CN114763379A - 新冠病毒s蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用SARS‑Cov‑2的S蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述SARS‑Cov‑2的S蛋白具有三聚体结构。本发明依靠骆驼科动物的免疫系统筛选、鉴定并制备特异性识别、结合新冠病毒S蛋白的抗体，所得到的抗体特异性强，可用于开展新冠病毒快速检测，有潜在临床诊断和治疗价值，且容易进行基因工程改造和人源化。本发明提供的抗体稳定性高，能避免常规抗体需要低温储存和运输的要求，有利于大规模普及应用，有利于降低生产成本、实现规模化生产。

Description

新冠病毒S蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及新冠病毒S蛋白的特异性抗体及其制备方法与 应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-Cov-2，以下简称新冠病毒)颗粒的包膜由Spike蛋白(以下简称S蛋白)、E蛋白和M蛋白构成，其中S蛋白是所有冠状病毒表面主要成分之一。新 冠病毒表面S蛋白全长1273个氨基酸，可分为S1和S2两部分，在病毒入侵细胞后，S蛋 白即被切割成S1亚基和S2亚基。S1主要包括NTD区域和RBD区域，其中RBD区域称为 受体结合区域，是S蛋白入侵宿主细胞必须的区域，但其氨基酸序列同源性与SARS、 MERS等其他冠状病毒超过70％。
在研究新冠病毒的过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，对于患者诊断、病毒分析与研究等都具有重大的价值和意义。抗体是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系 统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等外来物的蛋白质，该外来物被称为抗原。 抗体和抗原的结合完全依靠非共价键的相互作用，这种特异性的结合机制使得抗体可 以捕获外来微生物以及受感染的细胞，进一步诱导其他免疫机制对其进行攻击，或直 接中和其目标。抗体及抗体相关产品已经被广泛应用于生命科学与医学等研究领域， 基于抗原-抗体特异性结合而衍生的诸多实验技术奠定了科学研究与临床治疗的重要 基础，例如免疫诊断、免疫印迹、酶联免疫吸附、流式细胞分析等等。
根据近期的文献报道，世界上多个研究机构均已经开发出特异性识别并结合新冠病毒表面Spike蛋白的单克隆抗体，他们的主要技术方案是：(1)制备新冠病毒抗 原，例如灭活的新冠病毒颗粒、分离提取的新冠病毒不同成分、重组表达纯化新冠病 毒抗原蛋白质等；(2)将抗原注射至鼠、兔、猴等动物体内，依靠动物的免疫系统 产生抗体；(3)采集动物的血液并分离、提取出血清，再进一步分离出含有特异性 抗体的成分。
然而，上述基于鼠等动物的免疫系统产生S蛋白的抗体并分离提取的技术，有以下缺点：(1)抗体的特异性有限：Spike蛋白结构较大、空间折叠复杂，传统的鼠、 兔、猴等单克隆抗体难以识别Spike表面复杂的空间结构；尤为重要的是，大量生物 学研究表明，S蛋白以同源三聚体的形式存在于冠状病毒表面，若仅以S蛋白某一部 分片段(结构域)作为抗原，所得抗体的特异性是有限的；(2)抗体的应用价值有 限：绝大多数此类抗体仅能用于病毒检测，并无实际临床治疗价值；(3)抗体的稳 定性较差：上述鼠单抗，需要在低温(4摄氏度)下进行储藏、运输、测试与验证等 工作才能维持抗体的浓度、特异性等特征，不利于大规模应用于研究的开展；(4) 规模化批量生产成品高：上述鼠单抗是全长的免疫球蛋白，需要在哺乳动物细胞等成 本较为高昂的表达系统中进行重组表达后进行分离、纯化提起，操作复杂、成本昂贵， 不利于规模化批量生产。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，设计并实施有效、可行的抗体筛选与制备技术方案，获得能够特异性识别并结合新冠病毒表面S蛋白三聚体并且具有病毒中和效果的纳米 抗体。
本发明的上述目的通过以下具体方案实现。
第一方面，本发明提供用SARS-Cov-2的S蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述SARS-Cov-2的S蛋白具有三聚体结构。
在一些实施方案中，所述SARS-Cov-2的S蛋白是将编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸与编码T4噬菌体纤维蛋白结构域(T4 fibritin)的核苷酸串联后，构建重组表达载体，再进行表达、纯化所得。T4噬菌体纤维蛋白结构域具有促使融合蛋白形成三聚体的功 能。
在一些实施方案中，所述SARS-Cov-2的S蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：所述SARS-Cov-2的S蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：将编码SARS-Cov-2的S蛋白 的核苷酸与编码T4噬菌体纤维蛋白结构域的核苷酸串联，构建重组表达载体，形成S 蛋白三聚体重组表达质粒；将所得S蛋白三聚体重组表达质粒转染至感受态细胞，经过 筛选，培养，得到重组正确的病毒质粒；将所得病毒质粒转染至细胞，培养、收集病 毒；再将所得病毒侵染细胞，培养细胞并收集培养上清液；对所述上清液进行纯化， 得到具有三聚体结构的S蛋白。
在一些实施方案中，所述SARS-Cov-2的S蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述T4噬菌体纤维蛋白结构域具有如SEQ ID NO:3所示的氨基 酸序列。
在一些实施方案中，所述重组表达载体为pFASTBAC昆虫表达载体。
在一些实施方案中，所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞。
在一些实施方案中，病毒质粒为杆状病毒质粒，所述病毒为杆状病毒。
在一些实施方案中，病毒质粒转染的细胞为SF9昆虫细胞系。
在一些实施方案中，病毒侵染的细胞为High Five昆虫细胞系。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼 和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述SARS-Cov-2的S蛋白结合的kd值在100pM以下，优选在50pM以下，更优选在30pM以下。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与SARS-Cov-2病毒中和的EC50值在10μg/ml以下，优选在3μg/ml以下，更优选在1μg/ml以下。
第二方面，本发明提供一种构建抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将具有三聚体结构的SARS-Cov-2的S蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；
(2)提取所述淋巴细胞的总mRNA，反转录为cDNA并进行扩增；
(3)将所述扩增得到的DNA插入病毒表达载体，转化入细菌，收集菌落，得抗体 文库。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼 和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，步骤(1)所述免疫采用皮下注射方式。所述免疫的次数优选为3～5次。所述静脉外周血优选在最后一次免疫之前和之后分别采集。
在一些实施方案中，步骤(3)所述病毒表达载体为噬菌体表达载体。
在一些实施方案中，步骤(3)所述细菌为大肠杆菌。
第三方面，本发明提供上述构建抗体文库的方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体。
第四方面，本发明提供一种构建抗原特异性抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，所述构建抗原特异性抗体文库的方法包括如下步骤：
(i)对所述抗体文库进行培养，加入辅助噬菌体后，继续培养、提取噬菌体；
