

（1）一種多聚核苷酸，其編碼本發明所述抗體或抗原結合片段；或，

（2）一種表達載體，其包含編碼本發明所述抗體或抗原結合片段的多聚核苷酸；或，

（3）一種細胞，其包含編碼本發明所述抗體或抗原結合片段的一種或多種多聚核苷酸。

本發明的藥物組合物可包括本發明的抗體和藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可包括於試劑盒中，如診斷試劑盒。

本發明還提供了通過給予對象其所需的一種或多種結合CD47或其免疫活性片段的單克隆抗體從而緩解癌症或其他腫瘤病症症狀的方法，所述抗體在給藥後不會導致顯著的血紅血球血凝反應。所述抗體的給藥劑量應足夠緩解對象中癌症或其他腫瘤病症症狀。在一些實施方案中，所述對象是人。在一些實施方案中，所述抗體或其免疫活性片段阻止CD47與SIRPα相互作用。

在一些實施方案中，本文所述CD47抗體與一種或多種其它試劑組合聯用。合適的其它試劑包括現有的用於特定應用（如癌症）的藥物和/或手術療法。例如，所述CD47抗體與一種或多種其它化療或抗腫瘤試劑聯用。或者，其它化療劑是放射療法。在一些實施方案中，所述化療劑是細胞死亡誘導劑。在一些實施方案中，所述化療劑誘導跨質膜的磷脂不對稱缺失，例如引起磷脂醯絲氨酸（PS）的細胞表面暴露。在一些實施方案中，所述化療劑誘導內質網（ER）應激。在一些實施方案中，所述化療劑是蛋白酶體抑制劑。在一些實施方案中，所述化療劑誘導ER蛋白移位至細胞表面。在一些實施方案中，所述化療劑誘導鈣網蛋白的移位和細胞表面暴露。

在一些實施方案中，所述CD47抗體和其它試劑被製備為單個治療組合物，並同時給予所述CD47抗體和其它試劑。或者，所述CD47抗體和其它試劑彼此獨立，例如分別製備為獨立的治療組合物，並同時給予所述CD47抗體和其它試劑，或在治療方案期間在不同時間給予所述CD47抗體和其它試劑。例如，在給予其它試劑前給予所述CD47抗體，在給予其它試劑後給予所述CD47抗體，或在以交替的方案給予所述CD47抗體和其它試劑。本文中，以單個劑量或多個劑量給予所述CD47抗體和其它試劑。

在一些實施方案中，提供本發明抗體或抗原結合片段、組合物、生物材料在製備治療癌症或感染的藥物中的應用。

本領域技術人員應理解本發明的抗體有多種用途。例如，本發明的抗體可用作治療劑、用作診斷試劑盒中的試劑或用作診斷工具、或用作競爭實驗中的試劑以生成治療劑。

本發明提供了特異性結合CD47的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體能夠特異性結合人CD47。本文中，這些抗體被統稱作CD47抗體。除非本文中另外說明，否則抗體可變區和恒定區中的氨基酸殘基按照Kabat編號（Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest中的EU索引）。

本文所述抗體的一些特性包括：a）與CD47（如人CD47和獼猴CD47）特異性結合；b）阻斷CD47與SIRPα的相互作用；c）不具有顯著的血細胞凝集活性；d）能夠促進腫瘤細胞被巨噬細胞吞噬；和/或e）在人類癌症的小鼠模型中顯示有效的抗腫瘤活性。

因此，本文所述抗體在治療多種癌症中佔據重要地位。

許多現有的CD47抗體阻斷SIRPα；然而現有的阻斷SIRPα抗體會導致不需要的血凝反應副作用。其他現有的抗體（如2D3）不會引起血凝反應，但這些抗體也不阻斷SIRPα，使得其無法有效地促進吞噬作用。因此，細胞的凝集是使用現有的全IgG抗體治療性靶向CD47的主要限制。因此，人們迫切需要得到能夠阻斷SIRPα同時不導致細胞凝集的CD47抗體。

本發明的CD47抗體避免了不需要的血凝反應，從而增加治療性靶向CD47的效果，並維持阻斷CD47與SIRPα相互作用的能力，從而促進對表達CD47的細胞的吞噬作用。在一些實施方案中，本發明的CD47抗體（例如抗體L12及抗體L12-6等）不會以顯著水準凝集細胞。例如，本發明的CD47抗體不會以顯著水準凝集RBC。

本發明的CD47抗體結合人CD47並阻斷其與SIRPα的相互作用（圖3A-3E）。這些抗體不引起顯著的人紅血球血凝反應（圖4A-4E）。這些抗體能夠促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞（圖6A-6B）。此外，這些CD47抗體在人Raji淋巴瘤的小鼠模型中顯示出有效的抗腫瘤活性（圖9）。因此，本發明的CD47抗體克服了用於治療性靶向CD47的一個主要限制因素。因此，本發明的CD47抗體在治療大量癌症方面至關重要。

本發明的抗體與CD47表位結合的平衡解離常數（KD）小於等於1µM，例如小於等於100 nM，如小於等於10 nM，小於等於1 nM。例如，本文所提供的CD47抗體表現出小於1nM的KD值。

本發明的CD47抗體用於調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或干擾廣泛分佈的CD47的功能活性。CD47的功能活性包括例如通過與SIRPα的相互作用傳導信號、在細胞粘附至細胞外基質後調節（如增加）細胞內鈣離子濃度、與血小板反應蛋白的C端細胞結合結構域相互作用、與血纖蛋白原相互作用以及與多種整聯蛋白相互作用。例如，CD47抗體通過部分或完全地調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或干擾CD47與SIRPα的結合從而完全或部分地抑制CD47的功能活性。

定義

除非另有定義，本發明中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。通常，本文所述的細胞培養、分子生物學以及蛋白質純化使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和細胞培養與轉化（如電穿孔、脂質轉染），使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域公知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual（《分子克隆：實驗室手冊》）（第2版，冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press），紐約冷泉港（1989））。

如本公開中所用，除非另有說明，以下術語應理解為具有以下含義：術語「血紅血球」和「紅血球」是同義詞並可互換使用。

術語「凝聚」表示細胞結塊，而術語「血凝反應」表示特定的一類細胞（即血紅血球）結塊。因此，血凝反應是凝集的一種類型。在本文所述的血細胞凝集測定中，紅血球在給定孔中形成可為「紐扣」、「暈圈」或介於兩者之間的中間體的形式。術語「一條線」是指將96孔板傾斜45°後紅血球團流成一條線狀。術語「顯著的血細胞凝集活性」是指在加入本文所述的抗體時孔中存在任何暈圈形式。

本文所用術語「抗體」指免疫球蛋白（Ig）分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特異性結合抗原（與其免疫反應）的抗原結合位點的分子。「特異性結合」或「發生免疫反應」或「針對」是指抗體與目標抗原的一個或多個抗原決定簇反應且不與其它多肽反應，或者以很低親和力（KD＞10^-6 g/ml）與其它多肽結合。抗體包括但不限於單克隆抗體、嵌合抗體、dAb（結構域抗體）、單鏈抗體、Fab、Fab-和F(ab’)2片段、Fv和Fab表達庫。

已知基本的抗體結構單元包括一個四聚體。每個四聚體（或稱為「全抗」）由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條「輕」鏈（約25kDa）和一條「重」鏈（約50-70kDa）。每條鏈的氨基末端部分包括約100至110個或更多個氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。每條鏈的羧基端部分限定了一個恒定區，主要負責效應子功能。一般來講，從人類獲得的抗體分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意種類，這些由於分子中存在的重鏈的性質而彼此不同。某些種類還具有亞類，諸如IgG1、IgG2、以及其它。此外，在人類中，輕鏈可為κ鏈或λ鏈。

如本文所用，術語「單克隆抗體」（mAb）是指一群這樣的抗體分子：其只含有由獨特的輕鏈基因產物和獨特的重鏈基因產物組成的抗體分子中的一種分子種類。具體地，單克隆抗體的互補決定區（CDR）在該群體的所有分子中是相同的。MAb含有能夠與抗原的特定表位發生免疫反應的抗原結合位點。

術語「單鏈抗體」（scFv）是指由抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）通過15～20個氨基酸的連接短肽（linker）連接而成的抗體。

術語 「抗原結合位點」或「結合部分」指免疫球蛋白分子中參與抗原結合的部分。該抗原結合位點由重（「H」）鏈和輕（「L」）鏈的N端可變（「V」）區的氨基酸殘基形成。重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）中三個高度分化的分支（被稱作「高變區」） 位於較保守的分支（被稱作「框架區」或「FR」）之間。因此，術語「FR」表示免疫球蛋白中在天然情況下存在於高變區之間或鄰近高變區的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中彼此相對排列，以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作「互補決定區」或「CDR」。每個結構域氨基酸的比對可與Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest （National Institutes of Health (1987和1991)或Chothia和Lesk的文章（J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia等, Nature 342:878-883(1989)）的定義一致。

本文所用術語「表位」包括任意能夠特異性結合免疫球蛋白或其片段或T細胞受體的蛋白決定區。表位元決定區通常由分子的化學活性表面基團（如氨基酸或糖側鏈）組成且通常有特定的三維結構性質以及特定的電荷性質。

如本文所用，術語「特異性結合」是指在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白特異的抗原之間發生的非共價相互作用類型。免疫學結合相互作用的強度或親和力可以以相互作用的平衡解離常數（KD）表示，其中較小的KD代表較大的親和力。所選多肽的免疫結合特性可使用本領域熟知方法進行定量。一種此類方法需要測量抗原結合位元點/抗原複合物形成和解離的速率，其中那些速率取決於複合物配偶體的濃度、相互作用的親和力和在兩個方向同等影響該速率的幾何參數。因此，「結合速率常數」（k_on ）和「解離速率常數」（k_off ）兩者可通過計算濃度和實際的締合和解離速率測定。（參見Nature 361:186-87(1993)）。k_off /k_on 比率能夠消除所有與親和力無關的參數，並且等於平衡解離常數KD。（通常參見Davies等人(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473）。特異性結合可由放射性配體結合測定、表面等離子體共振（SPR）、流式細胞術結合測定、或本領域技術人員已知的類似測定所測，當平衡解離常數（KD）≦1 μM（例如小於等於100 nM、小於等於10 nM，又如小於等於1 nM）時，本公開的抗體與CD47特異性結合。

