WO2021157830A1 - Cmv pp65 펩타이드/hla-a*02 복합체에 특이적인 tcr-유사 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Cmv pp65 펩타이드/hla-a*02 복합체에 특이적인 tcr-유사 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to MHC-I molecules, in particular, the CMV pp65 peptide complex presented by HLA-A*02:01 (CMV P 495-503/HLA-A*02:01), which binds with specific and improved affinity.
  • CMV P 495-503/HLA-A*02:01 CMV P 495-503/HLA-A*02:01
  • TCR-like antibodies or antigen-binding fragments thereof are provided.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention, an expression vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the expression vector, a method for producing the same, the antibody or antigen-binding thereof It relates to a composition comprising T cells expressing the fragment as a chimeric antigen receptor, preferably a composition for preventing or treating cancer or an infectious disease, and a composition for diagnosis.
  • MHC Major histocompatibility complex
  • MHC-I is a set of genes encoding cell surface proteins for recognizing foreign molecules in vertebrates and It acts as an antigen presenting molecule.
  • MHC is largely divided into two types: type I MHC (MHC class I molecules, MHC-I) and type II MHC (MHC class II molecules, MHC-II).
  • MHC-II is a heterodimer structure composed of alpha-chain ( ⁇ -chain) and beta-chain ( ⁇ -chain).
  • HLA human leukocyte antigen
  • ⁇ 2m beta-2-microglobulin
  • Human MHC-I has three types of genes, HLA-A, HLA-B, and HLA-C, and is expressed in all cells with a nucleus, including tumor cells.
  • Antigens presented by MHC-I react with CD8+ T cells.
  • Type MHC-II has genes of HLA-DP, HLA-DQ, and HLA-DR, and proteins are antigen-presenting cells such as dendritic cells (DCs), macrophages, and B cells (B cells).
  • DCs dendritic cells
  • APCs Antigen presenting cells
  • Antigens presented by MHC-II react with CD4+ T cells.
  • Tumor and virus-infected cells can present peptide antigens (8-10 amino acid residues) via cell surface MHC-I molecules to CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which It is called I complex, and the antigen-derived peptide presented by MHC is called a T cell epitope.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • T cell epitope CD8+ T cells can recognize antigenic epitope peptides only when the antigen is presented in the form of a peptide bound to MHC-I, that is, in the peptide/MHC-I complex. This antigen recognition of T cells is called MHC-restricted antigen recognition (MHC restriction).
  • CD8+ cytotoxic T cells are recognized through T cell receptor (TCR) specific to the peptide/MHC-I complex, bind to them, and secrete effector substances to kill target cells.
  • TCR T cell receptor
  • Malignant transformed or virus-infected cells present tumor-associated antigens or peptides derived from viral protein antigens as peptide/MHC-I complexes via MHC-I molecules.
  • disease-specific peptide/MHC complexes can be the target of immunotherapeutic approaches.
  • T cell receptor has intrinsic specificity to the peptide/MHC complex, it has a low intrinsic affinity, making it difficult to use in practice. Accordingly, specific specificity is maintained for the peptide/MHC complex and antibodies with high affinity are developed, which are called TCR-like antibodies.
  • TCR-like antibodies are being developed as a new class of immunotherapeutic agents that can target tumor and virus-infected cells and mediate their specific death. In addition to therapeutic purposes, TCR-like antibodies are being developed as diagnostic reagents for cancer and infectious diseases, and are also used as research tools on the MHC-I pathway by visualizing MHC-I antigen presentation.
  • the MHC-I antigen-presenting molecule consists of alpha chains 1, 2, 3 and beta-2-microglobulin ( ⁇ 2m), 2 HLA-A depending on the type of alpha chain, With two HLA-B and two HLA-C, a total of six different antigen-presenting molecules are generated.
  • HLA-A proteins HLA-A*02 type accounts for about 25-30% of the world's population, and among them, HLA-A*02:01 subtype accounts for up to 30-90% depending on race, so the most common MHC- I is the molecule. (Lai, Choo et al. 2017)
  • CMV Human Cytomegalovirus
  • pp65 Phosphoprotein 65
  • the CMV-specific cytotoxic T cell activity of HLA-A*02:01-positive individuals was mainly derived from the amino acid residue sequence 495-503 of the pp65 protein (CMV P 495-503, 495-NLLVPMVATV-503) (Chee, Bankier et al. 1990).
  • CMV P 495-503, 495-NLLVPMVATV-503 the amino acid residue sequence 495-503 of the pp65 protein
  • it has been reported that the frequency of CD8+ T cells that specifically recognize the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex in the blood of healthy CMV-infected individuals accounts for 0.5 to 11% of all CD8+ T cells ( Schmittnaegel, Levitsky et al. 2015)
  • the TCR-like antibody with improved affinity for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex according to the present invention could not be detected in the previously reported antibody due to the remarkably mature affinity, HLA-A*02
  • the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex can be detected even in a cell line with a low expression level of the :01 molecule, so its utility is high.
  • the affinity-matured TCR-like antibody for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex reduces or loses MHC expression, such as a tumor microenvironment, resulting in a small amount of CMV. It can be effectively detected even in the environment presenting the P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • the peptide derived from amino acids 495-503 of the pp65 protein of human cytomegalovirus (CMV) is MHC-I HLA-A*02:01
  • CMV P 495-503, 495-NLVPMVATV-503 is MHC-I HLA-A*02:01
  • TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof that is specific for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex and has significantly improved affinity.
  • Another object of the present invention is to provide a heavy chain variable domain (VH) and a light chain variable domain (VL) of the improved TCR-like antibody.
  • Another object of the present invention is to provide complementarity determining regions (CDRs), which are antigen-binding sites in the heavy and light chain variable regions of the improved TCR-like antibody.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Another object of the present invention is to provide a protein, recombinant monoclonal antibody using a partial and entire amino acid sequence derived from a TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof having the improved affinity and high specificity.
  • Another object of the present invention is to provide a T cell receptor, preferably a Chimeric Antigen Receptor (CAR), using some and all amino acid sequences derived from a TCR-like antibody having the improved affinity and high specificity.
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • Another object of the present invention is to provide a modified T cell expressing the T cell receptor, CAR, using the partial and whole amino acid sequences derived from the TCR-like antibody with the improved affinity and high specificity.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a TCR-like antibody having improved affinity for the CMV P 495-503/HLA-A*02 complex.
  • Another object of the present invention is to provide a cell comprising the polynucleotide or the expression vector.
  • Another object of the present invention is to present HLA-A*02, which is MHC-I, of a peptide derived from amino acid residue sequence 495-503 of the pp65 protein of human cytomegalovirus (CMV) (CMV P 495-503, 495-NLVPMVATV-503)
  • CMV human cytomegalovirus
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of human cytomegalovirus (CMV)-infected cancer or infectious disease, or a pharmaceutical composition for prevention or treatment.
  • CMV cytomegalovirus
  • the present invention provides a TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof, which specifically binds to a complex of MHC-I presenting a peptide derived from a viral protein antigen.
  • the viral protein antigen-derived peptide may be peptide 495-503 or peptide 480-503 among the pp65 protein of human cytomegalovirus (CMV) of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • MHC-I presenting the viral protein antigen-derived peptide may be HLA-A*02:01.
  • One aspect of the present invention provides an affinity matured TCR-like antibody to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex. These antibodies can bind with higher affinity than antibody fragments known to previously bind to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 molecule, even in environments in which MHC-I expression is reduced or lost, such as a tumor microenvironment. Complexes of MHC-I presenting peptides derived from viral protein antigens can be detected.
  • the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex has a higher affinity than previously known antibodies
  • the clones showing the was isolated and identified, and the variable region sequence of the selected clone was inserted into mouse IgG2a to construct and purify a complete IgG antibody.
  • a TCR-like antibody specific for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex in the form of complete IgG is used by ELISA and Octet to CMV P 495-503/HLA-A*02 Affinity matured to the :01 complex was quantitatively analyzed.
  • a peptide containing a CMV pp65-derived T cell epitope (CMV P 480-503) in the cytoplasmic penetration antibody. )) was treated with a fusion virus epitope fusion antibody (viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab), it was confirmed that the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex could be detected on the cell surface. did.
  • the TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention having the above characteristics specifically binds to the MHC-I complex presenting the viral protein antigen-derived peptide.
  • the viral protein antigen-derived peptide is peptide 495-503 or peptide 480-503 among pp65 proteins of human cytomegalovirus (CMV), and the MHC-I is HLA-A*02:01.
  • the TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof is a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12, a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 13, 17 and 18, and a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16 ; and a light chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, a light chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 10 and 11, and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 9.
  • the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 5 the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 6, the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 8; and heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 13, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 15;
  • light chain CDR1 of SEQ ID NO: 5 light chain CDR2 of SEQ ID NO: 6, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 9; and heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 13, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 16;
  • the TCR-like antibody (T cell receptor-like antibody) or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 23 and/or the group consisting of SEQ ID NOs: 25 to 28 It may include a heavy chain variable region selected from, but is not limited thereto.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof and an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention also relates to a cell transformed with the expression vector.
  • the present invention also relates to a method for producing a TCR-like antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the steps of:
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising T cells expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof as a chimeric antigen receptor.
  • the present invention also relates to a composition for preventing or treating cancer or infectious disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also relates to a composition for diagnosing cancer or infectious disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • H9 clone shows the low affinity and non-specific binding characteristics of the H9 clone, which is a TCR-like antibody specific for the existing CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • 1a is a schematic diagram of an expression vector for expressing the H9 clone in the form of a full-length IgG antibody.
  • the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of the H9 clone were added to the heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3 domain) and the mouse kappa light chain constant region (kappa domain) of mouse immunoglobulin 2a (mIgG2a). introduced and expressed in animal cells (HEK293F).
  • Figure 1b shows the expression purification of the constructed full-length IgG-form H9, and after pulsing 50 ⁇ M of CMV P 495-503 peptide in cells having various cell surface MHC-I (HLA-A*02:01) expression levels, the H9 antibody
  • Figure 1c is a viral epitope fusion antibody (viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab) inCT99-CMV P ⁇ 480 in which a peptide (CMV P 480-503) containing a CMV pp65-derived T cell epitope is fused to a cytoplasmic penetration antibody; MDA-MB-231 cells were treated with -503 and inCT99-HPV E ⁇ 1-19 to induce the formation of the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, and then CMV P 495-503 of the H9 antibody /HLA-A*02:01 The binding capacity to the complex was analyzed by flow cytometry (flow cytometry) is the experimental result.
  • flow cytometry flow cytometry
  • FIG. 2a is a schematic diagram of the CMV / HLA-A * 02:01 single chain trimer (SCT) protein.
  • the CMV P 495-503 peptide- ⁇ 2m-HLA-A*02:01 complex was constructed in the form of a single chain trimer (SCT) through a peptide linker.
  • Figure 2b shows SCT proteins expressed and purified in animal cells (HEK293F), then biotinylated to separate 3 ⁇ g of protein on 12% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions, and size and combination shape through Coomassie Blue staining. is the result of the analysis.
  • Figure 2c shows that all of the peptide / HLA-A * 02:01 SCT protein purified using the Gel shift analysis method is biotinylated to Avi-tag, separated on SDS-PAGE under non-reducing conditions, and the size and It is the result of analysis in the form of combination.
  • Figure 2d shows the binding ability of the purified CMV/HLA-A*02:01 SCT protein with an antibody (BB7.2) recognizing the structure of HLA-A2 and whether it can bind with the H9 antibody, which is an existing TCR-like antibody, by ELISA. It is the result of analysis.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a yeast cell surface H9 scFab CDR3 library construction strategy for affinity maturation to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • Figure 3a shows the CDR3 portion of the heavy chain variable region (VH) and the CDR3 portion of the light chain variable region (VL) based on the sequence of the H9 clone known to previously bind to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • a library was constructed by putting the degenerate codon in
  • 3b is a schematic diagram of the constructed H9 scFab CDR3 library, which was fused to Aga1p-Aga2p on the yeast cell surface and expressed in the form of single chain Fab (single chain Fab (antigen binding fragment)).
  • Figure 4 analyzes the pool bound to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex by performing MACS and FACS using biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein as a binding antigen in the constructed library. This is the result of a FACS analysis.
  • 5A is a result of comparative analysis of a total of 50 monoclones with H9 scFab.
  • the binding ability of each clone to the 2nM biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein was identified by the median fluorescence intensity shown by FACS, and clones showing the upper median fluorescence intensity were selected among them.
  • FIG. 5b shows the results of FACS analysis of the binding to 2nM biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein and the expression level of scFab on the yeast cell surface of the clones selected in FIG. 5a.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • FIG. 8 shows H9 antibodies and H9 #1, H9 #38 with improved affinity after pulsing 50 ⁇ M of CMV P 495-503 peptide in cells having various cell surface MHC-I (HLA-A*02:01) expression levels. These are the experimental results of analyzing the binding ability of the antibody to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex by flow cytometry.
  • viral epitope fusion antibody viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab inCT99-CMV p ⁇ 480 in which a cytoplasmic penetration antibody is fused with a peptide (CMV P 480-503) containing a CMV pp65-derived T cell epitope.
  • MDA-MB-231 cells were treated with -503 and inCT99-HPV E ⁇ 1-19 to induce the formation of cell-surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, followed by H9 antibody and affinity These are the experimental results of detecting the cell-surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex by flow cytometry using the improved H9 #1 and H9 #38 antibodies.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a yeast cell surface H9 #1 scFab CDR2 library construction strategy for affinity maturation to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • Figure 10a is based on the sequence of the H9 #1 clone derived from the H9 scFab CDR3 library, a library was constructed by adding degenerate codons to the CDR2 portion of the heavy chain variable region and the CDR2 portion of the light chain variable region.
  • 10B is a schematic diagram of the constructed H9 #1 scFab CDR2 library, which was fused to Aga1p-Aga2p on the yeast cell surface and expressed in the form of a single chain Fab (scFab).
