WO2023103335A1 - 双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种双特异性抗体，该重组抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：CD3抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6；B7H6抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。所述重组抗体能同时靶向CD3和B7H6，且半衰期得到显著延长，较单靶抗体表现出更强的肿瘤抑制能力。

Description

双特异性抗体及其应用
优先权信息
本申请请求2021年12月07日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202111485404.0的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及双特异性抗体及其应用，更具体地，涉及重组抗体、免疫细胞、核酸、表达载体、重组细胞、组合物、上述物质在制备药物中的用途、试剂盒。
背景技术
双特异性抗体是可同时特异性结合两个抗原位点的抗体。用于肿瘤治疗的双特异性抗体按照其作用机制可以分为三类：再导向效应细胞；免疫调节；靶向肿瘤细胞受体双重结合。其中，用于再导向功能的抗体在其中占据大多数，目前已经上市的两个用于肿瘤治疗的抗体也是基于T细胞再导向。根据双特异性抗体的特性，它也可以很好的运用于其他治疗体系中，例如双重免疫调节或者靶向同一细胞膜的两个分子。
B7H6是属于B7家族的I型跨膜蛋白，它包含了2个免疫球蛋白结构域。B7H6也是NK细胞活化性受体NKp30的配体。B7H6在多种肿瘤细胞上均有表达，但是在人的正常组织和健康外周血单核细胞并没有检测到B7H6的mRNA。在炎症环境中，一些促炎性细胞因子如IL-1β和TNF可以刺激CD14 +和CD16 +单核细胞和中性粒细胞上调表达B7H6。B7H6的肿瘤表达谱非常广泛，这包括白血病、淋巴瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肝癌等。B7H6的表达与一些癌症的转移也存在关联，但是在多数肿瘤中B7H6的作用目前还不清楚。目前，尽管B7H6在多种肿瘤中表达，但是针对这一分子的肿瘤治疗手段并不多。有研究者开发了针对B7H6的双特异性抗体，它的构建形式是BiTE，这种形式不含有天然抗体的恒定区，因此也决定了这种分子在体内的半衰期很短，很大程度上限制了其使用。
在基于T细胞再导向的双特异性抗体中，CD3这个靶点非常重要。与免疫卡控点阻断抗体不同的是，CD3相关的双特异性抗体可以越过TCR和肽-主要组织相容性复合物(pMHC)来介导T细胞活化，但在突触中的分子发挥作用过程与经典TCR-pMHC相互作用很相似。双特异性抗体的活性受CD3亲和力的影响，CD3高亲和力双特异性抗体在体外实验中有着更好的促杀伤效果，但是在体内存在致命的细胞因子释放综合征毒性，这与嵌合抗原受体(CAR)T细胞毒性非常相似。同时有研究发现非常低亲和力的CD3抗体序列在构建双特异性抗体后也可以有效地刺激T细胞活化。当CD3抗体亲和力在合适范围(200±78nM)且肿瘤靶点相关抗体是高亲和力时，双特异性抗体会促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化。因此，开发靶向性强的双特异性抗体对肿瘤的预防及治疗具有极大的价值。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本发明中，发明人对CD3、B7H6抗原结合片段进行多种组合和筛选，设计了重组双特异性抗体，所述重组双特异性重组抗体可以特异性结合CD3和特异性结合B7H6，进而靶向性地将B7H6分子带入到肿瘤细胞附近，通过与肿瘤细胞上的B7H6分子结合促使CD3 +的淋巴细胞与肿瘤细胞形成免疫突触，从而使淋巴细胞活化杀伤B7H6 +的肿瘤细胞，所述重组双特异性抗体具有较高的CD3和B7H6结合活性，且抗肿瘤活性较高。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，所述重组抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：CD3抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6；B7H6抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:1)。
YTSRLES(SEQ ID NO:2)。
QQGNTLPWT(SEQ ID NO:3)。
GYTMN(SEQ ID NO:4)。
LINPYKGVSTYNQKFKD(SEQ ID NO:5)。
SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO:6)。
KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:7)。
AASTLHS(SEQ ID NO:8)。
QQSKEDPRT(SEQ ID NO:9)。
DYNMD(SEQ ID NO:10)。
DINPNNGGTLYNQKFRG(SEQ ID NO:11)。
SEVFYGNYADY(SEQ ID NO:12)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
Figure PCTCN2022100475-appb-000001
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸编码的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第三方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效大量表达所述重组抗体，进而可有效用于对肿瘤，特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第一方面所述的重组抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效大量表达上述重组抗体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3或B7H6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞，并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防肿瘤。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白结合，进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞，利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白结合，进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞，利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白分子结合，进而可特异性识别特异性高表达所述B7H6的肿瘤细胞因此，所述重组抗体可用于制备诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的试剂盒，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD3和/或B7H6蛋白分子。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的重组双特异性抗体的结构示意图；
