CN112724248A - 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用 - Google Patents

可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可结合SARS‑CoV‑2的多肽，包括3个互补决定区CDR1‑3，CDR1序列为或包括SEQ I D NO:1‑9所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ I D NO:10‑20所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ I D NO:21‑38所示序列之一。本发明针对SARS‑CoV‑2进行纳米抗体药物开发，通过免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合病毒的S蛋白上受体结构域的纳米抗体，鉴定了其CDR序列，构建了人源化的抗体C9NB；利用病毒中和实验评估C9NB在治疗该病毒感染的疗效；同时，利用AAV载体装载了编码C9NB的表达序列。本发明为SARS‑CoV‑2的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。

Description

可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合SARS-CoV-2的多肽，以及上述多肽在治疗、预防和检测SARS-CoV-2中的应用。
背景技术
2019年12月，一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)出现，导致人类爆发严重甚至致命的肺炎。该病毒进入细胞依赖于病毒刺突蛋白(S蛋白)的受体结构域(RBD)与靶细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)之间的结合，这表明，破坏RBD-ACE2相互作用将阻止SARS-CoV-2进入细胞。因此，以RBD为靶点，筛选与RBD有结合活性的抗体从而抑制RBD和ACE2的结合将是对抗SARS-CoV-2行之有效的方法。
1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
有研究报道，SARS-CoV-2的RBD-ACE2结合机制与SARS-CoV的几乎相同，且利用RBD蛋白免疫动物可以产生强有效的针对SARS-CoV的多克隆抗体，从而抑制病毒侵入。根据这些研究推断，抗RBD抗体也可以有效地阻止SARS-CoV-2的进入。因此我们期望通过新的技术手段，获得可检测SARS-CoV-2的特异性检测抗体，以及高效稳定的、低IC50的SARS-CoV-2特异性中和抗体。
发明内容
本发明通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于治疗SARS-CoV-2感染的病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合SARS-CoV-2的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-9所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ IDNO:10-20所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:21-38所示序列之一。
在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:39-42所示，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而一个可结合SARS-CoV-2的多肽或结构域。例如，人源的FR1-4的序列可设计为43-46。
在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。
在一个优选实施方案中，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR1的序列为FSISSXDT，其中，第6位的X表示异亮氨酸或缬氨酸；并且
II)CDR2的序列为SEQ ID NO:10并且CDR2的序列为SEQ ID NO:21；或者
CDR1的序列为SEQ ID NO:11并且CDR2的序列为SEQ ID NO:22。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:1，CDR2的序列为SEQ ID NO:10，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:21；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:2，CDR2的序列为SEQ ID NO:11，并且CDR3的序列为SEQID NO:22。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CD1的序列为SEQ ID NO:6
II)CD2的序列选自SEQ ID NO：15-17；并且
III)CD3的序列选自SEQ ID NO:26-35。
优选地，CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:15，并且CD3的序列选自SEQ ID NO:26-33和35；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:16，并且CD3的序列为SEQ IDNO:27；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:17，并且CD3的序列为SEQ IDNO:34。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
CD1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:12，并且CD3的序列为SEQ IDNO:23；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:4，CDR2的序列为SEQ ID NO:13，并且CD3的序列为SEQ IDNO:24；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:5，CDR2的序列为SEQ ID NO:14，并且CD3的序列为SEQ IDNO:25；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:18，并且CD3的序列为SEQ IDNO:36；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:19，并且CD3的序列为SEQ IDNO:37；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:9，CDR2的序列为SEQ ID NO:20，并且CD3的序列为SEQ IDNO:38。
本发明还提供了上述多肽在制备SARS-CoV-2感染治疗剂中的应用。
在一个优选实施方案中，上述多肽的CDR序列如下：
CD1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:12，并且CD3的序列为SEQ IDNO:23；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:16，并且CD3的序列为SEQ IDNO:27；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:17，并且CD3的序列为SEQ IDNO:34。
本发明还提供了上述多肽在在制备SARS-CoV-2检测剂中的应用。
在一个优选实施方案中，上述多肽的CDR序列如下：
CD1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:12，并且CD3的序列为SEQ IDNO:23；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:16，并且CD3的序列为SEQ IDNO:27；或者
CD1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:17，并且CD3的序列为SEQ IDNO:34。
本发明还提供了编码上述多肽的核酸。
本发明还提供了上述核酸在制备SARS-CoV-2治疗和预防药物中的应用。
在一个具体实施方案中，所述核酸为DNA或RNA。
在一个具体实施方案中，所述核酸存在于基因表达框中。
本发明还提供了包含上述核酸的表达框的表达载体。
在一个优选实施方案中，所述表达载体为类病毒表达载体。
在一个优选实施方案中，所述表达载体为腺相关病毒表达载体(AAV载体)。
本发明针对SARS-CoV-2进行纳米抗体药物开发，通过免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合SARS-CoV-2S蛋白上受体结构域(RBD)的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1(C9NB)；利用病毒中和实验评估C9NB在治疗SARS-CoV-2感染的疗效；同时，利用AAV载体装载了编码C9NB的表达序列。本发明为SARS-CoV-2的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。
附图说明
图1为SARS-CoV-S蛋白第2和3次免疫羊驼一周后分别针对S蛋白(A)和RBD蛋白(B)的抗血清效价，以免疫前的血清为对照；
图2为SARS-CoV-S-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图3为SARS-CoV-S-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对S蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2nd)和第三轮(3rd)淘选后的噬菌体抗体文库各挑选96个克隆,针对RBD蛋白进行噬菌体ELISA检测统计图；
图4为真核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对RBD的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性；
图5为真核表达的VHH抗体的SPR检测统计图；
图6为ELISA检测不同纯化浓度的阳性VHH抗体与RBD蛋白结合的OD450统计图；
图7为阳性VHH抗体中和SARS-CoV-2病毒感染实验统计图，其中，A为阳性抗体中和假病毒感染实验统计图；B为阳性抗体中和真病毒感染实验统计图。
具体实施方式
1.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg SARS-CoV-2的S蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天用125μg S蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫2次，第2次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第3次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，分别用浓度为0.5μg/ml的S蛋白和RBD蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，2免和3免的抗血清针对S蛋白效价分别为2.19×106和6.56×106针对RBD蛋白效价分别为2.43×104和2.19×105。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对S蛋白上RBD区域的高滴度抗血清。
2.VHH噬菌体库构建及淘选
收集200ml免疫后骆驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得骆驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将骆驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定CoV-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫S蛋白羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图2)，说明该CoV-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选50个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列没有完全一致的重复序列；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该实验构建了一个CoV-VHH噬菌体抗体文库，库容为2.0×109，阳性率为100％，序列多样性(Diversity)为100％，有效插入率(In frame rate)大于95％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的S-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体分别与S蛋白和RBD蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体pVAX1，转染293F细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与S蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的CoV-VHH噬菌体文库与S蛋白的结合读值为0.79，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为1.58、2.43、2.78(图3A)。为了进一步验证富集后的文库中结合CoV-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2轮和第3轮富集后的文库里各挑选了94个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，36.1％的单个噬菌体克隆与S蛋白结合，其中52.9％的单个噬菌体克隆同时与RBD结合，第3轮文库里31.9％的噬菌体克隆克隆与RBD结合，而且结合读值/空白对照组读值大于5(图3B)，通过S蛋白淘选成功的富集了高结合力的CoV-VHH噬菌体文库。
3.VHH-huFc(C9NB)真核表达
通过分子克隆技术，将上述经序列分析得到的21个不同序列的纳米单抗VHH基因融合人的Fc基因并插入在pCDNA3.4建形成Nb-huFc-pCDNA3.4表达质粒。将构建好的Nb-huFc-pCDNA3.4，转染293tt细胞，表达生产Nb-huFc(C9NB)，并利用Protein G纯化。收集纯化的VHH-huFc1(C9NB)进行ELISA测定，部分抗体有很好的结合能力(图4)。构建的人源化抗体相应的序列号如表1所示。
表1人源化抗体SNB对应的原抗体编号及CDR序列
Figure BDA0002921782160000071
对上述ELISA检测的全部克隆进行抗体与RBD蛋白的亲和力测定试验。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力。将待测抗体VHH-hfc1固化至Anti-human IgGFc Capture Biosensors(AHC)探头上，固化时间400s,再结合抗原RBD-his蛋白，结合时间180s,解离时间180s，观察抗体-抗原的结合解离情况，由仪器拟合曲线，导出数据。亲和力测定结果如表2所示，大部分的抗体的亲和力(KD)能达到10-8至10-9M(nM级别),部分抗体的结合解离曲线如图5所示。可见，我们获得的这些C9NB纳米抗体具有较高的亲和力，能够特异性地识别和结合SARS-CoV-2病毒S蛋白上的RBD结构域。其中，抗体C9NB15，C9NB22和C9NB31获得稳态时响应值较高，说明这三个抗体的结合能力较强，针对这三个抗体进行进一步研究。
表2 C9NB亲和力的总结。
