CN117534763B - 抗bcma的纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗bcma的纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗BCMA的纳米抗体及其制备方法与应用；所述纳米抗体或其抗原结合片段：包含重链可变区，其包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示。本发明方案提供的抗BCMA的纳米抗体能显著与人多发性骨髓瘤细胞结合，亲和力高，为后续治疗人多发性骨髓瘤提供了可供选择的抗体；同时本发明制备的纳米抗体可特异性识别并结合BCMA，具有潜在的治疗与BCMA相关的疾病的效用。

Description

抗BCMA的纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗BCMA的纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是浆细胞异常增生，同时导致体内产生大量病理性免疫球蛋白为特征的血液肿瘤性疾病的恶性肿瘤病，常伴有多发性溶骨性损害，包括高钙血症、贫血、肾脏损害，而且对细菌性感染的易感性增高，正常免疫球蛋白的生成受抑。
BCMA是TNF受体家族的一名成员(TNFγ-SF17)，全称为B细胞成熟抗原，也称CD269，仅表达在成熟B细胞表面，由185个氨基酸残基组成的非糖基化的III型整合膜蛋白，mRNA长为1.2kb。在管理B细胞的成熟与B细胞分化成浆细胞的过程中扮演着至关重要的角色。BCMA具有受体特异性，结合肿瘤坏死因子（配体）超家族成员13b（TNFSF13B / TALL-1 /BAFF），并导致NF-κB和MAPK8 / JNK活化。该受体还与各种TRAF家族成员结合，介导细胞存活和增殖的信号。在多发性骨髓瘤中BCMA的表达增加，促增殖信号增强，最终癌化。因此在多发性骨髓瘤细胞上BCMA的表达水平显著高于健康的浆细胞。
目前靶向BCMA的疗法主要包括抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）、双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T）三大阵营，以BCMA为靶点的免疫疗法在临床前及临床研究中疗效显著，尤其是CAR-T技术，能够以非主要组织相容性复合体依赖性方式特异识别肿瘤抗原而发挥强大的抗肿瘤免疫效应。但治疗过程中出现的CRS、脱靶效应等不良反应仍是亟待解决的问题，而利用抗体靶向治疗MM，分子量太大药物不能穿透血管，到达病灶，治疗效果也没有达到特别好的疗效，同时，相关技术的单克隆抗体上的FC片段于其他正常细胞有非特异性结合，致使药物不能特异性靶向目的细胞疗效减弱，副作用大。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段。
本发明还提出了一种重组蛋白。
本发明还提出一种编码上述抗BCMA的纳米抗体的核酸分子。
本发明还提出一种与上述核酸分子相关的生物材料。
本发明还提出了一种偶联物。
本发明还提出上述纳米抗体、重组蛋白、核酸分子、生物材料和偶联物的应用。
本发明还提出一种产品。
本发明还提出一种上述纳米抗体或其抗原结合片段的筛选方法。
本发明还提出一种上述纳米抗体或其抗原结合片段的制备方法。
根据本发明的第一方面，提出了一种抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段：包含重链可变区，其包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米抗体还包括骨架区序列FR。
在本发明的一些实施方式中，所述骨架区序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1）SEQ ID NO:2；
a2）将SEQ ID NO:2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a3）与SEQ ID NO:2至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%的同源性且与SEQ ID NO:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段还包括Fc标签序列。
在本发明的一些实施方式中，所述Fc标签序列如SEQ ID NO:19所示。
根据本发明的第二方面，提出了一种重组蛋白，所述重组蛋白包含上述纳米抗体或其抗原结合片段和假单孢杆菌外毒素蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述假单孢杆菌外毒素序列为PE38序列。
在本发明的一些实施方式中，所述编码假单孢杆菌外毒素蛋白的序列选自SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述重组蛋白还包括任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的一些实施方式中，所述的标签序列选自下组中的至少一种：His标签、GGGS序列、FLAG标签。
根据本发明的第三方面，提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的序列包含：
b1)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
b2)将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列所示的编码相同蛋白的核苷酸序列；或
b3)与SEQ ID NO:1具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%以上的同源性，且与SEQ ID NO:1所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。