(ii)将所述噬菌体与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(iii)用所述与抗原特异性结合的噬菌体侵染细菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，步骤(iii)所述细菌为大肠杆菌。
第五方面，本发明提供上述构建抗原特异性抗体文库的方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体。
第六方面，本发明提供一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合 的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法包括如下步骤：
(a)对所述抗体文库进行培养，加入辅助噬菌体后，继续培养、提取噬菌体；
(b)将所述噬菌体与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(c)用所述噬菌体与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落。
在一些实施方案中，步骤(c)所述细菌为大肠杆菌。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，之后进行抗原特异性结合鉴定。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，然后进行步骤(d)：提 取DNA，转化至宿主细胞并表达，以获得纳米抗体。
第七方面，本发明提供采用上述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第八方面，本发明提供特异性识别和/或结合SARS-Cov-2的S蛋白的抗原结合蛋白、 抗体或抗体活性片段；所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示的CDR1；
如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14 或SEQ ID NO:15所示的CDR2；和
如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20 或SEQ ID NO:21所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ IDNO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:16所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ IDNO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:17所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:6所示的CDR1、如SEQ IDNO:12所示的CDR2和如SEQ ID NO:18所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ IDNO:13所示的CDR2和如SEQ ID NO:19所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:8所示的CDR1、如SEQ IDNO:14所示的CDR2和如SEQ ID NO:20所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ IDNO:15所示的CDR2和如SEQ ID NO:21所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获 得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。对于纳米抗体而言，重链可变区对应的氨基酸序列即为纳米抗体的全长氨基酸序 列，具体如SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:27所示。
第九方面，本发明提供编码SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:21任意一条氨基酸序列、SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:27任意一条氨基酸序列或上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活 性片段的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。
第十方面，本发明提供含有上文所述核苷酸序列的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体。
在一些实施方案中，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白pIII的核苷酸序列。
第十一方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的病毒。
在一些实施方案中，所述病毒为噬菌体。
第十二方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的宿主细胞，或者被上文所述病毒侵染的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
第十三方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法。
第十四方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十五方面，本发明提供所述上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经人源化后获得的人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十六方面，本发明提供一种蛋白偶联物，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段以及配体。
在一些实施方案中，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
第十七方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述 蛋白偶联物。
在一些实施方案中，所述药物组合物中还含有其它活性成分和/或辅料。
第十八方面，本发明提供嵌合抗原受体，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十九方面，本发明提供表达上文所述嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。
第二十方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述抗体文库或多克隆抗体、上文所述抗原特异性抗体文库或与抗原特异性结合的多克 隆抗体、上文所述核苷酸序列、上文所述表达载体、上文所述病毒、上文所述宿主细 胞、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物、上 文所述药物组合物、上文所述嵌合抗原受体或者上文所述嵌合抗原受体T细胞在制备预 防SARS-Cov-2感染和/或治疗由SARS-Cov-2感染引起疾病的药物中的应用。
第二十一方面，本发明提供体外检测SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白的试剂盒，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋 白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记。优选地，所述标记物选自酶、化学发光基团和同位素基团。
第二十二方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述 试剂盒在体外检测SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白中的应用。
