JP2022518363A - Icam-1に特異的に結合する抗体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1(GYTFTDYA)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H1)、配列番号2(ISTYSGNT)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H2)、および配列番号3(ARSLYFGSSGFDY)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H3)を含む重鎖相補性決定部位(Complementarity Determining Regions;CDRs)または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域;および
配列番号4(QTLVYRNGNTY)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L1)、配列番号5(KVS)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L2)、および配列番号6(SQNTHFPYT)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L3)を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものであり得る。
配列番号1(GYTFTDYA)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H1)、配列番号2(ISTYSGNT)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H2)、および配列番号3(ARSLYFGSSGFDY)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-H3)を含む重鎖相補性決定部位(Complementarity Determining Regions;CDRs)または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域;および
配列番号4(QTLVYRNGNTY)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L1)、配列番号5(KVS)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L2)、および配列番号6(SQNTHFPYT)のアミノ酸配列を含むポリペプチド(CDR-L3)を含む軽鎖相補性決定部位または前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むものあり得る。
重鎖フレームワーク1(VH-FR1;CDRH1のN-末端隣接部位)は、配列番号97(QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKX7S;X1はQまたはV、X2はLまたはV、X3はVまたはK、X4はRまたはK、X5はVまたはA、X6はIまたはV、X7はGまたはA)または配列番号98(QVQLX8QSGAEVX9KPGASVKX10SCKX11S;X8はVまたはQ、X9はKまたはV、X10はIまたはV、X11はGまたはA)のアミノ酸配列、例えば、配列番号39、40、41、42、43、44、45、46、47、および48より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク2(VH-FR2;CDRH1のC-末端とCDRH2のN-末端の間の部位)は、配列番号99(LHWVX12QX13X14X15X16X17LEWX18GV;X12はKまたはR、X13はSまたはA、X14はHまたはP、X15はAまたはG、X16はKまたはQ、X17はSまたはR、X18はIまたはM)または配列番号100(LHWVX19QAPGQX20LEWX21GV;X19はRまたはK、X20はRまたはS、X21はIまたはM)のアミノ酸配列、例えば、配列番号49、50、51、52、53、54、および55より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
重鎖フレームワーク3(VH-FR3;CDRH2のC-末端とCDRH3のN-末端の間の部位)は、配列番号101(X22YX23QKFX24GX25X26TX27TX28DX29SX30X31TAYX32ELX33X34LX35SEDX36AX37X38YC;X22はDまたはK、X23はNまたはS、X24はRまたはQ、X25はKまたはR、X26はAまたはV、X27はMまたはI、X28はVまたはR、X29はKまたはT、X30はSまたはA、X31はTまたはS、X32はLまたはM、X33はAまたはS、X34はRまたはS、X35はTまたはR、X36はSまたはT、X37はIまたはV、X38はHまたはY)または配列番号102(X39YX40QKFX41GX42X43TX44TX45RX46SAX47TAYX48ELSSLRSEDTAX49X50YC;X39はDまたはK、X40はNまたはS、X41はRまたはQ、X42はRまたはK、X43はAまたはV、X44はIまたはM、X45はRまたはV、X46はTまたはK、X47はSまたはT、X48はMまたはL、X49はVまたはI、X50はYまたはH)のアミノ酸配列、例えば、配列番号56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、および80より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および/または