  • 11 is a result of screening the biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein from the constructed library by performing FACS as a binding antigen.
  • FIG. 12b shows the results of FACS analysis of the binding to 0.5nM biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein and the expression level of scFab on the yeast cell surface of the clones selected in FIG. 12a.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • FIG. 16 shows the formation of cell-surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complexes by treating MDA-MB-231 cells with inCT99-CMV p ⁇ 480-503 and inCT99-HPV E ⁇ 1-19 fusion antibodies. After induction, the cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex was analyzed by flow cytometry ( It is the experimental result detected by flow cytometry).
  • the present invention relates to a T-cell receptor-like antibody or antigen-binding fragment thereof, which specifically binds to a complex of MHC-I presenting a peptide derived from a viral protein antigen.
  • the virus-derived peptide may preferably have the sequence shown in Table 1.
  • An object of the present invention is that peptides derived from amino acid sequence 495-503 of pp65 protein of human cytomegalovirus (CMV) (CMV P 495-503, 495-NLVPMVATV-503) are MHC-I HLA-A*02:01 To provide a TCR-like antibody specific for the presented CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex and having improved affinity.
  • CMV human cytomegalovirus
  • a complete antibody in the present invention comprises two heavy chains and two light chains.
  • variable chain refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3, and It is interpreted as meaning including all fragments thereof.
  • light chain includes both full-length light chains and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. interpreted as meaning
  • the constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types, subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has the kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • variable region of an antibody is responsible for antigen binding.
  • the variable regions in the light and heavy chains generally include complementarity determining regions (CDRs) known to be majorly involved in antigen binding.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Each variable region typically contains three highly variable loops (light chain (LC) CDRs comprising VL-CDR1, VL-CDR2 and VL-CDR3, heavy chain comprising VH-CDR1, VH-CDR2 and VH-CDR3) (HC) CDRs).
  • LC light chain
  • HC heavy chain comprising VH-CDR1, VH-CDR2 and VH-CDR3
  • CDR boundaries for the antibodies and antigen-binding fragments disclosed herein may be defined or identified by the definitions of Kabat.
  • the antigen-binding fragment of an antibody refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • Fab Antigen binding fragment, Fab
  • Fab has a structure having a light chain and heavy chain variable regions, a light chain constant region and a heavy chain first constant region (CH1), and has one antigen-binding site.
  • a single chain antigen-binding fragment (scFab) is a polypeptide consisting of light and heavy chain variable regions, light chain constant regions, heavy chain first constant region (CH1), and a linker. In some cases, it may be stabilized by insertion of a cysteine residue.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • the F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond with a cysteine residue in the hinge region of Fab'.
  • Fv Frag., Fv
  • scFv single-chain variable fragment
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the whole antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2 fragments), gene It can also be produced through recombinant technology.
  • proteolytic enzymes for example, by restriction digestion of the whole antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2 fragments
  • gene It can also be produced through recombinant technology.
  • antibody fragment refers to each domain of the heavy or light chain of an antibody or a fragment thereof, for example, heavy chain variable region fragment (VH), antibody heavy chain constant region fragment (Fc), heavy chain constant region domain (CH1, CH2, or CH3) fragment, antigen-binding fragment (Fab), single chain variable fragment (scFv), light chain constant region fragment (CL) or light chain variable region fragment (VL) ) or a fragment thereof.
  • VH heavy chain variable region fragment
  • Fc antibody heavy chain constant region fragment
  • CH1, CH2, or CH3 heavy chain constant region domain
  • Fab antigen-binding fragment
  • scFv single chain variable fragment
  • CL light chain constant region fragment
  • VL light chain variable region fragment
  • the fragment of the antibody may be a monomer (monomer), a dimer (dimer) or a multimer.
  • the antibody is a monoclonal antibody, a non-specific antibody, a non-human antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single chain Fvs (scFV), a single chain antibody, a Fab fragment, an F(ab') fragment, a disulfide-linked Fvs ( sdFV) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of such antibodies.
  • scFV single chain Fvs
  • Fab fragment an F(ab') fragment
  • sdFV disulfide-linked Fvs
  • anti-Id anti-idiotypic antibodies
  • Said monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts.
  • Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site.
  • conventional (polyclonal) antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes)
  • each monoclonal antibody is directed against a single determinant on an antigen.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind. Epitopes are usually composed of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Conformational and nonsteric epitopes are distinguished in that in the presence of a denaturing solvent the binding to the former is lost but not to the latter.
  • the monoclonal antibody may be of IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, or IgD type.
  • the light chain constant region of the antibody may be ⁇ or ⁇ type.
  • the TCR-like antibody is heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 13, heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16. and a light chain CDR3 selected from the group consisting of a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, a light chain CDR2 of SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NOs: 8 and 9,
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12 heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 18, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 16 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, light chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10 and 11, sequence light chain CDR3 of number 9.
  • FRs Framework regions
  • Each variable domain typically has four FRs identified as FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the TCR-like antibody may include a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 23. It may include a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25 to 28.
  • the term “specifically binds” or “specific for” refers to a measurable and reproducible interaction that allows to determine the presence of a target in the presence of a heterogeneous population of molecules, including biological molecules, such as a target and an antibody or refers to binding between antibody fragments.
  • an antibody or antibody fragment that specifically binds to a target (which may be an epitope) has greater affinity, avidity, more readily, and/or for a longer duration than if it binds another target.
  • sequence according to the present invention may include not only the sequences described herein, but also biological equivalents thereof.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of an antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
  • the antibody or nucleic acid molecule encoding the same of the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence set forth in SEQ ID NO:.
  • the substantial identity is at least when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned to correspond to the maximum, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. refers to a sequence exhibiting 90% homology, most preferably at least 95% homology, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • the NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) can be accessed from NBCI, etc.
  • the BLSAT can be accessed at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a method for comparing sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% compared to the specified sequence or all of the sequences described in the specification. , 99%, or more homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof can be recombinantly produced by isolating a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of the DNA) or further expression. Based on this, the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid from another aspect.
  • Nucleic acid has a meaning comprehensively encompassing DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acids, include natural nucleotides as well as analogues in which sugar or base regions are modified. .
  • the sequences of the nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
  • the term "vector” refers to a means for expressing a target gene in a host cell, including a plasmid vector; cozmid vector; viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors, and the like.
  • the nucleic acid encoding the antibody is operably linked to a promoter.
  • “Operably linked” refers to a functional association between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is linked to the other nucleic acid. control the transcription and/or translation of the sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • a strong promoter capable of propagating transcription eg, tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter and human muscle creatine promoter
  • mammalian virus-derived promoters e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Moloney virus promoter Epstein Barr virus (EBV) promoter and Loose sarcoma virus (RSV) promoter
  • ESV Moloney virus promoter Epstein Barr virus
  • RSV Loose sarcoma virus
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexa-histidine; Quiagen, USA).
  • the vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a cell transformed with the above-mentioned vector.
  • the cells used to produce the antibodies of the invention can be, but are not limited to, prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells.
  • Bacillus genus strains such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (eg Pseudomonas putida), Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of: (a) culturing the cells; and (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the cells may be cultured in various media. Among commercially available media, it can be used as a culture medium without limitation. All other essential supplements known to those of ordinary skill in the art may be included in appropriate concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already in use with the host cells selected for expression, as will be apparent to the skilled person.
  • impurities may be removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant product may be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography, and the like.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising T cells expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof as a chimeric antigen receptor.
  • a CAR may comprise an extracellular domain comprising an antigen binding domain, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • the extracellular domain may be linked to the transmembrane domain by a linker.
  • the extracellular domain may also include a signal peptide.
  • the CAR comprises a single chain fragment variable region (scFv) of an antibody specific for a tumor associated antigen (TAA) that is coupled via a hinge and transmembrane region to the cytoplasmic domain of a T-cell signaling molecule.
  • TAA tumor associated antigen
  • Most common lymphocyte activation moieties contain T-cell costimulatory (eg CD28, CD137, OX40, ICOS, and CD27) domains in tandem with a T-cell triggering (eg CD3 ⁇ ) moiety.
  • TAA tumor associated antigen
  • Most common lymphocyte activation moieties contain T-cell costimulatory (eg CD28, CD137, OX40, ICOS, and CD27) domains in tandem with a T-cell triggering (eg CD3 ⁇ ) moiety.
  • TAA-mediated adoptive immunotherapy allows CAR-transplanted cells to directly recognize TAAs on target tumor cells in a non-HLA-restricted manner.
  • the present invention includes cells genetically modified to express said CAR.
  • the cell may be an immune cell, preferably a T cell.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer or infectious disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the invention may be a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or infectious disease comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer or an infectious disease, comprising administering to a patient an effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention to a patient.
  • the cancer is melanoma, lung cancer, liver cancer, glioblastoma, ovarian cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, kidney cancer, stomach cancer, breast cancer, metastatic cancer, Hodgkin's lymphoma, prostate cancer and the group consisting of pancreatic cancer It may be characterized in that it is selected from, but is not limited thereto.
  • treatment refers to the administration of a composition to inhibit or alleviate cancer or infectious disease or one or more symptoms resulting therefrom, as well as to prevent treatment or progression of cancer or infectious disease that reverses the symptoms of the disease.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of cancer or infectious disease by administration of the composition.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers for compositions formulated as liquid solutions include sterile and biocompatible, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • composition for preventing or treating cancer or infectious disease comprising the antibody and a pharmaceutically acceptable carrier of the present invention is applicable to any formulation containing the same as an active ingredient, and may be prepared as an oral or parenteral formulation.
  • the pharmaceutical formulation of the present invention may be administered to the oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), subcutaneous, vaginal or parenteral (intramuscular, subcutaneous) forms. and those suitable for administration (including intravenous) or forms suitable for administration by inhalation or insufflation.
  • Formulations for parenteral administration containing the composition of the present invention as an active ingredient include injections such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, suppository injection method, or an aerosol for inhalation through the respiratory tract.
  • injections such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, suppository injection method, or an aerosol for inhalation through the respiratory tract.
  • the composition of the present invention may be mixed with a stabilizer or buffer in water to prepare a solution or suspension, and it may be formulated for unit administration in ampoules or vials.
  • a composition for rectal administration such as a suppository or an enema containing a conventional suppository base such as cocoa butter or other glycerides.
  • a propellant or the like may be blended with an additive so that the water-dispersed concentrate or wet powder is dispersed.
  • administering means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient by any suitable method.
  • the administration route of the composition of the present invention may be administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue. Specifically, it may be administered in a conventional manner through oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal, inhalation, intraocular or intradermal routes.
  • the treatment method of the present invention includes administering the composition for preventing or treating cancer or infectious disease of the present invention in a pharmaceutically effective amount. It is obvious to a person skilled in the art that a suitable total daily usage amount can be determined by a physician within the scope of sound medical judgment. A specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the patient's age, weight, general health, sex and diet, time of administration; It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, the duration of treatment, the drug used together with or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field. Therefore, it is preferable to determine the effective amount of the composition for preventing or treating cancer suitable for the purpose of the present invention in consideration of the foregoing.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing cancer or infectious disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing cancer by treating a sample with the antibody or antigen-binding fragment thereof. Radioimmunoassay using the antibody or antigen-binding fragment thereof, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), capture-ELISA, inhibition or hardwood assay, sandwich assay, flow cytometry (flow flow cytometry), immunofluorescence staining, and immunoaffinity purification, but is not limited thereto.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • FIG. 1a shows the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of a TCR-like antibody H9 clone that specifically recognizes the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex with mouse immunoglobulin 2a
  • It is a schematic diagram of a vector for introducing into the heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3 domain) of mIgG2a) and the mouse kappa light chain constant region (kappa domain) for expression in animal cells (HEK293F).
  • VH human heavy chain variable region
  • VL human light chain variable region
  • Figure 1b shows the CMV of the H9 antibody after pulsing 50 ⁇ M of the CMV P 495-503 peptide in cells having various cell surface MHC-I (HLA-A*02:01) expression levels by expression purification of the constructed chimeric H9 antibody.
  • Malme-3M, MDA-MB-231, and HCT116 cells were prepared in RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotics at a density of 3.0 ⁇ 10 5 cells/ml, and CMV P 495-503 peptide was included.
  • a peptide derived from amino acid sequences 11-19 of HPV16 E7 protein, which is another virus-derived synthetic peptide that can form a complex with HLA-A*02:01 HPV E 11-19, 11-YMLDLQPET-19 was added to a concentration of 50 ⁇ M and reacted at 5% CO 2 , 37° C. for 3 hours.
  • the negative control group not treated with the peptide was added with DMSO.
  • Figure 1c is a viral epitope fusion antibody (viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab) inCT99-CMV P ⁇ 480 in which a peptide (CMV P 480-503) containing a CMV pp65-derived T cell epitope is fused to a cytoplasmic penetration antibody; MDA-MB-231 cells were treated with -503 and inCT99-HPV E ⁇ 1-19 to induce the formation of the cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, followed by CMV P 495 of the H9 antibody. The binding ability to the -503/HLA-A*02:01 complex was analyzed by flow cytometry.
  • the MDA-MB-231 cell line was diluted in RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic at a density of 1.8 ⁇ 10 5 cells/ml per well for 12 hours, 37°C, 5%
  • RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic
  • remove the medium and dilute the inCT99, inCT99-CMV P ⁇ 480-503, inCT99-HPV E ⁇ 1-19 fusion antibody to a concentration of 4 ⁇ M in 1 ml of medium for 18 hours, 37°C , 5% CO 2 was cultured under conditions.
  • 100 ⁇ l of a trypsin-EDTA (Trypsin-EDTA) solution per well was treated at 37° C.
  • the F(ab')2 antibody which specifically recognizes Alexa647 (red fluorescence)-linked mouse Fc, was diluted 1:600 in 100 ⁇ l of FACS buffer under 4°C condition. reacted for 30 min. After washing with 1ml of FACS buffer and analyzed by flow cytometry, non-specific binding of the H9 antibody was observed in the experimental group treated with inCT99-CMV P ⁇ 480-503 as well as inCT99 and inCT99-HPV E ⁇ 1-19.
