WO2020141869A1 - Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2020141869A1
WO2020141869A1 PCT/KR2019/018822 KR2019018822W WO2020141869A1 WO 2020141869 A1 WO2020141869 A1 WO 2020141869A1 KR 2019018822 W KR2019018822 W KR 2019018822W WO 2020141869 A1 WO2020141869 A1 WO 2020141869A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
acid sequence
icam
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/018822
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
문유리
지길용
윤상순
김정식
Original Assignee
다이노나(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이노나(주) filed Critical 다이노나(주)
Priority to CN201980087502.3A priority Critical patent/CN113272328B/zh
Priority to EP19907470.9A priority patent/EP3909979A4/en
Priority to AU2019419832A priority patent/AU2019419832B2/en
Priority to JP2021538358A priority patent/JP7308957B2/ja
Publication of WO2020141869A1 publication Critical patent/WO2020141869A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G01N2800/122—Chronic or obstructive airway disorders, e.g. asthma COPD
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the differentiation and/or function regulation of dendritic cells comprising as a component and a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of immune cell-mediated diseases.
  • Dendritic cells are highly specialized antigen presenting cells that incorporate a variety of immune responses and contain a heterogeneous family of antigen presenting cells involved in the initiation of immunity and immune tolerance. To date, immature dendritic cells induce T cells into an immunodeficiency state, and dendritic cells transformed into mature dendritic cells by active stimulants such as lipopolysaccharide (LPS) induce primary T cell responses. . In addition, semi-mature dendritic cells with unique cytokine production profiles can confer immunotolerant function.
  • active stimulants such as lipopolysaccharide (LPS)
  • LPS lipopolysaccharide
  • semi-mature dendritic cells with unique cytokine production profiles can confer immunotolerant function.
  • ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1
  • domain 1 to domain 5 consists of five extracellular interstitial globulin superfamily domains, cell transmembrane regions, and intracellular regions, numbered in the N- to C-terminal direction, 90 kDa is a type I cell surface glycoprotein.
  • ICAM-1 mediates white blood cell/leukocyte interactions, such as the interaction between T cells and antigen presenting cells. It also mediates leukocyte outflow into tissues during the inflammatory process.
  • LFA-1 ICAM-1/leukocyte function antigen-1
  • enlimomab In a monkey study using R6-5-D6 (enlimomab), a mouse monoclonal antibody that binds to the domain of human ICAM-1, renal allograft survival was increased and T cell infiltration into the graft was reduced compared to control (J Immunol. 1990, 144:4604-4612). In addition, enlimomab has been demonstrated to be effective in inhibiting disease activity in patients with rheumatoid arthritis (Arthritis Rheum. 1994, 37:992-999; J Rheumatol. 1996, 23:1338-1344). However, enrimomab induction treatment after kidney transplantation has no significant effect on reducing the rate of acute rejection or risk of delayed graft function.
  • Enrimomab functions to block the attachment of neutrophils to vascular endothelial cells as well as T cells, and thus it has been reported that interfering with neutrophil migration potentially increases susceptibility to infection (J Immunol. 1999, 162:2352-2357).
  • One example provides an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes ICAM-1.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (GYTFTDYA), polypeptide (CDR-H2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (ISTYSGNT), and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (ARSLYFGSSGFDY)
  • CDRs Complementarity Determining Regions
  • CDRs comprising a polypeptide (CDR-H3) comprising or a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining region;
  • Polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (QTLVYRNGNTY), polypeptide (CDR-L2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (KVS), and amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (SQNTHFPYT) It may be to include a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining region or the light chain complementarity determining region comprising a polypeptide (CDR-L3) comprising a.
  • the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 11 to 34
  • the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 35 to 38.
  • heavy chain complementarity determining region a heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region, or nucleic acid molecule encoding a heavy chain of an anti-ICAM-1 antibody.
  • nucleic acid molecules encoding light chain complementarity determining regions, light chain variable regions or light chains of anti-ICAM-1 antibodies.
  • Another example is a nucleic acid molecule encoding a heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-ICAM-1 antibody and a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining region, light chain variable region or a light chain of the anti-ICAM-1 antibody.
  • Recombinant vectors are provided that are included together or in separate vectors.
  • Another example provides a recombinant cell comprising the recombinant vector.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating a disease comprising the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the disease may be an immune cell mediated disease.
  • Another example comprises the step of administering a pharmaceutically effective amount of the ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of an immune cell-mediated disease, and And/or provide treatment.
  • the method may further comprise identifying a subject in need of prevention and/or treatment of an immune cell mediated disease prior to the step of administering.
  • the immune cell-mediated disease may be selected from transplant rejection, graft versus host disease, asthma, autoimmune disease, and the like.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for regulating the differentiation and/or function of dendritic cells comprising the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example is a method of modulating the differentiation and/or function of dendritic cells, comprising administering a pharmaceutically effective amount of an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need thereof.
  • Other examples provide use for use in the manufacture of pharmaceutical compositions for modulating the differentiation and/or function of dendritic cells or modulating the differentiation and/or function of dendritic cells of an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • anti-ICAM-1 antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically recognize ICAM-1, and uses thereof.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof is characterized by specifically recognizing and/or binding domain 2 of the domain of ICAM-1.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof may be an antagonist having inhibitory activity against ICAM-1.
  • the antibody does not inhibit ICAM-1/LFA-1 binding itself by binding to domain 2 rather than domain 1 of ICAM-1, which is a binding site with LFA-1, a ligand of the antigen ICAM-1. This can be confirmed through the fact that the antibody does not inhibit T cell transmigration.
  • the antibody is an immune synapse for the delivery of T cell activity in that it induces differentiation into intolerant dendritic cells and induces functional immunosuppression and suppresses the immune activity of T cells in co-culture with dendritic cells and T cells. It can potentially affect spatial function activation and binding and reorganization between related proteins.
  • the antibody may be an antagonist that functionally inhibits ICAM-1 activity rather than physically inhibiting receptor-ligand binding.
  • the antibody may be to induce a result of suppressing the immune activity of T cells containing a ligand as a result by the above-described activity.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein binds to domain 2 of ICAM-1 (eg, human ICAM-1) and induces antigen-specific T-cell resistance, thereby dendritic cells. Inhibiting the differentiation and / or function of, and may have a prophylactic and/or therapeutic effect on immune cell-mediated diseases.
  • ICAM-1 eg, human ICAM-1
  • ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1
  • CD54 Cluster of Differentiation 54
  • ICAM-1 acting as an antigen of the antibody provided herein may be of mammalian origin, such as human ICAM-1 (e.g., NCBI accession numbers NP_000192.2, etc.), monkey ICAM-1 (e.g., NCBI accession numbers NP_001266532 Etc.).
  • the antibody may exhibit cross-reactivity to human ICAM-1 and monkey ICAM-1.
  • the term "antibody” refers to a substance made by stimulation of an antigen in the immune system or a protein that specifically binds to a specific antigen, and is produced recombinantly or synthetically based on the substance or protein. It is also used as a concept that includes proteins.
  • the antibody may be non-naturally produced, for example, recombinantly or synthetically produced.
  • the antibody may be an animal antibody (eg, mouse antibody, etc.), a chimeric antibody (eg, mouse-human chimeric antibody), a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody can be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • an antibody herein can be understood to include all fragments of an antibody that retain antigen-binding ability, unless otherwise specified.
  • complementarity-determining regions means a region that confers binding specificity with an antigen among variable regions of an antibody.
  • the antigen-binding fragment of the above-described antibody may be an antibody fragment comprising one or more of the complementarity determining regions.
  • One example provides an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes ICAM-1 or specifically binds ICAM-1.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (GYTFTDYA), polypeptide (CDR-H2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (ISTYSGNT), and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (ARSLYFGSSGFDY)
  • CDRs Complementarity Determining Regions
  • CDRs comprising a polypeptide (CDR-H3) comprising or a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining region;
  • Polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (QTLVYRNGNTY), polypeptide (CDR-L2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (KVS), and amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (SQNTHFPYT)
  • Light chain complementarity determining region comprising a polypeptide (CDR-L3) comprising or a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining region
  • Heavy chain framework 1 (VH-FR1; N-terminal flanking region of CDRH1) is SEQ ID NO: 97 (QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKX7S; X1 is Q or V, X2 is L or V, X3 is V or K, X4 is R or K, X5 is R or K, X5 is V or A, X6 is I or V, X7 is G or A) or amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 (QVQLX8QSGAEVX9KPGASVKX10SCKX11S; X8 is V or Q, X9 is K or V, X10 is K or V, X10 is I or V, X11 is G or A) ,
  • Heavy chain framework 2 (VH-FR2; site between the C-terminus of CDRH1 and the N-terminus of CDRH2) is SEQ ID NO: 99 (LHWVX12QX13X14X15X16X17LEWX18GV; X12 is K or R, X13 is S or A, X14 is H or P, X15 A or G, X16 is K or Q, X17 is S or R, X18 is I or M) or amino acid of SEQ ID NO: 100 (LHWVX19QAPGQX20LEWX21GV; X19 is R or K, X20 is R or S, X21 is I or M)
  • a sequence may include an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 53, 54, and 55,
  • Heavy chain framework 3 (VH-FR3; site between the C-terminus of CDRH2 and the N-terminus of CDRH3) is SEQ ID NO: 101 (X22YX23QKFX24GX25X26TX27TX28DX29SX30X31TAYX32ELX33X34LX35SEDX36AX37X38YC; X22 is D or K, X, Is K or R, X26 is A or V, X27 is M or I, X28 is V or R, X29 is K or T, X30 is S or A, X31 is T or S, X32 is L or M, X33 is A Or S, X34 is R or S, X35 is T or R, X36 is S or T, X37 is I or V, X38 is H or Y) or SEQ ID NO: 102 (X39YX40QKFX41GX42X43TX44TX45RX46SAX47TA
  • the heavy chain framework 4 (VH-FR4; the region adjacent to the C-terminus of CDRH3) may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81.
  • Light chain framework 1 (VL-FR1; N-terminal flanking region of CDRL1) is SEQ ID NO: 103 (DVVLTQX51PLSX52PVX53LGX54X55ASISCRSS; X51 is T or S, X52 is L or S, X53 is N or T, X54 is D or Q, X55 is Q or P) or SEQ ID NO: 104 DVVLTQX56PLSX57PVTLGQPASISCRSS; X56 is S or T, X57 is L or S) may include an amino acid sequence selected from, for example, SEQ ID NO: 82, 83, and 84,
  • Light chain framework 2 (VL-FR2; site between the C-terminus of CDRL1 and the N-terminus of CDRL2) is SEQ ID NO: 105 (LHWYX58QX59X60GQX61PX62LLIX63; X58 is L or Q, X59 is K or R, X60 is A or P, X61 Silver S or P, X62 is K or R, X63 is Y or not present), for example, SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, and 89 may include an amino acid sequence selected from
  • Light chain framework 3 (VL-FR3; site between the C-terminus of CDRL2 and the N-terminus of CDRL3) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106 (NRFSGVPDRFSGSGX64GTDFTLKISRVEAEDX65GVYFC; X64 is S or A, X65 is L or V), e.g., sequence May comprise amino acid sequences selected from numbers 90, 91, and 93, and/or
  • Light chain framework 4 (VL-FR4; the region adjacent to the C-terminus of CDRL3) is SEQ ID NO: 107 (FGGGTKX66X67X68X69X70; I or L for X66, K or E for X66, R or I for X68, Q or K for X69, X70 R or not present) may include, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 or 94.
  • VH-FR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97 or 98 (e.g., SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, or 48) CDRH1 comprising amino acid sequence
  • VH-FR2 comprising amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 or 100 (e.g., SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, or 55), amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 CDRH2, SEQ ID NO: 101 or 102 (e.g., SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, or 80), including VH-FR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, CDRH3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, CDRH3 compris
  • the light chain variable region is VL-FR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 or 104 (e.g., SEQ ID NO: 82, 83, or 84), CDRL1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 105 (e.g., sequence VL-FR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, or 89, CDRL2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, amino acid of SEQ ID NO: 106 (e.g., SEQ ID NO: 90, 91, or 93) VL-FR3 comprising the sequence, CDRL3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and VL-FR4 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107 (eg, SEQ ID NO: 93 or 94).
  • SEQ ID NO: 103 or 104 e.g., SEQ ID NO: 82, 83, or 84
  • the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 11 to 34
  • the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 35 to 38.
  • Animal-derived antibodies produced by immunizing an immunized animal with a desired antigen may generally undergo an immune rejection reaction when administered to a human for therapeutic purposes, and chimeric antibodies have been developed to suppress such immune rejection.
  • Chimeric antibodies are those that replace the constant regions of animal-derived antibodies that cause anti-isotype reactions with the constant regions of human antibodies using genetic engineering methods. Chimeric antibodies have been significantly improved in anti-isotype reactions compared to animal-derived antibodies, but still contain animal-derived amino acids in the variable region, thus implicating potential anti-idiotypic reactions. Doing. Humanized antibodies have been developed to improve these side effects. It is produced by transplanting a region of CDR (complementaritiy determining regions) that plays an important role in antigen binding among variable regions of a chimeric antibody into a human antibody framework.
  • CDR complementaritiy determining regions
  • the most important thing in the CDR grafting technology for producing humanized antibodies is to select an optimized human antibody that can best accept the CDR regions of animal-derived antibodies. To this end, use of an antibody database and crystal structure structure), and molecular modeling technology.
  • the antibody may be an animal antibody (eg, mouse antibody), a chimeric antibody (eg, a mouse-human chimeric antibody) or a humanized antibody.
  • animal antibody eg, mouse antibody
  • chimeric antibody eg, a mouse-human chimeric antibody
  • humanized antibody e.g., humanized antibody.
  • the heavy chain framework and/or heavy chain constant region excluding heavy chain CDRs of SEQ ID NOs: 1 to 3 are immunoglobulins (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM, IgA, IgD , Or IgE), e.g., human immunoglobulins (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM, IgA, IgD, or IgE) and may be heavy chain framework and/or heavy chain constant regions.
  • the light chain framework and/or light chain constant region excluding the light chain CDRs of numbers 4 to 6 may be a kappa ( ⁇ ) or lambda ( ⁇ ) type light chain framework and/or light chain constant region.
  • a complete antibody has a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, and each light chain is linked by a heavy chain and a disulfide bond.
  • the constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses.
  • the constant regions of the light chain have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • variable chain refers to the variable region domain V H and the three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 and hinges (including amino acid sequences having sufficient variable region sequences to confer specificity to the antigen) ( It is interpreted as including both the full-length heavy chain and the fragments thereof.
  • light chain refers to both the full-length light chain comprising the variable region domain V L and the constant region domain C L and fragments thereof comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequences to confer specificity to the antigen. It is interpreted as including meaning.
  • CDR complementarity determining region
  • the heavy chain and light chain may each include three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3).
  • the CDRs can provide a major contact residue for the antibody to bind to an antigen or epitope.
  • specifically binding or “specifically recognized” is the same as the meaning commonly known to those skilled in the art, the antigen and the antibody specifically interact to perform an immunological reaction.
  • antigen-binding fragment is a fragment of the entire structure of an immunoglobulin, meaning a portion to which an antigen can bind, such as a portion of an antibody comprising a CDR.
  • the antigen-binding fragment of an antibody may be scFv, (scFv) 2 , Fab, Fab' or F(ab') 2 .
  • Fab has a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (C H1 ) of a heavy chain, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • the F(ab') 2 antibody is produced by cysteine residues in the hinge region of Fab' forming disulfide bonds.
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and recombinant techniques for generating Fv fragments are well known in the art.
  • the double-stranded Fv (two-chain Fv) is a non-covalently linked heavy chain variable region and a light chain variable region
  • single-stranded Fv (single-chain Fv; scFv) is generally composed of a heavy chain variable region and a single chain through a peptide linker.
  • the variable region may be linked by a covalent bond or directly linked at the C-terminus to form a dimer-like structure such as a double-chain Fv.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the whole antibody with papain yields Fab and cleavage with pepsin yields F(ab') 2 fragment), It can be produced through genetic recombination technology.
  • hinge region refers to a region contained in the heavy chain of an antibody, which exists between CH1 and CH2 regions, and functions to provide flexibility of an antigen binding site in an antibody.
  • the anti-ICAM-1 antibody may be a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods well known in the art. For example, it can be manufactured using a phage display technique.
  • the anti-ICAM-1 antibody can be produced as a monoclonal antibody derived from an animal (eg, mouse) by conventional methods.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Inhibitory activity can be assayed through functional assays such as competitive ELISA (competitive ELISA) or cell-based assays to assay molecular interactions for conjugates.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Each affinity for ICAM-1 can then be assayed for selected monoclonal antibody members based on strong inhibitory activity.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating diseases comprising the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the disease may be an immune cell mediated disease.
