WO2021110181A2 - 可结合cd47的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可结合人CD47蛋白的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14-24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25-34所示序列之一。本发明针对CD47这一肿瘤免疫治疗靶点，通过制备CD47蛋白，免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD47的纳米抗体VHH，并构建了人源化抗体；同时利用流式细胞术检测方法鉴定人源化抗体与细胞表面CD47蛋白的结合。本发明为多种癌症的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。

Description

可结合CD47的多肽及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合CD47的多肽及其应用。
背景技术
CD47广泛表达于不同组织细胞表面，是免疫球蛋白超家族成员。CD47蛋白通过与巨噬细胞上的配体信号调节蛋白α(SIRPα)发结合，可发出“别吃我”信号。肿瘤细胞可通过多种途径逃避机体免疫系统的识别和清除,其中即包括过表达细胞表面蛋白CD47。研究表明，使用抗体阻断CD47-SIRPα通路可促使肿瘤细胞被吞噬，靶向CD47是一个极具潜力的抗肿瘤方向，可用于治疗实体瘤和淋巴瘤患者。
1993年，一种来源于羊驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。此外随着细胞治疗领域的快速发展，纳米抗体也广泛应用于细胞治疗领域的抗体筛选。
治疗性抗体药物发展的趋势从鼠源、人鼠嵌合、人源化再到全人源，再到近年得到广泛关注的纳米抗体，纳米抗体的研发得到高速发展。2018年9月首个纳米抗体药物获批。目前国内外有多个纳米抗体药物在临床研究阶段。我们期望通过免疫羊驼，获得高亲和力的靶向CD47的治疗性纳米抗体。
发明内容
本发明通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于实体瘤及淋巴瘤的治疗。基于这些研究，本发明提供了一种可结合CD47的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14-24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25-34所示序列之一。
在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:35-38所示，但本发明的范围不限于此，也可将框架区FR1-4序列人源化为如SEQ ID NO:39-42所示。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或羊驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合人CD47的多肽或结构域。
在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。
在一个优选实施方案中，所述多肽为羊驼源的VHH或人源化的VHH。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为SEQ ID NO:43,其中，第4位的X表示异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸或苏氨酸，并且第8位的X表示苏氨酸或异亮氨酸；并且
II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:1-4，并且CDR3的序列选自SEQ ID NO:25-27。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:1，CDR2的序列为SEQ ID NO:14并且CDR3的序列为SEQ ID NO:25；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:2，CDR2的序列为SEQ ID NO:15并且CDR3的序列为SEQ ID NO:25；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:16并且CDR3的序列为SEQ ID NO:25；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:16并且CDR3的序列为SEQ ID NO:26；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:4，CDR2的序列为SEQ ID NO:17并且CDR3的序列为SEQ ID NO:27。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为SEQ ID NO:44，其中第6位的X为精氨酸或苏氨酸；并且
II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:5-8；并且CD3的序列选自SEQ ID NO:28-30。
优选地，所述多肽的CDR序列如下：
CDR1的序列为SEQ ID NO:5，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQ ID NO:28；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:5，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQ ID NO:29；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQ ID NO:28；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQ ID NO:28；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:19并且CDR3的序列为SEQ ID NO:30。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR3的序列为SEQ ID NO:31；并且
II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:9和10；并且CD2的序列选自SEQ ID NO:20和21。
优选地，所述多肽的CDR序列如下：
CDR1的序列为SEQ ID NO:9，CDR2的序列为SEQ ID NO:20并且CDR3的序列为SEQ ID NO:31；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:10，CDR2的序列为SEQ ID NO:21并且CDR3的序列为SEQ  ID NO:31。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
CDR1的序列为SEQ ID NO:11，CDR2的序列为SEQ ID NO:22并且CDR3的序列为SEQ ID NO:32；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:12，CDR2的序列为SEQ ID NO:23并且CDR3的序列为SEQ ID NO:33；
CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQ ID NO:34。
本发明还提供了上述多肽在肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述多肽的核酸编码序列。
在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
在一个具体实施方案中，所述核酸编码序列存在于基因表达框中。
本发明针对实体瘤和淋巴瘤进行纳米抗体药物开发，通过制备人CD47蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合人CD47的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1(C47NB)；同时利用流式细胞术评估人源化抗体与细胞表面CD47蛋白的结合。本发明为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。
附图说明
图1为CD47第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
图2为CD47第4次免疫一周后的血清与多发性骨髓瘤细胞8226细胞表面CD47蛋白结合的流式结果图。其中，横坐标表示血清中抗体结合细胞表面CD47蛋白，纵坐标为市售直标抗体结合细胞表面CD47蛋白。
图3为CD47-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图4为CD47-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD47蛋 白淘选后ELISA检测统计图；B为第二轮(2 nd)和第三轮(3 rd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选40个和46个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
图5为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对人CD47的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性；
