WO2021162394A1 - B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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송석길
성혜란
황서진
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충북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen receptor targeting B cell maturation antigen (BCMA) and uses thereof.
  • BCMA B cell maturation antigen
  • Multiple myeloma (multiple myeloma) or plasma cell myeloma (plasma cell myeloma) is a cancer of plasma cells, a type of white blood cells that are usually responsible for producing antibodies.
  • plasma cell myeloma (plasma cell myeloma) is a cancer of plasma cells, a type of white blood cells that are usually responsible for producing antibodies.
  • normal plasma cells are transformed into abnormal cancer cells, myeloma cells, and proliferate rapidly. Damaged myeloma cells gradually produce large amounts of malignant myeloma cells in the bone marrow, a process that destroys the body's normal immune system.
  • Treatments for multiple myeloma include melphalan, vincristine, doxorubicin, cyclophosphamide, corticosteroids (Steroids), boltezomib/velcade, and thalidomide.
  • Thialidomide chemotherapy such as lenalidomide (Lenalidomide), radiation therapy, hematopoietic stem cell transplantation and surgical treatment, etc.
  • Chimeric antigen receptor T cells are T cells that have been genetically engineered to create engineered T cell receptors for use in immunotherapy.
  • Chimeric antigen receptors are receptor proteins engineered to confer new functions targeting specific proteins to T cells.
  • the chimeric antigen receptor is composed of an external domain (ecto domain), a transmembrane domain and an internal domain (endo domain), and depending on the configuration of the internal domain that transmits the activation signal to the cell, the first generation, the second generation, It is evolving into 3rd and 4th generation.
  • BCMA B cell maturation antigen
  • TNFRSF17 tumor necrosis factor receptor superfamily 17
  • MM multiple myeloma
  • BCMA is an antigen targeted by chimeric antigen receptor (CAR) T-cells that have shown significant therapeutic effects in clinical trials.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • anti-BCMA antibody-drug conjugate also meant for patients who had weak therapeutic effects with therapeutic agents such as anti-CD38 antibody, proteosome inhibitor, and immunomodulatory agent. clinical results were obtained.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention seeks to provide a chimeric antigen receptor (CAR) anti-BCMA CAR that specifically recognizes BCMA.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention seeks to provide a nucleic acid molecule encoding an anti-BCMA CAR and a vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the present invention is to provide a cell expressing an anti-BCMA CAR comprising the nucleic acid molecule or the vector.
  • the present invention seeks to provide a composition comprising a cell expressing an anti-BCMA CAR.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of B cell-related diseases, including cells expressing anti-BCMA CAR.
  • the present invention seeks to provide the use of cells expressing anti-BCMA CARs for the treatment of diseases related to B cells.
  • An object of the present invention is to provide a method of treating a B cell-related disease using a cell expressing an anti-BCMA CAR.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • BCMA B cell maturation antigen
  • nucleic acid molecule encoding the chimeric antigen receptor.
  • a vector comprising the polynucleotide.
  • a cell comprising the nucleic acid molecule or the vector.
  • a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of B cell-related diseases comprising a pharmaceutically effective amount of cells containing the vector.
  • Immune cells expressing the chimeric antigen receptor of the present invention can be effectively used for treatment and prevention of B-cell-related diseases, particularly multiple myeloma or non-Hodgkin's lymphoma.
  • FIG. 1A shows a BCMA-chimeric antigen receptor (CAR) structure according to an embodiment of the present invention.
  • SP is signal peptide
  • TM is transmembrane domain
  • CS1-ICD is costimulatory 1-intracellular signaling domain
  • CS2-ICD is a costimulatory 2-intracellular signaling domain.
  • Figure 1b is a diagram showing the structure of the BCMA-CAR according to an embodiment of the present invention in more detail schematically.
  • CGT301, CGT302, CGT303, and CGT304 are NK cells transduced with BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, and BCMA-CAR4 of the present invention, respectively.
  • Figure 4a is the result of measuring the cancer cell killing ability of BCMA-CAR NK cells
  • Figure 4b is the result of measuring the amount of IFN ⁇ secretion of BCMA-CAR NK cells
  • Figure 4c is the secretion amount of Granzyme B of BCMA-CAR NK cells is the measurement result.