「分離的」抗體是從其天然環境的組分中分離和/或回收的抗體。其天然環境的污染組分是將妨礙抗體的診斷或治療用途的物質，並且可包括酶、激素、以及其它蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施方案中，將所述抗體純化到以下程度：（1）所述抗體按重量百分比計大於 95％，如大於99％，如由Lowry方法所測；（2）通過使用轉杯式測序儀可以獲得N-末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基；或者（3）通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE，使用考馬斯藍或銀染色測出具有同質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。通常，分離的抗體將通過至少一個或多個純化步驟製備。在一些實施方案中，分離的抗體的純度至少為約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%，或這些數值中的任何兩個值之間的範圍（包括終點）或其中任何值。

本文所用術語「多肽」是一個普通術語，表示天然蛋白質、片段或多肽序列的類似物，因此，天然蛋白質片段和類似物是多肽屬中的一種。

術語「序列同一性」或「序列同源性」指的是：在比較窗口中兩個多核苷酸或氨基酸序列是相同的 （即基於核苷酸對核苷酸或殘基對殘基是相同的）。術語「序列同一性百分比」通過如下方式計算：在比較視窗中比較兩個最佳比對的序列，確定在兩個序列中出現相同核酸堿基（例如 A、T、C、G、U或I）或氨基酸殘基的位置的數目以得到匹配的位置的數目，將匹配的位置的數目除以比較視窗中位置的總數目（即視窗尺寸），然後將結果乘以100以得到序列同一性百分比。

如本文所用，二十種常規氨基酸及其縮寫遵循常規用法。參見Immunology-A Synthesis（第2版，E. S. Golub和D. R. Gren編輯, Sinauer Associates, Sunderland 7 Mass. (1991)）。二十種常規氨基酸的立體異構體（例如，D-氨基酸）、非天然氨基酸（諸如α-、α-二取代氨基酸）、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常規氨基酸也可為適用於本公開多肽的組分。非常規氨基酸的示例包括：4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、ε-N,N,N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙醯賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙醯絲氨酸、N-甲醯甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨醯、σ- N-甲基精氨酸及其它類似的氨基酸和亞氨基酸（例如4-羥脯氨酸）。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向為氨基末端方向，並且右手方向為羧基末端方向，與標準用法和慣例一致。常規（或天然）氨基酸包括丙氨酸（三字母代碼：Ala，一字母代碼：A）、精氨酸（Arg，R）、天冬醯胺（Asn，N）、天冬氨酸（Asp，D）、半胱氨酸（Cys，C）、穀氨醯胺（Gln，Q）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、組氨酸（His，H）、異亮氨酸（Ile，I）、亮氨酸（Leu，L）、賴氨酸（Lys，K）、甲硫氨酸（Met，M）、苯丙氨酸（Phe，F）、脯氨酸（Pro，P）、絲氨酸（Ser，S）、蘇氨酸（Thr，T）、色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）和纈氨酸（Val，V）。

類似地，除非另外指明，否則單鏈多核苷酸序列的左手末端是5'端，雙鏈多核苷酸序列的左手方向被稱為5'方向。新生的RNA轉錄物的5’至3’的添加方向被稱為轉錄方向；DNA鏈上與RNA序列相同，且在RNA轉錄物5’端5’的序列區被稱為「上游序列」；DNA鏈上與RNA 序列相同，且在RNA轉錄物3’端3’的序列區被稱為「下游序列」。當應用於多肽時，術語「基本上相同」是指兩個肽序列在諸如通過GAP或BESTFIT程式使用預設空位權重進行最佳比對時，共用至少80％序列同一性，優選至少90％序列同一性，更優選至少95％序列同一性，並最優選至少99％序列同一性。

在一些實施方案中，不相同的殘基位置區別在於保守氨基酸取代。

抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小變化都涵蓋在本公開之內，條件是氨基酸序列的同一性保持至少75％、如至少80％、90％、95％並又如99％。在一些實施方案中，變化為保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其側鏈中相關的氨基酸家族內發生的取代。基因編碼的氨基酸大致分以下類：（1）酸性氨基酸為天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽；（2）鹼性氨基酸為賴氨酸、精氨酸、組氨酸；（3）非極性氨基酸為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）；以及（4）無電荷的極性氨基酸為甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括（i）脂肪族-羥基家族的絲氨酸和蘇氨酸；（ii）含醯胺家族的天冬醯胺和穀氨醯胺；（iii）脂肪族家族的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；以及（iv）芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一些實施方案中，保守氨基酸取代組為：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬醯胺-穀氨醯胺。例如，可以合理地預測用異亮氨酸或纈氨酸單獨的置換亮氨酸，用谷氨酸鹽置換天冬氨酸鹽，用絲氨酸置換蘇氨酸，或用一個結構相關的氨基酸類似的置換一個氨基酸，且對所得分子的結合或特性不會有重要影響，特別是該置換不涉及結合位點內的氨基酸。氨基酸改變是否產生功能性肽可以容易地通過測定多肽衍生物的比活性來確定。所述測定在本文進行了詳細描述。抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物可由本領域普通技術人員容易地製備。

在一些實施方案中，氨基酸取代具有如下效果：（1）降低對蛋白水解作用的敏感性，（2）降低對氧化作用的敏感性，（3）改變用於形成蛋白複合物的結合親和力，（4）改變結合親和力，和（5） 賦予或改進此類類似物的其它物理化學或功能特性。類似物可包括序列不同於天然存在的肽序列的各種突變蛋白。例如，可在天然存在的序列（優選在形成分子間接觸的結構域之外的多肽部分中）中進行單個或多個氨基酸取代（優選保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代不應當顯著改變親本序列的結構特性（例如，置換的氨基酸不應當趨於破壞親本序列中存在的螺旋結構，或破壞表徵親本序列的其它類型二級結構）。人工識別的多肽的二級和三級結構的示例描述於Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編輯, W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C.Branden和J.Tooze編輯, Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。

本文所用術語「試劑」表示化學化合物、化學化合物混合物、生物大分子或由生物材料製得的提取物。

如本文所用，術語「標記」或「經標記的」是指摻入可檢測標記，例如，通過摻入放射性標記的氨基酸，或者附著於可由標記的親和素（例如，含有螢光標記或可由光學方法或量熱法檢測的酶活性的鏈黴親和素）檢測的生物素基部分的多肽。在某些情況下，標記物或標記也可為治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領域已知的並且可以使用。用於多肽的標記物的示例包括但不限於以下項：放射性同位素或放射性核素（例如，³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I），螢光標記物（例如，FITC、羅丹明、鑭系磷光體），酶標記物（例如，辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶），化學發光標記，生物素醯基，被二級報告基因識別的預定多肽表位（例如，亮氨酸拉鍊對序列、二級抗體結合位元點、金屬結合結構域、表位元標籤）。在一些實施方案中，標記通過各種長度的間隔臂連接以減小可能的空間位阻。

術語「藥劑」或「藥物」是指適當施用於患者時能夠誘導期望的治療效果的化合物或組合物。

本文所用術語「抗腫瘤藥」是指具有抑制腫瘤在人體中發展或累進的功能特性的試劑，尤其是惡性（癌性）病變，諸如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制轉移在很多情況下是抗腫瘤藥的特性。

本文中的其它化學術語根據本領域的常規用法使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(《麥格勞-希爾化學術語詞典》) (Parker,S.編輯, 格勞-希爾公司(McGraw-Hill), 三藩市(1985))。

CD47抗體

本發明的抗體具有結合CD47的能力，以抑制SIRPα與CD47的結合，減少CD47-SIRPα介導的信號傳遞，促進吞噬作用並抑制腫瘤生長和/或轉移。例如，可使用本文實施例中描述的細胞實驗確定抑制作用。

本發明的示例性抗體包括抗體17、抗體L12、抗體6Y-G1和抗體6Y-G4等，以及其他的類似的具有相同或者相似CDR區域的抗體。

抗體17的VH CDR有SEQ ID NO: 14（VH CDR1）、SEQ ID NO: 17（VH CDR2）和SEQ ID NO: 23（VH CDR3），VL CDR有SEQ ID NO: 31（VL CDR1）、SEQ ID NO: 33（VL CDR2）和SEQ ID NO: 35（VL CDR3）。VH CDR為重鏈高變區，VL CDR為輕鏈高變區。

在一些實施方案中，本發明在抗體17的基礎上，對其VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3中一個或多個氨基酸位點進行取代。在一些實施方案中VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3的可取代位點（親本）及可被用於取代的氨基酸見表1中的一個或多個。表1中的「位置」表示SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列從左至右數的氨基酸位點；如，位置30，表示SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列從左至右數第30位氨基酸「D」。

表1：重鏈CDR氨基酸取代

結構	位置	親本	可被用於取代的氨基酸
VH CDR 1	30	D	A、G、N、S、T
31	N	D、G、S
33	Y	A、C、D、E、G、S、W
35	S	H、N、R
VH CDR 2	50	Y	A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W
52	Y	A、D、N、S、T
53	Y	C、D、G、N、S
54	S	D、G、N
55	G	S
56	N	A、D、G、S、T
VH CDR 3	98	G	A、C、D、H、P、R、S、Y
99	G	A、C、D、F、H、L、P、R、S、V、Y
100	R	A、C、D、F、G、H、I、L、N、P、S、T、V、Y
101	F	A、C、D、G、H、I、L、N、P、R、S、T、V、Y
102	L	A、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、V、Y
103	E	A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W、Y
104	R	D、G、H

