CN110950956B - 可结合pd1的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可结合PD1的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1‑3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1‑17所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:18‑34所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:35‑58所示序列之一。本发明针对PD1的多肽进行纳米抗体药物开发和诊断试剂盒研发，通过制备PD1蛋白、免疫小羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合PD1的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列。本发明为肿瘤和传染病的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。

Description

可结合PD1的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合PD1蛋白的多肽，所述的多肽在制备PD1蛋白的检测剂或肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术
肿瘤是指机体局部组织的细胞异常增生而形成的一种新生物，常常表现为局部的肿块。根据肿瘤的性质，一般将其分为良性肿瘤和恶性肿瘤。恶性肿瘤生长较快，易向周围组织扩散，容易发生转移，危及生命。PD-1(Programmed death-1)蛋白是T细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白，为CD28超家族成员。一些肿瘤细胞能够表达PD-L1或者PD-L2与T细胞表面的PD-1结合，使PD-1的胞内结构域的酪氨酸磷酸化，抑制TCR信号通路，从而逃避T细胞的杀伤。因此，理论上可通过使用PD-1抑制剂例如PD-1抗体来对抗该免疫逃避机制，从而达到治疗这类肿瘤的目的。
1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
目前市上已经有了一些用于治疗肿瘤的抗PD-1抗体，但是在黑色素瘤和软组织肉瘤起效率在30％左右，相比于传统治疗这并不是一个很高的起效率。PD-1抗体中位起效时间是12周。对80％可能无效患者而言，如果等到PD-1抗体治疗后12周或更长时间才调整治疗方案，有可能贻误治疗。因此，需要制备新的抗PD-1抗体，为研发抗肿瘤新药做储备。
发明内容
本发明通过用抗原免疫小羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于诊断和治疗肿瘤病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合PD1的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-17所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:18-34所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:35-58所示序列之一。
在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:59-62所示，但本发明的范围不限于此，也可将框架区FR1-4序列人源化为如SEQ ID NO:63-66所示。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或羊驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合人PD1的多肽或结构域。
在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。
在一个优选实施方案中，所述多肽为羊驼源的VHH或人源化的VHH。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为SEQ ID NO:24；并且
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:7或8，并且CDR3的序列选自SEQ ID NO:41-44。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQ ID NO:41；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQID NO:42；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQID NO:43；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQID NO:44；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQID NO:41。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR1的序列为SEQ ID NO:67，其中，第5位的X为丝氨酸或苏氨酸，第6位的X为天冬酰胺、精氨酸或丝氨酸，第8位的X为丙氨酸、赖氨酸或缬氨酸；并且
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:26-33，并且CDR3的序列选自SEQ ID NO:46-57。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:10，CDR2的序列为SEQ ID NO:26并且CDR3的序列为SEQ ID NO:46；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:10，CDR2的序列为SEQ ID NO:27并且CDR3的序列为SEQID NO:47；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:10，CDR2的序列为SEQ ID NO:26并且CDR3的序列为SEQID NO:48；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:11，CDR2的序列为SEQ ID NO:28并且CDR3的序列为SEQID NO:49；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:12，CDR2的序列为SEQ ID NO:29并且CDR3的序列为SEQID NO:50；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:51；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:52；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:31并且CDR3的序列为SEQID NO:53；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:54；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:55；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:32并且CDR3的序列为SEQID NO:51；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:56；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:33并且CDR3的序列为SEQID NO:51；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:57；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:14，CDR2的序列为SEQ ID NO:30并且CDR3的序列为SEQID NO:51。
本发明还提供了上述多肽在肿瘤或传染病治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述多肽的核酸编码序列。
在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
在一个具体实施方案中，所述核酸编码序列存在于基因表达框中。
本发明还提供了上述多肽在制备基因治疗药物中的应用。
本发明针对高表达PD1配体的肿瘤和传染病患者进行纳米抗体药物开发，通过制备PD1蛋白、免疫小羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合PD1蛋白的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列。本发明为高表达PD1配体的肿瘤病人临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。
附图说明
图1为sPD1第4和5次免疫小羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
图2为不同稀释度的第5次免疫小羊驼一周后的抗血清能结合转染PD1后细胞的曲线，以免疫前的血清为对照；
图3为sPD1-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图4为sPD1-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对sPD1蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2nd)和第三轮(3rd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选40和46个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
