TW202313700A - 雙特異性抗體及其應用 - Google Patents

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曹國帥
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Abstract

本發明提出了一種雙特異性抗體及其應用，該重組抗體含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列：CD3抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~6；B7H6抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 7~12。本發明所製備的重組抗體能同時靶向CD3和B7H6，且半衰期得到顯著延長，較單靶抗體表現出更強的腫瘤抑制能力。

Description

雙特異性抗體及其應用
本發明屬於生物醫藥領域，具體地，涉及雙特異性抗體及其應用，更具體地，涉及重組抗體、免疫細胞、核酸、表達載體、重組細胞、組合物、上述物質在製備藥物中的用途、試劑盒。
雙特異性抗體是可同時特異性結合兩個抗原位點的抗體。用於腫瘤治療的雙特異性抗體按照其作用機制可以分為三類：再導向效應細胞；免疫調節；靶向腫瘤細胞受體雙重結合。其中，用於再導向功能的抗體在其中佔據大多數，目前已經上市的兩個用於腫瘤治療的抗體也是基於T細胞再導向。根據雙特異性抗體的特性，它也可以很好的運用於其他治療體系中，例如雙重免疫調節或者靶向同一細胞膜的兩個分子。
B7H6是屬於B7家族的I型跨膜蛋白，它包含了2個免疫球蛋白結構域。B7H6也是NK細胞活化性受體NKp30的配體。B7H6在多種腫瘤細胞上均有表達，但是在人的正常組織和健康外周血單核細胞並沒有檢測到B7H6的mRNA。在炎症環境中，一些促炎性細胞因子如IL-1β和TNF可以刺激CD14+和CD16+單核細胞和中性粒細胞上調表達B7H6。B7H6的腫瘤表達譜非常廣泛，這包括白血病、淋巴瘤、結直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肝癌等。B7H6的表達與一些癌症的轉移也存在關聯，但是在多數腫瘤中B7H6的作用目前還不清楚。目前，儘管B7H6在多種腫瘤中表達，但是針對這一分子的腫瘤治療手段並不多。有研究者開發了針對B7H6的雙特異性抗體，它的構建形式是BiTE，這種形式不含有天然抗體的恒定區，因此也決定了這種分子在體內的半衰期很短，很大程度上限制了其使用。
在基於T細胞再導向的雙特異性抗體中，CD3這個靶點非常重要。與免疫卡控點阻斷抗體不同的是，CD3相關的雙特異性抗體可以越過TCR和肽-主要組織相容性複合物（pMHC）來介導T細胞活化，但在突觸中的分子發揮作用過程與經典TCR-pMHC相互作用很相似。雙特異性抗體的活性受CD3親和力的影響，CD3高親和力雙特異性抗體在體外實驗中有著更好的促殺傷效果，但是在體內存在致命的細胞因子釋放綜合症毒性，這與嵌合抗原受體（CAR）T細胞毒性非常相似。同時有研究發現非常低親和力的CD3抗體序列在構建雙特異性抗體後也可以有效地刺激T細胞活化。當CD3抗體親和力在合適範圍（200±78nM）且腫瘤靶點相關抗體是高親和力時，雙特異性抗體會促使T細胞選擇性地定位到腫瘤局部而不是在外周循環，避免全身活化。因此，開發靶向性強的雙特異性抗體對腫瘤的預防及治療具有極大的價值。
本申請是基於發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：
本發明中，發明人對CD3、B7H6抗原結合片段進行多種組合和篩選，設計了重組雙特異性抗體，所述重組雙特異性重組抗體可以特異性結合CD3和特異性結合B7H6，進而靶向性地將B7H6分子帶入到腫瘤細胞附近，通過與腫瘤細胞上的B7H6分子結合促使CD3+的淋巴細胞與腫瘤細胞形成免疫突觸，從而使淋巴細胞活化殺傷B7H6+的腫瘤細胞，所述重組雙特異性抗體具有較高的CD3和B7H6結合活性，且抗腫瘤活性較高。
因此，在本發明的第一方面，本發明提出了一種重組抗體。根據本發明的實施例，含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列：CD3抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~6；B7H6抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 7~12。根據本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。 RASQDIRNYLN（SEQ ID NO: 1）。 YTSRLES（SEQ ID NO: 2）。 QQGNTLPWT（SEQ ID NO: 3）。 GYTMN（SEQ ID NO: 4）。 LINPYKGVSTYNQKFKD（SEQ ID NO: 5）。 SGYYGDSDWYFDV（SEQ ID NO: 6）。 KASQSVDYDGDSYMN（SEQ ID NO: 7）。 AASTLHS（SEQ ID NO: 8）。 QQSKEDPRT（SEQ ID NO: 9）。 DYNMD（SEQ ID NO: 10）。 DINPNNGGTLYNQKFRG（SEQ ID NO: 11）。 SEVFYGNYADY（SEQ ID NO: 12）。
在本發明的第二方面，本發明提出了一種重組抗體。根據本發明的實施例，具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。根據本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：49）。 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：63）。
在本發明的第三方面，本發明提出了一種核酸。根據本發明的實施例，所述核酸編碼第一方面所述的重組抗體。根據本發明實施例的核酸編碼的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。
在本發明的第四方面，本發明提出了一種表達載體。根據本發明的實施例，所述表達載體攜帶第三方面所述的核酸分子。所述表達載體可包括可選的控制序列，所述控制序列與所述核酸分子可操作地連接。其中，所述控制序列為可指導所述核酸分子在宿主中表達的一個或多個控制序列。本發明實施例所提出的表達載體可在適合的宿主細胞中高效表達所述重組抗體，進而可有效用於對腫瘤，特別是表達B7H6的腫瘤的特異性治療或預防。
在本發明的第五方面，本發明提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，所述重組細胞攜帶第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體或第一方面所述的重組抗體。所述重組細胞是通過轉染或者轉化所述表達載體獲得的。根據本發明的實施例，所述重組細胞在合適條件下可高效表達上述重組抗體，所述重組細胞可有效用於對腫瘤，特別是表達B7H6的腫瘤的特異性治療或預防。