  • the H9 clone which is an antibody that specifically binds to the previously reported CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, was measured for affinity by SPR (surface plasmon resonance) and had a low affinity of about 300 nM.
  • the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex could not be detected in HCT116 cells with low cell surface MHC-I (HLA-A*02:01) expression levels, and cytoplasmic penetration CMV P 495-503/HLA-A*02 presented by processing a virus epitope fusion antibody in which an antibody is fused with a peptide (CMV P 480-503) containing a CMV pp65-derived T cell epitope to cancer cells, and then processed in cancer cells:
  • CMV P 480-503 containing a CMV pp65-derived T cell epitope to cancer cells
  • the protein was produced by linking the peptide/ ⁇ 2m/HLA-A*02:01 to the N-terminus of the heavy chain variable region of a monoclonal antibody through a peptide linker through an animal cell expression system (Truscott, Lybarger et al. 2007), to construct a protein expression vector with reference to this.
  • Figure 2a is a schematic diagram of a protein made of CMV P 495-503 peptide/ ⁇ 2m/HLA-A*02:01 in the form of a single chain trimer (SCT) through a peptide linker.
  • SCT single chain trimer
  • HLA-A*02:01 At the C-terminus of HLA-A*02:01, Avi-tag and 8X His-tag were fused using a GS peptide linker to construct DNA in the form of a fusion using PCR technique, and NotI and HindIII restriction enzymes were added to the animal cell expression vector pcDNA3.4.
  • Figure 2b shows the expression and purification of SCT proteins in animal cells (HEK293F), followed by biotinylation to separate 3 ⁇ g of protein on 12% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions, and size and combination through Coomassie Blue staining. It is the result of analysis in the form.
  • HEK293F cells were seeded in 90 mL of medium at a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells/ml, and cultured at 120 rpm, 8% CO 2 , 37°C.
  • the CMV P 495-503/ ⁇ 2m/HLA-A*02:01-Avi-8X His plasmid was diluted and filtered to 125 ⁇ g (1.25 ⁇ g/ml) in 5 ml FreeStyle 293 expression medium, and filtered to 375 ⁇ g PEI (3.75 ⁇ g). ⁇ g/ml) was mixed with 5 ml of diluted medium and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the reacted mixed medium was put into the cells seeded with 90 ml previously, and cultured for 6 days in an incubator at 120 rpm, 8% CO 2 .
  • the protein was purified using a Ni-NTA resin that specifically purifies the His-tag fused protein from the cell culture supernatant collected with reference to a standard protocol. 100ml of the cell culture supernatant was mixed 1:1 with 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, and 10mM Imidazole pH8.0 buffer, and then 1ml of Ni-NTA resin was added and rotated at 4°C for 1 hour.
  • Ni-NTA resin To wash the Ni-NTA resin, it was washed with 50 ml of 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, and 10 mM Imidazole pH 8.0 buffer, and then washed with 50 ml of 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole pH 8.0 buffer. Proteins were eluted using an elution buffer of 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, and 200 mM Imidazole pH8.0. The eluted fractions were collected, exchanged with DPBS buffer through a PD-10 desalting column (GE healthcare), and concentrated using a 30K centrifugal filter tube (Corning).
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve. When transfected with a volume of 100 ml, a yield of about 9 mg was obtained.
  • the birA enzyme kit was used for the Avi-Tag portion of the antigen. Specifically, 1.8 mg of protein in DPBS buffer was prepared and replaced with 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 reaction buffer using a PD-10 desalting column. In order to optimize the enzyme reaction, the concentration of the antibody was concentrated to a concentration of 40 ⁇ M or more using a centrifugal filter tube. The 10X reagent provided in the kit was mixed with the protein so that the final concentration was 50mM Bicine, 50 ⁇ M d-Biotin, 10mM MgOAc, and 10mM ATP, and the concentration of the antibody was 40 ⁇ M.
  • Figure 2c is the result of separation on SDS-PAGE under non-reducing conditions that all SCT proteins purified using the gel shift analysis are biotinylated to Avi-tag, and analyzed in size and combination form through Coomassie Blue staining.
  • Figure 2d shows the results of analysis by ELISA whether the purified CMV/HLA-A*02:01 SCT protein can bind specifically to the anti-HLA-A2 antibody and to specifically bind to the TCR-like antibody, H9.
  • CMV/HLA-A*02:01 SCT protein prepared by the above method had the ability to bind to the anti-HLA-A2 antibody or to show specific binding ability to the TCR-like antibody, H9.
  • IL interleukin-4 Receptor alpha protein
  • CMV P 495-503 peptide and HPV E 11-19 peptide were combined in PBS pH 7.4 buffer for 1 hour at room temperature to a concentration of 1 ⁇ g/ml, and then treated with 0.05% PBST (PBS pH 7.4, 0.05% Tween20) 10 Washed 3 times per minute.
  • H9-Avi antibody was diluted in Blocking buffer, diluted with 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, and anti-HLA-A2 antibody to 2 ⁇ g/ml, bound for 1 hour at room temperature, and washed 3 times for 10 minutes with 0.05% PBST buffer. did.
  • HRP-conjugated anti-mouse Fc antibody HRP-conjugated anti-mouse Fc
  • the T cell receptor consists of an ⁇ -polypeptide chain and a ⁇ -polypeptide chain.
  • Each chain has a variable region (V region), a junction region (J region), and a gene called a constant region (C region), and in the case of the ⁇ -chain, it additionally has a diversity region (D region).
  • V region variable region
  • J region junction region
  • C region constant region
  • D region diversity region
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDR3 region has the most diversity among them and plays the most important role when specifically recognizing an antigen (Rubtsova, Scott-Browne et al. 2009).
  • the antigen and more Clones with mature affinity were sought to isolate.
  • the antigen-binding fragment of the H9 antibody after cloning in the form of a single chain antigen-binding fragment (single chain fragment antigen binding, scFab) linker , the heavy chain variable region (VH) (VH-CDR3) and the light chain variable region (VL) CDR3 (VL-CDR3) sequence as a template by giving a synonymous codon (degenerate codon) to the initiator of the square was prepared.
  • the library was given with all NNK codons except for the portion corresponding to three residues at the C-terminus of the heavy chain variable region CDR3 region.
  • WTK which is a synonymous codon composed of phenylalanine, isoleucine, methionine, and leucine, was selected so that phenylalanine and methionine, which frequently appear in most antibody sequences, can be located at the 3rd residue at the C-terminus.
  • synonymous codons were constructed in consideration of amino acids conserved in most human antibodies.
  • a reverse initiator was synthesized in the CH1 portion of the antibody heavy chain constant region (Fc) fragment.
  • the forward initiator and the reverse initiator include a portion identical to the sequence of a vector of 50 base pairs or more to enable homologous recombination in yeast cells.
  • Library DNA was prepared by performing DNA polymerase chain reaction (PCR). Using the pYDS-H9 scFab vector in which the light chain variable region and heavy chain variable region sequences of the H9 clone were inserted into the pYDS vector (Baek and Kim 2014) capable of expressing scFab on the yeast cell surface as a template, the forward and reverse initiators were used DNA was amplified, and the amplified DNA (total 120 ⁇ g, 12 ⁇ g/transformation) was prepared by treating the pYDS vector with NheI and ApaI restriction enzymes (a total of 40 ⁇ g, 4 ⁇ g/transformation) and Together with yeast, electroporation was repeated 10 times to construct a library.
  • PCR DNA polymerase chain reaction
  • the library and vector were combined in yeast cells through homologous recombination.
  • the size of the library was confirmed to be 1.5X10 7 by measuring the number of colonies grown in a selection medium according to the selection factor present in the vector after serial dilution.
  • Example 4 Selection of affinity matured clones for CMV/HLA-A*02:01 SCT protein in the constructed yeast H9 scFab VH-/VL-CDR3 library
  • FIG. 4 shows the process of selecting clones that specifically bind to the CMV/HLA-A*02:01 SCT protein constructed in Example 2 from the constructed yeast H9 CDR3 scFab library. Specifically, one time of magnetic activated cell sorting (MACS) and two times of fluorescence activated cell sorting (FACS) were performed using the CMV/HLA-A*02:01 SCT protein prepared as in Example 2. 2 ⁇ M biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein was combined with the H9 scFab VH-/VL-CDR3 library expressed on the yeast cell surface at 25° C. for 1 hour.
  • MCS magnetic activated cell sorting
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the selected clones confirmed the yeast cell surface expression level through the mouse antibody 9e10 clone recognizing the c-myc tag and the antibody recognizing the mouse Fc conjugated with Alexa488 through FACS, and the PE-conjugated streptavidin (Streptavidin-R- By using phycoerythrin conjugate (SA-PE), Thermo) to confirm biotinylated antigen binding, the expression level of scFab is high while decreasing the concentration of biotinylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein Clones having high binding affinity to the nylated CMV/HLA-A*02:01 SCT protein were selected. This process was repeated twice.
  • Table 6 shows the CDR amino acid sequences of the light chain variable region and the heavy chain variable region of the two converged clones. The amino acid sequence changed compared to the sequence of the H9 clone is indicated in bold.
  • the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) sequences of the selected H9 #1 and H9 #38 clones were combined with the heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3 domain) of mouse immunoglobulin 2a (mIgG2a) and It was introduced into pcDNA3.4 vector encoding the mouse kappa light chain constant region (kappa domain).
  • H9 #1 and H9 #38 antibodies which have improved affinity for H9, were expressed and purified in animal cells (HEK293F), and then 3 ⁇ g of protein was treated with 12% SDS under reducing or non-reducing conditions. -These are the results of separation on PAGE and analysis of size and combination form through Coomassie Blue staining.
  • the yields of H9, H9 #1, and H9 #38 were 27.8 mg, 20.4 mg, and 8.51 mg, respectively, per 1 L of HEK293F animal cell culture medium.
  • the EIA/RIA plate was coated with CMV/HLA-A*02:01 SCT protein at a concentration of 10 ⁇ g/ml in PBS pH7.4 buffer for 1 hour at room temperature, and then washed three times with 0.05% PBST. Then, it was combined at room temperature with blocking buffer for 1 hour.
  • H9, H9 #1, H9 #38 antibodies were diluted in blocking buffer and bound for 1 hour at room temperature, and then washed 3 times with 0.05% PBST buffer.
  • HRP-conjugated anti-mouse Fc antibody HRP-conjugated anti-mouse Fc
  • HRP-conjugated anti-mouse Fc antibody HRP-conjugated anti-mouse Fc antibody as a labeling antibody was diluted 1:4000 in blocking buffer and bound. After reacting with TMB ELISA solution, the reaction was completed with H 2 SO 4 , and absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.
  • the H9 #1 and H9 #38 clones in the IgG form were CMV/HLA-A*02:01 SCT protein. It was confirmed that it can bind with remarkably high affinity.
  • Example 7 Evaluation of binding ability of selected TCR-like antibodies to cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex
  • FIG. 8 shows H9 antibodies and H9 #1, H9 #38 with improved affinity after pulsing 50 ⁇ M of CMV P 495-503 peptide in cells having various cell surface MHC-I (HLA-A*02:01) expression levels. These are the experimental results of analyzing the binding ability of the antibody to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex by flow cytometry.
  • peptide pulsing was performed on the Malme-3M melanoma cell line, the MDA-MB-231 breast cancer cell line, and the HCT116 colon cancer cell line in the same manner as in Example 1.
  • the cells were washed with FACS buffer and centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to remove the supernatant.
  • Prepare 1.5 ⁇ 10 5 cells per sample make H9 concentration of 500 nM in 100 ⁇ l of FACS buffer, and dilute H9#1 and H9#38 clones so that the concentration becomes 5 nM, and react at 4°C for 1 hour.
  • the F(ab')2 antibody which specifically recognizes Alexa647 (red fluorescence)-linked mouse Fc, was diluted 1:600 in 100 ⁇ l of FACS buffer under 4°C condition. reacted for 30 min. After washing with FACS buffer, 1ml was analyzed by flow cytometry, in the experimental group treated with the HPV E 11-19 peptide compared to the group not treated with the peptides in all the cell lines did not show a combination of T cell receptor antibodies similar to, CMV P Only the experimental group treated with the 495-503 peptide showed specific binding, confirming the specificity of the TCR-like antibodies to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • the affinity matured H9 #1 and H9 #38 antibodies were able to detect a higher amount of the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex even when reacted at a concentration 100 times lower than that of the H9 antibody. It was confirmed that affinity was improved through In particular, it was confirmed that Malme-3M and HCT116 cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, which could not be detected by the H9 antibody in Example 1, were effectively detected, and the cell surface expression level of HLA-A2 Proportional complex formation was comparable in the three cell lines.
  • the MDA-MB-231 cell line was diluted in RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic at a density of 1.8 ⁇ 10 5 cells/ml per well for 12 hours, 37°C, 5%
  • RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic
  • the medium was removed, washed with DPBS, and cells were detached from the plate by treatment with 50 ⁇ l of a trypsin-EDTA solution per well at 37° C. for 2 minutes.
  • 1 ml of RPMI medium containing 10% FBS per well was added to neutralize trypsin-EDTA, and cells were recovered and centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to remove the supernatant.
  • the cells were washed with 1 ml of FACS buffer and centrifuged to remove the supernatant.
  • the cell pellet per well was dissolved with 200 ⁇ l of FACS buffer, divided into two samples, and one sample was used as the secondary antibody alone control.
  • the concentrations of H9, H9 #1, and H9 #38 were 50 nM and 250 nM in 100 ⁇ l of FACS buffer for each sample, and reacted at 4° C. for 1 hour. After washing each sample with 1ml of FACS buffer, F(ab') 2 antibody that specifically recognizes Alexa647 (red fluorescence)-linked mouse Fc is diluted 1:600 in 100 ⁇ l of FACS buffer under 4°C condition. reacted for 30 min.
