KR20200143250A - Tigit에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TIGIT (T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.

Description

TIGIT에 대한 항체 및 이의 용도 {Antibodies Against T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains and Uses Thereof}
본 발명은 TIGIT (T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.
암 조직들 중에는 면역 세포들이 접근하지 못하는 경우와 면역 세포들이 암 조직 내로 침투해 있으나 암 조직에 의해 면역반응이 억제되어 있는 경우가 있다. 우리 몸의 면역 시스템은 T-세포의 과다증식으로 인한 과다면역 반응을 억제하기 위한 면역검문 체계를 가지고 있는데, 이러한 면역관문에 관여되는 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)을 타겟으로 하는 면역관문 차단제 (immune checkpoint blockade)는 암세포를 직접 targeting하는 방식이 아니라, 암조직 주변에 있으나 암세포들이 발현하는 면역 억제 인자들 (CD80, TIGIT)에 의해 활성이 저하된 TIL(tumor-infiltrating lymphocytes), 특히 CTL(Cytotoxic T cell)의 활성을 회복시켜줌으로써, CTL이 암세포를 제거하도록 유도한다. 이 때, 암세포 표면의 억제인자들과 T 세포 억제 수용체 (inhibitory receptor) 사이의 결합을 막음으로써 억제 신호 전달 (inhibitory signaling)을 막고 다른 자극 신호 전달(stimulatory signaling)들이 유효하게 작용하도록 하여, 결과적으로 CTL의 활성을 높이는 효과를 나타낸다.
기존의 화학치료제들의 경우, 약물의 극심한 부작용으로 약물 투여를 중단해야 하는 경우가 많음에 비해, 면역관문 차단제는 overall survival과 progression-free survival 등에서 임상적 우위를 보이고, 부작용 또한 경미한 정도에 그칠 수 있다. 또한, 기존의 화학치료제들의 경우, 동일 암 재발 시에 치료제에 대한 저항성을 획득하여 투여가 불가능하게 되는 반면, 면역관문 차단제의 투여에 의한 항암 면역반응은 동일 암종의 재발시에 memory response를 일으켜, 신속하게 암세포를 퇴치할 수 있다.
면역관문 차단제와 관련하여, 면역관문 수용체인 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4) 특이적인 단클론 항체인 이필리무맙(ipilimumab)으로, 전이성 악성 흑색종에서 그 효과를 보여 주었다. 이어서, PD-1(programmed cell death-1)과 PD-1에 대한 리간드인 PD-L1 (programmed death ligand-1)에 특이적인 단클론 항체들이 개발되고 있으며, 대표적인 것들로는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 아벨루맙(avelumab), 아테졸리주맙(atezolizumab)과 둘바루맙(durvalumab) 등이 있다. PD-1 또는 PD-L1 억제제는 악성 흑색종 뿐만 아니라 그 효과가 다양한 종양들에서 나타난다.
한편, TIGIT (=Vstm-3, WUCAM)은 PD-1과 마찬가지로 NK세포와 T세포가 활성화되면서 발현이 유도되는 co-inhibitory molecule로, 암세포는 TIGIT에 대한 리간드를 과발현함으로써 T 세포를 억제하여 T 세포로부터의 공격으로부터 빠져나갈 수 있다. 항-TIGIT 항체는 암세포의 TIGIT을 통한 면역활성억제를 차단함으로써 암환자의 면역기능을 회복시켜 암의 진행을 막을 것으로 예상된다.
TIGIT은 PD-1과 유사하게 CD8+CTL과 CD4+ T helper cell에서 유도 발현되고, 암조직에서 면역반응을 억제하는 데 주도적인 역할을 하는 FoxP3+ Treg에서는 PD-1과 함께 지속적으로 발현되며, Treg 활성화시 더 높은 수준으로 유도 발현된다.
현재까지 수 종류의 항-TIGIT 항체가 보고된 바 있지만(미국특허출원 공개 제2017-0088613호 등), 구체적인 기작에 대한 연구는 아직 미미한 실정일 뿐 아니라, 실제 치료제로 사용 가능한 정도의 효력(efficacy)을 가지는 항체가 개발되고 있지는 못한 실정으로, 여전히 높은 수준의 효력을 가지는 TIGIT 특이적 항체에 대한 요구는 여전히 절실한 상황이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 TIGIT에 높은 친화력으로 결합하는 항-TIGIT 항체를 개발하고, 이러한 항-TIGIT 항체가 효율적인 면역 항암 치료제로의 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TIGIT에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 약물과 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TIGIT (T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 서열번호 3, 6, 9 또는 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 4, 7 또는 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 5, 8, 11 또는 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 14, 17, 20, 23 또는 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 15, 18, 21 또는 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 16, 19, 22, 24 또는 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암 치료와 병용하기 위한 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT에 특이적이고, 강하게 결합하며, 기존의 항-TIGIT 항체에 비해 우수한 치료 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 세포 활성화를 통한 항암 면역 치료제로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학 의약품 및 기타 다른 항암 치료제와 병용 치료 요법 등에 활용이 가능하다.
도 1은 scFv 형태의 항-TIGIT 항체의 결합력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 IgG 형태의 항-TIGIT 항체의 결합력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 11종의 항-TIGIT 항체에 대하여 진행한 TIGIT과 이의 리간드인 PVR (poliovirus receptor)에 대한 blocking assay 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Octet을 이용하여 항-TIGIT 항체의 친화도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 BIACORE로 항-TIGIT 항체의 친화도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 세포 표면에 발현한 TIGIT과 TIGIT 후보항체의 결합력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TIGIT의 리간드인 PVR에 대한 TIGIT 후보항체의 경쟁력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 TIGIT 후보항체의 TIGIT과 PVR간의 결합 억제효과로 인한 T 세포 활성화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 TIGIT 후보항체의 생쥐, 원숭이 및 사람의 TIGIT에 대한 결합력이 있는지 교차반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 조절 T 세포 (Regulatory T cell)와 CFSE 표지된 응답기 (responder) 세포를 공동배양하여 TIGIT 후보항체에 의해 조절 T 세포의 기능이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 TIGIT 후보항체의 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 수지상 세포와 동종 이계 T 세포를 이용한 혼합 림프구 반응에서 명시된 항체를 처리했을 때 T 세포의 증식 및 IFN-γ 분비량의 변화를 분석한 결과이다.
도 13은 건강한 공여자의 regulatory T 세포에 명시된 항체를 처리했을 때 각 활성 지표를 발현하는 세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 14는 다발성 골수종 환자의 CD8 양성 T 세포와 regulatory T 세포에서 탈진 지표를 발현하는 세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 15는 다발성 골수종 환자의 PBMC에 명시된 항체를 처리했을 때 IFN-γ 분비량의 변화를 분석한 결과이다.
도 16은 HT29 세포주에서 PVR의 발현을 분석한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, TIGIT (T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 서열번호 3, 6, 9 또는 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 4, 7 또는 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 5, 8, 11 또는 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 14, 17, 20, 23 또는 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 15, 18, 21 또는 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 16, 19, 22, 24 또는 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
상기 TIGIT은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
Figure pat00001
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항-TIGIT 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 TIGIT에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 항체를 의미하며, 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 3, 6, 9 또는 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 4, 7 또는 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 5, 8, 11 또는 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 14, 17, 20, 23 또는 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 15, 18, 21 또는 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 16, 19, 22, 24 또는 27의 경쇄 CDR3를 포함한다.
