WO2023239226A1 - Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 인터류킨-15를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 인터류킨-15를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • fusion protein comprising an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to TIGIT and interleukin-15 (IL-15), and a medicinal use of the fusion protein.
  • Cancer immunotherapy is a method of treating cancer using the body's immune system, and is called the fourth treatment for cancer following chemotherapy, surgery, and radiation therapy. Cancer immunotherapy requires mechanisms to activate the immune system to increase recognition and response to tumor cells. Immune system activation is a complex mechanism involving the functions of a variety of cells, such as antigen-presenting cells, which are important for the initiation of antigen-specific responses, and effector cells, which are responsible for tumor cell destruction.
  • effector cells include cytotoxic T cells.
  • TIGIT T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain
  • WUCAM WUCAM
  • VSIG9 Vstm3
  • TIGIT is a transmembrane protein containing an intracellular ITIM domain, a transmembrane domain, and an immunoglobulin variable domain.
  • TIGIT expression is increased in disease settings such as tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and infections.
  • TIGIT expression may be a marker of exhausted T cells with lower effector function compared to TIGIT negative cells. Additionally, Treg cells expressing TIGIT exhibit enhanced immunosuppressive activity compared to the TIGIT negative Treg population.
  • drugs that have an antagonistic effect on TIGIT e.g., antagonistic anti-TIGIT antibodies, etc.
  • TIGIT drugs that have an antagonistic effect on TIGIT
  • drugs that have an antagonistic effect on TIGIT induce immune system activation and enhance immune responses in disease states such as cancer, thereby providing a beneficial effect in disease treatment. It is expected to show.
  • One example provides (1) an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes TIGIT, and (2) a fusion protein containing IL-15.
  • the IL-15 is located at the C-terminus of the heavy chain (heavy chain variable region or heavy chain constant region) or light chain (light chain variable region or light chain constant region) of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof. And/or may be connected to the N-terminus through a linker or directly without a linker.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • Another example provides a recombinant vector containing a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • Another example provides a recombinant cell comprising the nucleic acid molecule or recombinant vector.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • an immune-enhancing agent or pharmaceutical composition for immune-enhancing is provided.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a pharmaceutical composition for preventing and/or treating immune-related diseases is provided.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • Another example is immunization with a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method of enhancing immunity comprising administering to a subject in need of enhancement.
  • Another example is immunization with a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method for preventing and/or treating an immune-related disease comprising administering to a subject in need of prevention and/or treatment of the related disease.
  • Another example is a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector to treat cancer.
  • a method for preventing and/or treating cancer comprising administering to a subject in need of such prevention and/or treatment.
  • Other examples include at least one type selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector, for use in enhancing immunity or immunization. Provided is use for the manufacture of enhancers.
  • Another example is the prevention of one or more immune-related diseases selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector. and/or use for treatment or for the manufacture of drugs for the prevention and/or treatment of immune-related diseases.
  • Another example is the prevention of one or more types of cancer selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector. Or it provides a use for treatment or for the production of a drug for the prevention and/or treatment of cancer.
  • an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIGIT a fusion protein comprising IL-15, and a medical use thereof are provided.
  • the fusion protein has the activity of (1) activating immunity (e.g., strengthening effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.) by blocking the action of TIGIT by anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • (2) IL-15 can have the advantage of excellent binding ability to the receptor and low immunogenicity, so it can be applied as a variety of immune activators and/or immunotherapeutic agents.
  • nucleic acid molecule may be used interchangeably with “polynucleotide” or “gene”) or a polypeptide (may be used interchangeably with “protein”) “comprises a particular nucleic acid sequence or amino acid sequence or a particular nucleic acid sequence or “Consisting of or expressed as an amino acid sequence” may mean that the nucleic acid molecule or polypeptide essentially includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, and may be used to determine the original function and/or desired function of the nucleic acid molecule or polypeptide.
  • nucleic acid sequence or amino acid sequence provided herein can be modified by conventional mutagenesis methods, such as directed evolution and/or site-specific methods, to the extent of maintaining their original or desired function. It may include modifications made by site-directed mutagenesis, etc.
  • a nucleic acid molecule or polypeptide "comprises, consists of, or is represented by a particular nucleic acid sequence or amino acid sequence" means that the nucleic acid molecule or polypeptide (i) comprises the particular nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • Essentially comprising, or (ii) at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94% of the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence It consists of or essentially contains an amino acid sequence with at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9% homology, and has the original function and/ Or, it may mean maintaining the intended function.
  • nucleic acid sequence described herein is within a range that does not change the amino acid sequence and/or function of the protein expressed from the coding region, taking into account the preferred codon in microorganisms seeking to express the protein due to codon degeneracy. Various modifications can be made to the coding area within.
  • homology refers to the degree of matching with a given nucleic acid sequence or amino acid sequence and can be expressed as a percentage (%).
  • BLAST Altschul Standard et al.
  • an example provides (1) an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes TIGIT, and (2) a fusion protein containing IL-15.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof has the activity of activating immunity (e.g., strengthening effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.) by blocking the action of TIGIT.
  • activating immunity e.g., strengthening effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.
  • IL-15 has excellent binding ability to receptors and low immunogenicity, so it is a safe polypeptide that has an excellent immune-enhancing effect when administered to a living body and has a low risk of inducing an immune response that recognizes it as an immunogen. Accordingly, the fusion protein can be applied as various immune activators and/or immunotherapeutic agents.
  • the IL-15 is located at the C-terminus of the heavy chain (heavy chain variable region or heavy chain constant region) or light chain (light chain variable region or light chain constant region) of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof. And/or may be connected to the N-terminus through a linker or directly without a linker.
  • the fusion protein comprises one (1) an anti-TIGIT antibody (e.g., an IgG type antibody comprising two heavy chains and two light chains) and (2) IL-15, wherein IL-15 It may be linked to the C-terminus (C-terminus of the constant region) or N-terminus of one of the two heavy chains or one of the two light chains of the anti-TIGIT antibody with or without a peptide linker.
  • an anti-TIGIT antibody e.g., an IgG type antibody comprising two heavy chains and two light chains
  • IL-15 e.g., an IgG type antibody comprising two heavy chains and two light chains
  • the fusion protein comprises (1) an anti-TIGIT antibody (e.g., an IgG type antibody comprising two heavy chains and two light chains) and (2) two IL-15, IL-15 may be linked to the C-terminus or N-terminus of the two heavy chains or two light chains of the anti-TIGIT antibody, respectively, with or without a linker.
  • an anti-TIGIT antibody e.g., an IgG type antibody comprising two heavy chains and two light chains
  • two IL-15 may be linked to the C-terminus or N-terminus of the two heavy chains or two light chains of the anti-TIGIT antibody, respectively, with or without a linker.
  • either of the two IL-15s is bound to the C-terminus (i.e., the C-terminus of the heavy chain constant region (e.g., Fc)) or N-terminus (i.e., the C-terminus of the heavy chain constant region (e.g., Fc)) of either of the two heavy chains of the anti-TIGIT antibody That is, the N-terminus of the heavy chain variable region) and the other at the C-terminus of the other heavy chain of the anti-TIGIT antibody (i.e., the C-terminus of the heavy chain constant region (e.g., Fc)) or the N-terminus (i.e. , N terminus of the heavy chain variable region), with or without a linker, or
  • one of the two IL-15s is bound to the C-terminus (i.e., the C-terminus of the light chain constant region) or the N-terminus (i.e., the light chain variable region) of either of the two light chains of the anti-TIGIT antibody.
  • the C-terminus i.e., the C-terminus of the light chain constant region
  • the N-terminus i.e., the N-terminus of the light chain variable region
  • one of the two IL-15s is at the C-terminus of the Fc of one of the two heavy chains of the anti-TIGIT antibody, and the other is at the C-terminus of the Fc of the other one of the two heavy chains of the anti-TIGIT antibody connected with or without a linker, or
  • one of the two IL-15s is at the C-terminus of the constant region of one of the two light chains of the anti-TIGIT antibody, and the other is at the constant region of the other light chain of the anti-TIGIT antibody It may be connected to the C-terminus with or without a linker.
  • the linker may be a rigid peptide linker (e.g., [EAAAK]n, where n is the number of [EAAAK] and is an integer from 1 to 5), a flexible peptide linker (e.g., [(G)mS]l (m is the number of G), It may be an integer of 1 to 5, l is the number of [(G)mS] and may be an integer of 1 to 5)), etc., but is not limited thereto.
  • a rigid peptide linker e.g., [EAAAK]n, where n is the number of [EAAAK] and is an integer from 1 to 5
  • a flexible peptide linker e.g., [(G)mS]l (m is the number of G), It may be an integer of 1 to 5
  • l is the number of [(G)mS] and may be an integer of 1 to 5
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, or 3 (CDR-H1),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 5, or 6 (CDR-H2),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 8, or 9 (CDR-H3),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 13, or 14 (CDR-L1),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 16, or 17 (CDR-L2), and
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, 19, or 20 (CDR-L3)
  • the polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12.
  • the complementarity determining region is determined based on the CDR definition according to the kabat system.
  • CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 six CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3) that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein ) are summarized in Table 1 below:
  • CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 refer to the heavy chain complementarity-determining region
  • CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 refer to the light chain complementarity-determining region
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is,
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 1, 2, or 3, CDR-H2 of SEQ ID NO: 4, 5, or 6, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 7, 8, or 9, and
  • CDR-L1 of SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12), 13, or 14, CDR-L2 of SEQ ID NO: 15, 16, or 17, and CDR-L3 of SEQ ID NO: 18, 19, or 20
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof More specifically, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, or 28, and
  • Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, or 36
  • the heavy chain variable region and/or light chain variable region may additionally include an appropriate signal sequence at the N terminus.
  • amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein are shown in Table 2 below:
  • variable area Amino acid sequence (N ⁇ C) sequence number Heavy chain variable region DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 21 Heavy chain variable region DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RITISRDTSMNQFSLKLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS 22 Heavy chain variable region DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQPPGKGLEWMG YISYSGSARYNPSLKS RITISRDTSKNQFSLKLNSVTAEDTATYYCAR KGYPAYFAY WGQGTLVTVSS
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has amino acid residue 51 of a TIGIT protein, e.g., human TIGIT protein (SEQ ID NO: 64; NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) It may bind to one or more or two or more (e.g., consecutively located) amino acids selected from the -70 region (TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 37), but is not limited thereto.
  • a TIGIT protein e.g., human TIGIT protein (SEQ ID NO: 64; NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) It may bind to one or more or two or more (e.g., consecutively located) amino acids selected from the -70 region (TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 37),
  • antibody refers to a general term for proteins that specifically bind to a specific antigen, and may be a protein produced by stimulation of an antigen within the immune system or a protein produced chemically or recombinantly. The type is not particularly limited. The antibody may be non-naturally produced, for example, recombinantly or synthetically produced.
  • the antibody may be an animal antibody (e.g., mouse antibody, etc.), a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or polyclonal antibody.
  • the regions other than the heavy chain CDR and light chain CDR regions, or the heavy chain variable region and light chain variable region, as defined above, are used to control immunoglobulins of all subtypes (e.g., IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4), IgM, etc.), such as the framework region of immunoglobulins of all of the above subtypes, and/or the light chain constant region and/or the heavy chain constant region. It may be derived from the area.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may be a human IgG type antibody, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, but is not limited thereto.
  • a complete antibody (eg, IgG type) has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses. It has gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may include an IgG constant region as a heavy chain constant region and a kappa constant region as a light chain constant region, but is not limited thereto.
  • the constant region of the IgG may be wild type.
  • the constant region of the IgG is, based on human IgG1, S240D (S, the 240th amino acid, is replaced with D; hereinafter, amino acid changes are expressed in the same way), A331L, I333E, N298A, S299A, E334A , K335A, L235A, L236A, P330G, and K478 deletion ( ⁇ K478), and may be a variant comprising one or more mutations selected from the group consisting of, for example, the following mutations:
  • variable chain refers to a variable region domain V H containing an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 and a hinge ( It is interpreted to include both the full-length heavy chain including the hinge and fragments thereof.
  • light chain refers to both a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L containing an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to mean inclusive.
  • CDR complementarity determining region
  • the term “CDR (complementarity determining region)” refers to a region among the variable regions of an antibody that confers antigen-binding specificity, and refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light chains of immunoglobulins. .
  • the heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3).
  • the CDR may provide key contact residues for the antibody to bind to the antigen or epitope.
  • the term “specifically binds” or “specifically recognizes” has the same meaning commonly known to those skilled in the art, and refers to a condition in which an antigen and an antibody specifically interact to produce an immunological reaction. means that
  • CDR complementarity determining region
  • an antibody may be understood to include an antigen-binding fragment of an antibody that possesses antigen-binding ability.
  • antigen-binding fragment refers to any form of polypeptide containing a portion to which an antigen can bind (e.g., the six CDRs defined herein).
  • the antibody may be scFv, scFv-Fc, (scFv) 2 , Fab, Fab', or F(ab') 2 , but is not limited thereto.
  • Fab has one antigen-binding site with a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (C H1 ) of the heavy chain.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • F(ab') 2 antibody is produced when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Fv is a minimal antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region, and recombinant techniques for producing Fv fragments are widely known in the art.
  • Double-chain Fv (two-chain Fv) is a non-covalent bond in which the heavy chain variable region and light chain variable region are connected, and single-chain Fv (single-chain Fv) is generally shared between the heavy chain variable region and the short chain variable region through a peptide linker. They can be connected by a bond or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure, such as double-chain Fv.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.
  • a proteolytic enzyme for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin
  • flankinge region refers to a region included in the heavy chain of an antibody, exists between the CH1 and CH2 regions, and functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody.
  • Antibodies provided herein may be monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it can be manufactured using phage display techniques. Alternatively, the antibody may be prepared as a monoclonal antibody derived from an animal (eg, mouse) by a conventional method.
  • individual monoclonal antibodies can be screened based on their binding ability to the receptor binding domain of TIGIT using a typical ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) format.
  • Conjugates can be tested for inhibitory activity through functional assays such as competitive ELISA or cell-based assays to test molecular interactions.
  • the respective affinities (Kd values) for the receptor binding domain of TIGIT can then be assayed for monoclonal antibody members selected based on their strong inhibitory activity.
  • the final selected antibodies can be prepared and used as humanized antibodies as well as antibodies in which the remaining portion, excluding the antigen-binding site, is a human immunoglobulin antibody.
  • Methods for producing humanized antibodies are well known in the art.
  • the antigen-binding fragment of the anti-TIGIT antibody refers to a fragment derived from the anti-TIGIT antibody and retaining binding ability to the antigen (TIGIT), and includes the six CDRs of the anti-TIGIT antibody described above.