  • the H9 antibody did not detect the CMV P 495-503 peptide/HLA-A*02:01 complex, but the H9 #1 and H9 #38 clones with improved affinity were When reacted at a concentration of 250 nM, the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex was detected. However, since the expression level of the cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex was very low, the detection intensity was too weak, and it was determined that additional affinity improvement was necessary.
  • Example 7 the CMV P 495-503 peptide/HLA-A*02:01 complex was significantly better than the H9 #1 clone, which showed better binding to the cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • a library was prepared by giving a degenerate codon to the CDR2 sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region using H9 #1 as a template.
  • H9 #1 as a template.
  • most of them consisted of NNK synonymous codons to obtain as many different clones as possible, but with reference to the IMGT database, synonymous codons were constructed in consideration of amino acids conserved in most human antibodies.
  • the 1st, 2nd, 7th, and 8th amino acids from the N-terminus constituted RBM, ATC, KRT, and RNT synonymous codons, respectively, and the 11th and 12th amino acids were conserved with tyrosine and alanine, respectively.
  • the light chain variable region CDR2 consisted mostly of NNK synonymous codons, the 2nd and 3rd amino acids at the N-terminus were conserved with alanine and serine, and the 4th amino acid consists of WCT synonymous codons that can be encoded with serine or tyrosine. did.
  • Other detailed experimental methods were performed in the same manner as in Example 3.
  • the size of the library was confirmed to be 1.3X10 7 by measuring the number of colonies grown in a selection medium according to the selection factor present in the vector after serial dilution.
  • Example 10 Selection of affinity matured clones for CMV/HLA-A*02:01 SCT protein in the constructed yeast H9 #1 scFab VH-/VL-CDR2 library
  • Example 11 shows the process of selecting clones that specifically bind to the CMV/HLA-A*02:01 SCT protein constructed in Example 9 from the constructed yeast H9 #1 CDR2 scFab library. Specifically, using the CMV/HLA-A*02:01 SCT protein prepared as in Example 9, fluorescence activated cell sorting (FACS) was performed 4 times. The biotinylated 2nM CMV/HLA-A*02:01 SCT protein was combined with the H9 #1 CDR2 scFab library expressed on the yeast cell surface at 25° C. for 1 hour.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • yeast cell surface scFab library clone capable of binding to CMV/HLA-A*02:01 SCT protein was transferred to yeast cells through the mouse antibody 9e10 clone recognizing c-myc tag and an antibody recognizing mouse Fc conjugated with Alexa488.
  • Table 7 shows the CDR amino acid sequences of the light chain variable region and the heavy chain variable region of the two converged clones. The amino acid sequence changed by comparison with the sequence of the H9 #1 clone is indicated in bold.
  • Example 11 IgG conversion and identification of affinity matured scFab clones for the selected CMV/HLA-A*02:01 SCT protein
  • the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) sequences of the selected H9 #1-17 and H9 #1-30 clones were identical to the heavy chain constant region (mIgG2a) of mouse immunoglobulin 2a (mIgG2a). CH1-hinge-CH2-CH3 domain) and mouse kappa light chain constant region (kappa domain) was introduced into the encoding pcDNA3.4 vector.
  • H9 #1 and H9 #38 antibodies with improved affinity for H9 and H9 #1-17 and H9 #1-30 antibodies with improved affinity for H9 #1 in animal cells (HEK293F).
  • H9 #1-17 and H9 #1-30 antibodies with improved affinity for H9 #1 in animal cells HEK293F.
  • 3 ⁇ g of protein was separated on 12% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions, and analyzed in size and combination form through Coomassie Blue staining.
  • the H9 #1-17 and H9 #1-30 antibodies showed yields of 13.3 mg and 24.8 mg per 1 L of HEK293F cell culture, respectively.
  • Example 12 Evaluation of the binding capacity of selected TCR-like antibodies to CMV/HLA-A*02:01 SCT protein
  • CMV/HLA-A*02:01 SCT protein and HPV/HLA-A*02:01 SCT protein were coated on an EIA/RIA plate at a concentration of 10 ⁇ g/ml in PBS pH7.4 buffer for 1 hour at room temperature. After that, it was washed 3 times with 0.05% PBST. After blocking at room temperature for 1 hour with blocking buffer, the H9 #1, H9 #1-17, H9 #1-30 antibodies were diluted in blocking buffer and combined at a concentration of 1 nM, 0.5 nM, and 0.1 nM at room temperature for 1 hour. After washing, it was washed 3 times with 0.05% PBST buffer.
  • HRP-conjugated anti-mouse Fc antibody HRP-conjugated anti-mouse Fc
  • TMB ELISA solution diluted 1:4000 in blocking buffer and bound. After reacting with TMB ELISA solution at room temperature for 1 minute, the reaction was completed with H 2 SO 4 and absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.
  • H9#1-17 and H9#1-30 clones in the form of IgG have about two-fold improved affinity to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex in ELISA. showed
  • Example 13 Evaluation of binding capacity of selected TCR-like antibodies to cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex
  • the cells were washed with FACS buffer and centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to remove the supernatant.
  • the test group treated with HPV E 11-19 peptide did not show binding of T-cell receptor-like antibodies compared to the test group not treated with the peptide, and CMV P 495-503 Only the experimental group treated with the peptide showed specific binding.
  • the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex was not detected even at the highest concentration of 50 nM, and compared to the H9 #1 antibody at the same treatment concentration, H9 #1-17, H9 It was confirmed that the #1-30 antibody detected more CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex, indicating that affinity was improved.
  • the peak of the graph showed a non-specific shift even in the experimental group that was not treated with the peptide, In this case, it was not used in subsequent experiments.
  • the MDA-MB-231 cell line was diluted in RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic at a density of 1.8 ⁇ 10 5 cells/ml per well for 12 hours, 37°C, 5%
  • RPMI medium containing 10% FBS and 1% ABAM antibiotic
  • the cells were washed with 1 ml of FACS buffer and centrifuged to remove the supernatant.
  • the cell pellet per well was dissolved with 100 ⁇ l of FACS buffer, divided into two samples, and one sample was used as the secondary antibody alone control.
  • Each sample was reacted at 4° C. for 1 hour so that the concentrations of the H9 #1 antibody were 50 nM and 250 nM, and the concentrations of the H9 #1-17 antibody were 0.5 nM and 5 nM in 100 ⁇ l of FACS buffer.
  • F(ab') 2 antibody that specifically recognizes Alexa647 (red fluorescence)-linked mouse Fc is diluted 1:600 in 100 ⁇ l of FACS buffer under 4°C condition.
  • H9 #1 and H9 #1-17 antibodies were reacted for 30 min. After washing with 1ml of FACS buffer, and analysis by flow cytometry, specific binding of H9 #1 and H9 #1-17 antibodies was confirmed in the inCT99-CMV P ⁇ 480-503 fusion antibody-treated group, especially H9 #1 It was confirmed that the affinity of the -17 antibody was improved by detecting the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex more effectively than the H9 #1 antibody even when treated with 5 nM, which is a much lower concentration than the H9 #1 antibody.
  • Example 15 Binding affinity analysis of TCR-like antibodies selected according to the present invention
  • 17 is a result of analyzing the binding affinity of the TCR-like antibodies according to the present invention to the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex.
  • the TCR-like antibody specific for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex binds specifically to the previously reported CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex. It has a significantly more mature affinity than TCR-like antibodies.
  • Such high affinity can be a great benefit to detect molecules whose expression level is significantly lower than that of other cell surface antigens, such as peptide/MHC complexes.
  • other cell surface antigens such as peptide/MHC complexes.
  • treatment at a high concentration was required, and thus non-specific binding was observed.
  • the cell surface CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex was detected even at a low concentration, and no nonspecific binding was observed even at a high concentration.
  • CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex can be detected even in cell lines with a relatively low expression level of MHC molecules, which could not be detected with existing antibodies, so it can be used in a wide variety of cell lines. high.
  • CMV P 495-503 / HLA-A * 02 in accordance with the present invention and specifically bind to the 01 complex red,: specific TCR- Antibodies similar to the 01 complex CMV P 495-503 / HLA-A * 02 even at a low concentration Since non-specific binding was not performed even at high concentrations, it is possible to prepare a pharmaceutical composition for effective diagnosis and treatment of diseases caused by CMV infection.
  • the TCR-like antibody specific for the CMV P 495-503/HLA-A*02:01 complex according to the present invention can be developed as an effective cell therapeutic agent as a recombinant T cell receptor.

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Abstract

본 발명은 MHC-I류 분자, 특히 HLA-A*02에 의해 제시된 CMV pp65 펩타이드 복합체(CMVP495-503/HLA-A*02:01)에 특이적이면서 향상된 친화도를 가지고 결합하는 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포, 이의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물, 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

CMV PP65 펩타이드/HLA-A*02 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체 및 이의 용도
본 발명은 MHC-I류 분자, 특히 HLA-A*02:01에 의해 제시된 CMV pp65 펩타이드 복합체(CMVP495-503/HLA-A*02:01)에 특이적이면서 향상된 친화도를 가지고 결합하는 TCR-유사 항체(T cell receptor-like antibody) 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포, 이의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물, 바람직하게는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 진단용 조성물에 관한 것이다.
주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility complex, MHC)는 척추 동물에서 외래 분자를 인식시키기 위한 세포 표면 단백질을 코딩하는 유전자 세트이며, 면역반응의 대상 물질을 T 세포(T cells) 항원(antigen)으로 인식시키는 항원제시분자 역할을 한다. MHC는 크게 I형 MHC(MHC class I molecules, MHC-I)와 II형 MHC(MHC class II molecules, MHC-II)의 두 종류로 나뉜다. 사람의 MHC-II의 경우 알파 사슬(alpha-chain, α-chain), 베타 사슬(beta-chain, β-chain)으로 구성된 이형중합체(heterodimer) 구조이다. 사람의 MHC-I의 경우, 사람 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)과 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin, β2m)의 이형중합체(heterodimer) 구조이다. 사람의 MHC-I 형은 HLA-A, HLA-B, HLA-C의 세가지 형의 유전자가 있고, 종양 세포를 포함하여 핵을 가진 모든 세포에서 발현된다. MHC-I 형이 제시하는 항원은 CD8+ T 세포와 반응한다. MHC-II 형은 HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR의 유전자가 있고, 단백질은 수지상 세포 (Dendritic cells, DCs), 대식세포 (Macrophage), B세포 (B cells)과 같은 항원 제시 세포(Antigen presenting cells, APCs)에 발현된다. MHC-II 형이 제시하는 항원은 CD4+ T 세포와 반응한다.
종양 및 바이러스-감염 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes, CTLs)에 대해 세포 표면 MHC-I 분자를 통해 펩타이드 항원(8-10개의 아미노산 잔기)을 제시할 수 있는데, 이를 펩타이드/MHC-I 복합체라 하며, MHC에 의해 제시되는 항원 유래 펩타이드를 T 세포 에피토프(T cell epitope) 라고 한다. CD8+ T 세포는 항원이 반드시 MHC-I에 결합된 펩타이드 형태, 즉 펩타이드/MHC-I 복합체에 제시되어야만 항원 에피토프 펩타이드를 인식할 수 있다. 이러한 T 세포의 항원인식을 MHC-restricted antigen recognition (MHC restriction)이라 한다. CD8+ 세포독성 T 세포는 펩타이드/MHC-I 복합체에 특이적인 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)를 통해 인식하고 결합하여 효과기 물질을 분비하여 표적 세포를 사멸시킨다. 악성 변환(malignant transformation) 되거나 바이러스에 감염된 세포는 MHC-I 분자를 통해 종양-관련 항원(tumor-associated antigens) 또는 바이러스 단백질 항원 유래의 펩타이드를 펩타이드/MHC-I 복합체로 제시한다. 따라서, 질환-특이적 펩타이드/MHC-I 복합체(disease-specific peptide/MHC complexes)는 면역요법의 접근법(immunotherapeutic approaches)의 표적이 될 수 있다.
T 세포 수용체는 펩타이드/MHC 복합체에 대해 고유의 특이성(specificity)은 있으나 낮은 내재적 친화성도를 가져 실제 이용이 어렵다. 이에 따라 펩타이드/MHC 복합체에 대해 고유의 특이성은 유지되고 친화도가 높은 항체를 개발하는데, 이를 TCR-유사 항체(TCR-like antibodies) 라고 한다. TCR-유사 항체는 종양 및 바이러스-감염 세포를 타겟으로 하고 이들의 특이적 사멸을 매개할 수 있는 새로운 종류의 면역치료제로서 개발되고 있다. 치료 목적 이외에, TCR-유사 항체는 암 및 감염 질환의 진단 시약으로도 개발되고 있으며, MHC-I 항원 제시를 가시화시켜줌으로써 MHC-I pathway 관한 연구 도구로서도 사용되고 있다.
MHC-I 항원 제시 분자는 알파 사슬(alpha chain 1, 2, 3) 및 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin, β2m)으로 이루어지며, 알파 사슬의 종류에 따른 HLA-A 2개, HLA-B 2개, HLA-C 2개로 총 6개의 서로 다른 항원 제시 분자가 생성된다. HLA-A 단백질 중 HLA-A*02 유형은 전세계 인구 중 약 25~30% 정도이며, 그 중에서 HLA-A*02:01 하위유형이 인종에 따라 30~90%까지 차지하기 때문에 가장 흔한 MHC-I 분자이다. (Lai, Choo et al. 2017)
인간 거대세포바이러스(Cytomegalovirus, CMV)는 beta-헤르페스 바이러스로, 사람, 원숭이, 설치동물을 감염시키며, 핵내봉입체(inclusion)를 가진 독특한 거대세포를 생성한다. CMV는 전세계적으로 70%의 사람이 감염되어 있다. CMV에 의한 1차 감염은 잠복한 형태로 평생 지속되며, 따라서 건강한 성인에서는 일반적으로 증상을 보이지 않는다. 그러나 면역 손상 기관 이식 수용자(immuno-compromised organ transplant recipients) 또는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 사람과 같이 면역력이 약한 사람의 경우 CMV 바이러스의 재활성화로 인해 생명을 위협하는 질환이 발생할 위험이 높다.