본 발명에 있어, 상기 TIGIT에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 3의 중쇄 CDR1; 서열번호 4의 중쇄 CDR2; 서열번호 5의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 경쇄 CDR2; 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 6의 중쇄 CDR1; 서열번호 7의 중쇄 CDR2; 서열번호 8의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 서열번호 19의 경쇄 CDR3;
서열번호 9의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 11의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1; 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 서열번호 22의 경쇄 CDR3;
서열번호 9의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 11의 중쇄 CDR3, 서열번호 23의 경쇄 CDR1; 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 서열번호 24의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 27의 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
TIGIT 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중 쇄를 포함한다. 기능적으로, TIGIT 항체의 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, TIGIT 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
상기 TIGIT에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 28 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 TIGIT에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 34 내지 38로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 28의 중쇄 가변영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변영역; 서열번호 29의 중쇄 가변영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변영역; 서열번호 30의 중쇄 가변영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변영역; 서열번호 31의 중쇄 가변영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 38의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작(naive) B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 TIGIT을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-TIGIT 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 TIGIT에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 TIGIT에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
"암" 또는 "종양"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT에 높은 친화도로 결합하여, 항-종양 T 세포 활성을 회피하는 암을 치료하는 데에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 상기 혈액암으로는 예를 들어, 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다발성 골수종 환자의 조절 T세포에서 TIGIT의 발현이 높음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하는 경우 다발성골수종 환자의 PBMC에 anti-CD3/anti-CD28자극을 주었을 때의 IFN-γ 분비량이 유의하게 증가함을 확인할 수 있다.
암의 예로는 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 인간 대장암 세포 이종이식 모델에 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하는 경우 우수한 종양 성장 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 또한, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암 치료와 병용 다른 약물, 예를 들어 항암제와 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 TIGIT에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 또는 종양을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 TIGIT에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
상기 항체 이외에 다른 항암 치료제를 병용함으로써 TIGIT을 과발현하는 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜, 종양 세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제[(예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포, 예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포, 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토킨을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포(예를 들면, GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)]; 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 항체(상기 TIGIT 항체 이외의 항체, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)와 함께 사용될 수 있다.
상기 약물, 예를 들어 항암제는 면역관문억제제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 면역관문억제제와 병용하기 위한 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문억제제는 항원 제시 세포 (APC, antigen presenting cell)와 면역세포 예를 들어 T세포가 만나는 부위로 T세포 억제 신호를 차단하여, T 세포 활성화를 유도할 수 있는 제제를 의미한다. 상기 면역관문억제제는 예를 들어, PD-1, PD-L1, 또는 CTLA-4 등을 타겟으로 하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역관문억제제는 구체적으로, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 구체적으로는 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브로리주맙(Pembrolizumab), 아테조리주맙(Atezolizumab), 아베루맙(Avelumab) 또는 더바루맙(Durvalumab) 등이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항-PD-1 항체인 펨브로리주맙(Pembrolizumab)을 병용하는 경우, 항-TIGIT 항체 단독 사용에 비해 T 세포 반응성이 증가하고, 증가된 T세포 증식을 관찰하였으며, IFN-γ 분비량 역시 증가될 수 있음을 확인하였다.
"병용"은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 다른 약물, 예를 들어 항암제 각각이 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로, 통상의 기술자의 범위 내 적절한 유효량의 조합으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 전형적으로 면역치료요법에 반응하는 암, 및 지금까지 면역요법에 관련되지 않은 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종과 같은 혈액암 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 불응 또는 재발 암을 포함한다.
항체 또는 항체 단편은 단독, 또는 백신과 함께 사용되어 병원체, 독소, 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 부류 A, B 및 C, 엡스테인 바르 바이러스(Eppstein Barr virus), 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 사람 파필로마(papilloma) 바이러스, 헤르페스 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 사람을 전염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 자극시키는데 사용될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세균 또는 진균 기생체, 및 기타 병원체의 감염에 대한 면역 반응을 자극시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. TIGIT 항체 선별
Human synthetic library phage를 human TIGIT-His 항원이 코팅된 튜브에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 washing buffer (PBS + 0.05% Tween20)로 4회 washing하고, elution buffer (1% BSA/0.1M Glycine, pH 2.0)로 상온에서 10분간 반응시켜 phage를 회수하였다. 회수된 phage를 XLI-Blue Competent Cell에 infection시키고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 후 VCS M13 helper phage 1 mL을 처리하여 1시간 동안 37 ℃에서 배양하고, SB배지 80 ㎖, kanamycin 100 ㎕, carbencillin 100 ㎕를 추가로 처리하여 37 ℃에서 20시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 회수하여 PEG solution(20% PEG, 15% NaCl)로 phage를 침전시키고, 1% BSA/PBS 2 ㎖로 re-suspension 시켜 다음 차수의 panning에 사용하였다.
Human TIGIT 특이적 인간 항체를 선별하고자 phage 표면에 인간 항체 라이브러리를 디스플레이 시킨 후, 차수가 증가할수록 항원인 TIGIT의 농도를 변화시켜 총 3 round의 panning을 진행하였다. Panning의 차수가 진행됨에 따라 TIGIT의 농도를 100 nM에서 1 nM까지 감소시켰다. Phage의 output titer는 표 1과 같다.
[표 1] Phage output titer
Figure pat00002
실시예 2. TIGIT에 대한 결합력 확인
2.1 ScFv 형태의 항-TIGIT 항체의 결합력 확인
ELISA plate에 항원 human TIGIT-FC를 3 ㎍/㎖ 농도로 50 ㎕ 넣어준 후 4℃ overnight incubation 한 후 1% BSA in PBS 로 상온 2시간 blocking하였다. 총 16종의 scFv anti-TIGIT antibodies를 80 nM을 시작농도로 하여 PBS에 1/3 serial dilution 한 후 human TIGIT-Fc plate 에 50 ㎕ 넣어준 후 상온 2시간 반응시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS)로 3번 washing한 후 Anti-His-HRP를 PBS에 1/1000으로 희석하여 50 ㎕ 넣어준 후 상온 1시간 반응시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS) 로 3번 washing 한 후 TMB solution 50 ㎕ 넣어주었다. 상온에서 5분 반응 시킨 후 TMB stop solution 50 ㎕ 넣어준 후 ELISA Leader기에서 흡광도 450nm 에서 값을 측정하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. EC50 값을 기준으로 총 11종 (1C3, 1E4, 1E12, 1F2, 1F10, 1G8, WIN_1B6, WIN_1B11, WIN_1D2, 1E8, 1B11)의 클론을 선별하였다.
2.2 IgG 형태의 항-TIGIT 항체의 결합력 확인
scFv anti-human TIGIT antibodies 중 human TIGIT에 대해 결합력이 높았던 11종의 항체에 대해 IgG 형태로 전환하였다. ELISA plate에 항원 human TIGIT-Fc를 3 ㎍/㎖ 농도로 50 ㎕ 넣어준 후 4℃ overnight incubation 한 후 1% BSA in PBS 로 상온 2시간 blocking하였다. 총 11종의 IgG 형태의 anti-human TIGIT antibodies를 6.6 nM을 시작농도로 하여 PBS 에 1/2 serial dilution 한 후 human TIGIT-Fc plate 에 50 ㎕ 넣어준 후 상온 2시간 반응시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS)로 3번 washing 한 후 anti-His-HRP를 PBS에 1/1000으로 희석하여 50 ㎕ 넣어준 후 상온 1시간 반응시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS)로 3번 washing한 후 TMB solution 50 ㎕ 넣어주었다. 상온 5분 반응 시킨 후 TMB stop solution 50 ㎕ 넣어준 후 ELISA Leader기에서 흡광도 450nm에서 값을 측정하였다. 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00003
1E4, 1F2, 1G8, WIN-1D2, 1E8가 EC50 1 nM 정도의 결합력을 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 3. TIGIT의 ligand인 PVR에 대한 TIGIT 후보항체의 경쟁력 확인
3.1 Human PVR 발현 및 정제
GeneBank AAH15542.1에서 제공된 human PVR 서열 중 ECD (Extracellular domain) Gly27-Asn343 부분의 아미노산 (서열번호 2)을 합성하였다.