  • Another example comprises the step of administering a pharmaceutically effective amount of the ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of an immune cell-mediated disease, and And/or provide treatment.
  • the method may further comprise identifying a subject in need of prevention and/or treatment of an immune cell mediated disease prior to the step of administering.
  • Another example provides the use of the ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of immune cell-mediated diseases, or for the manufacture of pharmaceutical compositions for the prevention and/or treatment of immune cell-mediated diseases. do.
  • the immune cell-mediated disease may be selected from all diseases related to immune cells.
  • the immune cells may be one or more selected from the group consisting of T cells, B cells, dendritic cells, macrophage, and monocytes.
  • the immune cell mediated disease is transplant rejection (e.g., allogeneic transplantation, allograft transplantation, xenograft rejection reaction occurring during transplantation), graft-versus-host disease (e.g., occurs when allogeneic bone marrow transplantation) Graft-versus-host disease, etc.), asthma, obesity, type 2 diabetes, autoimmune diseases (e.g. encephalomyelitis (e.g.
  • allergic encephalomyelitis rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (loops), atopic dermatitis, multiple sclerosis, type 1 Diabetes, chronic inflammatory diseases (e.g., inflammatory growth diseases (e.g., Crohn's disease, ulcerative colitis)), Behcet's disease, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, scleroderma, crystalline polyarteritis, Kikuchi disease, collagen disease, Hashimoco thyroiditis, psoriasis, Vitiligo, hyperthyroidism, fibromyalgia, alopecia areata, allergies, etc., immune cells (e.g., T cells, B cells, dendritic cells, macrophages, monocytes, etc.) mediated inflammation (e.g. macrophage mediated inflammation, etc.), the immunity It may be selected from inflammatory diseases caused by cell-mediated inflammation, and the like.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for regulating the differentiation and/or function of dendritic cells comprising the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example is a method of modulating the differentiation and/or function of dendritic cells, comprising administering a pharmaceutically effective amount of an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need thereof.
  • Other examples provide use for use in the manufacture of pharmaceutical compositions for modulating the differentiation and/or function of dendritic cells or modulating the differentiation and/or function of dendritic cells of an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used for the formulation of drugs, lactose, dextrose, sucrose, trehalose, alginy, histidine, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, 1 selected from the group consisting of calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. 1 It may be more than a species, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc., which are commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition, or an effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, or local administration of a lesion site may be administered.
  • the protein or peptide is digested, so the oral composition can be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition can be administered by any device capable of transporting the active substance to the target cell.
  • “pharmaceutically effective amount” may mean a content or dosage of an active ingredient (ie, an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof) capable of exhibiting a desired pharmacological effect, and formulated.
  • an active ingredient ie, an anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof
  • Methods, dosage regimen, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, interval of administration, route of administration, rate of excretion and response responsiveness may vary.
  • the content of the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof or the dose of the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof in the pharmaceutical composition is the method of formulation, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, morbidity, food, It can be variously prescribed by factors such as administration time, administration interval, administration route, excretion rate and response sensitivity.
  • the daily dose of the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof is 0.001 to 1000 mg/kg, specifically 0.01 to 100 mg/kg, more specifically 0.1 to 50 mg/kg, more specifically 0.1 to 20 mg/kg, but is not limited thereto.
  • the daily dosage may be formulated as a single dosage form in unit dose form, or may be formulated in appropriate portions, or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs, such as other anticancer agents, and the dosage, administration method, and type of other drugs may be appropriately prescribed according to the patient's condition.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be formulated in the form of ex-agent, powder, granule, tablet or capsule, and dispersant or stable for formulation It may further include a topic.
  • the patient to which the pharmaceutical composition is administered may be a mammal including a primate such as a human or a monkey.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds ICAM-1, it is possible to detect or confirm ICAM-1 using the same.
  • another example of the present invention provides a composition for the detection of ICAM-1 comprising the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another example is processing the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment thereof in a biological sample; And it provides a method for detecting ICAM-1 comprising the step of determining whether the antigen-antibody reaction. In the detection method, when an antigen-antibody reaction is detected, it can be determined (determined) that ICAM-1 is present in the biological sample.
  • the detection method may further include determining that ICAM-1 is present in the biological sample when an antigen-antibody reaction is detected, after the step of determining whether the antigen-antibody reaction is detected.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of (separated) cells, tissues, body fluids, cultures, etc. obtained from mammals, such as humans (eg, patients to be transplanted or transplanted, patients with autoimmune diseases, etc.). .
  • the step of determining whether or not the antigen-antibody reaction can be performed through various methods known in the art. For example, it can be measured through conventional enzymatic reaction, fluorescence, luminescence and/or radiation detection. Specifically, immunochromatography, immunohistochemistry, enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting (Western blotting) ), may be measured by a method selected from the group consisting of microarrays, but is not limited thereto.
  • the heavy chain complementarity determining region, light chain complementarity determining region, or combinations thereof of the anti-ICAM-1 antibody described above; Or a polypeptide molecule comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof is provided.
  • the polypeptide molecule may be used as a precursor of an antibody, and may be used as an antibody precursor, and may be included as a component of a protein scaffold (eg, a peptide body), a bispecific antibody, or a multispecific antibody having a structure similar to an antibody. .
  • heavy chain complementarity determining region a heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region, or nucleic acid molecule encoding a heavy chain of an anti-ICAM-1 antibody.
  • nucleic acid molecules encoding light chain complementarity determining regions, light chain variable regions or light chains of anti-ICAM-1 antibodies.
  • Another example is a nucleic acid molecule encoding a heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-ICAM-1 antibody and a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining region, light chain variable region or a light chain of the anti-ICAM-1 antibody.
  • Recombinant vectors are provided that are included together or in separate vectors.
  • vector means a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated virus vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14) , pQKX1, pQKX2, pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phages (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.) or viruses (e.g., name, SV40, etc.).
  • plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9
  • the nucleic acid molecule can be operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional binding between a nucleotide expression control sequence (eg, promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequence can be "operatively linked” to control transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or for expression.
  • the expression vector can be used in the art, conventional ones used to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a prokaryotic cell is a host
  • a strong promoter eg, a pL ⁇ promoter, a CMV promoter, a trp promoter, a lac promoter, a tac promoter
  • T7 promoter e.g., T7 promoter
  • a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/detox termination sequence.
  • replication origins that operate on eukaryotic cells included in vectors include f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, and BBV replication origin, etc. It is not limited.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promoter
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promote
  • Another example provides a recombinant cell comprising the recombinant vector.
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell is a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector while being stable, and any host cell known in the art can be used.
  • a prokaryotic cell for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus strains such as Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serra Enterobacteria and strains such as Tia Marsensons and various Pseudomonas species, and when transformed into eukaryotic cells, as host cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2/0 , CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO-S, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK, HEK293 cell line, etc. may be used, but It is not limited.
  • a delivery method well known in the art can be used.
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a micro-injection method, calcium phosphate precipitation method, electroporation method, Liposomal-mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto.
  • the method for selecting the transformed host cell can be easily performed according to a method well known in the art using a phenotype expressed by a selection label.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another example provides a method for producing an anti-ICAM-1 antibody, comprising expressing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same in a host cell.
  • the preparation method may include culturing the recombinant cells containing the recombinant vector, and optionally further comprising the step of isolating and/or purifying the antibody from the culture medium.
  • the anti-ICAM-1 antibody or antigen-binding fragment provided herein has the property of binding to domain 2 of human ICAM-1 and inducing antigen-specific T-cell resistance, thereby differentiating and/or dendritic cells. Or it can be useful for the regulation of function and / or prevention and / or treatment for immune cell mediated diseases.
  • 2A to 2D are graphs showing the results of quantifying purified antibodies by measuring OD (optical density) at 280 nm in one embodiment.
  • 3A to 3D are graphs showing results of measuring a peak symmetry factor by performing size exclusion HPLC (SE-HPLC) analysis on an anti-ICAM-1 antibody obtained according to an embodiment.
  • SE-HPLC size exclusion HPLC
  • Figures 4a to 4d is a graph showing the results of measuring the change in fluorescence by the ANS reagent while leaving the anti-ICAM-1 antibody obtained according to one embodiment at 61°C for 1 hour.
  • 5 is a graph showing the results of measuring the ANS reactivity after leaving the anti-ICAM-1 antibody obtained according to one embodiment at 67°C for 1 hour.
  • FIG. 6 is a graph comparing the binding capacity of the anti-ICAM-1 antibody obtained according to an embodiment to the ICAM-1 antigen by ELISA test (y-axis: 450 nm OD value; x-axis: antibody concentration (ng/ml)).
  • 7A to 7C are graphs showing melting points of anti-ICAM-1 antibodies obtained according to one embodiment (7a: chimeric antibody, 7b: H17L1, 7c: H17L4).
  • FIG. 9 is a heat map graph showing changes in gene expression profiles by humanized antibody administration obtained according to one embodiment in various peripheral blood conditions.
  • Figure 10 is a graph showing the analysis of changes in the gene expression profile by administration of the humanized antibody DNP007 obtained according to an embodiment in various peripheral blood conditions for the KEGG pathway (-10 log (adjusted p-value)).
  • 11 is a graph showing the analysis of the change in the gene expression profile by administration of the humanized antibody DNP007 obtained according to an embodiment in various peripheral blood conditions for GO Biological process (-10 log (adjusted p-value)).
  • 12A and 12B are graphs showing analysis of changes in gene expression profiles by administration of humanized antibody DNP007 obtained according to one embodiment under various peripheral blood conditions by increasing and decreasing cytokine genes.
  • FIG. 13 is a graph showing analysis of changes in cytokines by administration of humanized antibody DNP007 obtained according to one embodiment under various peripheral blood conditions with increased and decreased changes in protein levels.
  • FIG. 14 is a graph showing analysis of changes in cytokines by administration of humanized antibody DNP007 obtained according to an embodiment under dendritic cells and their T cell co-cultivation conditions with increased and decreased changes in protein levels.
  • 15 is a graph showing the degree of maturation cofactor expression of humanized antibody DNP007-treated dendritic cells obtained according to one embodiment.
  • 16 is a graph showing the degree of inflammatory cytokine secretion of dendritic cells treated with humanized antibody DNP007 obtained according to an embodiment.
  • 17 is a graph showing the degree of apoptosis of humanized antibody DNP007-treated dendritic cells obtained according to one embodiment.
  • 18A and 18B are graphs showing the expression levels of the humanized antibody DNP007-treated dendritic cell surface factors obtained according to an embodiment, and show whether or not immune-induced dendritic cells are induced.
  • 19A and 19B are graphs showing the degree of IDO (Indoleamine 2,3-Dioxygenase) expression of humanized antibody DNP007-treated dendritic cells obtained according to one embodiment, 19a showing Canonical pathway results, 19b showing Non-canonical pathway results Show each.
  • IDO Indoleamine 2,3-Dioxygenase
  • FIG. 20 is a graph showing the proliferation degree of T cells cultured with humanized antibody DNP007-treated dendritic cells obtained according to an embodiment and the production of inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-r).
  • IFN-r inflammatory cytokine interferon gamma
  • FIG. 21 shows various dendritic cell maturation pathways for varying degrees of T cell proliferation and production of interferon gamma (IFN-r), an inflammatory cytokine of T cells cultured with humanized antibody DNP007-treated dendritic cells obtained according to one embodiment. It is a graph showing LPS stimulation, TNF-a stimulation, and CD40L stimulation).
  • IFN-r interferon gamma
  • FIGS. 22A and 22B show arthritis scores before and after administration of the antibody
  • FIG. 22C shows anti-collagen antibody levels (22c) respectively.
  • FIG. 23A and 23B are results of confirming the graft-versus-host disease inhibitory effect of the humanized antibody DNP007 obtained according to an embodiment in an graft-versus-host disease animal model, and FIG. 22A shows the survival rate and FIG.
  • Recombinant human ICAM-1 protein (0.5 mg/ml; NCBI accession number NP_000192.2) was mixed with the same volume of adjuvant (Invivogen, #vac-adx-10) to prepare an immune substance.
  • adjuvant Invivogen, #vac-adx-10
  • IP 6-week-old Balb/c female mouse intraperitoneal cavity
  • the spleen of the immunized mouse was excised as described above to obtain a single cell suspension, washed twice with RPMI (GIBCO, #21875034), and 0.4% (w/v) trypan blue (sigma) 1:1 (v/ After mixing with v), the number of cells was counted by trypan blue (Sigma-aldrich, #T8154) staining.
  • the X63 mouse myeloma cell line (ATCC CRL-1580) was washed and counted to be used as a cell fusion partner.
  • the bone marrow (myeloma) cells and spleen cells were mixed at a ratio of 1:5 and centrifuged to remove the supernatant.
  • 1 ml of 50% (w/v) PEG (polyethylene glycol) 1500 preheated to 37° C. was added slowly over 1 minute. After stagnating for about 1 minute, RPMI medium was slowly added and diluted stepwise.
  • ICAM-1 R&D system, #ADP4-050
  • PBS PBS
  • 1X casein blocking solution Sigma-aldrich, #B6429
  • the hybridoma culture solution was dispensed at 100 uL/well and stored in a 37°C incubator for 1 hour to induce an antigen/antibody reaction. After completely removing the culture solution, wash it three times with washing solution (0.02% Tween 20 in PBS), and dilute the secondary antibody Goat anti-mouse IgG-HRP (Jackson, #) in a blocking solution at a ratio of 1:10,000 (v/v). Dispense at 100 uL/well and store in a 37° C. incubator for 30 minutes to induce secondary antibody responses.
  • TMB Thermo, #
  • 1.0N sulfuric acid H 2 SO 4
  • Flow cytometry was additionally performed to confirm whether the obtained anti-ICAM-1 antibody recognizes ICAM-1 expressed on the cell surface.
  • Antibody binding was induced by adding 100 uL of culture medium to 1 x 10 6 cells of I145-1 expressing prostate cancer cell line Du145 (ATCC, #HTB-81) and standing at room temperature for 15 minutes.
  • the secondary antibody Goat anti-Mouse IgG-FITC (Jackson, #) was diluted in PBS at a ratio of 1:100 (v/v), added to 100 ul, and reacted for 10 minutes at room temperature. After washing, the unreacted secondary antibody was removed and reactivity was confirmed by a flow cytometer.
  • a positive antibody that binds to the ICAM-1 antigen was primarily selected, and a monoclonal antibody capable of fluorescent staining was additionally selected for the Du145 cell line.
  • the selected monoclonal antibody (named SI9) showed high reactivity to the ICAM-1 protein antigen and effectively binds to the surface of the Du145 cell line.
  • the gene of the mouse monoclonal antibody SI9 selected in Example 1 was cloned using a Mouse Ig-Primer Set (Millipore, Cat. #: 69831).
  • the monoclonal antibody SI9-producing hybridoma developed in Example 1 was cultured, and total RNA was extracted from the fusion cell line.
  • RNA was extracted using a mouse ig-primer set as a template, PCR was inserted into the pGem-T vector (Promega, Cat. #: A3600), and the DNA sequence was confirmed through sequencing. www.imgt.org) to confirm the mouse antibody gene.
  • the heavy and light chain variable region amino acid sequences and coding nucleic acid sequences of the analyzed SI9 antibodies are summarized in Table 1:
  • an anti-ICAM-1 chimeric antibody was produced.
  • plasmids for heavy chain expression and plasmids for light chain expression were prepared, respectively.
  • a light chain expression plasmid pOptiVEC (Invitrogen) vector was used, and a heavy chain expression plasmid was made using pcDNA3.3 (Invitrogen) vector.
  • variable region coding cDNA and constant region coding cDNA of each antibody in order to express the variable region coding cDNA and constant region coding cDNA of each antibody as a continuous amino acid sequence without additional amino acid insertion, the coding nucleic acid sequence of the cloned variable region (see Table 1) and the known human IgG4 constant region (heavy chain; Each of the genes linking the encoding nucleic acid sequence of GenBank_AIC59040.1) or the encoding nucleic acid sequence of the kappa constant region (light chain; GenBank_AAA58989.1) was synthesized (Bioneer). The "CPSCP" sequence of the middle hinge region of the light chain constant region was further modified with "CPPCP" as in the IgG1 isotype to prevent antibody shuffling.
  • the synthesized heavy and light chain expression genes were cut with restriction enzymes Xho I and Sal I, and then the light chain expression gene was ligated to the pOptiVec vector, and the heavy chain expression gene was ligated to the pcDNA3.3 vector to prepare a complete antibody expression plasmid. (pcDNA3.3-anti-ICAM-1 heavy chain expression plasmid and pOptiVEC-anti-ICAM-1 light chain expression plasmid).