CMV에 대한 면역체계는 복잡하며 체액성 반응 및 세포성 반응이 동반된다. 연구에 따르면 자연 살해 세포 (Natural killer cells, NK cells) 및 CD8+ 세포독성 T 세포가 CMV 재발 예방에 중요한 역할을 한다고 보고되었다. CMV의 많은 유전자 산물이 CMV 감염에 대한 세포독성 T 세포 반응을 유도하지만, pp65 (Phosphoprotein 65) 단백질의 높은 발현 빈도는 pp65 단백질을 세포 독성 T-림프구 매개 면역 반응의 주요 표적으로 제안한다. pp65 단백질 펩타이드 중에서, HLA-A*02:01 양성 개체의 CMV 특이적 세포독성 T 세포 활성은 주로 pp65 단백질의 아미노산 잔기 서열 495-503번 유래 펩타이드 (CMVP495-503, 495-NLVPMVATV-503)에 의해 일어난다 (Chee, Bankier et al. 1990). 특히 건강한 CMV 감염자의 혈액 내에는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 특이적으로 인지하는 CD8+ T 세포의 빈도가 전체 CD8+ T 세포 중에서 0.5~11%까지 차지한다고 보고되어 있다 (Schmittnaegel, Levitsky et al. 2015)
기존에 개발된 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 항체인 H9 클론은 IgG 형태로 SPR(surface plasmon resonance)을 통해 친화도를 측정한 결과, 결합속도상수(association rate constant, k on)가 k on=6.5×104 1/Ms 및 해리속도상수 (dissociation rate constant, k off)가 k off=0.0207 1/s 로 결정 되었으며, 평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant, K D)가 K D = 300 nM 로 결정되었다 (Makler, Oved et al. 2010). 이러한 낮은 친화도는 다른 세포 표면 항원들에 비해 그 발현량이 현저히 낮은 펩타이드/MHC 복합체를 검출하기에는 어려움이 있다.
본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도가 향상된 TCR-유사 항체는 현저히 성숙된 친화도에 의해 기존 보고된 항체에서는 검출하지 못했던, HLA-A*02:01 분자의 발현량이 낮은 세포주에서도 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출해낼 수 있어 활용도가 높다.
이에 따라 본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙된 TCR유사 항체는 종양미세환경(tumor microenvironment)과 같이 MHC 발현 감소 또는 손실이 일어나 적은 양의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 제시하고 있는 환경에서도 효과적으로 검출할 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질의 아미노산 495-503번 유래 펩타이드 (CMVP495-503, 495-NLVPMVATV-503)가 MHC-I인 HLA-A*02:01에 제시된 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적이며, 친화도가 현저하게 개선된 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 개선된 TCR-유사 항체의 중쇄가변영역 (heavy chain variable domain, VH) 및 경쇄가변영역 (light chain variable domain, VL)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 개선된 TCR-유사 항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역에서 항원 결합 부위인 상보성 결정 영역 (Complementarity determining regions, CDRs)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 향상된 친화도 및 높은 특이성을 가진 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편 유래 일부 및 전체 아미노산 서열을 이용한 단백질, 재조합 단일 클론 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 향상된 친화도 및 높은 특이성을 가진 TCR-유사 항체 유래 일부 및 전체 아미노산 서열을 이용한 T 세포 수용체, 바람직하게는 CAR(Chimeric Antigen Receptor)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 향상된 친화도 및 높은 특이성을 가진 TCR-유사 항체 유래 일부 및 전체 아미노산 서열을 이용한 T 세포 수용체, CAR를 발현하는 변형된 T 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CMVP495-503/HLA-A*02 복합체에 대한 향상된 친화도를 가지는 TCR-유사 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질의 아미노산 잔기 서열 495-503번 유래 펩타이드 (CMVP495-503, 495-NLVPMVATV-503)의 MHC-I인 HLA-A*02 제시에 관한 연구를 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 거대세포바이러스(CMV) 감염된 암 또는 감염 질환의 진단용 조성물, 또는 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I의 복합체에 특이적으로 결합하는, TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질 중 495-503번 펩타이드 또는 480-503번 펩타이드일 수 있다.
상기 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I은 HLA-A*02:01일 수 있다.
본 발명의 일 양상은 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙된 TCR-유사 항체를 제공한다. 이러한 항체는 기존에 CMVP495-503/HLA-A*02:01 분자와 결합한다고 알려진 항체 단편보다도 높은 친화도로 결합할 수 있으며, 종양미세환경과 같이 MHC-I 발현 감소 또는 손실이 일어난 환경에서도 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I의 복합체를 검출할 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 효모 세포 표면 scFab (single chain Fab(antigen binding fragment)) 라이브러리를 디자인 및 구축하여, CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 기존에 알려진 항체보다 높은 친화도를 보이는 클론을 선별하여 분리, 동정하였으며, 선별된 클론의 가변영역 서열을 마우스 IgG2a에 삽입하여 완전한 IgG 형태의 항체를 구축 및 정제하였다.
본 발명의 다른 구체예에서는 완전한 IgG 형태의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체를 ELISA 및 Octet을 이용하여 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 성숙된 친화도를 정량적으로 분석하였다.
본 발명의 구체예에서는 완전한 IgG 형태의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체를 이용하여 CMVP495-503 펩타이드 펄싱을 수행한 세포 표면에서 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 정량적으로 분석하였으며, MHC 분자의 발현이 상대적으로 낮은 세포에서도 효과적으로 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하였다.
본 발명의 구체예에서는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체를 이용하여 세포질 침투 항체에 CMV pp65 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드(CMVP480-503)를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체(viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab)를 처리하였을 때, 세포 표면에서 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기와 같은 특성을 갖는 본 발명에 따른 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편은 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I의 복합체에 특이적으로 결합한다. 이 때, 상기 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드는 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질 중 495-503번 펩타이드 또는 480-503번 펩타이드이고, 상기 MHC-I은 HLA-A*02:01이다.
본 발명에 따른 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 13, 17 및 18로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 15 및 16으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3; 및 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6, 10 및 11로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 서열번호 8 및 9로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함한다.
구체적으로, 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 서열번호 8의 경쇄 CDR3; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 13의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3;
서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 서열번호 9의 경쇄 CDR3; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 13의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3;
서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 10의 경쇄 CDR2, 서열번호 9의 경쇄 CDR3; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3; 또는
서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 서열번호 9의 경쇄 CDR3; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 18의 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 TCR-유사 항체 (T cell receptor-like antibody) 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20 내지 23로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역 및/또는 서열번호 25 내지 28으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 서열번호 20의 경쇄 가변영역 및 서열번호 25의 중쇄 가변영역;
서열번호 21의 경쇄 가변영역 및 서열번호 26의 중쇄 가변영역;
서열번호 22의 경쇄 가변영역 및 서열번호 27의 중쇄 가변영역; 또는
서열번호 23의 경쇄 가변영역 및 서열번호 28의 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor)로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
도 1은 기존 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체인 H9 클론의 낮은 친화도 및 비특이적 결합 특징를 나타낸다.
도 1a는 H9 클론을 전장 IgG 항체의 형태로 발현하기 위한 발현 벡터를 도식화한 모식도이다. H9 클론의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL)을 마우스 이뮤노글로불린 2a (mIgG2a)의 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역 (kappa domain)에 도입하여 동물세포 (HEK293F)에서 발현하였다.
도 1b는 구축한 전장의 IgG 형태의 H9을 발현 정제하여 다양한 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량을 가지는 세포들에서 CMVP495-503 펩타이드 50μM 펄싱 후, H9 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
도 1c는 세포질 침투 항체에 CMV pp65 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드(CMVP480-503)를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체(viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab) inCT99-CMVP†480-503 및 inCT99-HPVE†1-19 를 MDA-MB-231 세포에 처리하여 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체의 형성을 유도한 후, H9 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
도 2는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙 라이브러리에 사용할 결합항원을 구축 및 확인한 결과이다.
도 2a는 CMV/HLA-A*02:01 Single chain trimer(SCT) 단백질의 모식도이다. CMVP495-503 펩타이드-β2m-HLA-A*02:01 복합체가 펩타이드 링커를 통해 Single chain trimer(SCT) 형태로 구성되었다.
도 2b는 SCT 단백질들을 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 바이오틴화 하여 3㎍의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태를 분석한 결과이다.
도 2c는 Gel shift 분석법을 이용하여 정제한 펩타이드/HLA-A*02:01 SCT 단백질이 모두 Avi-tag에 바이오틴화가 이루어짐을 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다.
도 2d는 정제된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질의 HLA-A2의 구조를 인지하는 항체(BB7.2)와의 결합능과 기존의 TCR-유사 항체인 H9 항체와 결합할 수 있는지 ELISA로 분석한 결과이다.
도 3은 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙시키기 위한 효모세포표면 H9 scFab CDR3 라이브러리 구축 전략에 대한 모식도이다.
도 3a는 기존에 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 결합한다고 알려져 있는 H9 클론의 서열을 기반으로 중쇄가변영역(VH)의 CDR3 부분과 경쇄가변영역(VL)의 CDR3 부분에 degenerate codon을 넣어 라이브러리를 구축하였다.
도 3b는 구축된 H9 scFab CDR3 라이브러리의 도식으로, 효모 세포 표면에 Aga1p-Aga2p에 융합되어 단일사슬 Fab(scFab)(single chain Fab(antigen binding fragment)) 형태로 발현되었다.
도 4은 구축된 라이브러리에서 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 결합항원으로 MACS 및 FACS를 수행하여 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 결합한 pool을 분석한 FACS 분석결과이다. 이는 단일 사슬 Fab(scFab)의 발현 정도와 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합능을 분석할 수 있으며, 효모 세포 표면 단일 사슬 Fab(scFab) 발현량을 비교하였고, MACS 및 FACS를 거듭할수록 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 결합하며, 단일 사슬 Fab(scFab)의 발현이 잘되는 클론 수의 비중이 증가하는 것을 나타낸다.
도5는 선별된 단일 클론들의 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합을 FACS로 동정한 결과이다.
도 5a는 총 50개의 단일클론들을 H9 scFab과 비교 분석한 결과이다. 각 클론들의 2nM 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 FACS에서 나타난 형광 세기 중앙값(Median fluorescence intensity)으로 동정하였으며, 그 중에서 상위 형광 세기 중앙값을 나타낸 클론들을 선별하였다.
도 5b는 상기 도 5a에서 선정된 클론들의 2nM 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합과 효모 세포 표면 scFab 발현 정도를 FACS 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 수렴된 클론 #1 및 #38의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL) 서열을 마우스 이뮤노글로불린 2a(mIgG2a)의 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역(kappa domain)에 도입하여 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후 분석한 결과이다. 3㎍의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태를 분석하였다.
도 7은 동물세포에서 발현 정제된 IgG 형태의 #1 및 #38 클론의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
도 8은 다양한 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량을 가지는 세포들에서 CMVP495-503 펩타이드 50μM 펄싱 후, H9 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1, H9 #38 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
도 9는 세포질 침투 항체에 CMV pp65 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드(CMVP480-503)를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체(viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab) inCT99-CMVp†480-503 및 inCT99-HPVE†1-19 를 MDA-MB-231 세포에 처리하여 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체의 형성을 유도한 후, H9 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1, H9 #38 항체를 이용하여 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 유세포분석기 (flow cytometry)로 검출한 실험 결과이다.
도 10은 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙시키기 위한 효모세포표면 H9 #1 scFab CDR2 라이브러리 구축 전략에 대한 모식도이다.
도 10a는 상기 H9 scFab CDR3 라이브러리로부터 도출한 H9 #1 클론의 서열을 기반으로 중쇄가변영역의 CDR2 부분과 경쇄가변영역의 CDR2 부분에 degenerate codon을 넣어 라이브러리를 구축하였다.
도 10b는 구축된 H9 #1 scFab CDR2 라이브러리의 도식으로, 효모 세포 표면에 Aga1p-Aga2p에 융합되어 단일사슬 Fab(scFab) 형태로 발현되었다.
도 11은 구축된 라이브러리에서 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 결합항원으로 FACS를 수행하여 스크리닝한 결과이다.
도12는 선별된 단일 클론들의 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합을 FACS로 동정한 결과이다.
도 12a는 총 50개의 단일클론들을 H9 #1 scFab과 비교 분석한 결과이다. 각 클론들의 0.5 nM 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 FACS에서 나타난 형광 세기 평균값(Mean fluorescence intensity)으로 동정하였으며, 그 중에서 상위 형광 세기 중앙값을 나타낸 클론들을 선별하였다.
도 12b는 상기 도 12a에서 선정된 클론들의 0.5nM 바이오틴화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합과 효모 세포 표면 scFab 발현 정도를 FACS 분석한 결과를 나타낸다.
도 13은 수렴된 클론 H9 #1-17 및 H9 #1-30의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL) 서열을 마우스 이뮤노글로불린 2a(mIgG2a)의 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역(kappa domain)에 도입하여 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후 분석한 결과이다. 3μg의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태를 분석하였다.
도 14는 동물세포에서 발현 정제된 IgG 형태의 H9 #1, H9 #1-17 및 H9 #1-30 클론의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
도 15는 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01)을 발현하는 MDA-MB-231 세포주에서 CMVP495-503 펩타이드 4μM 펄싱 후, H9 #1 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1-17, H9 #1-30 항체의 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
도 16은 inCT99-CMVp†480-503 및 inCT99-HPVE†1-19 융합 항체를 MDA-MB-231 세포에 처리하여 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체의 형성을 유도한 후, H9 #1 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1-17, H9 #1-30 항체를 이용하여 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 유세포분석기 (flow cytometry)로 검출한 실험 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 TCR-유사 항체들의 친화도를 Octet으로 결정한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I의 복합체에 특이적으로 결합하는, TCR-유사 항체 (T cell receptor-like antibody) 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
상기 바이러스 유래 펩타이드는 바람직하게는 표 1에 기재된 서열을 가질 수 있다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000001
본 발명의 목적은 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질의 아미노산 서열 495-503번 유래 펩타이드 (CMVP495-503, 495-NLVPMVATV-503)가 MHC-I인 HLA-A*02:01에 제시된 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적이며, 친화도가 개선된 TCR-유사 항체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 완전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다.