根据本发明的第三方面，提出了与所述的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包含c1)～c7)中至少一种：
c1)包含上述核酸分子的表达盒；
c2)包含上述核酸分子的载体；
c3)包含上述表达盒的载体；
c4)包含上述核酸分子的转基因细胞系；
c5)包含c1)所述表达盒的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述载体的转基因细胞系；
c7)包含c3）所述载体的转基因细胞系。
根据本发明的第四方面，提出了一种偶联物，包含：上述的纳米抗体或其抗原结合片段和上述的重组蛋白中的至少一种；以及偶联部分，所述偶联部分包含药物、毒素、电子致密标记、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、放射性同位素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述偶联部分还包括可检测标记物。
在本发明的一些实施方式中，所述可检测标记物为荧光或发光标记物。
在本发明的一些实施方式中，所述可检测标记物选自吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺、异鲁米诺、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，所述放射性同位素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177和Re-188中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为其他抗BCMA的药物。
根据本发明的第五方面，提出了上述纳米抗体、重组蛋白、核酸分子、生物材料和偶联物中的至少一种的应用，所述应用为在制备产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防BCMA相关疾病；
d2)治疗和/或预防BCMA相关疾病所引起的疾病。
在本发明的一些实施方式中，所述BCMA相关疾病包括血液恶性肿瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述血液恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测BCMA相关疾病；
e2)诊断BCMA相关疾病所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防BCMA相关疾病所引起的疾病。
在本发明的一些实施方式中，所述BCMA相关疾病包括血液恶性肿瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述血液恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤。
根据本发明的第六个方面，提供一种产品，所述产品包含f1)～f3)中至少一种：
f1)上述的抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段；
f2)上述的重组蛋白；
f3)上述的偶联物；
在本发明的一些实施方式中，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防BCMA相关疾病；
d2)治疗和/或预防BCMA相关疾病所引起的疾病。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测BCMA相关疾病；
e2)诊断BCMA相关疾病所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防BCMA相关疾病所引起的疾病。
在本发明的一些实施方式中，所述BCMA相关疾病包括血液恶性肿瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述血液恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤。
根据本发明的第七方面，提出了一种上述纳米抗体或其抗原结合片段的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
S1、将免疫抗原用于免疫目的动物；
S2、分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；
S3、以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体噬菌体展示文库；
S4、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行BCMA纳米抗体的筛选。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫抗原包括BCMA蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述目的动物包括羊驼。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫目的动物的步骤包括将免疫抗原，按照0.2-0.4mg/次的剂量导入目的动物体内，共免疫3-5次，免疫间隔为12-15d。
在本发明的一些实施方式中，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段所用引物分别为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18。