  • Any polypeptide for example scFv, scFv-Fc, scFv-Ck (kappa constant region), scFv-C ⁇ (lambda constant region), (scFv) 2 , Fab, Fab' or F(ab') 2 days. However, it is not limited to this.
  • the antigen-binding fragment is an scFv, or a fusion polypeptide in which an scFv is fused to the Fc region of an immunoglobulin (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.) (scFv-Fc), or a constant region of a light chain (e.g., It may be a fusion polypeptide (scFv-Ck or scFv-C ⁇ ) fused with (kappa or lambda), but is not limited thereto.
  • an immunoglobulin e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.
  • scFv-Fc a constant region of a light chain
  • an antibody e.g., CDR, variable region, or heavy/light chain, antigen-binding fragment, etc.
  • “comprises a specific amino acid sequence, or consists of or is comprised of a specific amino acid sequence” means that the amino acid sequence is essentially the same. Cases where meaningless mutations (e.g., substitution, deletion, and/or addition of amino acid residues) that do not have a significant effect on antibody activity (e.g., antigen affinity, pharmacological activity, etc.) are introduced into the amino acid sequence. It could mean anything.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has a binding affinity (K D ) for TIGIT (eg, human TIGIT) measured by, for example, surface plasmon resonance (SPR). Based on the case, it may be 10mM or less, 5mM or less, 1mM or less, 0.5mM or less, 0.2mM or less, 0.1mM or less, 0.05mM or less, 0.01mM or less, 0.005mM or less, or 0.001mM or less, for example.
  • K D binding affinity for TIGIT
  • SPR surface plasmon resonance
  • Interleukin-15 IL-15
  • the interleukin-15 (IL-15),
  • polypeptide (1) (2) the polypeptide (1) and 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, Polypeptides with at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homology
  • Interleukin-15 has structural similarity to interleukin-2 (IL-2) and binds to the IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) and common gamma chain (gamma-C, CD132) complex. And through this, it participates in signal transmission.
  • interleukin-15 may be of human origin, e.g., NCBI Accession No. It may be NP_000576.1 (amino acid residues 49 to 162), but is not limited thereto.
  • the IL-15 may be expressed by the following amino acid sequence (N terminus ⁇ C terminus):
  • the polypeptide (1) may include additional oligopeptides for additional purposes, for example, for convenience of protein purification, a Tag for labeling at the N-terminus (e.g., MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGR (SEQ ID NO: 76), etc.) It may additionally include, but is not limited to this.
  • a Tag for labeling at the N-terminus e.g., MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGR (SEQ ID NO: 76), etc. It may additionally include, but is not limited to this.
  • interleukin-15 Since the interleukin-15 is of human origin, it is characterized by low immunogenicity when administered in the human body.
  • the IL-15 has binding activity to the receptor (e.g., IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) and/or gamma chain common with IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) (gamma-C , binding activity to the CD132) complex), and/or cytokine production and/or secretion activity in immune cells (e.g., T cells (CD4+, CD8+), NK cells, etc.).
  • the receptor e.g., IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) and/or gamma chain common with IL-2/IL-15 receptor beta chain (CD122) (gamma-C , binding activity to the CD132) complex
  • cytokine production and/or secretion activity in immune cells e.g., T cells (CD4+, CD8+), NK cells, etc.
  • the IL-15 is,
  • polypeptide (2) has at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homology to the polypeptide (1), IL-2/IL-15 A polypeptide that has receptor-binding activity and/or cytokine production and/or secretion activity in immune cells.
  • the IL-15 has excellent binding activity to the IL-2/IL-15 receptor, and/or cytokine production and/or secretion activity in immune cells, and/or anticancer activity (e.g., inhibition of cancer cell proliferation, cancer cell death, etc. ) may have.
  • the linker may be a peptide linker, such as [EAAAK]n (n is the number of [EAAAK] (SEQ ID NO: 77) and is an integer from 1 to 5), [(G)mS]l (m is the number of G) is an integer from 1 to 5, l is the number of [(G)mS] and is an integer from 1 to 5), A EAAAK A (SEQ ID NO: 78), A EAAAK EAAAK A (SEQ ID NO: 79), A EAAAK EAAAK EAAAK A (SEQ ID NO: Number 80), A EAAAK EAAAK EAAAK EAAAK A (SEQ ID NO: 81), A EAAAK EAAAK EAAAK EAAAK A (SEQ ID NO: 82), AEAAAKEAAAKAG (SEQ ID NO: 83), AEAAAKEAAAKAGS (SEQ ID NO: 84), GGGGG (SEQ ID NO: 85), GGAGG (SEQ ID NO: 86), GGGGGGGGGG
  • the peptide linker is a rigid linker such as [EAAAK]n (n is the number of [EAAAK] and is an integer from 1 to 5) or [(G)mS]l (m is the number of G is an integer from 1 to 5, l is the number of [(G)mS] and is an integer from 1 to 5), but is not limited thereto.
  • nucleic acid molecules Nucleic acid molecules, recombinant vectors, and recombinant cells
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • Another example provides a recombinant vector containing the above nucleic acid molecule.
  • the vector can be used as an expression vector for the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same.
  • the cells can be used for production of the fusion protein.
  • Another example provides a method of making the fusion protein, comprising expressing the nucleic acid molecule in a suitable host cell.
  • the step of expressing the nucleic acid molecule in an appropriate host cell may include culturing the previously described recombinant cell under normal conditions.
  • vector refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector include plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14 , pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phages (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.), or viruses (e.g., SV40, etc.).
  • plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLA
  • the nucleic acid molecule encoding the fusion protein may be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (e.g., a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequences can be “operatively linked” to regulate transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be one commonly used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, and the BBV origin of replication. It is not limited.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothioneine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell is a cell capable of stably and continuously cloning or expressing the recombinant vector, and any host cell known in the art can be used.
  • Prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli Bacillus genus strains such as BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E.
  • coli Enterobacteriaceae strains such as Tia marcescens and various Pseudomonas species are used as host cells when transformed into eukaryotic cells, such as yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells, and animal cells, such as Sp2/0.
  • eukaryotic cells such as yeast ( Saccharomyce cerevisiae )
  • insect cells such as insect cells, plant cells, and animal cells, such as Sp2/0.
  • CHO, DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines, etc. can be used, but are not limited thereto.
  • the nucleic acid molecule or the recombinant vector containing it can be transported (introduced) into a host cell using a transport method widely known in the art.
  • a transport method widely known in the art.
  • the transport method may be used, such as the CaCl 2 method or electroporation method, and if the host cell is a eukaryotic cell, microinjection method, calcium phosphate precipitation method, electroporation method, etc.
  • Liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto.
  • the method of selecting the transformed (recombinant vector-introduced) host cells can be easily performed according to methods widely known in the art, using the phenotype expressed by the selection marker.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • recombinant cells into which the recombinant vector has been introduced can be easily selected by culturing them in a medium containing the antibiotic.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof included in the fusion protein blocks the action of TIGIT (e.g., the interaction between TIGIT and its ligand, CD155 (PVR), etc.) to activate immunity (e.g., effector). It not only has the function of strengthening T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.), but also has excellent anticancer effects (e.g., killing cancer cells, inhibiting cancer cell proliferation, etc.).
  • IL-15 has excellent binding ability to receptors (IL-2/IL-15 receptors) and low immunogenicity, so when administered to a living body, it has excellent immune-enhancing effects such as increased cytokine secretion, but does not act as an immunogen, so it is used as an immunogen. Not only does it have the advantage of ensuring safety because the risk of inducing a recognized immune response is low, but it also has excellent anticancer effects (e.g., killing cancer cells, inhibiting cancer cell proliferation, etc.). Therefore, the fusion peptide has the advantages of both the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof and IL-15, and is useful for enhancing immunity, preventing and/or treating immune-related diseases, and especially preventing and/or treating cancer. It can be applied.
  • One example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • an immune-enhancing agent or pharmaceutical composition for immune-enhancing is provided.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a pharmaceutical composition for preventing and/or treating immune-related diseases is provided.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • an anticancer agent or a pharmaceutical composition for preventing and/or treating cancer is provided.
  • Another example is immunization with a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method of enhancing immunity comprising administering to a subject in need of enhancement.
  • the immune enhancement method may further include the step of identifying a subject in need of immune enhancement prior to the administering step.
  • Another example is immunization with a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method for preventing and/or treating an immune-related disease comprising administering to a subject in need of prevention and/or treatment of the related disease.
  • the method of preventing and/or treating an immune-related disease may further include the step of identifying a subject in need of prevention and/or treatment of an immune-related disease before the administering step.
  • Another example is a pharmaceutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector to treat cancer.
  • a method for preventing and/or treating cancer comprising administering to a subject in need of such prevention and/or treatment.
  • the cancer prevention and/or treatment method may further include the step of identifying a subject in need of cancer prevention and/or treatment before the administering step.
  • Another example is one or more types of immunopotentiating, immune-related methods selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • Pharmaceutical compositions for use in the prevention and/or treatment of diseases, and/or in the prevention and/or treatment of cancer, or in the enhancement of immunity, in the prevention and/or treatment of immune-related diseases, and/or in the prevention and/or treatment of cancer It provides use for the manufacture of.
  • the term “immune enhancement” may mean inducing an initial immune response to an antigen or increasing an existing immune response, and may be interchangeable with terms such as immune enhancement and immune activation. More specifically, the “immune enhancing effect” of the fusion protein provided herein refers to immune cells (NK cells, NKT cells, CD3+ T cells, effector T cells (CD4+ T cells), cytotoxic T cells (CD8+ T cells), etc.
  • IL-15 receptors e.g., located on the surface of immune cells (NK cells, etc.)
  • IL2RB/IL2RG dimerization e.g., IL2RB/IL2RG dimerization, etc.
  • immune-related disease encompasses all diseases caused by disorders and/or insufficient activity of the immune system, for example, a group consisting of cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, etc. It may be one or more selected from , but is not limited thereto.
  • the cancer may be a solid cancer or a hematological cancer, but is not limited to, squamous cell cancer, lung cancer (e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, etc.), peritoneal cancer, skin cancer, melanoma ( (e.g., skin or intraocular melanoma, etc.), rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, liver cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, and liver cancer.
  • lung cancer e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, etc.
  • peritoneal cancer skin cancer
  • It may be one or more types selected from the group consisting of subspecies, cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrium or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulva cancer, head and neck cancer, brain cancer, osteosarcoma, etc. .
  • the cancer prevention and/or treatment effect includes not only the effect of suppressing the occurrence and/or growth of cancer cells, but also the effect of suppressing the worsening of cancer due to migration, invasion, metastasis, etc. do.
  • infectious diseases are caused by strengthening immunity as described above (e.g., immune cells (NK cells, CD3+ T cells, effector T cells (CD4+ T cells), cytotoxic T cells (CD8+ T cells), etc.)). Enhancement (activation) and/or proliferation of functions, inhibition of activity and/or depletion of regulatory T (Treg) cells, production of immune proteins (e.g., cytokines (IL-2, IFN-gamma, etc.)) and/ or increased secretion, etc.) may be selected from among all infectious diseases, autoimmune diseases, and inflammatory diseases that can be treated, alleviated, and/or prevented.
  • immune cells e.g., immune cells (NK cells, CD3+ T cells, effector T cells (CD4+ T cells), cytotoxic T cells (CD8+ T cells), etc.
  • Enhancement (activation) and/or proliferation of functions e.g., inhibition of activity and/or depletion of regulatory T (Treg) cells, production of immune proteins (e.g.,
  • infectious diseases include viruses (e.g., influenza virus, coronavirus (e.g., Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) virus (SARS-CoV, SARS-CoV-2, etc.), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus (e.g., A disease that occurs when disease-causing pathogens such as bacteria, fungi, and parasites (MERS-CoV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), etc.) spread and invade living organisms (e.g., animals, including humans).
  • viruses e.g., influenza virus, coronavirus (e.g., Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) virus (SARS-CoV, SARS-CoV-2, etc.), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus (e.g., A disease that occurs when disease-causing pathogens such as bacteria, fungi, and parasites (MERS-CoV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, and Crohn's disease.
  • the inflammatory disease is a general term for inflammation (e.g., chronic inflammation or acute inflammation) or diseases caused by inflammation, for example, cardiac inflammation (e.g.
  • vascular inflammation e.g. atherosclerosis, vasculitis, disseminated intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (e.g.
  • TTP TTP
  • upper respiratory tract inflammation e.g., acute nasopharyngitis, allergic rhinitis, sinusitis, pharyngitis, tonsillitis, laryngitis, etc.
  • lower respiratory tract and/or lung inflammation e.g., bronchitis, bronchiectasis, asthma, chronic lung disease) (COPD), pneumonia, interstitial lung disease, tuberculosis, etc.
  • upper gastrointestinal tract inflammation e.g., gastritis, esophagitis, etc.
  • lower gastrointestinal tract inflammation e.g., enterocolitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, celiac disease, diverticulitis, irritable bowel
  • appendicitis fistula, etc.
  • inflammation of the liver biliary tract and/or pancreas (e.g.
  • kidney (upper urinary tract) inflammation e.g. pyelonephritis, glomerulonephritis
  • urinary tract infection e.g. pyelonephritis, glomerulonephritis
  • urinary tract infection e.g., urinary tract infection, ureteritis, urethritis, cystitis, prostatitis/chronic pelvic pain syndrome, etc.
  • thyroid and/or parathyroid inflammation e.g., thyroiditis, parathyroiditis, etc.
  • adrenal inflammation e.g. Reproductive tract inflammation (e.g.
  • pelvic inflammatory disease oophoritis, orchitis, epididymitis, etc.
  • bone and/or joint inflammation e.g. osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteomyelitis, synovitis, etc.
  • skin inflammation e.g. , Skin: cellulitis, erysipelas, rash, athlete's foot, acne, etc.
  • muscle inflammation e.g., myositis, etc.
  • brain inflammation e.g., encephalitis, major depressive disorder, etc.
  • nerve inflammation e.g., eyes, ears, etc.
  • eye inflammation e.g.
  • stye uveitis, conjunctivitis, etc.
  • ear inflammation e.g. otitis media, mastoiditis, etc.
  • oral inflammation e.g. stomatitis, etc.
  • It may be one or more selected from the group consisting of periodontitis, gingivitis, etc.), systemic inflammation (e.g., systemic inflammatory response syndrome (sepsis, etc.), metabolic syndrome-related disease, etc.), peritonitis, reperfusion injury, transplant rejection reaction, hypersensitivity reaction, etc. It is not limited.