图2A是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与人B7H6蛋白结合分析结果图；
图2B是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与人CD3蛋白结合分析结果图；
图2C是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与B7H6和人CD3双抗原ELISA检测结果图；
图3A是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与T细胞对HCT-15细胞的体外细胞毒性实验分析结果图；
图3B是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与T细胞对LoVo细胞的体外细胞毒性实验分析结果图；
图3C是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与T细胞对Hep G2细胞的体外细胞毒性实验结果图；
图3D是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体与T细胞对SK-BR-3细胞的体外细胞毒性实验结果图；
图4A是根据本发明实施例的T细胞与过表达荧光素酶的Ho8910细胞混合后加入梯度浓度的CD3×B7H6重组双特异性抗体分子，24小时后加入底物反应后检测到的化学发光值的分析结果图；
图4B是根据本发明实施例的T细胞与过表达荧光素酶的K562细胞混合后加入梯度浓度的CD3×B7H6双特异性抗体分子，24小时后加入底物反应后检测到的化学发光值的分析结果图；
图5A是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞增殖影响的结果图；
图5B是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞增殖影响的统计分析图；以及
图6A是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对CD4+和CD8+T细胞活化的影响结果图；
图6B是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对CD4+和CD8+T细胞脱颗粒水平的影响结果图；
图7A是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞分泌IFN-γ的影响结果图；
图7B是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞分泌IL-2的影响结果图；
图7C是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞分泌IL-10的影响结果图；
图7D是根据本发明实施例的HCT-15细胞存在下CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对T细胞分泌IL-17A的影响结果图；以及
图8是根据本发明实施例的CD3×B7H6重组双特异性抗体分子对于HCT-15细胞的体内抗肿瘤活性结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
重组抗体
在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的一些具体实施例，所述重组抗体包含与CD3结合的第一抗原结合区以及与B7H6特异性结合的第二抗原结合区。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与T细胞上的CD3以及肿瘤细胞上的B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，通过与T细胞以及肿瘤细胞同时结合使得两种细胞形成细胞突触，抗肿瘤效果显著。
根据本发明的一些具体实施例，上述重组抗体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述重组抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：CD3抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6；B7H6抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果 显著。
RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:1)。
YTSRLES(SEQ ID NO:2)。
QQGNTLPWT(SEQ ID NO:3)。
GYTMN(SEQ ID NO:4)。
LINPYKGVSTYNQKFKD(SEQ ID NO:5)。
SGYYGDSDWYFDV(SEQ ID NO:6)。
KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:7)。
AASTLHS(SEQ ID NO:8)。
QQSKEDPRT(SEQ ID NO:9)。
DYNMD(SEQ ID NO:10)。
DINPNNGGTLYNQKFRG(SEQ ID NO:11)。
SEVFYGNYADY(SEQ ID NO:12)。
根据本发明的一些具体实施例，含有CD3抗体的可变区，所述CD3抗体的可变区具有如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:14所示的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
Figure PCTCN2022100475-appb-000002
根据本发明的一些具体实施例，所述抗体含有B7H6抗体的可变区，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
Figure PCTCN2022100475-appb-000003
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24 所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
Figure PCTCN2022100475-appb-000004
Figure PCTCN2022100475-appb-000005
根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽的N端与所述CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述CD3抗体重链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例，所述所述连接肽的N端与所述B7H6轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述B7H6重链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例，还含有第一Fc区和第二Fc区，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG1或其突变体。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有S384C突变和T396W突变中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述第二Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有Y380C突变、T397S突变、L399A突变和Y408V突变中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述第一抗体Fc区具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述第二抗体Fc区具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