在本發明的第六方面，本發明提出了一種組合物。根據本發明的實施例，包括第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體或第五方面所述的重組細胞。如前所述，本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3或B7H6蛋白分子結合，進而可特異性識別高表達所述B7H6的腫瘤細胞，並促使T細胞選擇性地定位到腫瘤局部而不是在外周循環，避免全身活化，包含所述重組抗體的藥物同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本發明的第七方面，本發明提出了第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體、第五方面所述的重組細胞或第六方面所述的組合物在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於治療或預防腫瘤。如前所述，本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3和B7H6蛋白結合，進而可特異性識別高表達所述B7H6的腫瘤細胞，利用所述重組抗體及其相應的一系列物質製備的藥物同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本發明的第八方面，本發明提出了一種藥物。根據本發明的實施例，包括：第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體、第五方面所述的重組細胞或第六方面所述的組合物，所述藥物用於治療或預防癌症。如前所述，本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3和B7H6蛋白結合，進而可特異性識別高表達所述B7H6的腫瘤細胞，利用所述重組抗體及其相應的一系列物質製備的藥物同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本發明的第九方面，本發明提出了一種試劑盒。根據本發明的實施例，包括：第一方面或第二方面所述的重組抗體。根據本發明實施例的抗體可以有效與CD3和B7H6蛋白分子結合，進而可特異性識別特異性高表達所述B7H6的腫瘤細胞因此，所述重組抗體可用於製備診斷或檢測直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的試劑盒，所述試劑盒可用科學研究，如定性或定量檢測生物樣本中的CD3和/或B7H6蛋白分子。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
此外，術語「第一」、「第二」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。在本發明的描述中，「多個」的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
重組抗體
在本發明的第一方面，本發明提出了一種重組抗體，含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列：CD3抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~6；B7H6抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 7~12。根據本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。 RASQDIRNYLN（SEQ ID NO: 1）。 YTSRLES（SEQ ID NO: 2）。 QQGNTLPWT（SEQ ID NO: 3）。 GYTMN（SEQ ID NO: 4）。 LINPYKGVSTYNQKFKD（SEQ ID NO: 5）。 SGYYGDSDWYFDV（SEQ ID NO: 6）。 KASQSVDYDGDSYMN（SEQ ID NO: 7）。 AASTLHS（SEQ ID NO: 8）。 QQSKEDPRT（SEQ ID NO: 9）。 DYNMD（SEQ ID NO: 10）。 DINPNNGGTLYNQKFRG（SEQ ID NO: 11）。 SEVFYGNYADY（SEQ ID NO: 12）。
根據本發明的一些具體實施例，上述重組抗體還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的一些具體實施例，含有CD3抗體的可變區，所述CD3抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 13所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 14所示的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 13）。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 14）。
根據本發明的一些具體實施例，所述抗體含有B7H6抗體的可變區，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 20）。 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 23）。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 15所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根據本發明的一些具體實施例，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 18所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 15）。 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 16）。 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 17）。 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 18）。 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 19）。 EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 21）。 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 22）。 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 24）。 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 25）。 EVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 26）。
根據本發明的一些具體實施例，進一步包括連接肽。
根據本發明的一些具體實施例，所述連接肽具有SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列。 GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 46）。
根據本發明的一些具體實施例，所述連接肽的N端與所述CD3抗體輕鏈可變區的C端相連，所述連接肽的C端與所述CD3抗體重鏈可變區的N端相連。
根據本發明的一些具體實施例，所述所述連接肽的N端與所述B7H6輕鏈可變區的C端相連，所述連接肽的C端與所述B7H6重鏈可變區的N端相連。
根據本發明的一些具體實施例，還含有第一Fc區和第二Fc區，所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
根據本發明的一些具體實施例，所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自人源IgG或其突變體。
根據本發明的一些具體實施例，所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自人源IgG1或其突變體。
根據本發明的一些具體實施例，所述第一Fc區與野生型IgG1 Fc區相比具有S384C突變和T396W突變中的至少之一。
根據本發明的一些具體實施例，所述第二Fc區與野生型IgG1 Fc區相比具有Y380C突變、T397S突變、L399A突變和Y408V突變中的至少之一。
根據本發明的一些具體實施例，所述第一抗體Fc區具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述第二抗體Fc區具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 47）。 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 48）。