  • the subject of administration of the fusion protein and/or pharmaceutical composition provided herein may be any animal or cell, for example, an animal selected from mammals including humans, primates such as monkeys, rodents such as rats, mice, etc., Alternatively, it may be a cell, tissue, body fluid (such as serum) derived from (isolated) the animal, or a culture thereof, for example, a human or a cell, tissue, or body fluid (such as serum) isolated from a human.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or cells as active ingredients, and the carrier is commonly used in the formulation of protein drugs.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in addition to fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or cells as active ingredients, and the carrier is commonly used in the formulation of protein drugs.
  • lactose dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl It may be one or more selected from the group consisting of hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc., but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the content of fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or cells as active ingredients in the pharmaceutical composition is 0.00001 to 99% by weight, 0.0001 to 99% by weight, 0.001 to 99% by weight, 0.01 to 99% by weight, based on the total weight of the composition.
  • Administration of the fusion protein, nucleic acid molecule, vector, cell, and/or pharmaceutical composition may be via oral or parenteral routes.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration.
  • proteins or peptides are digested, so oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the fusion protein, nucleic acid molecule, vector, cell, and/or pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in oil or aqueous medium, or in the form of extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, injection, etc. It may be formulated in a form, and a dispersant or stabilizer may be additionally included for formulation.
  • the content of the active ingredient, fusion protein, nucleic acid molecule, vector, and/or cell, in the pharmaceutical composition is determined by the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration interval, administration route, It can be prescribed in various ways depending on factors such as excretion rate and reaction sensitivity.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition is 0.00001 to 1000 mg/kg, 0.00001 to 500 mg/kg, 0.00001 to 100 mg/kg, 0.00001 to 50 mg based on the active ingredient (fusion protein, nucleic acid molecule, vector, cell).
  • the daily dosage may be formulated as a single preparation in unit dosage form, may be formulated in appropriate portions, or may be prepared by placing it in a multi-dose container.
  • the pharmaceutically effective amount refers to the amount of the active ingredient that can exhibit the desired pharmaceutical activity, and may be within the dosage range described above.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • Another example includes as an active ingredient at least one selected from the group consisting of the fusion protein, a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • Health functional foods are foods manufactured (processed) using nutrients that are easily deficient in daily diet or raw materials or ingredients with useful functions for the human body (hereinafter referred to as ‘functional raw materials’) to maintain health or prevent certain diseases or diseases. It refers to all foods that help prevent and/or improve symptoms, and there are no particular restrictions on the final product form.
  • the health functional food may be selected from the group consisting of various foods, beverages, food additives, etc., but is not limited thereto.
  • the food composition may contain acceptable food supplements and may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the production of health functional foods.
  • the composition can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the content of the active ingredient contained in the food composition may be appropriately determined without particular limitation depending on the form of the food, desired effect, purpose, etc., for example, 0.00001 to 99% by weight, 0.0001 to 99% by weight of the total food weight, It may be 0.001 to 99% by weight, 0.01 to 99% by weight, 0.1 to 99% by weight, 1 to 99% by weight, or 10 to 99% by weight, but is not limited thereto.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof included in the fusion protein blocks the action of TIGIT (e.g., the interaction between TIGIT and its ligand, CD155 (PVR), etc.) to activate immunity (e.g., effector). It not only has the function of strengthening T cell function, controlling and/or eliminating the activity of Treg cells, increasing cytokine secretion, etc.), but also has excellent anticancer effects (e.g., killing cancer cells, inhibiting cancer cell proliferation, etc.).
  • IL-15 has excellent binding ability to receptors (IL-2/IL-15 receptors) and low immunogenicity, so when administered to a living body, it has excellent immune-enhancing effects such as increased cytokine secretion, but does not act as an immunogen, so it is used as an immunogen. Not only does it have the advantage of ensuring safety because the risk of inducing a recognized immune response is low, but it also has excellent anticancer effects (e.g., killing cancer cells, inhibiting cancer cell proliferation, etc.). Therefore, the fusion peptide has the advantages of both the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof and IL-15, and is useful for enhancing immunity, preventing and/or treating immune-related diseases, and especially preventing and/or treating cancer. It can be applied.
  • Figure 1 is a graph showing the binding affinity of a fusion protein to the human TIGIT protein according to an example.
  • Figures 2a to 2c are graphs showing the increase in cytokine production in immune cells by the fusion protein according to one embodiment (2a: CD4+ T cells, 2b: CD8+ T cells, 2c: CD56+ NK cells).
  • Figure 3 is a graph showing the increase in cytokine expression in PBMC of a fusion protein according to one embodiment.
  • Figures 4a and 4b are graphs showing the induction of STAT5 in immune cells by fusion proteins according to an example ( Figure 4a: CD8+ T cells, 4b: NK cells).
  • Figure 5 is a graph showing the long-term cytokine production effect of a fusion protein in immune cells according to an example.
  • Figure 6 is a graph showing the regulatory T cell quenching ability of a fusion protein according to one embodiment.
  • Figures 7a to 7c are graphs showing the immune cell proliferation ability of fusion proteins according to one embodiment (7a: T cells, 7b: NKT cells, 7c: NK cells).
  • Figure 8 is a graph showing the effect of a fusion protein on continuous cytokine production in NK cells according to one embodiment.
  • Figure 9 shows the cytotoxicity of the fusion protein against lung cancer cells (A549 cells) according to one example.
  • Figure 10 shows the cytotoxicity of a fusion protein against breast cancer cells (MCF-7 cells) according to one example.
  • a fusion protein in which an anti-TIGIT antibody and IL-15 were fused with or without a linker was designed to have the structure in Table 3 below:
  • Fusion protein name Structure Linker 7A615 (Fusion protein of TIGIT mAb 7A6 with wild type IL-15 at LC linking) TIGIT mAb-(LC-(EAAAK)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with rigid linker TIGIT mAb-(LC-(GGGGS)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with flexible linker 7A615-Fc (Fusion protein of TIGIT mAb 7A6 with wild type IL-15 at FC linking) TIGIT mAb-Fc-((EAAAK)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with rigid linker TIGIT mAb-Fc-((GGGGS)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with flexible linker TIGIT mAb-F
  • anti-TIGIT monoclonal antibodies 7A6 (7A6_VH3/Vk5), 2B7, 3F8;
  • IL-15 wild type IL-15
  • LC variant IL-15 fused to the C-terminus of the light chain constant region (LC) of the antibody;
  • Fc variants IL-15 fused to the C-terminus of the heavy chain constant region of the antibody (Fc; including ⁇ K478 mutation)
  • genes encoding the heavy and light chain variable regions of TIGIT mAb and genes encoding the heavy and light chain constant regions linked by [linker]-[wild type IL-15] were synthesized, and pcDNA3.1 (Invitrogen) Cloned into vector.
  • CHO-K1 cells ATCC
  • 1 ⁇ g/ ⁇ l of the genetic DNA and Lipofectamine reagent Thermo
  • the DNA-lipid complex was dropped onto CHO-K1 cells.
  • the cells were cultured at 37°C and transiently expressed. Culture supernatants were purified by Protein A and preparative SEC.
  • the produced protein was buffer exchanged with PBS, quantified by OD280nm measurement, and analyzed by SDS-PAGE.
  • 3F815 Components Amino acid sequence (N ⁇ C) or nucleic acid sequence (5' ⁇ 3') sequence number TIGIT mAb heavy chain variable region EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSS 28 GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACATCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAGTGGATCGGCCTGAGCATCCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCT GACCAGCGAGGACAGCGCCGT
  • TL-1 Linker V-1 linked to the C-terminus of the light chain of the anti-TIGIT antibody
  • TL-2 Linker V-2 linked to the C-terminus of the light chain of the anti-TIGIT antibody
  • TL-3 Linker V-1 linked to the C-terminus of the heavy chain (Fc) of the anti-TIGIT antibody;
  • TL-4 Linker V-2 linked to the C-terminus of the heavy chain (Fc) of the anti-TIGIT antibody;
  • TL-5 Does not contain a linker between the heavy chain (Fc) of the anti-TIGIT antibody and IL-15.
  • ELISA plates were coated with recombinant human TIGIT protein (acrobiosystems, China) at a concentration of 1 ⁇ g/ml dissolved in Phosphate-Buffered Saline (PBS) and incubated overnight at 4 °C.
  • the plate was blocked with blocking buffer (3% (v/v) skim milk in PBS) for 1 hour, and serially diluted anti-TIGIT monoclonal antibody (7A6) and fusion protein ([7A6]-[TL-2]-[ IL-15]; denoted as '7A615TL-2') (starting concentration: 61.097 nM; 1:3 serial dilution) was added to the coated plate.
  • anti-mouse/human IgG-HRP antibody (Abcam; 1:10000 dilution) was added to each well.
  • the plate was developed with TMB solution and stopped with 1N HCL.
  • the OD value (absorbance) at 450nM was measured using GloMax® Explorer Fully Loaded.
  • 500,000 human-derived PBMCs (Stemcell technologies) were incubated in the presence of anti-TIGIT 7A6 antibody (10ug/ml) or fusion protein (7A615TL-2, 68.79nM). and incubated with anti-CD3 monoclonal antibody (BD Biosciences, 0.2ug/ml; or anti-CD4 antibody or anti-CD8 antibody) and anti-CD28 monoclonal antibody (BD Biosciences, 1ug/ml).
  • anti-CD3 monoclonal antibody BD Biosciences, 0.2ug/ml; or anti-CD4 antibody or anti-CD8 antibody
  • anti-CD28 monoclonal antibody BD Biosciences, 1ug/ml
  • the cells were treated with Brefeldin A (10ug/ml) to prevent secretion of cytokines and cultured again in the incubator for 15 hours, for a total of 19 hours.
  • the washing method of spinning down the cells at 400 After staining with dye solution (Biolegend) at room temperature for 20 minutes, spin down at 400 x g for 10 minutes and wash. Then, they were labeled with fluorophore-conjugated antibodies against CD4+ T cells, CD8+ T cells, or CD56+ NK cell surface markers on ice for 30 minutes.
  • the anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, and anti-CD56 antibody used here were all obtained from Biolegend.
  • Cells were fixed and permeabilized using the eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit (eBiosciences) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were stained with fluorophore-conjugated antibodies (Biolegend) against intracellular IFN- ⁇ and TNF ⁇ at room temperature for 30 minutes. After washing the cells, surface marker labeling of each cell and fluorophore fluorescence of cytokines were detected using a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter). Data were analyzed with Flowjo software (BD Biosciences) and plotted with GraphPad Prism 9 software (Dotmatics).
  • FIGS. 2A to 2C show the fusion protein provided in the present application increases the production of Th1/Tc1 cytokine (IFN-gamma) and TNF-alpha in T cells and NK cells, thereby stimulating the immune response. Strengthening was confirmed.
  • the obtained results suggest that 7A615 has a more potent and dose-dependent effect on effector T cell and NK cell function enhancement than the anti-TIGIT antibody.
  • Example 4 Increased cytokine expression by fusion protein
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Cytokine levels were measured using the Bio-Plex cytokine assay (4-plex; #PPX-04, Invitrogen). Cytokine 4-plex analysis was performed for the following four human cytokines: IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ , and IL-9. All analyzes were performed according to the manufacturer's instructions, and the results were read with a Bio-Plex 200 array reader (Bio-Rad).
  • the cells were pelleted again by centrifugation at 500 xg for 5 minutes.
  • the supernatant was removed, the pellet was crushed by vortexing, and the cells were resuspended in 200 ⁇ L of ice-cold True-Nuclear 1X Perm Buffer (Biolegend).
  • the cells were then stored in the freezer for 1 hour and then pelleted by centrifugation at 500 xg for 5 minutes.
  • the supernatant was removed, the pellet was triturated by vortexing, and the cells were resuspended in staining buffer containing anti-pSTAT5 antibody (Biolegend, 1:25) for 15 minutes at room temperature. Cells were pelleted by centrifugation at 500 xg for 5 minutes.
  • FIG. 4a CD8+ T cells
  • 4b NK cells
  • IL-15 coupled to anti-TIGIT antibody induced STAT5 phosphorylation in both CD8+ T cells and NK cells.
  • receptor heterodimerization must lead to signal transduction across the membrane.
  • IL-15 receptor complex signaling can be measured by phosphorylation of STAT5.
  • Stimulation of CD8+ T cells and NK cells using the fusion proteins provided in this application induced high levels of STAT5 phosphorylation, and these results show that IL-15 in the fusion proteins has not lost its ability to induce robust signaling. .
  • the fusion protein provided in this application stimulates immune cells for a long period of time to induce cytokine production.
  • PBMCs from healthy human donors were cultured in R10 medium (RPMI1640 medium containing 10% (v/v) FBS (Gibco), Penicillin-Streptomycin (Sigma), and L-glutamine (Sigma) in 96-well U-bottom plates. (Gibco)) at an amount of 250,000 per well.
  • Cells were stimulated with IL-15 or 7A615TL-2 fusion protein at a concentration of 378.6 pM for 1 hour at 37°C and 5% CO 2 , then centrifuged at 400 xg for 3 minutes and washed five times at R10. Cells were left for 24 hours (resting) under conditions of 5% CO 2 and 37°C.
  • CytoStim (Miltenyibiotec) was added as a stimulator, and after 2 hours, Brefeldin A (Biolegend, 1:1000) and Monensin (Biolegend, 1:1000) were additionally added. Cells were washed in PBS by centrifugation at 400 Cells were incubated in the dark for 10 minutes at room temperature, then centrifuged at 400 xg for 3 minutes and washed with 100 ⁇ l of PBS.
  • Cells were centrifuged at 400 xg for 3 minutes, washed with 100 ⁇ l of PBS, and then resuspended in 50 ⁇ l of fixation buffer (Biolegend). Cells were cultured in dark conditions for 30 minutes at room temperature. Afterwards, the cells were centrifuged at 400 The cells were cultured in perm buffer at room temperature in dark conditions for 1 hour, centrifuged at 400 xg, and the supernatant was removed.
  • fixation buffer Biolegend
  • Cells were resuspended in 50 ⁇ l of perm buffer containing the following antibodies for 30 minutes at room temperature in dark conditions; anti-CD4-AlexaFluor700 antibody (1:50), anti-CD8-PerCP antibody (1:50), anti-CD56-BV421 antibody (1:50), anti-IL-2-PE antibody (1:50), and Anti-IFN- ⁇ -FITC antibody (1:50). All of the above antibodies were obtained from Biolegend. After centrifuging the cells at 400 xg and removing the supernatant, the cells were resuspended in 100 ⁇ l of PBS and analyzed using a CytoFlex flow cytometer.
