CN114276452A - 可结合bcma的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗BCMA纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1‑3，序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示本发明针对B细胞淋巴瘤进行纳米抗体药物开发，通过制备人BCMA蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合BCMA的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的纳米抗体；同时利用流式细胞术鉴定其结合B细胞淋巴瘤细胞的能力。本发明为B细胞淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药,同时为B细胞淋巴瘤患者的诊断提供相应的检测试剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合BCMA的纳米抗体，以及所述纳米抗体在制备BCMA检测剂或B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。
背景技术
BCMA是B细胞成熟抗原，是一种跨膜糖蛋白，亦称CD269或TNFRSF17，是TNF受体超家族成员之一，它的配体是B细胞激活因子(BAFF)以及增殖诱导配体(APRIL)。BCMA的表达限于B细胞谱系，主要存在于浆细胞和浆母细胞上，研究表明，BCMA mRNA和蛋白在恶性浆细胞上的表达远高于正常浆细胞，而在初始B细胞和记忆B细胞及其他正常组织细胞上不表达。BAFFF及APRIL通过BCMA的信号传导促进恶性浆细胞的存活。此外，有研究表明，在供体淋巴细胞输注与移植物抗肿瘤反应后缓解的多发性骨髓瘤患者中检测到BCMA抗体，以上研究结果表明，BCMA是非常有前景的B细胞淋巴瘤的靶向疗法抗原。
1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
治疗性抗体药物发展的趋势从鼠源、人鼠嵌合、人源化再到全人源，再到近年得到广泛关注的纳米抗体，纳米抗体的研发得到高速发展。2018年9月首个纳米抗体药物获批。目前国内外有多个纳米抗体药物在临床研究阶段。我们期望通过免疫羊驼，获得高亲和力的靶向BCMA的治疗性纳米抗体。
发明内容
本发明通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于诊断和治疗B细胞淋巴瘤病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合BCMA的纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1-3序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。
在一个具体实施方案中，所述纳米还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:4-7所示(羊驼源)，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合BCMA的纳米抗体。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备BCMA检测剂中的应用，该抗体即可检测游离的BCMA蛋白，也可检测细胞表面的BCMA蛋白。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述纳米抗体在制备针对B细胞淋巴瘤的CAR T治疗剂中的应用。
本发明还提供了编码上述纳米抗体的核酸。在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
本发明针对B细胞淋巴瘤治疗药物进行纳米抗体药物开发和诊断试剂研发，通过制备sBCMA蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合sBCMA的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1；同时利用流式细胞术评估人源化抗体与细胞表面BCMA蛋白的结合。本发明为B细胞淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药,同时为B细胞淋巴瘤患者的诊断提供相应的检测试剂。
附图说明
图1为sBCMA第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
图2为以sBCMA-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图3为sBCMA-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对BCMA蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2nd)、第三轮(3rd)和第四轮(4th)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选48、46和47个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
图4为BANB0352抗体分别与细胞表面表达的人BCMA或猴BCMA膜蛋白结合的流式检测结果。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们依据NCBI网站上人BCMA蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对BCMA蛋白的特异性抗体的多肽sBCMA，在C端连接His-tag(sBCMA-his)或兔Fc(sBCMA-rFc)用于后续纯化及检测。
2.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg sBCMA-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用sBCMA-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第3次和第4次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血100ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的BCMA蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为1.09×106和3.28×106。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对BCMA蛋白的高滴度抗血清。
3.VHH噬菌体库构建及淘选
收集100ml免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将羊驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定sBCMA-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫sBCMA羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图2)，说明该sBCMA-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选48个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列没有完全一致的重复序列；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个sBCMA-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.6×109，阳性率为100％，序列多样性(Diversity)为100％，有效插入率(In frame rate)为85.4％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的sBCMA-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与sBCMA蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体pVAX1，转染293F细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与BCMA蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的sBCMA-VHH噬菌体文库与sBCMA蛋白的结合读值为0.50，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为1.17、2.78、3.33(图3A)。为了进一步验证富集后的文库中结合sBCMA-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2轮、第3轮和第4轮富集后的文库里分别挑选48、46、47个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，6.25％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里13.04％的噬菌体克隆为阳性，第4轮文库里34.04％的噬菌体克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图3B)，通过sBCMA蛋白淘选成功地富集了高结合力的sBCMA-VHH噬菌体文库。