抗體L12和抗體L12-6的VH CDR有SEQ ID NO: 14（VH CDR1）、SEQ ID NO: 17（VH CDR2）和SEQ ID NO: 23（VH CDR3），VL CDR有SEQ ID NO: 30（VL CDR1）、SEQ ID NO: 32（VL CDR2）和SEQ ID NO: 34（VL CDR3）。

經實驗驗證，VH CDR1序列還可以是SEQ ID NO: 15或16。VH CDR2序列還可以是SEQ ID NO:18、19、20、21或22。VH CDR3序列還可以是SEQ ID NO: 24、25、26、27、28或29。其他CDR序列可以通過表1所示的氨基酸替代實現。在一些實施方案中，有1個、2個或者3個氨基酸被取代。

除了CDR的變化外，框架區的氨基酸也可以有適當的改變。比如，相對於抗體L12的重鏈的框架區經過兩個突變（R81K和R82aS）後產生的L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-8-VH或L12-9-VH也是合適的重鏈可變區。在一些實施方案中，CD47抗體的重鏈可變區可以在81位是個K，或者在82a位元是個S（根據Kabat編號）。其他的框架區突變也在不同的抗體序列中體現。因此，本發明提供具有R81K和/或R82aS（根據Kabat編號）突變的重鏈框架區。

本發明的示例性抗體包括含有序列選自SEQ ID NO: 11、36-44、50或56的重鏈可變區和序列選自SEQ ID NO: 12-13、45-49、51-55、65的輕鏈可變區的抗體。特別地，示例性抗體包括抗體17、抗體3-3、抗體3-6、抗體3、抗體6、抗體10、抗體11、抗體16、抗體18、抗體24、抗體25、抗體L1、抗體L2、抗體L5、抗體L12-1-1、抗體L12、抗體L24、抗體L26、抗體L12-1、抗體L12-2、抗體L12-3、抗體L12-4、抗體L12-5、抗體L12-6-1、抗體L12-6、抗體L12-7、抗體L12-8、抗體L12-9、抗體L12-10、抗體L12-11，還有與上述抗體的序列有合適的序列同一性的抗體。比如共用至少80％序列同一性，優選至少90％序列同一性，更優選至少95％序列同一性，並最優選至少99％序列同一性。在有些實施例裡面，這些有同一性的序列至少CDR不會變。

在一些實施方案中，對抗體L12進行人框架適應。在一些實施方案中，抗體L12的VH的框架突變見表3中L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-8-VH或L12-9-VH標記底線的氨基酸。在一些實施方案中，抗體L12的VL框架突變見表3中L12-1-1-VL、L12-1-VL、L12-2-VL、L12-3-VL、L12-4-VL、L12-5-VL、L12-6-1-VL、L12-7-VL、L12-8-VL、L12-9-VL、L12-10-VL或L12-11-VL標記底線的氨基酸。

本發明還包括與本文所述CD47抗體結合同一表位的抗體。例如，本發明的抗體特異性結合包括人CD47上一個或多個氨基酸殘基的表位（參見例如GenBank登錄號Q08722.1）。

下面提供了一種示例性人CD47的ECD氨基酸序列SEQ ID NO: 1 （GenBank登錄號Q08722.1（GI:1171879），其通過引用納入本文）。信號序列（氨基酸1-18）用底線表示。

SEQ ID NO: 1

MWPLVAALLLGSACCGSA QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSP

本文所述抗體調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或以其它方式妨礙CD47-和/或CD47/SIRPα介導的信號傳導的能力可通過包括在本文所述的一種或多種抗體存在下測量CD47-和/或CD47/SIRPα介導的信號傳導等方法評估。這些測定可包括競爭結合測定法或者可測量生物示值讀數，例如促進表達CD47的細胞被巨噬細胞吞噬的能力（如實施例3所述）。

本文所述抗體可使用本領域內已知的各種方法產生（例如，Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E和 Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，以引用方式併入本文）。完全人抗體是輕鏈和重鏈兩者的整個序列（包括CDR）來源於人基因的抗體分子。此類抗體在本文被稱為「人抗體」或「完全人抗體」。人單克隆抗體可通過使用trioma技術，人B細胞雜交瘤技術（參見Kozbor等人, 1983 Immunol Today 4:72），以及EBV雜交瘤技術來製備以產生人單克隆抗體（參見Cole等人, 1985. In: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁）產生。可利用人單克隆抗體並且其可通過使用人雜交瘤（參見Cote等人, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030）或通過用在體外用巴爾病毒（Epstein BarrVirus）轉化人B細胞（參見Cole等人, 1985. In: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁）產生。

抗體可通過公知的技術純化，例如利用蛋白A或蛋白G進行親和層析，其主要提供了免疫血清中的IgG級分。另外，可將免疫球蛋白所靶向的特異抗原或其表位固定於柱上，以通過免疫親和色譜來純化免疫特異性抗體。免疫球蛋白的純化可參考D. Wilkinson的文章（The Scientist，由The Scientist, Inc., Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28 頁）。

本公開的CD47抗體可以為單克隆抗體。調節、阻斷、抑制、減少、拮抗、中和或以其它方式妨礙CD47-和/或CD47/SIRPα介導的細胞信號傳導的單克隆抗體例如通過用如膜結合的和/或可溶的CD47（例如，人CD47或其免疫原性片段、衍生物或變體）免疫動物來產生。另選地，用經包含編碼CD47的核酸分子的載體轉染的細胞免疫動物，由此使得CD47被表達並與轉染細胞的表面相關聯。另選地，通過篩選包含抗體或抗原結合結構域序列的庫獲得抗體以用於與CD47結合。該庫如下製備：在噬菌體中，將與噬菌體外殼蛋白融合的蛋白質或肽的融合體表達於組裝的噬菌體顆粒表面上，並且將編碼的DNA序列整合於噬菌體顆粒之內（即，「噬菌體展示庫」）。然後通過與CD47的結合反應進行篩選。

使用例如雜交瘤方法來製備單克隆抗體，諸如Kohler和Milstein, Nature, 256: 495(1975)所述的那些。在雜交瘤方法中，通常用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物，以引起淋巴細胞，所述淋巴細胞產生或能產生特異性結合免疫劑的抗體。另選地，可將淋巴細胞在體外免疫。

免疫劑通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白。通常，如果需要人源細胞，則使用外周血淋巴細胞，或者如果需要非人哺乳動物源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然後用適合的融合劑，例如聚乙二醇，將淋巴細胞與永生化細胞系融合，以形成雜交瘤細胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986)第 59-103頁)。永生化細胞系通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可在適當的培養基中培養，該培養基優選含有一種或多種抑制未融合的永生化細胞生長或存活的物質。例如，如果親本細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT或HPRT），則雜交瘤的培養基通常包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶（「HAT培養基」），所述物質防止HGPRT-缺陷的細胞生長。

單克隆抗體還可通過重組DNA方法製備，例如美國專利No.4,816,567中所述的那些。編碼本文所述單克隆抗體的DNA可使用常規方法來分離和測序（例如，通過使用能夠與編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）。本文所述雜交瘤細胞充當此類DNA的優選來源。一旦分離後，可以將DNA置入表達載體中，然後將其轉染到宿主細胞例如不另外產生免疫球蛋白的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚胎腎（HEK）293細胞、猿 COS細胞、PER. NS0細胞、SP2/0、YB2/0、或骨髓瘤細胞中，從而在重組宿主細胞中獲得合成的單克隆抗體。DNA也可通過例如用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列取代同源鼠序列（參見美國專利No.4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13(1994)）或者通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價地連接進行修飾。此類非免疫球蛋白多肽能夠取代本文所述抗體的恒定結構域，或者能夠取代本文所述抗體的一個抗原結合位元點的可變結構域以產生嵌合二價抗體。

通過使用本領域技術人員公知的技術可以選擇、構建和培養生產抗體的細胞系。這些技術在各種實驗室手冊和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells, D.L. Hacker, F.M. Wurm, in Reference Module in Life Sciences, 2017，其全部內容包括補充內容通過引用併入全文。

在一些實施方案中，可以按常規方法根據本文所述抗體氨基酸序列設計合成編碼抗體的DNA，將其置入表達載體中，然後轉染宿主細胞，在培養基中培養被轉染的宿主細胞產生單克隆抗體。在一些實施方案中，表達抗體載體包括至少一個啟動子元件，抗體編碼序列，轉錄終止信號和polyA尾。其他元件包括增強子，Kozak序列及插入序列兩側RNA剪接的供體和受體位點。可以通過SV40的前期和後期啟動子，來自逆轉錄病毒的長末端重複序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨細胞病毒的早期啟動子來獲得高效的轉錄，也可應用其它一些細胞的啟動子如肌動蛋白啟動子。合適的表達載體可包括pIRES1neo，pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或者Plncx、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)、pcDNA3.1/Hygro(+/-)、PSVL、PMSG、pRSVcat、pSV2dhfr、pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳動物細胞包括293細胞、Cos1細胞、Cos7細胞、CV1細胞、鼠L細胞和CHO細胞等。

在一些實施方案中，插入基因片段需含有篩選標記，常見的篩選標記包括二氫葉酸還原酶，穀氨醯胺合成酶，新黴素抗性，潮黴素抗性等篩選基因，以便於轉染成功的細胞的篩選分離。將構建好的質粒轉染到無上述基因的宿主細胞，經過選擇性培養基培養，轉染成功的細胞大量生長，產生想要獲得的目的蛋白。

在一些實施方案中，編碼本發明的CD47抗體的DNA序列，可以通過抗體的氨基酸序列結合本領域常規的方法獲得。在一些實施方案中，編碼抗體6Y-G4的重鏈的DNA序列如SEQ ID NO: 57所示，其中，底線部分編碼VH CDR；編碼的抗體6Y-G4重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 60所示。