  • the transformation process was performed by transfection of the produced pcDNA3.3-anti-ICAM-1 heavy chain expression plasmid and pOptiVEC-anti-ICAM-1 light chain expression plasmid into DG44 cells (Invitrogen) derived from CHO cells.
  • DG44 cells were cultured in MEMa medium containing 5% FBS to induce adherent cells. Transformation was performed in a 6well plate using ViaFect transfection regent (Promega, Cat.#: E4981).
  • ViaFect transfection regent Promega, Cat.#: E4981.
  • DG44 cells adapted to adherence were prepared by passage culture at a concentration of 1 X 10 5 cells/well, and the amount of DNA used for transformation was pcDNA3.3-anti-ICAM-1 heavy chain expression plasmid and pOptiVEC.
  • -anti-ICAM-1 light chain expression plasmids were used in combination of a 1:2 ratio of 1.0 ⁇ g and 2.0 ⁇ g, respectively. Transformation was performed for 48 hours.
  • the transformed cell population was analyzed using a flow cytometer, and the results are shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, it is possible to confirm the binding phenomenon of the ICAM-1 expressing cell line of the chimeric antibody obtained by inserting the variable region coding gene of the mouse SI9 antibody into the constant region coding gene of the human antibody.
  • CDRH1 GYTFTDYA (SEQ ID NO: 1)
  • CDRH2 ISTYSGNT (SEQ ID NO: 2)
  • CDRH3 ARSLYFGSSGFDY (SEQ ID NO: 3)
  • CDRL1 QTLVYRNGNTY (SEQ ID NO: 4)
  • CDRL2 KVS (SEQ ID NO: 5)
  • CDRL3 SQNTHFPYT (SEQ ID NO: 6)
  • humanized antibody sequence recombining germline framework region encoding human antibody gene was selected by the in silico method.
  • Selected antibody sequences were expressed in HEK293 cells (ATCC CRL-1573) in human IgG4 form by connecting to human IgG4 heavy chain constant region and kappa light chain constant region, respectively.
  • the humanized recombinant antibody was purified from the culture medium using KanCap A resin (Kaneca).
  • the purified antibody was quantified by measuring the optical density (OD) at 280 nm, and the results are shown in FIGS. 2A to 2D. As shown in Figures 2a to 2d, most of the antibodies prepared regardless of the type of heavy and light chains combined showed relatively high productivity.
  • the peak symmetry factor was measured by performing a size exclusion HPLC (SE-HPLC) analysis using a Sepax Zenix-C SEC-300 size exclusion column (Sepax technologies). The obtained results are shown in FIGS. 3A to 3D.
  • SE-HPLC size exclusion HPLC
  • FIGS. 3A to 3D When a high purity antibody is analyzed by SE-HPLC, it is observed as one symmetric peak, but when a heterogeneous polymer/small molecule is included, two or more peaks are observed or a symmetric peak factor is observed low.
  • 3A to 3D in most cases, the anti-ICAM-1 humanized antibody exhibited a relatively high symmetric peak factor.
  • humanized antibodies that exhibit resistance to thermal denaturation were selected by leaving the antibody under severe conditions of high temperature and observing changes in physical properties.
  • ANS 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid
  • Example 96 kinds of humanized recombinant antibodies prepared in Example 2-1 were regularly diluted to a concentration of 0.2 mg/ml using phosphate buffered saline (PBS), and allowed to stand at a high temperature (61° C.) for a suitable time (1 hour).
  • 20 uL of 0.2 mg/ml ANS solution was added to 200 uL of the antibody sample, and the mixture was reacted for 15 minutes, and then analyzed under 360 nm excitation and 460 nm emission conditions.
  • the 460 nm wavelength emitted by the ANS reaction was measured with a fluorometer (BioTek, SynergyHT) and relative evaluation based on H1L1 antibody (100%) is shown in FIGS. 4A to 4D.
  • the 470 nm fluorescence emission by ANS was shown to increase rapidly, and was confirmed to be somewhat denatured by heat, but other antibodies showed relatively heat stability.
  • FIGS. 2A-2D, 3A-3D, and 4A-4D a total of 47 humanized antibodies showing relatively high antibody productivity, relatively high peak symmetry factor, and/or relatively high thermal stability under high temperature (61°C) conditions 1 It was selected by car (see FIG. 5).
  • the 47 humanized antibodies are constantly diluted to a concentration of 0.2 mg/ml, left at a high temperature of 67° C. for 1 hour, ANS reactivity is measured, and relative reactivity based on H1L1 antibody is shown in FIG. 5. It is shown in. Compared to the ANS reactivity at 61°C (4a to 4d), the ANS reactivity at 67°C tended to be somewhat higher, but the six humanized antibodies of the combination of H17L1, H4L3, H5L3, H11L3, H17L3, and H17L4 ( Table 7) exhibited relatively low ANS reactivity and were evaluated as antibodies with high resistance to heat denaturation.
  • Antigen ICAM-1 (ICAM-1; manufactured by R&D system) was coated on a 96 well plate at 100 ng per well, and then blocked. The primary antibody amount was serially diluted from 80 ng/ml twice and bound for 1 hour at a temperature of 37°C. As a secondary antibody, the goat anti-Human Ig-HRP conjugate (Jackson ImmunoResearch) was diluted 1:10000 to 30 at a temperature of 37°C. Combined for a minute. Each step was subjected to a washing process three times and reacted with TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine). After the reaction was stopped by treating the same amount (100ul) with the TMB solution with 1N H 2 SO 4 solution, the OD value was measured at 450 nm.
  • TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
  • the binding ability of the parent antibody obtained as described above and the five humanized recombinant antibodies to the ICAM-1 antigen is shown in FIGS. 6 and 8.
  • the melting temperatures of the humanized antibodies H17L1 and H17L4 showing stable physical properties were compared with the parent antibody (chimeric antibody; see Example 1.3) to evaluate stability.
  • Protein thermal shift dye (Lifetechnologies, #4466038) was added to the antibody sample to prepare a reaction sample, and the temperature was continuously increased from 25°C to 95°C to induce degeneration of the antibody sample. Antibody denaturation was confirmed by measuring the 623 nm wavelength emitted from the protein thermal shift dye by irradiating the reaction solution with a wavelength of 580 nm, and analyzing the melting temperature with ViiA TM 7 software. The results obtained above are shown in Table 9 below and in Figures 7a (chimeric parent antibody), 7b (H17L1) and 7c (H17L4):
  • melting temperature 1 was similarly measured at about 67°C for all three antibodies including the chimeric parent antibody, but melting temperature 2 was higher than 10°C in two humanized antibodies compared to the chimeric parent antibody. This means that two humanized antibodies have strong resistance to thermal denaturation compared to chimeric parent antibodies.
  • Octet system (ForteBio) was used to compare the affinity of H17L1 and H17L4 humanized antibodies for antigen with the parent antibody.
  • Three antibodies were attached to Amine reactive Bio-sensor AR2G (ForteBio) and 5 concentrations of ICAM-1 antigen solution were added to induce an antigen/antibody reaction.
  • binding constant (Kon) and dissociation constant (Koff) were measured, and affinity (KD) was calculated, and the results are shown in Tables 10 and 8:
  • the affinity (KD) of the chimeric parent antibody was measured to be 1.03 X 10 -8 M, and H17L1 and H17L4 humanized antibodies were 3.43 X 10 -9 and 3.62 x 10 -9 M, respectively. As measured by, it was possible to confirm the improved affinity in the humanized antibody.
  • peripheral blood mononuclear cells were treated with the DNP007 antibody (H17L4 antibody) prepared in Example 3 above, and the representative pro-inflammatory cytokine IFN-gamma secretion was measured. Did.
  • Blood was collected from normal volunteers, and peripheral blood monocytes were isolated with Ficoll-Paque Plus (GE healthcare, #17144002). Peripheral blood mononuclear cells isolated in 10% FBS-added RPMI medium were suspended, and GM-CSF (Creagene) and IL-4 (Creagene) were added at a concentration of 100 ng/ml to allow dendritic cells to differentiate from monocytes. DNP007 antibody was added to peripheral blood monocytes at a concentration of 10.0 ug/ml.
  • Ficoll-Paque Plus GE healthcare, #17144002
  • Peripheral blood mononuclear cells isolated in 10% FBS-added RPMI medium were suspended, and GM-CSF (Creagene) and IL-4 (Creagene) were added at a concentration of 100 ng/ml to allow dendritic cells to differentiate from monocytes.
  • DNP007 antibody was added to peripheral blood monocytes at a concentration of 10.0 u
  • DNP007 antibody to monocytes, which are dendritic cell progenitor cells
  • monocytes which are dendritic cell progenitor cells
  • the isolated peripheral blood mononuclear cells were cultured for 2 hours in a culture dish to induce adhesion to the culture dish, and then divided into adherent cells and suspended cells, respectively, to divide GM-CSF and IL -4 was added at a concentration of 100 ng/ml, respectively, and DNP007 antibody (10.0 ug/ml) was added together.
  • peripheral blood monocytes, adherent cells, and suspended cells were washed and Lipopolysaccharides (LPS, Sigma-Aldrich, #L2630) were added at 5.0 ug/ml to culture.
  • LPS Lipopolysaccharides
  • the next day's culture was taken to measure the concentration of IFN-gamma secreted by Human IFN gamma Uncoated ELISA kit (Invitrogen, #88-7316-77).
  • Peripheral blood monocytes, adherent cells and suspended cells showed a marked decrease in INF-gamma secretion in the sample group treated with DNP007 antibody in all conditions (Table 11). These results were understood as a phenomenon in which the DNP007 antibody inhibits the immune cell activation mechanism by LPS.
  • human peripheral blood mononuclear cells are separated and divided into 5 types of peripheral blood groups and divided into 100 ng groups as follows. /ml GM-CSF and 100ng/ml IL-4 were added, and cells were cultured for 6 days under the condition of adding 10 ug/ml of DNP007 antibody to obtain cells, and the cells were cultured on the 6th day for induction into mature dendritic cells.
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by performing a concentration gradient centrifugation with blood of healthy volunteers using Ficoll-Paque (GE Healthcare).
  • CD14+ monocyte-derived dendritic cells CD14+ monocytes from human peripheral blood mononuclear cells isolated by performing concentration gradient centrifugation with Ficoll-Paque (GE Healthcare) from healthy volunteers using magnetic separation (using magnetic beads) Separated.
  • CD14 deplete PBMC CD14+ monocytes of (2) were separated by magnetic separation (using magnetic beads) and the remaining peripheral blood population was used.
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells separated by performing a concentration gradient centrifugation with Ficoll-Paque (GE Healthcare) in healthy volunteers' blood were added to RPMI medium with 10% FBS for 2 hours at 37°C, 5 After attaching the cells in the% CO 2 incubator, the supernatant (including floating cells) was removed and only the attached cells were separated.
  • Ficoll-Paque GE Healthcare
  • FIG. 9 The results are shown in FIG. 9. As shown in FIG. 9, dendritic cells differentiated from CD14+ monocytes alone (A) and peripheral blood populations not containing CD14+ monocytes (B) showed similar gene expression profiles to the control group not treated with DNP007. On the other hand, in the condition where CD14+-derived dendritic cells are not present alone, but in which several other immune cells are present (C, D, E), the expression pattern of the gene was significantly different from that of the control group not added when DNP007 was added.
  • FIGS. 12A and 12B are schematic diagrams of cytokines among distinct genes.
  • cytokine gene expression is inhibited by DNP007 antibody treatment.
  • the ICAM-1 antibody DNP007 proposed in this specification is not limited to dendritic cells, but affects the process of contact between dendritic cells and other immune cells or cross-reaction between cells, through which It can be seen that the response gene expression is regulated, resulting in an immunosuppressive response.
  • sample administered with DNP007 antibody was also remarkably immune cytokine protein as shown in FIG. 14, even when it was separated into normal human blood and differentiated into dendritic cells, and when LPS treatment was induced by co-culture with T cells of the same person, LPS treatment was induced. Expression inhibition at the level was confirmed.
  • CD80 Invitrogen, Catalog# 11-0809-42
  • CD86 BD, Catalog# 555657
  • CD40 BD, Catalog# 555588
  • CD54 BD, Catalog# 347977
  • HLA-DR BioLegend, Catalog# 307616
  • each obtained factor (Mean of Fluorescent Intensity, MFI) was converted to a relative value for the group treated with LPS only, and is shown in FIG. 15. 15, in the case of dendritic cells treated with a control antibody (hIgG), expression of cofactors such as CD80, CD54, CD40, and HLA-DR was increased by LPS stimulation, but the test antibodies DNP007 and LPS were increased. In the group treated together, it was confirmed that the expression of these cofactors was significantly reduced.
  • human peripheral blood monocytes isolated from peripheral blood are cultured for 5 days with GM-CSF and IL-4 to differentiate into dendritic cells, and LPS After inducing maturation by incubating the same stimulating factor and incubating for 24 hours, the amount of inflammatory cytokines in the culture medium was analyzed to measure the maturity of dendritic cells.
  • human peripheral blood monocytes were isolated using a cell collection device (Miltenyi Biotec. Cat. 000403).
  • Differentiation was induced into immature dendritic cells (immature DC) for 5 days by adding 10% FBS-containing RPMI culture treated with GM-CSF and IL-4 at a concentration of 100 ng/ml, respectively.
  • immature dendritic cells Immature DC
  • FBS-containing RPMI culture treated with GM-CSF and IL-4 at a concentration of 100 ng/ml, respectively.
  • 5 ug/ml of LPS was added and stimulation of dendritic cells (mature DC) for 24 hours was induced to differentiate into mature dendritic cells.
  • Antibodies DNP007 H17L4 antibody
  • control antibody hIgG, provided herein
  • inflammatory cytokines in culture Proinflammatory cytokine
  • IL-6 and TNF-a were analyzed using ELISA technique.
  • Dendritic cell maturation refers to a process in which dendritic cells acquire an ability as antigen-presenting cells, and mature dendritic cells function to induce the activity of antigen-specific T cells.
  • the degree of death of dendritic cells differentiated and matured for 6 days according to the antibody treatment was measured.
  • the degree of apoptosis was confirmed by flow cytometry after 7AAD staining.
  • human peripheral blood monocytes were isolated using a cell collection device (Miltenyi Biotec. Cat. 000403). Differentiation was induced to immature dendritic cells (immature DC) for 5 days by adding RPMI culture containing 10% FBS treated with GM-CSF and IL-4 at a concentration of 100 ng/ml, respectively. On day 5 of culture, 5 ug/ml of LPS was added, and mature dendritic cells were differentiated by stimulating dendritic cells (mature DC) for 24 hours.
  • the antibody DNP007 H17L4 antibody
  • the control antibody hIgG
  • 7AAD 7-Amino-Actinomycin D, BD, 51-68981E 5ul/test
  • the apoptotic effect of dendritic cells by the test antibody may be evaluated as apoptosis.
  • the antibody DNP007 H17L4 antibody
  • the control antibody hIgG
  • the dendritic cell differentiation induction process was added twice at a concentration of 5.0 ug/mL on day 0 and 3, and on the 6th day after induction of differentiation, expression of the dendritic cell marker factor for immune tolerance was confirmed by a flow cytometer.
  • Cell fluid substances IDO Indoleamine 2,3-Dioxygenase; Invitrogen, Catalog# 12-9477-42
  • TGF- ⁇ R&D systems, Catalog# IC240P
  • IL-10 Miltenyi biotec, Catalog# 130-112-729
  • IC Fixation buffer Invitrogen, Catalog# 00-8222-49
  • 1x Permeabilization buffer (Invitrogen, Catalog# 00-8333-56) was added, centrifuged at 600 g for 5 minutes, and the supernatant was removed. The remaining cell pellet was prepared by adding the appropriate concentration of each antibody to 100 ul of 1x Permeabilization buffer, treated with cells, blocked the light at room temperature, and reacted for 30 minutes. 2 mL of 1x Permeabilization buffer was added, washed by centrifugation at 600 g for 5 minutes, and 2 ml of flow cytometry buffer was added and centrifuged to perform further washing. Cells were fixed by adding 1% paraformaldehyde, and the expression level of each antigen was analyzed using a flow cytometer.
  • FIGS. 18A and 18B The obtained results are shown in FIGS. 18A and 18B.
  • the test antibody DNP007-treated dendritic cells showed a significant increase in expression of IDO, a representative factor for immune tolerance, compared to the control antibody-treated dendritic cells (control), and other immunosuppressive factors.
  • the expression levels of known PDL1, PDL2 and adenosine R A2b were also increased compared to the control group.
  • the expression of some factors related to IDO and immune tolerance increased.