图5为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对sPD1的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们依据NCBI网站上PD1蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导小羊驼产生针对PD1蛋白的特异性抗体的多肽sPD1，在C端连接His-tag(sPD1-his)或兔Fc(sPD1-rFc)用于后续纯化及检测。
2.小羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg sPD1-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对小羊驼进行初免，在第14天、28天、42天、56天用sPD1-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫4次，第2次、第3和第4次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第5次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的PD1蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前小羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，4免和5免的抗血清效价分别为3.65×105和3.28×106。由此可见，该抗原可诱导小羊驼产生特异性针对PD1蛋白的高滴度抗血清。
为了进一步验证该高滴度的小羊驼抗血清是否能有效结合细胞表面PD1蛋白，进行了血清的细胞结合实验。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与转染了PD1质粒的细胞4℃共同孵育90min，然后用2％FBS的PBS洗2次，随后加入带荧光的二抗，在4℃孵育1h后通过流式细胞术来确定结合细胞的比例。细胞结合实验结果显示，PD1诱导的抗血清能高度特异性的与转染了PD1质粒的细胞结合(图2)。综上所述，PD1诱导了高滴度抗血清，同时该抗血清具有高度特异性的结合的PD1能力。
3.VHH噬菌体库构建及淘选
收集200ml免疫后小羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-PaquePlus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将羊驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定sPD1-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫sPD1羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图3)，说明该sPD1-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选50个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列没有完全一致的重复序列；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个sPD1-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.2×109，阳性率为97.8％，序列多样性(Diversity)为100％，有效插入率(In frame rate)95％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的sPD1-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与sPD1蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序。
淘选后的文库与sPD1蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的sPD1-VHH噬菌体文库与sPD1蛋白的结合读值为-0.02，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为1.54、2.9、2.95(图4A)。为了进一步验证富集后的文库中结合sPD1-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2轮和第3轮富集后的文库里分别挑选了40和46个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，65％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里70％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图4B)，通过sPD1蛋白淘选成功的富集了高结合力的sPD1-VHH噬菌体文库。
4.VHH原核表达文库的构建及VHH表达
对上述二轮和三轮淘选富集后的2nd-sPD1-VHH和3rd-sPD1-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落1000个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与sPD1蛋白进行ELISA结合检测。
结果显示，有156个细菌上清与sPD1蛋白结合，同时不与空白对照结合，sPD1结合的读值/空白对照的读值大于5.0(图5和表1)。将156个序列进行测序比对，剔除重复序列，最终获得63个的VHH抗体。进一步的实验证实，这63个VHH抗体以及从VHH抗体得到的CDR均可特异性地结合PD1蛋白。
表1 61个VHH抗体与sPD1蛋白的结合值及其序列
Figure GDA0003460013500000071
Figure GDA0003460013500000081
5.流式细胞法检测VHH抗体与PD1阳性的T细胞的结合
将VHH抗体与H9细胞(T淋巴细胞系)混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％PBSF洗涤两遍后，加入二抗Alexa Fluor 488goat anti human IgG，4℃30min；以0.5％PBSF洗涤两遍后，上机检测。MOCK为PBS对照；neg组为阴性对照，即不含抗体的原核表达上清对照；positive为阳性对照，即可结合PD1的阳性抗体对照。结果显示，上述所有VHH均表现出与H9细胞的结合。使用人源化的VHH抗体亦得到类似的结果。可见，上述VHH抗体具有结合T淋巴细胞表面的PD1的能力，同时有可能通过遮蔽细胞表面PD1分子，阻断PD1配体激活PD1的机会，避免表达PD1配体的肿瘤逃避免疫机制，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此这些VHH抗体均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。由于上述VHH抗体具有T淋巴细胞表面的PD1的能力，同时有可能通过遮蔽细胞表面PD1分子，阻断PD1配体激活PD1的机会，从而通过增强T淋巴细胞杀伤病毒或者细菌的能力，最终达到防控传染病的目的，因此这些VHH抗体均有潜力成为治疗传染病的新型抗体药物。
6.使用AAV病毒载体装载的人源化VHH进行体内实验
腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。
使多黑色素瘤模型小鼠接受AAV-VVH(1x1011gc/100μl)肌肉注射，以AAV-GFP为对照组。结果显示，AAV-VVH对黑色素瘤有治疗作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司
<120> 可结合PD1的多肽及其应用
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Ser Met Val Ser Ala Tyr Ser
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Val Asn Trp Arg Gly Phe Val Thr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ile Ser Thr Ser Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Asn Pro Ala Asp Ile Ser
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Thr His Leu Asp Glu Ser Arg Thr
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Val Ser Arg Ser Gly Arg Ser Thr
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ile Ser Ala Ser Gly Val Ile Thr
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ile Ala Glu Ser Gly Ser Ser Asn Ser Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ile Ala Gln Ser Gly Ser Ser Asn Ser Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ile Thr Trp Asn Gly Gly Ser Lys
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ile Thr Arg Asp Ala Gly Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Ile Thr Trp Asn Ile Gly Thr Thr