본 발명에서 "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 경쇄 및 중쇄 내의 가변 영역은 일반적으로 항원 결합에 주요하게 관여한다고 알려진 상보성 결정 영역 (Complementarity determining region, CDR)을 포함한다. 각 가변 영역은 전형적으로 3개의 고도 가변성 루프를 함유한다 (VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 경쇄 (LC) CDR, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 포함하는 중쇄 (HC) CDR). 본 발명에서 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat)의 규정에 의해 정의 또는 확인될 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체의 항원-결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab (Antigen binding fragment, Fab)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 단일사슬 항원-결합 절편(Single chain antigen binding fragment, scFab)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역, 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이다. 경우에 따라서, 시스테인 잔기의 삽입에 의해 안정화될 수 있다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv (Variable fragment, Fv) 는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(two-chain variable fragment)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단일 사슬 Fv(single-chain variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중 사슬 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 항체의 단편은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 각각의 도메인 또는 이의 단편을 의미하며, 예를 들면, 중쇄가변영역 절편(VH), 항체의 중쇄불변영역 절편(Fc), 중쇄불변영역 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3) 절편, 항원-결합 절편(antigen binding fragment, Fab), 단일사슬항체 절편(single chain variable fragment, scFv), 경쇄불변영역 절편(CL) 또는 경쇄가변영역 절편(VL) 또는 이들의 단편일 수 있다.
또한, 상기 항체의 단편은 단량체(monomer), 이량체(dimer) 또는 다량체일 수 있다.
상기 항체는 단일클론 항체, 비특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄(side chain)로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
상기 단일클론 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다. 또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다.
본 발명에 있어, TCR-유사 항체는 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 13의 중쇄 CDR2, 서열번호 15 및 16으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3. 및 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 서열번호 8 및 9로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하며,
서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 17 내지 18 로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 16의 중쇄 CDR3 및 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 10 및 11로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함한다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000002
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명에 있어, TCR-유사 항체는 서열번호 20 내지 23으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 서열번호 25 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000003
Figure PCTKR2020017067-appb-T000004
본 발명에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 포함한 이종 분자 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 결정하게 해주는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 표적과 항체 또는 항체 단편 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 다른 표적에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간 동안 상기 표적에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
본 발명에 따른 서열은 본 명세서에 기재된 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
“작동적으로 연결”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexa-histidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor)로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
CAR는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호화 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 세포외 도메인은 링커에 의해 막관통 도메인에 연결될 수 있다. 세포외 도메인은 또한 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
CAR는 T-세포 신호화 분자의 세포질 도메인에 경첩 및 막관통 영역을 통해 커플링되는 종양 연계 항원 (TAA)에 특이적인 항체의 단쇄 단편 가변부 (scFv)를 포함한다. 대부분의 통상적인 림프구 활성화 모이어티는 T-세포 촉발 (예를 들어 CD3ζ) 모이어티를 갖는 탠덤 (tandem)에서 T-세포 공자극 (예를 들어 CD28, CD137, OX40, ICOS, 및 CD27) 도메인을 포함한다. CAR-매개 입양 면역요법은 CAR-이식된 세포가 비-HLA-제한 방식으로 표적 종양 세포 상의 TAA를 직접 인식하게 한다.
본 발명은 상기 CAR를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 상기 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
예를 들어, (a) 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 또는 감염 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 흑색종, 폐암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장암, 위암, 유방암, 전이암, 호지킨 림프종, 전립선암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 암 또는 감염 질환이나 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 암 또는 감염 질환의 치료 또는 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 암 또는 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 또는 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
“투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 또는 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 의사에 의해 결정될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 샘플에 처리하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체 H9의 검증
도 1a는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 특이적으로 인지하는 TCR-유사 항체 H9 클론의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL)을 마우스 이뮤노글로불린 2a(mIgG2a)의 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역(kappa domain)에 도입하여 동물세포 (HEK293F)에서 발현하기 위한 벡터의 모식도이다.
구체적으로, CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 특이적으로 인지하는 TCR-유사 항체 H9 클론의 인간 중쇄가변영역(VH)과 인간 경쇄가변영역(VL)의 서열을 유전자 합성(Bioneer, Korea)을 통해 준비하였다. VH 유전자를 중쇄불변영역이 마우스 이뮤노글로불린G 2a인 중쇄에 PCR 기법을 통하여 DNA 절편을 제작하고 NotI과 HindIII 제한효소를 이용하여 동물세포 발현 벡터 pcDNA3.4에 NotI과 HindIII 제한효소로 클로닝하였으며, VL 유전자를 경쇄불변영역이 마우스 카파 불변영역인 경쇄에 상기와 동일한 방법으로 클로닝하여, 키메릭(Chimeric) 항체를 구축하였다.
도 1b는 구축한 키메릭 H9 항체를 발현 정제하여 다양한 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량을 가지는 세포들에서 CMVP495-503 펩타이드 50 μM 펄싱 후, H9 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
구체적으로, Malme-3M, MDA-MB-231, HCT116 세포를 3.0×105 세포/ml의 밀도로 10% FBS와 1% ABAM 항생제가 포함된 RPMI 배지에 준비하고 CMVP495-503 펩타이드를 포함하여 HLA-A*02:01와 복합체를 형성할 수 있는 다른 바이러스 유래 합성 펩타이드인 HPV16 E7 단백질의 아미노산 서열 11-19번 유래 펩타이드 (HPVE11-19, 11-YMLDLQPET-19)를 50 μM의 농도가 되도록 넣어 5% CO2, 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 주었다. 펩타이드를 처리하지 않은 음성 대조군은 DMSO를 넣어주었다. 3시간 뒤에 1300 rpm에서 3분동안 원심분리하여 세포에 결합되지 않은 펩타이드가 포함된 상층액을 제거하고, FACS 완충액(1% FBS가 포함된 PBS)으로 세척 후 1300 rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 각 샘플 당 1.5×105 개의 세포가 되도록 준비하고 발현 및 정제하여 얻은 H9 항체를 100μl의 FACS 완충액에 500nM의 농도가 되도록 희석하여 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, CMVP495-503 펩타이드를 펄싱한 MDA-MB-231 세포에만 특이적 결합을 보였고 이외의 펩타이드/MHC 복합체에는 결합하지 않았다. 하지만 Malme-3M 세포 또는 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량이 낮은 HCT116 세포에서는 H9 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적 결합이 관찰되지 않았다.
도 1c는 세포질 침투 항체에 CMV pp65 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드(CMVP480-503)를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체(viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab) inCT99-CMVP†480-503 및 inCT99-HPVE†1-19를 MDA-MB-231 세포에 처리하여 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체의 형성을 유도한 후, H9 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
본 실시예에서 사용된 세포질 침투 항체에 바이러스 항원 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체(viral antigen-derived T cell epitope peptide-fused cytotransmab)의 정보는 하기 표 5에 나타나있다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000005
구체적으로, 24 웰 플레이트에 MDA-MB-231 세포주를 웰 당 1.8×105 세포/ml의 밀도로 10% FBS와 1% ABAM 항생제가 포함된 RPMI 배지에 희석하여 12시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 배지를 제거하고 inCT99, inCT99-CMVP†480-503, inCT99-HPVE†1-19 융합 항체를 4μM의 농도가 되도록 1ml의 배지에 희석하여 18 시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양해주었다. 이 후 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 후, 웰 당 100μl의 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA) 용액을 2분간 37℃에서 처리해 주어 세포를 플레이트로부터 떼어냈다. 웰 당 10% FBS가 포함된 RPMI 배지를 1 ml씩 넣어주어 트립신-EDTA를 중화시키고 세포를 회수하여 1300rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 세포를 FACS 완충액 1ml로 세척해주고 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 웰 당 세포 펠렛을 FACS 완충액 200μl로 풀어주고 2개의 샘플로 나누어 하나의 샘플은 2차 항체 단독 대조군으로 사용하였다. 각 샘플에 H9 항체를 100μl에서 1μM의 농도가 되도록 FACS 완충액에 희석하여 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2항체를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, inCT99-CMVP†480-503 뿐만 아니라 inCT99와 inCT99-HPVE†1-19를 처리한 실험군에서도 H9 항체의 비특이적인 결합이 관찰되었다.
실시예 2: CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 단백질의 준비 및 검증
기존에 보고되어 있는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적으로 결합하는 항체인 H9 클론은 SPR(surface plasmon resonance)로 친화도를 측정한 결과, 약 300 nM의 낮은 친화도를 가지고 있다. 이에 따라 H9 항체를 처리했을 때 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량이 낮은 HCT116 세포에서는 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출할 수 없었고, 세포질 침투 항체에 CMV pp65 유래 T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드(CMVP480-503)를 융합시킨 바이러스 에피토프 융합항체를 암세포에 처리한 후 암세포 내에서 가공되어 제시된 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 검출하고자 하였을 땐 검출할 수 있는 농도에서 다른 실험군들에서도 비특이적인 결합이 관찰되었기 때문에 H9 항체의 VH 및 VL의 CDR3 서열에 라이브러리를 주어 친화도를 향상시키기 위한 전략을 선택하였다. 이를 위하여 효모세포 표면에 라이브러리를 제시하여 친화도가 향상된 항체를 스크리닝하기 위하여 사용할 항원을 준비하였다.
기존에 TCR-유사 항체를 제작하기 위하여 마우스에 면역을 진행할 항원을 준비할 때, E.coli에서 각각 HLA-A*02:01를 이루는 alpha 1, 2 및 3 chain 단백질과 β2m 단백질을 발현시켜 inclusion body로 형성시키며, 합성 펩타이드를 넣어주면서 refolding을 통해 trimer 복합체를 만드는 방법을 사용한다. 하지만 동물세포 발현 시스템을 통해 펩타이드/β2m/HLA-A*02:01를 펩타이드 링커를 통하여 단일클론항체의 중쇄 가변 영역 N-말단에 연결시켜서 단백질을 생산한 사례가 있기 때문에(Truscott, Lybarger et al. 2007), 이를 참고하여 단백질 발현 벡터를 구축하고자 하였다.
도 2a는 CMVP495-503 펩타이드/β2m/HLA-A*02:01을 펩타이드 링커를 통해 Single chain trimer(SCT) 형태로 만든 단백질의 모식도이다.
구체적으로, 5’ 말단에 분비 시그널 펩타이드와 CMVP495-503 펩타이드를 코딩하는 DNA와 β2m 사이를 GCGGS-(G4S)2 펩타이드 링커를 통하여 연결시켰으며, β2m과 HLA-A*02:01 세포외 도메인 α1(Y108C)-α2-α3(25~298번 잔기)의 경우에는 (G4S)4 펩타이드 링커로 연결시켰다. HLA-A*02:01 C-말단에는 Avi-tag및 8X His-tag을 GS 펩타이드 링커를 이용하여 융합된 형태의 DNA를 PCR 기법으로 구축하여 동물세포 발현 벡터 pcDNA3.4에 NotI과 HindIII 제한효소로 클로닝하였다. 단일 사슬로 연결된 CMVP495-503 펩타이드가 HLA 펩타이드 결합 부위에 안정적인 결합을 유지시키기 위해 HLA-A*02:01 α1 도메인에 108번째 Tyr을 Cys으로 치환시켜 GCGGS-(G4S)2 펩타이드 링커의 Cys와 이황화결합을 이루도록 하였다. CMVP495-503 펩타이드를 HPVE11-19 펩타이드로 교체한 단백질도 상기와 동일한 방법으로 구축하였다.
도 2b는 SCT 단백질들을 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 바이오티닐화 하여 3㎍의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다.
구체적으로, 진탕 플라스크에 100mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0×106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120rpm, 8% CO2, 37℃에서 배양하였다. 단백질을 생산하기 위해 CMVP495-503/β2m/HLA-A*02:01-Avi-8X His 플라스미드를 5ml FreeStyle 293 발현 배지에 125μg (1.25μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 375μg (3.75μg/ml)을 희석한 5ml의 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90ml로 파종한 세포에 넣어 120rpm, 8% CO2 배양기에서 6일동안 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 His-tag이 융합된 단백질을 특이적으로 정제하는 Ni-NTA 수지를 사용하여 단백질을 정제하였다. 세포 배양 상등액 100ml을 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10mM Imidazole pH8.0 버퍼를 사용하여 1 대 1로 섞어준 뒤, Ni-NTA수지를 1ml 넣어 1시간 동안 4℃에서 로테이션 시켜주었다. Ni-NTA수지를 세척하기 위해 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10mM Imidazole pH8.0 버퍼 50ml로 세척한 뒤, 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 30mM Imidazole pH8.0 버퍼 50ml로 세척해주었다. 용출 버퍼인 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 200mM Imidazole pH8.0을 이용하여 단백질을 용출하였다. 용리한 분획을 모아 PD-10 탈염 컬럼(GE healthcare)을 통해 DPBS 완충액으로 교환하며 30K 원심 분리 필터 튜브(Corning)를 이용하여 농축을 진행했다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였으며 100ml 부피로 트팬스펙션 시 약 9mg의 수율을 나타냈다.
정제된 단백질을 바이오틴화하기 위해 항원의 Avi-Tag 부분에 birA enzyme kit를 이용하였다. 구체적으로, DPBS 버퍼 상에 있는 1.8mg의 단백질을 준비하여 10mM Tris-HCl, pH8.0 반응 버퍼로 PD-10 탈염 컬럼을 이용하여 교체해주었다. 효소 반응을 최적화시키기 위하여 항체의 농도를 40μM 이상의 농도로 원심 분리 필터 튜브를 이용하여 농축시켰다. Kit에서 제공하는 10X 시약을 단백질에 섞어주어 최종 농도가 50mM Bicine, 50μM d-Biotin, 10mM MgOAc, 10mM ATP가 되도록 하며, 항체의 농도는 40μM가 되도록 하였다. 이 때 BirA 효소는 단백질 기질 10nmol 당 2.5μg씩 사용하였으며, 30℃ 항온 수조에서 40분간 반응시켰다. 반응시킨 후에 단백질의 버퍼를 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 DPBS로 교체해주었다. 단백질은 BCA protein assay를 통해 정량 하였으며, 1.8mg의 단백질을 사용한 반응 후의 수율은 약 1.7mg였다.