  • IDO expressed in dendritic cells is known to inhibit the proliferation of T cells and play an important role in immune tolerance.
  • increased IDO expression by the antibodies provided herein suggests a high likelihood that immune tolerance will be induced.
  • LPS and CD40L were used to induce maturation of dendritic cells.
  • IDO a dendritic cell marker for immune tolerance
  • Example 5-2 or 5-3 stimulation by LPS known as the Canonical pathway was performed under the same conditions as in Example 5-2 or 5-3 to prepare and test semi-mature dendritic cells that have undergone differentiation and maturation processes for 6 days.
  • CD40L In the stimulation test by CD40L, known as the non-canonical pathway, immature dendritic cells differentiated for 5 days with 10% FBS containing RPMI culture treated with GM-CSF and IL-4 at a concentration of 100 ng/ml were used. On the 5th day after cultivation, 1 ug/ml of CD40L (Enzo, ALX-522-110) was added to 10% FBS containing RPMI treated at a concentration of 100 ng/ml of GM-CSF and IL-4 to give 48 hours of stimulation. Mature dendritic cells (mature DC) were induced.
  • CD40L Enzo, ALX-522-110
  • the antibody DNP007 H17L4 antibody
  • the control antibody hIgG
  • Treatment On the seventh day of induction of differentiation, mature dendritic cells (Mature DC) were stained using the intracellular antigens mentioned above (Staining intracellular Antigens) and analyzed using a flow cytometer.
  • 19A and 19B the test antibody DNP007 induces a decrease in the expression of IDO in cells during the process of maturation of dendritic cells by CD40L, whereas maturation of dendritic cells by LPS shows a large difference in IDO expression between individuals.
  • the dendritic cell maturation pathways include the classical pathway induced by LPS and TNF-a stimulation and the non-classical pathway induced by CD40L.
  • the results show that the antibodies provided herein affect both dendritic cell maturation pathways, in particular limiting maturation by CD40L and inducing differentiation into immune-tolerant dendritic cells.
  • the dendritic cells and T cells are used.
  • the cells were cultured under isolated conditions, and the activity of T cells was inhibited.
  • CD3 microbead Motenyi, 130-050-201
  • human T cells isolated using a cell collection device and obtained under the same conditions as Examples 5-1 to 5-5 were obtained.
  • Mature dendritic cells Mature DC
  • autologous T cells were subjected to CFSE labeling as a condition to confirm proliferation.
  • differentiated dendritic cells were put by treating the antibody DNP007 (H17L4 antibody) provided herein.
  • the two cells were cultured for 4 days while sharing the culture medium in each chamber.
  • the number of dendritic cells and autologous T cells was treated at a ratio of 1:10.
  • FIG. 20 The obtained results are shown in FIG. 20.
  • proliferation was inhibited by the test antibody-treated dendritic cells, and the production of inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-r) was reduced.
  • IFN-r inflammatory cytokine interferon gamma
  • the activity and proliferation of T cells was confirmed under conditions in which dendritic cells and T cells were cultured together.
  • the maturation of dendritic cells was induced using LPS, TNF-a and CD40L, which are stimulators of two known mature pathways, and the proliferation of T cells and the expression level of inflammatory cytokines in the cells were measured.
  • dendritic cell maturation was induced using two known pathways (Canonical pathway: LPS, TNF-alpha/Non-canonical pathway: CD40L), respectively.
  • Stimulation with LPS and CD40L was performed in the same manner as in Example 5-5, and stimulation with TNF-alpha was 100 ng/ GM-CSF and IL-4 on Day 5, respectively, in the state induced by immature dendritic cells.
  • TNF-a 13 ng/ml, IL-1 ⁇ 10 ng/ml, and PGE2 350 ng/ml were treated with 10% FBS containing RPMI treated at ml concentration, and stimulated for 48 hours to differentiate into mature dendritic cells (mature DC). Proceeded.
  • the antibody DNP007 (H17L4 antibody) and the control antibody (hIgG) provided herein were treated twice at a concentration of 5.0 ug/ml on day 0 and 3 during the process of inducing dendritic cell differentiation.
  • T cells To induce the activity of T cells, 1 ⁇ g/ml of anti-CD3 antibody was added to the plate with mature dendritic cells and autologous T cells differentiated in the same manner as above. The expression level of inflammatory cytokines in the cells was measured. At this time, CFSE labeling was performed to confirm the proliferation of T cells.
  • T cells cultured with dendritic cells treated with a control antibody showed vigorous cell proliferation, and highly expressed IFN- ⁇ and IL-10, which are representative of inflammatory cytokines.
  • T cells cultured with dendritic cells with limited maturation by treatment with test antibody DNP007 inhibited proliferation despite stimulation by anti-CD3 antibody and markedly reduced inflammatory cytokine secretion.
  • T cells sensitized by dendritic cells have been shown to limit proliferation and expression of inflammatory cytokines. That is, the semi-mature dendritic cells induced by the antibodies provided herein suppress the activity and proliferation of T cells.
  • graft-versus-host disease is one of the side effects of transplanted patients (recipients) when transplanting allogeneic organs (e.g., bone marrow), where donor T cells or NK cells don't It is a phenomenon that appears by attack.
  • allogeneic organs e.g., bone marrow
  • donor T cells or NK cells don't It is a phenomenon that appears by attack.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a graft-versus-host disease (GVHD) model was established by irradiating NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) female mice with 1.6 Gy and then injecting human PBMC.
  • Human PBMC was obtained by centrifugation using Ficoll (GE Healthcare, 17544202) in a Leucosep TM tube (Greiner bio-one, 227290) and separating the intermediate white layer.
  • the isolated human PBMCs were administered intraperitoneally at 1 ⁇ 10 7 cells/200 ⁇ L per mouse.
  • the test group was prepared by administering the antibody DNP007 (H17L4 antibody) provided herein at a dose of 10 mg/kg twice a week for 6 weeks, and CTLA-4-Ig (Bio X cell, BE0099) 10 mg/kg
  • a positive control group was prepared by administering 12 doses twice a week for 6 weeks in total.
  • the measurement of GVHD induction and treatment effect was recorded by scoring five clinical criteria (weight loss, behavior, activity, hair loss, skin; weight loss, posture, activity, fur, skin).
  • FIGS. 23A and 23B The obtained results are shown in FIGS. 23A and 23B.
  • the test group (G4) administered with the antibody provided in the present specification significantly improved the survival rate than the negative control group G2 (FIG. 23A), and that human T cells were reorganized normally (FIG. 23B).
  • the antibody provided herein has an effect of preventing graft-versus-host disease occurring during allogeneic bone marrow transplantation and enabling re-establishment of normal donor T cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

ICAM-1에 특이적으로 결합하는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능 조절용 약학 조성물 및 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

ICAM-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
ICAM-1에 특이적으로 결합하는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능 조절용 약학 조성물 및 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
수지상 세포(Dendritic cell, DC)는 다양한 면역 반응을 통합시키는 고도의 특성화된 항원 제시 세포이며, 면역의 개시 및 면역 관용과 관련된 항원 제시 세포의 이종 패밀리를 포함한다. 현재까지, 미성숙 수지상 세포는 T 세포를 면역성 결여 (anergy) 상태로 유도하고, 지질다당류 (lipopolysaccharide; LPS)와 같은 활성 자극제에 의해 성숙 수지상 세포로 형질전환된 수지상 세포는 일차 T 세포 반응을 유도한다. 또한, 독특한 사이토카인 생산 프로파일을 가진 준성숙된 수지상 세포는 면역관용성 기능을 부여할 수 있다.
ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1)은 도메인 1 내지 도메인 5 로 명명되며 N 말단에서 C 말단 방향으로 번호가 매겨진 다섯 개의 세포외 면연글로불린 수퍼패밀리 도메인, 세포막투과 영역, 및 세포내 영역으로 구성된, 90 kDa의 타입 I 세포 표면 당단백질이다.
ICAM-1은 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호작용과 같은 백혈구/백혈구 상호작용을 매개한다. 또한, 염증 과정 동안 조직으로의 백혈구 유출을 매개한다. 인 비트로 연구에 의하여, ICAM-1/백혈구 기능 관련 항원-1(leukocyte function antigen-1, LFA-1)의 상호작용을 방해하는 항체가 T 세포의 내피 세포로의 부착을 방해할 수 있으며, 이들 항체들에 의해 T 세포 활성화 또한 혼합 림프구 내에서 유의적으로 감소할 수 있음이 제시되었다(Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85:3095-3099). 인간 ICAM-1의 도메인에 결합하는 마우스 단일클론 항체인 R6-5-D6(enlimomab)을 사용한 원숭이 연구에서는, 신장 동종이식편 생존율이 증가하였고 이식편 내로의 T 세포 침투가 대조군과 비교하여 감소하였다(J Immunol. 1990, 144:4604-4612). 또한, 엔리모맙(enlimomab)은 류마티스성 관절염 환자에서 질환 활성을 억제시키는 효과가 있음이 입증되었다(Arthritis Rheum. 1994, 37:992-999; J Rheumatol. 1996, 23:1338-1344). 그러나, 신장 이식 후의 엔리모맙 유도 치료는 급성 거부반응의 비율 또는 이식편 기능 지연의 위험을 감소시키는데 큰 효과가 없다. 또한, 엔리모맙은 T 세포뿐만 아니라 호중구의 혈관 내피 세포로의 부착을 차단하는 기능을 하며, 따라서 호중구의 이동을 방해하는 것은 잠재적으로 감염에 대한 감수성을 증가시킨다고 보고되었다(J Immunol. 1999, 162:2352-2357).
ICAM-1에 특이적으로 결합하여 수지상 세포의 분화 및 기능을 조절하여 보다 효과적으로 면역 반응을 조절할 수 있는 물질의 개발이 필요하다.
일 예는 ICAM-1을 특이적으로 인식하는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 (GYTFTDYA)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (ISTYSGNT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 3 (ARSLYFGSSGFDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4 (QTLVYRNGNTY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5 (KVS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 6 (SQNTHFPYT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7 및 11 내지 34로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8 및 35 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 예는 항 ICAM-1 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 ICAM-1 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 ICAM-1 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 면역세포 매개성 질환일 수 있다. 다른 예는 상기 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예는 상기 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, 면역세포 매개성 질환은 이식거부, 이식편대숙주질환, 천식, 자가면역질환 등에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 수지상 세포의 분화 및 기능의 조절을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 다른 예는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수지상 세포의 분화 및/또는 기능의 조절 또는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 ICAM-1을 특이적으로 인식하는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이들의 용도가 제공된다.
상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ICAM-1의 도메인 중 도메인 2를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ICAM-1에 대하여 억제 활성을 갖는 길항제 (antagonist)일 수 있다. 그러나, 상기 항체는 항원인 ICAM-1의 리간드인 LFA-1과의 결합 부위인 ICAM-1의 도메인 1 이 아니라 도메인 2 에 결합함으로써, ICAM-1/LFA-1 결합 자체는 저해하지는 않는다. 이는 상기 항체가 T 세포의 transmigration을 저해하지 않는다는 점을 통해 확인될 수 있다. 상기 항체는, 관용 수지상 세포로 분화를 유도하여 기능적으로 면역 억제를 유도한다는 점과 수지상 세포와 T 세포와의 공동배양에서 T 세포의 면역활성을 억제한다는 점에서 T 세포 활성 전달을 위한 면역 시냅스의 공간적 기능 활성화 및 관련 단백질 간의 결합 및 재편성에 잠재적으로 영향을 끼칠 수 있다. 이러한 점에서 상기 항체는 리셉터-리간드 결합을 물리적으로 억제하기보다 기능적으로 ICAM-1 활성을 억제하는 길항제일 수 있다. 또한, 상기 항체는 상기한 활성에 의하여 결과적으로 리간드를 포함하는 T 세포의 면역활성을 억제하는 결과를 유도하는 것일 수 있다. 다시 말하면, 본 명세서에서 제공되는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ICAM-1 (예컨대, 인간 ICAM-1)의 도메인 2에 결합하고, 항원 특이적 T-세포 내성을 유도함으로써, 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 억제하고, 면역세포-매개 질환에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.
ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1)은 CD54 (Cluster of Differentiation 54)이라고도 불리며, 내피세포 또는 면역계 세포 상에 발현되는 세포표면 당단백질이다.
본 명세서에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 ICAM-1은 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대 인간 ICAM-1 (예컨대, NCBI accession numbers NP_000192.2 등), 원숭이 ICAM-1 (예컨대, NCBI accession numbers NP_001266532 등) 일 수 있다. 일 예에서, 상기 항체는 인간 ICAM-1와 원숭이 ICAM-1에 교차반응성을 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질 또는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로, 상기 물질 또는 단백질을 기초로 재조합적 또는 합성적으로 생산된 단백질도 포함하는 개념으로 사용된다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
또한 본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 모든 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 "상보성 결정부위 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 항체 단편일 수 있다.
일 예는 ICAM-1을 특이적으로 인식 또는 ICAM-1에 특이적으로 결합하는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 (GYTFTDYA)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (ISTYSGNT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 3 (ARSLYFGSSGFDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4 (QTLVYRNGNTY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5 (KVS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 6 (SQNTHFPYT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중쇄 가변영역에서,
중쇄 프레임워크 1 (VH-FR1; CDRH1의 N-말단 인접부위)은 서열번호 97 (QVQLX1QSGAEX2X3X4PGX5SVKX6SCKX7S; X1은 Q 또는 V, X2는 L 또는 V, X3은 V 또는 K, X4는 R 또는 K, X5는 V 또는 A, X6은 I 또는 V, X7은 G 또는 A) 또는 서열번호 98 (QVQLX8QSGAEVX9KPGASVKX10SCKX11S; X8은 V 또는 Q, X9는 K 또는 V, X10은 I 또는 V, X11은 G 또는 A)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 및 48 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고,
중쇄 프레임워크 2 (VH-FR2; CDRH1의 C-말단과 CDRH2의 N-말단 사이의 부위)는 서열번호 99 (LHWVX12QX13X14X15X16X17LEWX18GV; X12는 K 또는 R, X13은 S 또는 A, X14는 H 또는 P, X15는 A 또는 G, X16은 K 또는 Q, X17은 S 또는 R, X18은 I 또는 M) 또는 서열번호 100 (LHWVX19QAPGQX20LEWX21GV; X19는 R 또는 K, X20은 R 또는 S, X21은 I 또는 M)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 54, 및 55 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고,
중쇄 프레임워크 3 (VH-FR3; CDRH2의 C-말단과 CDRH3의 N-말단 사이의 부위)은 서열번호 101 (X22YX23QKFX24GX25X26TX27TX28DX29SX30X31TAYX32ELX33X34LX35SEDX36AX37X38YC; X22는 D 또는 K, X23은 N 또는 S, X24는 R 또는 Q, X25는 K 또는 R, X26은 A 또는 V, X27은 M 또는 I, X28은 V 또는 R, X29는 K 또는 T, X30은 S 또는 A, X31은 T 또는 S, X32는 L 또는 M, X33은 A 또는 S, X34는 R 또는 S, X35는 T 또는 R, X36은 S 또는 T, X37은 I 또는 V, X38은 H 또는 Y) 또는 서열번호 102 (X39YX40QKFX41GX42X43TX44TX45RX46SAX47TAYX48ELSSLRSEDTAX49X50YC; X39는 D 또는 K, X40은 N 또는 S, X41은 R 또는 Q, X42는 R 또는 K, X43은 A 또는 V, X44는 I 또는 M, X45는 R 또는 V, X46은 T 또는 K, X47은 S 또는 T, X48은 M 또는 L, X49는 V 또는 I, X50은 Y 또는 H)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 및 80 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 및/또는
중쇄 프레임워크 4 (VH-FR4; CDRH3의 C-말단과 인접한 부위)는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변영역에서,
경쇄 프레임워크 1 (VL-FR1; CDRL1의 N-말단 인접부위)은 서열번호 103 (DVVLTQX51PLSX52PVX53LGX54X55ASISCRSS; X51은 T 또는 S, X52는 L 또는 S, X53은 N 또는 T, X54는 D 또는 Q, X55는 Q 또는 P) 또는 서열번호 104 DVVLTQX56PLSX57PVTLGQPASISCRSS; X56은 S 또는 T, X57은 L 또는 S)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 82, 83, 및 84 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고,
경쇄 프레임워크 2 (VL-FR2; CDRL1의 C-말단과 CDRL2의 N-말단 사이의 부위)는 서열번호 105 (LHWYX58QX59X60GQX61PX62LLIX63; X58은 L 또는 Q, X59는 K 또는 R, X60은 A 또는 P, X61은 S 또는 P, X62는 K 또는 R, X63은 Y 또는 존재하지 않음)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 85, 86, 87, 88, 및 89 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고,
경쇄 프레임워크 3 (VL-FR3; CDRL2의 C-말단과 CDRL3의 N-말단 사이의 부위)는 서열번호 106 (NRFSGVPDRFSGSGX64GTDFTLKISRVEAEDX65GVYFC; X64는 S 또는 A, X65는 L 또는 V)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 90, 91, 및 93 중에 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 및/또는
경쇄 프레임워크 4 (VL-FR4; CDRL3의 C-말단과 인접한 부위)는 서열번호 107 (FGGGTKX66X67X68X69X70; X66은 I 또는 L, X67은 K 또는 E, X68은 R 또는 I, X69는 Q 또는 K, X70은 R 또는 존재하지 않음)의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 93 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 97 또는 98 (예컨대, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48)의 아미노산 서열을 포함하는 VH-FR1, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 99 또는 100 (예컨대, 서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55)의 아미노산 서열을 포함하는 VH-FR2, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 서열번호 101 또는 102 (예컨대, 서열번호 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80)의 아미노산 서열을 포함하는 VH-FR3, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3, 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-FR4를 포함하고;
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 103 또는 104 (예컨대, 서열번호 82, 83, 또는 84)의 아미노산 서열을 포함하는 VL-FR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 105 (예컨대, 서열번호 85, 86, 87, 88, 또는 89)의 아미노산 서열을 포함하는 VL-FR2, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 서열번호 106 (예컨대, 서열번호 90, 91, 또는 93)의 아미노산 서열을 포함하는 VL-FR3, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3, 및 서열번호 107 (예컨대, 서열번호 93 또는 94)의 아미노산 서열을 포함하는 VL-FR4를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7 및 11 내지 34로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8 및 35 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등을 활용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체) 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편에 있어서, 서열번호 1 내지 3의 중쇄 CDR을 제외한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역은 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE), 예컨대, 인간 면역글로불린(IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)으로부터 유래한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역일 수 있고, 서열번호 4 내지 6의 경쇄 CDR을 제외한 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역은 카파(κ) 또는 람다(λ) 타입의 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분, 예컨대, CDR을 포함하는 항체의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있다.