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ile Thr Trp Ser Val Gly Thr Thr
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ile Thr Trp Ser Ala Gly Thr Thr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ile Ala Trp Asn Ile Gly Thr Thr
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr
1 5
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Ala Ala Asp Leu Gln Tyr Asp Gly Ser Ala Trp Thr Gly Ala Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ala Val Asp Ser Ser Asp Tyr Cys Thr Gly Asn Gly Pro His Pro Gly
1 5 10 15
Met Asp Tyr
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ala Thr Asp Arg Gly Gly Arg Asp
1 5
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Tyr Ala Ala Val Arg Gln Trp Asp Ala Arg Thr Arg Asp Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Ala Ala Ser Arg Arg Tyr Ser Tyr Ser Thr Pro Val Leu Gly Tyr Met
1 5 10 15
Tyr Glu Asn
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Ala Ala Gly Ala Phe Gly Leu Asn Ala Asp Asn Tyr Arg Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ala Ala Ser Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Pro Lys
1 5 10 15
Val Asp Asp Tyr Asn Tyr
20
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Ala Ala Ser Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Pro Lys
1 5 10 15
Val Asp Asp Tyr Asn His
20
<210> 43
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ala Ala Ser Arg Pro Pro Tyr Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Pro Lys
1 5 10 15
Val Asp Asp Tyr Asn Tyr
20
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Ala Ala Ser Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Trp Leu Val Ser Pro Lys
1 5 10 15
Val Asp Asp Tyr Asn Tyr
20
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Ala Gly Gly Leu Gln Tyr Asn Gly Arg Trp Trp Ser Gly Ala Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ala Ala Arg Thr Thr Phe Gly Val Val Ser Asp Glu Asp Ser Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Ala Ala Arg Thr Ala Phe Gly Val Val Ser Asp Glu Asp Ser Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ala Ala Arg Thr Thr Phe Gly Val Met Ser Asp Glu Asp Ser Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Ala Ala Asp Phe Arg His Pro Glu Val Val Pro Thr Thr Thr Asp Phe
1 5 10 15
Arg Asp
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ala Ala Thr Ala Pro Tyr Tyr Ser Thr Thr Asp Ser Arg His Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Ala Asp Tyr Glu Asp Pro Asp Gly Ser Phe Glu Asp Gly Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ala Asp Tyr Glu Asp Pro Asp Gly Ser Phe Glu Gly Gly Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Ala Ala Tyr Glu Asp Pro Asn Gly Ser Phe Glu Asp Gly Asp
1 5 10
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Ala Asp Tyr Gln Asp Pro Asp Gly Ser Phe Glu Asp Gly Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Ala Asp Tyr Glu Asp Pro Gly Gly Ser Phe Glu Asp Gly Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Ala Asp Tyr Gly Asp Pro Asp Gly Ser Phe Glu Asp Gly Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Ala Asp Tyr Glu Asp Pro Asp Ser Ser Phe Glu Asp Gly Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Asn Ala Asp Thr Pro Leu Ser Gly Thr Leu Gly Phe Arg Glu Ser
1 5 10 15
<210> 59
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser
1 5 10 15
His
<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Tyr Tyr Ser Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Glu Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
35
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Cys Glu Met Val Ala
1 5 10 15
<210> 65
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Ala Asp Ser Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
1 5 10 15
His Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Gly Arg Thr Phe Xaa Ser Xaa Xaa
1 5

Claims (6)

1.一种可结合PD1的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，所述纳米抗体的CDR序列如下：
CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQ IDNO:44；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQ IDNO:41。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为羊驼源的VHH或人源化的VHH。
4.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备细胞表面PD1检测剂中的应用。
5.编码权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体的核酸。
6.一种检测细胞表面的PD1的试剂，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述纳米抗体。
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Nanobodies targeting the interaction interface of programmed death receptor 1 (PD-1)/PD-1 ligand 1 (PD-1/PD-L1);Biyan Wen, et al;《Prep Biochem Biotechnol》;20191204;第50卷(第3期);第252-259页 *

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