SEQ ID NO: 57如下： caggtgcagctgcaggagtccggccctggcctggtgaagccttccgagaccctgtccctgacctgtaccgtgagcggcggcagcctggataactattactggagc tggatccggcagcctcctggcaagggcctggagtggatcggctacatctactattccggcaacaccaattacaacccttccctgaagagc cgggtgaccatctccgtggacaccagcaagaaccagtttagcctgaagctgtcctccgtgaccgccgctgataccgccgtgtactactgtgccaggggcggccggttcctggagagatat tggggccagggtaccctcgtgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccttccgtgttccccctggccccctgtagccggtccacctctgagagcaccgctgctctgggctgtctggtgaaggattactttcccgaaccggtgaccgtgtcatggaactccggggctctgacatccggtgtccacacttttcctgcagtgctgcagtcatccggcctgtacagcctgagctctgtggtcacagtcccaagttcatccctgggaaccaagacatatacttgcaacgtggatcataaacccagcaatactaaggtcgacaaacgagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagcacctgagttcctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcctaaagataccctgatgatcagtcggactcccgaggtcacctgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccctgaagtccagttcaactggtacgtggacggcgtcgaagtgcacaatgctaagacaaaacctcgagaggaacagtttaactccacataccgtgtcgtgagcgtcctgactgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaggagtataagtgcaaagtgagcaataagggactgccaagctctatcgagaaaactatttctaaggctaaaggacagcctagggaaccacaggtgtacaccctgccccctagtcaggaggaaatgactaagaaccaggtctcactgacctgtctggtgaaagggttctatccttcagatattgcagtggagtgggaatccaatggtcagccagagaacaattacaagacaactccacccgtgctggacagcgatgggtctttctttctgtattctagactgaccgtggacaaaagtcgctggcaggagggtaatgtcttttcttgtagtgtgatgcacgaagccctgcacaaccactacactcagaaaagcctgtcactgtccctgggtaaa

SEQ ID NO: 60： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

在一些實施方案中，編碼抗體6Y-G4的輕鏈的DNA序列如SEQ ID NO: 58所示，其中，底線部分編碼VL CDR；編碼的抗體6Y-G4輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 61所示。

SEQ ID NO: 58如下： gagatcgtgctgacccagtccccctccagcctgagcgccagcgtgggagaccgggtgaccatcccctgccgggcttccctgtccatcggcagcttcctgaac tggtatcagcagaggcctggcgaggcccctaagctgctgatctttgccgcttccagcctgcggagc ggcgtgcctagcaggttctccggcagcggctccggcaccgatttcaccctgaccatcagcggcctgcagcccgaggatttcgccacctactactgccagcagacctacaccaccccttacacc tttggccagggcaccaaggtggacatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttga

SEQ ID NO: 61： EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在一些實施方案中，抗體6Y-G1重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 62所示。

SEQ ID NO: 62： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在一些實施方案中，抗體6Y-G1輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 61所示。

在一些實施方案中，抗體17重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 63所示。

SEQ ID NO: 63： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在一些實施方案中，抗體17輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 64所示。

SEQ ID NO: 64： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTISCRANQAIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在一些實施方案中，抗體L12重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 63所示。在一些實施方案中，抗體L12輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 61所示。

人抗體和人源化抗體

本文所述抗體包括完全人抗體或人源化抗體。這些抗體適用於給人施用，而不會造成人對所施用的免疫球蛋白產生免疫應答。

CD47抗體例如通過噬菌體展示方法使用僅包含人序列的抗體來產生。此類方法在本領域中為人們所熟知，例如WO92/01047和美國專利No.6,521,404。在該方法中，使用天然或重組CD47來源或其片段來篩選攜帶有隨機的輕鏈和重鏈對的噬菌體的組合庫。在另一種方法中，CD47抗體可通過這樣的方法產生：至少一個方法步驟包括用人CD47蛋白質免疫轉基因非人動物。在此類方法中，一些轉基因的非人動物的內源性重鏈和/或k輕鏈基因座中已失效，並且不能發生產生編碼響應於抗原的免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一個人重鏈基因座和至少一個人輕鏈基因座已被穩定轉染到動物中。因此，回應於所施用的抗原，人基因座重排以提供編碼對抗原具有免疫特異性的人可變區的基因。因此，在免疫時，轉基因鼠產生分泌完全人免疫球蛋白的B細胞。

免疫原性降低的抗體的產生也使用適當的庫經由人源化技術、嵌合化技術和展示技術來實現。應當理解，鼠抗體或來自於其它物種的抗體可使用本領域熟知的技術人源化或靈長類源化。參見例如Winter和Harris Immunol Today 14:43 46(1993)以及Wright等人Crit. Reviews in Immunol. 12125-168(1992)。所關注的抗體可通過重組DNA技術進行工程化改造，以用相應的人序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈結構域和/或骨架結構域（參見WO 92102190和美國專利No.5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；和5, 777,085）。將Ig cDNA用於構建嵌合免疫球蛋白基因也為本領域已知的（Liu等人 P.N.A.S. 84:3439 (1987)和J. Immunol. 139:3521 (1987)）。mRNA從產生抗體的雜交瘤或其它細胞中分離出並用於產生cDNA。所關注的cDNA可使用特異性引物通過聚合酶鏈反應來擴增（美國專利4,683,195和4,683,202）。另選地，構建並篩選庫以分離所關注的序列。然後將編碼抗體可變區的DNA序列與人恒定區序列融合。人恒定區基因的序列可見於Kabat等人發表的 Sequences of Proteins of immunological Interest （N.I.H. publication no.91-3242 (1991)）。人C區基因可容易地從已知克隆中獲得。同種型的選擇將根據所期望的效應子功能，例如補體結合或抗體依賴性細胞毒性的活性來指導。優選的同種型為IgG1和IgG2。可使用任一種人輕鏈恒定區，即k或λ，然後通過常規方法表達嵌合人源化抗體。

在一些實施方案中，抗體片段如Fv、F(ab’)2和Fab可通過裂解完整的蛋白質來製備，例如通過蛋白酶或者化學裂解。包括但不限於：（i）用胃蛋白酶消化抗體分子得到F(ab’)2片段；（ii）通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵得到Fab片段；（iii）用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子生成Fab片段，以及 （iv）Fv片段。

重鏈和輕鏈的一致性序列J區可用於設計用作引物的寡核苷酸，以便在J區內引入有用的限制性位點，用於隨後將V區片段連接於人C區片段。C區cDNA可通過定點誘變修飾，以在人序列的類似位置放置一個限制性位點。

本文所述CD47抗體可以由包含編碼上述抗體的DNA片段的載體表達。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、YAC、EBV衍生的附加體等等。合適的載體通常是這樣一種載體，它編碼功能完整的人的重鏈恒定區（CH）或輕鏈恒定區（CL）免疫球蛋白序列，並帶有適當的限制性位點，使得任何VH或VL序列可以被容易地插入和表達。在此類載體中，剪接通常發生在被插入的J區中的剪接供體位元點與人C區域前面的剪接受體位元點之間，並且還發生在人CH外顯子內存在的剪接區域處。聚腺苷酸化和轉錄終止發生在編碼區下游的天然染色體位點處。所得的嵌合抗體可以連接於任何強啟動子，包括逆轉錄病毒LTR，例如SV-40早期啟動子 (Okayama等人Mol. Cell. Bio. 3:280(1983))、勞氏（Rous）肉瘤病毒LTR(Gorman等人 P.N.A.S. 79:6777(1982))和莫洛尼氏（moloney）鼠白血病病毒LTR（Grosschedl等人Cell 41:885 (1985)）。另外，可使用天然Ig啟動子等。

Fc修飾

本文所述抗體的有關效應子功能可以被修飾，以提高例如抗體在治療與異常CD47信號傳導相關的疾病和障礙中的有效性。例如，可將一個或多個突變引入到抗體的Fc區中，從而沉默效應子功能，由此減小殺死正常細胞的可能。

在一些實施方案中，本文所述的抗體是IgG同種型。在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG1同種型，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，對人IgG1恒定區上的氨基酸Asn297（Kabat編號）進行修飾以避免抗體的糖基化，例如Asn297Ala（N297A）。在一些實施方案中，對抗體恒定區上的氨基酸Leu235（Kabat編號）進行修飾以改變Fc 受體相互作用，例如Leu235Glu（L235E）或Leu235Ala（L235A）。在一些實施方案中，對抗體恒定區上的氨基酸Leu234（Kabat編號）進行修飾以改變Fc 受體相互作用，例如Leu234Ala（L234A）。在一些實施方案中，對抗體恒定區上的氨基酸234和235同時進行修飾，例如Leu234Ala和Leu235Ala （L234A/L235A）（Kabat等, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest中的EU索引）。

在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG4同種型，具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。

在一些實施方案中，對人IgG4恒定區內的鉸鏈區進行修飾以避免或減少鏈交換，例如Ser228Pro（S228P）。在其他實施方案中，對人IgG4恒定區上的氨基酸235進行修飾以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu（L235E）。在一些實施方案中，對人IgG4恒定區內的鉸鏈區和氨基酸235進行修飾，例如 Ser228Pro和Leu235Glu（S228P/L235E）。在一些實施方案中，對人IgG4恒定區上的氨基酸Asn297（加框，Kabat編號）進行修飾以避免抗體的糖基化，例如 Asn297Ala（N297A）。在一些實施方案中，對人IgG4恒定區上的氨基酸Ser228、 Leu235和Asn297進行修飾（例如S228P/L235E/N297A）。

針對CD47的抗體的使用

在一些實施方案中，包括本發明的CD47抗體可用於診斷、預後、監控、治療、緩和和/或預防對象中異常 CD47表達、活性和/或信號轉導相關的疾病或病變。通過使用標準方法鑒定患有異常CD47表達、活性和/或信號轉導相關的疾病或病症（如癌症或其他腫瘤病症），或有疾病發展風險的對象（如人類患者），可實施治療方案。在一些實施方案中，提供治療涉及異常的CD47表達、活性和/或信號轉導的疾病或病症的方法，包括給予需要治療該疾病或病症的對象有效量的一種本文所述抗體或其製劑。抗體的給藥可消除或抑制或干擾靶標（如 CD47）的表達、活性和/或信號轉導功能。抗體的給藥可消除或抑制或干擾靶標（如CD47）與其天然狀態下結合的內源性配體（如SIRPα）的結合。例如，抗體與靶標結合並調節、阻斷、抑制、降低、拮抗、中和或干擾CD47的表達、活性和/或信號轉導。