  • Treg cells and NK cells were isolated by magnetic bead isolation (Miltenyi Biotec). The cells were counted and seeded on a 96 U-bottomed plate at a ratio of 10 NK cells per Treg. 10 ⁇ g/mL of 7A615TL-2 fusion protein was added to the well. The co-cultured cells were incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO 2 conditions. Afterwards, the co-cultured cells were pelleted by centrifugation at 500 xg for 5 minutes.
  • Example 8 Proliferation of T cells, NKT cells, and NK cells by fusion protein treatment
  • PBMCs from four healthy human donors were counted and centrifuged at 400 xg for 3 minutes.
  • PBMC were resuspended in PBS containing CFSE dye (Biolegend, 1:2000 dilution) at a concentration of 5 x 10 6 cells/ml. After this step, the cells were incubated in an incubator at 37°C for 20 minutes while protecting the cells from direct sunlight. Afterwards, the tube was filled with R10 medium and the cells were incubated for another 10 minutes in an incubator at 37°C.
  • PBMC Plasma-derived Cells
  • 7A615TL-2 fusion protein at a concentration of 3876 pM or soluble IL-15 (Peprotech) and then incubated at 37 °C and 5% CO 2 for 7 days. Afterwards, the cells were centrifuged at 400 1:50), and Fixable Viability Dye eFluor 780 (eBioscience; 65-0865-18)). The cells were incubated at room temperature for 10 minutes, then centrifuged at 400 xg for 3 minutes and washed in 100 ⁇ l of PBS.
  • T cells were defined as CD3+CD56-
  • NKT cells were defined as CD3+CD56+
  • NK cells were defined as CD3-CD56+, respectively.
  • a threshold was set using an unstimulated control for each donor.
  • T cells T cells
  • NKT cells NKT cells
  • 7c NK cells
  • T cells T cells
  • NKT cells NKT cells
  • NK cells NK cells
  • Example 9 Effect of fusion protein on increasing cytokine expression in NK cells
  • PBMCs obtained from healthy human donors were cultured in R10 medium (RPMI1640 medium containing 10% (v/v) FBS (Gibco), Penicillin-Streptomycin (Sigma), and L-glutamine (Sigma) in 96-well U-bottom plates. (Gibco)) at an amount of 500,000 per well.
  • Cells were stimulated with IL-15 or 7A615TL-2 fusion protein at a concentration of 378.6 pM for 1 hour at 37°C and 5% CO 2 , then centrifuged at 400 xg for 3 minutes and washed five times at R10. Cells were left at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours.
  • Cells were centrifuged at 400 xg for 3 minutes, washed with 100 ⁇ l of PBS, and then resuspended in 50 ⁇ l of fixation buffer (Biolegend). Cells were cultured in dark conditions for 30 minutes at room temperature. Afterwards, the cells were centrifuged at 400 The cells were cultured in perm buffer at room temperature in dark conditions for 1 hour, centrifuged at 400 xg, and the supernatant was removed.
  • fixation buffer Biolegend
  • Cells were resuspended in 50 ⁇ l of perm buffer containing the following antibodies for 30 minutes at room temperature in dark conditions; CD3-APC (1:50), CD4-AlexaFluor700 (1:50), CD8-PerCP (1:50), CD56-BV421 (1:50) and IFNg-FITC (1:50). All of the above antibodies were obtained from Biolegend. After centrifuging the cells at 400 xg and removing the supernatant, the cells were resuspended in 100 ⁇ l of PBS and analyzed using a CytoFlex flow cytometer.
  • Frozen human PBMCs were thawed, washed, and resuspended in complete medium (RPMI Merk, UK, plus 10% (v/v) FCS Merk, UK). Cells were stimulated with 68.7 nM of IL-15 (peprotech) or 7A615TL-2 fusion protein for 1 hour. Cells were stimulated at a density of 5x10 6 cells/ml. Cells were washed five times for 3 min at 1500 rpm in complete medium (2 ml each). After washing, the cells were resuspended at a density of 2x10 6 cells/ml (to make 100,000 cells in 50 ⁇ l), transferred to a 96-well U bottom plate, and left for 24 hours (resting).
  • complete medium RPMI Merk, UK, plus 10% (v/v) FCS Merk, UK. Cells were stimulated with 68.7 nM of IL-15 (peprotech) or 7A615TL-2 fusion protein for 1 hour. Cells were stimulate
  • adherent A549-GFP target cells (A549-GFP (lung) MERK (ECACC) cat# 86012804-1VL) were washed with PBS (phosphate-buffer saline) and incubated for 5 days at 37°C and 5% CO 2 . Incubation in Trypsin/EDTA (0.05%, Gibco, Fisher UK) for 10 min. A549 cells were harvested and pelleted by centrifugation at 500 xg for 5 min.
  • PBS phosphate-buffer saline
  • the supernatant was removed, and the A549-GFP cells were resuspended in complete medium (RPMI Merk, UK and 10% FCS Merk, UK), and then seeded in a 96 flat-bottom well plate in an amount of 5 x 10 3 cells/well in 50 ⁇ l. It was seeded. Cells were left at 37°C and 5% CO 2 for 3 hours to attach. The previously prepared PBMCs were added to the attached A549-GFP cells at an amount of 1 x 10 5 cells/ml in 50 ⁇ l/well. Anti-CD3 antibody (Biolegend) was added at an amount of 10 ng/ml.
  • DRAQ7 (Biolegend), a marker of dead cells, was diluted 1/200 and added to each well at a final concentration of 1.5 ⁇ M.
  • the co-cultures were then grown in IncuCyte (Sartorius, UK) at 37°C and 5% CO 2 . Four images were taken every two hours for five days. Analysis was performed using IncuCyte's native software.
  • Figure 9 shows the change in the number of A549 cells (log2 fold change) over time, and B) shows the area under the curve of A).
  • PBMC treated with anti-CD3 antibody alone or anti-CD3 antibody + IL-15 PBMC cells activated with the 7A615TL-2 fusion protein of the present application showed a high level of cytotoxicity against the A549-GFP target cell line. In particular, it showed sustained cytotoxicity for a long time (up to 72 hours later) compared to PBMC treated with anti-CD3 antibody + IL-15.
  • NK cells were isolated using magnetic bead isolation (Miltney UK). The cells were pre-activated by culturing for 24 hours at 37°C, 5% CO 2 in the presence or absence of 10 ⁇ g/ml of 7A615TL-2 fusion protein or Pembrolizumab (Invivogen).
  • adherent MCF-7-GFP target cells MCF7-GFP (breast); MacroPhox Ltd) were lifted by washing with PBS and then incubated in trypsin/EDTA (0.05%, Gibco, Fisher UK) at 37 °C, 5% CO. It was incubated for 5 minutes under CO 2 conditions.
  • MCF-7 cells were harvested and pelleted by centrifugation at 500 xg for 5 minutes. The supernatant was removed, the MCF-7-GFP cells were resuspended in complete medium (RPMI Merk, UK, plus 10% (v/v) FCS Merk, UK), and then seeded at 1 x 10 4 cells/in a 96 flat-bottom well plate. It was added in an amount of 50 ⁇ l to the well. Cells were allowed to attach by resting at 37° C., 5% CO 2 for 3 hours. The previously prepared activated NK cells were added to the attached MCF-7-GFP cells at an amount of 1 x 10 5 cells/ml in 50 ⁇ l/well.

Abstract

TIGIT에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 인터류킨-15(IL-15)를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질의 의약 용도가 제공된다.

Description

TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 및 인터류킨-15를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2022년 6월 10일자 대한민국 특허출원 제10-2022-0070914호에, 2022년 9월 5일자 대한민국 특허출원 제10-2022-0112314호, 및 2023년 1월 18일자 대한민국 특허출원 제10-2023-0007617호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
TIGIT에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 인터류킨-15(IL-15)를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질의 의약 용도에 관한 것이다.
암 면역요법은 체내 면역작용을 이용해서 암을 치료하는 방법으로, 화학요법, 외과요법, 방사선 요법에 이어 암의 제4 치료법으로 불린다. 암 면역요법은 면역계를 활성화시켜 종양 세포에 대한 인식 및 반응을 증가시키는 메커니즘을 필요로 한다. 면역계 활성화는 항원-특이적 반응의 개시에 중요한 항원-제시 세포 및 종양 세포 파괴를 담당하는 이펙터(effector) 세포 등과 같은 다양한 세포의 기능을 수반하는 복잡한 메카니즘이다.
상기 이펙터 세포의 대표적인 예로서 세포독성 T 세포를 들 수 있다.
한편, TIGIT (T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain)은 WUCAM, VSIG9 또는 Vstm3로도 지칭되며, NK, CD8+ 및 CD4+ T 세포뿐만 아니라 조절 T 세포 (regulatory T　cell; "Treg")에서도 우선적으로 발현되는 공동-억제 수용체이다.　TIGIT는 세포 내의 ITIM 도메인, 막관통 도메인, 및 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 막관통 단백질이다.
TIGIT　발현은 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL) 및 감염과 같은 질병 환경에서 증가된다.　TIGIT　발현은　TIGIT　음성 세포와 비교하여 낮은 이펙터 기능을 갖는 exhausted T 세포의 표지가 될 수 있다. 또한,　TIGIT를 발현하는 Treg 세포는　TIGIT　음성 Treg 집단과 비교하여 향상된 면역억제 활성을 나타낸다.
이러한 점에 기초할 때, TIGIT에 대하여 길항작용을 하는 약물 (예컨대, 길항성 항-TIGIT　항체 등)은 면역계 활성화를 유도하고 암 등의 질병상태에서의 면역 반응을 증진시켜 질병 치료에 유리한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
일 예는 (1) TIGIT을 특이적으로 인식하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 (2) IL-15를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일 예에서, 상기 융합 단백질에 있어서, 상기 IL-15는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 중쇄 (중쇄 가변영역 또는 중쇄 불변영역) 또는 경쇄 (경쇄 가변영역 또는 경쇄 불변영역)의 C-말단 및/또는 N-말단에 링커를 통하여 연결되거나 링커 없이 직접 연결될 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서, TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 및 IL-15를 포함하는 융합 단백질 및 이의 의약 용도가 제공된다. 상기 융합 단백질은 (1) 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 의하여 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 활성을 가지며, (2) IL-15에 의하여 수용체와의 결합력이 우수하면서도 면역원성이 낮은 이점을 가질 수 있어서, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
용어의 정의
본 명세서에서, 핵산 분자("폴리뉴클레오타이드" 또는 "유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다, 또는 상기 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동성"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 잘 알려진 알고리즘 BLAST 또는 FASTA 등을 사용하여 결정할 수 있으며, 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
융합 단백질
본 명세서에서, 일 예는 (1) TIGIT을 특이적으로 인식하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 (2) IL-15를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 활성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 IL-15는 수용체와의 결합력이 우수하고 면역원성이 낮아서, 생체에 투여시 면역증강 효과가 우수하면서도 이를 면역원으로 인식하는 면역반응 유발 위험이 낮은 안전한 폴리펩타이드이다. 따라서, 상기 융합 단백질은 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
일 예에서, 상기 융합 단백질에 있어서, 상기 IL-15는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 중쇄 (중쇄 가변영역 또는 중쇄 불변영역) 또는 경쇄 (경쇄 가변영역 또는 경쇄 불변영역)의 C-말단 및/또는 N-말단에 링커를 통하여 연결되거나 링커 없이 직접 연결될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 융합 단백질은, (1) 항-TIGIT 항체 (예컨대, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 IgG 타입 항체) 및 (2) IL-15를 하나 포함하고, 상기 IL-15는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 중쇄 중 어느 하나 또는 2개의 경쇄 중 어느 하나의 C-말단 (불변영역의 C-말단) 또는 N-말단에 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은, (1) 항-TIGIT 항체 (예컨대, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 IgG 타입 항체) 및 (2) 2 개의 IL-15를 포함하고, 상기 2개의 IL-15는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 중쇄 또는 2개의 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 각각 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 융합 단백질에 있어서,
(i) 상기 2개의 IL-15 중 어느 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 중쇄 중 어느 하나의 C-말단 (즉, 중쇄 불변영역(예컨대, Fc)의 C-말단) 또는 N-말단 (즉, 중쇄 가변영역의 N 말단)에, 다른 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 다른 하나의 중쇄의 C-말단 (즉, 중쇄 불변영역(예컨대, Fc)의 C-말단) 또는 N-말단 (즉, 중쇄 가변영역의 N 말단)에, 링커를 통하거나 통하지 않고 연결되거나, 또는
(ii) 상기 2개의 IL-15 중 어느 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 경쇄 중 어느 하나의 C-말단 (즉, 경쇄 불변영역의 C-말단) 또는 N-말단 (즉, 경쇄 가변영역의 N-말단)에, 다른 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 다른 하나의 경쇄의 C-말단 (즉, 경쇄 불변영역의 C-말단) 또는 N-말단 (즉, 경쇄 가변영역의 N-말단)에, 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 융합 단백질에 있어서,
(i) 상기 2개의 IL-15 중 어느 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 중쇄 중 어느 하나의 Fc의 C-말단에, 다른 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 다른 하나의 Fc의 C-말단에, 링커를 통하거나 통하지 않고 연결되거나, 또는
(ii) 상기 2개의 IL-15 중 어느 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 2개의 경쇄 중 어느 하나의 불변영역의 C-말단에, 다른 하나는 상기 항-TIGIT 항체의 다른 하나의 경쇄의 불변영역의 C-말단에, 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다.