第二十三方面，本发明提供利用上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文 所述试剂盒检测样品中SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白的方法。
第二十四方面，本发明提供检测SARS-Cov-2感染的造影剂，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性 片段。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下显著优势：本发明提供的抗体kd值可达数皮摩，亲和力高，且特异性识别并结合新冠病毒S蛋白三聚体，特异性 强，将有利于确诊病患和对症实施治疗措施；本发明提供的抗体能够有效中和新冠病 毒，具有较大的临床治疗用途；本发明提供的抗体稳定性高，耐酸碱pH，耐高温， 能避免常规抗体需要低温储存和运输的要求，有利于大规模普及应用；本发明提供的 抗体在成本低廉的大肠杆菌表达系统就可以很好的重组表达，量产成本低、产量可以 高达数十毫克/升大肠杆菌，而大肠杆菌重组表达系统技术成熟，质量控制简单，有 利于降低生产成本、实现规模化生产。
附图说明
图1为Superose 6 increase 10/300GL凝胶过滤层析柱的标准曲线；该曲线中，样品1 为IgM(Mr约为970000)，样品2为甲状腺球蛋白(Mr为669000)，样品3为铁蛋白(Mr为440000)，样品4为牛血清白蛋白(Mr为66000)，样品5为肌红蛋白(Mr为17000)， 样品6为维生素B12(Mr为1355)；
图2为实施例1所得样品经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线；
图3为单抗5E10与抗原亲和力检测结果示意图；
图4为单抗5F11与抗原亲和力检测结果示意图；
图5为单抗6F1与抗原亲和力检测结果示意图；
图6为单抗8B4与抗原亲和力检测结果示意图；
图7为单抗8F10与抗原亲和力检测结果示意图；
图8为单抗8B5与抗原亲和力检测结果示意图；
图9为单抗5E10对新冠病毒中和效果示意图；
图10为单抗5F11对新冠病毒中和效果示意图；
图11为单抗6F1对新冠病毒中和效果示意图；
图12为单抗8B4对新冠病毒中和效果示意图；
图13为单抗8F10对新冠病毒中和效果示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
定义
SARS-Cov-2：国际病毒分类委员会对新型冠状病毒(简称新冠病毒)的命名。
S蛋白：棘突糖蛋白(Spike蛋白，简称S蛋白)是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白， 有着大量糖基化的修饰，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。它首先结合细胞表面的 受体，然后发生“变形”，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物 质注入细胞，达到感染细胞的目的。Spike蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有 两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。S2 含有膜融合过程所需的基本元件。Spike蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合 功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。
kd值：解离常数(dissociation constant，kd)是一种特定类型的平衡常数，用于衡 量一较大物体与另一较小组分分开(解离)的倾向，是缔合常数的倒数，单位为mol/L(M)、nmol/L(nM)或pmol/L(pM)。kd值越小说明两个物质的结合能力越强。
EC50值：半数最大效应浓度(concentration for 50％ of maximal effect，EC50)是指 能引起50％最大效应的浓度。EC50是药物安全性指标。其含义是：引起50％个体有效的药物浓度。EC50值越小说明药物安全性越高。
纳米抗体：在骆驼科动物外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体 片段那样容易相互沾粘，甚至聚集成块；单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重 链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单 位；VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody， Nb)。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，骆驼科动物体内的 免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米 抗体。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下表1：
表1
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下表2：
表2
Figure BDA0003141119990000101
Figure BDA0003141119990000111
实施例1：抗原的制备
现有技术的常规做法是重组表达、纯化S蛋白的某一区域作为抗原。
本发明是针对近乎全长的新冠病毒S蛋白制备抗原，具体方法为：
(1)合成编码S蛋白的DNA序列(第1-1208位氨基酸)，将其与一段编码T4 fibritin区域的DNA序列串联、构建至pFASTBAC昆虫细胞重组表达载体，形成S蛋白三聚体重 组表达质粒；
该T4 fibritin区域的氨基酸序列能够诱发整条肽链自发地进行三聚化，进而折叠形 成S蛋白三聚体；
上述S蛋白的氨基酸序列、核苷酸序列以及T4 fibritin区域的氨基酸序列如表3所示；
表3
Figure BDA0003141119990000112
Figure BDA0003141119990000121
Figure BDA0003141119990000131
Figure BDA0003141119990000141
(2)将该S蛋白三聚体重组表达质粒转染至DH10Bac感受态细胞，经过蓝白斑筛 选后，培养、抽提得到重组正确的杆状病毒质粒(Bacmid)。
(3)将Bacmid使用脂质体转染至SF9昆虫细胞系，培养、收集得到第一代杆状病毒；重复培养得到第二代杆状病毒。
(4)使用第二代杆状病毒侵染High Five(BTI-TN-5B1-4)昆虫细胞系，培养细胞并收集细胞培养上清液，累计收集约1.2×1010个细胞的细胞培养上清液。
(5)真空抽滤：于0.22um一次性抽滤杯中抽滤全部细胞培养上清；抽滤完成后， 至于冰中，加入适量的蛋白酶抑制剂Cocktail。
(6)切向流浓缩：组装好蠕动泵和膜包(100kd)，注意整个流路的密闭性；泵 入400mL预先0.22um抽滤过的ddH2O，润洗膜包和管路；泵入50mL清洗缓冲液(100 mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,1mM EDTA)，平衡、润洗膜包和管路；泵入已真 空抽滤过的细胞培养上清，直到浓缩至约100mL停止，操作期间，细胞培养上清需至 于冰中；再泵入50mL洗脱缓冲液，冲刷出膜包内残留的浓缩细胞培养上清。
(7)吸取4mL新Strep-Tactin蛋白纯化磁珠，转移至层析住中，滤去上清后，用清洗缓冲液润洗；对于合并后的约150mL浓缩的细胞培养上清，采用重力法结合磁珠， 重复2-3次，使目标蛋白与磁珠充分结合；用清洗缓冲液进行充分清洗后，用洗脱缓冲 液(100mMTris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,1mM EDTA,50mM Biotin)洗脱目标蛋白， 每次2mL，洗5-8次(注：每次加入缓冲液后孵育5min，可增强洗脱效率)，收集洗脱 样品。使用100kd浓缩管，将样品浓缩至0.5mL或1mL。
(8)使用Superdex 200increase 10/300层析住，检测目标蛋白的分子量均一性，收 集目标蛋白的紫外吸收峰。