Figure PCTCN2022100475-appb-000006
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
Figure PCTCN2022100475-appb-000007
Figure PCTCN2022100475-appb-000008
预防或治疗组合物
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码前面所述的重组抗体。根据本发明一些具体实施例的核酸编码的重组抗体可以有效与CD3、B7H6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。
编码CD3抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000009
编码B7H6-1抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000010
Figure PCTCN2022100475-appb-000011
编码B7H6-2抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000012
编码B7H6-3抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000013
编码B7H6-4抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000014
Figure PCTCN2022100475-appb-000015
编码B7H6-5抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000016
编码B7H6-6抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000017
Figure PCTCN2022100475-appb-000018
编码B7H6-7抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000019
编码B7H6-8抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000020
Figure PCTCN2022100475-appb-000021
编码B7H6-9抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000022
编码B7H6-10抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000023
编码B7H6-11抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000024
编码B7H6-12抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000025
编码B7H6-13抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000026
Figure PCTCN2022100475-appb-000027
编码B7H6-14抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000028
编码B7H6-15的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000029
Figure PCTCN2022100475-appb-000030
编码B7H6-16抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000031
编码B7H6-17抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000032
Figure PCTCN2022100475-appb-000033
编码B7H6-18抗体的核苷酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000034
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明一些具体实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，进而可有效用于对肿瘤，特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第一方面或第二方面所述的重组抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别是表达B7H6的肿瘤的特异性治疗或预防。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物，包括第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3或B7H6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞，并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体及相应一系列物质的组合物，如食品组合物或药物组合物，同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与CD3或B7H6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述B7H6的肿瘤细胞，并促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体系列物质的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
根据本发明的一些具体实施例提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
用途
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。如前所述，本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白结合，进而可特异性识别特异性高表达所述B7H6的肿瘤细胞，利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达B7H6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述肿瘤包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
试剂盒
