具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
重组抗体
在本发明的第一方面,本发明提出了一种重组抗体,含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列:CD3抗体可变区CDR序列:SEQ ID NO:1~6;B7H6抗体可变区CDR序列:SEQ ID NO:7~12。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合,具有较强的体内、外结合活性,以及较长的体内半衰期,抗肿瘤效果显著。
RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:1)。
YTSRLES(SEQ ID NO:2)。
QQGNTLPWT(SEQ ID NO:3)。
GYTMN(SEQ ID NO:4)。
LINPYKGVSTYNQKFKD(SEQ ID NO:5)。
SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO:6)。
KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:7)。
AASTLHS(SEQ ID NO:8)。
QQSKEDPRT(SEQ ID NO:9)。
DYNMD(SEQ ID NO:10)。
DINPNNGGTLYNQKFRG(SEQ ID NO:11)。
SEVFYGNYADY(SEQ ID NO:12)。
根据本发明的一些具体实施例,上述重组抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,含有CD3抗体的可变区,所述CD3抗体的可变区具有如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:14所示的重链可变区,或者与SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:13)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)。
根据本发明的一些具体实施例,所述抗体含有B7H6抗体的可变区,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:20)。
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:23)。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:16和SEQID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:16和SEQID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:16和SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:16和SEQID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:17和SEQID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:17和SEQID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:17和SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:17和SEQID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:19和SEQID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:19和SEQID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:19和SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:19和SEQID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:20和SEQID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:20和SEQID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:20和SEQID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:15和SEQID NO:26所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例,所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区,和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区,或者与SEQ ID NO:18和SEQID NO:21所示的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的氨基酸序列。
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:15)。
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:16)。
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:17)。
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)。
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:19)。
EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:21)。
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:22)。
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:24)。
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:25)。
EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:26)。
根据本发明的一些具体实施例,进一步包括连接肽。
根据本发明的一些具体实施例,所述连接肽具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)。
根据本发明的一些具体实施例,所述连接肽的N端与所述CD3抗体轻链可变区的C端相连,所述连接肽的C端与所述CD3抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例,所述所述连接肽的N端与所述B7H6轻链可变区的C端相连,所述连接肽的C端与所述B7H6重链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例,还含有第一Fc区和第二Fc区,所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例,所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG1或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例,所述第一Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有S384C突变和T396W突变中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述第二Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有Y380C突变、T397S突变、L399A突变和Y408V突变中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例,所述第一抗体Fc区具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列,所述第二抗体Fc区具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:47)。
