CN112794907B - 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 - Google Patents
一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112794907B CN112794907B CN202011394521.1A CN202011394521A CN112794907B CN 112794907 B CN112794907 B CN 112794907B CN 202011394521 A CN202011394521 A CN 202011394521A CN 112794907 B CN112794907 B CN 112794907B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ser
- thr
- gly
- leu
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了几种全人源抗人huOX40单克隆抗体，涉及高亲和力、低解离速率的抗人OX40单抗及其抗体片段。本发明在已构建大容量的全合成人源噬菌体抗体库基础上，利用磁珠偶联抗原法从中筛选获得了特异性抗人OX40单抗，和抗体工程改造后优选的几株高亲和力抗人OX40单抗，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体能特异性地与人huOX40抗原结合,包含全人源框架区以及全人源轻链和/重链的CDR区,其亲和力得到极大的提升，能更有效的识别人huOX40抗原。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程产品，涉开了几株具有高亲和力的全人源抗人huOX40的特异性单克隆抗体。
背景技术
目前，抗体在同种异体免疫排斥、自身免疫反应抑制、抗血小板治疗、癌症治疗等方面的应用非常广泛，也展现了诱人的市场前景；但鼠源的单克隆抗体在临床重复给药时在体内会产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱甚至消失。因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的；抗体库技术的出现为这一问题的解决提供了一条新的途径，Winter等在1994年就创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全利用基因工程技术制备人源性抗体。
噬菌体抗体库技术的特点：1.方法简单易行，节约时间，可通过发酵生产大量制备。2.选择范围广泛，可对百万至亿万个分子进行选择，获得高亲和力的人源抗体。3.可直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因或Ig的V区基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术。4.模拟了天然免疫系统亲和力的成熟过程，经过多轮突变，链置换和抗原选择等可创造出高亲和力的抗体。
OX40(CD134,TNFRSF4)，最初被定义为T细胞活化标记物，后发现是具有共激活功能的NGFR/TNFR超家族成员(Paterson DJ，et al,(1987)Mol Immunol.24:1281-1290)。OX40基因位于人1号染色体(小鼠4号染色体)，编码一种50kD的一型跨膜糖蛋白。胞外区有191个氨基酸，包含了三个完整的以及一个稍短的富含半胱氨酸结构域(CRDs)，主要由T细胞表达(结构性地由调节性T细胞表达，激活后由效应T细胞表达)。OX40的配体为OX40L，最初发现于HTLV-1转换的T细胞，被称为pg34，主要表达于APC，在NK细胞、肥大细胞和激活的T细胞上也有表达。OX40和OX40L的相互作用能够在OX40的胞内区域内招募TNFR相关(TRAFs)分子，形成包含IKKα和IKKβ以及PI3k和PKB(Akt)的信号传导复合物；OX40还与TCR信号协同作用，通过未知机制增强细胞内Ca2+，从而增强NFAT入核。OX40可激活经典的NF-κB1途径或非经典的NF-κB2途径、PI3k/PKB和NFAT途径，进而调控制T细胞分裂和存活的基因，以及促进细胞因子基因的转录以及细胞因子受体的表达，对于细胞存活至关重要。OX40信号传导会引起包括CTLA-4和Foxp3的下调(Gramaglia I,et al,(1998)J Immunol,161:6510–6517；Gramaglia I,et al,(2000)J Immunol,165:3043–3050；Murata K,et al,(2002)JImmunol,169:4628–4636)。
研究表明，在携带肿瘤的小鼠中，通过可溶性小鼠OX40L-免疫球蛋白融合蛋白可增强抗肿瘤免疫，导致小鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型中出现无肿瘤生存(Sμgamura etal.Nature Rev Imm2004；4:420-431)。在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，通过抗人OX40抗体可增强肿瘤免疫，可抑制各种人类恶性肿瘤细胞系如结肠癌和前列腺癌等肿瘤生长。
以OX40为靶点的药物对免疫细胞的调节和抗肿瘤活性在一些临床前癌症模型中也得到证实。在携带B细胞淋巴瘤的小鼠模型中，将刺激APC的TLR9激动剂与OX40小鼠单克隆抗体和/或抗CTLA4抗体联合给药，都能减少注射部位肿瘤特异性Treg。更令人印象深刻的是，三种药物联合使用，肿瘤特异性Treg减少，并治愈了大多数小鼠。Oberst等人证明，人OX40L IgG4P Fc融合蛋白MEDI6383在体外和体内模型中诱导T细胞活化，并克服了Tregs介导的抑制作用。在小鼠肉瘤模型(MCA205)中，研究人员发现，抗OX40单抗治疗增加了TME中具有强T细胞受体信号的T细胞，而肿瘤引流淋巴结(dLN)中CD8+T细胞的增加较小。当与过继性T细胞治疗结合使用时，抗OX40单抗可将治愈率从9％提高到70％，肿瘤消退更大，生存期更长。Weinberg及其同事的研究结果表明，OX40信号与增强的特异性抗肿瘤免疫反应相关。
靶向OX40的药物与其他疗法的组合也有相关研究和评估。在临床前模型中，与抗OX40和抗CTLA-4联合治疗可显著提高CD4+和CD8+T细胞的增殖和活性，与抗OX40单药治疗相比，可转化为更好的治疗结果。当联合使用抗PD-1和/或抗PD-L1时，抗OX40显著增加了dLN和肿瘤自身分化T细胞的扩张和效应器特性，CD8+/Treg比值增加，表现为肿瘤迅速萎缩和持久反应。在另一个小鼠模型中，与对照组相比，抗OX40和靶向CD73(在TME中负责免疫抑制和促血管生成)的联合治疗使生存期延长，免疫应答和肿瘤反应增强。与抗PD-1和抗OX40单药治疗相比，给予ATOR-1015可使小鼠膀胱癌模型的生存期延长、肿瘤缩小以及完全缓解率提高。
鉴于抗OX40抗体可以活化T细胞、诱导T细胞介导的抗肿瘤活性，本发明优选的抗OX40抗体可以增强T效应细胞的免疫刺激、促进细胞因子的分泌，因此本发明OX40抗体有望用来治疗和延缓癌症和T细胞功能障碍相关疾病。
发明内容
本发明从构建的大容量全合成人源抗体库中，筛选获得了5株能高特异性结合人OX40的全人源抗人OX40抗体。本发明的申请人进行了大量的实验设计，采用极致亲和力成熟的方法，对上述2株单克隆抗体进行亲和力成熟改造，结合基因工程相关技术构建获得了几株优选的具有高亲和力的抗人OX40单克隆抗体，并对其体内外活性进行鉴定。
本发明利用本单位构建大容量的全合成人源噬菌体抗体库，从中筛选并优化获得了5株优选的全人源抗人OX40抗体A2、A3、B2、B11和C10。本发明的优选抗体A2-1和B11-11具有较高亲和力，能够更加有效地识别OX40抗原。
所述全人源抗人huOX40单抗是从本单位构建的大容量的全合成人源抗体库中筛选得到。
本发明所使用的抗体库，是大容量的全合成人源scFv噬菌体抗体库。为了提高和改变获得的候选抗体分子亲和力，采用了极致亲和力成熟技术，通过分子进化改进OX40单抗分子的结合能力。