  • 6A and 6B are results confirming the antigen specificity of the BCMA-CAR of the present invention for BCMA derived from human (hu1, hu2), monkey (Rh), mouse (Ms) and rat (Rat).
  • BCMA-CAR NK cells is a BCMA-specific reaction through a competition assay with rhBCMA protein.
  • Figures 10a to 10d are the results of confirming the stability of BCMA-CAR NK cells
  • Figure 10a is the result of measuring cell viability
  • Figure 10b is the result of measuring the population doubling time
  • Figure 10c is the measurement of BCMA-CAR expression Results
  • Figure 10d is a result of measuring the cytotoxicity.
  • the present invention provides a chimeric antigen receptor (CAR) comprising the following polypeptide:
  • BCMA B cell maturation antigen
  • the extracellular antigen binding domain comprises an anti-BCMA antibody or antigen binding fragment thereof.
  • the antigen-binding fragment is a Fab fragment, Fab' fragment, F(ab)'2 fragment, F(ab)'3 fragment, Fv, single chain Fv antibody ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2 , minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, disulfide stabilized Fv proteins (“dsFv”), and single-domain antibodies (sdAbs, Nanobodies).
  • the extracellular antigen binding domain comprises (i) a light chain variable region of an anti-BCMA antibody comprising a complementarity determining region (L-CDR)1, L-CDR2, and L-CDR3; V L );
  • V H a heavy chain variable region of an anti-BCMA antibody comprising H-CDR1, H-CDR2, and H-CDR3;
  • the term “specifically binds” means that an antibody or antigen-binding fragment thereof, or a construct such as an scFv, forms a relatively stable complex with an antigen under physiological conditions.
  • variable region refers to the domain of an antibody heavy or light chain involved in binding an antibody to an antigen.
  • the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) of a native antibody generally have a similar structure, and each domain has four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (hypervariable regions). regions, HVR).
  • CDR complementarity determining region
  • the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) each have three CDRs (heavy chain: H-CDR1, H-CDR2 and H-CDR3; light chain: L-CDR1, L-CDR2 and L-CDR3). Included. CDRs provide key contact residues for the binding of an antibody to an antigen or epitope.
  • the extracellular antigen binding domain may include one or more light chain variable regions (V L ), or one or more heavy chain variable regions (V H ), for example, (V L ), ( V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), (V L )-( V L )-(V L ), (V L )-( V L )-(V L )-(V L ), or (V L )-(V L )-(V L )-(V L )-(V L ) (V H ), (V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H ) )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H
  • the extracellular antigen binding domain may include a form in which one light chain variable region (V L ) and one heavy chain variable region (V H ) are linked, (V L )-(V H ) and It may include a form connected together, or a form connected such as (V H )-(V L ) in the opposite direction.
  • the extracellular antigen-binding domain is one or more heavy chain variable regions (V H ) linked to two or more light chain variable regions (V L );
  • one or two or more light chain variable regions (V L ) may include a form in which two or more heavy chain variable regions (V H ) are linked.
  • the extracellular antigen-binding domain is two or more heavy chain variable regions (V H ), one or two or more light chain variable regions (V L ) are linked to;
  • one or two or more light chain variable regions (V L ) may include a form in which two or more heavy chain variable regions (V H ) are linked.
  • the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) may include a form in which they are alternately connected.
  • L-CDR1 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 19;
  • the L-CDR2 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 20;
  • the L-CDR3 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 21;
  • H-CDR1 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 22;
  • the H-CDR2 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 23;
  • the H-CDR3 is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 24.
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H) of an anti-BCMA antibody comprising H-CDR1 of SEQ ID NO: 4, H-CDR2 of SEQ ID NO: 5, and H-CDR3 of SEQ ID NO: 6 ); and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody comprising L-CDR1 of SEQ ID NO: 1, L-CDR2 of SEQ ID NO: 2, and L-CDR3 of SEQ ID NO: 3.
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H) of an anti-BCMA antibody comprising H-CDR1 of SEQ ID NO: 10, H-CDR2 of SEQ ID NO: 11, and H-CDR3 of SEQ ID NO: 12 ); and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody comprising L-CDR1 of SEQ ID NO: 7, L-CDR2 of SEQ ID NO: 8, and L-CDR3 of SEQ ID NO: 9.