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:48)。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例,具有SEQ ID NO:49和63所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合,具有较强的体内、外结合活性,以及较长的体内半衰期,抗肿瘤效果显著。
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:49)。
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)。
预防或治疗组合物
在本发明的第三方面,本发明提出了一种核酸,所述核酸编码前面所述的重组抗体。根据本发明一些具体实施例的核酸编码的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合,具有较强的体内、外结合活性,以及较长的体内半衰期,抗肿瘤效果显著。
根据本发明的一些具体实施例,所述核酸具有SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列,以及SEQ ID NO:70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。
编码CD3抗体的核苷酸序列
CAGGCCGTGGTGACCCAGGAGCCCTCCCTGACCGTGTCCCCCGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGGTCCTCCACCGGCGCCGTGACCACCTCCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGGGCCTGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCCTGGACCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTGCTGGGCGGCAAGGCCGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCCTGTGGTACTCCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGCGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGGATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGACAGGTTCACCATCTCCAGGGACGACTCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGAGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACGTGTCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:69)。
编码B7H6-1抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCATGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:70)。
编码B7H6-2抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:71)。
编码B7H6-3抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:72)。
编码B7H6-4抗体的核苷酸序列
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编码B7H6-15的核苷酸序列
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编码B7H6-16抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:85)。
编码B7H6-17抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGTGTCCCTGGCCGTGCCCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCTCCTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCTGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGATCACCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGCCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGATCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGTCCCTGACCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:86)。
编码B7H6-18抗体的核苷酸序列
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGTGTCCCTGGCCGTGCCCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGCCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCTCCTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCTGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGATCACCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGATCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGTCCCTGACCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA(SEQ ID NO:87)。
需要说明的是,对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本说明书和权利要求书中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种表达载体,所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列,所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中,所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明一些具体实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体,进而可有效用于对肿瘤,特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种重组细胞,所述重组细胞携带第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第一方面或第二方面所述的重组抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例,所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体,所述重组细胞可有效用于对肿瘤,特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
需要说明的是,本申请说明书中所述的“适合条件”,是指适合本申请所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化最适的所述重组抗体表达的条件。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种组合物,包括第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述,本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3或B7H6蛋白分子结合,进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞,并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环,避免全身活化,包含所述重组抗体及相应一系列物质的组合物,如食品组合物或药物组合物,同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用,其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种药物,包括:第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物,所述药物用于治疗或预防癌症。如前所述,本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3或B7H6蛋白分子结合,进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞,并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环,避免全身活化,包含所述重组抗体系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用,其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施例,所述癌症包括下列中的至少之一:直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