本发明的极致亲和力成熟技术是通过PCR引入突变的，它主要包括关键氨基酸(KA)扫描和突变引物设计。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的核心。本发明中所述的目标区域(拟突变的区域)是抗体A2和B11分子的6个CDR区，优先选择的是轻链和重链的CDR3。
本发明中通过淘筛获得的抗体分子均是scFv形式的，这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成Fab、全长抗体或其他形式。
本发明中经亲和力成熟获得的高亲和力抗人OX40单克隆抗体A2-1，其原型分子A2是用人OX40作为抗原在全合成人源抗体库进行淘筛获得的。通过SPR法分析测定，A2-1和A2分别以2.00×10-10和3.71×10-7或更小的平衡解离常数KD(M)结合huOX40；其特征在于所述抗体与人OX40的亲和力相比A2提高了约540倍。
本发明中经亲和力成熟获得的高亲和力抗人OX40单克隆抗体B11-11，其原型分子B11是用人OX40作为抗原在全合成人源抗体库进行淘筛获得的。通过SPR法分析测定，B11-11和B11分别以7.76×10-10和1.2×10-8或更小的平衡解离常数KD(M)结合huOX40；其特征在于所述抗体与人OX40的亲和力相比B11提高了约650倍。
本发明的全人源框架和Fc区，以及人OX40序列是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆或cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于Genbank或其他出版物或网站提供的生物信息为基础部分，合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。
为了获得全长重链基因，可以把编码VH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgGl的恒定区。为获得全长轻链基因，可以把编码VL区的DNA整合到人轻链恒定区。优先选择的是人κ恒定区。
一株全人源抗人huOX40单克隆抗体，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体能特异性地与人huOX40抗原结合；所述huOX40单克隆抗体包括重链和轻链；重链可变区包括GC IDNO:17,GC ID NO:19,GC ID NO:21,GC ID NO:23,GC ID NO:25,GC ID NO:27所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列，轻链可变区包括GCID NO:16,GC ID NO:18,GC ID NO:20,GC ID NO:22,GC ID NO:24,GC ID NO:26所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列。即包括上述的5株优选的全人源抗人OX40抗体A2、A3、B2、B11和C10。
进一步的，所述huOX40单克隆抗体包括全人源抗huOX40单克隆抗体A2-1(重链可变区包括GC ID NO:17，轻链链可变区包括GC ID NO:16所示)和全人源抗huOX40单克隆抗体B11-11(重链可变区包括GC ID NO:25，轻链链可变区包括GC ID NO:24所示)。以A2和B11为母序列极致亲和力后得到。
进一步的，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体A2-1以A2的轻重链可变区为母序列，极致亲和力成熟后得到。
进一步的，所述全人源抗huOX40单克隆抗体B11-11以B11的轻重链可变区为母序列，极致亲和力成熟后得到。
进一步的，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体包括轻链与重链；所述轻链可变区包含如GC ID NO:28，GC ID NO:30，GC ID NO:32，GC ID NO:34，GC ID NO:36，GC ID NO:38所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列，所述重链包含如GC ID NO:29，GC ID NO:31，GC ID NO:33，GC ID NO:35，GC ID NO:37，GC ID NO:39所示氨基酸序列的任意一种或与其任意一种具有至少80％序列同一性的同源序列。包括图6所展示的A2-1，A2-53，A2-54，B11-3，B11-11，B11-516种氨基酸序列所代表的全人源抗huOX40单克隆抗体
进一步的，所述全人源抗huOX40单克隆抗体是IgG类，且是IgG1亚类抗体。
本发明的全人源抗huOX40单克隆抗体的用途，所述全人源抗huOX40单克隆抗体能识别人huOX40抗原。
为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段，可以把其相应的重链和轻链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。编码重链和轻链的基因可以分别插入到两个独立的载体，也可以插入到同一个载体，所述表达载体可以预置恒定区，也可以不预置恒定区。
本发明中重链和轻链的表达可以通过瞬时表达来实现。该表达策略包括用一种或多种带有编码抗体重链和轻链的DNA片段的表达载体共转染哺乳动物细胞，从而使重链和轻链在受体细胞中表达并组装,优选的表达方式是分泌到培养基中,可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。
附图说明
图1为pCD-OX40-Avi-His质粒构建图解；
图2为ELISA法测定5株全人源抗人OX40单抗的结合活性；
图3为FACS法测定5株全人源抗人OX40单抗的结合活性；
图4为FACS法测定5株全人源抗人OX40单抗的阻断活性；
图5为ELISA法测定全人源抗人OX40单抗亲和力成熟前后亲和力排序；
图6-a，A2-1在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图6-b，A2-53在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图6-c，A2-54在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图6-d，B11-3在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图6-e，B11-11在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图6-f，B11-51在不同浓度时的亲和力测定解离曲线；
图7为通过测定T细胞活化后由T细胞释放的炎性因子。
具体实施方案
以下实施例仅对本发明做进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如构建载体和质粒的方法等对于本领域中具有普通技术的人员所众所周知的。
实施例1：膜表达人OX40稳转细胞株制备
下载人OX40核苷酸序列(NCBI Reference Sequence:NM_016547.3)和氨基酸序列(NCBI Reference Sequence:NP_003318.1)，全基因合成抗人OX40全长基因，包括信号肽、胞外段、跨膜区和胞内段，两端设置合适的酶切位点。使用直接酶切的方式，将OX40全长基因构建到真核表达载体GC-ID(改造自pMH3质粒，杭州安普)，获得GC-ID-OX40质粒，线性化后，利用脂质体法，该质粒被转染到CHO-DG44细胞中，从而构建膜表达人OX40稳转细胞株DG44-OX40，用于流式细胞检测OX40单抗的结合活性。
实施例2：rhOX40-Avi-His-bio抗原蛋白制备
