JP2024502091A - Pd-1結合分子およびその使用 - Google Patents
Pd-1結合分子およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024502091A JP2024502091A JP2023540715A JP2023540715A JP2024502091A JP 2024502091 A JP2024502091 A JP 2024502091A JP 2023540715 A JP2023540715 A JP 2023540715A JP 2023540715 A JP2023540715 A JP 2023540715A JP 2024502091 A JP2024502091 A JP 2024502091A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- none
- seq
- binding molecule
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 145
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 title claims abstract 26
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 100
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 90
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 84
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 82
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 61
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 56
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 52
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 51
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 45
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 38
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 31
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 31
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 28
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract description 2
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 112
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 10
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 8
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 6
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- -1 respectively Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229940121497 sintilimab Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108091007744 Programmed cell death receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229950007712 camrelizumab Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012738 dissolution medium Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229950007123 tislelizumab Drugs 0.000 description 1
- 229940121514 toripalimab Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
Abstract
本発明は、抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子を提供し、前記単一ドメイン抗体の相補性決定領域CDRは、SEQ ID NO:1に示されるCDR1、SEQ ID NO:2に示されるCDR2およびSEQ ID NO:3に示されるCDR3を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、生物医学または生物製薬技術の分野に関し、より具体的には、PD-1およびその使用に関する。
プログラム細胞死受容体1タンパク質はPD-1( programmed death1)とも称され、T細胞表面に発現し、免疫抑制作用を発揮する膜貫通タンパク質である。PD-1は、2つのリガンド分子を有し、それぞれリガンドPD-L1及びPD-L2であり、PD-L1及びPD-L2は抗原提示細胞に比較的に高レベルで発現している。PD-L1及びPD-L2がPD-1に結合すると、T細胞の機能活性を負に制御するように作用し、腫瘍細胞は、一般的に、PD-L1又はPD-L2を高発現することで「免疫回避」を達成することができる(Lee Lら、J Clin Pharmacol. 2016 Feb;56(2):157-69)。したがい、PD-1薬物は、免疫系に対する正の制御効果によって腫瘍に対する殺傷を実現する。現在、PD-1は免疫チェックポイント阻害剤療法の同義語でもある。
黒色腫の治療における優れた有効性により、2014年と2015年に2つのPD-1モノクローナル抗体Pembrolizumab (Keytruda)とNivolumab (Opdivo)がFDAにより承認され、現在その適応症は20近くの固形腫瘍をカバーしている(Prasad Vら、Semin Oncol. 2017 Apr;44(2):132-135.)。現在、すでに4種類のPD-1モノクローナル抗体薬物が、中国で市販されており、それぞれ恒瑞医薬のカムレリズマブ(Camrelizumab)、百済神州ののチスレリズマブ(Tislelizumab)、イノベントのシンチリマブ(Sintilimab)、および君実生物のトリパリマブ(Toripalimab)である。
研究によると、従来のscfv抗体は、T細胞において発現量が低く、PD-1阻害剤の効果を十分に発揮することが困難であることが分かり、それが主にscfv抗体自体が凝集しやすく、フォールドによりミスマッチしやすく、また熱安定性が低いなどの性質に原因がある(Martin Nら、Macromol Biosci. 2017 Feb;17(2))。一方、ナノボディは発現しやすく、安定性が高く、親和性が高いなどの天然の長所を有し、ナノボディ自体の長所とPD-1生物学的メカニズムにより、PD-1ナノボディの開発には、非常に幅広い使用の見込みがある。優れた特異性、遮断活性、臨床的薬効を有し、且つ生産が簡単で、低コストで、薬物負荷を軽減する新規な抗PD-1単一ドメイン抗体の開発が、早急に解決すべき課題となっている。
本発明の目的はPD-1結合分子およびその使用を提供することである。
本発明の第1の態様は、抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子を提供し、前記単一ドメイン抗体の相補性決定領域CDRはCDR1、CDR2およびCDR3を含み、そのうち、CDR1がSEQ ID NO:1に示される配列を含み、CDR2がSEQ ID NO:2に示される配列を含み、CDR3がSEQ ID NO:3に示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:4-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、Lまた
はRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はFまたはSであり、X4はFまたはSであり、X5はG、IまたはTであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID
NO:16、19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4IX6X7であり、ただし、X1はDまたはRであり、X2はPまたはTであり、X3はSまたはFであり、X4はFまたはSであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:16または19に示される配列を含む。
または、さらに好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2FSX5YX7であり、ただし、X1はG、F、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X5はG、IまたはTであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5GX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はF、LまたはNであり、X4はA、G、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、N、IまたはTであり、X9は無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:2はIX2X3X4X5GX7TX9であり、X2はN、SまたはTであり、X3はLまたはNであり、X4はA、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、IまたはNであり、X9は無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72、73の何れか1つに示される配列を含む。
または、さらに好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4RGX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はFまたはLであり、X4はA、GまたはSであり、X7はD、NまたはTであり、X9は無しである。または、CDR2はSEQ ID NO:55またはその変異体を含み、前記変異体は、X1のIからVへの突然変異、X2のNからSまたはTへの突然変異、X3のLからFへの突然変異、X4のSからAまたはGへの突然変異、X7のDからNまたはTへの突然変異から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸変化を含む。例示的に、CDR2はSEQ ID NO: 53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しである。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、G、NまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はA、G、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、P、Q
、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、N、PまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、G、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、L、R、SまたはVであり、X11はF、G、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、S、TまたはYであり、X13はD、H、P、S、TまたはVであり、X14はE、F、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 76、87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、GまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はG、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、Q、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、NまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、R、SまたはVであり、X11はF、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、SまたはTであり、X13はH、P、S、TまたはVであり、X14はF、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである。または、CDR3はSEQ ID NO:87に示される配列またはその変異体を含み、前記変異体は、X1のGからE、GまたはVへの突然変異、X2のVからA、G、IまたはVへの突然変異、X3のDからA、E、G、N、VまたはYへの突然変異、X4のRからG、I、KまたはSへの突然変異、X5のRからC、I、L、QまたはWへの突然変異、X6のQからE、K、PまたはRへの突然変異、X7のYからC、D、HまたはNへの突然変異、X8のGからE、R、VまたはWへの突然変異、X9のLからF、S、VまたはWへの突然変異、X10のGからC、D、R、SまたはVへの突然変異、X11のIからF、L、N、S、TまたはVへの突然変異、X12のPからH、L、R、SまたはTへの突然変異、X13のPからH、S、TまたはVへの突然変異、X14のLからF、H、I、PまたはRへの突然変異、X15のAからSまたはVへの突然変異、X16のDからA、E、G、HまたはVへの突然変異、X17のHからN、Q、RまたはYへの突然変異から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸変化を含む。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:4-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID
NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:16、19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76、87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:16または19に示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72、73の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ
ID NO: 87、108-111、113-134、136-146、148-154、156-163、165-168、172、173、177-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO: 53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:5、7、10、14-16、19、26、27、29、30、33の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO: 41、47、50-52、55、56、61-66の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76、77、85-87、93、94、97、99-101、104の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体は、以下の群a1~群a136のいずれか1群に示されるCDR1、CDR2およびCDR3を含む:
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体VHHのFR1は表1における各抗体番号のVHHのFR1から選ばれ、VHHのFR2は表1における各抗体番号のVHHのFR2から選ばれ、VHHのFR3は表1における各抗体番号のVHHのFR3から選ばれ、VHHのFR4は表1における各抗体番号のVHHのFR4から選ばれる。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域である。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319のいずれか1つに示される。好ましくは、前記単一ドメイン抗体はSEQ ID NO: 197、200、223-319のいずれか1つに示される。
1つまたは複数の実施形態において、前記PD-1結合分子は1本、2本または複数本の本明細書に記載の抗PD-1単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片である。
1つまたは複数の実施形態において、前記多価の単一ドメイン抗体または多重特異性単一ドメイン抗体はリンカーにより複数の単一ドメイン抗体に連結される。前記リンカーはGとSから選ばれ1-15のアミノ酸からなる。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体の抗原結合断片は一本鎖重鎖抗体である。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体はラクダ科動物の重鎖抗体または軟骨魚類の重鎖抗体である。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体はさらに重鎖定常領域を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖定常領域はラクダ科動物の重鎖抗体の定常領域であり、CH2とCH3を含む。1つまたは複数の実施形態において、前記CH2とCH3はヒトIgG FcのCH2とCH3であり、例えばIgG4のCH2とCH3である。好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖定常領域は軟骨魚類の重鎖抗体の定常領域であり、CH1、CH2、CH3、CH4およびCH5を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗体は重鎖可変ドメインの抗体として前記抗PD-1単一ドメイン抗体を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗体はさらに軽鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。