在本发明的第九方面，本发明提出了一种试剂盒，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体。本发明的一些具体实施例提供的所述重组抗体可与B7H6蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测高表达所述B7H6蛋白的肿瘤。
根据本发明的一些具体实施例，所述试剂盒用于诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与CD3和B7H6蛋白分子结合，进而可特异性识别特异性高表达所述B7H6的肿瘤细胞，因此，所述重组抗体可用于制备诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的试剂盒，所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样品中的CD3和/或B7H6蛋白分子。
疾病治疗用途和方法
在本发明的第十方面，本发明提出了前面所述的重组抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物或药物在治疗或预防癌症中的用途。如前所述，所述重组抗体可以特异性识别上述CD3和/或B7H6蛋白，当CD3抗体亲和力在合适范围且肿瘤靶点相关抗体具有高亲和力时，双特异性抗体会促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，在有效治疗、预防癌症的同时避免全身活化，因此，根据本发明实施例的重组抗体、包含所述重组抗体的组合物、药物以及在合适条件下表达能够获得所述重组抗体的一系列物质，如上述核酸分子、表达载体、重组细胞等均可以用来治疗或预防癌症。
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种治疗或预防癌症的方法。根据本发明的一些具体实施例，包括向受试者施用以下中的至少之一：1)前面所述的重组抗体；2)前面所述的核酸分子；3)前面所述的表达载体；4)前面所述的重组细胞；或5)前面所述的组合物。如前所述，所述重组抗体可以特异性识别上述CD3和/或B7H6蛋白，当CD3抗体亲和力在合适范围且肿瘤靶点相关抗体具有高亲和力时，双特异性抗体会促使T细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，在有效治疗、预防癌症的同时避免全身活化，因此，根据本发明实施例的方法可以有效治疗或预防癌症，并避免全身T细胞活化。
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 CD3×B7H6双特异性抗体分子的设计及构建
本实施例通过对多种构型进行筛选，发明人确定了以scFv-Fc构型的双特异性抗体，这个双特异性抗体被命名为CD3×B7H6。所述抗体含有两个单价单元，其中一个单价单元为抗CD3的ScFv-Fc形式，另一个单价单元为抗B7H6的ScFv-Fc形式，采用一条连接肽将所述CD3抗体的轻链可变区和重链可变区相连，采用与前所述相同的1条连接肽 将所述B7H6抗体的轻链可变区和重链可变区相连，所连接肽具有如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，所述CD3抗体具有如SEQ ID NO：13所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO：14所示的重链可变区，所述B7H6抗体具有如SEQ ID NO：15-20所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO：21-26所示的重链可变区。其中，发明人对不同的B7H6抗体可变区与CD3抗体的可变区的组合进行筛选，共构建了18个CD3×B7H6重组抗体分子；并且对单价单元的Fc均进行氨基酸突变改造，抗CD3的Fc区域氨基酸在位置384处变化为半胱氨酸(S384C)及在位置396处变化为色氨酸(T396W)，抗B7H6的Fc区域氨基酸在位置380处变化为半胱氨酸(Y380C)，在位置397处变化为丝氨酸(T397S)，在位置399处变化为丙氨酸(L399A)及在位置408处变化为缬氨酸(Y408V)，使其各自不容易形成同二聚体，而易于形成异二聚体，该异二聚体即为双特异性抗体CD3×B7H6，具体结构如图1所示，所述18个CD3×B7H6重组抗体分子具有如SEQ ID NO：27所示的CD3单链抗体、如SEQ ID NO：28-45所示的B7H6单链抗体、如SEQ ID NO:47所示的第一抗体Fc区、如SEQ ID NO:48所示的第二抗体Fc区，两者通过上述突变后以knob-into-hole结构进行连接。
使用常见的分子生物学技术，将编码CD3及B7H6(1-18)单价单元多肽链的核酸序列分别克隆于表达载体pTT5(优宝生物，货号VT2202)中，具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:69，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。同时为了使其在CHO细胞中高效表达并分泌到培养基中，选择了鼠源抗体kappa链的前导肽作为分泌信号肽插入到表达载体上，信号肽位于抗体可变区的N端，其氨基酸序列为：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:68)，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:88所示。
Figure PCTCN2022100475-appb-000035
CD3单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000036
B7H6-1单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000037
B7H6-2单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000038
B7H6-3单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000039
B7H6-4单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000040
B7H6-5单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000041
Figure PCTCN2022100475-appb-000042
B7H6-6单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000043
B7H6-7单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000044
B7H6-8单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000045
B7H6-9单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000046
B7H6-10单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000047
B7H6-11单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000048
B7H6-12单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000049