Fab은 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중가닥 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단일가닥 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
상기 항 ICAM-1 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 ICAM-1 항체는 이용해서 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 ICAM-1와의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석 또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론 항체 멤버들에 대해 ICAM-1에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정할 수 있다.
또 다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 면역세포 매개성 질환일 수 있다. 다른 예는 상기 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예는 상기 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 면역세포 매개성 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, 면역세포 매개성 질환은 면역세포와 관련된 모든 질병 중에서 선택될 수 있다. 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, 수지상세포 (dendritic cell), 대식세포 (macrophage), 단핵구(monocyte) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 면역세포 매개성 질환은 이식거부(예컨대, 동종세포이식, 동종장기이식, 이종세포이식, 이종장기이식시 발생하는 거부반응), 이식편대숙주질환 (예컨대, 동종 골수 이식시 발생하는 이식편대 숙주질환 등), 천식, 비만, 제2형 당뇨병, 자가면역질환 (예컨대, 뇌척수염 (예컨대, 알러지성 뇌척수염), 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창 (루프스), 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 만성염증성 질환(예컨대, 염증성장질환(예컨대, 크론병, 궤양성 대장염)), 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 알러지 등), 면역세포 (예컨대, T 세포, B 세포, 수지상세포, 대식세포, 단핵구 등) 매개 염증 (예컨대, 대식세포 매개 염증 등), 상기 면역세포 매개 염증에 의하여 유발되는 염증성 질병, 등에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 수지상 세포의 분화 및 기능의 조절을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 다른 예는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수지상 세포의 분화 및/또는 기능의 조절 또는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 알르기니, 히스티딘, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바로서, "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분 (즉, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량 또는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 구체적으로 0.01 내지 100 mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다른 항암제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
한편, 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ICAM-1에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 ICAM-1를 검출 또는 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 ICAM-1의 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 ICAM-1의 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 ICAM-1이 존재하는 것으로 결정 (판단)할 수 있다. 따라서, 상기 검출 방법은, 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계 이후에, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 ICAM-1이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 생물 시료는 포유류, 예컨대 인간 (예컨대, 이식 예정 환자 또는 이식 받은 환자, 자가면역질환 환자 등)으로부터 얻은 (분리된) 세포, 조직, 체액, 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항 ICAM-1 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디), 이중 특이 항체, 또는 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다.
다른 예는 항 ICAM-1 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 ICAM-1 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항 ICAM-1 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 ICAM-1 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pQKX1, pQKX2, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO-S, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK, HEK293 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항 ICAM-1 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 임의로 배양 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 ICAM-1 의 도메인 2에 결합하고, 항원 특이적 T-세포 내성을 유도하는 특성을 가지며, 이로 인하여, 수지상 세포의 분화 및/또는 기능의 조절 및/또는 면역세포 매개성 질환에 대한 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에서 제조한 키메릭 항체 SI9가 ICAM-1 발현 세포주 Du145 세포에 결합하는 현상을 유세포분석기로 확인한 결과이다.
도 2a 내지 2d는 일 실시예에서 280nm에서 OD (optical density)를 측정하여 정제된 항체를 정량한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 3d는 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체에 대하여 size exclusion HPLC (이하 SE-HPLC) 분석을 실시하여 peak symmetry factor을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a 내지 4d는 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체를 61℃에서 1시간동안 방치하면서 ANS 시약에 의한 형광변화를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체를 67℃에서 1시간 방치하고 ANS 반응성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체의 ICAM-1 항원에 대한 결합력을 ELISA 시험으로 비교한 그래프이다 (y축: 450nm OD 값; x축: 항체 농도 (ng/ml)).
도 7a 내지 7c는 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체의 melting point를 보여주는 그래프이다 (7a: 키메릭 항체, 7b: H17L1, 7c: H17L4).
도 8는 일 실시예에 따라 얻어진 항 ICAM-1 항체의 결합상수(Kon)와 해리상수(Koff)를 측정하고 친화도(KD)를 보여주는 그래프이다.
도 9는 여러 가지 말초혈액 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 투여에 의한 유전자 발현 프로파일에 대한 변화를 보여 주는 heat map 그래프이다.
도 10은 여러 가지 말초혈액 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 투여에 의한 유전자 발현 프로파일에 대한 변화를 KEGG pathway에 대해 분석하여 보여주는 그래프이다 (-10log(adjusted p-value)).
도 11은 여러 가지 말초혈액 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 투여에 의한 유전자 발현 프로파일에 대한 변화를 GO Biological process 에 대해 분석하여 보여주는 그래프이다 (-10log(adjusted p-value)).
도 12a 및 12b는 여러 가지 말초혈액 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 투여에 의한 유전자 발현 프로파일에 대한 변화를 사이토카인 유전자들에 대한 증가, 감소로 분석하여 보여주는 그래프이다.
도 13은 여러 가지 말초혈액 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 투여에 의한 사이토카인의 변화를 단백질 수준에서 변화된 증가, 감소로 분석하여 보여주는 그래프이다.
도 14는 수지상세포와 자신의 T 세포 공동 배양 조건에서 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 투여에 의한 사이토카인의 변화를 단백질 수준에서 변화된 증가, 감소로 분석하여 보여주는 그래프이다.
도 15는 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포의 성숙 보조 인자 발현 정도를 보여주는 그래프이다.
도 16은 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포의 염증성 사이토카인 분비 정도를 보여주는 그래프이다.
도 17은 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포의 세포자멸사 정도를 보여주는 그래프이다.
도 18a 및 18b은 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포 표면 인자들의 발현 정도를 나타낸 그래프로서, 면역관용 수지상 세포 유도 여부를 보여준다.
도 19a 및 19b는 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포의 IDO (Indoleamine 2,3-Dioxygenase) 발현 정도를 보여주는 그래프로서, 19a는 Canonical pathway 결과를, 19b는 Non-canonical pathway 결과를 각각 보여준다.
도 20은 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포와 함께 배양된 T 세포의 증식 정도 및 염증성 사이토카인인 인터페론 감마(IFN-r)의 생성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 21은 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007 처리된 수지상 세포와 함께 배양된 T 세포의 염증성 사이토카인인 인터페론 감마(IFN-r)의 생성 정도 및 T 세포 증식 정도를 다양한 수지상 세 포 성숙 경로 (LPS 자극, TNF-a 자극, 및 CD40L 자극)에 따라서 보여주는 그래프이다.
도 22a 내지 22c는 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007의 류마티스 관절염 치료 효과를 류마티스 관절염 동물 모델에서 확인한 결과로서, 도 22a 및 22b는 항체 투여 전후의 관절염 점수를, 도 22c는 항-콜라겐 항체 수준 (22c)을 각각 보여준다.
도 23a 및 23b는 일 실시예에 따라 얻어진 인간화 항체 DNP007의 이식편대 숙주 질환 억제 효과를 이식편대 숙주 질환 동물 모델에서 확인한 결과로서, 도 22a는 생존률을, 도 22b는 T 세포 재정립 정도를 각각 보여준다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
<실시예 1> 마우스 항 ICAM-1 단클론 항체 제작
ICAM-1에 특이적인 항체를 개발하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
1-1: 마우스 면역
재조합 인간 ICAM-1 단백질(0.5 mg/ml; NCBI accession number NP_000192.2)을 동일 부피의 adjuvant(Invivogen, #vac-adx-10)와 혼합하여 면역물질을 제조하였다. 6 주령 Balb/c 암컷 마우스 복강(IP; intraperitoneal cavity)에 상기 제조된 면역물질 200 uL을 3주 간격으로 세 번 주입하였다.
1-2: 마우스 항 ICAM-1 단클론 항체의 제조
상기와 같이 면역화된 마우스의 비장을 절제하여 단일 세포 부유액을 수득하고 RPMI(GIBCO, #21875034)으로 2회 세척한 후, 0.4%(w/v) trypan blue(sigma)를 1:1(v/v)로 섞은 후 트립판 블루(Sigma-aldrich, #T8154) 염색법으로 세포수를 계수하였다. X63 mouse myeloma 세포주(ATCC CRL-1580)를 세척하고 계수하여 세포 융합 partner로 사용하였다.
상기 골수(myeloma) 세포와 비장세포는 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 미리 37℃로 예열한 50%(w/v) PEG(polyethylene glycol) 1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 약 1분 정도 정체시켰다가 RPMI 배지를 서서히 추가하여 단계적으로 희석하였다. 원심 분리한 후 1xHAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine)이 포함된 RPMI(20% FBS, hypoxanthine-aminopterin-thymidine; Gibco)에 부유시키고, 96-웰 플레이트에 150 uL/웰로 분주한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 융합 후 일정기간 HAT feeding을 진행하였고, 군락을 형성한 웰이 관찰되면 HT 배지(hypoxanthine, thymidine) 150 uL를 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다.
하이브리도마 배양 96-웰 플레이트에서 배양액 100 uL을 취하여 ICAM-1 반응성 여부를 확인하였다. ICAM-1(R&D system, #ADP4-050)을 1.0 ug(microgram)/ml 농도로 PBS에 희석한 뒤 100 uL/웰로 Nunc-immunoplate(Thermo, #439454)에 분주하고 37℃ 배양기에 1시간 보관하여 코팅하였다. 코팅액을 완전히 제거한 뒤 1X casein blocking solution (sigma-aldrich, #B6429)을 200 uL/웰로 분주하여 37℃ 배양기에 1시간 보관하여 블로킹하였다. Blocking solution을 완전히 제거한 뒤 하이브리도마 배양액을 100 uL/웰로 분주하고 37℃ 배양기에 1시간 보관하여 항원/항체 반응을 유도하였다. 배양액을 완전히 제거한 뒤 세척액(0.02% Tween 20 in PBS)으로 3회 세척하고 2차 항체 Goat anti-mouse IgG-HRP(Jackson, #)을 blocking solution에 1:10,000(v/v) 비율로 희석하여 100 uL/웰로 분주하고 37℃ 배양기에 30분 보관하여 2차 항체 반응을 유도하였다. 3회 세척하고 TMB (Thermo, #)을 80 uL/웰로 분주하여 발색을 유도한 뒤 1.0N 황산(H2SO4)을 첨가하여 반응을 종결하였다. 상기 얻어진 항-ICAM-1 항체가 세포표면에 발현한 ICAM-1을 인지하는지 확인하기 위하여 유세포분석을 추가적으로 실시하였다. ICAM-1을 발현하는 전립선암 세포주 Du145(ATCC, #HTB-81) 1 X 106 cell 에 배양액 100 uL을 첨가하고 상온에서 15분간 방치하여 항체결합을 유도하였다. PBS를 첨가하여 세척하고 2차 항체 Goat anti-Mouse IgG-FITC(Jackson, #)을 1:100(v/v) 비율로 PBS에 희석하여 100 ul 첨가한 뒤 상온에서 10분 반응하였다. 세척을 실시하여 미반응 2차 항체를 제거한 뒤 유세포분석기로 반응성을 확인하였다.
상기 기술한 시험방법과 같이 ICAM-1 항원에 결합하는 양성 항체를 1차적으로 선별하였고 Du145 세포주에 형광 염색이 가능한 단클론항체를 추가적으로 선별하였다. 이와 같이 선별된 단클론항체 (SI9로 명명)는 ICAM-1 단백질 항원에 높은 반응성을 나타내었으며 Du145 세포주 표면에도 효과적으로 결합하는 특성을 나타내었다.
<실시예 2> 키메릭 항-ICAM-1 단클론 항체 제작
2-1. 항-ICAM-1 항체 유전자 서열 클로닝
실시예 1에서 선별된 마우스 단클론항체 SI9의 유전자를 Mouse Ig-Primer Set (Millipore, Cat. #: 69831)을 이용하여 클로닝하였다. 실시예 1에서 개발한 단클론항체 SI9 생산 하이브리도마를 배양하고, 융합세포주로부터 total RNA를 추출하였다. Mouse Ig-Primer Set을 사용하여 추출한 RNA를 주형으로 PCR을 수행하고, 이를 pGem-T 벡터(Promega, Cat. #: A3600)에 삽입한 후, 시퀀싱을 통해 DNA 염기서열을 확인하였으며, IMGT site (www.imgt.org)를 통해 마우스 항체 유전자를 확인하였다. 분석된 SI9 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산 서열 및 코딩 핵산 서열을 표 1에 정리하였다:
Figure PCTKR2019018822-appb-T000001
2-2. 키메릭 항체 제조
상기 제작된 항-ICAM-1 마우스 항체 SI9의 아미노산 서열을 기초로, 항-ICAM-1 키메릭 항체를 제작하였다.
2-2-1. 플라스미드 제작
항-ICAM-1 키메릭 항체의 발현을 위하여, 중쇄 발현용 플라스미드와 경쇄 발현용 플라스미드를 각각 제작하였다. 경쇄 발현용 플라스미드는 pOptiVEC (Invitrogen 사) 벡터를 사용하였고, 중쇄 발현용 플라스미드는 pcDNA3.3 (Invitrogen 사) 벡터를 사용하여 제작하였다.
추가적인 아미노산 삽입 없이 항체 각각의 가변영역 코딩 cDNA와 불변영역 코딩 cDNA를 연속적인 아미노산 서열로서 발현되도록 하기 위하여, 상기 클로닝한 가변영역의 코딩 핵산 서열 (표 1 참조)과 알려진 human IgG4 불변영역(중쇄; GenBank_AIC59040.1)의 코딩 핵산서열 또는 kappa 불변영역(경쇄; GenBank_ AAA58989.1)의 코딩 핵산서열을 연결한 유전자 각각을 합성(Bioneer 사)하였다. 경쇄 불변영역 중 middle hinge 부위의 "CPSCP" 서열을 IgG1 isotype과 같이 "CPPCP"로 추가 변형하여 antibody shuffling을 방지할 수 있도록 하였다. 이와 같이 합성한 중쇄 및 경쇄 발현 유전자는 제한 효소 Xho I 과 Sal I으로 자른 후, 경쇄 발현 유전자는 pOptiVec 벡터에, 중쇄 발현 유전자는 pcDNA3.3 벡터에 각각 ligation 하여, 완전한 항체 발현용 플라스미드를 제작하였다 (pcDNA3.3-anti-ICAM-1 중쇄 발현 플라스미드 및 pOptiVEC-anti-ICAM-1 경쇄 발현 플라스미드).
2-2-2. 형질전환
상기 제작된 pcDNA3.3-anti-ICAM-1 중쇄 발현 플라스미드와 pOptiVEC-anti-ICAM-1 경쇄 발현 플라스미드를 CHO 세포 유래인 DG44세포(Invitrogen)에 transfection시켜 형질전환 과정을 수행하였다.