상기 링커는 경직성 펩타이드 링커 (예컨대, [EAAAK]n (n은 [EAAAK]의 개수로서 1 내지 5의 정수임)), 유연성 펩타이드 링커 (예컨대, [(G)mS]l (m은 G의 개수로서 1 내지 5의 정수임, l은 [(G)mS]의 개수로서 1 내지 5의 정수임)) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1, 2, 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
서열번호 4, 5, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
서열번호 7, 8, 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
서열번호 10, 13, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
서열번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
서열번호 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1)는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 6개 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)을 아래의 표 1에 정리하였다:
서열 서열번호
CDR-H1 SDYAWN 1
CDR-H1 GSTFTEYTMH 2
CDR-H1 GYSFTDYIMN 3
CDR-H2 YISYSGSARYNPSLKS 4
CDR-H2 GLNPNNGGTSYNQRFKD 5
CDR-H2 LSIPYNGGTSYNQKFEG 6
CDR-H3 KGYPAYFAY 7
CDR-H3 GTYYDYSFAY 8
CDR-H3 GIKGYFAMDY 9
CDR-L1 XASQDVSTAVA (X=K or R) 10
CDR-L1 KASQDVSTAVA 11
CDR-L1 RASQDVSTAVA 12
CDR-L1 KASHYVSTAVA 13
CDR-L1 RSSQSLVNSFGKTYLS 14
CDR-L2 SASYRYT 15
CDR-L2 SPSYRYT 16
CDR-L2 GVSNRFS 17
CDR-L3 QHHYSTPYT 18
CDR-L3 HQHYSTPWT 19
CDR-L3 LQGTHQPWT 20
(상기 표 1에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)
구체예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1, 2, 또는 3의 CDR-H1, 서열번호 4, 5, 또는 6의 CDR-H2, 및 서열번호 7, 8, 또는 9의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 10 (예컨대, 서열번호 11 또는 서열번호 12), 13, 또는 14의 CDR-L1, 서열번호 15, 16, 또는 17의 CDR-L2, 및 서열번호 18, 19, 또는 20의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
경우에 따라서(예컨대, 재조합적으로 제작시), 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역은 N 말단에 적절한 신호서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 예시하였다:
가변영역 아미노산 서열(N→C) 서열번호
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRISITRDTSMNQFFLQLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 21
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSMNQFSLKLNSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 22
중쇄가변영역 DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 23
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 24
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 25
중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 26
중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSA 27
중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSS 28
경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPELLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQHHYSTPYTFGGGTKLEMK 29
경쇄가변영역 DIVMTQSHSFLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPELLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEMK 30
경쇄가변영역 DIVMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 31
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 32
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 33
경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 34
경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIK 35
경쇄가변영역 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIK 36
(표 2에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄)
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT 단백질, 예컨대, 인간 TIGIT 단백질(서열번호 64; NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)의 아미노산 잔기 51-70 영역(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; 서열번호 37) 중 선택되는 하나 이상 또는 2개 이상(예컨대, 연속하여 위치함)의 아미노산에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[인간 TIGIT 단백질 (UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)]
1 MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS GMMTGTIETT GNISAEKGGS IILQCHLSST TAQVTQVNWE
61 QQDQLLAICN ADLGWHISPS FKDRVAPGPG LGLTLQSLTV NDTGEYFCIY HTYPDGTYTG
121 RIFLEVLESS VAEHGARFQI PLLGAMAATL VVICTAVIVV VALTRKKKAL RIHSVEGDLR
181 RKSAGQEEWS PSAPSPPGSC VQAEAAPAGL CGEQRGEDCA ELHDYFNVLS YRSLGNCSFF
241 TETG
본 명세서에서 "항체"라 함은, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질 또는 이를 화학적 합성 또는 재조합적으로 제조한 단백질일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및/또는 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 인간 IgG형 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 형태의 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
완전한 항체(예컨대, IgG형)는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 중쇄 불변영역으로서 IgG의 불변영역, 경쇄 불변영역으로서 카파 불변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 IgG(예컨대, 인간 IgG1)의 불변영역은 야생형일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 IgG의 불변영역은, 인간 IgG1을 기준으로, S240D(240번째 아미노산인 S가 D로 치환됨, 이하 아미노산 변이는 동일한 방식으로 표현됨), A331L, I333E, N298A, S299A, E334A, K335A, L235A, L236A, P330G, 및 K478 결실(ΔK478)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 변이형일 수 있으며, 예컨대, 다음의 변이를 포함하는 변이형일 수 있다:
(1) S240D, A331L, 및 I333E;
(2) N298A;
(3) S299A, E334A, 및 K335A;
(4) L235A, L236A 및 P330G; 또는
(5) K478 결실.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미하는 것으로, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된 것이다.
본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 항원결합단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
용어, "항원결합단편"은 항원이 결합할 수 있는 부분(예컨대, 본 명세서에서 정의된 6개의 CDR)을 포함하는 모든 형태의 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원결합단편 중, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
본 명세서에서 제공되는　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체는 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 TIGIT의 수용체 결합 도메인과의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해TIGIT의 수용체 결합 도메인에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정할 수 있다.
최종 선택된 항체들은 항원결합부위를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체의 항원결합단편은 상기 항-TIGIT 항체에서 유래하고 항원(TIGIT)에 대한 결합력을 보유하는 단편을 의미하는 것으로, 상기한 항-TIGIT 항체의 6개의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어 scFv, scFv-Fc, scFv-Ck(카파 불변영역), scFv-Cλ(람다 불변영역), (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항원결합단편은 scFv, 또는 scFv가 면역글로불린 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등)의 Fc 부위와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Fc) 또는 경쇄의 불변 영역 (예컨대, 카파 또는 람다)와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Ck 또는 scFv-Cλ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 항체(예컨대, CDR, 가변영역, 또는 중쇄/경쇄, 항원결합단편 등)가 "특정 아미노산 서열을 포함한다, 또는 특정 아미노산 서열로 이루어진다 또는 포함된다" 함은 상기 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 경우, 및 상기 아미노산 서열에 항체 활성 (예컨대, 항원 친화도, 약리적 활성 등)에 유의한 영향이 없는 무의미한 변이(예컨대, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 추가)가 도입된 경우를 모두 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT (e.g., 인간 TIGIT)에 대한 결합 친화도 (KD)가, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance, SPR)으로 측정된 경우를 기준으로, 10mM 이하, 5 mM 이하, 1mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 0.1mM 이하, 0.05mM 이하, 0.01mM 이하, 0.005mM 이하, 또는 0.001mM 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.0001nM 내지 10mM, 0.0005nM 내지 10mM, 0.001nM 내지 10mM, 0.005nM 내지 10mM, 0.01nM 내지 10mM, 0.05nM 내지 10mM, 0.1nM 내지 10mM, 0.5nM 내지 10mM, 1nM 내지 10mM, 0.0001nM 내지 5mM, 0.0005nM 내지 5mM, 0.001nM 내지 5mM, 0.005nM 내지 5mM, 0.01nM 내지 5mM, 0.05nM 내지 5mM, 0.1nM 내지 5mM, 0.5nM 내지 5mM, 1nM 내지 5mM, 0.0001nM 내지 1mM, 0.0005nM 내지 1mM, 0.001nM 내지 1mM, 0.005nM 내지 1mM, 0.01nM 내지 1mM, 0.05nM 내지 1mM, 0.1nM 내지 1mM, 0.5nM 내지 1mM, 1nM 내지 1mM, 0.0001nM 내지 0.5mM, 0.0005nM 내지 0.5mM, 0.001nM 내지 0.5mM, 0.005nM 내지 0.5mM, 0.01nM 내지 0.5mM, 0.05nM 내지 0.5mM, 0.1nM 내지 0.5mM, 0.5nM 내지 0.5mM, 1nM 내지 0.5mM, 0.0001nM 내지 0.2mM, 0.0005nM 내지 0.2mM, 0.001nM 내지 0.2mM, 0.005nM 내지 0.2mM, 0.01nM 내지 0.2mM, 0.05nM 내지 0.2mM, 0.1nM 내지 0.2mM, 0.5nM 내지 0.2mM, 1nM 내지 0.2mM, 0.0001nM 내지 0.1mM, 0.0005nM 내지 0.1mM, 0.001nM 내지 0.1mM, 0.005nM 내지 0.1mM, 0.01nM 내지 0.1mM, 0.05nM 내지 0.1mM, 0.1nM 내지 0.1mM, 0.5nM 내지 0.1mM, 1nM 내지 0.1mM, 0.0001nM 내지 0.05mM, 0.0005nM 내지 0.05mM, 0.001nM 내지 0.05mM, 0.005nM 내지 0.05mM, 0.01nM 내지 0.05mM, 0.05nM 내지 0.05mM, 0.1nM 내지 0.05mM, 0.5nM 내지 0.05mM, 1nM 내지 0.05mM, 0.0001nM 내지 0.01mM, 0.0005nM 내지 0.01mM, 0.001nM 내지 0.01mM, 0.005nM 내지 0.01mM, 0.01nM 내지 0.01mM, 0.05nM 내지 0.01mM, 0.1nM 내지 0.01mM, 0.5nM 내지 0.01mM, 또는 1nM 내지 0.01mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인터류킨-15 (IL-15)
상기 인터류킨-15(IL-15)는,
(1) 야생형 IL-15 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드 (1)과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
인터류킨-15(IL-15)는 인터류킨-2(IL-2)와 구조적 유사성을 가지며, IL-2/IL-15 수용체 베타 체인 (CD122) 및 공통된 감마 체인　(gamma-C, CD132) 복합체에 결합하고 이를 통하여 신호전달에 관여한다. 일 예에서, 인터류킨-15는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, NCBI Accession No. NP_000576.1 (아미노산 잔기 49~162 부위) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 IL-15는 다음의 아미노산 서열로 표현되는 것일 수 있다(N말단 → C말단):
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 38)
상기 폴리펩타이드 (1)은 부가적 목적을 위하여 위한 추가의 올리고펩타이드를 포함할 수 있으며, 예컨대, 단백질 정제 편의를 위하여, N-말단에 표지를 위한 Tag (예컨대, MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGDYKDDDDKIEGR(서열번호 76) 등) 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인터류킨-15는 인간 유래의 것이어서 인체내 투여시 면역원성이 낮은 것을 특징으로 한다.
상기 IL-15는 수용체에 대한 결합 활성 (예컨대, IL-2/IL-15 수용체 베타 체인 (CD122) 및/또는 IL-2/IL-15 수용체 베타 체인 (CD122)과 공통된 감마 체인　(gamma-C, CD132) 복합체에 대한 결합 활성), 및/또는 면역세포 (예컨대, T 세포 (CD4+, CD8+), NK 세포 등)에서의 사이토카인 생산 및/또는 분비 활성을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IL-15는,
(1) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드 (1)과 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 가지고, IL-2/IL-15 수용체에 대한 결합 활성 및/또는 면역세포에서의 사이토카인 생산 및/또는 분비 활성을 가지는 폴리펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 IL-15는 우수한 IL-2/IL-15 수용체에 대한 결합 활성, 및/또는 면역세포에서의 사이토카인 생산 및/또는 분비 활성, 및/또는 항암 활성 (예, 암세포 증식 억제, 암세포 사멸 등)을 가지는 것일 수 있다.
링커
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 예컨대, [EAAAK]n (n은 [EAAAK](서열번호 77)의 개수로서 1 내지 5의 정수임), [(G)mS]l (m은 G의 개수로서 1 내지 5의 정수임, l은 [(G)mS]의 개수로서 1 내지 5의 정수임), A EAAAK A(서열번호 78), A EAAAK EAAAK A(서열번호 79), A EAAAK EAAAK EAAAK A(서열번호 80), A EAAAK EAAAK EAAAK EAAAK A(서열번호 81), A EAAAK EAAAK EAAAK EAAAK EAAAK A(서열번호 82), AEAAAKEAAAKAG(서열번호 83), AEAAAKEAAAKAGS(서열번호 84), GGGGG(서열번호 85), GGAGG(서열번호 86), GGGGGGGG(서열번호 87), GAGAGAGAGA(서열번호 88), RPLSYRPPFPFGFPSVRP(서열번호 89), YPRSIYIRRRHPSPSLTT(서열번호 90), TPSHLSHILPSFGLPTFN(서열번호 91), RPVSPFTFPRLSNSWLPA(서열번호 92), SPAAHFPRSIPRPGPIRT(서열번호 93), APGPSAPSHRSLPSRAFG(서열번호 94), PRNSIHFLHPLLVAPLGA(서열번호 95), MPSLSGVLQVRYLSPPDL(서열번호 96), SPQYPSPLTLTLPPHPSL(서열번호 97), NPSLNPPSYLHRAPSRIS(서열번호 98), LPWRTSLLPSLPLRRRP(서열번호 99), PPLFAKGPVGLLSRSFPP(서열번호 100), VPPAPVVSLRSAHARPPY(서열번호 101), LRPTPPRVRSYTCCPTP(서열번호 102), PNVAHVLPLL TVPWDNLR(서열번호 103), CNPLLPLCARSPAVRTFP(서열번호 104), LGTPTPTPTPTGEF(서열번호 105), EDFTRGKL(서열번호 106), L EAAAR EAAAR EAAAR EAAAR(서열번호 107), L EAAAR EAAAR EAAAR(서열번호 108), L EAAAR(서열번호 109), L EAAAR EAAAR (서열번호 110), EAAAR EAAAR EAAAR EAAAR(서열번호 111), EAAAR EAAAR EAAAR(서열번호 112), EAAAR EAAAR(서열번호 113), EAAAR(서열번호 114), LTEEQQEGGG(서열번호 115), TEEQQEGGG(서열번호 116), LAKLKQKTEQLQDRIAGGG(서열번호 117), LELKTPLGDT(서열번호 118), THTCPRCPEP(서열번호 119), KSCDTPPPCP(서열번호 120), RCPEPKSCDT(서열번호 121), PPPCPRCPEP(서열번호 122), KSCDTPPPCP(서열번호 123), RCPGG(서열번호 124), 및 LEPKSSDKTHTSPPSPGG(서열번호 125) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 펩타이드 링커는 [EAAAK]n (n은 [EAAAK]의 개수로서 1 내지 5의 정수임)와 같은 강직성 링커 (rigid linker) 또는 [(G)mS]l (m은 G의 개수로서 1 내지 5의 정수임, l은 [(G)mS]의 개수로서 1 내지 5의 정수임)와 같은 유연성 링커 (flexible linker) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 분자, 재조합 벡터, 및 재조합 세포
다른 예는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 상기 핵산 분자의 발현 벡터로 사용될 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 상기 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계는 앞서 설명한 재조합 세포를 통상의 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO, DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환(재조합 벡터 도입)된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 배양함으로써 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
의약 용도
본 명세서에서 제공되는 융합 단백질에 포함된 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용(예컨대, TIGIT과 이의 리간드인 CD155(PVR)와의 상호작용 등)을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T 세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가질 뿐 아니라 우수한 항암 효과 (예컨대, 암세포 사멸, 암세포 증식 억제 등)를 가진다. 또한 IL-15는 수용체(IL-2/IL-15 수용체)와의 결합력이 우수하고 면역원성이 낮아서, 생체에 투여시 사이토카인 분비 증가 등의 면역증강 효과가 우수하면서도 면역원으로 작용하지 않아서 이를 면역원으로 인식하는 면역반응 유발 위험이 낮아 안전성이 확보될 수 있다는 이점을 가질 뿐 아니라, 우수한 항암효과 (예컨대, 암세포 사멸, 암세포 증식 억제 등)를 가진다. 따라서, 상기 융합 펩타이드는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-15의 이점을 모두 가지며, 면역증강, 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
일 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다. 상기 면역증강 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역증강을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역증강, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도, 또는 면역증강, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "면역증강"은 항원에 대한 초기 면역반응을 유도하거나 기존의 면역반응을 증가시키는 것을 의미할 수 있으며, 면역강화, 면역활성화 등의 용어와 동등한 의미로 호환될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질의 “면역증강 효과”는 면역세포(NK 세포, NKT 세포, CD3+ T 세포, 이펙터 T 세포 (CD4+ T 세포), 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포) 등))의 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T (Treg) 세포의 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인(IL-2, IFN-gamma 등) 등) 생산 및/또는 분비 증가, IL-15 수용체 (예컨대, 면역세포(NK 세포 등) 표면에 위치)의 활성화 (예컨대, IL2RB/IL2RG dimerization 등으로 확인됨) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "면역 관련 질병"은 면역계의 장애 및/또는 불충분한 활성에 의하여 유발되는 모든 질병을 포괄하는 것으로, 예를 들어, 암, 감염성질환, 자가면역질환, 염증성질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 폐암 (예컨대, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 흑색종 (예컨대, 피부 또는 안구내 흑색종 등), 직장암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 발생 및/또는 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.