针对合成的OX40全长基因，设计合适的引物,正向引物F:CCGGAATTCGCCGCCACCATGTGTGTC,反向引物R:CCGGAATTCGGTACCCTAAATTTTCGCCAACG，将胞外段的免疫球蛋白可变区(IgV,29aa-214aa)结构域构建到用于重组蛋白真核表达的载体pCD-Avi-His(改造自pCDNA3.1+，Invitrogen公司)中，获得真核表达质粒pCD-OX40-Avi-His(图1)。图1为pCD-OX40-Avi-His质粒构建图解，该质粒经转染进入真核细胞，可获得表达的rhOX40-Avi-His蛋白。
将该质粒转染Expi 293悬浮细胞，使用培养基为Expi293TM Expression Medium(购自Gibco公司，货号A1435101)，转染试剂为Expi Fertamine 293Transfection Kit(购自Life Technologies公司，货号A14524)。转染后，细胞活率低于50％时，收集全部细胞离心，3000g离心5min，细胞上清液用0.22um滤膜(购自Millipore，REF号SLGPD33RB)过滤。将上清用3.5KD透析膜(购自BBI，货号F132594)透析过夜，使用GE公司的镍柱纯化系统Ni-NTA胶进行纯化后浓缩，用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自Thermo/Pierce，货号23225)测定蛋白浓度。利用BirA生物素化酶将Biotin共价连接到含有Avi标签肽序列的rhOX40-Avi-His蛋白，完成生物素化酶标记，BiaA酶和Biotin solution都来自GeneCopoeia公司，HitrapDesalting除盐柱来自GE公司，得到浓度较高，标记效率较好的rhOX40-Avi-His-bio蛋白，用于抗体淘筛。
实施例3：OX40单抗筛选
利用制备好的rhOX40-Avi-His-bio抗原蛋白，对8个全合成人源噬菌体抗体库进行4轮液相筛选，从第2、3、4轮的细菌培养板上挑取大量的单克隆，制备可溶性scFv抗体。
实施例4：ELISA检测可溶性抗体结合活性
首先用NaHCO3缓冲液将rhOX40-Avi-His稀释至1μg/ml铺96孔ELISA板(购自Nunc公司，货号469957)，每孔100μl，4℃冰箱过夜；第二天TPBS(PBS+0.1％Tween20)洗三遍，3％脱脂奶粉溶于TPBS作为封闭剂，加满每孔(约350μl)，37℃封闭1小时；然后TPBS洗三遍，加可溶性表达上清，100μl/孔，室温震荡温育1小时；TPBS洗三遍，加入1:5000稀释的Anti-Flag/HRP二抗(购自Sigma，货号A8592)，每孔100μl，室温震荡温育30min；TPBS洗三遍，每孔加入混有0.1％过氧化氢的OPD邻苯二胺(购自Sigma公司，货号78412)底物工作液100μl进行显色，约3-7分钟后加入100μl 1M硫酸终止，酶标仪(购自Biotek公司，货号ELX 800)测定OD490值。根据检测结果，获得了5株结合活性较强的scFv单链抗体。
实施例5：5株单链抗体的真核表达质粒构建
本实验室用于抗体真核表达的载体为pCD-huKappa和pCD-huIgG1，都改造自pCDNA3.1+(Invitrogen公司)。针对单链抗体轻链序列设计合适的引物，正向引物序列为ATTGGATCCACTGGTGACATCGTGTTGACGCAGTCTCCAGC或ATTGGATCCACTGGTGACATCGTGATGACTCAGTCTCCACTC，反向引物序列为AAGCTTGGTACCCTGACCGAAGGT或AATCGTACGTTTGATTTCAAGCTTAGTACCCTGAC，分别带有BamHI和KpnI或BsiWI酶切位点，针对单链抗体重链序列设计合适的引物，正向引物序列为ATTGGATCCACTGGTGACGTACAGCTGCAAGAGTCAGGT，反向引物序列为CACCAAGGTACCCTGACCCCAGTA，分别带有BamHI和KpnI酶切位点，PCR体系为4μl 2.5mMdNTPs，5μl FastPfu Buffer，1μl Forward Primer，1μl Reverse Primer，1μl FastPfuDNAPolymerase，适量的基因模板，以及ddH2O补齐到50μl，PCR反应程序为，95℃，2min；95℃20s，56℃20s，72℃15s，30cycles；72℃，5min。单一条带产物回收后使用BamHI和KpnI或BsiWI酶切，预混50μl的酶切体系，取适量的回收产物通过T4 DNA Ligase(购自Thermo)将轻链可变区基因构建到同样酶切的pCD-huKappa载体上，重链可变区基因构建到同样酶切的pCD-huIgG1载体上，连接体系为10μl。挑取阳性克隆测序验证，获得了5株单链抗体的轻重链真核表达质粒。将轻重链质粒瞬时共转染到Expi293悬浮细胞后，使用GE公司的ProteinA/Mabselect SuRe亲和层析胶纯化瞬转后的上清液，得到5株抗体的纯蛋白。
实施例6：ELISA初筛候选抗体亲和力排序
实验步骤如下：首先用50mM NaHCO3将rhOX40-AVI-His稀释到1μg/mL，铺96孔ELISA板，每孔100μl，于4℃冰箱过夜；第二天TPBS洗三遍，3％脱脂奶粉溶于TPBS作为封闭剂，加满每孔(约350μl)，37℃封闭1小时；然后TPBS洗三遍，用封闭剂将单抗稀释到1μg/mL，随后3倍梯度稀释，共稀释8个梯度，每孔100μl，室温震荡温育1小时；TPBS洗三遍，加入1:4000稀释的羊抗人/HRP二抗，每孔100μl，室温震荡温育30min；TPBS洗三遍，每孔加入混有0.1％过氧化氢的OPD邻苯二胺(购自Sigma公司，货号78412)底物工作液100μl进行显色，约3-7分钟后加入100μl 1M硫酸终止，酶标仪测定OD490值。该结果可用于初步计算OX40单抗与抗原rhOX40-AVI-His的相对亲和力EC50值，即半数有效浓度。
实施例7：初筛候选抗体细胞水平结合OX40检测
取对数生长期的DG44-OX40稳转细胞株，计数后分装到每管3×105细胞，1000g离心1min，弃上清，用含2％FBS的PBS洗液清洗两遍，将单抗稀释到10μg/ml和1μg/ml分别100μl加入对应的离心管中，细胞空白对照管和阴性对照管中加入100μl洗液，冰上温育1h(每10min轻弹混匀)；用含2％FBS的PBS洗液清洗三遍，羊抗人IgG/FITC按照1:200稀释，除细胞对照管外，每管加入100μl，冰上避光温育30min；用含2％FBS的PBS洗液清洗三遍，500μl的PBS悬浮细胞，立即上机检测。初筛候选抗体经过ELISA水平亲和力排序和流式检测其与人OX40分子细胞水平的结合活性，这5株单克隆抗体中，A2和B11这两个抗体分子的结合能力最强。在ELISA测定抗体相对亲和力实验中，A2、A3、B2、B11和C10的EC50分别为0.1864、0.1805、0.2382、0.0184和0.8974μg/mL(图2)；图2为ELISA法测定5株全人源抗人OX40单抗的结合活性。ELISA结果表明，全人源抗人OX40单抗可以与rhOX40-Avi-His抗原特异性结合。
在FACS检测OX40单抗细胞水平结合实验中，也是A2和B11这两个抗体分子表现最佳(图3、图4)。图3为FACS法测定5株全人源抗人OX40单抗的结合活性，结果表明，全人源抗人OX40单抗能够识别细胞表面的OX40蛋白。图4，FACS法测定5株全人源抗人OX40单抗的阻断活性。结果表明，全人源抗人OX40单抗能够呈现出浓度梯度依赖的与细胞表面OX40结合。
根据以上结果，选取A2和B11做为亲和力成熟的两个原型分子，采用极致亲和力成熟法对A2和B11进行抗体工程改造。
实施例8：A2和B11单抗的亲和力成熟。
首先对A2和B11抗体的6个CDR区按Kabat数据库进行定义，参照相同类别下已知抗体的序列设计饱和突变，采用逐个随机突提高亲和力成熟抗体库的有效库容的同时，理论上保证了可以监测对每个CDR中的氨基酸进行突变后的效果。