在一些實施方案中，涉及異常的CD47表達、活性和/或信號轉導的疾病或病症包括血液癌症和/或固體腫瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些實施方案中，白血病的某些形式包括急性淋巴細胞性白血病（ALL）；急性骨髓性白血病（AML）；慢性淋巴細胞性白血病（CLL）；慢性骨髓性白血病 （CML）；骨髓性增生疾病/腫瘤（MPDS）；和脊髓發育不良綜合征。在一些實施方案中，淋巴瘤的某些形式包括霍奇金淋巴瘤、無痛性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤（小細胞和大細胞）。在一些實施方案中，骨髓瘤的某些形式包括多發性骨髓瘤（MM）、巨細胞骨髓瘤、重鏈骨髓瘤和輕鏈或本斯-瓊斯骨髓瘤。實體瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和腎癌。

癌症和其他腫瘤病症相關的症狀包括例如炎症、發熱、全身不適、發熱、疼痛、局部區域經常性發炎（often localized to the inflamed area）、食欲下降、體重下降、水腫、頭痛、疲勞、皮疹、貧血、肌無力、肌肉疲勞和腹部症狀（例如腹痛、腹瀉或便秘）。

本發明的抗體的治療有效量通常涉及達到治療目標所需的量。給藥所需的量取決於抗體對其特異抗原的結合親和力，疾病、紊亂或病症的嚴重程度、給藥途徑、在接受給藥的對象中給予的抗體從自由體積耗盡的速率等。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的常見範圍為從約0.1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施方案中，以約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約50 mg/kg、約75 mg/kg、約100 mg/kg或更高或這些數值中的任何兩個值之間的範圍（包括終點）的劑量將本發明的抗體給予對象。常見的劑量頻率範圍是例如每天一次至每週一次。

在另一些實施方案中，針對CD47的抗體可用於本領域中已知的與CD47定位和/或定量相關的方法（例如，用於測定適當生理樣品中的CD47和/或CD47和SIRPα兩者的水準，用於診斷方法，用於蛋白成像等等）。在一個給定實施方案中，對CD47或其衍生物、片段、類似物或同系物具有特異性的、包含源於抗體的抗原結合結構域的抗體，被用作藥物學活性化合物（下文稱為「治療劑」）。

在另一些實施方案中，可通過標準技術例如免疫親和、色譜或免疫沉澱，使用對 CD47具有特異性的抗體來分離CD47多肽。針對CD47蛋白質的抗體（或其片段）可用於檢測生物樣品中的蛋白質。在一些實施方案中，在生物樣品中可檢測CD47作為臨床測試過程的一部分，例如，用於確定給定治療方案的功效。將抗體偶聯（即物理連接）到可檢測物質可有利於檢測。可檢測物質的示例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性材料。合適的酶的示例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的示例包括鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素；合適的螢光材料的示例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪氨螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料的一個示例包括魯米諾；生物發光材料的示例包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白，並且合適放射性材料的示例包括¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S或³ H。

在另一些實施方案中，本公開的抗體可用作檢測樣品中CD47和/或CD47和 SIRPα蛋白質兩者（或其蛋白質片段）存在的試劑。在一些實施方案中，抗體包含可檢測標記。抗體為多克隆抗體，或更優選單克隆抗體。使用完整的抗體或其片段（例如Fab、scFv或F （ab'）2）。所述實施方案的檢測方法可用於在體外及體內檢測生物樣品中的分析物mRNA、蛋白質或基因組DNA。例如，分析物mRNA體外檢測技術包括Norhtern雜交和原位雜交。分析物蛋白質體外檢測技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、Western印跡、免疫沉澱、以及免疫螢光。分析物基因組DNA 體外檢測技術包括Southern雜交。（ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology, 第42卷, J. R. Crowther Human Press, Totowa, N. J., 1995; Immunoassay, E. Diamandis和T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985）。此外，分析物蛋白質的體內檢測技術包括向受試者體內導入標記的抗分析物蛋白抗體。例如，可以用放射性標記標記抗體，然後可以通過標準成像技術檢測受試者體內該放射性標記物的存在和位置。

CD47抗體的治療性施用和製劑

可將本文所述抗體和其衍生物、片段、類似物和同系物摻入適於施用的藥物組合物中。製備此類組合物所涉及的原理和考慮事項以及選擇組分的指南在本領域中是熟知的，例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy, 第19版, Mack Pub. Co., Easton, Pa. :1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; Peptide And Protein Drug Delivery , Advances In Parenteral Sciences, 第4卷, 1991, M. Dekker, New York。

此類組合物通常包含抗體和藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，使用抗體片段為與靶蛋白結合結構域特異性結合的最小抑制片段。如，基於抗體的可變區序列並保留結合靶蛋白質序列能力的肽。

如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」旨在包括與藥物給藥相容的任何和所有溶劑、穩定劑、緩衝劑、分散介質、包衣、抑菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。合適載體描述於最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中。此類載體或稀釋劑可選擇包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%的人血清白蛋白。

待用於體內施用的製劑必須為無菌的。這可通過無菌濾膜過濾容易地實現。

所述實施方案的藥物組合物通常與其預期施用途徑相容。給藥途徑的示例包括腸胃外，例如靜脈內、皮內、皮下、經口（例如吸入）、經皮（即局部的）、經粘膜和直腸給藥。藥物組合物可包括以下組分中的一種或多種：注射用無菌稀釋劑，例如水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇類、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抑菌劑，例如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸（EDTA）；緩衝劑，例如組氨酸鹽酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；滲透壓調節劑，例如氯化鈉或右旋糖；穩定劑，例如精氨酸、甲硫氨酸、海藻糖、蔗糖、山梨醇；表面活性劑，例如吐溫20、吐溫80。pH可用酸或堿進行調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。可將藥物組合物包裝在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑膠制多劑量小瓶內。在一些實施方案中，適於注射用途的藥物組合物包括無菌水性溶液（在此是水溶性的）或分散體以及用於即時製備無菌注射液或分散體的無菌粉末。使用時，組合物必須是無菌的並且應當為流動性達到易於注射的程度。其在製造和儲存條件下必須是穩定的並且必須能防止微生物例如細菌和真菌的污染作用。注射用組合物的延長吸收可通過在所述組合物中包含延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來達到。

對於經粘膜或透皮給藥，在製劑中使用適於滲透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常在本領域是通常所知的，並且包括如用於經粘膜給藥的去污劑、膽鹽和夫西地酸衍生物。經粘膜給藥可以通過使用噴鼻劑或栓劑來實現。對於透皮給藥，可將一種或多種所述抗體配製成如本領域通常所知的膏劑、軟膏、凝膠、或霜膏。

藥物組合物以劑量單位形式配製，易於施用，劑量均勻。如本文所用，劑量單位形式是指用於待治療的受試者，適合作為單位劑量的物理上可分離的單位；每個單位含有經計算與所需藥物載體結合產生期望治療效果的預定量的一種或多種所述抗體。

所述藥物組合物可放於容器或分配器中，並與給藥說明書一起包裝。

本文所述藥物組合物還可根據要治療的具體情況而包含其它活性成分，優選具有互補活性但對彼此無負面影響的那些。在一些實施方案中，組合物可包含增強其功能的試劑，諸如細胞毒素試劑、細胞因數、化學治療劑、或生長抑制劑。此類活性成分以對預期目的有效的量適當地聯合存在。

在一個實施方案中，包括CD47抗體的一種或多種活性成分可在聯合治療中施用，即與其它試劑例如治療劑（例如一種或多種細胞因數和生長因數抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、和/或細胞毒素或細胞生長抑制劑等）聯合。術語「聯合」在本文中是指將試劑基本上同步地、同時地或順次地給予。在一些實施方案中，此類聯合治療可有利地利用較低劑量的施用的治療劑，因而避免了與各種單一療法相關的可能毒性或併發症。

在一些實施方案中，本文所述抗體被用作針對自身免疫性障礙、炎性疾病等的疫苗佐劑。疫苗可以是各種各樣的抗原。所述抗原來自於所靶向的自體抗原，即參與自身免疫的自身抗原，例如髓磷脂鹼性蛋白；炎性自體抗原，例如澱粉狀肽蛋白、或移植抗原，例如同種抗原。抗原可包括衍生自蛋白質的肽或多肽以及以下任一項的片段：糖、蛋白質、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、澱粉樣肽蛋白、移植抗原、過敏原或其它大分子組分。在一些實施方案中，多於一種抗原被包含在抗原性組合物中。

本文對出版物和專利文獻的引用並不表示承認上述任何內容是相關的在先技術，也並不表示承認其內容或日期。現在，本發明已以書面說明書方式描述，本領域技術人員應認識到可以多種實施方式實踐本發明，而上文的說明書和下文的實施例旨在說明而非限制本發明的請求項。本文中引用的所有出版物，專利，和專利申請全部內容通過參考併入本文用於所有目的。

實施例

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑或已知方法得到。在以下實施例中，抗體L12-6與抗體6Y-G1為相同的抗體。

CHO-CD47細胞構建流程：設計HindIII/ EcoRI視窗將編碼CD47（序列見Uniprot，Q08722）的多聚核酸導入pcDNA3.1(+)（Invitrogen，V790-20）質粒中，並通過PvuI單切轉染CHO細胞（ATCC#CCL-61），篩選獲得穩定CHO-CD47細胞株。