1つまたは複数の実施形態において、抗体の抗原結合断片はFab、F(ab’)2、Fv、scFvから選ばれる。
1つ又は複数の実施形態において、本発明の何れか1つの実施形態に係る結合分子はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
本発明はさらにポリヌクレオチドを提供し、
(1)本明細書の実施形態のいずれかに記載の単一ドメイン抗体または本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のコード配列;
(2)(1)の相補配列;
(3)(1)または(2)のいずれかの配列の5-50bpの断片
から選ばれる。
1つ又は複数の実施形態において、前記断片がプライマーである。
1つまたは複数の実施形態において、前記ポリヌクレオチドの配列はSEQ ID NO:322または323に示される。
本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを提供する。
1つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトが組換えベクター又は発現ベクターである。
本発明はまた、本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子のファージを提供する。
1つまたは複数の実施形態において、前記PD-1結合分子は前記ファージ表面に提示される。
本発明はさらに宿主細胞を提供し、
(1)本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子を発現および/または分泌すること;
(2)本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むこと;および/または
(3)本明細書に記載の核酸コンストラクトを含むことから選ばれる。
本発明はまた、PD-1結合分子を産生する方法であって、PD-1結合分子(例えば一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体またはその抗原結合断片)の産生に適した条件で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養物から前記PD-1結合分子を精製することを含む方法を提供する。
本発明はさらに医薬組成物を提供し、本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ファージまたは宿主細胞、および薬学的に許容される補助剤を含む。
1つ又は複数の実施形態において、前記医薬組成物ががんを治療するために利用される。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はさらに本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子の、がんを予防または治療するための薬物の製造における使用を提供する。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はまた、がんを治療または予防するための方法を提供し、前記方法は、必要な患者に治療有効量の本発明の何れか1つの実施形態によるPD-1結合分子、または本発明の何れか1つの実施形態によるPD-1結合分子を含む医薬組成物を投与することを含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はまた、薬物治療の効果評価またはがん診断に使われるPD-1検出キットを提供し、前記キットは本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ファージ、宿主細胞を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記キットはPD-1の、単一ドメイン抗体、抗体、またはその抗原結合断片への結合を検出するための試薬をさらに含む。前記試薬は例えば酵素免疫測定法によって前記結合を検出する試薬である。
1つまたは複数の実施形態において、前記結合検出試薬は、例えばビオチンなどPD-1結合分子に結合することができる検出可能な標識である。前記検出可能な標識は前記PD-1結合分子に結合され、または個別にキットに存在する。
本発明は、試料中のPD-1の存在を検出するための非診断的方法であって、本明細書のいずれかの実施形態に記載のPD-1結合分子を試料と共にインキュベートすることと、PD-1の、単一ドメイン抗体、抗体またはその抗原結合断片への結合を検出し、それによって試料中のPD-1の存在を決定することとを含む方法も提供する。前記検出は酵素免疫測定法による検出である。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:4-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、Lまた
はRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はFまたはSであり、X4はFまたはSであり、X5はG、IまたはTであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID
NO:16、19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4IX6X7であり、ただし、X1はDまたはRであり、X2はPまたはTであり、X3はSまたはFであり、X4はFまたはSであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:16または19に示される配列を含む。
または、さらに好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2FSX5YX7であり、ただし、X1はG、F、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X5はG、IまたはTであり、X7はAまたはDである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5GX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はF、LまたはNであり、X4はA、G、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、N、IまたはTであり、X9は無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:2はIX2X3X4X5GX7TX9であり、X2はN、SまたはTであり、X3はLまたはNであり、X4はA、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、IまたはNであり、X9は無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72、73の何れか1つに示される配列を含む。
または、さらに好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4RGX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はFまたはLであり、X4はA、GまたはSであり、X7はD、NまたはTであり、X9は無しである。または、CDR2はSEQ ID NO:55またはその変異体を含み、前記変異体は、X1のIからVへの突然変異、X2のNからSまたはTへの突然変異、X3のLからFへの突然変異、X4のSからAまたはGへの突然変異、X7のDからNまたはTへの突然変異から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸変化を含む。例示的に、CDR2はSEQ ID NO: 53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しである。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含む。
好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、G、NまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はA、G、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、P、Q
、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、N、PまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、G、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、L、R、SまたはVであり、X11はF、G、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、S、TまたはYであり、X13はD、H、P、S、TまたはVであり、X14はE、F、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 76、87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
さらに好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、GまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はG、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、Q、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、NまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、R、SまたはVであり、X11はF、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、SまたはTであり、X13はH、P、S、TまたはVであり、X14はF、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである。または、CDR3はSEQ ID NO:87に示される配列またはその変異体を含み、前記変異体は、X1のGからE、GまたはVへの突然変異、X2のVからA、G、IまたはVへの突然変異、X3のDからA、E、G、N、VまたはYへの突然変異、X4のRからG、I、KまたはSへの突然変異、X5のRからC、I、L、QまたはWへの突然変異、X6のQからE、K、PまたはRへの突然変異、X7のYからC、D、HまたはNへの突然変異、X8のGからE、R、VまたはWへの突然変異、X9のLからF、S、VまたはWへの突然変異、X10のGからC、D、R、SまたはVへの突然変異、X11のIからF、L、N、S、TまたはVへの突然変異、X12のPからH、L、R、SまたはTへの突然変異、X13のPからH、S、TまたはVへの突然変異、X14のLからF、H、I、PまたはRへの突然変異、X15のAからSまたはVへの突然変異、X16のDからA、E、G、HまたはVへの突然変異、X17のHからN、Q、RまたはYへの突然変異から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸変化を含む。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:4-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID
NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:16、19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76、87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:16または19に示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72、73の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ
ID NO: 87、108-111、113-134、136-146、148-154、156-163、165-168、172、173、177-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO: 53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、CDR1はSEQ ID NO:5、7、10、14-16、19、26、27、29、30、33の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO: 41、47、50-52、55、56、61-66の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76、77、85-87、93、94、97、99-101、104の何れか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体は、以下の群a1~群a136のいずれか1群に示されるCDR1、CDR2およびCDR3を含む:
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域である。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319のいずれか1つに示される。好ましくは、前記単一ドメイン抗体はSEQ ID NO: 197、200、223-319のいずれか1つに示される。
1つまたは複数の実施形態において、前記PD-1結合分子は1本、2本または複数本の本明細書に記載の抗PD-1単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片である。
1つまたは複数の実施形態において、前記多価の単一ドメイン抗体または多重特異性単一ドメイン抗体はリンカーにより複数の単一ドメイン抗体に連結される。前記リンカーはGとSから選ばれ1-15のアミノ酸からなる。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体の抗原結合断片は一本鎖重鎖抗体である。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体はラクダ科動物の重鎖抗体または軟骨魚類の重鎖抗体である。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖抗体はさらに重鎖定常領域を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖定常領域はラクダ科動物の重鎖抗体の定常領域であり、CH2とCH3を含む。1つまたは複数の実施形態において、前記CH2とCH3はヒトIgG FcのCH2とCH3であり、例えばIgG4のCH2とCH3である。好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される。
1つまたは複数の実施形態において、前記重鎖定常領域は軟骨魚類の重鎖抗体の定常領域であり、CH1、CH2、CH3、CH4およびCH5を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗体は重鎖可変ドメインの抗体として前記抗PD-1単一ドメイン抗体を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記抗体はさらに軽鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。
1つまたは複数の実施形態において、抗体の抗原結合断片はFab、F(ab’)2、Fv、scFvから選ばれる。
1つ又は複数の実施形態において、本発明の何れか1つの実施形態に係る結合分子はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
本発明はさらにポリヌクレオチドを提供し、
(1)本明細書の実施形態のいずれかに記載の単一ドメイン抗体または本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のコード配列;
(2)(1)の相補配列;
(3)(1)または(2)のいずれかの配列の5-50bpの断片
から選ばれる。
1つ又は複数の実施形態において、前記断片がプライマーである。
1つまたは複数の実施形態において、前記ポリヌクレオチドの配列はSEQ ID NO:322または323に示される。
本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを提供する。
1つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトが組換えベクター又は発現ベクターである。
本発明はまた、本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子のファージを提供する。
1つまたは複数の実施形態において、前記PD-1結合分子は前記ファージ表面に提示される。
本発明はさらに宿主細胞を提供し、
(1)本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子を発現および/または分泌すること;
(2)本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むこと;および/または
(3)本明細書に記載の核酸コンストラクトを含むことから選ばれる。
本発明はまた、PD-1結合分子を産生する方法であって、PD-1結合分子(例えば一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体またはその抗原結合断片)の産生に適した条件で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養物から前記PD-1結合分子を精製することを含む方法を提供する。
本発明はさらに医薬組成物を提供し、本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ファージまたは宿主細胞、および薬学的に許容される補助剤を含む。
1つ又は複数の実施形態において、前記医薬組成物ががんを治療するために利用される。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はさらに本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子の、がんを予防または治療するための薬物の製造における使用を提供する。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はまた、がんを治療または予防するための方法を提供し、前記方法は、必要な患者に治療有効量の本発明の何れか1つの実施形態によるPD-1結合分子、または本発明の何れか1つの実施形態によるPD-1結合分子を含む医薬組成物を投与することを含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記がんはPD-1関連がんである。好ましくは、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などから選択される。