B7H-13单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000050
B7H6-14单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000051
B7H6-15单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000052
B7H6-16单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000053
B7H6-17单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000054
B7H6-18单链抗体
Figure PCTCN2022100475-appb-000055
第一Fc区氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000056
第二Fc区氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000057
实施例2 CD3×B7H6双特异性抗体的表达及纯化
2.1 CD3×B7H6双特异性抗体分子表达
通过用携带有CD3×B7H6链编码基因的pTT5载体瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco，货号A29127)来制备结合CD3和B7H6的双特异性分子，其中，18个CD3×B7H6链编码基因分别具有如SEQ ID NO:49所示的抗CD3的ScFv-Fc，以及如SEQ ID NO:50-67所示的抗B7H6的ScFv-Fc。具体的实验操作如下：转染前一天，将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3-4)×10 6/mL，37℃，8％CO 2，120rpm摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7×10 6–1×10 7/mL，活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco，货号A2910002)将细胞稀释到6×10 6/mL，再取含有CD3多肽链和B7H6多肽链的质粒以1：1的质量比，利用ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco，货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中，于37℃，8％CO 2，120rpm摇动培养。转染后18-22h，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃，5％CO 2，120rpm摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10-14天后离心收获细胞，取上清纯化或冻于-80℃备用。
2.2 CD3×B7H6双特异性抗体分子纯化
2.1实验获得的上清用0.22μm滤膜过滤，利用Mabselect prism A亲和层析柱(GE公司，货号17549854)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠 檬酸,pH2.7)洗脱，最后用PBS缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95％以上。
CD3 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000058
B7H6-1ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000059
B7H6-2 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000060
B7H6-3 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000061
B7H6-4 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000062
B7H6-5 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000063
Figure PCTCN2022100475-appb-000064
B7H6-6 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000065
B7H6-7 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000066
B7H6-8 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000067
B7H6-9 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000068
B7H6-10 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000069
B7H6-11 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000070
Figure PCTCN2022100475-appb-000071
B7H6-12 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000072
B7H6-13 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000073
B7H6-14 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000074
B7H6-15 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000075
B7H6-16 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000076
B7H6-17 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000077
B7H6-18 ScFv-Fc氨基酸序列
Figure PCTCN2022100475-appb-000078
实施例3 CD3×B7H6双特异性抗体与抗原的结合活性检测(ELISA)
本实施例分别检测所述CD3×B7H6双特异性抗体与单抗原(B7H6抗原或CD3抗原)的结合活性，以及CD3×B7H6双特异性抗体与双抗原(B7H6抗原、CD3抗原)同时结合的结合活性，具体实验操作如下：
3.1 CD3×B7H6双特异性抗体与单抗原结合活性测定
将人B7H6(ACRO biosystems，货号B76-H52H8)、人CD3抗原(ACRO biosystems，货号CDD-H52W1)分别用包被缓冲液(35mM NaHCO 3，15mM Na 2CO 3,pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA,0.05％Tween20-PBS,pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-兔抗人IgG二抗(boster，货号BA1070)，室温孵育1小时。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2-5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。