在本發明的第二方面，本發明提出了一種重組抗體。根據本發明的實施例，具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。根據本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：49）。 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：63）。
預防或治療組合物
在本發明的第三方面，本發明提出了一種核酸，所述核酸編碼前面所述的重組抗體。根據本發明一些具體實施例的核酸編碼的重組抗體可以有效與CD3、B7H6進行結合，具有較強的體內、外結合活性，以及較長的體內半衰期，抗腫瘤效果顯著。
根據本發明的一些具體實施例，所述核酸具有SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。
編碼CD3抗體的核苷酸序列 CAGGCCGTGGTGACCCAGGAGCCCTCCCTGACCGTGTCCCCCGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGGTCCTCCACCGGCGCCGTGACCACCTCCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGGGCCTGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCCTGGACCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTGCTGGGCGGCAAGGCCGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCGCCCTGTGGTACTCCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGCGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGGATCAGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGACAGGTTCACCATCTCCAGGGACGACTCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGAGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACGTGTCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：69）。
編碼B7H6-1抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCATGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：70）。
編碼B7H6-2抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：71）。
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編碼B7H6-10抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：79）。
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編碼B7H6-12抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：81）。
編碼B7H6-13抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCATGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：82）。
編碼B7H6-14抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACACCTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：83）。
編碼B7H6-15的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：84）。
編碼B7H6-16抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCTCCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAAGTCCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGGTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：85）。
編碼B7H6-17抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGTGTCCCTGGCCGTGCCCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCTCCTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCTGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGATCACCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGCCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGATCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGTCCCTGACCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：86）。
編碼B7H6-18抗體的核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGTGTCCCTGGCCGTGCCCCTGGGCCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGCCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCACCCTGCACTCCGGCATCCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAACATCCACCCCGTGGAGGAGGAGGACGCCGCCTCCTACTACTGCCAGCAGTCCAAGGAGGACCCCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGCGGTGGATCAGGCGGAGGTGGCTCAGGTGGAGGCGGTTCTGAGGTGCTGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGATCACCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCGACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCCTGTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAGGGTGACCCTGATCGTGGACAAGTCCTCCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGGTCCCTGACCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGTCCGAGGTGTTCTACGGCAACTACGCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCCGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCTCCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAGTAA（SEQ ID NO：87）。