将设计好的突变引物委托苏州金唯智生物技术有限公司合成。以A2和B11质粒为模板，使用TransStart KD Plus PCR SuperMix(购自Transgene，货号AS301-01)聚合酶反应体系，通过重叠拼接PCR的方法分别扩增突变部分，PCR反应程序为，95℃，2min；95℃20s，60℃20s，72℃15s，10cycles；72℃，5min；95℃20s，56℃20s，72℃15s，20cycles；72℃，5min。连接转化后，结合本实验室高效电转感受态细胞，快速有效地各构建了3类由突变CDR区组合的亲和力成熟抗体文库，此scFv亲和力成熟噬菌体抗体库为一级库。
对6个突变CDR区的3类组合文库使用不同浓度梯度的rhOX40-Avi-His-bio抗原，进行了多轮液相筛选，淘筛到的克隆用原核表达的可溶性抗体进行ELISA判定相对亲和力。对亲和力高于野生型A2和B11的优选克隆进行序列分析，得到若干亲和力较大提高的CDR突变的scFv单链抗体。将部分有潜力的克隆如A2-1、A2-53和B11-11等，转入真核表达系统。使用ELISA(图5)，对上述获得的真核表达的单抗进行相对亲和力排序检测，结果显示，亲和力成熟后的优选抗体亲和力显著提高。
实施例9：亲和力常数测定
根据表面等离子共振(Surface PlasmonResonance，SPR)方法，利用T200分子间相互作用仪测定有潜力的优化后抗体OX40单抗的亲和力，即平衡解离常数。具体操作如下：使用SA芯片(GE；BR-1005-31)，用PBS稀释生物素标记的抗原rhOX40-Avi-His-bio至100ng/ml，抗原标记至200RU，每个样品测试7梯度，用PBS稀释2个OX40单抗蛋白至：8μg/mL，4，0.5，0.1，0.02，0.004，0.0008，0。测试结合、解离和Glycine 2.0(GE；BR-1003-55)再生条件。最后确定结合2分钟，解离10分钟，再生1分钟。计算最优抗体A2-1和B11-11等的平衡解离常数。如图6，浓度越高的曲线在浓度低的曲线上面，最下面一条曲线为baseline，浓度为0。在SPR法测定全人源抗人OX40单抗A2-1和B11-11与rhOX40-Avi-His-bio蛋白的结合动力学，测得其平衡解离常数KD(M)值约为2.0×10-10和7.76×10-10(每个图)。
实施例10：本发明的抗OX40抗体的激动剂活性
可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子评估本发明的抗OX40抗体的激动剂活性。用次优抗-CD3(0.25μg/ml)抗体(Biolegend)和抗-OX40(6μg/ml)测试抗体包被96孔平底板(Corning),在37摄氏度持续3小时。洗涤后，将100,000个膜表面高表达OX40的Jurkat-OX40-NFkB-21C6细胞加入到溶液中含有2μg/ml抗-CD28抗体(Biolegend)的总共100μl培养基的每孔中。3天后，通过FACS(Hu IL-2CBAFlex SetA4100Tst；BDPharmingen)测试IL-2分泌水平。
在如上测定法所述进行的实验中，亲和力成熟后的优选抗体A2-1和B11-11，在相对低浓度时比IgG1对照增加IL-2分泌，A2-1比来自百时美施贵宝的抗OX40抗体BMS-986178略增加IL-2分泌，B11-11比来自百时美施贵宝的抗OX40抗体BMS-986178增加数倍IL-2分泌(图7)，图7测定T细胞活化后由T细胞释放的炎性因子来评估本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。
将A2、B11以及A2-1和B11-11可变区序列与已公布的OX40单抗序列比对，均没有重复，因此，A2、B11以及A2-1和B11-11的单抗轻重链可变区是全新单抗序列。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何OX40抗体或其片段、方法和用途。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司
<120> 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体
<130> 2020
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> Human OX40氨基酸序列
<400> 1
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala
5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His
20 25 30
Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu
35 40 45
Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
50 55 60
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val
65 70 75
Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg
80 85 90
Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr
95 100 105
Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys
110 115 120
Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro
125 130 135
Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala
140 145 150
Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile
155 160 165
Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln
170 175 180
Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp
185 190 195
Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro
200 205 210
Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu
215 220 225
Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala
260 265 270
His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> MORX0916 VL氨基酸序列
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Gly His Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> MORX0916 VH氨基酸序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Ser Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser
95 100 105
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> BMS986178 VL氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
20 25 30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> BMS986178 VH氨基酸序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe
95 100 105
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> A2 VL氨基酸序列
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly
20 25 30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Asp Pro Arg Ala Thr Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> A2 VH氨基酸序列
<400> 7
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser
20 25 30
Asp Ser Gly Ala Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Ala Pro Ala Arg Gly Asp Thr
50 55 60
Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Trp Tyr Ile
95 100 105
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> A3 VL氨基酸序列
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp
20 25 30
Gln Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ala Val Arg Ala Thr Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Glu Gly Ser Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
95 100 105
Lys Arg
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> A3 VH氨基酸序列
<400> 9
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Thr Ala Ser Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Thr Asp Val Gly Ser Ala Thr
50 55 60
His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Asp Ser
95 100 105
Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
Ser
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> B2 VL氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu
20 25 30
His Asp Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr His Ala Asp Leu Arg Ala
50 55 60
Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 75
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
80 85 90
Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Arg Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln
95 100 105
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> B2 VH氨基酸序列
<400> 11
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Val Thr Asp Asp Gly Ser Arg
50 55 60
Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val
65 70 75
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
80 85 90
Ala Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Leu Asn
95 100 105
Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> B11 VL氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp
20 25 30
Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Asp Gln Arg Ala Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gln Gln Thr Ala Thr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
95 100 105
Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> B11 VH氨基酸序列
<400> 13
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Asp Gly Phe Ile Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Thr Thr Asn Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Phe Trp Asp Val
95 100 105
Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> C10 VL氨基酸序列
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp
20 25 30
Tyr Thr Gly Leu Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Asn Thr Arg Ala Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gln Gln Ser Val Lys Met Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
95 100 105
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> C10 VH氨基酸序列
<400> 15
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Thr Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Lys Leu Gly Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Gly Gly Ile
95 100 105
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> A2-1 VL氨基酸序列
<400> 16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Gly
20 25 30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Asp Leu Arg Ala Thr Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> A2-1 VH氨基酸序列