우선 transfection 3일전에 부유상태의 DG44 세포를 5%FBS가 포함된 MEMa 배지에 배양하여 부착상태 세포로 유도하였다. 형질전환은 ViaFect transfection regent(Promega, Cat.#: E4981)를 사용하여 6well plate에서 수행하였다. 형질전환 하루 전 1 X 105 cells/well의 농도로 계대 배양하여 부착상태로 적응된 DG44세포를 준비하였고, 형질전환에 사용된 DNA의 양은 pcDNA3.3-anti-ICAM-1 중쇄 발현 플라스미드와 pOptiVEC-anti-ICAM-1 경쇄 발현 플라스미드 각각 1.0㎍, 및 2.0㎍씩 1:2 비율의 조합으로 사용하였다. 형질전환은 48시간 동안 수행하였다. 유세포분석기(flow cytometer)을 사용하여 형질전환 세포군을 분석하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보여지는 바와 같이, 마우스 SI9 항체의 가변영역 코딩 유전자를 인간 항체의 불변영역 코딩 유전자에 삽입하여 얻어진 키메릭 항체의 ICAM-1 발현 세포주 결합 현상을 확인할 수 있다.
<실시예 3> 인간화 항-ICAM-1 항체 제작
3.1 In silico Humanization에 의한 재조합 항체 서열 선정
키메릭 ICAM-1 항체 (SI9)의 중쇄, 경쇄 각각의 CDR 부위의 아미노산 서열(CDRH1: GYTFTDYA (서열번호: 1), CDRH2: ISTYSGNT (서열번호: 2), CDRH3: ARSLYFGSSGFDY (서열번호: 3), CDRL1: QTLVYRNGNTY (서열번호: 4), CDRL2: KVS (서열번호: 5), CDRL3: SQNTHFPYT (서열번호: 6))을 유지하면서 사람 항체 유전자를 코딩하고 있는 germline framework region을 재조합한 인간화 항체 서열을 in silico 방법으로 선별하였다.
그 결과, 인간화 DNP007 항체 서열로서, 중쇄 가변영역 24종, 경쇄 가변영역 4종을 각각 선별하였다. 상기 선별된 인간화 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역, CDR, 및 프레임워크의 아미노산 서열을 하기 표 2, 3, 4 및 5에 나타내었다. 하기 표 2및 표 3 에서 진하게 밑줄을 그어 표시한 부분은 CDR의 아미노산 서열 (순서대로 CDR1, CDR2, 및 CDR3)이다.
Figure PCTKR2019018822-appb-T000002
Figure PCTKR2019018822-appb-I000001
Figure PCTKR2019018822-appb-T000003
Figure PCTKR2019018822-appb-T000004
Figure PCTKR2019018822-appb-I000002
Figure PCTKR2019018822-appb-T000005
3.2 인간화 재조합 항체의 발현 및 분석
선별된 항체 서열들은 각각 사람 IgG4 중쇄 불변영역과 kappa 경쇄 불변영역과 연결하여 사람 IgG4 형태로 HEK293 세포(ATCC CRL-1573)에서 발현시켰다.
Figure PCTKR2019018822-appb-T000006
Transfection 7일 후에, KanCap A resin (Kaneca 사)을 이용하여 배양액으로부터 인간화 재조합 항체를 정제하였다.
280nm에서의 OD (optical density)를 측정하여 정제된 항체를 정량하여 그 결과를 도 2a 내지 2d에 나타내었다. 도 2a 내지 2d에 나타난 바와 같이, 조합되는 중쇄 및 경쇄 종류와 상관 없이 제조된 대부분의 항체가 비교적 높은 생산성을 나타내었다.
정제된 항체의 순도 분석을 위하여, Sepax Zenix-C SEC-300 size exclusion column (Sepax technologies 사)을 사용하여 size exclusion HPLC (이하 SE-HPLC) 분석을 실시하여 peak symmetry factor을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3a 내지 3d에 나타내었다. 고순도 항체를 SE-HPLC로 분석하면 하나의 symmetric peak으로 관찰되나, 고분자/저분자 등의 이종체가 포함된 경우 2개 이상의 peak이 관찰되거나 symmetric peak factor가 낮게 관찰된다. 도 3a 내지 3d에 나타난 바와 같이, 대부분의 경우, 항 ICAM-1 인간화항체는 상대적으로 높은 symmetric peak factor를 나타내었다.
3-3. 물리화학적/생물학적 특성에 따른 인간화 항체 선별
3-3-1. 고안정성 인간화 항체 선별
3-3-1-1. 고안정성 인간화 항체 1차 선별
안정성이 높은 항체를 우선적으로 선별하기 위하여 고온의 가혹조건에 항체를 방치하고 물리적인 성질 변화를 관찰하여 열변성에 저항성을 보이는 인간화 항체를 선별하였다.
열변성 측정은 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (이하 ANS; Sigma 사)를 이용한 결합 실험을 통해 확인하였다. ANS는 단백질 변성 시 노출되는 소수성 부위에 결합하여 470 nm 파장의 빛을 방출하기 때문에 단백질 변성 유무를 확인할 수 있는 화합물이다.
실시예 2-1에서 준비된 인간화 재조합 항체 96종을 PBS (phosphate buffered saline)를 이용하여 0.2 mg/ml 농도로 일정하게 희석하고, 고온(61℃)에 적당 시간(1시간) 방치하였다. 항체 시료 200 uL에 0.2 mg/ml ANS 용액 20 uL을 넣고 혼합하여 15분 반응한 뒤 360 nm excitation, 460 nm emission 조건에서 분석하였다. ANS 반응에 의하여 방출된 460 nm 파장을 fluorometer(BioTek, SynergyHT)로 측정하고 H1L1 항체(100%)를 기준으로 상대평가 하여 도 4a 내지 4d에 나타내었다. 중쇄 VH7 및 VH22의 경우, 조합되는 경쇄와 관계없이 ANS에 의한 470 nm 형광 방출이 급격하게 증가하는 것으로 나타나 열에 의하여 다소 변성되는 것으로 확인되었으나, 그 외 항체들은 비교적 열에 대하여 안정성을 나타내었다.
3-3-1-2. 고안정성 인간화 항체 2차 선별
도 2a-2d, 3a-3d, 및 4a-4d에서 비교적 높은 항체 생산성, 비교적 높은 peak symmetry factor, 및/또는 고온(61℃) 조건에서의 비교적 높은 열안정성을 보이는 총 47종의 인간화 항체를 1차적으로 선정하였다 (도 5 참조).
보다 엄격한 안정성 평가를 위하여, 상기 47종의 인간화 항체를 0.2 mg/ml 농도로 일정하게 희석한 후, 67℃ 고온에서 1시간 방치하고 ANS 반응성을 측정하고, H1L1 항체를 기준으로 상대적인 반응성을 도 5에 나타내었다. 61℃ 조건에서의 ANS 반응성 (4a 내지 4d)과 비교하여, 67℃에서의 ANS 반응성이 다소 높아지는 경향이 나타났으나, H17L1, H4L3, H5L3, H11L3, H17L3, 및 H17L4 조합의 6종 인간화 항체 (표 7 참조)들은 상대적으로 낮은 ANS 반응성을 나타내어, 열변성에 대하여 높은 저항성을 가지는 항체로 평가되었다.
Figure PCTKR2019018822-appb-T000007
3-3-2. 항원 결합 분석
안정성 시험 평가로 표 7과 같이 선도 항체 6종의 인간화 항체를 선정하였고 H11L3 제외한 항체 5종의 결합력을 모항체 (키메릭 항체; 실시예 1.3 참조)와 비교 평가하였다.
항원 ICAM-1 (ICAM-1; R&D system 사)을 96 well plate에 웰 당 100 ng씩 코팅한 후, blocking하였다. 일차항체 양은 80ng/ml 부터 2 배씩 계열 희석하여 37℃ 온도에서 1시간 결합시켰으며, 이차항체로서 goat anti-Human Ig-HRP 접합체(Jackson ImmunoResearch 사)를 1:10000으로 희석하여 37℃ 온도에서 30분간 결합시켰다. 각 단계 사이는 3번씩 수세과정을 거치고 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 반응하였다. 1N H2SO4 용액으로 TMB 용액과 동량 (100ul) 처리하여 반응 중지한 후, 450nm 로 OD 값을 측정하였다.
상기와 같이 얻어진 모항체 및 5종의 인간화 재조합 항체의 ICAM-1 항원에 대한 결합력을 도 6 및 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2019018822-appb-T000008
평가한 인간화 항체 5종 모두 대체적으로 키메릭 모항체보다 높은 반응성을 나타내었으며, 이 중에서 H17L4 조합의 항체가 가장 높은 반응성을 나타내었다.
3-3-3. Melting temperature 분석
특히 안정한 물리적 특성을 나타내는 인간화 항체 H17L1와 H17L4의 melting temperature를 모항체(키메릭 항체; 실시예 1.3 참조)와 비교하여 안정성을 평가하였다.
항체 시료에 Protein thermal shift dye (Lifetechnologies, #4466038)을 첨가하여 반응 시료를 제조하고, 25℃부터 95℃까지 연속하여 온도를 올려 항체 시료의 변성을 유도하였다. 항체 변성은 반응액에 580 nm 파장을 조사하여 protein thermal shift dye에서 방출하는 623 nm 파장을 측정하여 확인하였고, ViiATM 7 software로 melting temperature을 분석하였다. 상기 얻어진 결과를 하기의 표 9 및 도 7a (키메릭 모항체), 7b (H17L1) 및 7c (H17L4)에 나타내었다:
Figure PCTKR2019018822-appb-T000009
표 9 및 도 7a 내지 7c에 나타난 바와 같이, 각각의 항체시료에서 2개의 melting temperature가 확인되었다. Melting temperature 1은 키메릭 모항체를 포함한 3종의 항체 모두 67℃ 정도로 유사하게 측정되었으나, melting temperature 2는 키메릭 모항체와 비교하여 2종의 인간화 항체에서 10℃ 이상 더 높게 측정되었다. 이는 인간화 항체 2종이 키메릭 모항체 대비하여 열변성에 강한 저항성이 있음을 의미한다.
3-3-4. Affinity 측정
H17L1 및 H17L4 인간화 항체의 항원에 대한 친화도를 모항체와 비교하기 위하여 Octet system (ForteBio)을 사용하였다. Amine reactive Bio-sensor AR2G (ForteBio)에 항체 3종을 각각 부착하고 5 가지 농도의 ICAM-1 항원 용액을 첨가하여 항원/항체 반응이 발생하도록 유도하였다. 상기 항원/항체 반응 결과를 이용하여 결합상수(Kon)와 해리상수(Koff)를 측정하고 친화도(KD)를 계산하여 그 결과를 표 10 및 도 8에 나타내었다:
Figure PCTKR2019018822-appb-T000010
표 10 및 도 8에 나타난 바와 같이, 키메릭 모항체의 친화도(KD)는 1.03 X 10-8 M로 측정되었으며, H17L1, H17L4 인간화 항체는 각각 3.43 X 10-9 및 3.62 x 10-9 M로 측정되어, 인간화 항체에서 개선된 친화도를 확인할 수 있었다.
<실시예 4> 말초혈액에서 의 면역조절 효능 시험 ( in vitro )
4-1. 말초혈액단핵구 분리 및 IFNg 변화 측정
본 명세서에서 제공된 항체의 면역조절 효능을 확인하기 위하여, 말초혈액단핵구에 상기 실시예 3에서 제조된 DNP007 항체 (H17L4 항체)를 처리하고 대표적인 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 IFN-gamma 분비량을 측정하였다.
정상 지원자로부터 채혈을 실시하고 Ficoll-Paque Plus (GE healthcare, #17144002)로 말초혈액단핵구를 분리하였다. 10% FBS 첨가 RPMI 배지에 분리한 말초혈액단핵구를 현탁하고 GM-CSF(Creagene)와 IL-4(Creagene)을 각각 100 ng/ml 농도로 첨가하여 monocyte로부터 수지상세포가 분화될 수 있도록 하였다. DNP007 항체는 10.0 ug/ml 농도로 말초혈액단핵구에 함께 첨가하였다.
수지상세포 전구세포인 monocyte에 미치는 DNP007 항체 효능을 확인하기 위하여, 분리한 말초혈액단핵구를 배양접시에서 2시간 배양하여 배양접시에 부착을 유도한 뒤 부착세포와 부유세포를 나누어 각각 GM-CSF와 IL-4을 100 ng/ml 농도로 각각 첨가하고, DNP007 항체(10.0 ug/ml)를 함께 첨가하였다.
배양 6일차에 말초혈액단핵구, 부착세포 및 부유세포를 각각 세척하고 Lipopolysaccharides(LPS, Sigma-Aldrich, #L2630)를 5.0 ug/ml로 첨가하여 배양하였다. 익일 배양액을 취하여 Human IFN gamma Uncoated ELISA 키트(Invitrogen, #88-7316-77)로 분비된 IFN-gamma 농도를 측정하였다.
말초혈액단핵구, 부착세포 및 부유세포 모든 조건에서 DNP007 항체를 처리한 시료군에서는 INF-gamma 분비량이 현격하게 감소하였다(표 11). 이러한 결과는 LPS에 의한 면역세포 활성화 기전을 DNP007 항체가 억제하여 나타나는 현상으로 이해되었다.
Figure PCTKR2019018822-appb-T000011
4-2. DNP007 항체의 말초혈액단핵구에 대한 영향 분석 - 유전자 발현 프로파일 분석 (RNA sequencing 에 의한 Transcriptome 분석)
DNP007의 면역반응 조절이 단지 수지상세포에 의한 것인지, 수지상세포와 T세포를 비롯한 면역세포들의 접촉에 의한 것인지를 알아보고자 하기와 같이 인간 말초혈액단핵세포를 분리 후 5종류의 말초혈액 집단으로 나눠 100ng/ml GM-CSF 및 100ng/ml IL-4를 첨가하고, 10 ug/ml의 DNP007항체 첨가유무의 조건하에서 6일간 배양하여 세포를 수득하였으며, 성숙한 수지상세포로의 유도를 위해 배양 6일째 상기 세포를 세척하고 5 ug/ml LPS (Sigma-Aldrich)로 하루 동안 처리하여 각 집단 별 세포를 수득하여 total RNA를 분리하고 유전자 발현프로파일을 분석하였다.
(1) Whole PBMC: 인간 말초혈액단핵세포는 건강한 지원자의 혈액을 Ficoll-Paque (GE Healthcare)로 농도구배 원심분리를 수행하여 분리하였다.
(2) CD14+ monocyte유래 수지상세포: 건강한 지원자의 혈액을 Ficoll-Paque (GE Healthcare)로 농도구배 원심분리를 수행하여 분리한 인간 말초혈액단핵세포로부터 CD14+ 단핵구를 자기 분리법(magnetic beads이용)을 사용하여 분리하였다.
(3) CD14 deplete PBMC: (2)의 CD14+ 단핵구를 자기분리법 (magnetic beads 이용)으로 분리하고 남은 말초혈액 집단을 사용하였다.
(4) Attached PBMC: 건강한 지원자의 혈액을 Ficoll-Paque (GE Healthcare)로 농도구배 원심분리를 수행하여 분리한 인간 말초혈액단핵세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI배지에 2시간동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 부착시킨 후 상층액(부유세포 포함)을 걷어내고 부착된 세포만 분리하였다.
(5) (4)의 실험에서 걷어낸 상층의 부유세포를 사용하였다.
결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, CD14+ 단핵구로부터 분화시킨 수지상세포 단독 (A) 및 CD14+ 단핵구가 포함되지 않은 말초혈액 집단(B)는 DNP007을 처리하지 않은 대조군과 유사한 유전자 발현 프로파일을 보여주었다. 반면, CD14+ 유래 수지상세포 단독으로 존재하는 조건이 아닌, 다른 여러 면역세포가 함께 존재하는 조건(C,D,E)에서는 DNP007의 첨가시 첨가하지 않은 대조군과는 현저히 다른 유전자 발현 프로파일 양상을 나타냈다.
또한, 이들 총 유전자 발현 프로파일에서 DNP007을 처리하지 않은 대조군 대비 2배 이상 상향 및 하향하는 유전자들을 비슷한 기능을 가진 유전자 그룹으로 나눈 KEGG pathway & GO Biological process 분석결과, DNP007에 의해 변화되는 유전자 발현 프로파일은 대부분 염증반응을 비롯한 면역 반응을 조절하는데 관여하는 유전자로 나타났다 (도 10 및 도 11). 변화 양상이 뚜렷한 유전자 중에서 사이토카인에 대한 부분을 도식화하면 도 12a 및 12b와 같다. 말초혈액 중에서 부착된 세포를 제외한 상층의 부유세포와 전체 말초혈액세포(whole PBMC) 샘플의 유전자 발현 분석 결과, 도 12a 및 12b와 같이 IL6, IL17, IL23, IL36 등 대표적인 자가면역질환의 타겟이 되는 사이토카인의 유전자 발현을 DNP007 항체 처리에 의해 억제하는 것으로 나타났다.