本発明はまた、薬物治療の効果評価またはがん診断に使われるPD-1検出キットを提供し、前記キットは本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、ファージ、宿主細胞を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記キットはPD-1の、単一ドメイン抗体、抗体、またはその抗原結合断片への結合を検出するための試薬をさらに含む。前記試薬は例えば酵素免疫測定法によって前記結合を検出する試薬である。
1つまたは複数の実施形態において、前記結合検出試薬は、例えばビオチンなどPD-1結合分子に結合することができる検出可能な標識である。前記検出可能な標識は前記PD-1結合分子に結合され、または個別にキットに存在する。
本発明は、試料中のPD-1の存在を検出するための非診断的方法であって、本明細書のいずれかの実施形態に記載のPD-1結合分子を試料と共にインキュベートすることと、PD-1の、単一ドメイン抗体、抗体またはその抗原結合断片への結合を検出し、それによって試料中のPD-1の存在を決定することとを含む方法も提供する。前記検出は酵素免疫測定法による検出である。
本発明はさらに、試料中のPD-1の検出、薬物治療の効果の評価、またはがん診断のためのキットの調製における、本明細書の実施形態のいずれかに記載のPD-1結合分子の使用を提供する。
本発明者は鋭意研究を重ね、多くの選別を経て、抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子を見出し、実験の結果によると、本発明の結合分子はPD-1を特異的に認識でき、PD-1に高い親和性で結合でき、良好な機能活性を有し、T細胞のサイトカイン分泌を促進でき、且つ組織交叉反応を起こしないことが分かる。本発明の単一ドメイン抗体の製造が簡単である。
具体的には、本発明は、ヒト由来のPD-1を用いてアルパカを免疫し、高品質の免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーを取得する。次に、PD-1たんぱく質をELISAプレートに結合し、免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーをファージディスプレイ技術によりスクリーニングし、PD-1特異的単一ドメイン抗体遺伝子を得る。次いで、この遺伝子を哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞で高度に発現でき、高い特異性を有する単一ドメイン抗体株が得られる。次に、ELISA、フローサイトメトリー、膜タンパク質交差反応、エピトープ競合試験などの方法により、高親和性、高特異性、高機能活性、低組織交差反応性を有する単一ドメイン抗体を同定する。
抗体
本明細書において、「PD-1結合分子」は、PD-1に特異的に結合するタンパク質であり、抗体、抗体の抗原結合断片、重鎖抗体、ナノボディ、ミニボディ、アフィボディ、受容体の標的結合ドメイン、細胞接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、及びケモカインを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「PD-1結合分子」は、PD-1に特異的に結合するタンパク質であり、抗体、抗体の抗原結合断片、重鎖抗体、ナノボディ、ミニボディ、アフィボディ、受容体の標的結合ドメイン、細胞接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、及びケモカインを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む)、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ダイアボディ、一本鎖分子、及び抗体断片(特に、抗原結合断片、例えば、Fab、F(ab’)2及びFv)を含む。本明細書において、用語「免疫グロブリン」(Ig)と「抗体」は互いに代用できる。
基本的な4本鎖抗体ユニットは2本の同じ軽鎖(L)と2本の同じ重鎖(H)により構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は5個の基本的なヘテロ四量体ユニット及びJ鎖と呼ばれるその他のポリペプチドからなり、10個の抗原結合部位を含む。IgA抗体は2-5個の基本的な4本鎖ユニットを含み、J鎖と重合して、多価集合体が形成できる。IgGの場合、4本鎖ユニットは通常約150,000ダルトンである。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結され、2本の重鎖は1つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されるが、ジスルフィド結合の数が重鎖のアイソタイプによって決定される。各重鎖と軽鎖との間は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド架橋を更に有する。各重鎖はN-末端に可変
ドメイン(VH)を有し、更に3つ(各α及びγ鎖に対しては、CH1、CH2とCH3である)及び4つ(μ及びεアイソタイプに対しては、CH1、CH2、CH3とCH4である)の定常ドメイン(CH)、およびCH1ドメインとCH2ドメインの間のヒンジ領域(Hinge)を有する。各軽鎖はN-末端に可変ドメイン(VL)を有し、更にその他端に定常ドメインを有する(CL)。VLはVHと整列し、CLは重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるVHとVLは一緒に1つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Basic and Clinical Immunology、第8版、Daniel P. Sties、Abba I. Terr及びTristram G. Parsolw編集、Appleton & Lange、Norwalk、CT、1994、71ページ及び第6章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる2種のうちの1種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5種類があり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるIgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のサブクラスに分けられる。
ドメイン(VH)を有し、更に3つ(各α及びγ鎖に対しては、CH1、CH2とCH3である)及び4つ(μ及びεアイソタイプに対しては、CH1、CH2、CH3とCH4である)の定常ドメイン(CH)、およびCH1ドメインとCH2ドメインの間のヒンジ領域(Hinge)を有する。各軽鎖はN-末端に可変ドメイン(VL)を有し、更にその他端に定常ドメインを有する(CL)。VLはVHと整列し、CLは重鎖の第1定常ドメイン(CH1)と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるVHとVLは一緒に1つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Basic and Clinical Immunology、第8版、Daniel P. Sties、Abba I. Terr及びTristram G. Parsolw編集、Appleton & Lange、Norwalk、CT、1994、71ページ及び第6章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる2種のうちの1種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5種類があり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるIgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のサブクラスに分けられる。
本明細書に記載の「重鎖抗体」はラクダ科生物または軟骨魚類生物由来の抗体である。上記の4鎖抗体と比べ、重鎖抗体は、軽鎖および重鎖定常領域1(CH1)を欠如し、可変領域(VHH)および他の定常領域からなる重鎖を2つのみ含み、可変領域は、ヒンジ領域構造に類似する構造によって定常領域と連結されている。ラクダ科動物の重鎖抗体の各重鎖は、1つの可変領域(VHH)及び2つの定常領域(CH2及びCH3)を含み、軟骨魚類の重鎖抗体の各重鎖は、1つの可変領域及び5つの定常領域(CH1-CH5)を含む。重鎖抗体の抗原結合断片はVHHと一本鎖重鎖抗体を含む。重鎖抗体は、ヒトIgG Fcの定常領域との融合により、ヒトIgG FcのCH2およびCH3を有することができる。
本明細書において、用語「単一ドメイン抗体」、「抗PD-1単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体の重鎖可変領域ドメイン」、「VHH」、「ナノボディ」は互いに交換して使用でき、いずれもPD-1を特異的に認識し、それに結合する単一ドメイン抗体を指す。単一ドメイン抗体は重鎖抗体の可変領域である。通常、単一ドメイン抗体は3つのCDRと4つのFRを含む。好ましくは、本発明の単一ドメイン抗体はSEQ ID NO:1に示されるCDR1、SEQ ID NO: 2に示されるCDR2、およびSEQ ID NO: 3に示されるCDR3を含む。単一ドメイン抗体は最も小さい機能性抗原結合断片である。通常、軽鎖および重鎖定常領域1(CH1)を天然に欠如した抗体を取得してから、抗体重鎖の可変領域をクローニングし、1つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築する。
2つ以上の単一ドメイン抗体を含む結合分子は、多価単一ドメイン抗体であり;2つ以上の異なる特異性単一ドメイン抗体を含む結合分子は、多重特異性単一ドメイン抗体である。多価の単一ドメイン抗体または多重特異性単一ドメイン抗体はリンカーにより複数の単一ドメイン抗体に連結される。前記リンカーは通常、GとSから選ばれ1-15のアミノ酸からなる。
本明細書において、重鎖抗体および抗体は、抗体の異なる組み合わせ方式を区別することを意図している。構造的に類似性を有するため、下記抗体に対する構造説明は軽鎖に関する内容以外は、重鎖抗体に適用する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ基末端ドメインである。重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ「VH」及び「VL」と呼ばれる。これらのドメインは通常、抗体の最も可変できる部分(同じタイプのその他の抗体)であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインにおける特定のセグメントが抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介して、特定抗体の、その特定抗原に対する特異性を限定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全てのアミノ酸スパンにわたって均一に分布しているわけではない。代わりに、超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメント(軽鎖及び重鎖可変ドメインのどちらにもある)に集中し、即ち、それぞれ重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2、HCDR3及び(重鎖抗体において、CDR1、CDR2、CDR3と略称してもよい)軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2、LCDR3である。可変ドメインにおけるより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ4つのFR領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)を含み、通常、βプリーツシート構造を採用するが、環状連結を形成すると共に場合によってβプリーツシート構造の一部を形成する3つのHVRにより連結される。各鎖におけるHVRは、FR領域により非常に近い距離で保持されており、且つ他方の鎖におけるHVRと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する。通常、軽鎖可変領域の構造はFR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4であり、重鎖可変領域の構造はFR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4である。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、例えば、抗体依存性細胞に仲介される細胞毒性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示している。
「Fc領域」(結晶性断片領域)または「Fcドメイン」または「Fc」は、抗体重鎖のC末端領域を指し、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するFc受容体への結合、または古典的補体系の第1成分(C1q)への結合を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。IgG、IgAおよびIgD抗体アイソタイプにおいて、Fc領域は、抗体の2本の重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインに由来する2つの同一のタンパク質断片から構成され;IgMおよびIgEのFc領域は、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2-4)を含む。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は、様々であり得るが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、一般的に、例えば、Kabatにおけるように、重鎖の位置C226またはP230のアミノ酸残基からカルボキシル末端までの配列セグメントとして定義され、その番号付けはEUインデックスに従う。本明細書において、Fc領域は天然配列Fcまたは変異体Fcであり得る。
「抗体断片」は無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域及び/又は可変領域を含む。抗体断片は抗体の抗原結合断片が好ましい。抗体断片の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片や、ダイアボディや、線状抗体や、一本鎖抗体分子や、scFv-Fc断片や、抗体断片により形成される多重特異性抗体や、化学的修飾又はリポソームに組込まれることにより半減期が増加可能な任意の断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、ならびに1つの残りの「Fc」断片を産生し、その名称は容易に結晶化する能力を反映している。Fab断片は完全な軽鎖及び重鎖可変ドメイン(VH)と1本の重鎖第1定常ドメイン(CH1)により構成される。各Fab断片は抗原結合に関して1価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、1つの大型F(ab’)2断片を生じ、これは、ジスルフィド結合によって連結された2つのFab断片にほぼ相当し、異なる抗原結合活性を有し、且つ依然として抗原を架橋することができる。Fab’断片は、CH1ドメインのカルボキシ基末端に幾つかのその他の残基(抗体ヒンジ領域に由来する1つ又は複数のシステインを含む)が付加されているため、Fab断片と異なる。F(ab’)2抗体断片は、元来対となるFab’断片として産生され、Fab’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片のその他の化学カップリングは既に知られている。Fc断片はジスルフィド結合により一体に保持されている2本の重鎖のカルボキシ基末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はFc領域における配列によって決定されるが、該領域は幾つかの種類の細胞に発見されたFc受容体(FcR)により認識された領域でもある。
「Fv」は完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、堅く、
非共有的に会合した1つの重鎖および1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら2つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原特異性を付与する6つの超可変ループ(各々重鎖および軽鎖からの3つのループ)を生じる。しかしながら、単一可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。「一本鎖Fv」は「sFv」又は「scFv」と略され、抗体VH及びVLドメインを含むと共に1本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはVHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、sFvを所望の抗原結合構造に形成させる。
非共有的に会合した1つの重鎖および1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら2つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原特異性を付与する6つの超可変ループ(各々重鎖および軽鎖からの3つのループ)を生じる。しかしながら、単一可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。「一本鎖Fv」は「sFv」又は「scFv」と略され、抗体VH及びVLドメインを含むと共に1本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはVHとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、sFvを所望の抗原結合構造に形成させる。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団により得られた抗体であり、即ち、天然に発生できる少量で存在可能な突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除き、集団を構成する各抗体が同様である。モノクローナル抗体は高度的な特異性を持ち、単一の抗原部位に対応するものである。ポリクローナル抗体製剤(異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を代表的に含む)に対して、各モノクローナル抗体は抗原における単一の決定基に対応する。これらの特異性の他に、モノクローナル抗体の優位性は、ハイブリドーマの培養によって合成されるため、その他の免疫グロブリンに汚染されていないことである。修飾語「モノクローナル」は、抗体が実質的に均質な抗体の集団により得られた特徴を示し、任意の特定方法による抗体の産生を要請すると解釈するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法、組換えDNA法、及び一部若しくは全体のヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物からヒト又はヒト様抗体を生成するための技術、単細胞シーケンシング法を含む様々な技術によって生成され得る。
