CN115850462A - 可识别和中和MERS-CoV的多肽NbM14及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可识别和中和MERS‑CoV的多肽NbM14，包括3个互补决定区CDR1‑3，序列如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明针对MERS‑CoV进行纳米抗体药物开发，通过制备MERS‑CoV S蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合MERS‑CoV的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH‑huFc1；同时利用假病毒中和实验评估NbM14在治疗MERS‑CoV感染的疗效，为MERS‑CoV感染的防治提供了潜在的检测剂和治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合MERS-CoV的多肽，还涉及所述多肽在制备MERS-CoV感染的治疗药物和诊断剂中的应用。
背景技术
中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome,MERS)首先发现于2012年6月一名死亡的60岁沙特阿拉伯男性患者。该病的潜伏期为2至14天，典型表现为急性呼吸道感染，起病急，高热(39-40℃)，可伴有畏寒、寒战、咳嗽、胸痛、头痛、全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等症状。目前尚无可用的疫苗和特异性治疗方法。虽然该病最初发生在中东地区，但随着贸易、旅游等的活动的开展，逐渐蔓延到欧洲、非洲、亚洲和北美洲等27个国家。因此，针对MERS的病原体开发安全有效的中和抗体在该疫情的防控中有重要的公共卫生意义。
引起MERS的病原体是MERS-CoV，属于β冠状病毒属(β-CoV)，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。MERS-CoV的单链RNA基因组的大小约30kb,共有10个开放阅读框(ORF)，编码16种非结构蛋白(nsp1-16)和四种结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。这四种结构蛋白组成球形、似王冠样病毒颗粒，其中S和N具有很强的免疫原性。S蛋白为三聚体状态的Ⅰ型跨膜糖蛋白，位于病毒膜表面，介导病毒附着宿主细胞及病毒-细胞膜的融合，是细胞靶向性和发病机制的主要决定因子。S蛋白能够诱导机体产生中和抗体，该抗体在预防MERS-CoV感染中发挥关键作用。因此，以S蛋白免疫动物，并从中筛选有中和活性的抗体将是治疗MERS-CoV感染的有效策略之一。
1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
发明内容
本发明通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗，用于检测和治疗MERS-CoV感染。基于这些研究，本发明提供了一种可结合MERS-CoV的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，序列如SEQ ID NO:1-3所示。
在一个具体实施方案中，所述多肽为纳米抗体。
在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:4-7所示(羊驼源)，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD4的纳米抗体。
在一个具体实施方案中，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
本发明还提供了上述多肽在制备MERS-CoV的检测剂或MERS-CoV的S蛋白的检测剂中的应用。
本发明还提供了上述多肽在制备MERS-CoV治疗药物中的应用。
本发明还提供了编码上述多肽的核酸。
本发明还提供了上述核酸在制备MERS-CoV治疗药物中的应用。
本发明针对MERS-CoV进行纳米抗体药物开发，通过制备MERS-CoV S蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合MERS-CoV的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1；同时利用假病毒中和实验评估NbM14在治疗MERS-CoV感染的疗效，为MERS-CoV感染的防治提供了潜在的检测剂和治疗药物。
附图说明
图1为MERS-CoV-S蛋白第4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线。
图2为不同稀释度的第4次免疫骆驼一周后的抗血清抑制MERS-CoV假病毒体外感染ghost细胞的曲线，以免疫前的血清为对照。
图3为MERS-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对MERS-CoV-S蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第一轮(1st)第二轮(2nd)和第三轮(3rd)淘选后的噬菌体抗体文库各挑选24,24个和40个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图。
图4为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对S蛋白的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性。
图5为NbM14抗体的SPR检测统计图。
图6为ELISA检测不同纯化浓度的NbM14抗体与MERS-S蛋白结合的OD450统计图。
图7为NbM14抗体中和MERS-CoV假病毒感染实验曲线图。
具体实施方式
1.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg MERS-S蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用MERS-S蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的MERS-S-his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前骆驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，4免的抗血清效价分别为3.28×106。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对MERS-S蛋白的高滴度抗血清。
为了进一步验证该高滴度的骆驼抗血清是否能有效阻止MERS-CoV病毒感染，进行病毒感染的中和实验。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与MERS-CoV假病毒共同孵育60min，随后转移到vero细胞，48h后通过Glo Max化学发光酶标仪(Promega)检测病毒载量并计算中和效果。中和实验结果显示，MERS-S蛋白诱导的抗血清抑制90％MERS-CoV感染的ID90为1000倍稀释度以上(图2)。综上所述，MERS-S蛋白诱导了高滴度抗血清，同时该抗血清具有高效抑制MERS-CoV假病毒感染的能力。
2.VHH噬菌体库构建及淘选
收集200ml免疫后骆驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得骆驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将骆驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。