Jurkat細胞購自中國科學院上海細胞庫，貨號為Clone E6-1。

IgG抗體購自BioXCell，貨號為BE0297。

獼猴CD47-Fc購自Creative BioMart，型號為CD47-745C。

實施例1：CD47抗原的製備

CD47抗原製備：在人CD47細胞外結構域（ECD）蛋白質（SEQ ID NO: 1）C-末端添加6×HIS標籤（HHHHHH, SEQ ID NO: 2）或者人Fc（SEQ ID NO: 3中帶底線部分）（參照R&D系統）構建成CD47重組蛋白。人CD47的ECD區分別與6×HIS或Fc通過基因合成並亞克隆到哺乳動物的表達載體pcDNA3.1(+)（Invitrogen，V790-20）中。在暫態轉染HEK293F細胞之後，獲得基於鎳的固定化金屬親和層析純化的His-標記的人CD47-ECD蛋白質（CD47-His）和經由固定化金屬親和層析（IMAC）使用proteinA柱（GE Healthcare）純化分泌的Fc-標記的人CD47-ECD蛋白質（CD47-Fc）。

實施例2：CD47抗體的製備

30種單鏈抗體（scFv）的VH和VL的組合見表2，由VH的C端和VL的N端通過序列如SEQ ID NO: 10所示（GGGGSGGGGSGGGGS）的連接短肽連接；抗體的重鏈可變區用抗體編號+「-VH」表示，如17-VH；抗體的輕鏈可變區用抗體編號+「-VL」表示，如17-VL；單鏈抗體（scFv）用抗體編號+「-ScFv」表示，如17-ScFv（由17-VH(如SED ID NO: 11所示)的C端和17-VL(如SED ID NO: 12所示)的N端通過如SEQ ID NO: 10所示的連接短肽連接，得到17-ScFv）。

30種IgG1全抗的VH和VL的組合見表2；VH與CH組成抗體的重鏈，VL和CL組成抗體的輕鏈；CH的序列如SED ID NO: 3，CL的序列如SED ID NO: 5所示；抗體的重鏈可變區用抗體編號+「-VH」表示，如17-VH；抗體的輕鏈可變區用抗體編號+「-VL」表示，如17-VL；IgG1全抗用「抗體」+抗體編號表示，如抗體17（抗體重鏈由17-VH(如SED ID NO: 11所示)和如SED ID NO: 3所示的CH組成，抗體輕鏈由17-VL(如SED ID NO: 12所示)和如SED ID NO: 5所示的CL組成）。

抗體6Y-G4重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 60所示，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 61所示。

表2對應的VH和VL序列見表3，其中，重鏈CDR見表4，輕鏈CDR見表5。

採用常規的技術手段對質粒pcDNA3.1(+)（Invitrogen，V790-20）進行改造，使其載有編碼上述氨基酸序列的DNA序列。再將質粒暫態轉染HEK293F細胞，使HEK293F細胞表達上述氨基酸序列的抗體。使用proteinA柱（GE Healthcare）經由固定化金屬親和層析（IMAC）純化得到CD47抗體，測序後與預期序列一致，用於生物活性鑒定。 表2：抗體的可變區組合

抗體編號	重鏈可變區（VH） SEQ ID NO:	輕鏈可變區（VL） SEQ ID NO:
17	11	12
3-3	36	12
3-6	37	12
3	38	12
6	39	12
10	40	12
11	56	12
16	41	12
18	42	12
24	43	12
25	44	12
L1	11	45
L2	11	46
L5	11	47
L12-1-1	11	13
L12	11	65
L24	11	48
L26	11	49
L12-1	50	54
L12-2	50	51
L12-3	50	53
L12-4	11	52
L12-5	11	54
L12-6-1	50	13
L12-6	50	65
L12-7	11	53
L12-8	50	52
L12-9	50	55
L12-10	11	51
L12-11	11	55

表3：抗體可變區序列

名稱	序列	SEQ ID NO:
17-VH\L1-VH\L2-VH\L5-VH\ L12-1-1-VH \L12-VH\L24-VH\L26-VH\L12-4-VH\L12-5-VH\L12-7-VH\L12-10-VH\L12-11-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSS	11
3-3-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFGGYWGQGTLVTVSS	36
3-6-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFAGYWGQGTLVTVSS	37
3-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDGYYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSTTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFAGYWGQGTLVTVSS	38
6-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLNDYYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNGDTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRILAGYWGQGTLVTVSS	39
10-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRILAGYWGQGTLVTVSS	40
11-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDGYYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYDGSGTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFGGYWGQGTLVTVSS	56
16-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFSGYWGQGTLVTVSS	41
18-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGRGIFGYWGQGTLVTVSS	42
24-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGDSATNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFSGYWGQGTLVTVSS	43
25-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLRSVTAADTAVYYCARGGRIFGHWGQGTLVTVSS	44
17-VL\3-3-VL\3-6-VL\3-VL\6-VL\10-VL\11-VL\16-VL\18-VL\24-VL\25-VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTISCRANQAIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPLTFGGGTKLEIK	12
L1-VL	EIVLTQSPSTLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVEIK	45
L2-VL	DIVMTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGPGTRLDIK	46
L5-VL	EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGPGTRLEIK	47
L12-1-1-VL\L12-6-1-VL	EIVLTQPPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVDIK	13
L12-VL\L12-6-VL	EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVDIK	65
L24-VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVEIK	48
L26-VL	EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKLEIK	49
L12-1-VH\L12-2-VH\L12-3-VH\L12-6-1-VH\L12-6-VH\L12-8-VH\L12-9-VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSLDNYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK LS SVTAADTAVYYCARGGRFLERYWGQGTLVTVSS	50
L12-2-VL\L12-10-VL	EIVLTQS PSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQRPGEAPKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVE IK	51
L12-4-VL\L12-8-VL	EIVLTQS PSSLSASVGDRVTIPCRASLSIGSFLNWYQQK PGK APKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVE IK	52
L12-3-VL\L12-7-VL	EIVLTQS PSSLSASVGDRVTIT CRASLSIGSFLNWYQQK PGK APKLLIFAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVE IK	53
L12-1-VL\L12-5-VL	EIVLTQS PSSLSASVGDRVTIT CRASLSIGSFLNWYQQK PGK APKLLIY AASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVE IK	54
L12-9-VL\L12-11-VL	DIQMTQS PSSLSASVGDRVTIT CRASLSIGSFLNWYQQK PGK APKLLIY AASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTTPYTFGQGTKVE IK	55

表4：抗體VH CDR

名稱	VH CDR1	SEQ ID NO:	VH CDR2	SEQ ID NO:	VH CDR3	SEQ ID NO:
17-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
3-3-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRIFGGY	24
3-6-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRIFAGY	25
3-VH	DGYYWS	15	RIYGNSTTNYNPSLKS	18	GGRIFAGY	25
6-VH	NDYYWS	16	RIYGNGDTNYNPSLKS	19	GGRILAGY	26
10-VH	DNYYWS	14	RIYYNGNTNYNPSLKS	20	GGRILAGY	26
11-VH	DGYYWS	15	RIYDGSGTNYNPSLKS	22	GGRIFGGY	24
16-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRIFSGY	27
18-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GRGIF GY	28
24-VH	DNYYWS	14	RIYGDSATNYNPSLKS	21	GGRIFSGY	27
25-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRIFGH	29
L1-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L2-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L5-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L12-1-1-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L12-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L24-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L26-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23
L12X-VH	DNYYWS	14	YIYYSGNTNYNPSLKS	17	GGRFLERY	23

注：L12X-VH代表L12-1-VH、L12-2-VH、L12-3-VH、L12-4-VH、L12-5-VH、L12-6-1-VH、L12-6-VH、L12-7-VH、L12-8-VH、L12-9-VH、L12-10-VH或L12-11-VH 表5：抗體VL CDR

名稱	VL CDR1	SEQ ID NO:	VL CDR2	SEQ ID NO:	VL CDR3	SEQ ID NO:
17-VL	RANQAIGTWLA	31	AASTLQS	33	QQYYTTPLT	35
X-VL	RANQAIGTWLA	31	AASTLQS	33	QQYYTTPLT	35
L1-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L2-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L5-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L12-1-1-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L12-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L24-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L26-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34
L12X-VL	RASLSIGSFLN	30	AASSLRS	32	QQTYTTPYT	34

注：X-VL代表3-3-VL、3-6-VL、3-VL、6-VL、10-VL、11-VL、16-VL、18-VL、24-VL或25-VL；L12X-VL代表L12-1-VL、L12-2-VL、L12-3-VL、L12-4-VL、L12-5-VL、L12-6-1-VL、L12-6-VL、L12-7-VL、L12-8-VL、L12-9-VL、L12-10-VL或L12-11-VL。

對於目標細胞清除而言，抗體（如CD47抗體）的主要Fc依賴性功能是 C1q與Fc區結合起始的補體依賴的細胞毒性（CDC）；Fc區與免疫效應細胞（如 NK細胞和嗜中性粒細胞）上的Fcγ受體（FcγR）主要FcγRIIIa相互作用介導的抗體依賴的細胞毒性（ADCC）；以及由巨噬細胞經由FcγRI識別視蛋白化目標細胞進行的抗體依賴的細胞吞噬作用（ADCP）。各抗體亞類在介導Fc依賴性效應活性的能力方面具有差異。在人中，IgG1和IgG3亞類由於結合C1q而對 CDC具有高效力。此外，IgG1亞類對FcγR具有最高親和力且因此在ADCC和 Fc依賴性ADCP方面最有效。IgG4亞類不具有C1q結合能力且具有大幅下降的FcγR結合親和力且因此具有顯著減弱的效應功能。

根據抗體6Y-G1製備具有突變S228P以穩定抗體的鉸鏈區的IgG4P亞類抗體6Y-G4（將6Y-G1中如SEQ ID NO: 3所示的CH替換成如SEQ ID NO: 4所示的CH，其它序列不變），進一步減弱抗體Fc效應。

將17-ScFv的製備作為一個示例，本發明製備ScFv的方法如下：

利用限制性內切酶Hin d III/Eco RI 將編碼17-ScFv的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 59所示）連接至pcDNA3.1(+)質粒載體中。再將質粒載體暫態轉染HEK293F細胞，使HEK293F細胞表達上述氨基酸序列的抗體。使用proteinA柱經由固定化金屬親和層析（IMAC）純化得到17-ScFv抗體，測序後與預期序列一致。