本明細書において、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体を含み、これは、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖及び/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、並びに、このような抗体の断片である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。従って、「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に発見された配列と交換した非ヒト抗体である。通常、ヒト化抗体において、抗体全体(CDRを除く)は、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされ、又はこのような抗体(CDRを除く)と同じである。CDR(その一部又は全部が非ヒト生体に由来する核酸によりコードされる)がヒト抗体可変領域のβ-プリーツシート骨格に移植されて抗体が産生されるが、その特異性は移植されるCDRによって決定される。このような抗体を産生する方法は本分野において周知されており、例えば、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを利用して作製する。本発明において、抗体、単一ドメイン抗体、重鎖抗体等はいずれも、各抗体のヒト化変異体を含む。
「ヒト抗体」は、ヒトから産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び/又は本願に開示されたヒト抗体を産生するための任意の技術を利用して産生されるような抗体である。このヒト抗体の定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明らかに排除した。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーを含む、本分野における様々な既存技術を利用して産生してもよい。
幾つかの実施形態において、本発明はまた、本発明の任意の抗PD-1単一ドメイン抗体と
同じヒトPD-1エピトープに結合する単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体又はその抗原結合断片、すなわち、本発明の任意の単一ドメイン抗体と、PD-1への結合について交差競合することができる単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
同じヒトPD-1エピトープに結合する単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体又はその抗原結合断片、すなわち、本発明の任意の単一ドメイン抗体と、PD-1への結合について交差競合することができる単一ドメイン抗体、重鎖抗体、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明において、抗PD-1単一ドメイン抗体のCDR1はSEQ ID NO:1に示される配列を含み、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTである。例示的に、CDR1はSEQ ID NO:4-39、320の何れか1つに示される配列を含む。
抗PD-1単一ドメイン抗体のCDR2はSEQ ID NO:2に示される配列を含み、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しである。例示的に、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含む。
抗PD-1単一ドメイン抗体のCDR3はSEQ ID NO:3に示される配列を含み、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しである。例示的に、CDR3はSEQ ID NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含む。
1つまたは複数の実施形態において、単一ドメイン抗体はNB182、NB194またはその変異体であり、CDR1はSEQ ID NO:16、19、36-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72-75に示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76、87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。または、CDR1はSEQ ID NO:16または19に示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:52、53、55、72、73に示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-111、113-134、136-146、148-154、156-163、165-168、172、173、177-183の何れか1つに示される配列を含む。または、CDR1はSEQ ID NO: 19、36-39、320のいずれか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO: 53、55、72-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 87、108-183の何れか1つに示される配列を含む。
好ましくは、a14、a17、a40-a136から選ばれるいずれか1つの群に示されるCDR1、CDR2およびCDR3を含み、または、好ましくは、a14、a40-a44から選ばれるいずれか1つの群に示されるCDR1、CDR2およびCDR3を含み、または、好ましくは、a17、a45-a136から選ばれるいずれか1つの群に示されるCDR1、CDR2およびCDR3を含む。
1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体VHHのFR1は表1における各抗体番号のVHHのFR1から選ばれ、VHHのFR2は表1における各抗体番号のVHHのFR2から選ばれ、VHHのFR3は表1における各抗体番号のVHHのFR3から選ばれ、VHHのFR4は表1における各抗体番号のVHHのFR4から選ばれる。
好ましい実施形態において、前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域である。さらに好ましくは、このような抗体のCDRは前記群a1-群a136のいずれか1群に示されるCDRから選ばれる。1つまたは複数の実施形態において、前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319のいずれか1つに示される。好ましくは、前記単一ドメイン抗体はSEQ ID NO: 197、200、223-319のいずれか1つに示され
る。
る。
本明細書に記載のPD-1結合分子は1本、2本または複数本の本明細書に記載の抗PD-1単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片であり得る。前記重鎖抗体はさらに重鎖定常領域、例えばラクダ科動物の重鎖抗体または軟骨魚類の重鎖抗体の定常領域を含む。好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される。
本発明はさらに前記抗体誘導体と類似体を含む。「誘導体」及び「類似体」とは、本発明の抗体と相同な生物学機能又は活性を基本的に保持するタンパク質を指す。本発明の誘導体或いは類似体は、(i)1つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または(ii)成熟したポリペプチドがその他の化合物(例えば、ポリエチレングリコールなどの、ポリペプチドの半減期を延長する化合物)に融合して形成されたポリペプチド、或いは(iii)付加されたアミノ酸配列が当該ポリペプチド配列に融合されて形成されたポリペプチド(例えば、リーダー配列、分泌配列、当該ポリペプチドを精製するための配列又はタンパク質構成配列、或いは6Hisタグと形成された融合タンパク質)であってもよい。本明細書に教示されるように、これらの誘導体及び類似体は、当業者の周知範囲である。
抗体活性に実質的な影響を与えない前提で、当業者は本発明の配列に対して1個以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上)のアミノ酸を変更して、前記抗体又はその機能性断片配列の変異体を得ることができる。これらの変異体は、1つ又は複数の(通常は1-50個であり、好ましくは1-30個であり、より好ましくは1-20個であり、最も好ましくは1-10個である)アミノ酸が欠如、挿入及び/又は置換され、及びC末端及び/又はN末端に1つ又は複数の(通常は20個以下であり、好ましくは10個以下であり、より好ましくは5個以下である)アミノ酸が付加されることで得られたものを含むが、これらに限定されない。本分野において、近い特性又は類似的な特性を持つアミノ酸で性保存的な置換した場合、通常、タンパク質の機能が変化することはない。例えば、可変領域のFR及び/又はCDR領域で類似する特性を有するアミノ酸を置換する。保存的な置換できるアミノ酸残基は本分野で周知されている。このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされてもされなくてもよい。また、例えば、C末端及び/又はN末端に1つ又は複数のアミノ酸が付加された場合でも、通常、タンパク質の機能が変化することはない。これらは本発明により請求される範囲内に含まれると見なされる。
本明細書に記載される抗体の変異型には、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、および高または低ストリンジェンシー条件下で本発明の抗体をコードするDNAとハイブリダイズできるDNAによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を用いて得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る変異体の配列はその由来配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有してもよい。本発明に係る配列同一性は配列分析ソフトウエアを利用して測定できる。例えば、デフォルト引数を使用するコンピュータプログラムBLAST、特にBLASTP又はTBLASTNが挙げられる。本発明は、それらのCDRが本明細書で同定されるCDRと90%を超える(好ましくは95%を超え、最も好ましくは98%を超える)相同性を有する限り、CDRを有する抗体重鎖可変領域を有する分子をさらに含む。
例えば、本分野でよく知られているハイブリドーマ技術など、本分野の常用方法により本発明の抗体を製造してもよい。例えば、本分野でよく知られているファージディスプレイ技術など、本分野の常用方法により本発明の重鎖抗体を製造してもよい。または、本発明の抗体または重鎖抗体は他の細胞系で発現してもよい。本発明の抗体をコードする配列
で適切な哺乳動物宿主細胞を変換してもよい。変換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス(又はウイルスベクター)にパッケージングしてウイルス(又はベクター)で宿主細胞に対して形質導入を行うことなどを含む、任意の既知方法を採用してもよい。使用される変換工程は変換する宿主によって決定される。ヘテロポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は本分野においてよく知られており、デキストランにより仲介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンにより仲介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及びDNAの細胞核への直接マイクロインジェクションなどを含む。発現するための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は本分野においてよく知られており、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手できる様々な不死化細胞系を含むが、これらに限定されず、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、HepG2)などを含むが、これらに限定されない。特に好ましい細胞系は、高発現レベルを有するとともに、基本的なPD-1結合特性を有する抗体を産生する細胞系を特定することで選定する。
で適切な哺乳動物宿主細胞を変換してもよい。変換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス(又はウイルスベクター)にパッケージングしてウイルス(又はベクター)で宿主細胞に対して形質導入を行うことなどを含む、任意の既知方法を採用してもよい。使用される変換工程は変換する宿主によって決定される。ヘテロポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は本分野においてよく知られており、デキストランにより仲介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンにより仲介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及びDNAの細胞核への直接マイクロインジェクションなどを含む。発現するための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は本分野においてよく知られており、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手できる様々な不死化細胞系を含むが、これらに限定されず、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、HepG2)などを含むが、これらに限定されない。特に好ましい細胞系は、高発現レベルを有するとともに、基本的なPD-1結合特性を有する抗体を産生する細胞系を特定することで選定する。
核酸
本発明はさらに、前記抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各CDRをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはDNA形態又はRNA形態であってもよい。DNA形態はcDNA、ゲノムDNA又は人工合成DNAを含む。DNAは一本鎖又は二本鎖であってもよい。DNAはコード鎖又は非コード鎖であってもよい。
本発明はさらに、前記抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各CDRをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはDNA形態又はRNA形態であってもよい。DNA形態はcDNA、ゲノムDNA又は人工合成DNAを含む。DNAは一本鎖又は二本鎖であってもよい。DNAはコード鎖又は非コード鎖であってもよい。
当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重により大量の核酸を製造できるが、このような核酸の全ては本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が既に同定された場合、当業者はタンパク質をコードするアミノ酸配列を改変しない方式で1つ又は複数のコドンを簡単に修飾する配列により、任意数の異なる核酸を製造できる。したがって、本発明は、上記ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、且つ2つの配列間で少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%の同一性を有するポリヌクレオチドにも関する。本発明は、特に、本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、(1)例えば0.2×SSC、0.1%SDS、60℃など低いイオン強度および高い温度でのハイブリダイゼーションおよび溶出;または(2)例えば50%(v/v)ホルムアミド、0.1%子ウシ血清/0.1%Ficoll、42℃など変性剤によるハイブリダイゼーション;または(3)2つの配列間の同一性が少なくとも90%以上であり、より好ましくは95%以上である場合のみハイブリダイゼーションが発生する。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本発明の抗体のヌクレオチドの全長配列或いはその断片は、通常、PCR増幅法、組換え法または人工合成の方法により得られる。特に断片の長さが短い場合、人工合成方法により関連配列を合成してもよい。通常、複数の小さい断片を合成した後に、これらを結合して長い配列の断片を得る。さらに、重鎖のコード配列と発現タグ(6Hisなど)を融合して融合タンパク質を形成することもできる。
関連の配列を取得すると、組換え法により関連配列を大量に得ることができる。通常、それをベクターにクローニングして、細胞に導入した後に、通常の方法により増殖した宿主細胞から分離して関連配列を得る。本発明に係る生体分子(核酸、タンパク質等)には、単離された形態で存在する生体分子も含まれる。現在、化学合成だけにより、本発明のタンパク質(又はその断片、あるいはその誘導体)をコードするDNA配列を得ることがで
きる。その後、当該DNA配列を本分野における既知の様々な既存DNA分子(例えば、ベクター)と細胞に導入する。また、化学合成により突然変異を本発明のタンパク質配列に導入してもよい。
きる。その後、当該DNA配列を本分野における既知の様々な既存DNA分子(例えば、ベクター)と細胞に導入する。また、化学合成により突然変異を本発明のタンパク質配列に導入してもよい。