需要說明的是，對於本發明說明書和請求項書中所提及的核酸，本發明所屬技術領域具有通常知識者應當理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和請求項書中，雖然多數情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。另外，本申請中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種，意味著另一種也被公開。
在本發明的第四方面，本發明提出了一種表達載體，所述表達載體攜帶前面所述的核酸分子。所述表達載體可包括可選的控制序列，所述控制序列與所述核酸分子可操作地連接。其中，所述控制序列為可指導所述核酸分子在宿主中表達的一個或多個控制序列。本發明一些具體實施例所提出的表達載體可在適合的宿主細胞中高效表達所述重組抗體，進而可有效用於對腫瘤，特別是表達B7H6的腫瘤的特異性治療或預防。
在本發明的第五方面，本發明提出了一種重組細胞，所述重組細胞攜帶第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體或第一方面或第二方面所述的重組抗體。所述重組細胞是通過轉染或者轉化所述表達載體獲得的。根據本發明的一些具體實施例，所述重組細胞在合適條件下可高效表達上述重組抗體，所述重組細胞可有效用於對腫瘤，特別是表達B7H6的腫瘤的特異性治療或預防。
需要說明的是，本申請說明書中所述的「適合條件」，是指適合本申請所述重組抗體表達的條件。本發明所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，適合重組抗體表達的條件包括但不限於合適的轉化或轉染方式、合適的轉化或轉條件、健康的宿主細胞狀態、合適的宿主細胞密度、適宜的細胞培養環境、適宜的細胞培養時間。「適合條件」不受特別限制，本發明所屬技術領域具有通常知識者可根據實驗室的具體環境，優化最適的所述重組抗體表達的條件。
在本發明的第六方面，本發明提出了一種組合物，包括第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體或第五方面所述的重組細胞。如前所述，本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3或B7H6蛋白分子結合，進而可特異性識別高表達所述B7H6的腫瘤細胞，並促使T細胞選擇性地定位到腫瘤局部而不是在外周循環，避免全身活化，包含所述重組抗體及相應一系列物質的組合物，如食品組合物或藥物組合物，同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本發明的第八方面，本發明提出了一種藥物，包括：第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體、第五方面所述的重組細胞或第六方面所述的組合物，所述藥物用於治療或預防癌症。如前所述，本發明實施例的重組抗體可以有效與CD3或B7H6蛋白分子結合，進而可特異性識別高表達所述B7H6的腫瘤細胞，並促使T細胞選擇性地定位到腫瘤局部而不是在外周循環，避免全身活化，包含所述重組抗體系列物質的藥物同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根據本發明的一些具體實施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
根據本發明的一些具體實施例提供的藥物，包括藥學上可接受的載體和有效量的所述抗體活性成分。
如本文所用，術語「有效量」或「有效劑量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。
如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應) 的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
本發明的藥物含有安全有效量的本發明的活性成分以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物的劑型為注射劑、口服製劑(片劑、膠囊、口服液)、透皮劑、緩釋劑。例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物宜在無菌條件下製造。
本發明所述的活性成分的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本發明所屬技術領域具有通常知識者根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於：所述的活性成分的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
本發明所述的藥學上可接受的載體包括(但不限於)：水、鹽水、脂質體、脂質、蛋白、蛋白-抗體綴合物、肽類物質、纖維素、奈米凝膠、或其組合。載體的選擇應與給藥方式相匹配，這些都是本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。
用途
在本發明的第七方面，本發明提出了第一方面或第二方面所述的重組抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表達載體、第五方面所述的重組細胞或第六方面所述的組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防腫瘤。如前所述，本發明一些具體實施例提供的重組抗體可以有效與CD3和B7H6蛋白結合，進而可特異性識別特異性高表達所述B7H6的腫瘤細胞，利用所述重組抗體及其相應的一系列物質製備的藥物同樣具有顯著的治療或預防表達B7H6的腫瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根據本發明的一些具體實施例，上述用途還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的一些具體實施例，所述腫瘤包括下列中的至少之一：直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
試劑盒
在本發明的第九方面，本發明提出了一種試劑盒，包括：第一方面或第二方面所述的重組抗體。本發明的一些具體實施例提供的所述重組抗體可與B7H6蛋白進行結合，因此，包含所述重組抗體的試劑盒可用於有效診斷或檢測高表達所述B7H6蛋白的腫瘤。
根據本發明的一些具體實施例，所述試劑盒用於診斷或檢測直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。本發明一些具體實施例提供的重組抗體可以有效與CD3和B7H6蛋白分子結合，進而可特異性識別特異性高表達所述B7H6的腫瘤細胞，因此，所述重組抗體可用於製備診斷或檢測直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的試劑盒，所述試劑盒可用於科學研究，如定性或定量檢測生物樣品中的CD3和/或B7H6蛋白分子。
下面將對實施例作具體介紹。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 CD3×B7H6雙特異性抗體分子的設計及構建