与Superose 6increase 10/300GL凝胶过滤层析柱的标准曲线 (https://cdn.cytivalifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx？mediaformatid＝10061 &destinationid＝10016&assetid＝17336，如图1所示)对比可知，本实施例所得样品采用同品牌、同型号、同规格凝胶过滤层析柱以及同样的洗脱条件所获得的洗脱曲线(如 图2所示)对应的相对分子质量约450kd，约为3倍单体的大小，可以认为该样品是S蛋 白三聚体。
实施例2：羊驼免疫注射
本实施例将实施例1制备得到的抗原免疫羊驼。具体步骤如下：
(1)将实施例1中制备好的抗原平均分装成4份，每份约1mg；
(2)累计对羊驼进行4次免疫，将抗原经皮下注射至动物体内，记第一次免疫为 第一天，后续的免疫分别于第10天、第19天、第28天；其中，第28天，于第四次免疫 注射前，采集约200mL羊驼静脉外周血液，且第42天，即第四次免疫之后14天，采集 约300mL羊驼静脉外周血液。
相比于传统鼠、兔等动物抗体的免疫技术方案，本实施例提供的方法采集大量的羊驼静脉外周血液，有利于后续筛选得到高度多样性的纳米抗体。
实施例3：抗体文库的构建
以实施例2中采集的两批次羊驼静脉外周血液为原料，构建高多样性的纳米抗体文 库。两批次羊驼静脉外周血液的处理方法相同，具体为：
(1)使用密度梯度离心法，从羊驼静脉外周血液中分离得到淋巴细胞；
(2)提取淋巴细胞的总mRNA，并反转录为cDNA；
(3)使用适当的DNA引物，以上述cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩 增得到羊驼免疫球蛋白IgG2和IgG3的VHH片段，即纳米抗体的DNA片段；
(4)将VHH的DNA连接至噬菌体表面展示筛选载体，构成VHH-pIII融合蛋白表达 载体质粒库；其中，pIII是存在于噬菌体表面鞭毛上的蛋白质；
(5)将DNA连接产物经电转化方法，转化至TG1感受态细菌，适当培养后收集全 部菌落，即为羊驼的纳米抗体文库。
相比于传统的从鼠、兔等动物血清或淋巴细胞中分离得到抗体的方法，本实施例能够获得并长期保存持有羊驼的全部纳米抗体片段(即文库)，能够持续地支撑后续 不断地进行纳米抗体的筛选与开发。
实施例4：噬菌体表面展示筛选特异性纳米抗体
本实施例以实施例3得到的纳米抗体文库为来源，经噬菌体表面展示筛选得到抗原 特异性的纳米抗体。具体步骤如下：
(1)取适量冻存的实施例3获得的纳米抗体文库，接种至细菌培养基，经适当培 养后加入适量的辅助噬菌体，继续于适量条件下培养；
(2)以PEG-NaC法提取细菌培养上清中扩增的噬菌体；
(3)将实施例1获得的S蛋白三聚体抗原固定于免疫试管(Maxisorp免疫试管，ThermoFisher Scientific)，将噬菌体与抗原孵育；
(4)淘洗：弃去噬菌体，再用PBS缓冲液润洗抗原适当次数，淘洗、除去与抗原 非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(5)洗脱：采用酸性甘氨酸溶液处理与抗原特异性结合的噬菌体，使噬菌体与抗原解离并保留。
至此，即得到了表达有特异性纳米抗体的噬菌体。
实施例5：抗原特异性抗体文库的构建
本实施例利用实施例4所得的噬菌体构建抗原特异性纳米抗体文库。具体步骤为：
(1)将所述表达有特异性纳米抗体的噬菌体侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体；
(2)待噬菌体侵染完全后，特异性的纳米抗体即以DNA质粒的形式存在于大肠杆菌中，收集这些全部的大肠杆菌，即成为抗原特异性的纳米抗体文库。
本实施例所得的文库可以作为原料返回实施例4进行噬菌体表面展示筛选。
实施例6：单克隆抗体菌落的获得
本实施例利用实施例4所得的噬菌体获得单克隆纳米抗体菌落。具体步骤为：
(1)将所述表达有特异性纳米抗体的噬菌体侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体；
(2)待噬菌体侵染完全后，将这些大肠杆菌均匀涂抹于细菌培养皿培养，即可得到含有纳米抗体DNA质粒的单克隆菌落。
实施例7：阳性单克隆抗体的鉴定
本实施例对实施例6获得的单克隆菌落进行鉴定。具体步骤如下：
(1)挑取6组所述单克隆菌落于微孔板进行培养；
(2)加入IPTG诱导VHH-pIII(即含有纳米抗体的融合蛋白质)表达；
(3)收集含有纳米抗体的细菌培养上清，与抗原孵育，S蛋白三聚体抗原预先固 定于96微孔板(Maxisorp透明微孔板，ThermoFisher Scientific)；
(4)采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法，检测单克隆纳米抗体是否与新冠病毒 S蛋白三聚体结合；
(5)对于可以与抗原结合的单克隆纳米抗体微生物菌落，再次适当培养后，提取DNA质粒并进行DNA测序获得纳米抗体核酸序列，翻译后即可得到纳米抗体的完整氨 基酸序列。
具体而言，6组单克隆抗体微生物菌落对应的氨基酸序列以及核苷酸序列具体如下 表4～表9所示：
表4：单抗5E10的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000171
表5：单抗5F11的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000172
Figure BDA0003141119990000181
表6：单抗6F1的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000182
表7：单抗8B4的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000183
表8：单抗8F10的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000184
Figure BDA0003141119990000191
表9：单抗8B5的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003141119990000192
实施例8：小批量抗体生产与制备
将实施例7所得能够特异性识别并结合抗原的单克隆纳米抗体的DNA质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，借助大肠杆菌表达系统小批量表达、纯化单克隆纳米抗体， 批产能约数毫克。
利用ELISA方法孵育不同浓度的纳米抗体，根据纳米抗体与细胞的结合能力测量纳 米抗体与抗原的亲和力大小，结果如图3～图8所示，亲和力数值kd的结果如下表10所示。
表10：亲和力测试结果
Figure BDA0003141119990000193
Figure BDA0003141119990000201
实施例9：纳米抗体新冠病毒中和实验
于P3实验室条件下培养、扩增新冠病毒，分别加入纯化的各组单克隆纳米抗体，检测对病毒的中和效果，结果如图9～图13所示，EC50值如下表11所示。
表11：新冠病毒中和结果
抗体 EC50
5E10 1.02
5F11 /
6F1 2.81
8B4 9.95
8F10 0.19
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显 而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发 明要求保护的范围。
序列表
<110> 生物岛实验室
华中科技大学
<120> 新冠病毒S蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1208
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly Ser Ala Ser Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
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Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
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Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