したがって、本発明はさらに、上記の適切なDNA配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む、発現ベクターおよび組換えベクターなどの核酸構築物に関する。これらのベクターは、タンパク質を発現させるように、適切な宿主細胞の形質転換に利用できる。ベクターは、通常、プラスミドの維持及び外因性ヌクレオチド配列のクローンと発現に使用される配列を含む。前記配列(幾つかの実施形態において「隣接配列」と総称される)は通常、1つ又は複数の下記ヌクレオチド配列、即ち、プロモーター、1つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌に利用されるリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとする抗体をコードする核酸を挿入するためのマルチコネクソン領域及び任意の標識エレメントを含む。例示的なベクターはCN105154473AとCN111206043Aを参照し、これらの文献は引用によりその全文が本明細書に組み込まれている。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、酵母細胞などの下等真核細胞、または哺乳類細胞などの高等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ミバエS2又はSf9などの昆虫細胞、CHO、COS7、293細胞などの動物細胞などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は例えば様々なキラー細胞など、当技術分野で知られている様々な機能細胞であり得、サイトカイン誘導キラー細胞(CIK)、樹状細胞刺激サイトカイン誘導キラー細胞(DC-CIK)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、γδT細胞、ナチュラルキラー細胞(NK)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、リンホカイン活性化キラー細胞(LAK)、CD3AK細胞(抗CD3モノクローナル抗体キラー細胞)およびCAR-T/TCR-T細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記キラー細胞はT細胞またはNK細胞である。例示的なNK細胞は初代NK細胞、NK細胞株(例えばNK92)およびNKT細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記NK細胞は初代NK細胞である。例示的なT細胞は末梢血Tリンパ球、細胞傷害性キラーT細胞(CTL)、ヘルパーT細胞、サプレッサー/制御性T細胞、γδT細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの混合細胞集団のT細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記T細胞は末梢血Tリンパ球およびTIL由来のT細胞である。
いくつかの実施形態において、宿主細胞はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するコード配列を含み、および/またはキメラ抗原受容体を発現する。
組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術で行うことができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、DNAを取り込むことができるコンピテントセルを指数増殖期後に採取でき、当技術分野で周知の手順を用いてCaCl2法で処理することができる。もう1つの方法はMgCl2を利用することである。必要な場合、形質転換はエレクトロポレーション法で行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法などのDNAトランスフェクション法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの通常機械方法生体してもよい。
得られた形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。培養に使用される培地は、使用される宿主細胞によって、様々な通常の培地から選べても良い。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法(温度変換や化学誘導など)によって選択されたプロモーターを誘導し、さらに一定期間細胞を培養する。
得られた形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。培養に使用される培地は、使用される宿主細胞によって、様々な通常の培地から選べても良い。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法(温度変換や化学誘導など)によって選択されたプロモーターを誘導し、さらに一定期間細胞を培養する。
上記方法におけるポリペプチドは、細胞内、または細胞膜に発現され、又は細胞外に分泌される。必要に応じて、その物理的、化学的、及びその他の特性を利用して、様々な分離方法で組換えタンパク質を分離および精製してもよい。これらの方法は、当業者に周知するものである。これらの方法は、通常の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理(塩析方法)、遠心分離、浸透殺菌、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及びその他の様々な液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
治療用途と医薬組成物
ナノボディのライブラリーを構築することにより、本発明者は、PD-1に結合することができる126個のナノボディ及びその変異体を発見し、発現および精製した。タンパク質レベルの親和性検出、細胞レベルの親和性検出、腫瘍細胞PD-1結合検出、エピトープ競合実験および組織交差反応によって、抗原および細胞に対するこれらの抗体の結合能力および薬物安全性を検証した。
ナノボディのライブラリーを構築することにより、本発明者は、PD-1に結合することができる126個のナノボディ及びその変異体を発見し、発現および精製した。タンパク質レベルの親和性検出、細胞レベルの親和性検出、腫瘍細胞PD-1結合検出、エピトープ競合実験および組織交差反応によって、抗原および細胞に対するこれらの抗体の結合能力および薬物安全性を検証した。
本明細書に記載される抗体の全ての様態は本明細書に記載される様々な病状及び疾患を予防または治療するための薬物の製造に利用できるが、前記病状及び疾患、特に病状はPD-1を発現する細胞に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施態様において、前記疾患または病状はがんであり、前記がんは黒色腫、肺がん、頭頸部癌、腎細胞がん、尿路上皮癌、非ホジキンリンパ腫などを含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物は本明細書に記載の結合分子、および薬学的に許容される補助剤、を含み、前記補助剤は希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び/又はアジュバントを含むが、これらに限定されない。補助剤は、好ましくは、用いられる用量および濃度において受容者に毒性はない。このような補助剤としては、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のpH値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を改善、維持又は保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られている。所望の投与経路、送達方式及び必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。
インビボで投与する医薬組成物は、通常、無菌製剤の形態で提供する。無菌ろ過膜によりろ過することで殺菌を実現する。組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥及び再構成の前に又はその後にこの方法により殺菌する。本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。非経口投与に利用される組成物は凍結乾燥の形態又は溶液で保存できる。例えば、生理食塩水、グルコースおよびその他の添加物を含む水溶液を用いて通常の方法により調製することができる。非経口組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、またはバイアルに入れられる。或いは、組成物は吸入又は消化器(例えば、経口)送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に抗体が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術(例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射)も当業者によく知られている。
医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、或いは脱水又は凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記調製物はレディー・ツー・ユー
スの形態又は投与直前再構成の形態(例えば、凍結乾燥)のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第1容器と含水調製物を有する第2容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ(例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ)を含む試薬キットを提供する。
スの形態又は投与直前再構成の形態(例えば、凍結乾燥)のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第1容器と含水調製物を有する第2容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ(例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ)を含む試薬キットを提供する。
本発明は、本発明の何れか1つの実施形態に係る結合分子又はその医薬組成物を投与することで、患者(特に患者のPD-1関連疾患)を治療する方法を提供する。本明細書において、用語「患者」、「被験者」、「個体」、「対象」は互いに交換して使用できるが、任意の生体を含み、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギなど)であり、最も好ましくはヒトである。「治療」は、被験者に対して本明細書に記載される治療方案を採用して、少なくとも1つの陽性治療効果(例えば、がん細胞数減少、腫瘍体積減少、がん細胞の周辺器官への浸潤速度低下又は腫瘍転移又は腫瘍成長の速度低下)を得ることである。患者を有効的に治療する治療方案は様々な要素(例えば、患者の疾患状態、年齢、体重及び療法の被験者の抗がん反応を活性化させる能力)によって変更する。
採用しようとする本発明の結合分子を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度及び目標によって決定される。当業者に理解されるように、治療に使用される適切な用量レベルは部分的に送達される分子、適応症、投与経路及び患者の大きさ(体重、体表又は器官の大きさ)及び/又は状況(年齢及び一般健康状況)によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。例えば1日当たり約10μg/kg体重-約50μg/kg体重である。
投与頻度は使用される調製物における結合分子の薬物動態パラメータに依存する。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は1回用量として投与してもよく、或いは2回以上の用量(必要とされる分子を同じ量で含んでもよく又は含まなくてもよい)として経時的に、または移植デバイス又はカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。
医薬組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈又は病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。
診断、検出及び試薬キット
本発明の結合分子は、そのPD-1に対する高親和性により測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織または細胞に発現するPD-1を検出及び/又は定量する。例えば単一ドメイン抗体などの結合分子はPD-1の疾患における作用のさらなる研究に利用できる。PD-1を検出する方法は大体次の通りである:細胞および/または組織試料を取得する;試料中のPD-1のレベルを検出する。
本発明の結合分子は、そのPD-1に対する高親和性により測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織または細胞に発現するPD-1を検出及び/又は定量する。例えば単一ドメイン抗体などの結合分子はPD-1の疾患における作用のさらなる研究に利用できる。PD-1を検出する方法は大体次の通りである:細胞および/または組織試料を取得する;試料中のPD-1のレベルを検出する。
本発明のPD-1はPD-1に関連する疾患及び/又は病状を検出、診断又は監視するための診断目的に利用できる。本発明は当業者によく知られている代表的な免疫組織学方法により試料におけるPD-1の存在を検出することを提供する。インビボ又はインビトロでPD-1を検出できる。PD-1の存在検出に適する方法の実例はELISA、FACS、RIAなどを含む。
診断使用について、通常、検出できる標識基により例えば単一ドメイン抗体などの結合分子を標識する。適切な標識基は、下記のもの、即ち、放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、発蛍光団(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光剤)、酵素団(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-
ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光団、ビオチン団又は二次レポーターにより認識された予定ポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー配列、二次抗体に利用される結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、MRI(磁気共鳴映像)またはCT(コンピュータ断層撮影)造影剤を含むが、これらに限定されない。タンパク質を標識するための各方法は本分野においてよく知られていると共に、本発明を実施できる。
ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光団、ビオチン団又は二次レポーターにより認識された予定ポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー配列、二次抗体に利用される結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、MRI(磁気共鳴映像)またはCT(コンピュータ断層撮影)造影剤を含むが、これらに限定されない。タンパク質を標識するための各方法は本分野においてよく知られていると共に、本発明を実施できる。
本発明の別の様態は本発明の抗体に対してPD-1と競合的に結合する試験分子の存在の検出方法を提供する。前記測定の実例は、試験分子が存在する、又は存在しない場合の、PD-1を一定量で含む溶液における遊離抗体の量の検出に関する。遊離抗体(即ち、PD-1と結合していない抗体)の量の増加は、該抗体に対して試験分子がPD-1と競合的に結合できることを示す。一実施形態において、標識基で抗体を標識する。或いは、試験分子を標識すると共に、抗体が存在する、又は存在しない場合に遊離試験分子の量を監視する。
本発明はまた、PD-1のレベルを検出するための検出キットを提供し、このキットは、PD-1を認識する抗体、試料を溶解するための溶解媒体、検出に必要な一般的な試薬および緩衝液、例えば様々な緩衝液、検出用標識、検出用基質などを含む。当該検出キットは、体外診断装置であってもよい。
本発明、具体的には、以下の実施形態のいずれかを含む。
1、CDR1、CDR2およびCDR3を含む相補性決定領域CDRを有する抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子であって、CDR1がSEQ ID NO:1に示される配列を含み、CDR2がSEQ ID NO:2に示される配列を含み、CDR3がSEQ ID NO:3に示される配列を含み、
SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTであり;好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はFまたはSであり、X4はFまたはSであり、X5はG、IまたはTであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDであり、
SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5GX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はF、LまたはNであり、X4はA、G、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、N、IまたはTであり、X9は無しであり、
SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17
はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、G、NまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はA、G、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、P、Q、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、N、PまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、G、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、L、R、SまたはVであり、X11はF、G、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、S、TまたはYであり、X13はD、H、P、S、TまたはVであり、X14はE、F、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである、PD-1結合分子。
1、CDR1、CDR2およびCDR3を含む相補性決定領域CDRを有する抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子であって、CDR1がSEQ ID NO:1に示される配列を含み、CDR2がSEQ ID NO:2に示される配列を含み、CDR3がSEQ ID NO:3に示される配列を含み、
SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTであり;好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はFまたはSであり、X4はFまたはSであり、X5はG、IまたはTであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDであり、
SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5GX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はF、LまたはNであり、X4はA、G、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、N、IまたはTであり、X9は無しであり、
SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17
はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、G、NまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はA、G、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、P、Q、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、N、PまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、G、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、L、R、SまたはVであり、X11はF、G、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、S、TまたはYであり、X13はD、H、P、S、TまたはVであり、X14はE、F、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである、PD-1結合分子。
2、項目1に記載のPD-1結合分子において、前記単一ドメイン抗体のCDR1はSEQ ID No:4-39、320の何れか1つに示される配列を含み、CDR2はSEQ ID NO:40-75の何れか1つに示される配列を含み、CDR3はSEQ ID NO: 76-183のいずれか1つに示される配列を含み、
好ましくは、前記単一ドメイン抗体は表1の群a1-群a136のいずれかの群に示されるCDR1、CDR2とCDR3を含むことを特徴とする、PD-1結合分子。
好ましくは、前記単一ドメイン抗体は表1の群a1-群a136のいずれかの群に示されるCDR1、CDR2とCDR3を含むことを特徴とする、PD-1結合分子。
3、項目1または2に記載のPD-1結合分子において、
前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域を含み、および/または
前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319から選ばれる何れか1つに示され、および/または
前記PD-1結合分子は1本、2本または複数本の前記単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする、PD-1結合分子。
前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域を含み、および/または
前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319から選ばれる何れか1つに示され、および/または
前記PD-1結合分子は1本、2本または複数本の前記単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする、PD-1結合分子。
4、項目3に記載のPD-1結合分子において、前記PD-1結合分子は重鎖抗体であり、前記重鎖抗体はさらに重鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される配列を含むことを特徴とする、PD-1結合分子。
好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される配列を含むことを特徴とする、PD-1結合分子。
5、ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは
(1)項目1-4のいずれか1つに記載のPD-1結合分子のコード配列;
(2)(1)の相補配列;
(3)(1)または(2)のいずれかの配列の5-50bpの断片
から選ばれることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
(1)項目1-4のいずれか1つに記載のPD-1結合分子のコード配列;
(2)(1)の相補配列;
(3)(1)または(2)のいずれかの配列の5-50bpの断片
から選ばれることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
6、核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは項目5に記載のポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えベクターまたは発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。
好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えベクターまたは発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。
7、項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を含むファージであって、
好ましくは、前記PD-1結合分子は前記ファージ表面に提示される、ファージ。
好ましくは、前記PD-1結合分子は前記ファージ表面に提示される、ファージ。
8、宿主細胞であって、前記宿主細胞は、
(1)項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を発現および/または分泌し;および/または
(2)項目5に記載のポリヌクレオチドを含み;および/または
(3)項目6に記載の核酸コンストラクトを含むことを特徴とする、宿主細胞。
(1)項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を発現および/または分泌し;および/または
(2)項目5に記載のポリヌクレオチドを含み;および/または
(3)項目6に記載の核酸コンストラクトを含むことを特徴とする、宿主細胞。
9、PD-1結合分子を産生する方法であって、PD-1結合分子の産生に適した条件で項目8に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養物から前記PD-1結合分子を精製することを含む、方法。
10、医薬組成物であって、項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子と、項目5に記載のポリヌクレオチドと、項目6に記載の核酸コンストラクトと、項目7に記載のファージまたは項目8に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される補助剤とを含み、
好ましくは、前記医薬組成物ががんを治療するために利用される、医薬組成物。
好ましくは、前記医薬組成物ががんを治療するために利用される、医薬組成物。
11、項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子の、がんを予防または治療するための薬物の製造における使用。
12、薬物治療の効果評価またはがん診断に使われるPD-1検出キットであって、前記キットは項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子と、項目5に記載のポリヌクレオチドと、項目6に記載の核酸コンストラクトと、項目7に記載のファージまたは項目8に記載の宿主細胞とを含み、
好ましくは、前記キットはPD-1の、単一ドメイン抗体、抗体、またはその抗原結合断片への結合を検出するための試薬をさらに含み、
さらに好ましくは、前記試薬は酵素免疫測定法によって前記結合を検出する試薬である、キット。
好ましくは、前記キットはPD-1の、単一ドメイン抗体、抗体、またはその抗原結合断片への結合を検出するための試薬をさらに含み、
さらに好ましくは、前記試薬は酵素免疫測定法によって前記結合を検出する試薬である、キット。
13、試料中のPD-1の存在を検出するための非診断的方法であって、項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を試料と共にインキュベートすることと、PD-1の、単一ドメイン抗体、抗体またはその抗原結合断片への結合を検出し、それによって試料中のPD-1の存在を決定することとを含む、方法。
14、試料中のPD-1の検出、薬物治療の効果の評価、またはがん診断のためのキットの調製における、項目1-4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子の使用。
下記は具体的な実施例により本発明を説明する。これらの実施例は説明するためのものであり、意図的に本発明の範囲を限定するものではない。実施例に使用される方法及び材料は別途で断りのない限り、本分野でよく知られている材料及び方法である。
実施例1、アルパカ免疫
1.1免疫原調製:
NCBIでPD-1配列を調べ、ヒトIgGFc断片配列と融合し、ジェンスクリプト社(南京)に合成委託し、pCDNA3.4(Thermo)プラスミドの真核発現ベクターを構築し、合成後のプラスミドをExpiCHOTM(Thermo Fisher)発現系で発現させ、発現後、5mLのProtein Aプレパックカラム(GE)でさらにアフィニティー精製を行い、精製後の試料を例えばPBSバッファーに置き換え、SDS-PAGE電気泳動ゲルとHPLCで純度を同定し、ELISAで活性を同定した後、小分けしてその後の免疫のために-80度の冷蔵庫に冷凍保存した。
1.1免疫原調製:
NCBIでPD-1配列を調べ、ヒトIgGFc断片配列と融合し、ジェンスクリプト社(南京)に合成委託し、pCDNA3.4(Thermo)プラスミドの真核発現ベクターを構築し、合成後のプラスミドをExpiCHOTM(Thermo Fisher)発現系で発現させ、発現後、5mLのProtein Aプレパックカラム(GE)でさらにアフィニティー精製を行い、精製後の試料を例えばPBSバッファーに置き換え、SDS-PAGE電気泳動ゲルとHPLCで純度を同定し、ELISAで活性を同定した後、小分けしてその後の免疫のために-80度の冷蔵庫に冷凍保存した。
1.2アルパカ免疫:
初回免疫抗原(PD-1.hFc)の量は400μgであり、アジュバント(GERBU FAMA)と均一に混合し、アルパカの背部から4か所を選択して皮下注射し、各箇所の免疫量は1mLとした。2回目から7回目までの免疫:免疫抗原の量は200μgであり、アルパカの背部から4か所を選択して皮下注射し、各箇所の免疫量は1mLとした。各免疫の間隔は1週間であった。
初回免疫抗原(PD-1.hFc)の量は400μgであり、アジュバント(GERBU FAMA)と均一に混合し、アルパカの背部から4か所を選択して皮下注射し、各箇所の免疫量は1mLとした。2回目から7回目までの免疫:免疫抗原の量は200μgであり、アルパカの背部から4か所を選択して皮下注射し、各箇所の免疫量は1mLとした。各免疫の間隔は1週間であった。
1.3免疫血清力価検出:
1.3.1 タンパク質レベルの力価検出
4度で一晩PD-1.His抗原をコーティングし、ブロッキングおよび洗浄後、勾配希釈された血清をELISAプレートに加えてインキュベートし、さらにanti-llama(抗アルパカ)IgG HRP(Abcam)抗体を用いてインキュベートし、洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450nmにおける吸光値を検出した。実験結果は図1に示されるように、7回の免疫後、アルパカの力価は比較的高いレベルに達した(>81000)。
1.3.1 タンパク質レベルの力価検出
4度で一晩PD-1.His抗原をコーティングし、ブロッキングおよび洗浄後、勾配希釈された血清をELISAプレートに加えてインキュベートし、さらにanti-llama(抗アルパカ)IgG HRP(Abcam)抗体を用いてインキュベートし、洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450nmにおける吸光値を検出した。実験結果は図1に示されるように、7回の免疫後、アルパカの力価は比較的高いレベルに達した(>81000)。
1.3.2 細胞レベルの力価検出
PD-1でトランスフェクトされたCHO-K1細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、細胞の量は3×105細胞/ウェルであった。次いで、細胞を3倍勾配希釈した血清とともにインキュベートした。インキュベートと洗浄後、anti-llama IgG PE(Jackson)抗体を加えてインキュベートし、洗浄後PBSで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーター(Beckman)によって蛍光強度(MFI)を検出した。7回の免疫を経て、アルパカの細胞レベルの力価は9000に達した。結果は図2に示される。
PD-1でトランスフェクトされたCHO-K1細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、細胞の量は3×105細胞/ウェルであった。次いで、細胞を3倍勾配希釈した血清とともにインキュベートした。インキュベートと洗浄後、anti-llama IgG PE(Jackson)抗体を加えてインキュベートし、洗浄後PBSで細胞を再懸濁させ、フローサイトメーター(Beckman)によって蛍光強度(MFI)を検出した。7回の免疫を経て、アルパカの細胞レベルの力価は9000に達した。結果は図2に示される。
実施例2、PD-1に対するナノボディ免疫ライブラリーの構築とスクリーニング
(1)7回の免疫後、ラクダ末梢血リンパ球100mLを抽出し、総RNAを抽出した。RNAの抽出はTAKARA社のRNAiso試薬の取扱説明書に従って行った。
(2)RNAをテンプレートとし、オリゴdTをプライマーとして、TAKARA社の逆転写酵素の説明書に従ってcDNAの第1鎖を合成した。
(3)PrimeSTARハイフィデリティーDNAポリメラーゼを用い、ネステッドPCRにより、重鎖抗体の可変領域をコードする遺伝子を得た。ネステッドPCRにより重鎖抗体の可変領域断片を増幅:
(1)7回の免疫後、ラクダ末梢血リンパ球100mLを抽出し、総RNAを抽出した。RNAの抽出はTAKARA社のRNAiso試薬の取扱説明書に従って行った。
(2)RNAをテンプレートとし、オリゴdTをプライマーとして、TAKARA社の逆転写酵素の説明書に従ってcDNAの第1鎖を合成した。
(3)PrimeSTARハイフィデリティーDNAポリメラーゼを用い、ネステッドPCRにより、重鎖抗体の可変領域をコードする遺伝子を得た。ネステッドPCRにより重鎖抗体の可変領域断片を増幅:
1回目のPCR:
上流プライマー:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
下流プライマー:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
重鎖抗体ガイドペプチドと抗体CH2との間の断片を増幅し、55℃でアニールし、30サイクルし;約600bpのDNA断片を回収し、2回目のPCRのテンプレートとした。
上流プライマー:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
下流プライマー:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
重鎖抗体ガイドペプチドと抗体CH2との間の断片を増幅し、55℃でアニールし、30サイクルし;約600bpのDNA断片を回収し、2回目のPCRのテンプレートとした。
2回目のPCR:
上流プライマー:GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
下流プライマー:GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
重鎖抗体FR1領域と長、短のヒンジ領域との間の断片(長断片および短断片)を増幅し、55℃でアニールし、30サイクルし、標的とする断片を回収した結果、当該断片のサイズは約500bpであり、つまりナノボディ遺伝子の電気泳動バンドは約500bpであった。
上流プライマー:GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
下流プライマー:GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
重鎖抗体FR1領域と長、短のヒンジ領域との間の断片(長断片および短断片)を増幅し、55℃でアニールし、30サイクルし、標的とする断片を回収した結果、当該断片のサイズは約500bpであり、つまりナノボディ遺伝子の電気泳動バンドは約500bpであった。
(4)ファージミドpME207およびPCR増幅産物をそれぞれSfi IおよびNot Iで二重酵素切断(NEB)し、回収し、定量してから、1:3のモル比で2つの断片をT4 DNAリガーゼ(TaKaRa)でライゲーションし、16℃で一晩ライゲーションした。
(5)ライゲーション産物をエタノールで沈殿させた後、100μLの滅菌水に溶解し、エレクトロポレーションを10回行い、大腸菌TG1を形質転換した。電気ショック、培養された菌液を100μL取り、数倍希釈し、アンピシリンLB培養プレートに塗布し、ライブラリー容量を計算し、残りを全てアンピシリン2×YT培養プレートに塗布し、37℃で、13~16時間反転培養した。培養プレート上の菌叢を10mLで2×YTの培地でこすって洗浄してから、終濃度25%のグリセリンを加えて小分けして、-80℃で保存しておいた。ライブラリー容量は
4.3×109であった。ライブラリーの挿入率を検出するために、無作為に48のクローンを取りコロニーPCRを行った結果、90%以上の挿入率に達した。
4.3×109であった。ライブラリーの挿入率を検出するために、無作為に48のクローンを取りコロニーPCRを行った結果、90%以上の挿入率に達した。
(6)計算されたライブラリー容量により、10倍のライブラリー容量の生細胞を、2×YT(2%グルコース、100μg/mLアンピシリンを含む)200mLに播種し、37℃、200rpmでOD600が0.5になるまで培養し、ヘルパーファージを感染多重度20:1で添加し、37℃で30min静置した後、37℃、200rpmで30分間インキュベートした。培養物を遠心分離し、200mLの2×YT(100μg/mLアンピシリンおよび50μg/mLカナマイシンを含む)で再懸濁沈殿させ、37℃、250r/minで一晩インキュベートした後、8000rpmで遠心分離し上清を取り、5×PEG/NaCl溶液を加え、氷上で60min放置し、8000rpmで30min遠心分離し、5mLのPBSに再懸濁させ、抗PD-1の単一ドメイン重鎖抗体(VHH)免疫ライブラリーを得、力価を測定するために10μL取り、残りは小分けして-80℃で保存しておいた。