상기 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환은 앞서 설명한 면역 강화(예컨대, 면역세포(NK세포, CD3+ T 세포, 이펙터 T 세포 (CD4+ T 세포), 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포) 등))의 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T (Treg) 세포의 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인(IL-2, IFN-gamma 등) 등) 생산 및/또는 분비 증가 등)에 의하여 치료, 완화, 및/또는 예방 가능한 모든 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환 중에서 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 감염성 질환은 바이러스(예, 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스(예컨대, Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS) 바이러스(SARS-CoV, SARS-CoV-2 등), Middle East Respiratory Syndrome(MERS) 바이러스(MERS-CoV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV) 등), 세균, 진균, 기생충과 같이 질병을 일으키는 병원체가 생물체(예, 인간을 포함하는 동물) 내에 전파, 침입하여 발생하는 질병을 총칭하는 것으로, 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원체의 감염 또는 상기 감염으로 인한 질병(감염증)일 수 있다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트 증후군, 루푸스, 쇼그랜 증후군, 중증근무력증, 경피증, 갑상선기증저하증, 갑상선기능항진증, 건선, 백반증, 다발성경화증, 자가면역성 간염, 자가면역성 신장염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 뇌염, 사이토카인 폭풍 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염증성 질환은 염증(예, 만성 염증 또는 급성 염증) 또는 염증으로 인한 질병을 총칭하는 것으로, 예를 들어, 심장 염증(예, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색, 심장막염, 심근염 등), 혈관 염증(예, 죽상경화증, 혈관염, 파종성혈관내응고(DIC), 면역성혈소판감소자반증(ITP), 혈전성혈소판감소자반증(TTP), 빈혈 등), 상기도 염증(예, 급성 비인두염, 알레르기비염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염 등), 하기도 및/또는 폐 염증(예, 기관지염, 기관지확장증, 천식, 만성폐홰성폐질환(COPD), 폐렴, 간질성 폐질환, 결핵 등), 상부 위장관 염증(예, 위염, 식도염 등), 하부 위장관 염증(예, 소장염, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병, 게실염, 과민성대장증후군, 맹장염, 치루 등), 간, 담도 및/또는 췌장 염증(예, 간염, 지방간, 담관염, 담낭염, 췌장염, 제1형 당뇨병 등), 신장(상부요로) 염증(예, 신우신염, 사구체신염, 요로감염증 등), 하부요로 염증(예, 요로감염증, 요관염, 요도염, 방광염, 전립선염/만성골반통증후군 등), 갑상선 및/또는 부갑상선 염증(예, 갑상선염, 부갑상선염 등), 부신 염증(예, 부신염 등), 생식기관 염증(예, 골반내 염증성 질환, 난소염, 고환염, 부고환염 등), 뼈 및/또는 관절 염증(예, 골관절염, 류마티스 관절염, 골수염, 활막염 등), 피부 염증(예, 피부: 연조직염, 단독(Erysipelas), 어루러기, 무좀, 여드름 등), 근육 염증(예, 근염 등), 뇌 염증(예, 뇌염, 주요우울장애 등), 신경 염증(예, 눈, 귀 등 다양한 부위의 신경염, 복합부위 통증 증후군, 길랑-바레 증후군 등), 눈 염증(예, 다래끼, 포도막염, 결막염 등), 귀 염증(예, 중이염, 유양돌기염 등), 구강 염증(예, 구내염, 치주염, 치은염 등), 전신성 염증(예, 전신성 염증반응 증후군(패혈증 등), 대사증후군 관련 질환 등), 복막염, 재관류 손상, 이식거부반응, 과민반응 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 융합 단백질, 및/또는 약학 조성물의 투여 대상은 모든 동물 또는 세포일수 있으며, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택되는 동물, 또는 상기 동물로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대 혈청), 또는 이의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 인간 또는 인간으로부터 분리된 세포, 조직, 체액 (예컨대 혈청)일 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 유효성분으로서의 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 단백질 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 내의 유효성분으로서의 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포의 함량은, 전체 조성물 중량 기준으로, 0.00001 내지 99 중량%, 0.0001 내지 99 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 1 내지 99 중량%, 10 내지 99 중량%, 15 내지 99 중량%, 20 내지 99 중량%, 25 내지 99 중량%, 30 내지 99 중량%, 35 내지 99 중량%, 40 내지 99 중량%, 45 내지 99 중량%, 또는 50 내지 99 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약학 조성물의 투여는 경구 또는 비경구 경로를 통할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.
또한, 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포, 및/또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제, 주사제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분인 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 세포의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분(융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포)을 기준으로 0.00001 내지 1000㎎/kg, 0.00001 내지 500㎎/kg, 0.00001 내지 100㎎/kg, 0.00001 내지 50㎎/kg, 0.0001 내지 1000㎎/kg, 0.0001 내지 500㎎/kg, 0.0001 내지 100㎎/kg, 0.0001 내지 50㎎/kg, 0.001 내지 1000㎎/kg, 0.001 내지 500㎎/kg, 0.001 내지 100㎎/kg, 0.001 내지 50㎎/kg, 0.01 내지 1000㎎/kg, 0.01 내지 500㎎/kg, 0.01 내지 100㎎/kg, 0.01 내지 50㎎/kg, 0.1 내지 1000㎎/kg, 0.1 내지 500㎎/kg, 0.1 내지 100㎎/kg, 또는 0.1 내지 50㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에서 약학적 유효량은 유효성분이 목적하는 약학적 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 의미하는 것으로, 상기한 투여량 범위일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역증강용, 또는 신진대사 증진용 건강기능식품을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질, 상기 융합 단백질을를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
'건강기능식품'은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조(가공)한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 식품 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분의 함량은 식품의 형태, 소망하는 효과, 목적 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없이 결정될 수 있으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.00001 내지 99 중량%, 0.0001 내지 99 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.01 내지 99 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 1 내지 99 중량%, 또는 10 내지 99 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 융합 단백질에 포함된 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용(예컨대, TIGIT과 이의 리간드인 CD155(PVR)와의 상호작용 등)을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 세포의 활성 제어 및/또는 소거, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가질 뿐 아니라 우수한 항암 효과 (예컨대, 암세포 사멸, 암세포 증식 억제 등)를 가진다. 또한 IL-15는 수용체(IL-2/IL-15 수용체)와의 결합력이 우수하고 면역원성이 낮아서, 생체에 투여시 사이토카인 분비 증가 등의 면역증강 효과가 우수하면서도 면역원으로 작용하지 않아서 이를 면역원으로 인식하는 면역반응 유발 위험이 낮아 안전성이 확보될 수 있다는 이점을 가질 뿐 아니라, 우수한 항암효과 (예컨대, 암세포 사멸, 암세포 증식 억제 등)를 가진다. 따라서, 상기 융합 펩타이드는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-15의 이점을 모두 가지며, 면역증강, 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 인간 TIGIT 단백질에 대한 결합친화도를 보여주는 그래프이다.
도 2a 내지 2c는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 면역세포에서의 사이토카인 생산 증가를 보여주는 그래프이다 (2a: CD4+ T 세포, 2b: CD8+ T 세포, 2c: CD56+ NK 세포).
도 3는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 PBMC에서의 사이토카인 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 4a 및 4b는 실시예에 따른 융합 단백질의 면역세포에서의 STAT5 유도를 보여주는 그래프이다 (도 4a: CD8+ T 세포, 4b: NK 세포).
도 5은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 면역세포에서의 장기간 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 조절 T 세포 소거능을 보여주는 그래프이다.
도 7a 내지 7c는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 면역세포 증식능을 보여주는 그래프이다 (7a: T 세포, 7b: NKT 세포, 7c: NK 세포).
도 8는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 NK 세포에서의 지속적인 사이토카인 생산 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 폐암 세포 (A549 세포)에 대한 세포독성을 보여준다.
도 10은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 유방암 세포 (MCF-7 세포)에 대한 세포독성을 보여준다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. [항-TIGIT 단클론 항체]-[야생형 IL-15] 융합 단백질 (7A615, 2B715, & 3F815)의 생성
1.1. [항-TIGIT 단클론 항체]-[야생형 IL-15] 융합 단백질의 발현 및 정제
항-TIGIT 항체와 IL-15가 링커를 통하거나 통하지 않고 융합된 융합 단백질을 아래의 표 3 구조를 가지도록 설계하였다:
Fusion protein name Structure Linker
7A615
(Fusion protein of TIGIT mAb 7A6 with wild type IL-15 at LC linking)		 TIGIT mAb-(LC-(EAAAK)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with rigid linker
TIGIT mAb-(LC-(GGGGS)3-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with flexible linker
7A615-Fc
(Fusion protein of TIGIT mAb 7A6 with wild type IL-15 at FC linking)		 TIGIT mAb-Fc-((EAAAK)3-(IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with rigid linker
TIGIT mAb-Fc-((GGGGS)3-(IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with flexible linker
TIGIT mAb-Fc-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) without linker
2B715
(Fusion protein of TIGIT mAb 2B7 with wild type IL-15 at LC linking)		 TIGIT mAb-(LC-(EAAAK)3-IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with rigid linker
TIGIT mAb-(LC-(GGGGS)3- IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with flexible linker
2B715-Fc
(Fusion protein of TIGIT mAb 2B7 with wild type IL-15 at FC linking)		 TIGIT mAb-Fc-((EAAAK)3-IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with rigid linker
TIGIT mAb-Fc-((GGGGS)3-IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with flexible linker
TIGIT mAb-Fc-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) without linker
3F815
(Fusion protein of TIGIT mAb 3F8 with wild type IL-15 at LC linking)		 TIGIT mAb-(LC-(EAAAK)3- IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with rigid linker
TIGIT mAb-(LC-(GGGGS)3- IL-15)2 Wild type IL-15 fused to LC C-terminus (LC variant) with flexible linker
3F815-Fc
(Fusion protein of TIGIT mAb 3F8 with wild type IL-15 at FC linking)		 TIGIT mAb-Fc-((EAAAK)3-IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with rigid linker
TIGIT mAb-Fc-((GGGGS)3-IL-15)2
 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) with flexible linker
TIGIT mAb-Fc-(IL-15)2 Wild type IL-15 fused to Fc C-terminus (Fc variant) without linker
(상기 표 3에서,항-TIGIT 단클론 항체(TIGIT mAb): 7A6(7A6_VH3/Vk5), 2B7, 3F8;
IL-15: wild type IL-15;
LC variant: IL-15가 항체의 경쇄 불변영역(LC)의 C-말단에 융합;
Fc variants: IL-15가 항체의 중쇄 불변영역(Fc; ΔK478 변이 포함)의 C-말단에 융합)
융합 단백질 생산을 위하여, TIGIT mAb의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자, 및 [링커]-[야생형 IL-15]이 연결된 중쇄 및 경쇄 불변영역의 암호화 유전자를 합성하고, pcDNA3.1 (Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다. CHO-K1 세포 (ATCC)를 plate에 시딩하여 70-90%가 되도록 배양한 다음, 상기 유전자 DNA 1 μg/μl와 Lipofectamine reagent (Thermo)를 각각 Opti-MEM 배양액에 희석하고 1:1로 혼합하였다. 5분 동안 incubation한 뒤, DNA-lipid complex를 CHO-K1세포에 떨어뜨렸다. 이 후 세포를 37℃에서 배양하여 일시적으로 발현시켰다. 배양 상청액을 Protein A 및 preparative SEC으로 정제하였다. 생성된 단백질을 PBS로 버퍼 교환하고, OD280nm 측정으로 정량하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
7A615 (7A6 VH3/Vk5-IL-15)
Components 아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열번호
TIGIT mAb 중쇄가변영역 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSS 24
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGACCGGCTACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCGCCAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCAGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGAGGACACCGCCACCTACTACTGCGCCAGGAAGGGCTACCCCGCCTACTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC 65
TIGIT mAb 중쇄불변영역 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41
GCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG 67
TIGIT mAb 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42
TIGIT mAb 경쇄가변영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIK 34
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGAGCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACCACTACAGCACCCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 66
TIGIT mAb 경쇄불변영역 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 43
AGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC 68
TIGIT mAb 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 44
IL-15 폴리펩타이드 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 38
AACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTCCTGCTGGAGCTGCAGGTGATCAGCCTGGAGAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTCCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGC 69
유연성 링커
(V-1)		 GGGGSGGGGSGGGGS 39
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC 70
강직성 링커
(V-2)		 EAAAKEAAAKEAAAK 40
GAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAG 71
7A615 TL-1
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 45
7A615 TL-2
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 46
7A615 TL-3
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 47
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 44
7A615 TL-4
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 48
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 44
7A615 TL-5
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 없이 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[IL-15]) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSARYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTATYYCARKGYPAYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 49
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 44
2B715
Components 아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열 번호
TIGIT mAb 중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSA 27
GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGACCAGCGGCAGCACCTTCACCGAGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCGGCCTGAACCCCAACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAGGTTCAAGGACAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCACCAGGGGCACCTACTACGACTACAGCTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCC 72
TIGIT mAb 중쇄불변영역 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41
TIGIT mAb 중쇄 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50
TIGIT mAb 경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIK 35
GACATCGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACAGGGTGAGCATCACCTGCAAGGCCAGCCACTACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCCCCAGCTACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCACCAGCACTACAGCACCCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 73
TIGIT mAb 경쇄불변영역 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 43
TIGIT mAb 경쇄 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 51
IL-15 폴리펩타이드 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 38
유연성 링커(V-1) GGGGSGGGGSGGGGS 39
강직성 링커(V-2) EAAAKEAAAKEAAAK 40
2B715 TL-1
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 52
2B715 TL-2
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 53
2B715 TL-3
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 54
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 51
2B715 TL-4
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 55
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 51
2B715 TL-5
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 없이 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 56
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 51
3F815
Components 아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열 번호
TIGIT mAb 중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSS 28
GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACATCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAGTGGATCGGCCTGAGCATCCCCTACAACGGCGGCACCAGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATCAAGGGCTACTTCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC 74
TIGIT mAb 중쇄불변영역 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41
TIGIT mAb 중쇄 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 57
TIGIT mAb 경쇄가변영역 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIK 36
GACGTGGTGGTGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCTTCGGCGACCAGGTGAGCATCAGCTGCAGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGAACAGCTTCGGCAAGACCTACCTGAGCTGGTTCCTGCACAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGATCATGTACGGCGTGAGCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCACCATCAAGCCCGAGGACCTGGGCATGTACTACTGCCTGCAGGGCACCCACCAGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 75
TIGIT mAb 경쇄불변영역 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 43
TIGIT mAb 경쇄 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58
IL-15 폴리펩타이드 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 38
유연성 링커(V-1) GGGGSGGGGSGGGGS 39
강직성 링커(V-2) EAAAKEAAAKEAAAK 40
3F815 TL-1
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 57
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 59
3F815 TL-2
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 경쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 (TIGIT mAb 중쇄(IgG1)) EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 57
경쇄 가닥 ([TIGIT mAb 경쇄(kappk)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 60
3F815 TL-3
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-1을 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-1)]-[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 61
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58
3F815 TL-4
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 V-2를 통하여 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]-[링커(V-2)]-[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEAAAKEAAAKEAAAKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 62
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58
3F815 TL-5
(IL-15(2개)가 항-TIGIT 항체의 중쇄(2개)의 각각의 C 말단에 링커 없이 연결됨)
중쇄 가닥 ([TIGIT mAb 중쇄(IgG1)]- -[IL-15]) EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS 63
경쇄 가닥 (TIGIT mAb 경쇄(kappk)) DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58
상기 표 4 내지 표 6 및 이하의 실시예들에 기재된 융합 단백질에서의 항-TIGIT 항체와 IL-15 사이의 링커와 관련된 표시의 정의를 정리하면 다음과 같다:
TL-1: 항-TIGIT 항체의 경쇄의 C-말단에 결합된 링커 V-1;
TL-2: 항-TIGIT 항체의 경쇄의 C-말단에 결합된 링커 V-2;
TL-3: 항-TIGIT 항체의 중쇄(Fc)의 C-말단에 결합된 링커 V-1;
TL-4: 항-TIGIT 항체의 중쇄(Fc)의 C-말단에 결합된 링커 V-2;
TL-5: 항-TIGIT 항체의 중쇄(Fc)와 IL-15 사이에 링커를 포함하지 않음.