根据本发明的第八方面，提出了一种上述纳米抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：通过上述的转基因细胞系表达得到。
根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案提供的抗BCMA的纳米抗体能显著与人多发性骨髓瘤细胞结合，亲和力高，为后续治疗人多发性骨髓瘤提供了可供选择的抗体；同时本发明制备的纳米抗体可特异性识别并结合BCMA，具有潜在的治疗与BCMA相关的疾病的效用；本发明方案还将制备得到的抗BCMA的纳米抗体与假单孢杆菌外毒素（PE38）序列制备得到融合蛋白，可以有效的降低人多发性骨髓瘤细胞的存活，用于治疗人多发性骨髓瘤，为开发治疗人多发性骨髓瘤的药物提供了新的方向。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的动物免疫效价检测结果图；
图2为本发明实施例1中的第一轮PCR产物检测结果图，其中，M为marker，1-5分别对应不同泳道PCR产物的检测结果；
图3为本发明实施例1中的第二轮PCR产物检测结果图，其中，M为marker，1-5分别对应不同泳道PCR产物的检测结果；
图4为本发明实施例3中的165个不同序列的BCMA抗体的ELISA检测结果图；
图5为本发明实施例3中的流式检测结果图，其中A为空白对照检测结果图，B为候选分子与U266细胞系流式结合结果图；
图6为本发明实施例3中的流式检测结果图，其中，A为空白对照检测结果图，B为候选分子与RPMI8226细胞系流式结合结果图；
图7为本发明实施例3中的SDS-PAGE检测结果图，其中，M为marker，1为NBBCMA-9候选分子；
图8为本发明实施例3中的亲和力测定结果图；
图9为本发明测试例中的纳米抗体融合表达药物对多发性骨髓瘤细胞系U266的杀伤作用检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1噬菌体库的构建
1、llama免疫
将成年雄性健康llama羊驼，进行皮下多点注射免疫。每次注射0.25mg BCMA蛋白（购于上海近岸蛋白，货号cs79），每隔14天注射一次，共注射3次。第三次免疫后14天采血2mL测效价。
效价检测利用酶联免疫法，靶抗原为带HIS标签的BCMA蛋白，一抗为抗his-HRP，TMB显色，450nm检测O.D值）。检测时将血清用pH7.4的PBS缓冲液稀释，其中血清被稀释倍数为0.1k倍、1k倍、2k倍、4k倍、8k倍、16k倍、32k倍、64k倍、128k倍、256k倍、512k倍、1024k倍，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明免疫效价达到血清稀释倍数1024k，远超行业通常数值。
2、羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总RNA以及cDNA的获得
对满足效价要求的羊驼进行大量采血，分离PBMC，提取总RNA。提取总RNA的方法为TRZOL手提操作法，具体操作如下：将分离完的PBMC细胞从液氮罐中取出，迅速解冻；800g离心，5分钟，弃上清，向沉淀中加入1mL的TRIZOL液，用枪轻轻来回吹打几次使细胞充分裂解；加200μL氯仿后手摇剧烈震荡30s，静置5min，13500r/min，离心10min，分层，吸取上层液体相到另一新的无RNA酶1.5mL管中，加入等体积的异丙醇。混匀，-20℃沉淀20mins。将沉淀液体离心，13500转，离心10分钟，弃上清。75%冰乙醇洗两遍，超净台吹干，用60μL无RNA酶的水复溶，得到羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总RNA溶液，备用。
使用Thermo公司反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA（具体方案参见Thermo公司反转录试剂盒）后，定量分装，-80℃保存备用。
3、噬菌体库构建
（1）通过进行两步PCR扩增，获得目的片段。
1）第一轮PCR
以Kz-001和Kz-002为引物（序列如表1所示）进行第一轮PCR，用TAKARA公司高保真PCR聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟，（94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒）循环18轮，72℃末端延伸10分钟，4℃降温1分钟。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果如图2所示，回收750bp条带。反应体系参见TAKARA公司高保真PCR聚合酶的说明书，模板DNA为步骤2羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总RNA以及cDNA的获得，得到的cDNA。
表1
2）第二轮PCR
以Kz-003、Kz-004、Kz-005和Kz-006为引物（序列如表1所示）进行第二轮PCR，用TAKARA公司高保真PCR聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟，（94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒）循环20轮，72℃末端延伸10分钟，4℃降温1分钟。回收450bp条带。反应体系参见TAKARA公司高保真PCR聚合酶的说明书，模板DNA为第一步PCR获得的产物。第二轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，从图中可以看出，一条特异性的目的条带，大小为450bp，此条带即为纳米抗体片段。将这些条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，定量。