重鎖フレームワーク4(VH-FR4;CDRH3のC-末端と隣接する部位)は、配列番号81のアミノ酸配列を含むものであり得る。
軽鎖フレームワーク1(VL-FR1;CDRL1のN-末端隣接部位)は、配列番号103(DVVLTQX51PLSX52PVX53LGX54X55ASISCRSS;X51はTまたはS、X52はLまたはS、X53はNまたはT、X54はDまたはQ、X55はQまたはP)または配列番号104 DVVLTQX56PLSX57PVTLGQPASISCRSS;X56はSまたはT、X57はLまたはS)のアミノ酸配列、例えば、配列番号82、83、および84より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク2(VL-FR2;CDRL1のC-末端とCDRL2のN-末端の間の部位)は、配列番号105(LHWYX58QX59X60GQX61PX62LLIX63;X58はLまたはQ、X59はKまたはR、X60はAまたはP、X61はSまたはP、X62はKまたはR、X63はYまたは存在しない)のアミノ酸配列、例えば、配列番号85、86、87、88、および89より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、
軽鎖フレームワーク3(VL-FR3;CDRL2のC-末端とCDRL3のN-末端の間の部位)は、配列番号106(NRFSGVPDRFSGSGX64GTDFTLKISRVEAEDX65GVYFC;X64はSまたはA、X65はLまたはV)のアミノ酸配列、例えば、配列番号90、91、および93より選ばれたアミノ酸配列を含むものであり得、および/または
軽鎖フレームワーク4(VL-FR4;CDRL3のC-末端と隣接する部位)は、配列番号107(FGGGTKX66X67X68X69X70;X66はIまたはL、X67はKまたはE、X68はRまたはI、X69はQまたはK、X70はRまたは存在しない)のアミノ酸配列、例えば、配列番号93または94のアミノ酸配列を含むものであり得る。
前記重鎖可変領域は配列番号97または98(例えば、配列番号39、40、41、42、43、44、45、46、47、または48)のアミノ酸配列を含むVH-FR1、配列番号1のアミノ酸配列を含むCDRH1、配列番号99または100(例えば、配列番号49、50、51、52、53、54、または55)のアミノ酸配列を含むVH-FR2、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDRH2、配列番号101または102(例えば、配列番号56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80)のアミノ酸配列を含むVH-FR3、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDRH3、および配列番号81のアミノ酸配列を含むVH-FR4を含み;
前記軽鎖可変領域は配列番号103または104(例えば、配列番号82、83、または84)のアミノ酸配列を含むVL-FR1、配列番号4のアミノ酸配列を含むCDRL1、配列番号105(例えば、配列番号85、86、87、88、または89)のアミノ酸配列を含むVL-FR2、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDRL2、配列番号106(例えば、配列番号90、91、または93)のアミノ酸配列を含むVL-FR3、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDRL3、および配列番号107(例えば、配列番号93または94)のアミノ酸配列を含むVL-FR4を含むものであり得る。
ICAM-1に特異的な抗体を開発するために次のような実験を行った。
組換えヒトICAM-1タンパク質(0.5mg/ml;NCBI accession number NP_000192.2)を同一体積のadjuvant(Invivogen,#vac-adx-10)と混合して免疫物質を製造した。6週齢Balb/c雌マウス腹腔(IP;intraperitoneal cavity)に前記製造された免疫物質200uLを3週間隔で3回注入した。
前記のように免疫化されたマウスの脾臓を切除して単一細胞浮遊液を収得してRPMI(GIBCO,#21875034)で2回洗浄した後、0.4%(w/v) trypan blue(sigma)を1:1(v/v)で混ぜた後トリパンブルー(Sigma-aldrich,#T8154)染色法で細胞数を計数した。X63 mouse myeloma細胞株(ATCC CRL-1580)を洗浄して計数して細胞融合partnerとして使用した。
2-1.抗-ICAM-1抗体遺伝子配列クローニング
実施例1で選別したマウス単クローン抗体SI9の遺伝子をMouse Ig-Primer Set(Millipore,Cat.#:69831)を用いてクローニングした。実施例1で開発した単クローン抗体SI9生産ハイブリドーマを培養し、融合細胞株からtotal RNAを抽出した。Mouse Ig-Primer Setを使用して抽出したRNAを鋳型としてPCRを行い、これをpGem-Tベクター(Promega,Cat.#:A3600)に挿入した後、シーケンシングによりDNA塩基配列を確認し、IMGT site(www.imgt.org)を介してマウス抗体遺伝子を確認した。分析したSI9抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を表1に整理した:
前記製作された抗-ICAM-1マウス抗体SI9のアミノ酸配列に基づいて抗-ICAM-1キメラ抗体を製作した。