本實施例通過對多種構型進行篩選，發明人確定了以scFv-Fc構型的雙特異性抗體，這個雙特異性抗體被命名為CD3×B7H6。所述抗體含有兩個單價單元，其中一個單價單元為抗CD3的ScFv-Fc形式，另一個單價單元為抗B7H6的ScFv-Fc形式，採用一條連接肽將所述CD3抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區相連，採用與前所述相同的1條連接肽將所述B7H6抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區相連，所連接肽具有如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，所述CD3抗體具有如SEQ ID NO：13所示的輕鏈可變區，和如SEQ ID NO：14所示的重鏈可變區，所述B7H6抗體具有如SEQ ID NO：15-20所示的輕鏈可變區，和如SEQ ID NO：21-26所示的重鏈可變區。其中，發明人對不同的B7H6抗體可變區與CD3抗體的可變區的組合進行篩選，共構建了18個CD3×B7H6重組抗體分子；並且對單價單元的Fc均進行氨基酸突變改造，抗CD3的Fc區域氨基酸在位置384處變化為半胱氨酸（S384C）及在位置396處變化為色氨酸（T396W），抗B7H6的Fc區域氨基酸在位置380處變化為半胱氨酸（Y380C），在位置397處變化為絲氨酸（T397S），在位置399處變化為丙氨酸（L399A）及在位置408處變化為纈氨酸（Y408V），使其各自不容易形成同二聚體，而易於形成異二聚體，該異二聚體即為雙特異性抗體CD3×B7H6，具體結構如圖1所示，所述18個CD3×B7H6重組抗體分子具有如SEQ ID NO：27所示的CD3單鏈抗體、如SEQ ID NO：28-45所示的B7H6單鏈抗體、如SEQ ID NO:47所示的第一抗體Fc區、如SEQ ID NO:48所示的第二抗體Fc區。
使用常見的分子生物學技術，將編碼CD3及B7H6（1-18）單價單元多肽鏈的核酸序列分別克隆於表達載體pTT5（優寶生物，貨號VT2202）中，具體的核苷酸序列為SEQ ID NO: 69，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。同時為了使其在CHO細胞中高效表達並分泌到培養基中，選擇了鼠源抗體kappa鏈的前導肽作為分泌信號肽插入到表達載體上，信號肽位於抗體可變區的N端，其氨基酸序列為：METDTLLLWVLLLWVPGSTG（SEQ ID NO: 68），編碼所述信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 88所示。 ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCTCCACCGGC（SEQ ID NO: 88）。
CD3單鏈抗體 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 27）。
B7H6-1單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 28）。
B7H6-2單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 29）。
B7H6-3單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 30）。
B7H6-4單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 31）。
B7H6-5單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 32）。
B7H6-6單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 33）。
B7H6-7單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 34）。
B7H6-8單鏈抗體 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 35）。
B7H6-9單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 36）。
B7H6-10單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 37）。
B7H6-11單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 38）。
B7H6-12單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 39）。
B7H-13單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 40）。
B7H6-14單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 41）。
B7H6-15單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 42）。
B7H6-16單鏈抗體 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 43）。
B7H6-17單鏈抗體 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 44）。
B7H6-18單鏈抗體 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 45）。
第一Fc區氨基酸序列 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 47）。
第二Fc區氨基酸序列 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 48）。
實施例2 CD3×B7H6雙特異性抗體的表達及純化
2.1 CD3×B7H6雙特異性抗體分子表達
通過用攜帶有CD3×B7H6鏈編碼基因的pTT5載體瞬時轉染ExpiCHO-S細胞（Gibco，貨號A29127）來製備結合CD3和B7H6的雙特異性分子，其中，18個CD3×B7H6鏈編碼基因分別具有如SEQ ID NO: 49所示的抗CD3的ScFv-Fc，以及如SEQ ID NO: 50-67所示的抗B7H6的ScFv-Fc。具體的實驗操作如下：轉染前一天，將ExpiCHO-S細胞調整細胞密度為（3-4）×10 6/mL，37℃，8% CO 2，120 rpm搖動培養過夜。轉染當天，細胞生長到7×10 6–1×10 7/mL，活率大於95%時準備轉染，使用新鮮預熱的ExpiCHO培養基（Gibco，貨號A2910002）將細胞稀釋到6×10 6/mL，再取含有CD3多肽鏈和B7H6多肽鏈的質粒以1：1的質量比，利用ExpiFectamine CHO轉染試劑（Gibco，貨號A29129）轉染到ExpiCHO-S細胞中，於37℃，8% CO 2，120 rpm搖動培養。轉染後18-22 h，將ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混勻後立即加入轉染後細胞，混勻，於32℃，5%CO 2，120 rpm搖動培養。轉染後第5天，向細胞中再補加8 mL ExpiCHO Feed，混勻後繼續培養。每日觀察細胞數和細胞活率變化，待細胞活率下降至80%以下或培養10-14天後離心收穫細胞，取上清純化或凍於-80℃備用。
2.2  CD3×B7H6雙特異性抗體分子純化
2.1實驗獲得的上清用0.22μm濾膜過濾，利用Mabselect prism A親和層析柱（GE公司，貨號17549854）從表達上清中捕獲帶有Fc結構域的抗體，用pH7.2的磷酸鹽緩衝液平衡層析柱後，上清過親和層析柱，用洗脫緩衝液（100mM 檸檬酸, pH2.7）洗脫，最後用PBS緩衝液濃縮置換，純化後的抗體通過SDS-PAGE鑒定純度在95%以上。
CD3 ScFv-Fc氨基酸序列 MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 49）。
B7H6-1ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 50）。
B7H6-2 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 51）。
B7H6-3 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 52）。
B7H6-4 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 53）。