根据本发明的一些具体实施例提供的药物,包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
用途
在本发明的第七方面,本发明提出了第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗或预防肿瘤。如前所述,本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白结合,进而可特异性识别特异性高表达所述B7H6的肿瘤细胞,利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用,其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的一些具体实施例,所述肿瘤包括下列中的至少之一:直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
试剂盒
在本发明的第九方面,本发明提出了一种试剂盒,包括:第一方面或第二方面所述的重组抗体。本发明的一些具体实施例提供的所述重组抗体可与B7H6蛋白进行结合,因此,包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测高表达所述B7H6蛋白的肿瘤。
根据本发明的一些具体实施例,所述试剂盒用于诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白分子结合,进而可特异性识别特异性高表达所述B7H6的肿瘤细胞,因此,所述重组抗体可用于制备诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的试剂盒,所述试剂盒可用于科学研究,如定性或定量检测生物样品中的CD3和/或B7H6蛋白分子。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1CD3×B7H6双特异性抗体分子的设计及构建
本实施例通过对多种构型进行筛选,发明人确定了以scFv-Fc构型的双特异性抗体,这个双特异性抗体被命名为CD3×B7H6。所述抗体含有两个单价单元,其中一个单价单元为抗CD3的ScFv-Fc形式,另一个单价单元为抗B7H6的ScFv-Fc形式,采用一条连接肽将所述CD3抗体的轻链可变区和重链可变区相连,采用与前所述相同的1条连接肽将所述B7H6抗体的轻链可变区和重链可变区相连,所连接肽具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列,所述CD3抗体具有如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区,和如SEQ ID NO:14所示的重链可变区,所述B7H6抗体具有如SEQ ID NO:15-20所示的轻链可变区,和如SEQ ID NO:21-26所示的重链可变区。其中,发明人对不同的B7H6抗体可变区与CD3抗体的可变区的组合进行筛选,共构建了18个CD3×B7H6重组抗体分子;并且对单价单元的Fc均进行氨基酸突变改造,抗CD3的Fc区域氨基酸在位置384处变化为半胱氨酸(S384C)及在位置396处变化为色氨酸(T396W),抗B7H6的Fc区域氨基酸在位置380处变化为半胱氨酸(Y380C),在位置397处变化为丝氨酸(T397S),在位置399处变化为丙氨酸(L399A)及在位置408处变化为缬氨酸(Y408V),使其各自不容易形成同二聚体,而易于形成异二聚体,该异二聚体即为双特异性抗体CD3×B7H6,具体结构如图1所示,所述18个CD3×B7H6重组抗体分子具有如SEQ ID NO:27所示的CD3单链抗体、如SEQ ID NO:28-45所示的B7H6单链抗体、如SEQ ID NO:47所示的第一抗体Fc区、如SEQ ID NO:48所示的第二抗体Fc区。
使用常见的分子生物学技术,将编码CD3及B7H6(1-18)单价单元多肽链的核酸序列分别克隆于表达载体pTT5(优宝生物,货号VT2202)中,具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:69,以及SEQ ID NO:70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。同时为了使其在CHO细胞中高效表达并分泌到培养基中,选择了鼠源抗体kappa链的前导肽作为分泌信号肽插入到表达载体上,信号肽位于抗体可变区的N端,其氨基酸序列为:METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ IDNO:68),编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示。
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCTCCACCGGC(SEQ IDNO:88)。
CD3单链抗体
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
B7H6-1单链抗体
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B7H6-2单链抗体
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:29)。
B7H6-3单链抗体
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:30)。
B7H6-4单链抗体
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:31)。
B7H6-5单链抗体
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B7H6-6单链抗体
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B7H6-7单链抗体
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B7H6-8单链抗体
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B7H6-9单链抗体
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B7H6-10单链抗体
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B7H6-11单链抗体
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B7H6-12单链抗体
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B7H-13单链抗体
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B7H6-14单链抗体
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:41)。
B7H6-15单链抗体
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:42)。
B7H6-16单链抗体
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:43)。
B7H6-17单链抗体
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:44)。
B7H6-18单链抗体
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:45)。
第一Fc区氨基酸序列