抗-ICAM-1キメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはpOptiVEC(Invitrogen社)ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはpcDNA3.3(Invitrogen社)ベクターを使用して製作した。
前記製作されたpcDNA3.3-anti-ICAM-1重鎖発現プラスミドとpOptiVEC-anti-ICAM-1軽鎖発現プラスミドをCHO細胞由来であるDG44細胞(Invitrogen)にtransfectionさせて形質転換過程を行った。
3.1.In silico Humanizationによる組換え抗体配列の選定
キメラICAM-1抗体(SI9)の重鎖、軽鎖それぞれのCDR部位のアミノ酸配列(CDRH1:GYTFTDYA(配列番号:1)、CDRH2:ISTYSGNT(配列番号:2)、CDRH3:ARSLYFGSSGFDY(配列番号:3)、CDRL1:QTLVYRNGNTY(配列番号:4)、CDRL2:KVS(配列番号:5)、CDRL3:SQNTHFPYT(配列番号:6))を維持しながらヒト抗体遺伝子をコーディングしているgermline framework regionを組換えたヒト化抗体配列をin silico方法で選別した。
選別した抗体配列はそれぞれのヒトIgG4重鎖不変領域とkappa軽鎖不変領域と連結してヒトIgG4形態にHEK293細胞(ATCC CRL-1573)で発現させた。
3-3-1.高安定性ヒト化抗体の選別
3-3-1-1.高安定性ヒト化抗体の1次選別
安定性が高い抗体を優先的に選別するために、高温の苛酷条件に抗体を放置して、物理的な性質変化を観察して、熱変性に抵抗性を示すヒト化抗体を選別した。
図2a-2d、3a-3d、および4a-4dで比較的高い抗体生産性、比較的高いpeak symmetry factorおよび/または高温(61℃)条件での比較的高い熱安全性を示す合計47種のヒト化抗体を一次的に選定した(図5参照)。
安定性試験評価で表7のように先導抗体6種のヒト化抗体を選定し、H11L3除いた抗体5種の結合力を親抗体(キメラ抗体;実施例1.3参照)と比較評価した。
特に安定した物理的特性を示すヒト化抗体H17L1とH17L4のmelting temperatureを親抗体(キメラ抗体;実施例1.3参照)と比較して安定性を評価した。
H17L1およびH17L4ヒト化抗体の抗原に対する親和度を親抗体と比較するためにOctet system(ForteBio)を使用した。Amine reactive Bio-sensor AR2G(ForteBio)に抗体3種をそれぞれ付着して五つの濃度のICAM-1抗原溶液を添加して抗原/抗体反応が発生するように誘導した。前記抗原/抗体反応結果を用いて結合定数(Kon)と解離定数(Koff)を測定して親和度(KD)を計算してその結果を表10および図8に示した:
4-1.末梢血液単核球分離およびIFNg変化測定
本明細書で提供された抗体の免疫調節効能を確認するために、末梢血液単核球に前記実施例3で製造されたDNP007抗体(H17L4抗体)を処理して代表的な前炎症性(pro-inflammatory)サイトカインIFN-gamma分泌量を測定した。
DNP007の免疫反応調節が単に樹状細胞によるものであるか、樹状細胞とT細胞をはじめとする免疫細胞の接触によるものであるかを調べるために、下記のようにヒト末梢血液単核細胞を分離後、5種類の末梢血液集団に分けて100ng/ml GM-CSFおよび100ng/ml IL-4を添加し、10ug/mlのDNP007抗体添加有無の条件下で6日間培養して細胞を収得し、成熟した樹状細胞への誘導のために培養6日目に前記細胞を洗浄して5ug/ml LPS(Sigma-Aldrich)で一日の間処理して、各集団別の細胞を収得して。total RNAを分離して遺伝子発現プロファイルを分析した。
(2)CD14+monocyte由来の樹状細胞:健康な支援者の血液をFicoll-Paque(GE Healthcare)で濃度こう配遠心分離を行って分離したヒト末梢血液単核細胞からCD14+単核球を磁気分離法(magnetic beads利用)を用いて分離した。
(3)CD14 deplete PBMC:(2)のCD14+単核球を磁気分離法(magnetic beads利用)で分離して残った末梢血液集団を使用した。
(4)Attached PBMC:健康な支援者の血液をFicoll-Paque(GE Healthcare)で濃度こう配遠心分離を行って、分離したヒト末梢血液単核細胞を10%FBSが添加されたRPMI培地に2時間の間37℃、5%CO2インキュベーターで細胞を付着させた後、上層液(浮游細胞を含む)を掬い取り、付着した細胞のみ分離した。
(5)(4)の実験で掬い取った上層の浮游細胞を使用した。
上記4-2実験セットの準備の際、遺伝子発現変化が実際のタンパク質発現変化と相関関係を示すかどうかを確認するために、4-2実験時に上層液を分離して実際のサイトカインを定量分析した。IFNgamma、IL1 beta、IL-6、IL-10、IL-12(p70)、IL-17、IL-27はHuman Luminex Screening assay(LXSAH,R&D)キットを用いて、TGF-betaはTGF-beta premixed assayキット(TGTBMAG-64K-03;Merck Millipore)を用いて分析した。
5-1.末梢血液単核球での準成熟樹状細胞(Semi-matured Dendritic Cells)の誘導活性試験