(7)PD-1たんぱく質を5μg/mL、100μL/ウェルでELISAプレートにコーティングし、4℃で一晩置いて、同時にネガティブコントロールを設定した。2日目に、200μLの3%BSAを5つのウェルのそれぞれに添加し、室温で2時間ブロックした。2時間後に、PBST(PBSに0.05%のtween20を含有)で3回洗浄した。プレート洗浄後、まず5%のスキムミルクで予めブロックしたファージ(2~3×1011tfu免疫ラクダ・ナノボディ・ファージ・ディスプレイ・ライブラリー)100μLを各ネガティブセレクションウェルに添加し、室温で1.5時間作用し、次いでネガティブセレクションされた後の上清を標的の抗原コーディングウェルに移し、室温で1.5時間作用させた。PBST(PBSに0.05%のtween20を含有)で12回洗浄し、結合されていないファージを洗い流した。Glycine(SIGMA)を用いてPD-1に特異的に結合するファージを解離させ、溶出したファージをTris(Invitrogen、1M、PH8.0)で中和した後、対数期にあるTG1を感染し、増殖増幅してから、次回の「吸着-溶出」を行った。最後に溶出されたファージにTG1を感染させ、IPTG(Thermo)を用いてナノボディを発現するようにTG1を誘導し、TG1発現の上清を取り、ELISA結合検出とPD-L1.hFc検出のブロックを行った。ELISA結合検出に使用される二次抗体はanti-c-myc Antibody HRP(抗c-myc抗体HRP)(Bethyl)であり、PD-L1結合検出をブロックするために使用される二次抗体はGoat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP(羊抗ヒトIgG-Fcフラグメント抗体HRP)(Bethyl)であった。
(8)配列解析により、以下の表に示すようにPD-1タンパク質に結合することができるナノボディが合計39個得られた。
実施例3、候補抗体の発現と精製
ナノボディをpCDNA3.4-IgG4ベクターに構築され、EXpiCHOTM(Thermo Fisher)発現システムによって1週間発現され、その後上清を取りProtein A(GE)精製を行った。次に、Nanodropでタンパク質の質量を検出し、HPLCでタンパク質の純度を検出した。得られたたんぱく質の純度と収量は、その後の実験のニーズを満たした。Keytruda及びOpdivoは、ht
tps://www.drugbank.ca/に提供された配列に従ってIgG4抗体を調製した。
ナノボディをpCDNA3.4-IgG4ベクターに構築され、EXpiCHOTM(Thermo Fisher)発現システムによって1週間発現され、その後上清を取りProtein A(GE)精製を行った。次に、Nanodropでタンパク質の質量を検出し、HPLCでタンパク質の純度を検出した。得られたたんぱく質の純度と収量は、その後の実験のニーズを満たした。Keytruda及びOpdivoは、ht
tps://www.drugbank.ca/に提供された配列に従ってIgG4抗体を調製した。
実施例4、候補抗体の特性評価
タンパク質レベルの親和性検出:表面プラズモン共鳴(SPR)により、抗体がヒトPD-1.Fc抗原に対する結合動態および親和性を検出した。精製された抗体を、protein Aを予め固定化したセンサーチップに流し、protein Aによって抗体を捕捉し、次いで、5つの異なる濃度のPD-1.Fcタンパク質を流動相として利用し、結合時間と解離時間はそれぞれ30minと60minであった。Biacore Evaluation Software 2.0 (GE)により、結合速度(ka)、解離速度(kd)及び平衡定数(KD)を分析した。市販のPD-1抗体薬物であるKeytrudaおよびOpdivoを対照として選択した。結果を下表に示す。
タンパク質レベルの親和性検出:表面プラズモン共鳴(SPR)により、抗体がヒトPD-1.Fc抗原に対する結合動態および親和性を検出した。精製された抗体を、protein Aを予め固定化したセンサーチップに流し、protein Aによって抗体を捕捉し、次いで、5つの異なる濃度のPD-1.Fcタンパク質を流動相として利用し、結合時間と解離時間はそれぞれ30minと60minであった。Biacore Evaluation Software 2.0 (GE)により、結合速度(ka)、解離速度(kd)及び平衡定数(KD)を分析した。市販のPD-1抗体薬物であるKeytrudaおよびOpdivoを対照として選択した。結果を下表に示す。
実施例5:異なる種のPD-1結合
異なる種の(ヒト、カニクイザル、マウス)PD-1たんぱく質(ACROBiosystems)をELISAプレートにコーティングし、それぞれ1μg/mLの濃度で、4℃で一晩置いた。ブロック及び洗浄後、希釈した抗体をそれぞれELISAプレートに加え、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、Goat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP(Bethyl)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450値を読み取った。
異なる種の(ヒト、カニクイザル、マウス)PD-1たんぱく質(ACROBiosystems)をELISAプレートにコーティングし、それぞれ1μg/mLの濃度で、4℃で一晩置いた。ブロック及び洗浄後、希釈した抗体をそれぞれELISAプレートに加え、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、Goat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP(Bethyl)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450値を読み取った。
実験結果は、以下の表に示すように、候補抗体、Keytruda及びOpdivoは、いずれもヒト及びカニクイザルPD-1に結合し、マウスPD-1タンパク質には結合しなかった。
実施例6:CD28ファミリータンパク質結合試験
それぞれCD28ファミリータンパク質(CD28、CTLA-4、ICOSおよびPD-1)(ACROBiosystems)をELISAプレートにコーティングし、1μg/mLの濃度で、4℃で一晩置いた。ブロック及び洗浄後、希釈した抗体をそれぞれELISAプレートに加え、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG-Fccフラグメント抗体HRP(Bethyl)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450値を読み取った。
それぞれCD28ファミリータンパク質(CD28、CTLA-4、ICOSおよびPD-1)(ACROBiosystems)をELISAプレートにコーティングし、1μg/mLの濃度で、4℃で一晩置いた。ブロック及び洗浄後、希釈した抗体をそれぞれELISAプレートに加え、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG-Fccフラグメント抗体HRP(Bethyl)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後TMB発色液を加えて発色させ、2M HClで反応を終結させた後、マイクロプレートリーダーでOD450値を読み取った。
結果は下表に示されるように、候補抗体、KeytrudaおよびOpdivoはいずれもPD-1たんぱく質にのみ結合し、CD28ファミリーのその他のたんぱく質には結合しなかった。
実施例7:エピトープ競合実験
装置Biacore T200(GE)を使用して、検出温度25℃、バッファー1×HBS-EP+(10mM HEPES,
150 mM NaCl, 3mM EDTAと0.05% v/v Surfactant P20, GE)、流速30ul/minであった。PD-1-Hisを、pH4.0(Biacore Amine Coupling Kit、GE)の酢酸緩衝液に最終濃度10ug/mlまで溶解し、アミノカップリングキット製品の説明書に従い、PD-1-Hisを、CM5チップ(GE)チャネル2(FC-2)に固定化し、約21RUであった。チャネル1(FC-1)をブランク対照とした。抗体をそれぞれ1×HBS-EP+で目標濃度に希釈し、PD-1固定完了した上記のチップFC-1及びFC-2に、一方の抗体を飽和レベルで注入し、続いて他方の抗体を飽和レベルで注入して、両抗体の競合関係を評価した。第2の抗体注射の完了後、複合体が400s解離した。最後に、50mM NaOHを15s注入してチップ表面を再生させた。データ処理にはBiacore Evaluation
Software 2.0 (GE)を使用し、センサーグラムには二重参照減算を使用し、FC2-1シグナルを記録した。
装置Biacore T200(GE)を使用して、検出温度25℃、バッファー1×HBS-EP+(10mM HEPES,
150 mM NaCl, 3mM EDTAと0.05% v/v Surfactant P20, GE)、流速30ul/minであった。PD-1-Hisを、pH4.0(Biacore Amine Coupling Kit、GE)の酢酸緩衝液に最終濃度10ug/mlまで溶解し、アミノカップリングキット製品の説明書に従い、PD-1-Hisを、CM5チップ(GE)チャネル2(FC-2)に固定化し、約21RUであった。チャネル1(FC-1)をブランク対照とした。抗体をそれぞれ1×HBS-EP+で目標濃度に希釈し、PD-1固定完了した上記のチップFC-1及びFC-2に、一方の抗体を飽和レベルで注入し、続いて他方の抗体を飽和レベルで注入して、両抗体の競合関係を評価した。第2の抗体注射の完了後、複合体が400s解離した。最後に、50mM NaOHを15s注入してチップ表面を再生させた。データ処理にはBiacore Evaluation
Software 2.0 (GE)を使用し、センサーグラムには二重参照減算を使用し、FC2-1シグナルを記録した。
実験結果は以下の表に示されるように、NB194およびNB182抗体が結合するエピトープは、KeytrudaおよびOpdivoのエピトープと一部重なる。残りの抗体の結果は、NB194およびNB182抗体と類似し、エピトープについて、いずれもKeytrudaおよびOpdivoと部分的に競合していた。
実施例8:抗体機能活性試験
1)レポーター遺伝子実験。まず、GS/C2-PDL1(ジェンスクリプト)標的細胞を抗生物質を含まない培地で、密度を5*105個/mLに調整し、ウェルあたり20μLで384ウェルプレートにプレーティングし、16-20h培養した。抗体をRMPI1640+10%FBS bufferにより勾配希釈し、GS-J2/PD1(ジェンスクリプト)エフェクター細胞を抗生物質を含まない培地で、密度を2*106個/mLに調整し;384ウェルプレートにある古い培地を除去し、20μLの抗体と20μLのGS-J2/PD1エフェクター細胞を各ウェルに加え、6hインキュベートした。最後に、各ウェルに40μL One-Gloの基質を加え、10分間反応させてからマイクロプレートリーダーにより検出した。図3に示すように、抗体はReporter Gene Assay機能検出法において良好な機能活性を示し、NB182およびNB194のEC50は16.3nMおよび7.0nMであり、KeytrudaおよびOpdivoのEC50は3.3nMおよび7.3nMであった。残りの抗体のEC50は1.7~75nMの間である。
1)レポーター遺伝子実験。まず、GS/C2-PDL1(ジェンスクリプト)標的細胞を抗生物質を含まない培地で、密度を5*105個/mLに調整し、ウェルあたり20μLで384ウェルプレートにプレーティングし、16-20h培養した。抗体をRMPI1640+10%FBS bufferにより勾配希釈し、GS-J2/PD1(ジェンスクリプト)エフェクター細胞を抗生物質を含まない培地で、密度を2*106個/mLに調整し;384ウェルプレートにある古い培地を除去し、20μLの抗体と20μLのGS-J2/PD1エフェクター細胞を各ウェルに加え、6hインキュベートした。最後に、各ウェルに40μL One-Gloの基質を加え、10分間反応させてからマイクロプレートリーダーにより検出した。図3に示すように、抗体はReporter Gene Assay機能検出法において良好な機能活性を示し、NB182およびNB194のEC50は16.3nMおよび7.0nMであり、KeytrudaおよびOpdivoのEC50は3.3nMおよび7.3nMであった。残りの抗体のEC50は1.7~75nMの間である。
2)混合リンパ球反応。健常者の末梢血100ミリリットルを抽出してPBMCの単離に用い、得られたPBMCをさらにmonocyteの単離に用い、得られたmonocyteは9日間で成熟樹状細胞DCに誘導された。9日目、DCをフローサイトメトリーで品質検出し、成熟誘導の基準を満たした後、再びヒト末梢血100ミリリットルを抽出してPBMCの単離に用い、PBMCからCD4+T細胞を単離し、エフェクター細胞および刺激細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、被験試料を8の濃度、3つの二重ウェル、10倍の希釈、初期濃度10~50μg/mlで加えた。3日間インキュベートした。細胞培養の上清を収集し、IL-2およびIFN-γの放出を検出した。
検出結果は図4および図5に示されるように、NB182およびNB194は、一定範囲内で用量依存的にT細胞によるIL-2およびIFN-γの分泌を促進することができ、KeytrudaおよびOpdivoと同等の機能的効果を示した。残りの抗体の結果はNB182およびNB194と類似し、いずれも用量依存的にT細胞によるIL-2およびIFN-γの分泌を促進でき、IL-2のEC50は0.115nM~3.278nMであり、IFN-γのEC50は0.078nM~1.102nMの間であった。
実施例9:抗体特異性検証
1)膜タンパク質交差反応
米国のIntegral Molecular Companyが開発した膜タンパク質アレイスクリーニングプラットフォーム(Membrane Proteome Array、MPA)を用いて膜タンパク質交差反応を行った。ヒトの5300種の異なる膜タンパク質をHEK293細胞にトランスフェクトすることにより細胞表面に提示し、これらのタンパク質に対する抗体の結合シグナルをFACSにより検出し、そ
れにより検出すべき抗体の特異性を評価した。MPAスクリーニングの結果(図6および7)により、NB182およびNB194抗体がヒトPD-1タンパク質のみに結合し、他の5000種を超えるタンパク質のいずれにも結合しないことを示している。NB171抗体を除いて、残りの抗体もヒトPD-1タンパク質にのみ結合する。
1)膜タンパク質交差反応
米国のIntegral Molecular Companyが開発した膜タンパク質アレイスクリーニングプラットフォーム(Membrane Proteome Array、MPA)を用いて膜タンパク質交差反応を行った。ヒトの5300種の異なる膜タンパク質をHEK293細胞にトランスフェクトすることにより細胞表面に提示し、これらのタンパク質に対する抗体の結合シグナルをFACSにより検出し、そ
れにより検出すべき抗体の特異性を評価した。MPAスクリーニングの結果(図6および7)により、NB182およびNB194抗体がヒトPD-1タンパク質のみに結合し、他の5000種を超えるタンパク質のいずれにも結合しないことを示している。NB171抗体を除いて、残りの抗体もヒトPD-1タンパク質にのみ結合する。
2)組織交差反応性
34個の組織を選択し、凍結切片を作り、室温で乾燥させた後、アセトンで固定した。内因性ビオチンブロッキングキット(Sangon、E674001)の試薬Aおよび試薬Bを使用してブロックをし、ビオチン標識抗体試料を30minインキュベートし、洗浄してから西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Abcam、ab7403)を加え、15minインキュベートした。DABによる発色反応、ヘマトキシリンによる対比染色をして、中性プラスチックで切片を封入し、顕微鏡検査のために自然乾燥させた。陽性対照はAnti-PD-1抗体(abcam)であり、陰性対照はIgG4アイソタイプ対照であった。
34個の組織を選択し、凍結切片を作り、室温で乾燥させた後、アセトンで固定した。内因性ビオチンブロッキングキット(Sangon、E674001)の試薬Aおよび試薬Bを使用してブロックをし、ビオチン標識抗体試料を30minインキュベートし、洗浄してから西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Abcam、ab7403)を加え、15minインキュベートした。DABによる発色反応、ヘマトキシリンによる対比染色をして、中性プラスチックで切片を封入し、顕微鏡検査のために自然乾燥させた。陽性対照はAnti-PD-1抗体(abcam)であり、陰性対照はIgG4アイソタイプ対照であった。
実施例10:抗体のヒト化
ナノボディをヒト化する方法(J. Biol. Chem. 2009; 284 : 3273-3284)を参照して、CDR領域移植の方法を使用してNB182とNB194をヒト化した。IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)データベースで、NB182とNB194と相同性の高い系列(germline)をテンプレートとしてスクリーニングした。Biacoreを使用してヒト化前後の抗体の親和性を検出した。精製された抗体を、protein Aを予め固定化したセンサーチップに流し、protein
Aによって抗体を捕捉し、次いで、5つの異なる濃度のPD-1.Hisタンパク質を流動相として利用し、結合時間と解離時間はそれぞれで30minと60minであった。Biacore Evaluation
Software 2.0 (GE)により、結合速度(ka)、解離速度(kd)及び平衡定数(KD)を分析した。NB182-z1およびNB182-z2の2つのヒト化分子は、NB182と親和性が一致しており、NB
182-z3、NB182-z4、NB182-z5は、NB182と親和性が類似している。NB194-z4とNB194-z5の2つのヒト化分子は、NB194と親和性が一致しており、NB194-z1、NB194-z2、NB194-z3はNB194と親和性が類似している。
ナノボディをヒト化する方法(J. Biol. Chem. 2009; 284 : 3273-3284)を参照して、CDR領域移植の方法を使用してNB182とNB194をヒト化した。IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)データベースで、NB182とNB194と相同性の高い系列(germline)をテンプレートとしてスクリーニングした。Biacoreを使用してヒト化前後の抗体の親和性を検出した。精製された抗体を、protein Aを予め固定化したセンサーチップに流し、protein
Aによって抗体を捕捉し、次いで、5つの異なる濃度のPD-1.Hisタンパク質を流動相として利用し、結合時間と解離時間はそれぞれで30minと60minであった。Biacore Evaluation
Software 2.0 (GE)により、結合速度(ka)、解離速度(kd)及び平衡定数(KD)を分析した。NB182-z1およびNB182-z2の2つのヒト化分子は、NB182と親和性が一致しており、NB
182-z3、NB182-z4、NB182-z5は、NB182と親和性が類似している。NB194-z4とNB194-z5の2つのヒト化分子は、NB194と親和性が一致しており、NB194-z1、NB194-z2、NB194-z3はNB194と親和性が類似している。