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:47)。
第二Fc区氨基酸序列
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:48)。
实施例2CD3×B7H6双特异性抗体的表达及纯化
2.1CD3×B7H6双特异性抗体分子表达
通过用携带有CD3×B7H6链编码基因的pTT5载体瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco,货号A29127)来制备结合CD3和B7H6的双特异性分子,其中,18个CD3×B7H6链编码基因分别具有如SEQ ID NO:49所示的抗CD3的ScFv-Fc,以及如SEQ ID NO:50-67所示的抗B7H6的ScFv-Fc。具体的实验操作如下:转染前一天,将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3-4)×106/mL,37℃,8%CO2,120rpm摇动培养过夜。转染当天,细胞生长到7×106–1×107/mL,活率大于95%时准备转染,使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco,货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL,再取含有CD3多肽链和B7H6多肽链的质粒以1:1的质量比,利用ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco,货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中,于37℃,8%CO2,120rpm摇动培养。转染后18-22h,将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞,混匀,于32℃,5%CO2,120rpm摇动培养。转染后第5天,向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed,混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化,待细胞活率下降至80%以下或培养10-14天后离心收获细胞,取上清纯化或冻于-80℃备用。
2.2CD3×B7H6双特异性抗体分子纯化
2.1实验获得的上清用0.22μm滤膜过滤,利用Mabselect prism A亲和层析柱(GE公司,货号17549854)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体,用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后,上清过亲和层析柱,用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸,pH2.7)洗脱,最后用PBS缓冲液浓缩置换,纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95%以上。
CD3 ScFv-Fc氨基酸序列
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:49)。
B7H6-1ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-2 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-3 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-4 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-5 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-6 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-7 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-8 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:57)。
B7H6-9 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:58)。
B7H6-10 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-11 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:60)。
B7H6-12 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-13 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-14 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)。
B7H6-15 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)。
B7H6-16 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)。
B7H6-17 ScFv-Fc氨基酸序列
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B7H6-18 ScFv-Fc氨基酸序列
DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:67)。
实施例3CD3×B7H6双特异性抗体与抗原的结合活性检测(ELISA)
本实施例分别检测所述CD3×B7H6双特异性抗体与单抗原(B7H6抗原或CD3抗原)的结合活性,以及CD3×B7H6双特异性抗体与双抗原(B7H6抗原、CD3抗原)同时结合的结合活性,具体实验操作如下:
3.1CD3×B7H6双特异性抗体与单抗原结合活性测定
将人B7H6(ACRO biosystems,货号B76-H52H8)、人CD3抗原(ACRO biosystems,货号CDD-H52W1)分别用包被缓冲液(35mM NaHCO3,15mM Na2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL,向酶联板中每孔加入100μL,4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05%Tween 20-PBS,pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1%BSA,0.05%Tween20-PBS,pH 7.2),室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体,室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-兔抗人IgG二抗(boster,货号BA1070),室温孵育1小时。用PBST清洗3遍,每孔加入TMB,室温避光反应2-5分钟,每孔再用2M硫酸终止反应,最后用酶标仪读取OD450数值。
具体的实验结果如图2A所示,图2A显示了不同的B7H6序列与CD3序列组成的CD3×B7H6双特异性抗体分子与B7H6抗原的结合情况,可以看出这些双特异性抗体分子均可以结合B7H6抗原,其中,CD3×B7H6-14的结合活性最强,因此,后续实验主要围绕CD3×B7H6-14展开;图2B展示了CD3×B7H6-14双特异性抗体分子可以结合CD3抗原。
3.2CD3×B7H6双特异性抗体与双抗原结合活性测定
将人B7H6(ACRO biosystems,货号B76-H82Wb)用包被缓冲液(35mM NaHCO3,15mMNa2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL,向酶联板中每孔加入100μL,4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05%Tween 20-PBS,pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1%BSA,0.05%Tween20-PBS,pH 7.2),室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体,室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的人CD3抗原(ACRO biosystems,货号CDD-H52W1),室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-抗His标签二抗(Genscript,货号A00612),室温孵育1小时。用PBST清洗3遍,每孔加入TMB,室温避光反应2-5分钟,每孔再用2M硫酸终止反应,最后用酶标仪读取OD450数值。具体结果如图2C所示,结果显示,随着CD3×B7H6-14双特异性抗体分子浓度增加,其OD450读数逐渐增加,说明该双特异性抗体分子可以同时结合人CD3和B7H6。