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Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
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Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
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Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
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Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
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Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1205
<210> 2
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<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
atgttcgtgt tcctcgtgct cctgcctctg gtgtctagcc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cggacccagc tccctcccgc ctacacaaac tctttcaccc ggggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc ggtctagcgt gctccactct acacaggacc tgttcctccc tttcttcagc 180
aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tctggcacaa acggcacaaa gcggttcgac 240
aaccccgtgc tccctttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gtctaacatt 300
atccggggct ggattttcgg caccacactc gactctaaga cacagtccct cctgattgtg 360
aacaacgcca caaacgtggt gattaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccctttc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agtctgagtt cagagtgtac 480
tctagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctcat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgaga gagttcgtgt tcaagaacat tgacggctac 600
ttcaagattt actctaagca caccccaatt aacctcgtga gggacctccc tcagggcttc 660
tccgccttag aaccactggt ggacctccct attggcatta acatcacacg cttccagaca 720
ctgctcgccc tccaccggtc ttacctgacc ccaggcgact ctagctctgg ctggacagcc 780
ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg cagcctagga ccttcctcct gaagtacaac 840
gagaacggca caattaccga cgccgtggac tgcgccctgg acccactgtc cgagacaaag 900
tgcacactga agtccttcac agtggagaag ggcatttacc agacatctaa cttccgggtg 960
cagcctacag agtctattgt gcggttccca aacatcacaa acctgtgccc tttcggcgag 1020
gtgttcaacg ccacccggtt cgcctctgtg tacgcctgga accggaagcg gatctctaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac tccgcctctt tctctacatt caagtgctac 1140
ggcgtgtccc ctacaaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactctttc 1200
gtgattagag gcgacgaggt gaggcagatt gcccccggcc agacaggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320
ctggactcta aggtgggcgg caactacaac tacctgtaca gactgttccg gaagtctaac 1380
ctgaagccat tcgagaggga cattagcacc gagatttacc aggccggctc taccccatgc 1440
aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggctt ccagcctaca 1500
aacggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg gtggtgctgt ctttcgagct gctccacgcc 1560
cccgccacag tgtgcggccc aaagaagagc acaaacctcg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctcac aggcacaggc gtgctcaccg agtctaacaa gaagttcctc 1680
cctttccagc agttcggccg cgacattgcc gacaccaccg acgccgtgcg ggaccctcag 1740
acactggaaa ttctcgacat caccccttgc agcttcggcg gcgtgtccgt gatcacccca 1800
ggcacaaaca catctaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860
ccagtggcca tccacgccga ccagctcacc ccaacatgga gggtgtacag cacaggctct 1920
aacgtgttcc agacccgggc cggctgcctc attggcgccg agcacgtgaa caactcttac 1980
gagtgcgaca tccctattgg cgccggcatt tgcgcctctt accagaccca gacaaactct 2040
ccaggcagcg ccagctctgt ggcctctcag agcattattg cctacaccat gtctctgggc 2100
gccgagaact ctgtggccta ctctaacaac tctattgcca tccctacaaa cttcacaatt 2160
tctgtgacca ccgagattct cccagtgtct atgaccaaga catctgtgga ctgcaccatg 2220
tacatttgcg gcgactccac cgagtgctct aacctcctgc tccagtacgg ctctttctgc 2280
acccagctca accgcgccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatttacaag acccccccaa ttaaggactt cggcggcttc 2400
aacttctctc agattctccc cgacccatcc aagcctagca agcggtcctt cattgaggac 2460