图6和7为本发明制备的19个VHH抗体与PRMI8226细胞表面CD47结合的流式图。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们依据NCBI网站上人CD47蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对细胞表面CD47蛋白的特异性抗体的多肽CD47，在C端连接His-tag(CD47-his)或兔Fc(CD47-rFc)用于后续纯化及检测。
2.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg CD47-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对双峰羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用CD47-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的CD47-his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H 2SO 4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为1.09×10 6和3.28×10 6。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对人CD47蛋白的高滴度抗血清。
为了进一步验证该高滴度的羊驼抗血清是否能有效结合细胞表面CD47蛋白，进行流 式细胞检测。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞共同孵育60min，洗涤细胞后加入荧光二抗Alexa Fluor 488 Goat anti Alpaca IgG(H+L),4℃孵育30min后洗涤细胞，上机检测。流式细胞术结果显示，CD47免疫的羊驼抗血清可结合细胞表面CD47蛋白(图2)。综上所述，CD47蛋白诱导了高滴度抗血清，同时该抗血清具有结合细胞表面CD47蛋白的能力，可用于流式检测。
3.VHH噬菌体库构建及淘选
收集200ml免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将羊驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定CD47-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫CD47羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图3)，说明该CD47-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选33个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列多样性为93.9％；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个CD47-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.35×10 9，阳性率为100％，序列多样性(Diversity)为93.9％，有效插入率(In frame rate)大于95％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的CD47-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与CD47蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体phv13，转化SS320细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与CD47蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的CD47-VHH噬菌体文库与CD47蛋白的结合读值为0.33，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为0.49、1.73、3.34(图4A)。为了进一步验证富集后的文库中结合CD47-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2、3轮富集后的文库里分别挑选了40、46个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，42.5％的单个噬菌体克隆为阳 性，第3轮文库里89％的噬菌体克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图4B)，通过CD47蛋白淘选成功地富集了高结合力的CD47-VHH噬菌体文库。
4.VHH原核表达文库的构建及VHH表达
对上述二轮和三轮淘选富集后的2nd-CD47-VHH和3rd-cCD47-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落600个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与CD47蛋白进行ELISA结合检测。
结果显示，有细菌上清与CD47蛋白结合，同时不与空白对照结合，CD47结合的读值/空白对照的读值大于5.0(图5和表1)。将这些序列进行测序比对，剔除重复序列，最终获得52个的VHH抗体序列。进一步的实验证实，这52个VHH抗体中有19个抗体可与细胞表面CD47蛋白结合(SEQ ID NO:1-19)。
表1 19个VHH抗体与CD47蛋白的结合值及其序列
Figure PCTCN2021075043-appb-000001
5.流失细胞法检测VHH抗体与肿瘤细胞的结合
将VHH抗体与PRMI 8226细胞混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％PBSF洗涤两遍后，加入二抗Alexa Fluor 488 goat anti human IgG，4℃30min；以0.5％PBSF洗涤两遍后，上机检测。MOCK为PBS对照；neg组为阴性对照，即不含抗体的原核表达上清对照；positive为阳性对照，即可结合CD47膜蛋白的阳性抗体对照。结果如图6和7所示，流式检测显示，19个VHH抗体均可与PRMI8226细胞结合，其中，IAP-114、118、121、129、132、140和148的结合力较高。使用人源化的VHH抗体亦得到类似的结果。可见，上述VHH抗体具有靶向结合肿瘤细胞的能力，同时有可能通过阻断肿瘤细胞表面的CD47分子，促进巨噬细胞的吞噬作用，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此这19个VHH抗体均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。
因为19个VHH能够识别肿瘤细胞表面的CD47分子，因此19个VHH抗体序列也可以应用于CAR(Chimeric Antigen Receptor,抗原嵌合受体,由VHH序列融合第三代或者第四代CD28-4-1BB-CD3zeta分子序列构成)细胞治疗肿瘤的治疗。另外因为19个VHH能识别肿瘤细胞表面的CD47分子，因此VHH可以通过偶联药物用于ADC(Antibody-drug conjugate,抗体偶联药物)治疗或者偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等。
为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米新药。
6.使用AAV病毒载体装载的人源化VHH进行体内实验
腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS 里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。
使多发性骨髓瘤模型小鼠接受AAV-VVH(1x10 11gc/100μl)肌肉注射，以AAV-GFP为对照组。结果显示，AAV-VVH对多发性骨髓瘤有治疗作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种可结合CD47的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14-24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25-34所示序列之一。
  2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
  3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为单克隆抗体。
  4. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为VHH。
  5. 根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽为羊驼源的VHH或人源化的VHH。
  6. 权利要求1-5中任一项所述的多肽在检测细胞表面CD47中的应用。
  7. 权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备肿瘤治疗药物中的应用。
  8. 权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备CAT T细胞治疗剂中的应用。
  9. 权利要求1-5中任一项所述的多肽的核酸编码序列在基因治疗中的应用。
  10. 一种检测细胞表面的CD47的试剂，其特征在于，包含权利要求1-5中任一项所述的多肽。
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