（2）片段与载体的酶切、连接以及电转得到噬菌体库
将步骤（1）得到的纳米抗体片段采用限制性酶进行酶切，所用的两种限制性酶切位点为sfiI和NotI（采用的sfiI和NotI酶购自上海生工生物工程有限公司，酶切体系和条件参照说明书进行），利用凝胶回收试剂盒（购自上海生工生物工程有限公司）回收后定量；本发明使用商业化载体pcantab5e（购自成都传世科为生物技术有限公司，货号：trans12-4），同时此载体也采用上述两种限制性酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后定量。
将所有酶切后的载体与酶切后的纳米抗体片段按照摩尔比1：3过夜连接，之后电击转化进TG1感受态细胞中，稀释涂平板进行克隆计数，得到库容为9.9×107pfu/mL；随机挑克隆20个送测序，阳性率为100%，包装成噬菌体滴度为2.14×1013pfu/mL。
实施例2 噬菌体库的筛选
采用固相筛选方法筛选噬菌体库，具体筛选方法如下：
将靶分子包被在96孔表面，洗去未吸附的靶分子，然后封闭，之后用扣除背景的噬菌体抗体库加入到孔中结合。洗去未结合的噬菌体，再用0.2M甘氨酸-盐酸洗脱得到亲和噬菌体。每轮通过降低包被靶分子浓度和加大洗涤力度得到高亲和力噬菌体。每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的纳米抗体在噬菌体库中得到富集。经过2轮筛选，进行挑取单克隆验证，结果如表2所示，筛选后富集达到1000倍以上。
表2抗BCMA纳米抗体噬菌体库2轮筛选结果
实施例3 纳米抗体分子的筛选
（1）通过ELISA鉴定靶标抗原特异性克隆，具体步骤如下：
从实施例2的第2轮筛选产物中挑取752个单克隆进行ELISA鉴定，ELISA鉴定方法如下：用pH9.6为碳酸氢钠包被液稀释靶蛋白，37℃静置1h进行包被，PBS洗3次。加入封闭液进行封闭37℃静置1小时，甩出多余的封闭液PBS洗3次。取扩增产物用1%M-PBS 10倍稀释混匀50μL/孔37℃静置1小时。一抗：用1%M-PBS按1：1000稀释兔抗M13，50μL/孔37℃静置1.0h。二抗：用1%M-PBS按1：3000稀释HRP-羊抗兔50μL/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2M/L Na2HPO4+0.1M/L柠檬酸各4.5mL加入少量OPD，60μL H2O混匀，50μL/孔。2M硫酸终止50μL/孔。490nm检测。Phage ELISA最少要重复一次。阳性克隆保存：取0.5mL Phage+0.3mL 50%甘油，混匀。-80℃保存。
将ELISA中所有阳性序列送测序，得到不同的纳米抗体序列共165个，这些序列的ELISA结果如图4所示；从图4中可以看出，筛选到的所有序列在490nm处吸收值都远大于空白对照组，显示BCMA纳米抗体与BCMA蛋白结合呈阳性结果。
（2）候选纳米抗体分子与细胞结合活性分析
将上述步骤（1）得到的165个候选序列进行克隆构建到表达载体PET30a(+)原核表达载体（来自生物（安徽）股份有限公司赠予）中，进行37℃，220rpm/min,过夜1mMIPTG诱导表达，取3mL过夜诱导表达菌超声破碎，13500rpm/min，离心10分钟，取上清进行流式细胞结合实验，实验选取两株表达BCMA蛋白的多发性骨髓瘤细胞系，分别为：RPMI8226和U266细胞系。分别检测165个候选序列与这两株细胞系结合情况，筛选得到纳米抗体候选分子NBBCMA-9，其中，候选序列与低表达BCMA的RPMI8226细胞系结合如图5所示。之后更换细胞系，使用BCMA高表达细胞系U266，检测候选分子与该细胞系流式结合情况，结果如图6所示，这个候选分子也同时与高表达BCMA的细胞系U266结合。
流式细胞检测具体方法：收集细胞，制备单细胞悬液，计数；离心弃上清，用1.5mLFACS BUFF（2% FBS-PBS）重悬；加入blocking regeant（invitrogen 14-9161-73）60μL混匀，冰上孵育10min；将细胞加入含有样品的1.5mL EP管（300μL/sample) ，冰上孵育15min；另设空白对照和仅加抗体的对照各一个；流式buffer 洗2次，弃上清，在残液（~100μL）中加入流式抗体 anti-his-FITC，冰上孵育20min，混匀过细胞筛网，用流式仪（贝克曼cytoFlex）进行测试。
（3）候选纳米抗体分子的抗原抗体亲和力检测
表3
将上述制备得到的候选分子NBBCMA-9与FC标签融合表达在pCDNA3.1(+)真核载体中，293细胞瞬转，30mL体系，之后用Protein A柱子纯化，得到纯化后的蛋白，蛋白样品还原处理后跑SDS-PAGE胶，如图7所示，进行抗原抗体亲和力检测，具体检测方法如下：固定BCMA无标签蛋白抗原，结合纯化的NBBCMA-FC蛋白梯度稀释（100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM），使用anti-humanFC探针。亲和力结果如表3和图8所示，从图表中可以看出，NBBCMA-9的KD为9.85×10-9。
FC标签序列：
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:19）。
本发明获得的纳米抗体分子CDR区序列如表4所示。
表4
本发明获得纳米抗体分子蛋白序列如下：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDHAVGWFRQAPGKEREGVVCVSSAHDNTYFADSVKGRFTISSDNAKTTVYLQMENLKPEDTAIYYCAAAPPPAAAPPPWRYYGKYYCLSPSGYWGQGTQVTVSS（SEQ ID NO:2）。