Clone ID Ka(1/MS) Kd(1/S) KD(M) Response(nM)
C9NB01 6.48E+04 2.97E-03 4.59E-08 0.0156
C9NB02 6.85E+05 1.69E-02 2.47E-08 0.0302
C9NB04 4.40E+05 6.30E-03 1.43E-08 0.1824
C9NB05 7.62E+05 1.11E-03 1.46E-09 0.0195
C9NB07 1.84E+05 2.40E-02 1.30E-07 0.0166
C9NB09 5.16E+05 4.67E-03 9.04E-09 0.1254
C9NB12 3.79E+05 4.70E-03 1.24E-08 0.2218
C9NB13 3.04E+05 2.49E-04 8.19E-10 0.0203
C9NB14 5.76E+04 <1.0E-07 <1.0E-12 0.0159
C9NB15 6.94E+05 4.22E-03 6.09E-09 0.2314
C9NB19 3.48E+05 1.31E-02 3.76E-08 0.0366
C9NB22 4.92E+05 2.94E-03 5.99E-09 0.2322
C9NB24 8.30E+05 3.53E-03 4.25E-09 0.1684
C9NB25 3.12E+05 1.92E-03 6.14E-09 0.0168
C9NB27 2.46E+05 5.61E-03 2.28E-08 0.016
C9NB28 2.04E+03 5.82E-02 2.86E-05 0.0068
C9NB29 1.34E+05 5.95E-04 4.45E-09 0.0169
C9NB30 5.46E+05 1.16E-02 2.12E-08 0.0469
C9NB31 6.37E+05 6.64E-03 1.04E-08 0.246
C9NB33 4.34E+05 1.95E-03 4.51E-09 0.1328
注：ka为结合常数，kd为解离常数，KD为亲和力，Response为获得稳态时的响应值。
4.抗体梯度稀释ELISA
用0.5μg/ml的RBD蛋白包被检测板，每孔100μl，37℃孵育2h，洗涤2-4次，4％牛血清封闭，每孔250μl，37℃孵育1h，洗涤2-4次，每孔加入梯度稀释的纯化抗体100μl，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的anti-human抗体100μl，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD450nm。结果显示(图6)，当抗体C9NB15,C9NB22,C9NB31浓度分别低至0.001526，0.000763,0.000763ug/ml，其与RBD蛋白结合的OD450/空白对照的OD450，比值仍大于2。
5.C9NB中和SARS-CoV-2假病毒
通过将表达萤火虫荧光素酶(pNL43R-E-luciferase)和pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体共转染到293T细胞(ATCC)中，分别生成了SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS–cov假病毒。48h后收集病毒上清。病毒滴度通过相对光单位的荧光素酶活性测定(Bright-Glo荧光素酶检测载体系统，Promega Biosciences)。对照单克隆抗体为抗SFTS抗体SNB02(1mg/ml)。选取VHH-huFc1中的C9NB15,C9NB22和C9NB31进行体外中和实验。将抗体梯度稀释为不同的浓度，与SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒一起，于5％CO2 37℃下共孵育1个小时，添加1.5x104个Huh7细胞，5％CO2 37℃温箱培养48小时后，通过检测荧光素酶活性测定评估单克隆抗体的半最大抑制浓度(IC50)
结果如图7A所示，C9NB15,C9NB22和C9NB31具有很好的中和活性，当抗体浓度分别在0.00395，0.00794和0.02029μg/ml时，抑制率能达到90％。
6.C9NB中和SARS-CoV-2真病毒
SARS-CoV-2聚焦还原中和试验(FRNT)是在一个生物安全三级认证实验室进行的。使用先前从一名感染患者的鼻咽拭子中获得的临床分离物(Beta/Shenzhen/SZTH-003/2020,EPI_ISL_406594at GISAID)，对活的SARS-CoV-2进行中和试验。连续稀释检测抗体，与75μl的SARS-CoV-2(8×103聚焦形成单位/ml,FFU/ml)在96孔微波板中混合，37℃孵育1小时。然后将混合物转移到96孔板中，接种Vero E6细胞，在37℃条件下吸收1小时。然后去除接种菌，加入覆盖培养基(100μl含1.6％的羟甲基纤维素，CMC)。然后在37℃下孵育24小时。4％多聚甲醛溶液固定细胞30分钟，去除覆盖层。用0.2％Triton X-100使细胞通透，并与交叉反应兔抗sars-cov-n IgG(Sino Biological,Inc)在室温下孵化1小时，然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch)。细胞在室温下进一步孵育。该反应是用KPL TrueBlue过氧化物酶底物(Seracare生命科学公司)进行的。使用EliSpot分析仪(Cellular Technology Ltd.)计算SARS-CoV-2病灶的数量。
结果如图7B所示，C9NB15,C9NB22和C9NB31具有很好的中和活性，当抗体浓度分别在0.0308，0.1716和0.0411μg/ml时，抑制率能达到90％。
10、AAV病毒载体装载的VVH
腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。
由于上述抗体可特异性识别并结合SARS-CoV-2的S蛋白，并且C9NB15,C9NB22和C9NB31具有良好的中和活性，因此，装载VHH的AAV载体导入到人体后，可使人体表达具有中和活性的抗体，从而使人体可预防SARS-CoV-2感染，也可治疗感染了SARS-CoV-2的患者。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京拓峰生物科技有限公司
<120> 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Tyr Gly Gln Asp Ile Leu Gly Gln Ile Tyr
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20 25 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种可结合SARS-CoV-2的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-9所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:10-20所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:21-38所示序列之一。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为VHH。
5.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
6.权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备SARS-CoV-2感染治疗剂中的应用。
7.权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备SARS-CoV-2检测剂中的应用。
8.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-5中任一项所述的多肽。
9.权利要求8所述的核酸在制备SARS-CoV-2治疗药物中的应用。
10.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求8所述的核酸。
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