実施例11:変異型抗体
NB194抗体についてGeneMorph IIキット(アジレント、200550)を用いてランダム点突然変異を導入し、そしてファージ抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングして77個の突然変異抗体(NB194-P1~NB194-P77)を得た。検証により、これらの抗体の親和性および抗体機能活性はNB194抗体と類似している。以下の表および図8に示すように、NB194-P29変異の親和性が最も高く、NB194と比較して5倍向上しており、機能活性も向上している。
NB194抗体についてGeneMorph IIキット(アジレント、200550)を用いてランダム点突然変異を導入し、そしてファージ抗体ライブラリーを構築し、スクリーニングして77個の突然変異抗体(NB194-P1~NB194-P77)を得た。検証により、これらの抗体の親和性および抗体機能活性はNB194抗体と類似している。以下の表および図8に示すように、NB194-P29変異の親和性が最も高く、NB194と比較して5倍向上しており、機能活性も向上している。
Claims (14)
- CDR1、CDR2およびCDR3を含む相補性決定領域CDRを有する抗PD-1単一ドメイン抗体を含むPD-1結合分子であって、CDR1がSEQ ID NO:1に示される配列を含み、CDR2がSEQ ID NO:2に示される配列を含み、CDR3がSEQ ID NO:3に示される配列を含み、
SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はA、F、I、L、N、R、SまたはVであり、X4はD、F、G、L、M、NまたはSであり、X5はA、D、F、G、I、N、R、SまたはTであり、X6はD、F、H、I、L、S、V、WまたはYであり、X7はA、D、E、G、N、P、SまたはTであり;好ましくは、SEQ ID NO:1はGX1X2X3X4X5X6X7であり、ただし、X1はD、F、G、H、LまたはRであり、X2はP、SまたはTであり、X3はFまたはSであり、X4はFまたはSであり、X5はG、IまたはTであり、X6はSまたはYであり、X7はAまたはDであり、
SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5X6X7X8X9であり、ただし、X1はI、L、S、TまたはVであり、X2はA、N、SまたはTであり、X3はF、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、WまたはYであり、X4はA、D、G、H、N、R、SまたはTであり、X5はA、D、G、N、R、Sまたは無しであり、X6はGまたはR、SまたはTであり、X7はD、E、I、L、M、N、R、S、TまたはVであり、X8はA、K、M、QまたはTであり、X9はAまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:2はX1X2X3X4X5GX7TX9であり、ただし、X1はIまたはVであり、X2はN、SまたはTであり、X3はF、LまたはNであり、X4はA、G、SまたはTであり、X5はRまたは無しであり、X7はD、N、IまたはTであり、X9は無しであり、
SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はA、E、G、N、R、S、TまたはVであり、X2はA、G、I、K、L、P、R、TまたはVであり、X3はA、D、E、G、K、N、P、R、S、VまたはYであり、X4はA、C、D、E、G、I、K、L、R、S、T、VまたはYであり、X5はA、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、WまたはYであり、X6はA、C、D、E、G、I、K、L、M、P、Q、R、SまたはYであり、X7はA、C、D、F、G、H、I、N、P、R、S、T、VまたはYであり、X8はA、C、D、E、G、I、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X9はA、D、E、F、G、I、L、P、R、S、V、W、Yまたは無しであり、X10はC、D、F、G、K、L、N、P、R、S、T、V、W、Yまたは無しであり、X11はD、F、G、H、I、K、L、N、P、S、T、V、Yまたは無しであり、X12はA、D、G、H、I、L、M、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X13はC、D、E、H、P、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X14はA、D、E、F、H、I、L、P、R、T、Yまたは無しであり、X15はA、D、E、G、N、Q、R、S、T、V、Yまたは無しであり、X16はA、D、E、F、G、H、M、P、S、V、Yまたは無しであり、X17はA、D、E、H、N、Q、R、T、Yまたは無しであり、X18はD、E、R、S、Yまたは無しであり、X19はN、S、Yまたは無しであり、X20はD、E、Yまたは無しであり、X21はE、N、Yまたは無しであり、X22はYまたは無しであり;好ましくは、SEQ ID NO:3はX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22であり、ただし、X1はE、G、NまたはVであり、X2はA、G、I、LまたはVであり、X3はA、D、E、G、N、VまたはYであり、X4はA、G、I、K、RまたはSであり、X5はC、I、L、P、Q、RまたはWであり、X6はE、K、P、QまたはRであり、X7はC、D、H、N、PまたはYであり、X8はE、G、R、VまたはWであり、X9はF、G、L、S、VまたはWであり、X10はC、D、G、L、R、SまたはVであり、X11はF、G、I、L、N、S、TまたはVであり、X12はH、L、P、R、S、TまたはYであり、X13はD、H、P、S、TまたはVであり、X14はE、F、H、I、L、PまたはRであり、X15はA、SまたはVであり、X16はA、D、E、G、HまたはVであり、X17はH、N、Q、RまたはYであり、X18-X22は無しである、PD-1結合分子。 - 前記単一ドメイン抗体のFR領域はSEQ ID NO: 184-319から選ばれるいずれか1つのVHHのFR領域を含み、および/または
前記単一ドメイン抗体VHHはSEQ ID NO: 184-319から選ばれる何れか1つに示され、および/または
前記PD-1結合分子は1本、2本または複数本の前記単一ドメイン抗体を含む一価または多価の単一ドメイン抗体、多重特異性単一ドメイン抗体、重鎖抗体またはその抗原結合断片、抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする、請求項1または2に記載のPD-1結合分子。 - 前記PD-1結合分子は重鎖抗体であり、前記重鎖抗体はさらに重鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域はSEQ ID NO: 321に示される配列を含むことを特徴とする、請求項3に記載のPD-1結合分子。 - ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは
(1)請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子のコード配列;
(2)(1)の相補配列;
(3)(1)または(2)のいずれかの配列の5-50bpの断片
から選ばれることを特徴とする、ポリヌクレオチド。 - 核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは請求項5に記載のポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えベクターまたは発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を含むファージであって、
好ましくは、前記PD-1結合分子は前記ファージ表面に提示される、ファージ。 - 宿主細胞であって、前記宿主細胞は、
(1)請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を発現及び/又は分泌し;および/または
(2)請求項5に記載のポリヌクレオチドを含み;および/または
(3)請求項6に記載の核酸コンストラクトを含む
ことを特徴とする、宿主細胞。 - PD-1結合分子を産生する方法であって、PD-1結合分子の産生に適した条件で請求項8に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養物から前記PD-1結合分子を精製することを含む、方法。
- 医薬組成物であって、請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子と、請求項5に記載のポリヌクレオチドと、請求項6に記載の核酸コンストラクトと、請求項7に記載のファージまたは請求項8に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される補助剤とを含み、
好ましくは、前記医薬組成物ががんを治療するために利用される、医薬組成物。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子の、がんを予防または治療するための薬物の製造における使用。
- 薬物治療の効果評価またはがん診断に使われるPD-1検出キットであって、前記キットは請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子、請求項5に記載のポリヌクレオチド、請
求項6に記載の核酸コンストラクト、請求項7に記載のファージまたは請求項8に記載の宿主細胞を含み、
好ましくは、前記キットはPD-1の、単一ドメイン抗体、抗体、またはその抗原結合断片への結合を検出するための試薬をさらに含み、
さらに好ましくは、前記試薬は酵素免疫測定法によって前記結合を検出する試薬である、キット。 - 試料中のPD-1の存在を検出するための非診断的方法であって、前記方法は、請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子を試料と共にインキュベートすることと、PD-1の、単一ドメイン抗体、抗体またはその抗原結合断片への結合を検出し、それによって試料中のPD-1の存在を決定することとを含む、方法。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のPD-1結合分子の、試料中のPD-1の検出、薬物治療の効果の評価、またはがん診断のためのキットの調製における使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011582908.X | 2020-12-28 | ||
CN202011582908.XA CN114685655B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | Pd-1结合分子及其应用 |
PCT/CN2021/141740 WO2022143552A1 (zh) | 2020-12-28 | 2021-12-27 | Pd-1结合分子及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024502091A true JP2024502091A (ja) | 2024-01-17 |
Family
ID=82130716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023540715A Pending JP2024502091A (ja) | 2020-12-28 | 2021-12-27 | Pd-1結合分子およびその使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4269437A1 (ja) |
JP (1) | JP2024502091A (ja) |
CN (3) | CN114685655B (ja) |
AU (1) | AU2021416127A1 (ja) |
CA (1) | CA3206838A1 (ja) |
IL (1) | IL304096A (ja) |
WO (1) | WO2022143552A1 (ja) |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105154473B (zh) | 2015-09-30 | 2019-03-01 | 上海细胞治疗研究院 | 一种高效安全的转座子整合系统及其用途 |
CN106046152A (zh) | 2016-07-07 | 2016-10-26 | 南昌大学 | 特异性识别组氨酸标签的纳米抗体 |
NL2017267B1 (en) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Aduro Biotech Holdings Europe B V | Anti-pd-1 antibodies |
CN107814845B (zh) * | 2016-09-14 | 2021-02-09 | 浙江特瑞思药业股份有限公司 | 新的抗pd-1纳米抗体及其应用 |
CN110167966B (zh) * | 2017-01-06 | 2024-08-30 | 克雷森多生物制剂有限公司 | 程序性细胞死亡(pd-1)的单结构域抗体 |
WO2018220235A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Merck Patent Gmbh | Mmp13 binding immunoglobulins |
CN111699200B (zh) * | 2018-01-15 | 2023-05-26 | 南京传奇生物科技有限公司 | 针对pd-1的单域抗体和其变体 |
CN110144010B9 (zh) * | 2018-02-14 | 2021-01-05 | 上海洛启生物医药技术有限公司 | 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途 |
TWI829677B (zh) * | 2018-03-20 | 2024-01-21 | 大陸商上海藥明生物技術有限公司 | 新型抗pd-1抗體 |
EP3864049A1 (en) * | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Inhibrx, Inc. | Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
CN111206043A (zh) | 2018-11-21 | 2020-05-29 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种改进的pb转座子系统及其用途 |
CN110950956B (zh) * | 2019-12-12 | 2022-03-08 | 源道隆(苏州)医学科技有限公司 | 可结合pd1的多肽及其应用 |
-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011582908.XA patent/CN114685655B/zh active Active
- 2020-12-28 CN CN202410342939.XA patent/CN118240082A/zh active Pending
-
2021
- 2021-12-27 JP JP2023540715A patent/JP2024502091A/ja active Pending
- 2021-12-27 AU AU2021416127A patent/AU2021416127A1/en active Pending
- 2021-12-27 EP EP21914288.2A patent/EP4269437A1/en active Pending
- 2021-12-27 IL IL304096A patent/IL304096A/en unknown
- 2021-12-27 CN CN202180088155.3A patent/CN116829718A/zh active Pending
- 2021-12-27 CA CA3206838A patent/CA3206838A1/en active Pending
- 2021-12-27 WO PCT/CN2021/141740 patent/WO2022143552A1/zh active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022143552A1 (zh) | 2022-07-07 |
CN118240082A (zh) | 2024-06-25 |
IL304096A (en) | 2023-08-01 |
EP4269437A1 (en) | 2023-11-01 |
CN114685655B (zh) | 2024-04-12 |
AU2021416127A1 (en) | 2023-08-10 |
CN116829718A (zh) | 2023-09-29 |
CA3206838A1 (en) | 2022-07-07 |
CN114685655A (zh) | 2022-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7393337B2 (ja) | 抗b7-h4抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途 | |
US11555077B2 (en) | 4-1BB antibody and preparation method and use thereof | |
WO2018161872A1 (zh) | 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
CN109476735A (zh) | Flt3和cd3的抗体构建体 | |
CN114685666B (zh) | 抗间皮素纳米抗体及其应用 | |
CN111196854A (zh) | Ox40抗体及其制备方法和应用 | |
US20240190986A1 (en) | Mesothelin binding molecule and application thereof | |
CN115109156A (zh) | 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用 | |
CN114685667B (zh) | 间皮素结合分子及其应用 | |
US11685778B2 (en) | Anti-human LAG-3 monoclonal antibody and use thereof | |
EP4403571A1 (en) | Human epidermal growth factor receptor binding molecule and use thereof | |
CN114685655B (zh) | Pd-1结合分子及其应用 | |
WO2023051618A1 (zh) | Ctla-4结合分子及其应用 | |
TWI833227B (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用 | |
WO2023142297A1 (zh) | Muc1结合分子及其应用 | |
TW202132351A (zh) | 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用 |