ctcctgttca acaaggtgac actggccgac gccggcttca ttaagcagta cggcgactgc 2520
ctgggcgaca ttgccgcccg ggacctgatt tgcgcccaga agttcaacgg cctcacagtg 2580
ctccccccac tgctcaccga cgagatgatt gcccagtaca catctgccct cctggccggc 2640
acaattacat ctggctggac cttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc gtgacacaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc attggcaaga ttcaggactc tctgagcagc 2820
acagccagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac 2880
acactggtga agcagctgtc ttctaacttc ggcgccattt ctagcgtgct gaacgacatt 2940
ctgtcgcggc tggacccacc cgaggccgag gtgcagattg acaggctcat cacaggcaga 3000
ctgcagtctc tgcagacata cgtgacccag cagctgatta gagccgccga gattagagcc 3060
tccgccaacc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tcggccagtc taagcgggtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctcatg tctttccctc agtccgcccc tcacggcgtg 3180
gtgttcctcc acgtgacata cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccccgcc 3240
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<211> 9
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1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Arg Ala Phe Asp Leu Leu Thr Met
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Arg Thr Phe Asp Leu Leu Thr Met
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Phe Pro Phe Asp Asp Tyr Ala Ile
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Phe Thr Leu Asn Tyr Tyr Ala Ile
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Glu Ile Gly Gly Val Thr Ile Ser Thr Asn
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<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Glu Ile Gly Gly Val Thr Leu Ser Thr Asn
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Ser Asp Asp Ser Thr Tyr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ser Ser Ala Asp Gly Arg Ala Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 14
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Asp Arg Gln Val Arg Ser Ser Trp Asn Glu Thr Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Tyr Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Val Pro Arg Thr Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Tyr Phe His Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Asp Leu Leu
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Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Val Asp Thr Ala Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asp Leu Leu
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Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Ile Arg Glu Ile Gly Gly Val Thr Leu Ser Thr Asn Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Val Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Val Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagattcac aagtgcgtag ttcctggaat gagactccct attggggcca ggggacccag 360
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<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggtgcagc tggtggagtc tggcggagga tcggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggccg caccttcgat ctgcttacca tgggctggtt ccggcaggct 120
ccggggaagg aacgtgagtt cgtagcggct attagggaga ttggtggtgt cacgttaagc 180
acaaattatg cagactccgt ggtgggccga ttcaccatct ccaaagtcaa cgccaagaac 240
acgctgtatc tgcaaatgga cagcctgaaa ccggaggaca cggccgttta ttactgcgca 300
gcagatcgac aagtgcgtag ttcctggaat gagactccct attggggcca ggggacccag 360
gtcactgtct cctca 375
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccgagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggacgttt atttctgtgc agccggatat 300
aatgggtata gtggtagtct ctactacacc ccaaaaccgt atgtattctg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc a 381
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttggat tattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagtagta gtgatgatag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acaacctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc gacaggacct 300