Figure pat00004
합성된 Human PVR을 주형으로 하여 hPVR-F (5`- GGCCCAGGCGGCCGGCGA-3')/ hPVR-R primer (5`- GGCCAGGCTGGCCGTTCC -3`)로 PCR 진행한 후 Sfi I enzyme을 이용하여 pclw-huIgG4 vector에 삽입하였다. Expi293F™ 2.5x106cells/㎖ 30 ㎖에 light chain 과 heavy chain DNA를 각각 1:1의 비율로 30 ㎍을 ExpiFectamine 293 reagent를 사용하여 transient expression시킨 뒤 10일 배양하였다. 세포 배양액(상등액)을 0.22 ㎛ bottle top filter를 이용하여 filtration한 뒤 MabSelect Xtra bead 200 ㎕ 를 넣고 bio rotator에서 2시간 섞어 반응시켰다. Incubation 후, bead와 항체 mixture를 protein A column에 넣었다. Protein A column에 binding buffer를 2 ㎖을 이용해서 2번 세척하였다. Protein A column에 200 ㎕의 Protein A elution buffer 이용하여 총 5번의 elution fraction을 모았다. Elution된 항체를 Zeba spin desalting column을 이용하여 1,000 rpm 에서 5분 원심분리하여 desalting하였다.
3.2 경쟁력 확인
ELISA plate에 항원 human TIGIT-Fc를 3 ㎍/㎖ 농도로 50 ㎕ 넣어준 후 4℃ overnight incubation한 후 1% BSA in PBS로 상온 2시간 blocking하였다. Ligand인 biotinylated human PVR과 Anti-human TIGIT antibodies를 1:0, 1:0.1, 1:1, 1:10의 molar ratio로 섞어준 후 상온에서 10분 반응시켰다. 그 후 50 ㎕씩 human TIGIT 이 coating 된 plate 에 넣어준 후 상온에서 2시간 incubation시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS) 로 3번 washing 한 후 anti-SA-HRP 를 PBS 로 1:3000 희석 후 50 ㎕ 넣어준 후 상온에서 1시간 incubation시켰다. PBST (0.05% Tween 20 in PBS)로 3번 washing한 후 TMB solution 50 ㎕ 넣어주었다. 상온 5분 반응시킨 후 TMB stop solution 50 ㎕ 넣어준 후 ELISA Leader기에서 흡광도 450nm에서 값을 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. TIGIT과 PVR에 대한 blocking assay를 11종의 anti-TIGIT antibodies에 대해 진행하였고 11종 모두 ligand blocking함을 확인하였다.
실시예 4. 항-TIGIT 항체의 친화도 측정
4.1 Octet을 이용한 측정
Human TIGIT-HIS를 5 ㎍/㎖로 1XKB buffer에 희석하여 준비하였다. Anti-human TIGIT antibodies를 시작농도 100nM부터 1XKB buffer로 1/2 serial dilution하여 준비하였다. Penta-His sensor를 1XKB buffer에 10min 반응시킨 후, Octet을 이용해 Human TIGIT-HIS에 대한 항체의 친화력을 측정하였다. 그 결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.
[표 3]
Figure pat00005
11종의 항-TIGIT 항체에 대한 친화력을 Octet을 이용해 측정하였고, 이 중 1B11, 1E12, 1F2, 1E8은 dissociation이 다른 클론에 비해 떨어짐을 확인하였다.
4.2 항-TIGIT 항체의 IgG4 형태 전환
최종 5종의 항-인간 TIGIT 항체에 대하여 각각의 Heavy chain variable region 과 Light chain variable region을 합성하였다.
[표 4]
Figure pat00006
[표 5]
Figure pat00007
4.3 Biacore experiment
(1) Immobilization
Anti-protein A를 10 ㎍/㎖의 농도가 되도록 acetate 4.0 buffer에 희석하여 준비하였다. 100 nM NHS, 400 mM EDC 와 1 M ethanolamine을 준비하였다. Sensor chip 은 CM5 를 사용하였으며 contact time 300s (5min), flow rate 5 ㎍/㎖ 과 immobilization level 2500RU로 지정하였다. System control 창에서 running 을 진행 후 Target RU 에 도달하는지 확인하였다.
(2) KD measurement
Capture antibodies 1G8, WIN_1B6와 reference 항체를 1XHBS-EP buffer에 1 ㎍/㎖로 희석하고 300RU로 target level을 지정하였다. Antigen TIGIT-HIS 을 160nM 부터 1XHBS-EP 로 1/2 serial dilution하고 contact time 120s, Dissociation time 600s 로 지정하여 반응시켰다. Running이 완료되면 evaluation software를 사용하여 fitting하여 ka, kd 및 KD값을 구하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 1G8, WIN_1B6와 reference 항체 에 대해 BIACORE로 친화력을 측정하였다. Reference 항체 와 후보항체 1G8은 nM 이상의 친화력을 보였고 다른 후보항체인 WIN_1B6은 10 nM 이상의 친화력을 보였다.
실시예 5. 세포 표면에 발현한 TIGIT과 TIGIT 후보항체의 결합력 확인
TIGIT을 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하기 위해 Jurkat cell (Jurkat E6.1(ATCC; TIB-152TM)에 TIGIT cDNA를 형질주입시키고 항생제인 G418 1 ㎎/㎖를 처리하여 선별하여 TIGIT 과발현 세포주를 제작하였다 (Jurkat-TIGIT). Jurkat-TIGIT세포주를 2%(v/v) FBS를 첨가한 DPBS (이하, FACS 버퍼)에 재부유한 후, 1,500 rpm에서 원심 분리한 후, 세포 수가 3x106cell/㎖이 되도록 FACS 버퍼에 재부유하여 U-bottom 96-well plate의 각 well에 100 ㎕씩 넣어주었다. 그 후, 각 well의 세포 및 배양액을 회수하여 1,500 rpm에서 원심 분리한 후 상층액을 버렸다. 회수한 세포를 인간 Fc block (BD Pharmingen; Cat.# 564220) 용액을 0.5 ㎕ 넣은 FACS 버퍼 50 ㎕에 재부유한 후 4℃에서 15분 동안 배양하였다. TIGIT 후보항체 또는 인간 IgG4 (Sigma; Cat.# I4639)를 FACS 버퍼 50 ㎕에 25 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖, 0.04 ㎍/㎖, 0.008 ㎍/㎖, 0.0016 ㎍/㎖, 0.00032 ㎍/㎖ 농도의 2배가 되도록 희석하였다. Fc blocker가 있는 상태의 세포에 앞서 희석한 TIGIT 후보항체 또는 인간 IgG4를 50 ㎕씩 넣어 25 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖, 0.04 ㎍/㎖, 0.008 ㎍/㎖, 0.0016 ㎍/㎖, 0.00032 ㎍/㎖ 농도가 되도록 맞춘 후 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. TIGIT 후보항체와 반응시킨 세포를 FACS 버퍼에 재부유한 후, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세척하는 과정을 두 번 반복하였다. 피코에리트린 (이하, PE)이 표지된 염소 항-인간 Fab'2 (Phycoerithrin-conjugated goat anti-human Fab'2) (Sigma; Cat.# P8047)를 FACS 버퍼에 1:500 부피 비율로 희석시킨 후 각 well에 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 30분 동안 어두운 곳에 반응시켰다. PE와 반응시킨 세포를 회수하여 FACS 버퍼에 재부유하고, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 버리는 세척과정을 두 번 반복하였다. 그 후, 세포를 고정버퍼 (BD Cytofix™; Cat.# 554655) 100 ㎕에 재부유한 후 4℃에서 30분 동안 어두운 곳에 배양하였다. 고정버퍼와 반응시킨 세포를 회수하여 FACS 버퍼에 재부유하고, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 버리는 세척 과정을 두 번 반복하였다. 세척한 세포를 FACS 버퍼 200 ㎕에 재부유한 후, FACS LSR-Fortessa 장비에서 세포에 표지된 PE의 MFI (median fluorescence intensity)를 비교하였다. 모든 FACS 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었으며, TIGIT 후보항체 중 WIN_1B6, WIN_1D2, 1E8, 1F10, 1G8에서 높은 결합력을 보임을 확인하였다.