本发明获得候选分子的核酸序列如下：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCGATGATCATGCCGTAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCGTATGTGTTAGTAGCGCTCATGATAATACATACTTTGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGTGACAACGCCAAGACAACGGTGTATCTGCAAATGGAAAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCTGCGGCGCCCCCCCCAGCTGCGGCGCCCCCCCCATGGCGCTATTATGGGAAATACTACTGCCTATCACCCAGTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCG（SEQ ID NO:1）。
实施例4 一种抗多发性骨髓瘤的药物
本实施例提供了一种抗多发性骨髓瘤的药物，为实施例3制备得到的纳米抗体序列（如SEQ ID NO:1所示的序列）与假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq9（如SEQ ID NO:10所示的序列）通过linker（GGGS）2融合表达得到的药物，具体制备方法如下：
假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq9:
PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK（SEQ ID NO:10）。
将纳米抗体序列（如SEQ ID NO:1所示的序列）与假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq9（如SEQ ID NO:10所示的序列）通过linker（GGGS）2进行连接得到的人工序列交由上海生工生物工程有限公司进行合成，得到融合蛋白序列。
实施例5 一种抗多发性骨髓瘤的药物
本实施例提供了一种抗多发性骨髓瘤的药物，为实施例3制备得到的纳米抗体序列（如SEQ ID NO:1所示的序列）与假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq10（如SEQ ID NO:11所示的序列）通过linker（GGGS）2融合表达得到的药物，具体制备方法同实施例4的区别仅在于，将假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq9替换为假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq10。
假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq10:
PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPKDEL（SEQ ID NO:11）。
实施例6 一种抗多发性骨髓瘤的药物
本实施例提供了一种抗多发性骨髓瘤的药物，为实施例3制备得到的纳米抗体序列（如SEQ ID NO:1所示的序列）与假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq11（如SEQ ID NO:12所示的序列）通过linker（GGGS）2融合表达得到的药物，具体制备方法同实施例4的区别仅在于，将假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq9替换为假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq11。
假单孢杆菌外毒素(PE38)序列Seq11:
ASGGPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPKDEL（SEQ IDNO:12）。
试验例
本试验例测试了实施例4-6制备得到的抗多发性骨髓瘤的药物对高表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞系U266的杀伤作用。
本发明采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖和细胞毒性。工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan），其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，对同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。
具体试验步骤如下：
1.种板：在96孔板中种U266细胞（购自上海酶研生物科技有限公司）10000个/孔，每组设置4个复孔，同时设置空白组。然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养18h（12-24 h）均可。
2.加药：吸出各孔培养基，实验组加入含不同浓度（浓度分别为20000ng/mL、10000ng/mL、5000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL、312.5ng/mL、156.25ng/mL、78.125ng/mL、39.0625ng/mL、19.53125ng/mL、9.765625ng/mL）药物（分别为实施例4-6制备得到的抗多发性骨髓瘤的药物组）的培养基，空白组加入不含药物培养基，阴性对照组将U266细胞替换为jarket细胞系，假单孢杆菌外毒素对照组加入浓度分别为9000ng/mL、2500ng/mL、1250ng/mL、625ng/mL、312.5ng/mL、156.25ng/mL、78.125ng/mL、39.0625ng/mL、19.53125ng/mL、9.765625ng/mL的假单孢杆菌外毒素(PE38)蛋白Seq9、Seq10、Seq11；然后将96孔板在37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中孵育24h。