B7H6-5 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 54）。
B7H6-6 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 55）。
B7H6-7 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 56）。
B7H6-8 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 57）。
B7H6-9 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 58）。
B7H6-10 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 59）。
B7H6-11 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 60）。
B7H6-12 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 61）。
B7H6-13 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 62）。
B7H6-14 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 63）。
B7H6-15 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 64）。
B7H6-16 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSVDYDGDSYMNWYLQKPGQPPQLLIYAASTLHSGIPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSKEDPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGKGLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 65）。
B7H6-17 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 66）。
B7H6-18 ScFv-Fc氨基酸序列 DIVLTQSPVSLAVPLGQRATISCKASQSVDYDADSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASTLHSGIPVRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAASYYCQQSKEDPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPEVVKPGASVKITCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTLYNQKFRGRVTLIVDKSSSTAYMELRSLTSDDTAVYYCARSEVFYGNYADYWGQGTTLTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO: 67）。
實施例3  CD3×B7H6雙特異性抗體與抗原的結合活性檢測（ELISA）
本實施例分別檢測所述CD3×B7H6雙特異性抗體與單抗原（B7H6抗原或CD3抗原）的結合活性，以及CD3×B7H6雙特異性抗體與雙抗原（B7H6抗原、CD3抗原）同時結合的結合活性，具體實驗操作如下：
3.1 CD3×B7H6雙特異性抗體與單抗原結合活性測定
將人B7H6（ACRO biosystems，貨號B76-H52H8）、人CD3抗原（ACRO biosystems，貨號CDD-H52W1）分別用包被緩衝液（35 mM NaHCO 3，15 mM Na 2CO 3, pH 9.6）稀釋至2 μg/mL，向酶聯板中每孔加入100 μL，4℃過夜。之後用PBST清洗3遍（0.05% Tween 20-PBS，pH7.2）。向板中加入300 μL封閉緩衝液（1% BSA, 0.05% Tween20-PBS, pH 7.2），室溫靜置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相應雙特異性抗體，室溫孵育1小時。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封閉緩衝液稀釋的HRP-兔抗人IgG二抗（boster，貨號BA1070），室溫孵育1小時。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室溫避光反應2-5分鐘，每孔再用2M 硫酸終止反應，最後用酶標儀讀取OD450數值。
具體的實驗結果如圖2A所示，圖2A顯示了不同的B7H6序列與CD3序列組成的CD3×B7H6雙特異性抗體分子與B7H6抗原的結合情況，可以看出這些雙特異性抗體分子均可以結合B7H6抗原，其中，CD3×B7H6-14的結合活性最強，因此，後續實驗主要圍繞CD3×B7H6-14展開；圖2B展示了CD3×B7H6-14雙特異性抗體分子可以結合CD3抗原。
3.2 CD3×B7H6雙特異性抗體與雙抗原結合活性測定
將人B7H6（ACRO biosystems，貨號B76-H82Wb）用包被緩衝液（35 mM NaHCO3，15 mM Na2CO3, pH 9.6）稀釋至2μg/mL，向酶聯板中每孔加入100 μL，4℃過夜。之後用PBST清洗3遍（0.05% Tween 20-PBS，pH7.2）。向板中加入300μL封閉緩衝液（1% BSA, 0.05% Tween20-PBS, pH 7.2），室溫靜置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相應雙特異性抗體，室溫孵育1小時。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封閉緩衝液稀釋的人CD3抗原（ACRO biosystems，貨號CDD-H52W1），室溫孵育1小時。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封閉緩衝液稀釋的HRP-抗His標簽二抗（Genscript，貨號A00612）,室溫孵育1小時。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室溫避光反應2-5分鐘，每孔再用2M 硫酸終止反應，最後用酶標儀讀取OD450數值。具體結果如圖2C所示，結果顯示，隨著CD3×B7H6-14雙特異性抗體分子濃度增加，其OD450讀數逐漸增加，說明該雙特異性抗體分子可以同時結合人CD3和B7H6。
實施例4 雙特異性抗體分子的體外殺傷檢測
4.1 人外周血單個核細胞（PBMC）的分離
將抗凝人外周血加入等體積的無菌PBS中，取50 mL無菌離心管，將25 mL稀釋後的外周血輕輕加到15 mL淋巴分離液上（GE healthcare，貨號17144003），整個過程保持界面清晰不晃動，21℃，400 g離心30 min，離心機升速1，降速0。離心後管內分為三層，中間層為淋巴細胞層，吸取中間的白膜層至新的50 mL離心管，吸取完畢後用PBS加滿至50 mL，500 g離心10 min。棄上清，加入1 mL PBS輕輕吹勻，PBS加滿40 mL，250 g離心10 min。
離心後棄去上清，用1 mL MACS緩衝液（0.5%BSA，2.5mM EDTA-PBS）重懸後稀釋計數。
4.2 純化T細胞分離
人T細胞使用磁珠分選（Miltenyi公司，貨號130096535）的方法將其從外周血中分離出來。將PBMC收集後棄盡上清，每10 7個細胞加入40 μL MACS buffer重懸細胞後再加入10 μL T Cell Biotin-Antibody Cocktail，混勻，4℃孵育10min。每10 7個細胞再加入30 μL MACS buffer和20 μL T Cell MicroBead Cocktail，混勻，4℃孵育15 min。將LS分離柱放入磁場，用3 mL MACS buffer 潤濕分離柱，將細胞懸液加入分離柱，1 mL MACS buffer 涮洗離心管後，加入分離柱，收集流出液。3 mL MACS buffer洗分離柱，收集流出液。混勻後，細胞計數。將細胞懸液300 g，4℃，10 min離心後用培養基重懸。