其它ScFv用類似方法製備純化，測序後與預期序列一致。

SEQ ID NO: 59的序列如下： caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccctcgataattactactggagctggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattggatatatctattacagtgggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccagttctcgttgaggctgaggtctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgagaggagggcgatttttggaacgttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatctcttgtcgggcgaatcaggctattggcacttggttagcctggtatcagcaaaagccaggaaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatactactcccctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaa

實施例3：CD47抗體的生物活性

1、FACS檢測17-ScFv的結合活性

驗證17-ScFv 與CHO-CD47或者Jurkat細胞表面的CD47結合的活性（圖1A-1B）。結合的活性實驗操作如下：

17-ScFv及Hu5F9-G4抗體（Hu5F9-G4的重鏈由如SEQ ID NO: 8所示的可變區和如SEQ ID NO: 4所示的恒定區組成，輕鏈由如SEQ ID NO: 9所示的可變區和如SEQ ID NO: 5所示的恒定區組成）用PBS稀釋不同濃度（20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.02、0.01 μg/ml）與CHO-CD47或Jurkat細胞表面CD47 4℃孵育30 min，PBS洗一遍；加入Goat anti-human IgG Fc-PE（eBioscience，貨號：2183639）螢光二抗，4℃孵育15 min，PBS洗兩遍；上流式機檢測PE-A 平均螢光信號值。圖1A-1B表明17-ScFv能劑量依賴性地結合細胞表面CD47。

2、SIRP-α阻斷活性

採用FACS技術檢測17-ScFv阻斷SIRPa結合CHO-CD47細胞表面CD47能力，17-ScFv抗體用PBS稀釋不同濃度（160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml），Hu5F9-G4及IgG抗體（用PBS稀釋不同濃度40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μg/ml）與CHO-CD47細胞表面CD47 4℃孵育30 min，PBS洗一遍；加入SIRPα-Fc-Bio（6.5 μg/ml），4℃孵育15 min，PBS洗一遍；再加入Streptavidin PE（eBioscience，貨號：1992345）螢光二抗，4℃孵育15 min，PBS洗兩遍；上流式機檢測PE-A 平均螢光信號值。圖2示出17-ScFv能劑量依賴性地抑制SIRPα結合細胞表面CD47。

採用ELISA競爭法，17-ScFv或者18種抗體（抗體3、抗體3-3、抗體3-6、抗體6、抗體10、抗體11、抗體16、抗體18、抗體24、抗體25、抗體L12、抗體L1、抗體L5、抗體L24、抗體L26、抗體17、抗體6Y-G1、抗體6Y-G4）、陽性對照（抗體Hu5F9-G4）和陰性對照（抗體IgG）用PBS稀釋不同濃度（12、6、3、2、1.5、1.2、0.75、0.375、0.188、0.094 μg/ml）與包被在ELISA板上的CD47-His（2 μg/ml）抗原室溫孵育1小時，PBST洗四遍，再加入SIRPα-Fc-Bio（0.1 μg/ml）（參考Thermo Scientific EZ-Link^® NHS-Biotin Reagents試劑盒製備）配體與CD47-His抗原室溫孵育1小時，PBST洗四遍。結合的SIRPα-Fc-Bio與HRP-綴合的鏈黴親和素二抗產生化學發光反應，並通過讀板機檢測OD450值，根據OD450值換算出抗體的IC₅₀ ，從而判斷抗體的SIRPα阻斷活性。圖3A-3E示出所測抗體都展示出SIRPα與CD47抗原結合的劑量依賴性抑制。

3、血紅血球凝集測定

檢測CD47抗體的紅血球凝集反應。從健康人供體中採集5 ml新鮮血液至含肝素鈉的抗凝管中，先用淋巴細胞分離液分離PBMC（另作他用），再取管底1 ml紅血球至6 ml生理鹽水中，反復清洗，2000 rpm，離心5 min，清洗至上清無明顯紅色，然後用生理鹽水重懸製成2%的紅血球懸浮液。在室溫下，將50 μl用PBS連續2倍稀釋（最高濃度800 nM，共12個梯度）的CD47抗體與50 μl的2%的紅血球懸浮液混勻加至96孔U型板中孵育4小時，隨後評估抗體紅血球凝集情況，將96孔U型板傾斜45°，觀察紅血球團的流向，如果呈「一字型」，說明紅血球沒有發生凝集。大部分測試的CD47抗體在高濃度情況下誘導紅血球凝集（抗體17會有明顯的紅血球凝聚），在6 nM左右不會引起紅血球凝集，其中抗體L12、抗體6Y-G1（即抗體L12-6）、抗體6Y-G4不會引起任何的紅血球凝集反應（圖4A-4E）。陽性對照抗體Hu5F9-G4會引起紅血球凝集，AB6.12-G1以及配體SIRPα不會引起紅血球凝集。AB6.12-G1的重鏈由如SEQ ID NO: 6所示的可變區和如SEQ ID NO: 3所示的恒定區組成，輕鏈由如SEQ ID NO: 7所示的可變區和如SEQ ID NO: 5所示的恒定區組成。Hu5F9-G4的重鏈由如SEQ ID NO: 8所示的可變區和如SEQ ID NO: 4所示的恒定區組成，輕鏈由如SEQ ID NO: 9所示的可變區和如SEQ ID NO: 5所示的恒定區組成。見表6。 表6：陽性抗體序列表

名稱	SEQ ID NO:	序列
AB6.12-G1 重鏈可變區	6	QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTEYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSS
AB6.12-G1 輕鏈可變區	7	NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK
Hu5F9-G4 重鏈可變區	8	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
Hu5F9-G4 輕鏈可變區	9	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK

4、CD47結合測定（ELISA）：

通過ELISA法測定CD47抗體與人CD47及獼猴CD47的結合活性。抗體17、抗體L12、抗體6Y-G1、抗體6Y-G4及抗體Hu5F9-G4從5 μg/ml開始用PBS 3倍稀釋8個濃度後與包被在ELISA板上的人或獼猴CD47-Fc（2 μg/ml）抗原室溫孵育1小時，PBST洗四遍，再加入HRP-anti-kappa（1:10000，sigma）二抗與抗體室溫孵育1小時，PBST洗四遍。結合的HRP-anti-kappa與TMB底物產生化學發光反應，並通過讀板機檢測OD450值，根據OD450值換算出抗體的EC₅₀ ，從而判斷抗體與人或獼猴CD47的結合活性。圖5A-5B示出所測抗體都展示出抗體與CD47抗原結合的劑量依賴性結合，各參數如表7所示。 表7： CD47抗體結合人CD47和獼猴C47的親和力

抗體	Hu5F9-G4	17	L12	6Y-G1	6Y-G4
CD47類型	人CD47	獼猴CD47	人CD47	獼猴CD47	人CD47	獼猴CD47	人CD47	獼猴CD47	人CD47	獼猴CD47
親和力(μg/ml)	0.092	0.075	0.088	0.064	0.094	0.066	0.132	0.083	0.142	0.11

5、CD47結合測定（Fortebio）

通過Fortebio法測定11個抗體（抗體L12-1、抗體L12-2、抗體L12-3、抗體L12-4、抗體L12-5、抗體L12-6、抗體L12-7、抗體L12-9、抗體L12-10、抗體L12-11、抗體L12）以及Hu5F9-G4與人CD47結合活性。

Protein A感測器置於PBS中預濕10分鐘備用，將待測抗體用pH為6.8的含有0.5% BSA的PBST（以下簡稱稀釋緩衝液）稀釋至10 μg/mL，將PA感測器在抗體中固化至信號約為1.7 nm。將CD47-His抗原用稀釋緩衝液稀釋至50、25、12.5、6.25 nM。將稀釋緩衝液、梯度濃度的抗原稀釋液、再生緩衝液（pH為8.4的1M MgCl₂ ）、中和緩衝液（PBST）依次加入96孔板相應列中，運行如下步驟：①Baseline：在稀釋緩衝液中檢測基線60秒；②Association：在抗原梯度稀釋液及樣品空白（稀釋緩衝液）中結合100秒；③Dissociation：在稀釋緩衝液中解離700秒；④Regeneration：在再生緩衝液中再生5秒；⑤Neutralization：在中和緩衝液中中和5秒；⑥Regeneration和Neutralization迴圈進行3次。

用Data Analysis 8.2對數據進行處理分析，樣品數據經參比（樣品空白）信號扣減後進行擬合，得到親和常數KD。抗體的親和力結果統計見表8。結果顯示11個抗體與CD47抗原結合的親和力差不多。 表8：抗體親和力

抗體編號	KD（nM）	抗體編號	KD（nM）
L12-1	0.152	L12-7	0.149
L12-2	0.122	L12-9	0.124
L12-3	0.144	L12-10	0.195
L12-4	0.107	L12-11	0.175
L12-5	0.138	L12	0.112
L12-6	0.142	Hu5F9-G4	0.306

6、吞噬作用

進行體外吞噬作用測定以評估CD47抗體是否增強巨噬細胞對表達CD47的靶細胞的吞噬。簡而言之，在CD47抗體（0.7 nM）的存在下，將RAW264.7巨噬細胞（2×10⁵ 個/mL）（中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，3111C0001CCC000146）與CFSE標記的Raji細胞（4×10⁵ 個/mL） （Promega，JA1595）以1:2比率鋪板到24-孔底板中，37℃下避光孵育2小時。孵育完成時，用PBS洗滌細胞兩次並用胰酶消化RAW264.7細胞，將消化下來的巨噬細胞轉移至1.5 ml EP管，2000 rpm, 離心5分鐘。去除上清，再每管加入100 μl APC-F4/80螢光抗體（eBiosciences），4攝氏度避光孵育30分鐘，2000 rpm, 離心5分鐘，PBS緩衝液洗滌兩次。在BD C6流式細胞儀上獲得細胞。分析吞噬指數，吞噬指數計算方式為：吞噬指數=CFSE陽性的巨噬細胞數（即吞噬了腫瘤細胞的巨噬細胞數）/每5000個巨噬細胞。抗體6Y-G1、6Y-G4、17、L12和Hu5F9-G4顯示出強勁的吞噬增強能力（圖6A-6B）。圖6B示出6Y-G4引起的細胞吞噬反應比6Y-G1稍微弱些，說明IgG4抗體的Fc效應更弱。