<400> 17
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser
20 25 30
Asp Ser Gly Ala Tyr Trp Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Ala Pro Ala Arg Gly Asp Thr
50 55 60
Leu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Trp Tyr Ile
95 100 105
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> A2-53 VL氨基酸序列
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly
20 25 30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ala Val Arg Ala Thr Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Glu Gly Ser Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
95 100 105
Lys
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> A2-53 VH氨基酸序列
<400> 19
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Thr Ala Ser Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Thr Asp Val Gly Ser Ala Thr
50 55 60
His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Asp Ser
95 100 105
Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
Ser
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> A2-54 VL氨基酸序列
<400> 20
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly
20 25 30
Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Asp Glu Arg Ala Thr Gly Val Pro Thr
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> A2-54 VH氨基酸序列
<400> 21
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser
20 25 30
Asp Ser Gly Ala Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Ala Pro Ala Arg Gly Asp Thr
50 55 60
Leu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Trp Tyr Ile
95 100 105
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> B11-3 VL氨基酸序列
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp
20 25 30
Ser Asp Gly Tyr Glu Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Asp Gln Arg Ala Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gln Gln Thr Pro Thr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
95 100 105
Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> B11-3 VH氨基酸序列
<400> 23
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Asp Gly Phe Ile Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Thr Thr Asn Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Phe Trp Asp Val
95 100 105
Ser Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
122
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> B11-11 VL氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp
20 25 30
Ser Asp Glu Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Asp Gln Arg Ala Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gln Gln Thr Pro Thr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
95 100 105
Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 25
<211> 122
<212> PRT
<213> B11-11 VH氨基酸序列
<400> 25
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Asp Gly Phe Ile Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Thr Thr Asn Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Phe Trp Asp Val
95 100 105
Ser Tyr Gly Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
122
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> B11-51 VL氨基酸序列
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Glu Ser Ser Gln Ser Val Asp
20 25 30
Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Asp Gln Arg Ala Ser
50 55 60
Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
80 85 90
Tyr Cys Gln Gln Thr Ala Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
95 100 105
Leu Glu Ile Lys Arg
110
<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> B11-51 VH氨基酸序列
<400> 27