4.VHH原核表达文库的构建及VHH表达
对上述四轮淘选富集后的4th-sBCMA-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落2016个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与sBCMA蛋白进行ELISA结合检测。
结果显示，有细菌上清与sBCMA蛋白结合，同时不与空白对照结合，sBCMA结合的读值/空白对照的读值大于2.5。其中，编号为BANB0352抗体，其与BCMA的结合活性好，OD450target/OD450 blank的值为17.29。经测序，该抗体的CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示，FR1-4的序列如SEQ ID NO：4-7所示。
5.Fortebio检测抗体BANB0352与BCMA蛋白的亲和力
将BCMA蛋白以AR2G生物传感器耦联后，检测VHH抗体与BCMA蛋白的亲和力水平。将耦联好抗原的生物传感器以0.02％PBST平衡后，结合VHH抗体，时间180S，于0.02％PBST中解离，时间180S，以Fortebio数据分析软件8.0版本，1∶1结合模式拟合分析，得出抗体BANB0352与BCMA蛋白亲和力数据如表1所示。
表1抗体BANB0352与BCMA蛋白的亲和力相关数据
| Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | RMax | Full R^2 |
| BCMA-352 | 25 | 0.2707 | 2.56E-09 | 2.16E+05 | 5.53E-04 | 0.4482 | 0.9936 |
6.流式细胞法检测VHH抗体与肿瘤细胞的结合
将抗体BANB0352序列构建为人源化VHH-hfc1抗体表达载体，所得载体转染293TT后，收取抗体上清进行如下流式实验。将293TT细胞转染表达膜蛋白human BCMA或MonkeyBCMA，将抗体BANB0352与表达BCMA的293TT细胞(293TT-human BCMA或293TT-monkey BCMA)混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％PBSF洗涤两遍后，加入荧光二抗：Alexa Fluor488anti human FC，Alexa Fluor 647anti human BCMA，4℃30min；以0.5％PBSF洗涤两遍后，上机检测。同时做阴性细胞对照组，即未转染的293TT细胞组。流式结果如图4所示，抗体BANB0352可与293TT-human BCMA细胞或293TT-monkey BCMA细胞结合而不与293TT细胞结合。以上抗体在与表达BCMA膜蛋白的RPMI-8226细胞的流式检测实验，同样可见阳性结合。由此可见，上述VHH抗体具有靶向结合膜蛋白BCMA的能力，同时有可能通过靶向肿瘤细胞表面的BCMA分子，促进巨噬细胞的吞噬作用，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此抗体BANB0352均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。
因为BANB0352抗体能够识别细胞表面的BCMA分子，因此这些VHH抗体序列也可以应用于CAR(Chimeric Antigen Receptor,嵌合抗原x受体,由VHH序列融合第三代或者第四代CD28-4-1BB-CD3zeta分子序列构成)细胞治疗肿瘤的治疗。另外因为上述VHH能识别肿瘤细胞表面的BCMA分子，因此VHH可以通过偶联药物用于ADC(Antibody-drug conjugate,抗体偶联药物)治疗或者偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等，为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米新药。
7.使用AAV病毒载体装载的人源化VHH进行体内实验
腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。
ImmunodeficientNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠购自南京大学模式动物所，与NSG小鼠类似，该小鼠在SCID小鼠基础上缺失了IL2受体基因，导致体内没有小鼠T细胞，B细胞以及极少量的NK细胞。1.0-15x107PBMC腹腔注射进4-6周的NCG小鼠体内；三周后，采血流式检测人T细胞，通过染色人的CD45+、CD3+、CD4+和CD8+。人CD45阳性细胞的比例到达5％以上，判定为小鼠人源化成功。将上述小鼠腹腔注射RPMI-8226细胞3*106/只，一周后，使小鼠接受AAV-BANB(1x1011gc/100μl)肌肉注射，以AAV-GFP为对照组。结果显示，注射了AAV-BANB的小鼠体内，肿瘤增长收到明显抑制，这说明AAV-BANB对多发性骨髓瘤有治疗作用。
由以上实验结果可知，上述VHH以及人源化后得到的VHH-hfc1抗体均可特异性地识别、结合sBCMA，并且在流式细胞层面也可有效结合BCMA膜蛋白，也可对B细胞淋巴瘤在小鼠体内发展产生抑制作用。说明这些抗体可识别天然构象的细胞表面膜蛋白BCMA，可利用其靶向作用，偶联治疗性药物，用以制备抗体偶联药物ADC(Antibody-drug conjugate)或偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等。也可应用于CAR疗法，用于治疗多发性骨髓瘤等B细胞恶性肿瘤，比如CAR-T或CAR-NK疗法，将T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)经修饰后表达抗BCMA CAR，从而达到治疗目的。更进一步的，可将编码上述抗体VHH片段的核酸搭载在AAV系统中，用以制备基因治疗药物，达到治疗目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司
<120> 可结合BCMA的纳米抗体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5
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<211> 8
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Ala Arg Ser Arg Tyr Ser Glu Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
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Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
Claims (8)
1.一种可结合BCMA的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为羊驼源的VHH或人源化的VHH。
4.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备BCMA检测剂中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。
6.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备针对B细胞淋巴瘤的CAR T细胞治疗剂中的应用。
7.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-3中任一项所述的多肽。
8.权利要求7所述的核酸在制备基因治疗药物中的应用。
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| CN117069842A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-11-17 | 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 | 具有特定等电点的抗人bcma纳米抗体及car-t和应用 |
| CN117069844A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-11-17 | 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 | 包含特定等电点的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用 |
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| CN117534763A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-02-09 | 康维众和(中山)生物药业有限公司 | 抗bcma的纳米抗体及其制备方法与应用 |
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