3.加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10μL的CCK-8溶液。将加完CCK-8的培养板放入37°C 5%CO2培养箱中孵育4h，将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。
4.结果分析：
细胞存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值（空白组）各重复孔的OD值取平均数±SD。按照cck8说明书上的细胞活率计算公式计算试验中细胞活率。
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%。
As：实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)；
Ac：对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab：空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。
检测结果如图9所示，从图中可以看出，本发明制备得到的纳米抗体序列分别与假单孢杆菌外毒素(PE38)序列seq9、seq10、seq11通过linker（GGGS）2融合表达的抗肿瘤药物分子对多发性骨髓瘤细胞系U266具有明显杀伤细胞作用，也具有明显的特异性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体或其抗原结合片段：包含重链可变区，其包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含：
a1）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
a2）与SEQ ID NO:2至少80%以上的同源性且与SEQ ID NO:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
3.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段和假单孢杆菌外毒素蛋白；和/或，任选的协助表达和/或纯化的标签序列；所述标签序列选自下组中的至少一种：His标签、GGGS序列、FLAG标签。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段；所述核酸分子的序列包含：
b1)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
b2)与SEQ ID NO:1具有至少80%以上的同源性，且与SEQ ID NO:1所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。
5.与权利要求4所述的核酸分子相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含c1)～c7)中至少一种：
c1)包含权利要求4所述的核酸分子的表达盒；
c2)包含权利要求4所述的核酸分子的载体；
c3)包含c1)所述表达盒的载体；
c4)包含权利要求4所述的核酸分子的转基因细胞系；
c5)包含c1)所述表达盒的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述载体的转基因细胞系；
c7)包含c3)所述载体的转基因细胞系。
6.一种偶联物，包含：权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段和权利要求3所述的重组蛋白中的至少一种；以及偶联部分，所述偶联部分包含药物、毒素、电子致密标记、生物素、自旋标记、放射性同位素、酶、金纳米颗粒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种。
7.（1）~（5）中至少一种在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用；
（1）权利要求1或2所述的抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段；
（2）权利要求3所述的重组蛋白；
（3）权利要求4所述的核酸分子；
（4）权利要求5所述的生物材料；
（5）权利要求6所述的偶联物。
8.（1）~（5）中至少一种在制备检测多发性骨髓瘤的产品中的应用；
（1）权利要求1或2所述的抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段；
（2）权利要求3所述的重组蛋白；
（3）权利要求4所述的核酸分子；
（4）权利要求5所述的生物材料；
（5）权利要求6所述的偶联物；
所述产品为试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
9.一种产品，其特征在于，所述产品包含f1)～f3)中至少一种：
f1)权利要求1或2所述的抗BCMA的纳米抗体或其抗原结合片段；
f2)权利要求3所述的重组蛋白；
f3)权利要求6所述的偶联物；
所述产品为药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
10.一种权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：通过权利要求5中的转基因细胞系表达得到。
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