具体的实验结果如图2A所示，图2A显示了不同的B7H6序列与CD3序列组成的CD3×B7H6双特异性抗体分子与B7H6抗原的结合情况，可以看出这些双特异性抗体分子均可以结合B7H6抗原，其中，CD3×B7H6-14的结合活性最强，因此，后续实验主要围绕CD3×B7H6-14展开；图2B展示了CD3×B7H6-14双特异性抗体分子可以结合CD3抗原。
3.2 CD3×B7H6双特异性抗体与双抗原结合活性测定
将人B7H6(ACRO biosystems，货号B76-H82Wb)用包被缓冲液(35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6)稀释至2μg/mL，向酶联板中每孔加入100μL，4℃过夜。之后用PBST清洗3遍(0.05％Tween 20-PBS，pH7.2)。向板中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA,0.05％Tween20-PBS,pH 7.2)，室温静置2h。再用PBST清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的人CD3抗原(ACRO biosystems，货号CDD-H52W1)，室温孵育1小时。再用PBST清洗3遍。每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的HRP-抗His标签二抗(Genscript，货号A00612),室温孵育1小时。用PBST清洗3遍，每孔加入TMB，室温避光反应2-5分钟，每孔再用2M硫酸终止反应，最后用酶标仪读取OD450数值。具体结果如图2C所示，结果显示，随着CD3×B7H6-14双特异性抗体分子浓度增加，其OD450读数逐渐增加，说明该双特异性抗体分子可以同时结合人CD3和B7H6。
实施例4双特异性抗体分子的体外杀伤检测
4.1人外周血单个核细胞(PBMC)的分离
将抗凝人外周血加入等体积的无菌PBS中，取50mL无菌离心管，将25mL稀释后的外周血轻轻加到15mL淋巴分离液上(GE healthcare，货号17144003)，整个过程保持界面清晰不晃动，21℃，400g离心30min，离心机升速1，降速0。离心后管内分为三层，中间层为淋巴细胞层，吸取中间的白膜层至新的50mL离心管，吸取完毕后用PBS加满至50mL，500g离心10min。弃上清，加入1mL PBS轻轻吹匀，PBS加满40mL，250g离心10min。
离心后弃去上清，用1mL MACS缓冲液(0.5％BSA，2.5mM EDTA-PBS)重悬后稀释计数。
4.2纯化T细胞分离
人T细胞使用磁珠分选(Miltenyi公司，货号130096535)的方法将其从外周血中分离出来。将PBMC收集后弃尽上清，每10 7个细胞加入40μL MACS buffer重悬细胞后再加入10μL T Cell Biotin-Antibody Cocktail，混匀，4℃孵育10min。每10 7个细胞再加入30μL MACS buffer和20μL T Cell MicroBead Cocktail，混匀，4℃孵育15min。将LS分离柱放入磁场，用3mL MACS buffer润湿分离柱，将细胞悬液加入分离柱，1mL MACS buffer涮洗离心管后，加入分离柱，收集流出液。3mL MACS buffer洗分离柱，收集流出液。混匀后，细胞计数。将细胞悬液300g，4℃，10min离心后用培养基重悬。
4.3贴壁肿瘤细胞体外杀伤检测
将贴壁培养的肿瘤细胞消化后计数，调整细胞密度为2×10 5/mL。打开RTCA仪器(安捷伦)，选择仪器类型DP，选择实验模式，填写细胞信息和药物信息。进入schedule设置实验步骤，将板子加入50μL新鲜培养基(89％RPMI 1640培养基+10％胎牛血清+1％青链霉素)后放入仪器中，关好，点击第一步开始。完成Done后取出板子，加入100μL细胞悬液，室温静置15-30min防止边缘效应，放入仪器，点击开始。待生长到对数期后，暂停，加入50μL纯化T细胞(1×10 6/mL)，并加入梯度浓度的双特异性抗体，点击开始，一段时间后分析。
具体实验结果如图所示，其中，随着CD3×B7H6-14双特异性抗体浓度增加，T细胞对HCT-15细胞(图3A)、LoVo细胞(图3B)、Hep G2细胞(图3C)及SK-BR-3细胞(图3D)的杀伤效率逐渐增加，说明CD3×B7H6-14可以很好地促进T细胞杀伤B7H6+的肿瘤细胞。
实施例5荧光素酶反应法检测悬浮细胞体外杀伤实验
将过表达荧光素酶的肿瘤细胞收集后调整细胞密度为2×10 5/mL，如实施例4.1和4.2所描述分离纯化、收集、纯化T细胞并调整细胞密度为5×10 5/mL。各取50μL肿瘤细胞和纯化T细胞于96孔平底板中，并加入梯度浓度的双特异性抗体，混匀。37℃，5％CO 2孵育4小时后向每孔加入100μL(15mg/mL)荧光素钾盐溶液(Goldbio公司，货号LUCK-1G)，快速混匀，用酶标仪检测化学发光值。
具体实验结果如图所示，随着CD3×B7H6-14双特异性抗体添加浓度增加，其检测到Ho8910和K562的化学发光值逐渐下降，说明存活的肿瘤细胞越少，即CD3×B7H6-14可以显著促进T细胞杀伤Ho8910细胞(图4A)和K562细胞(图4B)。
实施例6在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞增殖情况
为了测定T细胞增殖，本实施例设置为2*2双因素实验，包括如下组：T细胞+PBS组、T细胞+CD3×B7H6-14组、HCT-15+T细胞+PBS组、HCT-15+T细胞+CD3×B7H6-14组，如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞，用5μM细胞Trace CFSE(Invitrogen，货号C34554)标记纯化T细胞。随后将标记后的T细胞与人结肠癌细胞(HCT-15细胞)以效靶比2：1混合，再向其中加入PBS或者双特异性抗体，3天后收获细胞，通过流式细胞仪检测T细胞增殖情况。
具体实验结果如图所示，其中，CD3×B7H6-14双特异性抗体在HCT-15存在的情况下可以显著促进T细胞增殖(图5A)，并且随着双特异性抗体CD3×B7H6-14浓度增加，其促进T细胞增殖效果越明显(图5B)。
实施例7在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞活化和脱颗粒水平
如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞，实验共设置2组，其中，对照组为T细胞组，实验组将T细胞与HCT-15靶细胞按照效靶比1：1加入至96孔板内，再加入梯度浓度的CD3×B7H6双特异性抗体，混匀。37℃孵育24小时后离心收集细胞，用PBS重悬细胞，加入小鼠血清室温封闭15分钟，再加入检测表面分子的流式抗体，4℃避光孵育30分钟后用PBS清洗，再加入固定穿膜液(invitrogen，货号00512343)，室温固定半小时以上。再加入穿膜缓冲液(invitrogen，货号00833356)清洗，加入小鼠血清室温封闭15分钟，之后加入相应的细胞内分子标记抗体，室温避光孵育30分钟，再加入PBS清洗两次后用流式细胞仪检测。
具体实验结果如图6A和6B所示，其中，在B7H6+细胞存在(+HCT-15)情况下，随着CD3×B7H6-14双特异性抗体浓度增加，CD4+T细胞和CD8+T细胞表面表达CD69分子(图6A)和细胞内表达CD107a(图6B)的比例逐渐增多，而不存在B7H6+肿瘤细胞(-HCT-15)时，T细胞在经过双特异性抗体孵育后活化和脱颗粒能力很有限，说明该双特异性抗体可以特异性靶向T细胞和B7H6+肿瘤细胞并且促进T细胞活化和脱颗粒。