4.3 貼壁腫瘤細胞體外殺傷檢測
將貼壁培養的腫瘤細胞消化後計數，調整細胞密度為2×10 5/mL。打開RTCA儀器（安捷倫），選擇儀器類型DP，選擇實驗模式，填寫細胞信息和藥物信息。進入schedule設置實驗步驟，將板子加入50μL新鮮培養基（89% RPMI 1640培養基+10%胎牛血清+1%青鏈黴素）後放入儀器中，關好，點擊第一步開始。完成Done後取出板子，加入100 μL細胞懸液，室溫靜置15-30min防止邊緣效應，放入儀器，點擊開始。待生長到對數期後，暫停，加入50μL純化T細胞（1×10 6/mL），並加入梯度濃度的雙特異性抗體，點擊開始，一段時間後分析。
具體實驗結果如圖所示，其中，隨著CD3×B7H6-14雙特異性抗體濃度增加，T細胞對HCT-15細胞（圖3A）、LoVo細胞（圖3B）、Hep G2細胞（圖3C）及SK-BR-3細胞（圖3D）的殺傷效率逐漸增加，說明CD3×B7H6-14可以很好地促進T細胞殺傷B7H6+的腫瘤細胞。
實施例5 螢光素酶反應法檢測懸浮細胞體外殺傷實驗
將過表達螢光素酶的腫瘤細胞收集後調整細胞密度為2×10 5/mL，如實施例4.1和4.2所描述分離純化、收集、純化T細胞並調整細胞密度為5×10 5/mL。各取50μL 腫瘤細胞和純化T細胞于96孔平底板中，並加入梯度濃度的雙特異性抗體，混勻。37℃，5% CO 2孵育4 小時後向每孔加入100 μL（15mg/mL）螢光素鉀鹽溶液（Goldbio公司，貨號LUCK-1G），快速混勻，用酶標儀檢測化學發光值。
具體實驗結果如圖所示，隨著CD3×B7H6-14雙特異性抗體添加濃度增加，其檢測到Ho8910和K562的化學發光值逐漸下降，說明存活的腫瘤細胞越少，即CD3×B7H6-14可以顯著促進T細胞殺傷Ho8910細胞（圖4A）和K562細胞（圖4B）。
實施例6 在B7H6陽性腫瘤細胞存在下檢測T細胞增殖情況
為了測定T細胞增殖，本實施例設置為2*2雙因素實驗，包括如下組：T細胞+PBS組、T細胞+CD3×B7H6-14組、HCT-15+T細胞+PBS組、HCT-15+T細胞+CD3×B7H6-14組，如實施例4.1和4.2所描述分離純化T細胞，用5μM細胞Trace CFSE（Invitrogen，貨號C34554）標記純化T細胞。隨後將標記後的T細胞與人結腸癌細胞（HCT-15細胞）以效靶比2：1混合，再向其中加入PBS或者雙特異性抗體，3天後收穫細胞，通過流式細胞儀檢測T細胞增殖情況。
具體實驗結果如圖所示，其中，CD3×B7H6-14雙特異性抗體在HCT-15存在的情況下可以顯著促進T細胞增殖（圖5A），並且隨著雙特異性抗體CD3×B7H6-14濃度增加，其促進T細胞增殖效果越明顯（圖5B）。
實施例7 在B7H6陽性腫瘤細胞存在下檢測T細胞活化和脫顆粒水平
如實施例4.1和4.2所描述分離純化T細胞，實驗共設置2組，其中，對照組為T細胞組，實驗組將T細胞與HCT-15靶細胞按照效靶比1：1加入至96孔板內，再加入梯度濃度的CD3×B7H6雙特異性抗體，混勻。37℃孵育24小時後離心收集細胞，用PBS重懸細胞，加入小鼠血清室溫封閉15分鐘，再加入檢測表面分子的流式抗體，4℃避光孵育30分鐘後用PBS清洗，再加入固定穿膜液（invitrogen，貨號00512343），室溫固定半小時以上。再加入穿膜緩衝液（invitrogen，貨號00833356）清洗，加入小鼠血清室溫封閉15分鐘，之後加入相應的細胞內分子標記抗體，室溫避光孵育30分鐘，再加入PBS清洗兩次後用流式細胞儀檢測。
具體實驗結果如圖6A和6B所示，其中，在B7H6+細胞存在(+HCT-15)情況下，隨著CD3×B7H6-14雙特異性抗體濃度增加，CD4+T細胞和CD8+T細胞表面表達CD69分子（圖6A）和細胞內表達CD107a（圖6B）的比例逐漸增多，而不存在B7H6+腫瘤細胞(-HCT-15)時，T細胞在經過雙特異性抗體孵育後活化和脫顆粒能力很有限，說明該雙特異性抗體可以特異性靶向T細胞和B7H6+腫瘤細胞並且促進T細胞活化和脫顆粒。
實施例8 在B7H6陽性腫瘤細胞存在下檢測T細胞分泌細胞因子
如實施例4.1和4.2所描述分離純化T細胞，對照組僅有T細胞，實驗組含有T細胞和HCT-15細胞，5×10 5個T細胞、5×10 5個T細胞和5×10 5個HCT-15細胞分別加入至24孔板內，總體積為500μL，再加入梯度濃度的CD3×B7H6雙特異性抗體（0、10 0、10 1、10 2、10 3），混勻。37℃孵育24小時後離心收集上清液，用CBA人Th1/Th2/Th17細胞因子檢測試劑盒（BD，貨號560484）檢測上清中各種細胞因子的濃度，最後用流式細胞儀檢測。
具體實驗結果如圖7A-D所示，其中，展示了細胞共孵育上清中IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A細胞因子的濃度，在HCT-15腫瘤細胞存在下，隨著CD3×B7H6-14抗體濃度增加，T細胞分泌這4種細胞因子的水平也逐漸增強，說明該雙特異性抗體可以促進T細胞活化並分泌細胞因子。
實施例9 活體內異種移植功效研究
為了檢測CD3×B7H6雙特異性抗體分子對於HCT-15腫瘤細胞的體內抗腫瘤活性，本實施例共設置3組進行實驗，包括緩衝液組、人免疫球蛋白（IGg）組和CD3×B7H6-14雙特異性抗體分子組。如實施例4.1和4.2所描述分離純化T細胞，再使用T細胞擴增試劑盒（gibco，貨號11131D）擴增T細胞7天。將HCT-15結直腸癌細胞（1×106）與擴增T細胞（2×106）混合後皮下注射（s.c.）於雄性NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc小鼠的皮下，接種後每隔兩天通過靜脈注射CD3×B7H6雙特異性抗體（1mg/kg，溶於PBS中）、IgG對照抗體（sigma，貨號I4506）或緩衝液（對照溶劑）到小鼠體內，共注射三次。通過外部卡尺測量檢測腫瘤長和寬並用標準公式計算腫瘤體積。
圖8展示了CD3×B7H6-14雙特異性抗體分子對於HCT-15細胞的體內抗腫瘤活性。通過CD3×B7H6-14雙特異性抗體治療可以明顯促使HCT-15腫瘤消退，而使用對照IgG或者對照溶劑則不能達到治療效果，說明CD3×B7H6雙特異性抗體具有明顯的體內抗腫瘤活性。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、 「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本發明所屬技術領域具有通常知識者在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
無
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中： 圖1是根據本發明實施例的重組雙特異性抗體的結構示意圖； 圖2A是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與人B7H6蛋白結合分析結果圖； 圖2B是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與人CD3蛋白結合分析結果圖； 圖2C是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與B7H6和人CD3雙抗原ELISA檢測結果圖； 圖3A是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與T細胞對HCT-15細胞的體外細胞毒性實驗分析結果圖； 圖3B是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與T細胞對LoVo細胞的體外細胞毒性實驗分析結果圖； 圖3C是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與T細胞對Hep G2細胞的體外細胞毒性實驗結果圖； 