실시예 2. 융합 단백질의 인간 TIGIT에 대한 결합 측정 (ELISA)
ELISA 플레이트를 PBS(Phosphate-Buffered Saline)에 용해된 1 μg/ml 농도의 재조합 인간 TIGIT 단백질(acrobiosystems, China)로 코팅하고 4 °C에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 블로킹 버퍼(3%(v/v) skim milk in PBS)로 1시간 동안 블로킹하고, 연속희석된 항-TIGIT 단클론 항체(7A6) 및 융합 단백질 ([7A6]-[TL-2]-[IL-15]; ‘7A615TL-2’로 표시) (시작 농도: 61.097 nM; 1:3 연속희석)를 상기 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 항-마우스/인간 IgG-HRP 항체(Abcam; 1:10000 희석)를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 TMB 용액으로 전개하고, 1N HCL로 정지시켰다. OD 값은 GloMax® Explorer Fully Loaded를 사용하여 450nM에서의 OD 값(흡광도)를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과에서 보여지는 바와 같이, 7A615TL-2 융합 단백질이 모항체(항-TIGIT 단클론 항체 7A6)와 유사한 정도의 결합친화도로 인간 TIGIT에 결합하였다. 이러한 결과는 IL-15의 항-TIGIT 항체와의 융합이 상기 항체의 항원 결합 부위에 영향을 주지 않고, 모항체의 모든 기능적 특성을 유지함을 보여준다.
실시예 3. 융합 단백질에 의한 인간 PBMCs의 사이토카인 분비 증가
인간 CD3+ T 세포와 CD56+ NK 세포에서의 사이토카인 생산을 측정하기 위해, 인간 유래의 500,000 PBMCs(Stemcell technologies)를 항-TIGIT 7A6 항체(10ug/ml) 또는 융합 단백질(7A615TL-2, 68.79nM) 존재 하에서 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences, 0.2ug/ml; 또는 항-CD4 항체 또는 항-CD8 항체) 및 항-CD28 단클론 항체(BD Biosciences, 1ug/ml)와 함께 배양하였다. 항-TIGIT 항체 또는 7A615TL-2를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 배양 후, 사이토카인의 분비를 막기 위해 Brefeldin A(10ug/ml)를 처리하고 다시 배양기에서 15시간 배양하여, 총 19시간 배양하였다.
사이토카인을 생성하는 세포의 비율을 분석하기 위해 세포들을 4℃에서 10분간 400 x g에서 스핀다운하는 세척 방법을 두 번 반복한 뒤, 다음의 방법으로 세포를 염색하였다: 세포를 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution(Biolegend)으로 20분간 상온에서 염색한 뒤, 10분간 400 x g에서 스핀다운하여 세척한다. 그리고 30분 동안 얼음 위에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD56+ NK 세포 표면 마커에 대한 플루오로포어(fluorophore)-접합 항체로 표지하였다. 이 때 사용된 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-CD56 항체는 모두 Biolegend에서 입수하였다.
eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(eBiosciences)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 세포를 고정화하고 침투화시켰다(permeabilized). 상기 세포를 세포 내 IFN-γ 및 TNFα에 대한 플루오로포어-접합 항체(Biolegend) 로 30분간 상온에서 염색하였다. 상기 세포들을 세척한 뒤, 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 각 세포의 표면 마커 표지 및 사이토카인의 플루오로포어 형광을 탐지하였다. 데이터는 Flowjo software(BD Biosciences)로 분석 및 GraphPad Prism 9 software(Dotmatics)로 도식화하였다.
상기 결과를 도 2a (CD4+ T 세포), 2b (CD8+ T 세포), 및 2c (CD56+ NK 세포)에 나타내었다. 도 2a 내지 2c에 나타난 바와 같이, 본 출원에서 제공되는 융합 단백질은 T 세포와 NK 세포 내에서의 Th1/Tc1 사이토카인(IFN-gamma)과 TNF-alpha의 생산을 증가시키고, 이를 통하여 면역반응을 강화시킴을 확인하였다. 상기 얻어진 결과는 7A615는 항-TIGIT 항체보다 더 강력하고 용량-의존적인 이펙터 T 세포와 NK세포 기능 증진 효과를 가짐을 시사한다.
실시예 4. 융합 단백질에 의한 사이토카인 발현 증가
건강한 기증자로부터 유래한 인간말초혈액단핵세포(PBMC)를 0.15 ~ 0.16 x 106개의 양으로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 항-CD3 항체(Biolegend) 1μg/ml와 함께 37℃ 및 5% CO2에서 44시간 동안 배양하였다. 7A615TL-2 융합 단백질 및 모항체(7A6)를 동일한 양(68.79 nM)으로 배양 배지에 각각 첨가하였다. 배양 부피는 웰당 250μl였다. 배양 후, 4℃에서 10분 동안 원심분리 (660 x g)하여 스핀다운하였다. 상층액을 1.5ml 마이크로원심분리 튜브에 수집하고 -80°C에서 보관하였다.
사이토카인 수준은 Bio-Plex cytokine assay (4-plex; #PPX-04, Invitrogen)을 사용하여 측정하였다. 사이토카인 4-plex 분석은 다음의 4종의 인간 사이토카인에 대하여 수행하였다: IFN-γ, IL-2, TNF-α 및 IL-9에 대하여 수행하였다. 모든 분석은 제조사 지침에 따라 수행하였으며, 결과는 Bio-Plex 200 array reader (Bio-Rad)로 판독하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 항-CD3 단클론 항체로 T 세포를 활성화시킨 인간 PBMC의 배양(in vitro)에 있어서, 본 출원에서 제공되는 융합 단백질(7A615TL-2)로 T 세포를 공동자극하는 경우, 모항체(7A6)로 공동자극하는 경우와 비교하여, 사이토카인(IFN-γ, IL-2, TNF-α 및 IL-9)의 발현 수준이 높게 나타났다.
실시예 5. 융합 단백질에 의한 STAT5 인산화 유도
세포(인간 PBMC)를 해동하고 106 cells/mL 농도로 R10 배지 (10%(v/v) FBS(Gibco), Penicillin-Streptomycin (Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유하는 RPMI1640 배지(Gibco))에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액 100 μl을 각 웰에 시딩하였다 (equaling 1x106 cells/well). 7A615TL-2 융합 단백질을 68.7 nM로 희석하고, 이 농도를 시작 농도로 하여 69fM까지 10배 연속희석하였다. 상기 세포와 융합 단백질을 피펫팅하여 잘 섞은 후, 37℃에서 15분간 배양하였다. 배양 후, 세포를 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 분쇄하였다. 세포를 viability marker (eBioScience, 1:500), 항-CD3 항체(Biolegend, 1:50) 및 항-CD8 항체(Biolegend, 1:50)를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 1:50). 세포를 실온에서 10분 동안 염색한 후, 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 분쇄하였다. 세포를 37℃에서 예열된 Fixation Buffer (Biolegend) 200 μL에 실온에서 15분 동안 재현탁하였다. 그런 다음, 세포를 다시 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 분쇄하고, 세포를 ice-cold True-Nuclear 1X Perm Buffer(Biolegend) 200μL에 재현탁하였다. 이어서, 세포를 냉동고에서 1시간 동안 보관한 후, 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 분쇄하고, 세포를 항-pSTAT5 항체 (Biolegend, 1:25)를 함유하는 염색 버퍼에 실온에서 15분 동안 재현탁시켰다. 세포를 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 분쇄하고, 세포를 PBS에 재현탁하고, 앞서 기재한 바와 같이 다시 펠렛화하였다. 마지막으로, 세포를 PBS 100μL 에 재현탁하고 유세포측정법(CytoFlex, BeckmanCoulter)에 의해 데이터를 획득하였다. 데이터는 FlowJo(BD, USA)로 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4a (CD8+ T 세포) 및 4b (NK 세포)에 나타내었다. 항-TIGIT 항체에 연결된 IL-15는 CD8+ T 세포 및 NK 세포 모두에서 STAT5 인산화를 유도하였다. 일차 세포(primary cell)에서 수용체 이종이합체화는 막을 가로지르는 신호 전달을 유도하여야 한다. IL-15 수용체 복합체 신호 전달의 경우 STAT5의 인산화로 측정할 수 있다. 본 출원에서 제공되는 융합 단백질을 사용한 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 자극은 높은 수준의 STAT5 인산화를 유도하였으며, 이러한 결과는 융합 단백질 내의 IL-15가 강력한 신호 전달을 유도 능력을 상실하지 않았음을 보여준다.
실시예 6. 융합 단백질의 장기간 사이토카인 생성 지속 효과
본 출원에서 제공되는 융합 단백질이 면역세포를 장기간 자극하여 사이토카인 생성을 유도함을 확인하였다.
보다 구체적으로, 7A615TL-2 융합 단백질을 사용한 자극이 장기간 신호를 유발할 수 있는지를 시험하였다.
이를 위하여, 건강한 인간 공여자의 PBMC를 96-웰 U-바닥 플레이트 내의 R10 배지 (10%(v/v) FBS(Gibco), Penicillin-Streptomycin (Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유하는 RPMI1640 배지(Gibco))에 웰당 250,000개의 양으로 시딩하였다. 세포를 37°C 및 5% CO2 조건에서 IL-15 또는 7A615TL-2 융합 단백질 378.6pM 농도로 1시간 동안 자극한 다음, 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 R10에서 5회 세척하였다. 세포를 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24시간 동안 그대로 두었다(resting).
24시간 휴식(resting) 후, 세포를 항-CD3 항체 (CytoStim, 1:500; Miltenyi)로 자극하고, 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. stimulator로서 CytoStim(Miltenyibiotec)를 첨가하고, 2시간 후에 Brefeldin A(Biolegend, 1:1000) 및 Monensin(Biolegend, 1:1000)를 추가로 첨가하였다. 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS에서 세척한 다음, Fixable Viability dye eFluor 780 (Thermo Fisher, 1:500)을 포함하는 PBS 50μl에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 암조건에서 인큐베이션한 다음 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS 100 μl로 세척하였다. 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS 100 μl로 세척한 다음 고정 버퍼(Biolegend) 50 μl에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 30분 동안 암조건에서 배양하였다. 그 후, 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 Perm buffer (Biolegend; diluted to a 1x solution in water) 100 μl로 세척한 다음, perm buffer (Biolegend) 200 μl에 재현탁하였다. 세포를 암조건에서 실온의 perm buffer 에서 1시간 동안 배양한 후, 400 x g에서 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포를 암조건의 실온에서 30분 동안 다음의 항체를 포함하는 perm buffer 50 μl에 재현탁하였다; 항-CD4-AlexaFluor700 항체(1:50), 항-CD8-PerCP 항체(1:50), 항-CD56-BV421 항체(1:50), 항-IL-2-PE 항체(1:50) 및 항-IFN-γ-FITC 항체(1:50). 상기 항체들은 모두 Biolegend에서 입수하였다. 세포를 400 x g에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 세포를 PBS 100 μl에 재현탁하고, CytoFlex 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
CytExpert Software(Beckman Coulter)를 사용하여 FCS 파일을 생성하고, FlowJo v10.8.1을 사용하여 분석하였다. 그래프 생성 및 통계 처리는 GraphPad Prism 9를 사용하여 수행하였다. Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001, **** P≤0.0001.제
상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 융합 단백질로 자극하고 24시간 휴식 후에도 사이토카인 (IL-2, IFN-γ)의 생산이 유의하게 증가하였다. 그러나, 이러한 증가는 IL-15 단독으로 자극되었을 때는 대체적으로 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 본 출원에서 제공되는 융합 단백질 내의 항-TIGIT 항체 성분이 T 세포 표면에서 지속적인 신호 전달을 촉진함과 상기 융합 단백질이 장기간 지속능을 가짐을 보여준다.