实施例8在B7H6阳性肿瘤细胞存在下检测T细胞分泌细胞因子
如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞，对照组仅有T细胞，实验组含有T细胞和HCT-15细胞，5×10 5个T细胞、5×10 5个T细胞和5×10 5个HCT-15细胞分别加入至24孔板内，总体积为500μL，再加入梯度浓度的CD3×B7H6双特异性抗体(0、10 0、10 1、10 2、10 3)，混匀。37℃孵育24小时后离心收集上清液，用CBA人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒(BD，货号560484)检测上清中各种细胞因子的浓度，最后用流式细胞仪检测。
具体实验结果如图7A-D所示，其中，展示了细胞共孵育上清中IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A细胞因子的浓度，在HCT-15肿瘤细胞存在下，随着CD3×B7H6-14抗体浓度增加，T细胞分泌这4种细胞因子的水平也逐渐增强，说明该双特异性抗体可以促进T细胞活化并分泌细胞因子。
实施例9活体内异种移植功效研究
为了检测CD3×B7H6双特异性抗体分子对于HCT-15肿瘤细胞的体内抗肿瘤活性，本实施例共设置3组进行实验，包括缓冲液组、人免疫球蛋白(IGg)组和CD3×B7H6-14双特异性抗体分子组。如实施例4.1和4.2所描述分离纯化T细胞，再使用T细胞扩增试剂盒(gibco，货号11131D)扩增T细胞7天。将HCT-15结直肠癌细胞(1×106)与扩增T细胞(2×106)混合后皮下注射(s.c.)于雄性NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc小鼠的皮下，接种后每隔两天通过静脉注射CD3×B7H6双特异性抗体(1mg/kg，溶于PBS中)、IgG对照抗体(sigma，货号I4506)或缓冲液(对照溶剂)到小鼠体内，共注射三次。通过外部卡尺测量检测肿瘤长和宽并用标准公式计算肿瘤体积。
图8展示了CD3×B7H6-14双特异性抗体分子对于HCT-15细胞的体内抗肿瘤活性。通过CD3×B7H6-14双特异性抗体治疗可以明显促使HCT-15肿瘤消退，而使用对照IgG或者对照溶剂则不能达到治疗效果，说明CD3×B7H6双特异性抗体具有明显的体内抗肿瘤活性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (26)

  1. 一种重组抗体，其特征在于，含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：
    CD3抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6；
    B7H6抗体可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。
  2. 根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，含有CD3抗体的可变区，所述CD3抗体的可变区具有如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:14所示的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，所述抗体含有B7H6抗体的可变区，所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区， 或者与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列；
    所述B7H6抗体的可变区具有如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，进一步包括连接肽；
    任选地，所述连接肽具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求4所述的重组抗体，所述连接肽的N端与所述CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述CD3抗体重链可变区的N端相连。
  6. 根据权利要求4所述的重组抗体，所述所述连接肽的N端与所述B7H6轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述B7H6重链可变区的N端相连。
  7. 根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，还含有第一Fc区和第二Fc区，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
  8. 根据权利要求7所述的重组抗体，其特征在于，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG或其突变体；
    任选地，所述第一Fc区和第二Fc区的至少一部分来自人源IgG1或其突变体。
  9. 根据权利要求7所述的重组抗体，其特征在于，所述第一Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有S384C突变和T396W突变中的至少之一。
  10. 根据权利要求9所述的重组抗体，其特征在于，所述第二Fc区与野生型IgG1 Fc区相比具有Y380C突变、T397S突变、L399A突变和Y408V突变中的至少之一。
  11. 根据权利要求7-10任一项所述的重组抗体，其特征在于，所述第一抗体Fc区具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述第二抗体Fc区具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
  12. 一种重组抗体，其特征在于，具有SEQ ID NO：49和63所示的氨基酸序列。
  13. 一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-12任一项所述的重组抗体。
  14. 根据权利要求13所述的核酸，其特征在于，具有SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：70-87所示的核苷酸序列中的至少之一。
  15. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求13或14所述的核酸分子。
  16. 一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求13或14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体或权利要求1-12任一项所述的重组抗体。
  17. 一种组合物，其特征在于，包括：权利要求1-12任一项所述的重组抗体、权利要求13或14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体或权利要求16所述的重组细胞。
  18. 权利要求1-12任一项所述的重组抗体、权利要求13或14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体、权利要求16所述的重组细胞或权利要求17所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症。