이들 결과를 통해, 본 명세서에서 제안된 ICAM-1 항체 DNP007은 단지 수지상세포에만 국한하여 영향을 미치는 것이 아니라, 수지상세포와 다른 면역세포의 접촉 과정이나 세포 간 교차반응에 작용하며, 이를 통해 다양한 면역반응 유전자 발현을 조절하여 결과적으로 면역억제 반응을 초래함을 알 수 있다.
4-3. DNP007 항체의 말초혈액단핵구에 대한 영향 분석 - 사이토카인 분석
위 4-2 실험 세트 준비 시, 유전자 발현 변화가 실제 단백질 발현 변화와 상관관계를 보이는 지 확인하기 위해, 4-2 실험 시, 상층액을 분리하여 실제 사이토카인을 정량분석하였다. IFNgamma, IL1 beta, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IL-17, IL-27은 Human Luminex Screening assay (LXSAH, R&D) 키트를 이용하였으며, TGF-beta 는 TGF-beta premixed assay 키트(TGTBMAG-64K-03; Merck Millipore)를 이용하여 분석하였다.
도 13 과 같이 분석한 사이토카인 모두 DNP007 항체 투여에 의해 40 ~ 80% 수준의 실제 단백질 발현의 감소를 나타내었다. 이는 실시예 4-2 의 유전자 발현 프로파일 결과와 일치되는 결과로서 DNP007 항체에 의한 면역억제 반응을 재확인한다고 할 수 있다.
또한, 정상인 말초혈액으로 분리하여 수지상세포로 분화시킨 후, 동일인의 T 세포와 공동배양 조건에서 LPS 처리로 면역활성화를 유도하였을 때도 DNP007 항체의 투여한 샘플은 도 14 와 같이 현저한 면역 사이토카인의 단백질 수준에서의 발현 억제를 확인하였다.
실시예 5. 항체의 수지상 세포에 대한 효과 시험
5-1. 말초혈액단핵구에서의 준성숙 수지상 세포 (Semi-matured Dendritic Cells) 유도 활성 시험
본 실시예에서는 본 명세서에서 제공된 항체가 수지상 세포의 분화 및 성숙에 미치는 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 정상 지원자로부터 채혈을 실시하여 준비된 말초혈액에 CD14 microbead (Miltenyi Biotec, 130-050-201)를 부착한 후, 세포모음장치(Miltenyi Biotec. Cat. 000403)를 이용하여 인간 말초혈액단핵구를 분리하였다. 여기에 GM-CSF(Creagene)와 IL-4(Creagene)을 각각 100 ng/ml 농도로 처리한 10% FBS containing RPMI 배양액을 넣어, 5일간 미성숙 수지상 세포(immature DC)로 분화를 유도하였다. 배양 5일차에 LPS Lipopolysaccharides, Sigma-Aldrich, #L2630) 5ug/ml을 첨가하고 24시간 동안 수지상 세포(mature DC)를 자극하여 성숙 수지 상세포로 분화시켰다. 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007 (H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG)는 수지상 세포 분화 유도과정 0, 3 일차에 5.0 ug/mL 농도로 첨가하였다. 분화 6일차에 수지상 세포의 성숙 표면인자인 CD80(Invitrogen, Catalog# 11-0809-42), CD86(BD, Catalog# 555657), CD40(BD, Catalog# 555588), CD54(BD, Catalog# 347977) 및 HLA-DR(BioLegend, Catalog# 307616) (이상, 괄호 안은 해당 인자에 대한 항체임)의 발현량을 유세포 분석기를 이용하여 확인 및 비교하였다.
상기 얻어진 각 인자의 발현량(Mean of Fluorescent Intensity, MFI)을 LPS만을 처리한 군에 대한 상대값으로 환산하여, 도 15에 나타내었다. 도 15에서 확인되는 바와 같이, 대조항체(hIgG)를 처리한 수지상 세포의 경우 LPS 자극으로 CD80, CD54, CD40, 및 HLA-DR 등의 보조인자의 발현이 모두 증가하였으나, 시험 항체 DNP007와 LPS를 함께 처리한 군에서는 이러한 보조인자의 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 본 명세서에서 제공된 항체가 항원자극에 의한 수지상 세포의 성숙을 제한하며, 면역 억제 환경을 유도함을 보여준다.
5-2. 수지상 세포에서의 염증성 사이토카인 분비량 시험
본 명세서에서 제공된 항체가 수지상 세포의 분화 및 성숙 단계에 영향을 주는지 확인하고자, 말초혈액으로부터 분리한 인간 말초혈액단핵구를 GM-CSF와 IL-4와 함께 5일간 배양하여 수지상 세포로 분화시키고, LPS와 같은 자극인자를 넣고 24시간 배양하여 성숙을 유도시킨 후, 수지상세포의 성숙도를 측정하기 위해 배양액 내 염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokine)의 양을 분석하였다.
보다 구체적으로, 인간 말초혈액에 CD14 microbead (Miltenyi Biotec, 130-050-201)를 부착한 후 세포모음장치(Miltenyi Biotec. Cat. 000403)를 이용하여 인간 말초혈액단핵구를 분리하였다. 여기에 GM-CSF와 IL-4을 각각 100 ng/ml 농도로 처리한 10% FBS containing RPMI 배양액을 넣어 5일간 미성숙 수지상 세포(immature DC)로 분화를 유도하였다. 배양 5일차에 LPS 5 ug/ml을 첨가하고 24시간 동안 수지상 세포(mature DC)를 자극하여 성숙 수지상세포로 분화를 유도하였다. 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007 (H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG는 수지상 세포 분화 유도과정 0, 3 일차에 각각 0.1~10.0 ug/mL 농도로 첨가하였다. 분화 6일차에 배양액 내 염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokine; IL-6 및 TNF-a)의 양을 ELISA 기법을 이용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에 나타난 바와 같이, 대조항체를 처리한 성숙된 수지상세포에서는 LPS 자극으로 인해 대표적 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 분비량이 크게 증가되는 반면, 시험 항체 DNP007을 처리한 수지상 세포에서는 염증성 사이토카인의 분비능이 크게 감소되었다. 수지상 세포의 성숙은 수지상세포가 항원제시세포로서 능력을 획득하는 과정을 의미하며, 성숙한 수지상세포는 항원특이적 T 세포의 활성을 유도하는 기능을 한다. 본 명세서에서 제공된 항체의 처리로 인해, 수지상세포 성숙도의 중요한 척도인 염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 분비가 크게 억제 되었으며, 이를 통해 본 명세서에서 제공된 항체가 수지상세포의 성숙을 억제하는 기능을 가지고 있음을 확인하였다.
5-3. 수지상 세포의 세포자멸사(Apoptosis) 시험
수지상 세포의 분화단계에서 본 명세서에서 제공된 항체가 세포사멸에 영향을 주는지 확인하고자, 상기 항체 처리에 따른 6일간 분화 및 성숙시킨 수지상 세포의 사멸 정도를 측정하였다. 세포사멸 정도는 7AAD 염색 후 유세포 분석을 통해 확인하였다.
보다 구체적으로, 인간 말초혈액에 CD14 microbead (Miltenyi Biotec, 130-050-201)를 부착한 후 세포모음장치(Miltenyi Biotec. Cat. 000403)를 이용하여 인간 말초혈액단핵구를 분리하였다. GM-CSF와 IL-4을 각각 100 ng/ml 농도로 처리한 10% FBS containing RPMI 배양액을 넣어 5일간 미성숙 수지상 세포(immature DC)로 분화를 유도하였다. 배양 5일차에 LPS 5 ug/ml을 첨가하고 24시간 동안 수지상 세포(mature DC)를 자극하여 성숙 수지상세포를 분화시켰다. 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007 (H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG)는 수지상 세포 분화 유도과정 0, 3 일차에 5.0 ug/mL 농도로 2회 첨가하였다. 분화 유도 후 6 일째 되는 날 성숙 수지상 세포(mature DC)를 7AAD (7-Amino-Actinomycin D, BD, 51-68981E 5ul/test)를 염색하여 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에 나타난 바와 같이, 분화 및 성숙을 거친 수지상 세포의 세포사멸 정도를 확인한 결과, 대조 항체 처리군은 2.33%의 세포사멸을 보인데 비해, 시험 항체 DNP007를 처리한 수지상세포의 세포사멸률은 36.3%로, 대조군보다 높은 세포사멸 효과를 보였다.
상기 시험항체에 의한 수지상세포의 세포사멸효과는 세포자멸사(apoptosis)에 의한 것으로 평가될 수 있다.
5-4. 면역관용 수지상 세포 (Tolerogenic DC)의 유도 시험
본 명세서에서 제공된 항체가 면역관용 수지상 세포를 유도하는지 확인하고자, 6일간 분화 및 성숙 과정을 거친 준 성숙 수지상 세포에서 유세포 분석기로 면역관용 수지상 세포 표지 인자의 발현을 확인하였다.
보다 구체적으로, 실시예 5-2 또는 5-3과 동일하게 인간 말초혈액단핵구로부터 6일간 분화 및 성숙 과정을 거친 준성숙 수지상 세포에 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007 (H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG)를 수지상 세포 분화 유도과정 0, 3 일차에 5.0 ug/mL 농도로 2회 첨가하고, 분화 유도 후 6 일째 되는 날 유세포 분석기로 면역관용 수지상 세포 표지 인자의 발현을 확인하였다.
세포표면 발현인자 PDL1(Invitrogen, Catalog# 17-5983-42), PDL2(Miltenyi biotec, Catalog# 130-098-528), 및 Adenosin Receptor A2b(Novus, Catalog# NBP2-41312PE) (이상, 괄호 안은 해당 인자에 대한 항체임)은 해당 항체를 적정 농도로 처리한 후 냉장에서 20 분간 반응하여 염색하였다. 유세포분석 버퍼(0.5%BSA, 0.01%NaN3 in 1XPBS) 2ml을 첨가하고 2200 rpm에 3분 원심분리하였고 상층액을 제거하여 세척하고 분석하였다.
세포액 물질인 IDO(Indoleamine 2,3-Dioxygenase; Invitrogen, Catalog# 12-9477-42), TGF-β(R&D systems, Catalog# IC240P), IL-10(Miltenyi biotec, Catalog# 130-112-729) (이상, 괄호 안은 해당 인자에 대한 항체임)은 세포내 항원염색방법 키트 제조사의 매뉴얼에 따라 염색하였다. 세포 pellet에 100 ul의 IC Fixation buffer (Invitrogen, Catalog# 00-8222-49)를 넣어주고 상온에서 빛을 차단시킨 후 30분간 반응하여 세포를 고정하였다. 1x Permeabilization buffer (Invitrogen, Catalog# 00-8333-56)를 2 mL을 첨가하여 600g 5분 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 남아있는 세포 pellet에 각 항체의 적정 농도를 1x Permeabilization buffer 100 ul에 첨가하여 준비하고 세포에 처리한 후 상온에서 빛을 차단시킨 후 30분간 반응시켰다. 1x Permeabilization buffer 2 mL을 넣어 600g 5분 조건으로 원심분리하여 세척하고 유세포 분석 buffer 2ml씩 첨가하고 원심분리하여 추가 세척을 실시하였다. 1% 파라포름 알데하이드를 첨가하여 세포를 고정하고 유세포 분석기를 이용하여 각각 항원의 발현 양을 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 18a 및 18b에 나타내었다. 도 18a 및 18b에 나타난 바와 같이, 시험 항체 DNP007가 처리된 수지상 세포는 면역관용의 대표 인자인 IDO의 발현이 대조 항체 처리된 수지상 세포(대조군) 대비 상당한 증가를 보였으며, 그 외 면역억제 인자로 알려진 PDL1, PDL2 및 adenosine R A2b의 발현량 역시 대조군 대비 증가하였다. 이와 같이, 본 명세서에서 제공된 항체를 처리한 수지상 세포의 분석을 통해 IDO 및 면역관용과 관련된 일부 인자 들의 발현이 증가함을 확인하였다. 특히 수지상 세포에 발현되는 IDO는 T 세포의 증식을 억제하고 면역 관용에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 항체에 의한 IDO 발현 증가는 면역관용이 유도될 높은 가능성을 시사한다.
5-5. 수지상 세포에서의 IDO 발현 시험
본 명세서에서 제공된 항체에 의한 수지상 세포 성숙 억제가, 알려진 두 성숙 경로 중 어느 경로에 의한 것인지 확인하고자, LPS 와 CD40L 를 이용하여 수지상 세포의 성숙을 유도하였다. 6일간 분화 및 성숙 과정을 거친 준 성숙 수지상 세포에서 유세포 분석기로 면역관용 수지상 세포 표지 인자인 IDO의 발현을 확인하였다.
보다 구체적으로, Canonical pathway로 알려진 LPS에 의한 자극은 실시예 5-2 또는 5-3과 동일한 조건으로 수행하여 6일간 분화 및 성숙 과정을 거친 준 성숙 수지상 세포를 준비하여 시험하였다.
Non-canonical pathway로 알려진 CD40L에 의한 자극시험에서는 GM-CSF와 IL-4을 각각 100 ng/ml 농도로 처리한 10% FBS containing RPMI 배양액을 넣어 5일간 분화한 미성숙 수지상 세포를 사용하였다. 배양한지 5일차 되는 날 GM-CSF, IL-4 100 ng/ml의 농도로 처리된 10% FBS containing RPMI에 CD40L(Enzo, ALX-522-110) 1ug/ml을 함께 첨가하여 48시간 자극을 주어 성숙 수지상 세포(mature DC)를 유도하였다. 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007(H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG)는 수지상 세포 분화 유도과정 0, 3일차에 5.0 ug/mL 농도로 2회 처리하였고, 5일차에 CD40L를 5.0 ug/mL의 양으로 처리하였다. 분화 유도 7일 째 되는 날 성숙 수지상 세포 (Mature DC)에 위에 언급한 세포 내 항원 염색 방법(Staining intracellular Antigens)으로 염색 후 유세포 분석기를 이용해 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 19a (Canonical pathway) 및 19b (Non-canonical pathway)에 나타내었다. 도 19a 및 19b에 나타난 바와 같이, 시험 항체 DNP007은 CD40L에 의한 수지상 세포의 성숙 진행 과정에서 세포 내 IDO의 발현 감소를 유도하는 반면, LPS에 의한 수지상 세포의 성숙은 개체 간 IDO 발현이 큰 차이를 보였다. 수지상 세포의 성숙 경로에는 LPS 및 TNF-a 자극에 의해 유도되는 고전적 경로와 CD40L에 의해 유도되는 비고전적 경로가 있다. 상기 결과는 본 명세서에서 제공된 항체가 두 수지상 세포 성숙 경로에 영향을 주며, 특히 CD40L에 의한 성숙을 제한하고 면역관용 수지상 세포로 분화를 유도함을 보여준다.
5-6. 수용성 물질에 의한 T세포 면역 억제 시험
본 명세서에서 제공된 항체의 처리로 성숙이 억제된 수지상세포가 T 세포에 영향을 주는 요인이 세포 간의 접합에 의한 것인지, 혹은 세포로부터 분비된 매개인자에 의한 것인지를 확인하고자, 수지상세포와 T 세포를 분리된 조건에서 배양하고 T 세포의 활성 억제능을 확인하였다.
보다 구체적으로, 인간 말초혈액에 CD3 microbead (Miltenyi, 130-050-201)를 부착한 후 세포모음장치를 이용하여 분리한인간 T 세포와 상기 실시예 5-1 내지 5-5와 동일한 조건으로 얻은 성숙 수지상 세포 (Mature DC)를 분리된 조건에서 배양하여 T 세포의 활성 억제능을 확인하였다. 배양액에 통과할 수 있도록 제작된 플레이트의 아래 챔버에 항-CD3 항체(BD, 557052) 1ug/ml과 항-CD28 항체(BD, 555725) 1 ug/ml을 코팅하고 말초혈액에서 분리한 자가 T 세포를 넣어주었다. 이때 자가 T 세포는 증식을 확인하기 위한 조건으로 CFSE Labeling을 하였다. 윗 챔버에는 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007(H17L4 항체)을 처리하여 분화시킨 수지상 세포를 넣어 주었다. 그리고 두 세포는 각 챔버에서 배양액을 공유한 채로 4일간 배양하였다. 수지상 세포와 자가 T 세포의 개수는 1:10의 비율로 처리하였다.