本実施例では本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟に及ぼす効果を確認した。より具体的には、正常支援者から採血を実施して準備した末梢血液に、CD14 microbead(Miltenyi Biotec、130-050-201)を付着した後、セルハーベスター(Miltenyi Biotec.Cat.000403)を用いてヒト末梢血液単核球を分離した。ここにGM-CSF(Creagene)とIL-4(Creagene)をそれぞれ100ng/ml濃度で処理した10%FBS containing RPMI培養液を入れ、5日間未成熟樹状細胞(immature DC)に分化を誘導した。培養5日目にLPS Lipopolysaccharides,Sigma-Aldrich,#L2630)5ug/mlを添加して、24時間の間樹状細胞(mature DC)を刺激して成熟樹状細胞に分化させた。本明細書で提供された抗体DNP007(H17L4抗体)および対照抗体(hIgG)は、樹状細胞分化誘導過程0、3日目に5.0ug/mL濃度で添加した。分化6日目に樹状細胞の成熟表面因子であるCD80(Invitrogen,Catalog# 11-0809-42)、CD86(BD,Catalog# 555657)、CD40(BD,Catalog# 555588)、CD54(BD,Catalog# 347977)およびHLA-DR(BioLegend,Catalog# 307616)(以上、括弧内は該当因子に対する抗体である)の発現量をフローサイトメトリーを用いて確認および比較した。
本明細書で提供された抗体が樹状細胞の分化および成熟段階に影響を与えるかどうかを確認するために、末梢血液から分離したヒト末梢血液単核球をGM-CSFとIL-4とともに5日間培養して樹状細胞に分化させ、LPSのような刺激因子を入れて24時間培養して成熟を誘導させた後、樹状細胞の成熟度を測定するために培養液内の炎症性サイトカイン(Proinflammatory cytokine)の量を分析した。
樹状細胞の分化段階で本明細書で提供された抗体が細胞死滅に影響を与えるかどうかを確認するために、前記抗体処理による6日間の分化および成熟させた樹状細胞の死滅程度を測定した。細胞死滅程度は7AAD染色後フローサイトメトリーにより確認した。
本明細書で提供された抗体が免疫寛容樹状細胞を誘導するかどうかを確認するために、6日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞の標識因子の発現を確認した。
本明細書で提供された抗体による樹状細胞成熟抑制が、知られている二つの成熟経路のうちどの経路によるものかを確認するために、LPSとCD40Lを用いて樹状細胞の成熟を誘導した。6日間の分化および成熟過程を経た準成熟樹状細胞で、フローサイトメトリーで免疫寛容樹状細胞標識因子であるIDOの発現を確認した。
本明細書で提供された抗体の処理により成熟が抑制された樹状細胞がT細胞に影響を与える要因が細胞間の接合によるものであるか、あるいは細胞から分泌された媒介因子によるものであるかを確認するために、樹状細胞とT細胞を分離した条件で培養してT細胞の活性抑制能を確認した。
本明細書で提供された抗体の処理で成熟が抑制された樹状細胞のT細胞活性抑制能を評価するために、樹状細胞とT細胞を共に培養した条件でT細胞の活性および増殖を確認した。先に樹状細胞の成熟は知られている二つの成熟経路への刺激因子であるLPS、TNF-aおよびCD40Lを用いて誘導し、T細胞の増殖と細胞内炎症性サイトカインの発現量を測定した。
6-1.リウマチ関節炎の治療効果試験
本明細書で提供された抗体がリウマチ関節炎に効果があるかどうかを確認するために、mild and moderateリウマチ関節炎モデルを次のように準備した:最初の日にType II Bovine collagen(Chodrex inc,Cat.#:20021) 4mgをCFA(Sigma Cat.#:F5881)とともに1:1体積の割合で0.5ml+0.5mlの量で準備して、0.1mlずつ10ヶ所に分けて霊長類動物(Cynomolgus Macaques(macaca fascicularis)、性別:female、年齢:2.5~5years、体重:2~6kg、入手元:PrimGen)などの表皮(Intradermal)に注入した。21日目の日と45日目の日にも同様の方法で注入し、ただし二回目と三回目の注入はCFAの代わりにIFA(Sigma,Cat.#:F5506)に交替して注入した。対照群はPBSを同じ方式で注入した。関節炎誘発の有無を測定するRA scoreは動物の各関節の腫れや赤い色変化の程度を半定量的に点数化した(図22a)。本明細書で提供された抗体DNP007(H17L4抗体)は初めてcollagen処理後、70日目から週2回、8mg/kgで投与しながら評価基準によって64関節の関節炎点数(Arthritis score)を測定した。また、投与動物の血漿からBovine collagen特異抗体を検査した。これはChondrex社の)ELISAキット(Cat.#:2052T)を用いてBovine collagen特異抗体の変化を測定した。
移植片対宿主疾患(Graft-versus-host disease,GVHD)は、同種臓器(例えば、骨髄)移植時移植を受けた患者(授与者)から現れる副作用の一つであり、供与者のT細胞やNK細胞が授与者の臓器を攻撃して現れる現象である。本明細書で提供された抗体が同種骨髓移植時移植片対宿主疾患の抑制に効果があるかどうかを確認するために、NOD-SCIDハツカネズミにヒトの末梢血液単核球(PBMC)を入れてT細胞の再構成(Reconstitution)と生残率を対照群と比較した。
Claims (15)
- 次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む、抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1のアミノ酸配列を含むCDR-H1、
配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR-H2、
配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR-H3、