actacattct atagtggtcg tatctactac accggtctct gtgcttcggg ctacggcatg 360
cactactggg gcaaagggac ccaggtcact gtctcctca 399
<210> 32
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ccctttcgac gattatgcca tcggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attagtagtg ctgatgggcg cgcatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagtgaca actccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcagtcccc 300
cgtacatact acggtggtac ttactacttt cactgtcgcc ctgagtatga ctactggggc 360
caggggaccc aggtcactgt ctcctca 387
<210> 33
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttgaat tattatgcca taaactggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagtagta gtgatggtag cacatactat 180
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ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc gacagatgca 300
tttacgcagt gtgtacctgg gggggcggac atggacttct ggggcaaagg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372

Claims (30)

1.用SARS-Cov-2的S蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述SARS-Cov-2的S蛋白具有三聚体结构。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述SARS-Cov-2的S蛋白是将编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸与编码T4噬菌体纤维蛋白结构域的核苷酸串联后，构建重组表达载体，再进行表达、纯化所得；
优选地，所述SARS-Cov-2的S蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，和/或，编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，和/或，所述T4噬菌体纤维蛋白结构域具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，和/或，所述重组表达载体为pFASTBAC昆虫表达载体。
3.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼。
4.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段；
和/或，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述SARS-Cov-2的S蛋白结合的kd值在100pM以下，优选在50pM以下，更优选在30pM以下；
和/或，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与SARS-Cov-2病毒中和的EC50值在10μg/ml以下，优选在3μg/ml以下，更优选在1μg/ml以下。
6.一种构建抗体文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将具有三聚体结构的SARS-Cov-2的S蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；
(2)提取所述淋巴细胞的总mRNA，反转录为cDNA并进行扩增；
(3)将所述扩增得到的DNA插入病毒表达载体、优选为噬菌体表达载体，转化入细菌、优选为大肠杆菌，收集菌落，得抗体文库；
优选地，所述SARS-Cov-2的S蛋白是将编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸与编码T4噬菌体纤维蛋白结构域的核苷酸串联后，构建重组表达载体，再进行表达、纯化所得；
更优选地，所述SARS-Cov-2的S蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，和/或，编码SARS-Cov-2的S蛋白的核苷酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，和/或，所述T4噬菌体纤维蛋白结构域具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，和/或，所述重组表达载体为pFASTBAC昆虫表达载体。
7.权利要求6所述方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的抗体；所述抗体优选为纳米抗体。
8.一种构建抗原特异性抗体文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：对权利要求7所述抗体文库进行噬菌体表面展示筛选，获得抗原特异性抗体文库；
优选地，包括如下步骤：
(i)对所述抗体文库进行培养，加入辅助噬菌体后继续培养、提取噬菌体；
(ii)将所述噬菌体与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(iii)用所述与抗原特异性结合的噬菌体侵染细菌、优选为大肠杆菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。
9.权利要求8所述方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的抗体；所述抗体优选为纳米抗体。
10.一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：对权利要求7所述抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；
优选地，包括如下步骤：
(a)对所述抗体文库进行培养，加入辅助噬菌体后继续培养、提取噬菌体；
(b)将所述噬菌体与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(c)用所述与抗原特异性结合的噬菌体侵染细菌、优选为大肠杆菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落，可选择地对所述单一菌落进行抗原特异性结合鉴定；
更优选地，还包括：(d)提取所述单一菌落的DNA，转化至宿主细胞并表达。
11.权利要求10所述方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
12.特异性识别和/或结合SARS-Cov-2的S蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的CDR1；
如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:15所示的CDR2；和
如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQID NO:21所示的CDR3；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