实施例4双特异性抗体分子的体外杀伤检测
4.1人外周血单个核细胞(PBMC)的分离
将抗凝人外周血加入等体积的无菌PBS中,取50mL无菌离心管,将25mL稀释后的外周血轻轻加到15mL淋巴分离液上(GE healthcare,货号17144003),整个过程保持界面清晰不晃动,21℃,400g离心30min,离心机升速1,降速0。离心后管内分为三层,中间层为淋巴细胞层,吸取中间的白膜层至新的50mL离心管,吸取完毕后用PBS加满至50mL,500g离心10min。弃上清,加入1mL PBS轻轻吹匀,PBS加满40mL,250g离心10min。
离心后弃去上清,用1mL MACS缓冲液(0.5%BSA,2.5mM EDTA-PBS)重悬后稀释计数。
4.2纯化T细胞分离
人T细胞使用磁珠分选(Miltenyi公司,货号130096535)的方法将其从外周血中分离出来。将PBMC收集后弃尽上清,每107个细胞加入40μL MACS buffer重悬细胞后再加入10μL T Cell Biotin-Antibody Cocktail,混匀,4℃孵育10min。每107个细胞再加入30μLMACS buffer和20μL T Cell MicroBead Cocktail,混匀,4℃孵育15min。将LS分离柱放入磁场,用3mL MACS buffer润湿分离柱,将细胞悬液加入分离柱,1mL MACS buffer涮洗离心管后,加入分离柱,收集流出液。3mL MACS buffer洗分离柱,收集流出液。混匀后,细胞计数。将细胞悬液300g,4℃,10min离心后用培养基重悬。
4.3贴壁肿瘤细胞体外杀伤检测
将贴壁培养的肿瘤细胞消化后计数,调整细胞密度为2×105/mL。打开RTCA仪器(安捷伦),选择仪器类型DP,选择实验模式,填写细胞信息和药物信息。进入schedule设置实验步骤,将板子加入50μL新鲜培养基(89%RPMI 1640培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素)后放入仪器中,关好,点击第一步开始。完成Done后取出板子,加入100μL细胞悬液,室温静置15-30min防止边缘效应,放入仪器,点击开始。待生长到对数期后,暂停,加入50μL纯化T细胞(1×106/mL),并加入梯度浓度的双特异性抗体,点击开始,一段时间后分析。
具体实验结果如图所示,其中,随着CD3×B7H6-14双特异性抗体浓度增加,T细胞对HCT-15细胞(图3A)、LoVo细胞(图3B)、Hep G2细胞(图3C)及SK-BR-3细胞(图3D)的杀伤效率逐渐增加,说明CD3×B7H6-14可以很好地促进T细胞杀伤B7H6+的肿瘤细胞。
实施例5荧光素酶反应法检测悬浮细胞体外杀伤实验
将过表达荧光素酶的肿瘤细胞收集后调整细胞密度为2×105/mL,如实施例4.1和4.2所描述分离纯化、收集、纯化T细胞并调整细胞密度为5×105/mL。各取50μL肿瘤细胞和纯化T细胞于96孔平底板中,并加入梯度浓度的双特异性抗体,混匀。37℃,5%CO2孵育4小时后向每孔加入100μL(15mg/mL)荧光素钾盐溶液(Goldbio公司,货号LUCK-1G),快速混匀,用酶标仪检测化学发光值。
具体实验结果如图所示,随着CD3×B7H6-14双特异性抗体添加浓度增加,其检测到Ho8910和K562的化学发光值逐渐下降,说明存活的肿瘤细胞越少,即CD3×B7H6-14可以显著促进T细胞杀伤Ho8910细胞(图4A)和K562细胞(图4B)。
实施例6在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞增殖情况
为了测定T细胞增殖,本实施例设置为2*2双因素实验,包括如下组:T细胞+PBS组、T细胞+CD3×B7H6-14组、HCT-15+T细胞+PBS组、HCT-15+T细胞+CD3×B7H6-14组,如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞,用5μM细胞Trace CFSE(Invitrogen,货号C34554)标记纯化T细胞。随后将标记后的T细胞与人结肠癌细胞(HCT-15细胞)以效靶比2:1混合,再向其中加入PBS或者双特异性抗体,3天后收获细胞,通过流式细胞仪检测T细胞增殖情况。
具体实验结果如图所示,其中,CD3×B7H6-14双特异性抗体在HCT-15存在的情况下可以显著促进T细胞增殖(图5A),并且随着双特异性抗体CD3×B7H6-14浓度增加,其促进T细胞增殖效果越明显(图5B)。
实施例7在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞活化和脱颗粒水平
如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞,实验共设置2组,其中,对照组为T细胞组,实验组将T细胞与HCT-15靶细胞按照效靶比1:1加入至96孔板内,再加入梯度浓度的CD3×B7H6双特异性抗体,混匀。37℃孵育24小时后离心收集细胞,用PBS重悬细胞,加入小鼠血清室温封闭15分钟,再加入检测表面分子的流式抗体,4℃避光孵育30分钟后用PBS清洗,再加入固定穿膜液(invitrogen,货号00512343),室温固定半小时以上。再加入穿膜缓冲液(invitrogen,货号00833356)清洗,加入小鼠血清室温封闭15分钟,之后加入相应的细胞内分子标记抗体,室温避光孵育30分钟,再加入PBS清洗两次后用流式细胞仪检测。
具体实验结果如图6A和6B所示,其中,在B7H6+细胞存在(+HCT-15)情况下,随着CD3×B7H6-14双特异性抗体浓度增加,CD4+T细胞和CD8+T细胞表面表达CD69分子(图6A)和细胞内表达CD107a(图6B)的比例逐渐增多,而不存在B7H6+肿瘤细胞(-HCT-15)时,T细胞在经过双特异性抗体孵育后活化和脱颗粒能力很有限,说明该双特异性抗体可以特异性靶向T细胞和B7H6+肿瘤细胞并且促进T细胞活化和脱颗粒。
实施例8在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞分泌细胞因子
如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞,对照组仅有T细胞,实验组含有T细胞和HCT-15细胞,5×105个T细胞、5×105个T细胞和5×105个HCT-15细胞分别加入至24孔板内,总体积为500μL,再加入梯度浓度的CD3×B7H6双特异性抗体(0、100、101、102、103),混匀。37℃孵育24小时后离心收集上清液,用CBA人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒(BD,货号560484)检测上清中各种细胞因子的浓度,最后用流式细胞仪检测。
具体实验结果如图7A-D所示,其中,展示了细胞共孵育上清中IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A细胞因子的浓度,在HCT-15肿瘤细胞存在下,随着CD3×B7H6-14抗体浓度增加,T细胞分泌这4种细胞因子的水平也逐渐增强,说明该双特异性抗体可以促进T细胞活化并分泌细胞因子。
实施例9活体内异种移植功效研究
为了检测CD3×B7H6双特异性抗体分子对于HCT-15肿瘤细胞的体内抗肿瘤活性,本实施例共设置3组进行实验,包括缓冲液组、人免疫球蛋白(IGg)组和CD3×B7H6-14双特异性抗体分子组。如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞,再使用T细胞扩增试剂盒(gibco,货号11131D)扩增T细胞7天。将HCT-15结直肠癌细胞(1×106)与扩增T细胞(2×106)混合后皮下注射(s.c.)于雄性NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc小鼠的皮下,接种后每隔两天通过静脉注射CD3×B7H6双特异性抗体(1mg/kg,溶于PBS中)、IgG对照抗体(sigma,货号I4506)或缓冲液(对照溶剂)到小鼠体内,共注射三次。通过外部卡尺测量检测肿瘤长和宽并用标准公式计算肿瘤体积。
图8展示了CD3×B7H6-14双特异性抗体分子对于HCT-15细胞的体内抗肿瘤活性。通过CD3×B7H6-14双特异性抗体治疗可以明显促使HCT-15肿瘤消退,而使用对照IgG或者对照溶剂则不能达到治疗效果,说明CD3×B7H6双特异性抗体具有明显的体内抗肿瘤活性。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。