配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-L1、
配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-L2、および
配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-L3。 - フレームワークとして次を含む、請求項1に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号97または98のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク1;
配列番号99または100のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク2;
配列番号101または102のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク3;
配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク4;
配列番号103または104のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク1;
配列番号105のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク2;
配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク3;および
配列番号107のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク4。 - フレームワークとして次を含む、請求項1に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号39、40、41、42、43、44、45、46、47、および48より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク1;
配列番号49、50、51、52、53、54、および55より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク2;
配列番号56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、および80より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク3;
配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク4;
配列番号82、83、および84より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク1;
配列番号85、86、87、88、および89より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク2;
配列番号90、91、および93より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク3;および
配列番号93または94のアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク4。 - 配列番号7および11~34からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
配列番号8および35~38からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片。 - 抗ICAM-1抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片は、前記抗ICAM-1抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、またはF(ab’)2である、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫細胞媒介性疾患の予防または治療のための医薬組成物。
- 前記免疫細胞媒介性疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患、喘息、肥満、第2型糖尿病、免疫細胞媒介炎症、または自己免疫疾患である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記自己免疫疾患は、脳脊髄炎、リウマチ関節炎、全身紅斑性狼瘡、アトピー皮膚炎、多発性硬化症、1型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、硬皮症、結節性多発動脈炎、菊池病、膠原病、橋本甲状腺炎、乾癬、白斑症、甲状腺機能亢進症、線維筋痛、円形脱毛、またはアレルギーである、請求項8に記載の医薬組成物。
- 配列番号1~6より選ばれたアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
- 配列番号7および11~34より選ばれたアミノ酸配列;
配列番号8および35~38より選ばれたアミノ酸配列;または
それらの両方
をコードする、核酸分子。 - 請求項10または11に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
- 請求項13に記載の組換え細胞を培養する工程を含む、抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の抗ICAM-1抗体またはその抗原結合断片を含む、ICAM-1検出用組成物。
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