실시예 6. TIGIT의 ligand인 PVR에 대한 TIGIT 후보항체의 경쟁력 확인
TIGIT과발현 세포주 (Jurkat-TIGIT)를 2%(v/v) FBS 첨가한 DPBS(이하, FACS 버퍼)에 재부유한 후, 1,500 rpm에서 원심 분리한 후, 세포 수가 3x106cells/㎖이 되도록 FACS 버퍼에 재부유하여 U-bottom 96-well plate의 각 well에 100 ㎕씩 넣어주었다. 그 후, 각 well의 세포 및 배양액을 회수하여 1,500 rpm에서 원심 분리한 후 상층액을 버렸다. 회수한 세포를 인간 Fc block (BD Pharmingen; Cat.# 564220) 용액을 0.5 ㎕ 넣은 FACS 버퍼 50 ㎕에 재부유한 후 4℃에서 15분 동안 배양하였다.
HEK293 (ThermoFisher scientific; Cat.# A14527) 세포로부터 정제된 PVR-Fc를 각 well에 10 ㎍씩 0.5 ㎕로 넣어주고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PVR-Fc와 반응시킨 세포를 FACS 버퍼에 재부유한 후, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세척하는 과정을 두 번 반복하였다. TIGIT 후보항체 또는 인간 IgG4 (Sigma; Cat.# I4639)를 FACS 버퍼 100 ㎕에 10 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖, 0.04 ㎍/㎖, 0.008 ㎍/㎖, 0.0016 ㎍/㎖, 0.00032 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석하고, 각 well에 100 ㎕씩 넣어 세포를 재부유한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. TIGIT 후보항체와 반응시킨 세포를 FACS 버퍼에 재부유한 후, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세척하는 과정을 두 번 반복하였다. Anti-PVR-PE 항체(Invitrogen; Cat. # 12-1550-41)을 각 well에 처리한 후 4℃에서 30분 동안 어두운 곳에 반응시켰다. Anti-PVR-PE 항체와 반응시킨 세포를 회수하여 FACS 버퍼에 재부유하고, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 버리는 세척과정을 두 번 반복하였다. 그 후, 세포를 고정버퍼 (BD Cytofix™; Cat.# 554655) 100 ㎕에 재부유한 후 4℃에서 30분 동안 어두운 곳에 배양하였다. 고정버퍼와 반응시킨 세포를 회수하여 FACS 버퍼에 재부유하고, 1,500 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 버리는 세척 과정을 두 번 반복하였다. 세척한 세포를 FACS 버퍼 200 ㎕에 재부유한 후, FACS LSR-Fortessa 장비에서 세포에 표지된 PE의 MFI (median fluorescence intensity)를 비교하였다. 모든 FACS 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었으며, TIGIT 후보항체 중 WIN_1B6, WUN_1B11, WIN_1D2, 1G8, 1E8 에서 PVR과 강하게 결합함을 확인하였다.
실시예 7. TIGIT 후보항체의 TIGIT과 PVR간의 결합 억제효과로 인한 T 세포 활성화 분석
TIGIT/CD155 Blockade Bioassay Kit (Promega, Cat No. J2305)를 이용하여 TIGIT 후보항체에 의한 T세포 활성화를 확인하였다. -140℃에 보관 중인 Thaw-and-Use TIGIT Effector Cells 1 vial을 녹여, 10%(v/v) FBS를 첨가한 RPMI1640 (Gibco, Cat No. 11875-065)를 12㎖ 넣어 재부유시켰다. 세포액을 80 ㎕씩 96well white and flat-bottom assay plate의 안쪽 60개 홈에 넣고 37℃에서 16시간 내지 18시간 배양시켰다. 다음 날, -140℃에 보관 중인 Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 Cells 1vial을 녹여, 10%(v/v) FBS를 첨가한 RPMI1640 (Gibco, Cat No. 11875-065) 3 ㎖을 넣어 세포를 재부유시켰다. TIGIT 후보 항체는 최고 농도를 300 ㎍/㎖ (6X)로 준비하고, 2.5배씩 순차적인 희석을 10번 시켰다. 전날 배양한 TIGIT effector cells plate를 꺼내, 항체 20 ㎕를 넣고 Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 cells 부유물을 20 ㎕ 넣고 37℃ CO2 incubator에서 6시간 동안 배양했다. 6시간 후, 96 well plate를 incubator에서 꺼내어 상온에서 20분 두었다. Bio-glo substrate와 buffer 10 ㎖을 섞은 뒤, cell suspension이 들어있는 안쪽 60개 홈에 120 ㎕를 처리 후 10분간 두었다. GloMax Discover System으로 luminescence를 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었으며, 5종의 TIGIT 후보항체 중 1G8 처리시 EC50 값은 2.1 nM로 후보항체 중 가장 높은 T 세포의 활성화 능력을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 8. TIGIT 후보항체의 교차반응 확인
TIGIT 항체가 생쥐, 원숭이 및 사람의 TIGIT에 대한 결합력이 있는지 확인하기 위해 HEK293 세포에 각각의 대조군 벡터로서 pEF1a-AcGFP-N1 vector (Clontech, Cat No. 631973), 생쥐 TIGIT, 원숭이 TIGIT 그리고 인간 TIGIT 플라스미드 20 ㎍을 각각 넣고, Lipofectamine™ 3000 (Invitrogen, Cat No. L3000001)을 이용하여 형질 주입하였다. 형질 주입 48시간 후 형광 현미경으로 GFP 발현을 확인한 후, 세포를 TrypLE Express Solution(ThermoFisher Scientific; Cat.#12605010)을 1 ㎖ 처리하여 떼어내고 10%(v/v) FBS를 첨가한 DMEM(Gibco, Cat No.11995-065)를 9 ㎖로 희석한 뒤 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. PBS로 1회 세척한 후 FACS 버퍼에 세포 수가 5x105 cells/100 ㎕ 농도가 되도록 재부유시켰다. 인간 Fc Block용액을 각 샘플당 1 ㎕ 넣고 4℃에서 10분 동안 반응시켰다. 인간 IgG4, WIN_1B6, WIN_1D2, E8, 1F10, 1G8을 1 ㎍/5x105 cells 농도로 처리하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. FACS 버퍼로 세척 후 PE가 표지된 염소-항-인간 Fab'2항체를 FACS 버퍼에 1:200으로 희석하여 각 샘플당 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. FACS 버퍼를 200 ㎕까지 채운 후 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 고정버퍼 300 ㎕를 넣고 세포를 재부유시켰다. FACS LSR-Fortessa 장비에서 GFP를 발현한 세포를 선별하고 TIGIT 후보항체는 PE 형광채널로 확인하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었으며, TIGIT후보항체 중 WIN_1B6, WIN_1D2, E8, 1G8은 인간뿐만 아니라 원숭이의 TIGIT에도 결합하는 것을 세포 표면에 발현된 단백질에 대한 결합력으로 확인하였다. 하지만 생쥐의 TIGIT에는 모두 결합하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 9. TIGIT후보항체의 regulatory T세포의 억제능 확인
9.1 말초 혈액에서 단핵구 세포 (PBMC) 분리
농축적혈구 혈액백 (200~250 ㎖)에서 18G needle과 50 ㎖ syringe를 이용하여 혈액을 disposable bottle에 옮긴 후 DPBS를 추가하여 1:1로 혈액을 희석하였다. 15 ㎖의 Ficoll-paque (GE Healthcare, Cat No. 17-1440-03)을 새로운 50 ㎖ conical tube에 준비하고 Ficoll-paque 위에 30 ㎖의 dilute blood를 conical tube 벽면에 파이펫 팁을 대고 천천히 layering 하였다. 1,500 rpm, 25℃에서 30분간 원심분리하고 (no brake) 원심 종료 후 PBMC층을 조심스럽게 채취하여 새로운 50 ㎖ conical tube에 옮긴 후 워싱 버퍼를 넣어 total 50 ㎖을 맞추어 1500 rpm, 4℃ 에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 뒤 세포를 워싱 버퍼로 재부유한 후 1,500 rpm, 4℃ 에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 버린 뒤 10%(v/v) FBS를 첨가한 IMDM (GIBCO, Cat No. 12440-053)으로 1번 세척 후 세포 수와 viability를 체크하고 6well plate에 16시간 내지 18시간 배양하였다.