13.特异性识别和/或结合SARS-Cov-2的S蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:16所示的CDR3；
或，如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:17所示的CDR3；
或，如SEQ ID NO:6所示的CDR1、如SEQ ID NO:12所示的CDR2和如SEQ ID NO:18所示的CDR3；
或，如SEQ ID NO:7所示的CDR1、如SEQ ID NO:13所示的CDR2和如SEQ ID NO:19所示的CDR3；
或，如SEQ ID NO:8所示的CDR1、如SEQ ID NO:14所示的CDR2和如SEQ ID NO:20所示的CDR3；
或，如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:15所示的CDR2和如SEQ ID NO:21所示的CDR3；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
14.特异性识别和/或结合SARS-Cov-2的S蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段，其特征在于，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
或，如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
或，如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
或，如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
或，如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
或，如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
15.编码SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:21中任意一条氨基酸序列、SEQ ID NO:22～SEQ IDNO:27中任意一条氨基酸序列或权利要求1～5或11～14任意一项所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列；
优选地，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列选自如下序列：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
16.含有权利要求15所述核苷酸序列的表达载体；
优选地，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体；
更优选地，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白pIII的核苷酸序列。
17.外源转入了权利要求16所述表达载体的病毒；所述病毒优选为噬菌体。
18.外源转入了权利要求8所述表达载体或被权利要求9所述病毒侵染的宿主细胞，优选为大肠杆菌。
19.利用所述权利要求18所述宿主细胞表达抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法。
20.利用权利要求18所述所述宿主细胞表达获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
21.权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经人源化后获得的人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
22.蛋白偶联物，其特征在于，包含权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段和配体；
优选地，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
23.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或权利要求22所述蛋白偶联物；
优选地，所述药物组合物中还含有其它活性成分和/或辅料。
24.嵌合抗原受体，其特征在于，包含权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
25.表达权利要求24所述的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。
26.权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求7所述抗体文库或多克隆抗体、权利要求9所述抗原特异性抗体文库或与抗原特异性结合的多克隆抗体、权利要求15所述核苷酸序列、权利要求16所述表达载体、权利要求17所述病毒、权利要求18所述宿主细胞、权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求22所述蛋白偶联物、权利要求23所述药物组合物、权利要求24所述嵌合抗原受体或权利要求25所述嵌合抗原受体T细胞在制备预防SARS-Cov-2感染和/或治疗由SARS-Cov-2感染引起疾病的药物中的应用。
27.体外检测SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记；
更优选地，所述标记物选自酶、化学发光基团和同位素基团。
28.权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求22所述蛋白偶联物或权利要求27所述试剂盒在体外检测SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白中的应用。
29.利用权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、权利要求22所述蛋白偶联物或权利要求27所述试剂盒检测样品中SARS-Cov-2或SARS-Cov-2的S蛋白的方法。
30.检测SARS-Cov-2感染的造影剂，其特征在于，包含权利要求1～5、11～14或20所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或权利要求21所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112010964A (zh) * 2020-09-02 2020-12-01 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种新冠病毒羊驼抗体及其制备方法和应用
CN112358533A (zh) * 2020-10-30 2021-02-12 上海泽润生物科技有限公司 重组刺突蛋白及其制备方法和用途
CN112480217A (zh) * 2020-11-30 2021-03-12 广州市锐博生物科技有限公司 基于SARS-CoV-2的S抗原蛋白的疫苗和组合物
CN112724248A (zh) * 2021-01-28 2021-04-30 南京拓峰生物科技有限公司 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112010964A (zh) * 2020-09-02 2020-12-01 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种新冠病毒羊驼抗体及其制备方法和应用
CN112358533A (zh) * 2020-10-30 2021-02-12 上海泽润生物科技有限公司 重组刺突蛋白及其制备方法和用途
CN112480217A (zh) * 2020-11-30 2021-03-12 广州市锐博生物科技有限公司 基于SARS-CoV-2的S抗原蛋白的疫苗和组合物
CN112724248A (zh) * 2021-01-28 2021-04-30 南京拓峰生物科技有限公司 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用

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