为了进一步鉴定MERS-CoV-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫MERS-S蛋白骆驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为450bp，大小符合预期，说明该MERS-CoV-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选25个克隆进行测序，21个克隆有目的片段插入，插入率约为84％。测序结果显示，这21个克隆没有完全一致的重复序列，文库多样性为100％。比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个CD4-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.37×109。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的MERS-S-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与CD4蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体pcDNA3.1，转染293tt细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与MERS-S蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的CD4-VHH噬菌体文库与CD4蛋白的结合读值为0.78，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为0.97、2.59、3.34(图3A)。为了进一步验证富集后的文库中结合MERS-CoV-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第1、2和3轮富集后的文库里各挑选了24、24和40个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，50％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里75％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且Target/Blank比值均＞5(图3B)，通过MERS-S蛋白淘选成功的富集了高结合力的MERS-CoV-VHH噬菌体文库。
3.VHH原核表达文库的构建及VHH表达
对上述二轮和三轮淘选富集后的2nd-MERS-CoV-VHH和3rd-MERS-CoV-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落182个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与S蛋白进行ELISA结合检测。
结果显示，有49个细菌上清与S蛋白结合，同时不与空白对照结合，S蛋白结合的读值/空白对照的读值大于5.0(图4)。其中,筛选出抗体NbM14,CDR1-3的序列如SEQ ID NO:1-3所示,FR1-4的序列如SEQ ID NO:4-7所示。
4.VHH-huFc真核表达
通过分子克隆技术，将NbM14基因融合人的Fc基因并插入在pCDNA3.4真核表达载体，构建形成NbM14-huFc-pCDNA3.4表达质粒。将构建好的NbM14-huFc-pCDNA3.4，转染293tt细胞，表达生产NbM14-huFc(4NB)。收集细胞上清进行ELISA测定。
对抗体NbM14与MERS-S蛋白的亲和力测定试验。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力。将抗体固化至Anti-human IgG Fc Capture Biosensors(AHC)探头上，固化时间400s,再结合抗原CD4-his蛋白，结合时间180s,解离时间180s，观察抗体-抗原的结合解离情况，由仪器拟合曲线，导出数据。亲和力测定结果如表1所示，大部分的抗体的亲和力能达到10-12(picomole级)，结合解离曲线如图5所示。由此可见，我们获得了具有高亲和力抗体。
表1 4NB334亲和力数据
| Clone ID | Ka(1/MS) | Kd(1/S) | KD(M) | Response(nm) |
| NbM14 | 9.34E+05 | ＜1E-07 | ＜1E-12 | 0.211 |
5.抗体梯度稀释ELISA
用0.5μg/ml的MERS-S蛋白包被检测板，每孔100μl，37℃孵育2h，洗涤2-4次，4％牛血清封闭，每孔250μl，37℃孵育1h，洗涤2-4次，每孔加入梯度稀释的纯化抗体100μl，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的anti-human抗体100μl，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD450nm。结果如图6所示，当抗体NbM14浓度低至0.00164μg/ml，其与MERS-S蛋白结合的OD450/空白对照的OD450，比值仍大于2。
5.NbM14中和MERS-CoV假病毒
通过将表达萤火虫荧光素酶(pNL43R-E-luciferase)和pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体共转染到293T细胞(ATCC)中，生成了MERS-CoV假病毒。48h后收集病毒上清。病毒滴度通过相对光单位的荧光素酶活性测定(Bright-Glo荧光素酶检测载体系统，PromegaBiosciences)。对照单克隆抗体为抗SFTSV抗体SNB02(1mg/ml),对NbM14进行体外中和实验。将抗体梯度稀释为不同的浓度，与MERS-CoV假病毒一起，于5％CO2 37℃下共孵育1个小时，添加1x104个vero细胞，5％CO2 37℃温箱培养48小时后，通过检测荧光素酶活性测定评估单克隆抗体的半最大抑制浓度(IC50)
结果如图7所示，NbM14具有很好的中和活性，当抗体浓度在0.0407μg/ml时，抑制率能达到90％。
由以上实验结果可知，本发明的抗体NbM14及其人源化形式均可对特异性地识别、结合MERS-CoV及其S蛋白，并且可中和MERS-CoV，阻断其感染，从而用来治疗MERS。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可结合MERS-CoV的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，序列如SEQID NO:1-3所示。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为纳米抗体。
3.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
5.权利要求1-4中任一项所述的多肽在制备MERS-CoV的检测剂或MERS-CoV的S蛋白的检测剂中的应用。
6.权利要求1-4中任一项所述的多肽在制备MERS-CoV感染的治疗药物中的应用。
7.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-4中任一项所述的多肽。
8.权利要求6所述的核酸在制备MERS-CoV感染的治疗药物中的应用。
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