9.2 Regulatory T세포 분리
그 전날 배양한 PBMC에서 regulatory T세포를 분리하기 위하여 regulatory T세포 분리 kit (STEMCELL, Cat No. 18063)을 사용하였다. 5x108 cells/㎖ 의 분리된 인간 PBMC를 round-bottom tube에 넣고 100 ㎕ CD25 positive selection cocktail 넣은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 60 ㎕ Releasable RapidSpheres (사용하기전 vortex)을 넣고 100 ㎕ CD4+ T cell enrichment cocktail 추가하여 넣은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 재부유한 후 round-bottom tube를 magnet에 끼운 후 상온에서 10분간 반응시킨 후 파이펫으로 조심스럽게 상층액(CD4+CD25-)을 따내어 새로운 tube로 옮겼다. Magnet으로부터 tube를 조심스럽게 분리한 후 EasySep buffer를 2.5 ㎖ 넣고 2-3번 조심스럽게 파이펫 재부유한 후 다시 magnet에 장착한 후 상온에서 5분간 반응시킨 후 파이펫으로 조심스럽게 상층액(CD4+CD25-)을 따낸다. 이 과정을 2번 반복하였다. Magnet에서 tube를 분리하고 처음 시작했던 양으로 EasySep buffer를 넣은 후 200 ㎕ Release buffer를 넣고 5번 이상 재부유 한 후 CD127high depletion cocktail를 100ul 넣은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. Dextran RapidSpheres (사용하기전 vortex)를 20 ㎕ 넣고 상온에서 5분간 반응 시키고 재부유한 후 round-bottom tube를 magnet에 끼운 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 파이펫으로 조심스럽게 상층액(CD4+CD25+CD127low)을 따내어 새로운 tube로 옮긴 후 10%(v/v) FBS를 첨가한 IMDM (GIBCO, Cat No. 12440-053)로 1번 세척 후 세포 수를 측정하였다.
9.3 Responder 세포에 CFSE 표지
그 전날 배양한 PBMC에서 1 x 106 cells/㎖ (1 ㎖)을 15 ㎖ tube에 넣고 20 uM CFSE(eBioscience, Cat No. 65-0850-84)을 1 ㎖ 넣어 세포를 잘 섞어주고 은박지로 빛을 차단하여 37℃ CO2 배양기에서 20분 동안 반응시켰다. 20분 후 10 ㎖의 10%(v/v) FBS를 첨가한 차가운 IMDM을 넣고 1,200 rpm, 4℃ 에서 5분간 원심 분리하고 이 과정을 두 번 반복하였다.
9.4 Regulatory T 세포와 CFSE 표지된 responder 세포 공동 배양
CFSE로 표지한 responder 세포를 10%(v/v) FBS를 첨가한 IMDM에 재부유하여 96well round 플레이트에 2 x 105cells/100 ㎕로 넣고, regulatory T세포를 0:1, 0.1:1(2x104), 0.25:1(5x104), 0.5:1(1x105)비율로 (Treg : Responder) 넣어주었다. Soluble anti-CD3/anti-CD28 (2 ㎍/㎖)를 각 well에 첨가하고 인간 IgG4와 TIGIT항체를 10 ㎍/㎖ 의 농도로 각 well에 넣은 후 37℃, 5% CO2배양기에서 5일 동안 배양하였다. 5일 후에 세포 및 배양액을 회수하여 1,500 rpm에서 원심 분리한 후 상층액은 IFN-γ ELISA를 위해 -80℃에 보관하였고 남은 세포는 회수하여 FACS 버퍼로 교체한 뒤 4℃에서 15분간 Fc 수용체를 블로킹(blocking)하였다. 각각 다른 염료가 표지된 CD45-PE (TONBO, Cat No. 50-0459-T100), CD3-Percific blue (Biolegend, Cat No. 300330), CD8-APC (TONBO, Cat No. 20-0088-T100), CD4-PE-Cy7 (TONBO, Cat No. 60-0049-T100), CD25-APC-Cy7 (Biolegend, Cat No. 302614)에 대한 항체를 플레이트에 처리한 후 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 FACS 버퍼를 채워 넣고 원심분리하고 이 과정을 세 번 반복한다. 세포를 고정 버퍼 (BD cytofix; cat.#554655) 100 ㎕에 재부유한 후 30분 동안 4℃에서 반응시켰다. FACS 버퍼로 2번 세척 한 후 분석을 위해 FACS 버퍼 200 ㎕로 재부유하였다. FACS LSR-Fortessa 장비에서 CD8 세포 중 CFSE로 세포 증식을 확인하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. TIGIT 후보항체에 의해 regulatory T 세포의 기능이 억제되어 대조군보다 CD8 T세포가 14% 가량 증가한 세포 증식을 보였다.
9.5 TIGIT후보항체에 의한 IFN- γ 분비량 확인
-80℃에 보관한 시료 상층액을 상온에서 녹이고 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다. IFN-γ 분비량을 측정하기 위해 human IFN-γ immunoassay kit (R&D SYSTEMS, Cat No. DIF50)를 사용하였다. ELISA에 사용되는 모든 reagent를 상온에 두고 준비하였다. Microplate strips을 sample수만큼 준비하고 sample넣을 각 well에 100 ㎕씩 diluent RD1-51을 넣었다. 상층액을 calibrator diluent RD6-21로 20배로 희석한다. IFN- γ standard stock (1000pg/ml)을 500 pg/㎖로 희석한 후 1:1 부피비율로 순차적인 희석을 6번 시켰다. 각 well당 standard와 sample을 100 ㎕넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 워시 버퍼로 3번 세척 후에 인간 IFN-γ conjugate를 well당 200 ㎕씩 처리한 뒤 상온에서 2시간 반응시켰다. 워시 버퍼로 3번 세척 후 기질 용액을 well당 200 ㎕씩 처리하고 상온에서 30분간 반응시킨 후에 각 well당 정지용액을 50 ㎕씩 처리하고 Molecular dynamics reader장비를 이용하여 540nm 또는 570nm 파장에서 O.D값을 측정하였다. 측정값은 SoftMax Pro 5.4.1 프로그램을 이용해 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. TIGIT 후보항체에 의해 regulatory T세포의 기능이 억제되어 배양 상층액에서 측정한 IFN-γ 분비량은 대조군보다 2배 가량 높은 수치를 보였다.