圖3D是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體與T細胞對SK-BR-3細胞的體外細胞毒性實驗結果圖； 圖4A是根據本發明實施例的T細胞與過表達螢光素酶的Ho8910細胞混合後加入梯度濃度的CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子，24小時後加入底物反應後檢測到的化學發光值的分析結果圖； 圖4B是根據本發明實施例的T細胞與過表達螢光素酶的K562細胞混合後加入梯度濃度的CD3×B7H6雙特異性抗體分子，24小時後加入底物反應後檢測到的化學發光值的分析結果圖； 圖5A是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞增殖影響的結果圖； 圖5B是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞增殖影響的統計分析圖；以及 圖6A是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對CD4+和CD8+T細胞活化的影響結果圖； 圖6B是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對CD4+和CD8+T細胞脫顆粒水平的影響結果圖； 圖7A是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞分泌IFN-γ的影響結果圖； 圖7B是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞分泌IL-2的影響結果圖； 圖7C是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞分泌IL-10的影響結果圖； 圖7D是根據本發明實施例的HCT-15細胞存在下CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對T細胞分泌IL-17A的影響結果圖；以及 圖8是根據本發明實施例的CD3×B7H6重組雙特異性抗體分子對於HCT-15細胞的體內抗腫瘤活性結果圖。

Claims (23)

  1. 一種重組抗體，其中含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列： CD3抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~6； B7H6抗體可變區CDR序列：SEQ ID NO: 7~12。
  2. 如請求項1所述的重組抗體，其中含有CD3抗體的可變區，所述CD3抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 13所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 14所示的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
  3. 如請求項1所述的重組抗體，其中所述抗體含有B7H6抗體的可變區，所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 22所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 24所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 20所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 15所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 26所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列； 所述B7H6抗體的可變區具有如SEQ ID NO: 18所示的輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的重鏈可變區，或者與SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
  4. 如請求項1所述的重組抗體，其中進一步包括連接肽； 任選地，所述連接肽具有SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列。
  5. 如請求項4所述的重組抗體，所述連接肽的N端與所述CD3抗體輕鏈可變區的C端相連，所述連接肽的C端與所述CD3抗體重鏈可變區的N端相連。
  6. 如請求項4所述的重組抗體，所述所述連接肽的N端與所述B7H6輕鏈可變區的C端相連，所述連接肽的C端與所述B7H6重鏈可變區的N端相連。
  7. 如請求項1所述的重組抗體，其中還含有第一Fc區和第二Fc區，所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
  8. 如請求項7所述的重組抗體，其中所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自人源IgG或其突變體； 任選地，所述第一Fc區和第二Fc區的至少一部分來自人源IgG1或其突變體。
  9. 如請求項7所述的重組抗體，其中所述第一Fc區與野生型IgG1 Fc區相比具有S384C突變和T396W突變中的至少之一。
  10. 如請求項9所述的重組抗體，其中所述第二Fc區與野生型IgG1 Fc區相比具有Y380C突變、T397S突變、L399A突變和Y408V突變中的至少之一。
  11. 如請求項7-10任一項所述的重組抗體，其中所述第一抗體Fc區具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述第二抗體Fc區具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
  12. 一種重組抗體，其中具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。
  13. 一種核酸，其中所述核酸編碼請求項1-12任一項所述的重組抗體。
  14. 如請求項13所述的核酸，其中具有SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。
  15. 一種表達載體，其中所述表達載體攜帶請求項13或14所述的核酸分子。
  16. 一種重組細胞，其中所述重組細胞攜帶請求項13或14所述的核酸分子、請求項15所述的表達載體或請求項1-12任一項所述的重組抗體。
  17. 一種組合物，其中包括：請求項1-12任一項所述的重組抗體、請求項13或14所述的核酸分子、請求項15所述的表達載體或請求項16所述的重組細胞。
  18. 請求項1-12任一項所述的重組抗體、請求項13或14所述的核酸分子、請求項15所述的表達載體、請求項16所述的重組細胞或請求項17所述的組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防癌症。
  19. 如請求項18所述的用途，其中所述癌症包括下列中的至少之一：直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
  20. 一種藥物，其中包括：請求項1-12任一項所述的重組抗體、請求項13或14所述的核酸分子、請求項15所述的表達載體、請求項16所述的重組細胞或請求項17所述的組合物，所述藥物用於治療或預防癌症。
  21. 如請求項20所述的藥物，其中所述癌症包括下列中的至少之一：直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
  22. 一種試劑盒，其中包括：請求項1-12任一項所述的重組抗體。
  23. 如請求項22所述的試劑盒，其中所述試劑盒用於診斷直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。
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