  19. 根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌 和肝癌。
  20. 一种药物，其特征在于，包括：权利要求1-12任一项所述的重组抗体、权利要求13或14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体、权利要求16所述的重组细胞或权利要求17所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症。
  21. 根据权利要求20所述的药物，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
  22. 一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-12任一项所述的重组抗体。
    根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于诊断直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。
  23. 权利要求1-12任一项所述的重组抗体、权利要求13或14所述的核酸分子、权利要求15所述的表达载体、权利要求16所述的重组细胞、权利要求17所述的组合物或权利要求21-22任一项所述的药物在治疗或预防癌症中的用途。
  24. 根据权利要求24所述的用途，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
  25. 一种治疗或预防癌症的方法，其特征在于，包括向受试者施用以下中的至少之一：
    1)权利要求1-12任一项所述的重组抗体；
    2)权利要求13或14所述的核酸分子；
    3)权利要求15所述的表达载体；
    4)权利要求16所述的重组细胞；
    5)权利要求17所述的组合物；或
    6)权利要求21-22任一项所述的药物。
  26. 根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114395047B (zh) * 2021-12-07 2023-11-07 合肥天港免疫药物有限公司 双特异性抗体及其应用
CN115611985A (zh) * 2022-10-27 2023-01-17 合肥天港免疫药物有限公司 抗cd3的抗体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110511278A (zh) * 2012-05-07 2019-11-29 达特茅斯大学理事会 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法
WO2021064137A2 (en) * 2019-10-02 2021-04-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Multi-specific binding proteins for cancer treatment
CN113286821A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
CN114395044A (zh) * 2021-12-07 2022-04-26 合肥天港免疫药物有限公司 重组抗体及其应用
CN114395047A (zh) * 2021-12-07 2022-04-26 合肥天港免疫药物有限公司 双特异性抗体及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2783740C (en) * 2009-12-09 2020-03-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Monoclonal antibodies that bind b7h6 and uses thereof
AR087601A1 (es) * 2011-08-23 2014-04-03 Roche Glycart Ag Anticuerpos sin fc que comprenden dos fragmentos fab y metodos de utilizacion
KR20240017102A (ko) * 2013-12-17 2024-02-06 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법
MX2017015011A (es) * 2015-05-28 2018-03-23 Genentech Inc Ensayo a base de celulas para detectar homodimeros anti-cd3.
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
US11034767B2 (en) * 2016-04-15 2021-06-15 Trustees Of Dartmouth College High affinity B7-H6 antibodies and antibody fragments
TWI805665B (zh) * 2017-12-21 2023-06-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合hla-a2/wt1之抗體

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110511278A (zh) * 2012-05-07 2019-11-29 达特茅斯大学理事会 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法
CN113286821A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
WO2021064137A2 (en) * 2019-10-02 2021-04-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Multi-specific binding proteins for cancer treatment
CN114395044A (zh) * 2021-12-07 2022-04-26 合肥天港免疫药物有限公司 重组抗体及其应用
CN114395047A (zh) * 2021-12-07 2022-04-26 合肥天港免疫药物有限公司 双特异性抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUN XIN; ZHAO JINGYUAN; MA LI; SUN XIMING; GE JING; YU YANG; MA JUAN; ZHANG MAN: "B7-H6 as an efficient target for T cell-induced cytotoxicity in haematologic malignant cells", INVESTIGATIONAL NEW DRUGS, SPRINGER US, NEW YORK, vol. 39, no. 1, 7 August 2021 (2021-08-07), New York, pages 24 - 33, XP037353706, ISSN: 0167-6997, DOI: 10.1007/s10637-020-00976-5 *

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