실시예 10. TIGIT후보항체의 항암효과 확인
Raji 암세포와 PVR 과발현되게 제작된 Raji-PVR 세포주를 RPMI 1640 배지(ThermoFisher Scientific; Cat.# 11875093)에 1x105 cells/100 ㎕ 농도로 15 ㎖ tube에 재부유하고 30 ㎕ Calcein-AM (final 30 uM, Invitrogen; Cat.#C3099)을 넣은 후 37℃에서 어둡게 하여 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 후 RPMI 1640 배지로 2번 세척 후 RPMI 1640 배지 1x105 cells/100 ㎕ 농도로 재부유하여 96-웰-플레이트에 넣는다. Expanded NK세포를 암세포 대비 3:1로 각 well에 함께 넣어주고 이 때, 1G8을 10 ㎍/㎖ 농도로 각 웰에 함께 넣어주고 대조군으로 인간IgG4를 동일하게 처리하고 빛을 차단하여 37℃ 온도에서 5% CO2 조건으로 6시간 동안 공동 배양한다. 6시간 후 96-웰-플레이트를 2,000 rpm, 3분동안 원심분리하고 100 ㎕ 상층액을 따서 96-웰-검은 플레이트로 옮긴 후 multiple reader에서 485nm/535nm 파장으로 각 시료의 값을 측정하였다. 아래와 같은 수식을 이용하여 lysis 값을 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. PVR이 과발현된 세포에서 1G8처리에 의해 NK세포의 암세포 사멸화가 증가됨을 확인하였으며 이는 PVR 발현 의존적으로 TIGIT에 대한 specific targeting에 의한 효력을 나타냄을 확인하였다.
Figure pat00008
실시예 11. TIGIT 후보 항체(1G8)와 PD-1 항체의 병용 처리에 의한 T 세포 반응성 증가 확인
11.1. 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포(PBMC)에서 CD14 양성 세포 분리 후 성숙된 수지상 세포로 분화.
냉동 보존된(Cryopreserved) 건강한 공여자 유래 말초혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지(thawing media) (RPMI, Gibco 11875-093 + 10% FBS, Gibco 16000-044)를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1200rpm으로 4℃ 에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 40 mL의 MACS buffer (PBS+0.5% FBS+2mM EDTA)에 재부유시킨 후 세포 수를 정량하였다. 세포 107개 당 20 μL의 CD14 microbeads (Miltenyi Biotec, 130-050-201)와 80 μL의 MACS buffer를 처리한 뒤 15분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 그 다음 1350rpm으로 4℃ 에서 8분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 500 μL의 MACS buffer에 재현탁시킨 후 QuadroMACS separator (Miltenyi Biotec, 130-090-976)에 장착된 LS column (Miltenyi Biotec 130-042-401)에 로딩하였다. LS column을 MACS buffer로 3 mL씩 3회 씻어낸 뒤, QuadroMACS separator 에서 제거한 후 15 mL 코니컬 튜브 위로 옮긴 뒤 plunger로 눌러 CD14 양성 세포를 수득하였다. 얻어진 CD14 양성 세포들은 1.2x106 cells/mL의 농도로 complete RPMI (RPMI, Gibco A10491-01+10% FBS+55 μM β-Mercaptoethanol, Gibco 21985-023+1X Antibiotic-Antimycotic, Gibco 15240)에 재부유 시키고 2X GM-CSF (2x103 U/mL) (R&D systems, 215-GM-010)와 2X IL-4 (2x103 U/mL) (R&D systems, 204-IL-010) 싸이토카인이 포함된 complete RPMI와 1:1의 비율로 섞어서 6-웰 플레이트에 넣은 후 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 3일 뒤 각 웰에서 상층 배양액 1.5 mL씩을 1 mL 파이펫으로 제거하고 각 웰에 1X GM-CSF+1X IL-4 가 포함된 complete RPMI 배지를 2 mL씩 추가하였다. 2일 뒤 각 6-웰에서 2 mL 배양액을 제거하고 각 싸이토카인 GM-CSF (1000 U/mL)+IL-4 (1000 U/mL)+TNF-α (10 ng/mL) (R&D systems, 210-TA-010)+IL-1β (10 ng/mL) (R&D systems, 201-LB-005)+IL-6 (10 ng/mL) (R&D systems, 206-IL-010)+PGE2 (1 μg/mL) (Sigma, P0409-1MG)가 포함된 배지를 3 mL 추가하고 2일간 세포들을 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포를 풀어서 배양한 지 7일째 되는 날 바닥에 접합한 성숙된 수지상 세포들을 파이펫팅하여 50 mL 코니컬 튜브에 모은 뒤 세포 수를 측정하고 1x105 cells/mL의 농도로 조절하였다.
11.2. 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포(PBMC)에서 전체 T 세포(pan T cell) 분리 및 VPD450 염색
수지상 세포를 분리한 공여자와는 다른 동종 이계(allogeneic) 공여자로부터 분리된 냉동 보존된 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1200rpm으로 4℃ 에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 40 mL의 MACS buffer에 재부유시킨 후 세포 수를 정량하였다. 세포 107개 당 10 μL의 pan T cell biotin antibodies (Miltenyi Biotec, 130-096-535)와 40 μL의 MACS buffer를 처리한 뒤 5분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 그 다음 세포 107개 당 20 μL의 anti-biotin microbeads (Miltenyi Biotec, 130-096-535)와 30 μL의 MACS buffer를 처리한 뒤 10분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 최종 부피가 500 μL가 되도록 MACS buffer로 양을 맞춘 뒤 QuadroMACS separator에 장착된 LS column에 로딩하였다. LS column을 MACS buffer로 3 mL씩 3회 로딩하며 LS column에서 흘러져 나온 세포들을 15 mL 코니컬 튜브에 모두 모은 뒤, 세포 수를 정량하였다. 모아진 T 세포들을 1200rpm, 4℃ 에서 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 뒤 1X PBS 용액에 재부유해서 최종 농도를 2x107 cells/mL로 맞춰 주었다. 세포가 들어있는 용액과 동일한 부피의 1 μM VPD450 용액을 넣은 후 세포를 잘 섞어주고 알루미늄 호일로 빛을 차단하여 37℃의 CO2 인큐베이터에서 20분 동안 반응시켰다. 그 후 10 mL의 해동 배지를 넣고 1200rpm, 4℃ 에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하는 과정을 두 번 반복하였다. 얻어진 T 세포들의 최종 농도가 2x106 cells/mL가 되도록 complete RPMI 배지에 재부유시켰다.
11.3. 수지상 세포와 동종 이계 T 세포를 이용한 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR) 시험.
11.1에서 유래된 7일간 시험관에서 성숙된 수지상 세포와 2.2에서 분리된 VPD450이 염색된 동종 이계 T 세포를 1:20의 비율로 공동 배양을 하기 위해서 complete RPMI 배지의 양을 조정하였고 다음과 같이 최종 농도를 맞추었다(수지상 세포 최종 농도: 1x105 cells/mL; T 세포 최종 농도: 2x106 cells/mL). 96-웰 U bottom 플레이트에 각 웰 당 5x103 cells/50 μL 의 수지상 세포와 1x105 cells/50 μL 의 T 세포를 파이펫팅하여 옮겨주었다. 일정한 비율로 세포들을 옮겨준 뒤 다음과 같이 총 5가지 조건에서 5일간 공동 배양을 진행하였다: 1) 수지상 세포와 T 세포만을 배양, 2) 1)의 조건에 인간 IgG4 타입의 isotype항체(BioLegend, 403702)를 처리, 3) 1)의 조건에 TIGIT 후보 항체(1G8)를 단독 처리, 4) 1)의 조건에 PD-1 항체(MSD, Pembrolizumab)를 단독 처리, 5) 1)의 조건에 TIGIT 후보 항체(1G8)과 PD-1 항체를 병용 처리. 모든 실험에서 각 항체들의 최종 농도는 5 μg/mL이 되도록 조정하였다. 각 항체들을 처리한 뒤, 96-웰 플레이트를 37℃의 CO2 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. 5일 후에 세포 및 배양액을 회수하여 2000rpm에서 원심 분리한 후 상층액은 인간 IFN-γ ELISA 시험 분석을 위해 -80℃ 냉동고에 보관하였고 96-웰 플레이트에 남은 세포에는 FACS buffer(1% FBS/sheath buffer)를 첨가한 뒤 1200rpm, 4℃ 에서 5분간 원심 분리하고 상층액을 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 100 μL의 FACS buffer에 재부유하여 5 mL tube에 준비하고, 항체를 처리한 뒤 30분 간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 항체는 FITC anti-CD8 (BioLegend 301006), PE anti-TIGIT (eBiosciences, 12-9500-42), PE-Cy7 anti-PD-1 (eBiosciences, 25-2799-42), APC anti-CD4 (Tonbo 20-0049-T100), APC-Cy7 anti-CD3 (BD 560176), PerCP Cy5.5 anti-7AAD (BD 559925)를 사용하였다. 그 다음, 각 샘플 당 1 mL FACS buffer를 넣어주고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심 분리한 다음 상층액을 제거하여 시료를 수득하였다. LSR Fortessa로 CD4 양성 T세포와 CD8 양성 T 세포 중 VPD450 음성/양성 비율을 통해 각 그룹의 세포 증식 정도를 확인하고 분석한 결과를 도 12a에 나타내었다.