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
5 10 15
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Asp Gly Phe Ile Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Thr Thr Asn Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
65 70 75
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
80 85 90
Ala Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Phe Trp Asp Val
95 100 105
Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
122
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> A2-1 LCDR1氨基酸序列
<400> 28
Arg Ala Ser Glu Asp Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> A2-1 LCDR2氨基酸序列
<400> 29
His Thr Asp Leu Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> A2-1 LCDR3氨基酸序列
<400> 30
Gln Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> A2-1 HCDR1氨基酸序列
<400> 31
Gly Asp Ser Val Ser Asp Ser Gly Ala Tyr Trp Val
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> A2-1 HCDR2氨基酸序列
<400> 32
Thr Ile Ala Pro Ala Arg Gly Asp Thr Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> A2-1 HCDR3氨基酸序列
<400> 33
Asp Val Trp Tyr Ile Asp Tyr
1 5
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> B11-11 LCDR1氨基酸序列
<400> 34
Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Ser Asp Glu Tyr Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> B11-11 LCDR2氨基酸序列
<400> 35
Arg Thr Asp Gln Arg Ala Ser
5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> B11-11 LCDR3氨基酸序列
<400> 36
Gln Gln Thr Pro Thr Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> B11-11 HCDR1氨基酸序列
<400> 37
Gly Gly Ser Ile Ser Ala Asp Gly Phe Ile Trp Gly
5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> B11-11 HCDR2氨基酸序列
<400> 38
Gly Ile Thr Thr Asn Gly Gly Tyr Thr Asp
5 10
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> B11-11 HCDR3氨基酸序列
<400> 39
Trp Phe Trp Asp Val Ser Tyr Gly Phe Asp Thr
5 10
Claims (3)
1.一种全人源抗人huOX40单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体包括全人源抗人huOX40单克隆抗体A2-1或全人源抗人huOX40单克隆抗体B11-11；
所述全人源抗人huOX40单克隆抗体A2-1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示 ，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
所述全人源抗人huOX40单克隆抗体B11-11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示 ，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所述的全人源抗人huOX40单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体A2-1的轻链可变区包含如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
或，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体B11-11的轻链可变区包含如SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；重链可变区包含如SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:39所示氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的全人源抗huOX40单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体是IgG1亚类抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011394521.1A CN112794907B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011394521.1A CN112794907B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112794907A CN112794907A (zh) | 2021-05-14 |
| CN112794907B true CN112794907B (zh) | 2022-09-06 |
Family
ID=75806411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011394521.1A Active CN112794907B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112794907B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR126257A1 (es) * | 2021-06-29 | 2023-10-04 | Hifibio Hk Ltd | Anticuerpo monoclonal anti-ox40 y métodos para su uso |
| CN114409781A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-04-29 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 全人源抗人cd40单克隆抗体及其应用 |