도 2c는 Gel shift 분석법을 이용하여 정제한 SCT 단백질이 모두 Avi-tag에 바이오티닐화가 이루어짐을 비환원성 조건의 SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다.
구체적으로, 3μg의 단백질을 준비하여 몰 수의 4배의 SA을 DPBS 버퍼 상에 희석해주었으며, 상온에서 30분 동안 반응시켜 복합체를 형성하도록 하였다. 약 49.7 kDa인 단백질에 약 52.8 kDa의 SA이 복합체를 이루었을 때, 사이즈가 shift되어 SDS-PAGE 상에서 100 kDa에 위치함을 확인할 수 있었다. 모든 단백질이 SA와 복합체를 이루어 반응시킨 단백질의 100% 가까이 바이오티닐화 되었음을 관찰하였다.
도 2d는 정제된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질의 항-HLA-A2 항체와의 결합능과 TCR-유사 항체인 H9과 특이적으로 결합할 수 있는지 ELISA로 분석한 결과이다.
상기 방법을 통해 준비된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질이 항-HLA-A2 항체와 결합능이 있는지, TCR-유사 항체인 H9과 특이적인 결합능을 보이는지 ELISA를 실시하였다. 구체적으로, EIA/RIA 플레이트(COSTAR Corning)에 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질, HPV/HLA-A*02:01 SCT 단백질 및 IL(interleukin)-4 Receptor alpha 단백질은 10μg/ml 농도로, CMVP495-503 펩타이드 및 HPVE11-19 펩타이드는 1μg/ml 농도가 되도록 PBS pH7.4 버퍼에서 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후 0.05% PBST(PBS pH 7.4, 0.05% Tween20) 로 10분간 3회 세척하였다. 이후 Blocking 버퍼(PBS pH 7.4, 2% Bovine Serum Albumin(BSA))로 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 이후 H9-Avi 항체를 Blocking 버퍼에 희석하여 500nM, 100nM, 10nM, 1nM 및 항-HLA-A2항체를 2μg/ml로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.05% PBST 버퍼로 10분간 3회 세척하였다. 표지항체로 HRP 가 접합된 항-마우스 Fc 항체(HRP-conjugated anti-mouse Fc)를 1:4000으로 Blocking 버퍼에 희석하여 결합시켰다. TMB ELISA solution으로 반응시킨 뒤, H2SO4로 반응을 완료하고 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실험을 통하여 정제된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질의 구조가 제대로 형성되어 있음을 HLA-A2의 구조를 인지하는 항-HLA-A2 항체(BB7.2)의 결합과 H9 항체의 농도 의존적인 결합능을 통하여 확인할 수 있었다.
실시예 3: CMV/HLA-A*02:01에 대한 친화도 향상을 위한 효모 H9 단일사슬 Fab(scFab) CDR3 라이브러리 디자인 및 구축
T 세포 수용체는 α-폴리펩타이드 사슬과 β-폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. 각각의 사슬은 가변 영역 (V region)과 연결 영역 (J region), 그리고 불변 영역 (C region)이라고 불리는 유전자를 가지고, β-사슬의 경우 다양성 영역 (D region)을 추가로 가진다. α-사슬과 β-사슬의 가변 영역(V region)에는 상보성 결정 영역 (Complementarity determining regions, CDR) 이라고 불리는 3개의 과가변 영역(hypervariable regions)이 존재한다. 일반적으로 이 중 CDR3 영역이 가장 다양성이 높으며, 항원을 특이적으로 인지할 때 가장 주요한 역할을 한다 (Rubtsova, Scott-Browne et al. 2009). 이에 따라 본 발명에서는, H9 클론의 중쇄가변영역(VH)의 CDR3 (VH-CDR3) 및 경쇄가변영역(VL)의 CDR3 (VL-CDR3) 영역에 라이브러리를 줌으로써, 기존의 H9 클론보다 항원과 더 성숙된 친화도를 가지는 클론을 단리하고자 하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 도 3b에 나타낸 바와 같이 H9 항체의 항원-결합 절편(antigen binding fragment, Fab) 링커로 연결한 단일사슬 항원-결합 절편(single chain fragment antigen binding, scFab) 형태로 클로닝한 후, 중쇄가변영역(VH) (VH-CDR3) 및 경쇄가변영역(VL)의 CDR3 (VL-CDR3) 서열을 주형으로 정방형 시발자에 동의 코돈(degenerate codon)을 주어 라이브러리를 제작하였다. 최대한 다양한 클론을 얻고자 중쇄가변영역 CDR3 영역의 C-말단에서 3개 잔기가 해당되는 부분을 제외한 모든 NNK 코돈으로 라이브러리를 주었다. 대부분의 항체 CDR3 영역의 C-말단 2개 잔기에는 각각 아스파라긴산, 티로신으로 서열이 보존되어 있어 이 영역은 제외하였다. 또한 C-말단에서 3번째 잔기에 대부분의 항체 서열에서 자주 나타나는 페닐알라닌, 메티오닌이 위치할 수 있도록, 페닐알라닌, 아이소류신, 메티오닌, 류신으로 구성된 동의 코돈인 WTK를 선택하였다. 경쇄가변영역 CDR3도 이와 마찬가지로 대부분의 인간 항체에서 보존되어 있는 아미노산들을 고려하여 동의 코돈을 구성하였다.
또한, 항체 중쇄불변부위(Fc) 절편의 CH1 부분에 역방향 시발자를 합성하였다. 이 정방향 시발자와 역방향 시발자에는 효모세포에서 상동성 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 50 염기쌍 이상의 벡터의 서열과 동일한 부분을 포함한다.
라이브러리 DNA는 DNA중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 준비되었다. 효모 세포 표면에 scFab을 발현할 수 있는 pYDS 벡터(Baek and Kim 2014)에 H9 클론의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역 서열을 삽입한 pYDS-H9 scFab 벡터를 주형으로 하여 상기 정방향 및 역방향 시발자를 이용하여 DNA를 증폭하였으며, 증폭된 DNA(총 120㎍, 12㎍/1회 형질전환)는 pYDS 벡터를 NheI과 ApaI 제한효소를 처리하여 준비한 벡터 DNA(총 40㎍, 4㎍/1회 형질전환)와 함께 효모에 전기천공법(electroporation)을 10번 반복해 라이브러리를 구축하였다. 뒤이어 상동성 접합(Homologous recombination)을 통하여 효모세포 내에서 라이브러리와 벡터를 결합하였다. 라이브러리의 크기는 계단식 희석한 후, 벡터에 존재하는 선별인자에 따른 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정해 1.5X107임을 확인하였다.
실시예 4: 구축된 효모 H9 scFab VH-/VL-CDR3 라이브러리에서 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 친화도 성숙된 클론의 선별
도 4는 구축한 효모 H9 CDR3 scFab 라이브러리에서 상기 실시예 2에서 구축한 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 특이적으로 결합하는 클론을 선별한 과정을 나타낸다. 구체적으로, 상기 실시예 2와 같이 준비한 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 이용하여 1회의 MACS(magnetic activated cell sorting) 및 2회의 FACS(Fluorescence activated cell sorting)를 수행하였다. 바이오틴화 된 2μM의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 효모세포표면에 발현된 H9 scFab VH-/VL-CDR3 라이브러리와 25℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후 이를 MACS 버퍼를 통해 1회 워싱한 후, Streptavidin-Microbead(Miltenyi Biotec Inc., Germany)와 4℃에서 10분간 반응시킴으로써 효모세포표면 scFab 라이브러리와 결합한 바이오틴화된 CMV pp65/MHC 복합체에 자성을 부여하였다. 이후 1차 MACS를 실시하여 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질과 결합할 수 있는 효모세포표면 scFab 라이브러리 클론을 선별하였다.
선별된 클론들은 FACS를 통해 c-myc tag을 인지하는 마우스 항체 9e10 클론과 Alexa488이 접합된 마우스 Fc를 인지하는 항체를 통해 효모세포표면 발현량을 확인하고, PE가 접합된 streptavidin (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Thermo)을 이용하여 바이오티닐화된 항원 결합력을 확인하여, 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질의 농도를 낮춰가면서 scFab의 발현량이 높고 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질와 결합력이 높은 클론을 선별하였다. 이 같은 과정을 2회 반복하였다.
도 5는 상기 라이브러리로부터 단리된 개별 클론 총 50개를 2nM의 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질과 결합시킨 후 FACS 분석한 결과이다. scFab 발현량이 우수하며 항원 결합 세기가 높은 #14, #22, #32, #38, #43 클론 및 그래프의 양상이 나머지 49개 클론과 다소 달랐던 #1 클론을 선별하여 서열 분석하였을 때, #38 클론을 제외한 모든 클론이 #1과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 scFab을 발현하고 있었다.
하기 표 6은 수렴된 두 클론의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역의 CDR 아미노산 서열을 나타낸다. H9 클론의 서열과 비교하여 바뀐 아미노산 서열을 굵은 글자로 표시하였다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000006
실시예 5: CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 친화도 성숙된 scFab 클론들의 IgG 전환 및 동정
상기 선별된 H9 #1, H9 #38 클론의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL) 서열을 마우스 이뮤노글로불린 2a(mIgG2a)의 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역(kappa domain)을 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다.
도 6은 TCR-유사 항체인 H9의 친화도를 향상시킨 H9 #1과 H9 #38 항체를 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 3㎍의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다. H9, H9 #1, H9 #38의 수율은 HEK293F 동물세포 배양액 1L당 각각 27.8mg, 20.4mg, 8.51mg의 수율을 보였다.
실시예 6: 선별된 TCR-유사 항체들의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합능의 평가
도 7은 동물세포에서 발현 정제된 IgG 형태의 H9 #1 및 H9 #38 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
구체적으로, EIA/RIA 플레이트에 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 10μg/ml 농도가 되도록 PBS pH7.4 버퍼에서 1시간동안 상온에서 코팅한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 이후 Blocking 버퍼로 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. H9, H9 #1, H9 #38 항체를 Blocking 버퍼에 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.05% PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 표지항체로 HRP 가 접합된 항-마우스 Fc 항체(HRP-conjugated anti-mouse Fc)를 1:4000으로 Blocking 버퍼에 희석하여 결합시켰다. TMB ELISA solution으로 반응시킨 뒤, H2SO4로 반응을 완료하고 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질 농도 의존적인 ELISA를 수행결과, IgG 형태의 H9과 비교하여, IgG 형태의 H9 #1 및 H9 #38 클론은 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 현저히 높은 친화도를 가지고 결합할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 선별된 TCR-유사 항체들의 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 결합능 평가
도 8은 다양한 세포 표면 MHC-I (HLA-A*02:01) 발현량을 가지는 세포들에서 CMVP495-503 펩타이드 50μM 펄싱 후, H9 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1, H9 #38 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다.
구체적으로, Malme-3M 흑색종 세포주, MDA-MB-231 유방암 세포주 및 HCT116 대장암 세포주에 펩타이드 펄싱을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다. 펄싱이 끝난 후 세포를 FACS 완충액으로 세척 후 1300 rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 샘플 당 1.5×105 개의 세포가 되도록 준비하고 100μl의 FACS 완충액에 H9의 농도가 500nM이 되도록 하고, H9#1 및 H9#38 클론의 농도가 5nM이 되도록 희석하여 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2항체를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, 모든 세포주에서 펩타이드를 처리하지 않은 실험군에 비해 HPVE11-19 펩타이드를 처리한 실험군에서는 T세포 수용체 유사 항체들의 결합을 보이지 않았으며, CMVP495-503 펩타이드를 처리한 실험군에서만 특이적 결합을 보여 TCR 유사 항체들의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 특이성을 확인할 수 있었다. 또한 친화도 성숙된 H9 #1, H9 #38 항체는 H9 항체에 비하여 100배 낮은 농도로 반응시켰음에도 더 많은 양의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출할 수 있음을 통해 친화도가 향상되었음을 확인하였다. 특히 실시예 1에서 H9 항체에서는 검출할 수 없었던 Malme-3M, HCT116 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 효과적으로 검출하는 것을 확인하였으며, HLA-A2의 세포 표면 발현량에 비례한 복합체의 형성을 세포주 3가지에서 비교할 수 있었다.
실시예 8: 선별된 TCR-유사 항체를 이용한 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 검출
MDA-MB-231 세포주에 inCT99-CMVP†480-503 융합 항체를 처리하였을 때 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 형성을 유도할 수 있는지 H9의 친화도를 향상시킨 H9 #1 과 H9 #38 항체를 이용하여 유세포분석기로 분석한 실험 결과이다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 MDA-MB-231 세포주를 웰 당 1.8×105 세포/ml의 밀도로 10% FBS와 1% ABAM 항생제가 포함된 RPMI 배지에 희석하여 12시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 배지를 제거하고 inCT99, inCT99-CMVP†480-503, inCT99-HPVE†1-19 융합 항체를 4μM의 농도가 되도록 1ml의 배지에 희석하여 18시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양해주었다. 이 후 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 후, 웰 당 50μl의 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA) 용액을 2분간 37℃에서 처리해 세포를 플레이트로부터 떼어냈다. 웰 당 10% FBS가 포함된 RPMI 배지를 1ml씩 넣어주어 트립신-EDTA를 중화시키고 세포를 회수하여 1300rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 세포를 FACS 완충액 1ml로 세척해주고 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 웰 당 세포 펠렛을 FACS 완충액 200μl로 풀어주고 2개의 샘플로 나누어 하나의 샘플은 2차 항체 단독 대조군으로 사용하였다. 각 샘플에 100μl의 FACS 완충액에 H9, H9 #1, H9 #38의 농도가 50nM, 250nM이 되도록 하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2항체를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, H9 항체는 CMVP495-503 펩타이드/HLA-A*02:01 복합체를 검출하지 못하였지만 친화도가 향상된 H9 #1과 H9 #38 클론은 250nM 농도로 반응 시켰을 때 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하였다. 하지만 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체의 발현량이 굉장히 적기 때문에 검출 세기가 너무 약하였고, 이에 추가적인 친화도 향상이 필요하다고 판단하였다.