도 12a에서 CD4 양성 T 세포와 CD8 양성 T 세포에서 모두 IgG4 isotype 항체 처리 대조군에 비해 TIGIT 후보 항체(1G8) 단독 처리시에는 통계적으로 유의한 세포 증식의 증가가 일어나지 않았으나 PD-1 항체 단독 처리시에는 통계적으로 유의한 세포 증식의 증가가 일어났다. 이 때, PD-1 항체 단독 처리시 반응 대비, PD-1 항체와 TIGIT 후보 항체(1G8)을 병용 처리한 조건에서 통계적으로 유의한, 더욱 증가된 세포 증식을 관찰하였다.
11.4. IFN-γ 분비량 변화 확인
-80℃에 보관한 시료 상층액을 상온에서 녹이고 1500rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. IFN-γ 분비량을 측정하기 위해 Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit (R&D SYSTEMS, DIF50)을 사용하였다. ELISA에 사용되는 모든 reagent를 상온에 두고 준비하였다. Microplate strips를 샘플 수만큼 준비하고 샘플을 넣을 각 웰에 100 μL씩 diluent RD1-51을 넣었다. 상층액은 calibrator diluent RD6-21로 20배로 희석하였고 IFN-γ standard stock (1000 pg/mL)은 500 pg/mL로 희석한 후 1:1 부피비율로 순차적인 희석을 6번 시켰다. 각 웰당 standard와 샘플을 100 μL 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 워시 버퍼로 3번 세척 후에 인간 IFN-γ conjugate를 웰당 200μL씩 처리한 뒤 상온에서 2시간 반응시켰다. 워시 버퍼로 3번 세척 후 기질 용액을 well당 200μL씩 처리하고 상온에서 30분간 반응시킨 후에 각 웰당 정지 용액을 50μL씩 처리하고 즉시 Molecular dynamics reader 장비를 이용하여 540nm 또는 570nm 파장에서 O.D값을 측정하였다. 측정값은 SoftMax Pro 5.4.1 프로그램을 이용해 분석한 측정값을 도 12b에 나타내었다.
도 12b에서 IgG4 isotype 항체 처리 대조군에 비해 TIGIT 후보 항체 단독 처리시에는 IFN-γ 분비량의 차이가 없었으나 PD-1 항체 단독 처리시에는 통계적으로 유의한 IFN-γ 분비량의 증가가 일어났다. 이 때, PD-1 항체 단독 처리시 반응 대비, PD-1 항체와 TIGIT 후보 항체(1G8)를 병용 처리한 조건에서 통계적으로 유의한, 더욱 증가(평균적으로 47% 가량)된 IFN-γ 분비량을 관찰하였다.
실시예 12. TIGIT 후보 항체(1G8)에 의한 regulatory T 세포의 활성 지표(activation marker) 발현 감소 확인
12.1. 건강한 공여자 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포(PBMC)에 TIGIT 후보 항체(1G8) 처리
냉동 보존된 건강한 공여자 유래 말초혈액 단핵 세포를 37℃ 수조에 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1200rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 15 mL의 해동 배지에 세포를 재부유시킨 후 세포 수를 정량하였다. 1x107 cells/mL로 complete RPMI에 재현탁시킨 후 96-웰 U bottom 플레이트에 1x106 세포와 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (gibco, 111.31D) 2 μL를 하나의 well 당 총 200 μL로 맞추어 3배수로 분주하였다. 각 그룹 별로 해당 항체(1G8, hIgG4)는 최종 농도 1 mg/mL로 처리하여 6일간 배양하였다.
12.2. Regulatory T 세포의 형질 변화 분석
6일간 배양한 세포를 플레이트 그대로 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 웰당 200 μL의 PBS로 재부유한 후 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 죽은 세포를 구분하기 위해 LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, L34957)를 처리하고 30분 간 빛을 차단하여 4℃에서 배양하였다. 웰당 FACS buffer 100 μL를 추가로 처리하고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 항체를 처리한 뒤 30분 간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 항체는 BV421 anti-CD25 (BD 562442), FITC anti-CD127 (BD 564423), BB700 anti-CD8 (BD 566452), R700 anti-CD4 (BD 564975), APC-H7 anti-CD3 (BD 560176), PE-Cy7 anti-CD39 (eBioscience 25-0399-41), PE-Cy7 anti-PD-1 (Biolegend 135216), Alexa647 anti-ICOS (Biolegend 313516), Alexa647 anti-TIGIT (Biolegend 372724), PE-Cy7 anti-LAG-3 (Biolegend 369310), PE-Cy7 anti-HLA-DR (BD 565096), APC anti-CCM1 (R&D FAB2244A)를 사용하였다. 웰당 FACS buffer 100 μL를 추가로 처리하고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 FoxP3/transcription factor staining buffer set (eBioscience, 00-5523-00)의 프로토콜에 따라 세포 내 염색 (Intracellular staining)를 진행하였다. 항체는 PE anti-FoxP3 (eBiosicence 12-4776-42), APC anti-CTLA-4 (R&D FAB386A)을 사용하였다. 염색을 마친 세포들을 LSR Fortessa로 분석한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 1G8 항체가 정상인의 regulatory T 세포의 활성 지표 중 ICOS, PD-1, LAG3의 발현에는 영향을 주지 않지만 CD39와 CTLA-4의 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 13. 다발성골수종 환자의 CD8 T 세포와 regulatory T 세포의 탈진지표(exhaustion maker)발현 분석
냉동 보존된 다발성골수종 환자 유래 말초혈액 단핵 세포를 37℃ 수조에 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1200rpm으로 4℃에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 15 mL의 해동 배지에 세포를 재부유시킨 후 세포 수를 정량하였다. 해동시킨 환자의 말초혈액 단핵 세포를 네 개의 FACS 튜브에 나누어 담은 후, PBS 2 mL을 추가하여 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 죽은 세포를 구분하기 위해 LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit 를 처리하고 30분 간 빛을 차단하여 4℃에서 배양하였다. 각 튜브에 FACS buffer 2 mL를 추가로 처리하고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 항체를 처리한 뒤 30분 간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 항체는 Alexa700 anti-CD3 (BD 557943), PerCP-Cy5.5 anti-CD8 (Biolegend 344710), BB700 anti-CD8 (BD 566452), R700 anti-CD4 (BD 564975), BV421 anti-CD25 (BD 562442), BV786 anti-CD127 (BD 563324), FITC anti-CD138 (Biolegend 356508), PE-Cy7 anti-PD-1 (Biolegend 135216), BV421 anti-TIGIT (BD 747844), Alx647 anti-TIGIT (Biolegend 372724), APC anti-Tim-3 (R&D FAB2356aA), PE-Cy7 anti-LAG-3 (Biolegend 369310), APC anti-CTLA-4 (R&D FAB386A)를 사용하였다. 염색 후 튜브당 FACS buffer 2 mL을 추가하고 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액 제거 후 FoxP3/transcription factor staining buffer set의 프로토콜에 따라 세포 내 염색을 진행한다. 항체는 PE anti-FoxP3 (eBiosicence 12-4776-42), APC anti-CTLA-4 (R&D FAB386A)를 사용하였다. 염색을 마친 세포들을 LSR Fortessa로 분석한 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에서 다발성 골수종 환자의 CD8 T 세포의 탈진 지표 5종 중 TIGIT의 발현이 다른 4종에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다. 다발성 골수종 환자의 regulatory T 세포의 경우 PD-1과 TIGIT의 발현을 비교하였을 때 TIGIT의 발현이 월등히 높았다.