실시예 7. 융합 단백질-매개 Treg 세포 소거(depletion)
동결된 인간 말초혁액단핵세포 (Birmingham hospital)를 해동하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 16시간 동안 그대로 두었다. 다음 날, Treg 세포와 NK 세포를 모두 magnetic bead isolation (Miltenyi Biotec)에 의하여 분리하였다. 상기 세포를 계수하고, Treg 1개 당 NK 세포 10개의 비율로 96 U-bottomed plate에 시딩하였다. 7A615TL-2 융합 단백질 10 μg/mL을 웰에 첨가하였다. 상기 공배양된 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 상기 공배양된 세포를 500 x g로 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 볼텍싱하여 파쇄하였다. 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)에 재현탁하고 500 x g로 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 그 후, 상기 세포를 viability marker (eBioScience, at 1:500), 항-CD3 항체 (Biolegend, at 1:50), 항-CD4 항체 (Biolegend, at 1:50), 항-CD127 항체 (Biolegend, 1:50), 항-CD25 (Biolegend, 1:50) 항체, 및 anti-CD56 (Biolegend, 1:50)를 함유하는 염색 버퍼에 재현탁하고, 암조건에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그 후, 세포를 PBS 200 μl로 세척하였다. 마지막으로, 세포를 PBS 100 μl에 재현탁하고, 유세포분석법(CytoFlex, Beckman Coulter)으로 데이터를 얻었다. 상기 데이터는 FlowJo (BD, USA)로 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 본 출원에서 제공되는 융합 단백질은 NK 세포와 Treg 세포의 공배양시에 Treg 세포의 소거능이 우수함을 확인할 수 있다.
실시예 8. 융합 단백질 처리에 의한 T 세포, NKT 세포, 및 NK 세포의 증식
4명의 건강한 인간 공여자로부터 얻은 PBMC를 계수하고, 400 x g로 3 분간 원심분리하였다. PBMC를 CFSE dye (Biolegend, 1:2000 dilution)를 포함하는 PBS에 5 x 106 cells/ml의 농도로 재현탁하였다. 이 단계 이후, 세포를 직사광선으로부터 보호한 채로 세포를 37℃의 인큐베이터에서 20분동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 튜브에 R10 배지를 채우고 세포를 37℃의 인큐베이터에서 10분 더 인큐베이팅하였다. 세포(PBMC)를 400 x g로 3분간 원심분리하여 R10 배지에서 3회 세척한 후, 계수하고 R10 배지 100 μl에 500,000 cells의 양으로 시딩하였다. 세포를 3876 pM 농도의 7A615TL-2 융합 단백질 또는 가용성 soluble IL-15 (Peprotech)로 자극시킨 후, 37 °C, 5 % CO2 조건에서 7일동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 세포를 400 x g로 3분간 원심분리한 후, 항체 칵테일(anti-CD3 APC (Biolegend; 1:50), anti-CD4-AF700 (Biolegend, 1:50), anti-CD56 BV421 (Biolegend, 1:50), 및 Fixable Viability Dye eFluor 780 (eBioscience; 65-0865-18))을 포함하는 PBS 50 μl로 염색하였다. 세포를 실온에서 10분동안 인큐베이팅한 후, 400 x g로 3분간 원심분리하여 PBS 100μl에서 세척하였다. 그 후, 세포를 PBS 100μl에 재현탁하여 CytoFlex Flow Cytometer (Beckman Coulter) 분석에 사용하였다. 얻어진 데이터는 FlowJo v10.8.1로 분석하였다. 게이팅 전략으로서, T 세포는 CD3+CD56-로, NKT 세포는 CD3+CD56+로, NK 세포는 CD3-CD56+로 각각 정의하였다. 세포가 분열함에 따라 CFSE 염료의 수준이 어두워지므로, 전체 분열은 시작 모집단보다 CFSE 발현이 어두운 모든 세포로 게이팅하였다. 각 공여자에 대한 비자극 대조군을 사용하여 임계값(threshold)을 설정하였다. 그래프 생성 및 통계 분석은 GraphPad Prism 9를 사용하여 수행하였다. Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001, **** P≤0.0001.
상기 얻어진 결과를 도 7a(T 세포), 7b(NKT 세포), 및 7c(NK 세포)에 나타내었다. 본 실시예에서 PBMC의 증식 정도를 측정하기 위하여 CFSE 염료로 표지하였다. 세 가지 유형의 세포 집단 (T 세포, NKT 세포, NK 세포) 모두에서, 7A615TL-2 융합 단백질 또는 free IL-15로 자극한 후 현저한 증식을 나타내었으며, 7A615TL-2 융합 단백질로 자극한 경우에 세포 증식 정도가 다소 높게 나타났다. 즉, 7A615TL-2 융합 단백질은 free IL-15와 동등 이상의 수준으로 T 세포, NKT 세포 및 NK 세포 증식을 자극할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 본 출원에서 제공되는 융합 단백질 내의 IL-15가 면역세포 증식을 자극하는 능력을 유지하고 있음을 보여준다.
실시예 9. 융합 단백질의 NK 세포에서의 사이토카인 발현 증가 효과
본 출원에서 제공되는 융합 단백질에 의한 면역세포의 자극이 장기간 신호를 유발할 수 있는지 시험하였다.
이를 위하여 건강한 인간 공여자로부터 얻은 PBMC를 96-웰 U-바닥 플레이트 내의 R10 배지 (10%(v/v) FBS(Gibco), Penicillin-Streptomycin (Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유하는 RPMI1640 배지(Gibco))에 웰당 500,000개의 양으로 시딩하였다. 세포를 37°C 및 5% CO2 조건에서 IL-15 또는 7A615TL-2 융합 단백질 378.6pM 농도로 1시간 동안 자극한 다음, 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 R10에서 5회 세척하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 그대로 두었다(resting).
24시간 휴식(resting) 후, 세포를 IL-12(Peprotech) 50 ng/ml로 자극하고 5% CO2 및 37℃ 조건에서 밤새 배양하였다. stimulator로서 CytoStim (Miltenyibiotec)를 첨가하고 2시간 후에 Brefeldin A(Biolegend, 1:1000) 및 Monensin(Biolegend, 1:1000)를 추가로 첨가하였다. 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS에서 세척한 다음, Fixable Viability dye eFluor 780 (Thermo Fisher, 1:500)을 포함하는 PBS 50μl에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 암조건에서 인큐베이션한 다음 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS 100 μl 로 세척하였다. 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 PBS 100 μl 로 세척한 다음, 고정 버퍼(Biolegend) 50 μl에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 30분 동안 암조건에서 배양하였다. 그 후, 세포를 400 x g에서 3분 동안 원심분리하여 Perm buffer (Biolegend; diluted to a 1x solution in water) 100 μl로 세척한 다음, perm buffer (Biolegend) 200 μl에 재현탁하였다. 세포를 암조건에서 실온의 perm buffer 에서 1시간 동안 배양한 후, 400 x g에서 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포를 암조건의 실온에서 30분 동안 다음의 항체를 포함하는 perm buffer 50 μl에 재현탁하였다; CD3-APC (1:50), CD4-AlexaFluor700 (1:50), CD8-PerCP (1:50), CD56-BV421 (1:50) and IFNg-FITC (1:50). 상기 항체들은 모두 Biolegend에서 입수하였다. 세포를 400 x g에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 세포를 PBS 100 μl에 재현탁하고, CytoFlex 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
CytExpert Software(Beckman Coulter)를 사용하여 FCS 파일을 생성하고, FlowJo v10.8.1을 사용하여 분석하였다. 그래프 생성 및 통계 처리는 GraphPad Prism 9를 사용하여 수행하였다. Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001, **** P≤0.0001.
상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 본 출원의 7A615TL-2 융합 단백질을 사용한 자극한 경우, IL-12로 재자극하기 24시간 전 7A615TL-2 융합단백질을 펄스 자극하였을 때 NK 세포에서 상당히 높은 수준의 IFN-γ 발현을 유도하였다. 반면, 7A6 항체와 IL-15를 병용처리한 경우에는 대조군 (융합 단백질 및 병용 처리 안함)과 비교하여 유의미한 결과가 얻어지지 않았다(n.s. = non-significant). 이러한 결과는 본 출원의 융합 단백질은 지속적인 신호를 제공하여 지속적인 IFN-γ 생산을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 10. 융합 단백질의 세포독성 (폐암 세포; A549)
동결된 인간 PBMC를 해동하고, 세척하고, 완전 배지(RPMI Merk, UK, plus 10%(v/v) FCS Merk, UK)에 재현탁하였다. 세포를 IL-15(peprotech) 또는 7A615TL-2 융합 단백질 68.7nM로 1시간 동안 자극하였다. 세포는 5x106 cells/ml의 밀도로 자극하였다. 세포를 완전 배지(각 2ml)에서 1500rpm으로 3분 동안 5회 세척하였다. 세척 후, 세포를 2x106 cells/ml의 밀도로 재현탁하고(to make 100,000 cells in 50 μl), 96-웰 U 바닥 플레이트로 옮겨 24시간 동안 그대로 두었다(resting).
분석 당일, 부착성 A549-GFP 표적 세포(A549-GFP (lung) MERK (ECACC) cat# 86012804-1VL)를 PBS(phosphate-buffer saline)로 세척한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 5분 동안 Trypsin/EDTA(0.05%, Gibco, Fisher UK)에서 인큐베이션하였다. A549 세포를 수확하고 5분 동안 500 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상층액은 제거하고, A549-GFP 세포를 완전 배지(RPMI Merk, UK 및 10% FCS Merk, UK)에 재현탁한 다음, 96 flat-bottom well plate 에 5 x 103 cells/well in 50 μl의 양으로 시딩하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 3시간 동안 두어 부착시켰다. 앞서 준비한 PBMC를 상기 부착 A549-GFP 세포에 1 x 105 cells/ml in 50 μl/well의 양으로 첨가하였다. 항-CD3 항체(Biolegend)를 10 ng/ml의 양으로 첨가하였다 사멸 세포의 표지인 DRAQ7 (Biolegend)을 각 웰에 1/200로 희석하여 최종 농도 1.5 μM로 첨가하였다. 그런 다음 공동 배양물을 IncuCyte(Sartorius, UK) 내에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 5일 동안 2시간마다 4개의 이미지를 촬영하였다. IncuCyte’s native software를 사용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다 [A)는 시간에 따른 A549 세포 개수의 변화(log2 fold change)를 보여주고, B)는 A)의 곡선 아래 면적을 보여줌]. 미처리군, 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD3 항체+IL-15 처리된 PBMC와 비교하여, 본 출원의 7A615TL-2 융합 단백질로 활성화된 PBMC 세포는 A549-GFP 표적 세포주에 대해 높은 수준의 세포독성을 나타내었으며, 특히, 항-CD3 항체+IL-15 처리된 PBMC와 비교하여 장시간 동안 (72시간 이후까지) 지속적인 세포 독성을 보였다.
실시예 12. 융합 단백질의 세포독성 (유방암 세포; MCF-7)
동결된 인간 PBMC를 해동하였다. magnetic bead isolation (Miltney UK)를 사용하여 NK 세포를 분리하였다. 상기 세포를 10 μg/ml의 7A615TL-2 융합 단백질 또는 Pembrolizumab (Invivogen)의 존재 또는 부재 하에서 37 ℃, 5 % CO2에서 24시간 동안 배양하여 사전 활성화시켰다. 분석 당일, 접착성 MCF-7-GFP 표적 세포 (MCF7-GFP (breast); MacroPhox Ltd)를 PBS로 세척하여 들어올린 다음, 트립신/EDTA(0.05%, Gibco, Fisher UK)에서 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 5분 동안 배양하였다. MCF-7 세포를 수확하고 500 x g으로 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고 MCF-7-GFP 세포를 완전 배지(RPMI Merk, UK, plus 10%(v/v) FCS Merk, UK)에 재현탁한 다음, 96 flat-bottom well plate 에 1 x 104 cells/well in 50 μl의 양으로 첨가하였다. 세포를 37 ℃, 5 % CO2에서 3시간 동안 휴지(resting)시켜 부착시켰다. 앞서 준비된 활성화된 NK 세포를 부착 MCF-7-GFP 세포에 1 x 105 cells/ml in 50 μl/well의 양으로 첨가하였다. 상기 웰에 7A615TL-2 융합 단백질 또는 Pembrolizumab (Invivogen) 10 μg/ml을 추가로 첨가하였다. 이어서, 공동 배양물을 IncuCyte(Sartorius, UK) 내에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 6일 동안 2시간마다 4개의 이미지를 촬영하였다. IncuCyte’s native software를 사용하여 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다 [A)는 시간에 따른 MCF-7 세포 개수의 변화(log2 fold change)를 보여주고, B)는 A)의 곡선 아래 면적을 보여줌]. 무처리군 또는 Pembrolizumab 처리군와 비교하여, 본 출원의 7A615TL-2 융합 단백질을 처리한 NK 세포는 MCF-7-GFP 표적 세포주에 대해 높은 수준의 세포 독성을 나타내었다.

Claims (17)

  1. 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및
    인터류킨-15(IL-15)
    를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
    서열번호 1, 2, 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 4, 5, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 7, 8, 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 10, 13, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    서열번호 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    를 포함하는 것인,
    융합 단백질
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3;
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
    서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체는 동물 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원결합단편은 상기 항-TIGIT 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인터류킨-15는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 인터류킨-15 사이에 펩타이드 링커를 포함하지 않는, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편 및 인터류킨-15 사이에 펩타이드 링커를 포함하는, 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 [EAAAK]n (n은 [EAAAK]의 개수로서 1 내지 5의 정수임) 또는 [(G)mS]l (m은 G의 개수로서 1 내지 5의 정수임, l은 [(G)mS]의 개수로서 1 내지 5의 정수임)인, 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  11. 제10항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제10항의 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역관련 질병은 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환인, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948658A (en) * 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody
US8603466B2 (en) * 2006-03-29 2013-12-10 King's College London Agonist antibodies against TSHR
KR20170041272A (ko) * 2014-08-19 2017-04-14 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-tigit 항체
KR20200128116A (ko) * 2018-02-28 2020-11-11 화이자 인코포레이티드 Il-15 변이체 및 이의 용도
KR20200143250A (ko) * 2019-06-13 2020-12-23 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948658A (en) * 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody
US8603466B2 (en) * 2006-03-29 2013-12-10 King's College London Agonist antibodies against TSHR
KR20170041272A (ko) * 2014-08-19 2017-04-14 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-tigit 항체
KR20200128116A (ko) * 2018-02-28 2020-11-11 화이자 인코포레이티드 Il-15 변이체 및 이의 용도
KR20200143250A (ko) * 2019-06-13 2020-12-23 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도

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