실시예 9: CMV/HLA-A*02:01에 대한 친화도 향상을 위한 효모 H9 #1 단일사슬 Fab(scFab) VH-/VL-CDR2 라이브러리 디자인 및 구축
실시예 7에서 세포표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대해 더 우수한 결합력을 보인 H9 #1 클론보다 CMVP495-503 펩타이드/HLA-A*02:01 복합체에 대해 현저히 높은 친화도를 가지는 클론을 단리하고자 H9 #1을 주형으로 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 CDR2 서열에 동의 코돈(degenerate codon)을 주어 라이브러리를 제작하였다. 실시예 3과 마찬가지로, 최대한 다양한 클론을 얻고자 대부분을 NNK 동의코돈으로 구성하되, IMGT 데이터베이스를 참고하여 대부분의 인간 항체에서 보존되어 있는 아미노산들을 고려하여 동의 코돈을 구성하였다. 경쇄가변영역 CDR2 영역에서는 N-말단으로부터 1, 2, 7, 8번째 아미노산을 각각 RBM, ATC, KRT, RNT 동의코돈을 구성하였으며, 11, 12번째 아미노산은 각각 티로신과 알라닌으로 보존하였다. 경쇄가변영역 CDR2도 이와 마찬가지로 대부분을 NNK 동의코돈으로 구성하였으며, N-말단에서 2, 3번째 아미노산은 알라닌과 서린으로 보존하였고, 4번째 아미노산은 서린 또는 티로신으로 코딩될 수 있는 WCT 동의코돈으로 구성하였다. 이외 자세한 실험 방법은 실시예 3과 동일하게 수행하였다.
라이브러리의 크기는 계단식 희석한 후, 벡터에 존재하는 선별인자에 따른 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정해 1.3X107임을 확인하였다.
실시예 10: 구축된 효모 H9 #1 scFab VH-/VL-CDR2 라이브러리에서 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 친화도 성숙된 클론의 선별
도 11은 구축한 효모 H9 #1 CDR2 scFab 라이브러리에서 상기 실시예 9에서 구축한 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 특이적으로 결합하는 클론을 선별한 과정을 나타낸다. 구체적으로, 상기 실시예 9와 같이 준비한 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 이용하여 4회의 FACS(Fluorescence activated cell sorting)를 수행하였다. 바이오틴화 된 2nM의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 효모세포표면에 발현된 H9 #1 CDR2 scFab 라이브러리와 25℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질과 결합할 수 있는 효모세포표면 scFab 라이브러리 클론을 c-myc tag을 인지하는 마우스 항체 9e10 클론과 Alexa488이 접합된 마우스 Fc를 인지하는 항체를 통해 효모세포표면 발현량을 확인하고, PE가 접합된 streptavidin (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Thermo)을 이용하여 바이오티닐화된 항원 결합력을 확인하여, 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질의 농도를 낮춰가면서 scFab의 발현량이 높고 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질와 결합력이 높은 클론을 선별하였다. 이 같은 과정을 4회 반복하였다.
도 12는 상기 라이브러리로부터 단리된 개별 클론 총 50개를 2nM의 바이오티닐화된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질과 결합시킨 후 FACS 분석한 결과이다. scFab 발현량이 우수하며 항원 결합 세기가 높은 #4, #9, #10, #17, #45, #50 클론 및 그래프의 양상이 나머지 49개 클론과 다소 달랐던 #30 클론을 선별하여 서열 분석하였을 때, #30 클론을 제외한 모든 클론이 #17과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 scFab을 발현하고 있었다.
하기 표 7은 수렴된 두 클론의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역의 CDR 아미노산 서열을 나타낸다. H9 #1 클론의 서열과 비교하여 바뀐 아미노산 서열을 굵은 글자로 표시하였다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000007
실시예 11: 선별된 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 친화도 성숙된 scFab 클론들의 IgG 전환 및 동정
상기 선별된 H9 #1-17, H9 #1-30 클론의 중쇄가변영역(VH) 와 경쇄가변영역(VL) 서열을 실시예 5와 동일하게 마우스 이뮤노글로불린 2a(mIgG2a)의 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3 domain)과 마우스 카파 경쇄불변영역(kappa domain)을 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다.
도 13은 TCR-유사 항체인 H9의 친화도를 향상시킨 H9 #1과 H9 #38 항체 및H9 #1의 친화도를 향상시킨 H9 #1-17, H9 #1-30 항체를 동물세포 (HEK293F)에서 발현 및 정제한 후, 3㎍의 단백질을 환원성 또는 비환원성 조건의 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, Coomassie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다. H9 #1-17, H9 #1-30 항체는 HEK293F 세포 배양액 1L당 각각 13.3mg, 24.8mg의 수율을 보였다.
실시예 12: 선별된 TCR-유사 항체들의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합능의 평가
도 14는 동물세포에서 발현 정제된 IgG 형태의 H9 #1-17 및 H9 #1-30 클론의 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 결합력을 측정한 ELISA 실험 결과이다.
구체적으로, EIA/RIA 플레이트에 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질, HPV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 10μg/ml 농도가 되도록 PBS pH7.4 버퍼에서 1시간 동안 상온에서 코팅한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. Blocking 버퍼로 1시간 동안 상온에서 blocking 시킨 후, H9 #1, H9 #1-17, H9 #1-30 항체를 Blocking 버퍼에 희석하여 1nM, 0.5nM, 0.1nM 의 농도로 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.05% PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-마우스 Fc 항체(HRP-conjugated anti-mouse Fc)를 1:4000으로 Blocking 버퍼에 희석하여 결합시켰다. TMB ELISA solution으로 상온에서 1분 동안 반응시킨 뒤, H2SO4로 반응을 완료하고 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
IgG 형태의 H9 #1과 비교하여, IgG 형태의 H9#1-17 및 H9#1-30 클론은 ELISA 상에서 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 약 2배 가량 향상된 친화도를 보였다.
실시예 13: 선별된 TCR-유사 항체들의 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 결합능 평가
도 15는 MHC-I (HLA-A*02:01) 을 발현하는 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 CMVP495-503 펩타이드 4μM 펄싱 후, H9 #1 항체 및 친화도를 향상시킨 H9 #1-17, H9 #1-30 항체의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 대한 결합능을 유세포분석기 (flow cytometry)로 분석한 실험 결과이다. 친화도 향상된 항체들이 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체가 세포 표면에서 현저히 낮은 양으로 발현되어 있어도 효과적으로 이를 검출할 수 있는지 확인하기 위해 상기 실시예 1 및 실시예 7 보다 낮은 펩타이드 농도로 펄싱하여 진행하였다. 펄싱이 끝난 후 세포를 FACS 완충액으로 세척 후 1300rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 샘플 당 1.5×105 개의 세포가 되도록 준비하고 100μl의 FACS 완충액에 H9, H9 #1-17, H9 #1-30 항체의 농도가 0.5nM, 5nM, 50nM이 되도록 희석하여 넣고 4℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2 항체를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, 펩타이드를 처리하지 않은 실험군에 비해 HPVE11-19 펩타이드를 처리한 실험군에서는 T세포 수용체 유사 항체들의 결합을 보이지 않았으며, CMVP495-503 펩타이드를 처리한 실험군에서만 특이적 결합을 보였다. 또한 H9 항체의 경우 가장 높은 농도인 50nM에서도 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하지 못하였으며, 같은 처리 농도에서 비교하였을 때 H9 #1 항체보다 H9 #1-17, H9 #1-30 항체가 더 많은 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하는 것을 확인하여 친화도가 향상되었음을 알 수 있었다. 하지만 H9 #1-17 및 H9 #1-30 항체의 경우 펩타이드를 처리하지 않은 실험군에서도 그래프의 피크(peak)가 비특이적으로 이동하는 현상을 보였고, 이러한 현상이 더 크게 나타나는 H9 #1-30 항체의 경우에 이후 실험에서 사용하지 않았다.
실시예 14: 선별된 TCR-유사 항체를 이용한 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 검출
도 16는 MDA-MB-231 세포주에 inCT99-CMVP†480-503 융합 항체를 처리하였을 때 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체 형성을 유도할 수 있는지 H9 #1-17 항체를 이용하여 유세포분석기로 분석한 실험 결과이다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 MDA-MB-231 세포주를 웰 당 1.8×105 세포/ml의 밀도로 10% FBS와 1% ABAM 항생제가 포함된 RPMI 배지에 희석하여 12시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, 배지를 제거하고 inCT99, inCT99-CMVP†480-503, inCT99-HPVE†1-19 융합 항체를 4μM의 농도가 되도록 1ml의 배지에 희석하여 18시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양해주었다. 이 후 스크래핑(scrapping)하여 세포를 회수하고 1300 rpm에서 3분동안 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 세포를 FACS 완충액 1ml로 세척해주고 원심분리하여 상층액을 제거해주었다. 웰 당 세포 펠렛을 FACS 완충액 100μl로 풀어주고 2개의 샘플로 나누어 하나의 샘플은 2차 항체 단독 대조군으로 사용하였다. 각 샘플을 100μl의 FACS 완충액에 H9 #1 항체의 농도가 50nM, 250nM이 되도록 하고, H9 #1-17 항체의 농도는 0.5nM, 5nM이 되도록 하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 각 샘플을 1ml의 FACS 완충액으로 세척한 뒤, Alexa647(적색형광)이 연결된 마우스 Fc를 특이적 인지하는 F(ab’)2항체를 100μl의 FACS 완충액에 1:600으로 희석하여 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 1ml의 FACS 완충액으로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, inCT99-CMVP†480-503 융합 항체 처리군에서 H9 #1 및 H9 #1-17 항체의 특이적 결합을 확인할 수 있었다, 특히 H9 #1-17 항체는 H9 #1 항체보다 훨씬 적은 농도인 5nM로 처리하였을 때에도 H9 #1 항체보다 효과적으로 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출함으로써 친화도가 향상되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 15: 본 발명에 따라 선별된 TCR-유사 항체들의 결합 친화도 분석
도 17은 본 발명에 따른 TCR-유사 항체들의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 결합 친화도를 분석한 결과이다.
ELISA 방법과는 별도로, CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도를 정량적으로 측정하기 위해 Octet Qke(ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 항체를 PBS에 10μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, H9 항체의 경우 CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질을 3μM부터, 나머지 클론들의 경우 300nM부터 계단식 희석하여 빛이 투과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 각 200μl씩 넣어주었다. AMC(anti-mouse IgG Fc capture) 센서칩이 PBS 용액, 항체, PBS 용액, 항원, PBS 용액의 순서로 옮겨간 후 1000rpm으로 빠르게 진동하면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 결합 동역학(kinetics)을 분석하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.
그 결과, CMV/HLA-A*02:01 SCT 단백질에 대한 H9 #1-17의 결합속도상수(association rate constant, k on)가 k on=9.30×105 1/Ms 및 해리속도상수 (dissociation rate constant, k off)가 k off=4.84×10-3 1/s 로 결정되었으며, 평형 해리 상수 (equilibrium dissociation constant, K D)가 K D = 5.20nM 로 결정되었다. 이 결과를 통해 기존 문헌에 보고 되어 있던 H9 항체에 비해 약 67배, 친화도 향상을 위한 라이브러리 주형으로 사용했던 H9 #1 항체에 비해 약 2.4배 친화도가 향상되었음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020017067-appb-T000008
본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체는 기존에 보고된 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 항체보다 현저히 성숙된 친화도를 가진다.
펩타이드/MHC 복합체와 같이, 다른 세포표면 항원들에 비해 그 발현량이 현저히 낮은 분자를 검출하기 위해서는 이러한 높은 친화도는 큰 이익을 줄 수 있다. 예로, 기존 항체를 이용해 낮은 발현량의 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하기 위해서는 높은 농도로 처리를 해야 하며, 이에 따른 비특이적 결합이 관찰되었다. 본 발명에 따른 친화도가 성숙된 TCR-유사 항체에서는 적은 농도를 처리하였을 때에도 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출하였으며, 높은 농도에서도 비특이적 결합이 관찰되지 않았다.
또한 기존 항체에서는 검출하지 못했던, MHC 분자의 발현량이 상대적으로 낮은 세포주에서도 세포 표면 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출해낼 수 있어 훨씬 다양한 세포주에서 사용될 수 있어 그 활용성이 높다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 대한 친화도 성숙된 구축물은 종양미세환경과 같이 MHC 손실이 일어난 환경에서도 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체는 낮은 농도에서도 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체와 특이적으로 결합하며, 높은 농도에서도 비특이적 결합을 하지 않았기 때문에 CMV 감염에 의한 질병의 효과적인 진단 및 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 CMVP495-503/HLA-A*02:01 복합체에 특이적인 TCR-유사 항체는 재조합 T 세포 수용체로서 효과적인 세포 치료제로 개발될 수 있다.
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Claims (10)

  1. 서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 13, 17 및 18로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 15 및 16으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3; 및 서열번호 5 경쇄 CDR1, 서열번호 6, 10 및 11로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 서열번호 8 및 9로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하며,
    바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드를 제시하는 MHC-I의 복합체에 특이적으로 결합하는, TCR-유사 항체 (T cell receptor-like antibody) 또는 이의 항원 결합 단편으로,
    상기 바이러스 단백질 항원 유래 펩타이드는 인간 거대세포바이러스 (CMV)의 pp65 단백질 중 495-503번 펩타이드 또는 480-503번 펩타이드이고, 상기 MHC-I은 HLA-A*02:01인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 25 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 20 내지 23으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  5. 제4항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  7. 다음 단계를 포함하는 TCR-유사 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제6항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor)로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 진단용 조성물.
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