상기 얻어진 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타난 바와 같이, 두 세포의 직접적인 접촉이 없는 조건에서도 T 세포는 시험 항체 처리 수지상 세포에 의해 증식이 억제되었고, 염증성 사이토카인인 인터페론 감마(IFN-r)의 생성이 감소하였다. 상기 결과는 본 명세서에서 제공되는 항체 처리 수지상세포가 T 세포와의 물질 교환을 통해 T 세포의 활성 및 증식을 억제할 수 있음을 보여주며, 수지상세포로부터 분비된 물질은 T 세포의 활성을 억제하는 매개인자로서 작용하며, 면역 관용을 유도함을 의미한다.
5-7. 항체 처리된 수지상세포에 의한 T세포 면역 억제 시험
본 명세서에서 제공된 항체의 처리로 성숙이 억제된 수지상 세포의 T 세포 활성 억제능을 평가하고자, 수지상 세포와 T 세포를 함께 배양한 조건에서 T 세포의 활성 및 증식을 확인하였다. 먼저 수지상 세포의 성숙은 알려진 두 성숙경로의 자극인자인 LPS, TNF-a 및 CD40L를 이용해 유도하고, T 세포의 증식과 세포 내 염증성 사이토카인의 발현량을 측정하였다.
보다 구체적으로, 수지상 세포의 성숙은 알려진 두 성숙경로 (Canonical pathway: LPS, TNF-alpha/Non-canonical pathway: CD40L)를 이용해 각각 유도하였다. LPS와 CD40L에 의한 자극은 실시예 5-5와 동일한 방법으로 진행되었고, TNF-alpha에 의한 자극은, 미성숙 수지상 세포로 유도된 상태에서 5일차에 GM-CSF 및 IL-4 를 각각 100 ng/ml 농도로 처리한 10% FBS containing RPMI에 TNF-a 13 ng/ml, IL-1β 10 ng/ml, PGE2 350 ng/ml을 처리하고 48시간 자극을 주어 성숙 수지상 세포(mature DC)로 분화시켜 진행하였다. 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007(H17L4 항체) 및 대조항체 (hIgG)는 수지상 세포 분화 유도과정 중 0, 3일차에 5.0 ug/ml 농도로 2회 처리하였다.
T세포의 활성을 유도하기 위해 항-CD3 항체 1 ug/ml을 코팅한 플레이트에 위와 같은 방법으로 분화된 성숙 수지상 세포와 자가 T 세포를 1:10 비율로 넣어주고 3일 뒤 T 세포의 증식과 세포 내 염증성 사이토카인의 발현량을 측정하였다. 이때 마찬가지로 T 세포의 증식을 확인하기 위해 CFSE Labeling 하였다.
상기 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에 나타난 바와 같이, 대조항체를 처리한 수지상세포와 함께 배양한 T 세포는 활발한 세포증식을 보였고, 염증성 사이토카인으로 대표되는 IFN-γ 및 IL-10를 높게 발현하였다. 이와 대조적으로, 시험 항체 DNP007를 처리하여 성숙이 제한된 수지상 세포와 함께 배양한 T 세포는 항 CD3 항체에 의한 자극에도 불구하고 증식이 억제되었고, 염증성 사이토카인 분비가 현저히 감소하였다.
이러한 결과는 본 명세서에서 제공되는 항체가 두 가지 수지상 세포의 성숙 경로 (LPS 및 TNF-a 자극에 의해 유도되는 고전적 경로와 CD40L에 의해 유도되는 비고전적 경로) 모두에 영향을 주며, 성숙이 억제된 수지상 세포에 의해 감작된 T 세포는 증식과 염증성 사이토카인의 발현을 제한함을 보여준다. 즉, 본 명세서에서 제공되는 항체에 의해 유도된 준 성숙 수지상 세포는 T세포의 활성 및 증식을 억제한다
실시예 6. 항체의 면역 관련 질환 치료 효과 ( in vivo )
6-1. 류마티스 관절염 치료 효과 시험
본 명세서에서 제공된 항체가 류마티스 관절염에 효과가 있는지를 확인하기 위해, mild and moderate 류마티스 관절염 모델을 다음과 같이 준비하였다: 첫째 날에 Type II Bovine collagen(Chodrex inc, Cat. #: 20021) 4 mg을 CFA(Sigma Cat. #: F5881)와 함께 1:1 부피 비율로 0.5 ml + 0.5ml의 양으로 준비하여 0.1ml 씩 10군데로 나누어 영장류 동물(Cynomolgus Macaques(macaca fascicularis), 성별: female, 연령: 2.5 ~ 5 years, 체중: 2 ~ 6 kg, 입수처: PrimGen) 등의 표피(Intradermal)에 주입하였다. 21일째 날과 45일째 날에도 같은 방법으로 주입하였으며, 다만 두 번째 세 번째 주입은 CFA 대신 IFA(Sigma, Cat. #: F5506)로 교체하여 주입하였다. 대조군은 PBS를 같은 방식으로 주입하였다. 관절염 유발 여부를 측정하는 RA score는 동물의 각 관절의 붓기나 붉은색 변화 정도를 반정량적으로 점수화하였다 (도 22a). 본 명세서에서 제공된 항체 DNP007(H17L4 항체)는 첫 collagen 처리 후 70일째부터 주 2회, 8mg/kg으로 투여하면서 평가기준에 따라 64 관절의 관절염 점수(Arthritis score)를 측정하였다. 또한, 투여 동물의 혈장으로부터 Bovine collagen 특이 항체를 검사하였다. 이는 Chondrex 사의 ELISA 키트(Cat. #: 2052T)를 이용하여 Bovine collagen 특이 항체의 변화를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 22b 및 22c에 나타내었다. 그 결과, 시험 항체 DNP007을 투여한 그룹 (n=3)은 투여하지 않은 그룹 (n=2)에 비하여 Arthritics score가 감소하였고 (도 22b), 질환의 직접적인 면역학적 인자인 anti-collagen 항체 또한 현저히 감소하였다 (도 22c). 이러한 결과는 본 명세서에 제공된 항체가 류마티스 관절염의 치료에 효과적임을 보여준다.
6-2. 이식편대 숙주 질환 치료 효과 시험
이식편대 숙주 질환(Graft-versus-host disease, GVHD)은 동종 장기 (예컨대, 골수) 이식 시 이식 받은 환자(수여자)에게서 나타나는 부작용 중 하나로, 공여자의 T 세포나 NK 세포가 수여자의 장기를 공격하여 나타나는 현상이다. 본 명세서에서 제공된 항체가 동종 골수 이식 시 이식편대 숙주질환의 억제에 효과가 있는 지를 확인하기 위해 NOD-SCID 생쥐에 사람의 말초혈액단핵구(PBMC)를 넣고 T 세포의 재정립(Reconstitution)과 생존율을 대조군과 비교하였다.
보다 구체적으로, 이식편대 숙주 질환(Graft-versus-host disease, GVHD) 모델은 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 암컷 마우스를 1.6 Gy 로 방사선 조사한 후, 사람의 PBMC를 주입함으로써 확립하였다. 사람 PBMC는 LeucosepTM tube(Greiner bio-one, 227290)에 Ficoll (GE Healthcare, 17544202)을 사용하여 원심분리하고 중간 하얀색 층을 분리하여 확보하였다. 분리한 사람 PBMC 는 마우스 한 마리 당 1x107 cells/ 200 μL로 복강 투여하였다.
본 명세서에서 제공된 항체 DNP007(H17L4 항체)를 10 mg/kg 용량으로 주 2회씩 6주간 총 12회 투여하여 시험군을 준비하고, CTLA-4-Ig (Bio X cell, BE0099)를 10 mg/kg 용량으로 주 2회씩 6주간 총 12회 투여하여 양성 대조군을 준비하였다. G1(n=3)은 PBMC도 투여하지 않은 음성 대조군이고 G2(n=7)은 vehicle 로서 GVHD를 유발시키고 PBS를 투여한 음성 대조군이다. 또한 G3(n=7)는 CTLA-4-Ig 를 투여한 양성 대조군이고, G4(n=7)은 시험 항체 DNP007를 투여한 시험군이다. GVHD 유발 및 치료 효과의 측정은 다섯가지 임상적 기준(체중감소, 행동, 활성도, 탈모, 피부; weight loss, posture, activity, fur, skin)을 점수화 하여 기록하였다.
상기 얻어진 결과를 도 23a 및 23b에 나타내었다. 그 결과, 본 명세서에 제공된 항체가 투여된 시험군(G4)은 음성대조군인 G2 보다 생존율이 크게 향상되었고(도 23a), 사람 T 세포의 재정립이 정상적으로 잘 이루어지고 있음을 확인하였다(도 23b). 이러한 결과는, 본 명세서에서 제공된 항체가 동종 골수 이식 시 발생하는 이식편대 숙주질환을 방지하고 정상적인 공여자 T 세포의 재 정립을 가능하게 해주는 효과가 있음을 보여준다.

Claims (15)

  1. 다음의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs)를 포함하는, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
  2. 제1항에 있어서, 프레임워크로서 다음을 포함하는, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 97 또는 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 1;
    서열번호 99 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 2;
    서열번호 101 또는 102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 3;
    서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 4;
    서열번호 103 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 1;
    서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 2;
    서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 3; 및
    서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 4.
  3. 제1항에 있어서, 프레임워크로서 다음을 포함하는, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 및 48 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 1;
    서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 54, 및 55 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 2;
    서열번호 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 및 80 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 3;
    서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프레임워크 4;
    서열번호 82, 83, 및 84 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 1;
    서열번호 85, 86, 87, 88, 및 89 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 2;
    서열번호 90, 91, 및 93 중에 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 3; 및
    서열번호 93 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 프레임워크 4.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 7 및 11 내지 34로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 8 및 35 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항 ICAM-1 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 ICAM-1 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 면역세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역세포 매개성 질환은 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 천식, 비만, 제2형 당뇨병, 면역세포 매개 염증, 또는 자가면역질환인, 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 자가면역질환은 뇌척수염, 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창, 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 또는 알러지인 약학 조성물.
  10. 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
  11. 서열번호 7 및 11 내지 34 중에서 선택된 아미노산 서열;
    서열번호 8 및 35 내지 38에서 선택된 아미노산 서열; 또는
    이들 모두
    를 암호화하는 핵산 분자.
  12. 제10항 또는 제11항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제12항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  14. 제13항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항 ICAM-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, ICAM-1 검출용 조성물.
PCT/KR2019/018822 2018-12-31 2019-12-31 Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 WO2020141869A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980087502.3A CN113272328B (zh) 2018-12-31 2019-12-31 与icam-1特异结合的抗体及其用途
EP19907470.9A EP3909979A4 (en) 2018-12-31 2019-12-31 ANTIBODIES SPECIFIC TO ICAM-1 BINDING AND USE THEREOF
AU2019419832A AU2019419832B2 (en) 2018-12-31 2019-12-31 Antibody specifically binding to ICAM-1 and use thereof
JP2021538358A JP7308957B2 (ja) 2018-12-31 2019-12-31 Ｉｃａｍ－１に特異的に結合する抗体およびその用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180173725A KR102063341B1 (ko) 2018-12-31 2018-12-31 Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
KR10-2018-0173725 2018-12-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020141869A1 true WO2020141869A1 (ko) 2020-07-09

Family

ID=69153585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/018822 WO2020141869A1 (ko) 2018-12-31 2019-12-31 Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3909979A4 (ko)
JP (1) JP7308957B2 (ko)
KR (1) KR102063341B1 (ko)
CN (1) CN113272328B (ko)
AU (1) AU2019419832B2 (ko)
WO (1) WO2020141869A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230059469A (ko) * 2021-10-26 2023-05-03 재단법인 아산사회복지재단 암 생존자 유래 항체 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991016927A1 (en) * 1990-04-27 1991-11-14 Celltech Limited Humanized cdr-grafted anti-icam-1 antibodies, methods of preparation and usage thereof
KR20080090532A (ko) * 2006-01-26 2008-10-08 에이치엑스 디아그노스틱스, 인크. 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 ｈ５ 헤마글루티닌에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 용도
KR20110023897A (ko) * 2008-08-08 2011-03-08 다이노나(주) 세포간 부착분자-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하는 항체 및 이의 용도
KR20140026567A (ko) * 2011-07-05 2014-03-05 다이노나(주) 항원-특이적 세포 내성을 유도하는 항체 및 이의 용도
US20180221482A1 (en) * 2013-01-09 2018-08-09 Bioinvent International Ab Use of antibodies against icam-1 in combination with an anti cancer drug in the treatment of patients

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004060919A1 (ja) * 2002-12-26 2004-07-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体
WO2005086568A2 (en) * 2004-01-26 2005-09-22 Morphosys Ag Anti-icam-1 human antibodies and uses thereof
WO2007091719A1 (ja) * 2006-02-07 2007-08-16 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗gpvi抗体の併用療法及び新規医薬用途
JP5382692B2 (ja) * 2006-07-10 2014-01-08 学校法人藤田学園 抗体の分類法、抗原の同定法、抗体又は抗体セットの取得法、抗体パネルの作成法、並びに抗体又は抗体セット及びその用途
KR101434029B1 (ko) * 2012-09-14 2014-08-26 서울대학교산학협력단 Ｉｃａｍ－1에 대한 항체 및 그 용도
MX2019002742A (es) * 2016-09-08 2019-05-09 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991016927A1 (en) * 1990-04-27 1991-11-14 Celltech Limited Humanized cdr-grafted anti-icam-1 antibodies, methods of preparation and usage thereof
KR20080090532A (ko) * 2006-01-26 2008-10-08 에이치엑스 디아그노스틱스, 인크. 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 ｈ５ 헤마글루티닌에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 용도
KR20110023897A (ko) * 2008-08-08 2011-03-08 다이노나(주) 세포간 부착분자-1 과의 결합을 통하여 수지상 세포의 기능 및 분화를 조절하는 항체 및 이의 용도
KR20140026567A (ko) * 2011-07-05 2014-03-05 다이노나(주) 항원-특이적 세포 내성을 유도하는 항체 및 이의 용도
US20180221482A1 (en) * 2013-01-09 2018-08-09 Bioinvent International Ab Use of antibodies against icam-1 in combination with an anti cancer drug in the treatment of patients

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NP_001266532
ARTHRITIS RHEUM, vol. 37, 1994, pages 992 - 999
J IMMUNOL, vol. 144, 1990, pages 4604 - 4612
J IMMUNOL, vol. 162, 1999, pages 2352 - 2357
J RHEUMATOL, vol. 23, 1996, pages 1338 - 1344
PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 85, 1988, pages 3095 - 3099
See also references of EP3909979A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP3909979A4 (en) 2022-09-14
JP2022518363A (ja) 2022-03-15
CN113272328B (zh) 2024-05-14
AU2019419832B2 (en) 2023-12-14
JP7308957B2 (ja) 2023-07-14
AU2019419832A1 (en) 2021-07-22
KR102063341B1 (ko) 2020-01-07
EP3909979A1 (en) 2021-11-17
CN113272328A (zh) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11053298B2 (en) Epitope for switching to TH2 cell and use thereof
JP2022106950A (ja) モノクローナル抗ＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体
WO2020111913A1 (en) Anti-4-1bb antibody and use thereof
WO2019098682A1 (ko) 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
JP6621778B2 (ja) ＩＬ７受容体のα鎖に対する抗体‐薬剤候補物質の製造におけるこれらの使用
KR102003075B1 (ko) 인간 il33r에 대한 항체 및 이의 용도
WO2015058573A1 (zh) 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2021006619A1 (ko) B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2018222019A1 (ko) 신규한 항-ｃｄ40 항체 및 이의 용도
WO2020141869A1 (ko) Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US11905331B2 (en) Antibody binding specifically to CD40 and use thereof
WO2022177392A1 (ko) Cd47에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2023234748A1 (ko) 항-tigit 항체 및 이의 용도
RU2789757C2 (ru) Антитело, специфично связывающееся с icam-1, и его применение
WO2023239226A1 (ko) Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 인터류킨-15를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
WO2022250502A1 (en) Ox40 agonist and use thereof
WO2023132719A1 (ko) Cd40l에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2022216079A1 (ko) Gucy2c 결합 폴리펩타이드 및 그의 용도
WO2021029746A2 (ko) 항-tie2 항체 및 이의 용도
WO2022139537A2 (ko) 뮤신 1에 특이적인 폴리펩티드 및 이의 이용
WO2022098173A1 (ko) 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2021118246A1 (en) Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2021132746A1 (en) Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2019194314A1 (ja) Ｓｐｎｓ２中和抗体
TW202412852A (zh) 人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素結合物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19907470

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021538358

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019419832

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20191231

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019907470

Country of ref document: EP

Effective date: 20210802