실시예 14. TIGIT 후보 항체(1G8)에 의한 다발성골수종 환자 말초혈액 단핵 세포에서의 IFN-γ 발현 증가 확인
14.1 다발성골수종 환자의 말초혈액 단핵 세포에 TIGIT 후보 항체(1G8) 처리.
냉동 보존된 다발성골수종 환자 유래 말초혈액 단핵 세포를 37℃ 수조에 신속하게 녹인 후, 50 mL 코니컬 튜브로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1200rpm으로 4℃ 에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 15 mL의 해동 배지에 세포를 재부유시킨 후 세포 수를 정량하였다. 5x106 cells/mL로 complete RPMI에 재부유한 후 96-웰 U bottom 플레이트에 웰 당 1x105 개의 세포와 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 2 μL를 3배수로 분주하였다. 각 그룹 별로 해당 항체(TIGIT 후보 항체(1G8), PD-1 항체, hIgG4, TIGIT 후보 항체(1G8)과 PD-1 항체를 병용 처리)를 1 mg/mL로 처리하였다. 4일 후 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심 분리한 후 상층 배양액을 96-웰 U bottom 플레이트에 100 μL씩 수집하여 -20℃에 밀봉하여 보관하였다.
14.2 IFN-γ 분비량 변화 확인
-20℃에 보관한 배양액을 플레이트 그대로 상온에 두어 녹인다. IFN-γ 분비량을 정량 하기 위해 BDTM Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2/Th17 cytokine kit (BD, 560484)의 프로토콜을 따랐다. 키트에서 제공하는 동결건조된 싸이토카인 standard stock을 15 mL 튜브로 옮긴 후, 2 mL의 희석용 버퍼로 파이펫팅을 충분히 해 주어 용해시킨 후 상온에 최소 15분간 방치한다. 이후 300 μL의 동일 용량의 버퍼로 1:1로 순차적으로 희석하며 10개의 standard를 준비한다. 음성 기준 standard는 희석용 버퍼로 준비한다. 배양액은 키트의 희석용 버퍼를 이용하여 1:20으로 희석하였다. 각 싸이토카인의 capture bead를 샘플 수와 standard 수 대로 준비하고 96웰 1.1 mL Cluster Tubes Bulk (Axygen, MTS-11-C)에 샘플 50 μL와 섞어 놓은 capture bead 샘플 50 μL, PE detection antibody 50 μL를 넣은 후 잘 섞어준다. 빛을 차단하여 3시간 배양한 후, 300 μL의 wash buffer를 더해 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심 분리한 후 상층액을 제거한다. 과정이 완료된 각 샘플들의 IFN-γ 분비량을 LSR Fortessa로 분석한 후 도 15에 나타내었다.
도 15에서 다발성골수종 환자의 PBMC에 anti CD3/28 자극을 주었을 때의 IFN-γ 분비량이 TIGIT 후보 항체(1G8)를 처리한 경우 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 15. 인간화 마우스를 이용한 인간 대장암 세포 이종이식 모델에서 TIGIT 후보 항체(1G8)의 종양 성장 억제 효과 확인
TIGIT 후보 항체(1G8)의 종양 성장 억제 효과를 in vivo 에서 확인하기 위하여, 면역세포가 부재되어 있는 NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull, Jackson Laboratory, 5-6주령) 마우스에 인간 암세포주와 정상인의 말초혈액 단핵 세포를 이식하는 이종이식 동물모델을 사용하였다. 인간 암세포주로는 인간 대장암 세포주인 HT29 (ATCC, HTB-38)를 사용하였고 PE anti-PVR 항체(Thermo Fisher Scientific, 12-1550-41)를 이용하여 PVR 발현을 확인한 결과를 도 16에 나타내었다. HT29 세포에 발현된 PVR은 면역세포에서 발현된 TIGIT과 결합하여 면역세포의 활성 억제 효과를 유발한다. 먼저 HT29 세포 3.5x106 cells/0.2 mL를 암컷 NOG 마우스의 우측 겨드랑이 아래 피하에 주사하여 종양이 형성되도록 하였다(Day 0). 종양 세포 주사 6시간 후에 말초혈액 단핵 세포 7x106 cells/0.2 mL을 복강 안으로 주사하여 인간의 면역체계를 갖춘 마우스 모델을 만들었다. 종양부피가 50-80mm3으로 자랐을 때, 유사한 종양 크기를 가지는 그룹으로 분류하고 TIGIT 후보 항체(1G8) (10 mg/kg)를 마우스의 복강으로 일주일에 2회, 총 6회 투여하였다. TIGIT 후보 항체(1G8)를 10 mg/kg의 용량으로 투여 받은 실험군의 평균 종양 부피는 음성대조군의 평균 종양 부피와 비교하여 약 28.1% 정도의 종양 성장 억제 효과를 보였다(*: P<0.05).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GREEN CROSS CORPORATION MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> Antibodies Against T cell Immunoreceptor with IgAntibodies <130> 098 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Met Gly Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn 20 25 30 Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser 35 40 45 Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln 85 90 95 Ser Leu Thr Val Asn Asp Ala Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr 100 105 110 Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu 115 120 125 Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly 130 135 140 Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile 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Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Trp Glu Gln Gln Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Trp Glu Gln Gln Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 33 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro 100 105 110 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 34 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Gly 85 90 95 Ala Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 35 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 35 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Gly Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 36 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 36 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 37 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 37 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Ala 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Ser Asn Ser Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 39 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg

Claims (12)

  1. TIGIT (T cell Immunoreceptor with Ig and Tyrosine-Based Inhibitory Motif Domains)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로,
    서열번호 3, 6, 9 또는 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 4, 7 또는 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 5, 8, 11 또는 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 14, 17, 20, 23 또는 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 15, 18, 21 또는 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 16, 19, 22, 24 또는 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 중쇄 CDR1; 서열번호 4의 중쇄 CDR2; 서열번호 5의 중쇄 CDR3, 서열번호 14의 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 경쇄 CDR2; 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
    서열번호 6의 중쇄 CDR1; 서열번호 7의 중쇄 CDR2; 서열번호 8의 중쇄 CDR3, 서열번호 17의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 서열번호 19의 경쇄 CDR3;
    서열번호 9의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 11의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1; 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 서열번호 22의 경쇄 CDR3;
    서열번호 9의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 11의 중쇄 CDR3, 서열번호 23의 경쇄 CDR1; 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 서열번호 24의 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 12의 중쇄 CDR1; 서열번호 10의 중쇄 CDR2; 서열번호 13의 중쇄 CDR3, 서열번호 25의 경쇄 CDR1; 서열번호 26의 경쇄 CDR2; 서열번호 27의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 28 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 34 내지 38로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  8. 다음 단계를 포함하는 TIGIT에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제7항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암 치료와 병용하기 위한 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 면역관문억제제와 병용하기 위한 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-1을 타겟으로 하는 약물 또는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
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