| CN114656564A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-06-24 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用 |
| CN114920844B (zh) * | 2022-06-27 | 2023-12-29 | 上海润诺生物科技有限公司 | 一种增强car-t功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013038191A2 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Bioceros B.V. | Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof |
| CN109734806A (zh) * | 2019-03-15 | 2019-05-10 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用 |
| CN110172090A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-08-27 | 北京岳昊科技发展有限公司 | Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用 |
| CN111196854A (zh) * | 2018-11-20 | 2020-05-26 | 上海开拓者生物医药有限公司 | Ox40抗体及其制备方法和应用 |
| WO2020108463A1 (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-04 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 人源化抗人ox40单克隆抗体及其制备方法和用途 |
-
2020
- 2020-12-03 CN CN202011394521.1A patent/CN112794907B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013038191A2 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Bioceros B.V. | Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof |
| CN111196854A (zh) * | 2018-11-20 | 2020-05-26 | 上海开拓者生物医药有限公司 | Ox40抗体及其制备方法和应用 |
| WO2020108463A1 (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-04 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 人源化抗人ox40单克隆抗体及其制备方法和用途 |
| CN109734806A (zh) * | 2019-03-15 | 2019-05-10 | 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 | 一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用 |
| CN110172090A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-08-27 | 北京岳昊科技发展有限公司 | Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Development and characterization of a novel anti-OX40 antibody for potent immune activation";Zhihui Kuang et al.;《Cancer Immunology,Immunotherapy》;20200220;第69卷;第939-950页 * |
| "抗人OX40单克隆抗体的制备和初步鉴定";侯小娟 等;《生物技术通讯》;20170531;第28卷(第3期);第242-248、376页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112794907A (zh) | 2021-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220251195A1 (en) | Anti-tigit antibodies and their use as therapeutics and diagnostics | |
| JP7273904B2 (ja) | 液性免疫応答の増強方法 | |
| JP7062640B2 (ja) | 抗ｃｄ１９抗体に対する抗イディオタイプ抗体 | |
| CN112794907B (zh) | 一株全人源抗人huOX40单克隆抗体 | |
| CN110305210B (zh) | 新型抗体分子、其制备方法及其用途 | |
| US11660340B2 (en) | Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function | |
| US11505605B2 (en) | T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function | |
| US20170335016A1 (en) | Stable multivalent antibody | |
| KR20160144430A (ko) | 트랜스진 유전자 태그 및 사용 방법 | |
| KR20170081699A (ko) | Cd47 항체, 방법 및 용도 | |
| CN111848809A (zh) | 靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途 | |
| CN112574312B (zh) | 一组ox40单克隆抗体及其医药用途 | |
| CN111454358A (zh) | 一种嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN111247429A (zh) | 用于新颖抗原结合模块的特异性测试的通用报告细胞测定法 | |
| TW202237661A (zh) | 抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３三特異性抗體及其用途 | |
| CN113698492B (zh) | 人间皮素嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN113004408B (zh) | 抗人程序死亡因子-1单克隆抗体 | |
| CN113527493A (zh) | 一种b7-h3抗体及其应用 | |
| CN109970859B (zh) | Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞 | |
| WO2022247804A1 (zh) | 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途 | |
| CN114656564A (zh) | 一种抗hu-OX40抗原的纳米抗体及其应用 | |
| WO2023093811A1 (zh) | 分子开关调控型嵌合抗原受体细胞和抗体的组合及其应用 | |
| WO2023165516A1 (zh) | 抗pd-l1和vegf双特异性抗体及其应用 | |
| KR20220087488A (ko) | Pd-l1 결합 분자 | |
| WO2024044779A2 (en) | Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |