CN114276453A - 可结合cd4的纳米抗体4nb334及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可结合CD4的纳米抗体4NB334，包括3个互补决定区CDR1‑3，序列如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明通过制备CD4蛋白、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD4的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化抗体；并利用评估抗体在治疗HIV感染的疗效。本发明利用CD4结合的纳米抗体为HIV感染的临床治疗以及CD4淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，双靶向抗体新药，基因治疗新药以及CAR细胞治疗等。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合CD4的纳米抗体，还涉及所述纳米抗体在制备HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物和诊断剂中的应用。
背景技术
CD4是T细胞表面上表达的重要受体分子，但同时也是病毒例如HIV等攻击T细胞的靶点。报道，HIV主要通过包膜表面的糖蛋白gp120与宿主细胞表面的特定受体(例如CD4)接触而影响病毒进入细胞的过程。抑制gp120和CD4的结合，可以有效地抑制HIV-1对宿主细胞的感染。另外，由于T细胞肿瘤也表达CD4。因此，可考虑以CD4为靶点，利用抗CD4抗体来治疗HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤。
1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
我们期望通过新的技术手段，筛选出获得能够结合CD4的抗体，为预防和治疗CD4相关疾病例如HIV感染或CD4阳性T细胞肿瘤等提供潜在新药。
发明内容
本发明通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗及其VHH，用于治疗HIV感染的病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合CD4的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，序列如SEQ ID NO:1-3所示。
在一个具体实施方案中，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:4-7所示(羊驼源)，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD4的纳米抗体。
在一个具体实施方案中，所述纳米抗体为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备CD4检测剂中的应用。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备针对HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的CAR-T治疗剂中的应用。
本发明还提供了编码上述纳米抗体的核酸。
本发明还提供了上述核酸在制备HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
本发明针对HIV进行纳米抗体药物开发，通过制备CD4蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD4的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1；同时利用假病毒中和实验评估4NB在治疗HIV感染的疗效。本发明利用CD4结合的纳米抗体为HIV感染的临床治疗以及CD4淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，双靶向抗体新药，基因治疗新药以及CAR细胞治疗等。
附图说明
图1为CD4第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
图2为不同稀释度的第4次免疫骆驼一周后的抗血清抑制HIV假病毒体外感染ghost细胞的曲线，以免疫前的血清为对照；
图3为CD4-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图4为CD4-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD4蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2nd)和第三轮(3rd)淘选后的噬菌体抗体文库各挑选40个和46个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
图5为抗体4NB334中和HIV假病毒感染实验统计图，JRFL为HIV假病毒，MuLv为无关对照病毒，X轴为抗体浓度，Y轴为病毒的相对抑制率。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们依据CD4蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导骆驼产生针对CD4蛋白的特异性抗体的多肽CD4，在C端连接His-tag(CD4-his)或兔Fc(CD4-rFc)用于后续纯化及检测。
2.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg CD4-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用CD4-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的CD4-his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前骆驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为3.28×106和9.84×106。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对CD4蛋白的高滴度抗血清。
为了进一步验证该高滴度的骆驼抗血清是否能有效阻止HIV病毒感染，进行病毒感染的中和实验。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与HIV病毒共同孵育60min，随后转移到ghost细胞，48h后通过Glo Max化学发光酶标仪(Promega)检测病毒载量并计算中和效果。中和实验结果显示，CD4诱导的抗血清抑制90％HIV感染的ID90为540倍稀释度以上(图2)。综上所述，CD4诱导了高滴度抗血清，同时该抗血清具有高效抑制HIV假病毒感染的能力。
3.VHH噬菌体库构建及淘选
收集200ml免疫后骆驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得骆驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将骆驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。