實施例4：CD47抗體對血液細胞的影響

本發明前，已知的阻斷SIRPα且含有Fc結構域的CD47結合分子（例如CD47抗體和重組SIRPα-Fc融合蛋白）都不同程度的誘導紅血球、血小板減少。為此，在食蟹猴體內評估本發明的抗體對血液細胞的影響，挑選符合試驗要求的食蟹猴共8隻，普通級，雌性各半，雄性和雌性體重範圍分別為3.70～5.30 kg和2.75～3.55 kg；按體重通過簡單隨機化方案分為4組，每組2隻動物，雌雄各半。陰性對照組給予生理鹽水，受試物為抗體6Y-G1（即抗體L12-6）和Hu5F9-G4、AB6.12-G1，靜脈輸注溶媒：生理鹽水，靜脈輸注給藥，一週一次，給5次藥，每次按照1→10→10→30→30 mg/kg的劑量給藥，給藥體積均為10 ml/kg。給藥結束後觀察至第42天。圖7A-7D示出，三個抗體給藥後均導致血紅蛋白、紅血球減少，大概兩周降至低點隨後逐漸恢復至正常水準；血小板含量均呈現給藥前後上下波動現象，停藥後恢復正常；網織紅細胞數量給藥後均有增加趨勢，其中6Y-G1較其它兩個抗體給藥後網織紅細胞數量上升更高。

實施例5：CD47抗體的Fc變體體內抗腫瘤活性

評價測試藥抗體L12在人血液瘤MV4-11系統瘤模型中的抗腫瘤作用。NOD.SCID 小鼠（江蘇集萃藥康生物科技有限公司，體重18g-22g，鼠齡6-8周）尾靜脈接種MV4-11細胞（ATCC），接種後約4周，建立人血液瘤MV4-11系統瘤模型。試驗分為測試AB6.12-G1 0.2mg/隻，Hu5F9-G4 0.2mg/隻，抗體L12 0.2 mg/隻及溶媒（生理鹽水）對照組，每組6隻，腹腔注射給藥，每週給藥三次，共給藥三周。根據生存期延長時間（ILS）進行療效評價，根據給藥期間動物體重變化和死亡情況進行安全性評價。圖8顯示測試藥物AB6.12-G1（0.2 mg/隻），Hu5F9-G4（0.2 mg/隻）與溶媒對照組相比生存期均延長了7.4%和6.5%，統計學上均沒有顯著性差異（p=1.000），未能表現出顯著的抗腫瘤作用。抗體L12（0.2mg/隻） 中位生存期均為69天，與對照組相比生存期均延長了27.8%，在統計學上呈現出顯著性差異（p=0.007）。

在淋巴瘤的拉吉模型中評估了抗體6Y-G4的抗腫瘤活性。將拉吉細胞植入NOD.SCID小鼠皮下，並隨機分成3個組（每組8隻小鼠，第0天）。第1 組：溶媒對照（生理鹽水）；第2組：Hu5F9-G4（陽性對照）；第3組：6Y-G4。在腫瘤可觸摸時（50 mm³ ，第4天）使用各抗體或載劑（僅緩衝液）治療，在腫瘤體積達到約3000 mm³ 時處死小鼠。每3天量次腫瘤體積。腹腔內（IP）給予抗體，每個劑量為100 μg，每週3次共3 周（每隻小鼠共9次劑量）。治療於第4天開始並於第21天結束。如圖9所示，測試藥6Y-G4和Hu5F9-G4治療組在0.1 mg/隻的給藥濃度下均產生了極顯著的抗腫瘤效果，在開始給藥後便明顯抑制了腫瘤的生長，到開始給藥後第17天（PG-D17）大部分小鼠腫瘤消失，6Y-G4 （0.1 mg/隻）、Hu5F9-G4（0.1 mg/隻）治療組平均腫瘤體積分別為4 mm³ （8隻小鼠有7隻腫瘤消失）、7 mm³ （8隻小鼠有5隻腫瘤消失），相對腫瘤抑制率TGI分別為99.87%和99.76%，相對溶媒對照組統計學上均有顯著性差異（p值均＜0.001）。

圖1為組圖，描述了抗體17-ScFv與細胞表面CD47結合的能力，分別使用CHO-CD47細胞（圖1A）或Jurkat細胞（圖1B）。 圖2顯示了使用流式細胞術分析抗體17-ScFv與配體SIRPα競爭CHO表面CD47的結合的能力。 圖3為組圖，圖3A-3E顯示了由競爭ELISA評估CD47抗體阻斷SIRPα與CD47抗原結合的能力。 圖4為組圖，圖4A-4E顯示了CD47抗體導致的血紅血球（RBC）血凝反應，外觀顯示紅血球團流成一條線的為不引起血凝反應，輕微凝聚的為一個點，凝集明顯的為整個孔模糊一團；圖4A顯示抗體11有明顯凝聚現象，圖4B顯示抗體L12不會引起血凝反應，圖4C顯示抗體L12-6不會引起血凝反應，圖4D顯示抗體17、Hu5F9-G4有明顯血凝現象，AB6.12-G1、SIRPα不會引起血凝反應，圖4E顯示抗體6Y-G4不會引起血凝反應。 圖5為組圖，圖5A-5B顯示由ELISA法評估CD47抗體與人CD47或獼猴CD47的結合。 圖6為組圖，圖6A-6B顯示由流式細胞術評估CD47抗體促進RAW264.7吞噬Raji的能力。 圖7為組圖，圖7A-7D在食蟹猴體內分析了抗體6Y-G1對紅血球、血小板的影響；圖7A-7B顯示抗體6Y-G1會引起血紅蛋白及紅血球減少，大概2周後開始逐漸恢復，反應程度與抗體AB6.12-G1、Hu5F9-G4類似；圖7C顯示每次給予抗體6Y-G1後，血小板呈波動性變化，給藥結束後恢復；圖7D顯示每次給予抗體6Y-G1後，網織紅細胞數量上升，並且上升幅度大於抗體AB6.12-G1、Hu5F9-G4給藥組。 圖8顯示了抗體L12在人血液瘤MV4-11系統瘤模型中的抗腫瘤作用，使用抗體AB6.12-G1、Hu5F9-G4作為陽性對照。均使用200 µg抗體劑量處理小鼠，一週三次。 圖9分析了拉吉腫瘤模型中6Y-G4抗體的抗腫瘤效果；使用100 µg抗體劑量處理小鼠，一週三次。

Claims (15)

1. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合CD47並且包含下述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一個或多個，其中： （a）VH CDR1包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 14的變體，其在SEQ ID NO:14序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （b）VH CDR2包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 17的變體，其在SEQ ID NO: 17序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （c）VH CDR3包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 23的變體，其在SEQ ID NO: 23序列有如表1所示的1~3個氨基酸取代； （d）VL CDR1包含如SEQ ID NO: 30-31所示的任一氨基酸序列； （e）VL CDR2包含如SEQ ID NO: 32-33所示的任一氨基酸序列；或 （f）VL CDR3包含如SEQ ID NO: 34-35所示的任一氨基酸序列。
2. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合CD47並且包含下述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中的一個或多個，其中： （a）VH CDR1包含如SEQ ID NO: 14-16所示的任一氨基酸序列； （b）VH CDR2包含如SEQ ID NO: 17-22所示的任一氨基酸序列； （c）VH CDR3包含如SEQ ID NO: 23-29所示的任一氨基酸序列； （d）VL CDR1包含如SEQ ID NO: 30-31所示的任一氨基酸序列； （e）VL CDR2包含如SEQ ID NO: 32-33所示的任一氨基酸序列；或 （f）VL CDR3包含如SEQ ID NO: 34-35所示的任一氨基酸序列。
3. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 11、36-44、50和56中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。
4. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區VL，所述VL包含選自SEQ ID NO: 12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 12-13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。
5. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段特異性結合CD47並且包含如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR1，如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2，如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR3，如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR1，如SEQ ID NO: 32所示的VL CDR2和如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。
6. 2或5所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自以下組中一個或多個根據Kabat編號的氨基酸殘基突變： （a）R81K，和 （b）R82aS。
7. 2或5所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11或50所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 11或50所示的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。
8. 2、5或7所述的抗體或抗原結合片段，其特徵在於，其中所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區VL，所述VL包含選自SEQ ID NO: 13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 13、45-49、51-55和65中任一的氨基酸序列至少有90%序列同源性的氨基酸序列。
9. 一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，所述VH包含選自SEQ ID NO: 11或50所示的氨基酸序列，所述VL包含選自SEQ ID NO: 13或65所示的氨基酸序列。
10. 如請求項1-9中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含重鏈H和輕鏈L；所述重鏈H包含選自SEQ ID NO: 60和62-63中任一的氨基酸序列，所述輕鏈L包含選自SEQ ID NO: 61或64所示的氨基酸序列。
11. 如請求項1-9中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是IgG同種型，其選自IgG1亞型、IgG2亞型、IgG3亞型、或者IgG4亞型。
12. 如請求項11所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是IgG4P。
13. 一種組合物，所述組合物包含如請求項1-12任一項所述的抗體或抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
14. 一種生物材料，為 （1）一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼如請求項1-12任一項所述的抗體或抗原結合片段；或 （2）一種表達載體，所述表達載體包含編碼如請求項1-12任一項所述的抗體或抗原結合片段的多聚核苷酸；或 （3）一種細胞，所述細胞包含編碼如請求項1-12任一項所述的抗體或抗原結合片段的一種或多種多聚核苷酸。
15. 如請求項1-12任一項所述的抗體或抗原結合片段、或如請求項13所述的組合物、或如請求項14所述的生物材料在製備治療癌症或感染的藥物中的應用。

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