为了进一步鉴定CD4-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫CD4骆驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图3)，说明该CD4-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选50个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列没有完全一致的重复序列；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个CD4-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.6×109，阳性率为100％，序列多样性(Diversity)为100％，有效插入率(In frame rate)大于95％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的CD4-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与CD4蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体phv3，转染293tt细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与CD4蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的CD4-VHH噬菌体文库与CD4蛋白的结合读值为1.71，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为2.5、3.1、3.1(图4A)。为了进一步验证富集后的文库中结合CD4-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2轮和第3轮富集后的文库里各挑选了40、46个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，57.5％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里82.6％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图4B)，通过CD4蛋白淘选成功的富集了高结合力的CD4-VHH噬菌体文库。其中,筛选出抗体4NB334,CDR1-3的序列如SEQ IDNO:1-3所示,FR1-4的序列如SEQ ID NO:4-7所示。
4.VHH-huFc真核表达
通过分子克隆技术，将文库筛选的阳性克隆VHH基因融合人的Fc基因并插入在pCDNA3.4真核表达载体，构建形成Nb-huFc-pCDNA3.4表达质粒。将构建好的Nb-huFc-pCDNA3.4，转染293tt细胞，表达生产Nb-huFc(4NB)。收集细胞上清进行ELISA测定。
对抗体4NB334与CD4蛋白的亲和力测定试验。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力。将抗体4NB334固化至Anti-human IgG Fc Capture Biosensors(AHC)探头上，固化时间400s,再结合抗原CD4-his蛋白，结合时间180s,解离时间180s，观察抗体-抗原的结合解离情况，由仪器拟合曲线，导出数据。亲和力测定结果如表1所示，大部分的抗体的亲和力能达到10-8或10-9(Nano mole级)。由此可见，我们获得了具有高亲和力的VHH-huFc1(C9NB)抗体，可用于检测CD4。
表1 4NB334亲和力数据
| Clone ID | Ka(1/MS) | Kd(1/S) | KD(M) | Response(nm) |
| 4NB334 | 8.36E+04 | 4.20E-03 | 5.03E-08 | 0.2944 |
5. 4NB334阻断HIV感染ghost细胞
将抗体4NB334稀释至1μg/ml作为起始浓度，3倍比梯度稀释，共设8个梯度，分别与JRFL病毒一起，于5％CO2 37℃下共孵育1个小时，添加1.0x104个ghost细胞，5％CO237℃温箱培养48小时后，移除细胞上清，加入100μl/孔的Glolysis buffer(提前恢复至室温)，轻晃培养板使细胞充分裂解,接着转移50μl/孔细胞裂解物于96孔白色荧光酶标板中(Costar)，再加入50μl/孔Brite-Glo luciferase底物(提前恢复至室温)，涡旋震荡混匀，立即放入Glo Max化学发光酶标仪(Promega)进行检测。中和滴度(IC50)表述为50％抑制率时的抗体浓度。
结果如图5所示，抗体4NB334的IC50为20.5928ng/ml。
由以上实验结果可知，本发明的抗体4NB334及其人源化形式均可对特异性地识别、结合CD4，阻断CD4的配体与CD4的结合，从而抑制与CD4通路相关的疾病，例如HIV感染、CD4阳性的T细胞肿瘤等。因为抗体4NB334能够识别细胞表面的CD4分子，因此其序列也可以应用于CAR(Chimeric Antigen Receptor,抗原嵌合受体,由VHH序列融合第三代或者第四代CD28-4-1BB-CD3zeta分子序列构成)细胞治疗肿瘤或HIV感染。
另外因为抗体4NB334能识别细胞表面的CD4分子，因此也可以通过偶联药物用于ADC(Antibody-drug conjugate,抗体偶联药物)治疗或者偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等。也可将编码抗体4NB334的核酸搭载在AAV系统中，用于治疗作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司
<120> 可结合CD4的纳米抗体4NB334及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Leu Thr Phe Asn Ser Asn Asn
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Arg Trp Asn Ala Asn Pro
1 5
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Phe Gly Asp Tyr Phe Val Gln
1 5 10 15
Gln Ser Ser Tyr Asp Tyr
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ile Thr Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
Claims (8)
1.一种可结合CD4的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，序列如SEQ IDNO:1-3所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
4.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备CD4检测剂中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备针对HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的CAR-T治疗剂中的应用。
7.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体。
8.权利要求7所述的核酸编码序列在制备HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
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