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H) of an anti-BCMA antibody comprising H-CDR1 of SEQ ID NO: 16, H-CDR2 of SEQ ID NO: 17, and H-CDR3 of SEQ ID NO: 18 ); and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody comprising L-CDR1 of SEQ ID NO: 13, L-CDR2 of SEQ ID NO: 14, and L-CDR3 of SEQ ID NO: 15.
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H) of an anti-BCMA antibody comprising H-CDR1 of SEQ ID NO: 22, H-CDR2 of SEQ ID NO: 23, and H-CDR3 of SEQ ID NO: 24 ); and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody comprising L-CDR1 of SEQ ID NO: 19, L-CDR2 of SEQ ID NO: 20, and L-CDR3 of SEQ ID NO: 21.
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • the extracellular antigen binding domain is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe
  • V L the light chain variable region of at least one anti-BCMA antibody selected from the group consisting of the polypeptides of SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 31; and
  • V H heavy chain variable regions
  • the combination of the light chain variable region (V L ) and the heavy chain variable region (V H ) is the same as the above-described combination.
  • V L may comprise one or more light chain variable regions (V L ), or may comprise one or more heavy chain variable regions (V H ), for example, (V L ), (V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), (V L )-(V L )-(V L ), or (V L )-(V L )-(V L )-(V L )-(V L )-(V L ), and also (V L )-(V L ) H ), (V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H ), (V H )-(V H )-(V H )-(V H
  • one light chain variable region (V L ) and one heavy chain variable region (V H ) may include a linked form, such as (V L )-(V H ), or the opposite direction ( V H )-(V L ) may be in a connected form.
  • the heavy chain variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) may include a form in which they are alternately connected.
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 26; and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 25.
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 28; and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 27.
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 30; and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 29.
  • the extracellular antigen binding domain comprises a heavy chain variable region (V H ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 32; and a light chain variable region (V L ) of an anti-BCMA antibody of SEQ ID NO: 31.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may further comprise a linker positioned between two or more light or heavy chain variable regions.
  • the linker may be a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38.
  • the extracellular antigen binding domain of the present invention may further include a hinge region connected to the transmembrane domain.
  • the hinge region comprises a hinge region of IgG1, IgG4, or CD8 ⁇ .
  • the IgG1 hinge region comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO:39; wherein said IgG4 hinge region comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO:40;
  • the CD8 ⁇ hinge region comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.
  • the transmembrane domain comprises a transmembrane region of CD8 alpha or CD28.
  • the CD8 alpha transmembrane region comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42
  • the CD28 transmembrane region comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
  • the intracellular co-stimulatory signaling domain comprises an intracellular co-stimulatory signaling domain of CD28, DAP10, or CD137 (4-1BB).
  • the CD28 intracellular co-stimulatory signal transduction domain comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44.
  • the DAP10 intracellular co-stimulatory signal transduction domain comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.
  • the CD137(4-1BB) intracellular costimulatory signaling domain comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO:46.
  • the intracellular major signaling domain comprises the intracellular domain of CD3 zeta ( ⁇ ).
  • the CD3 zeta ( ⁇ ) intracellular domain comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO:47.
  • the intracellular co-stimulatory signaling domain and/or the intracellular major signaling domain may be linked by a linker.
  • the linker connecting the intracellular co-stimulatory signal transduction domain and/or the intracellular major signal transduction domain is a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the extracellular antigen binding domain further comprises a signal peptide.
  • the signal peptide comprises a signal peptide of CD16, GM-CSF, human IgG, or CD8.
  • the signal peptide of CD16 comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO:33; the signal peptide of GM-CSF comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; the signal peptide of human IgG comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; The signal peptide of CD8 comprises a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention comprises a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L ) of the aforementioned anti-BCMA antibody; CD8 ⁇ hinge region; CD28 transmembrane region; CD137(4-1BB) co-stimulatory signaling domain; and a CD3 zeta ( ⁇ ) intracellular domain.
  • FIG. 1B the configuration of a polypeptide constituting a more specific chimeric antigen receptor of the present invention may be shown in FIG. 1B, but the chimeric antigen receptor of the present invention is not limited to the configuration of FIG. 1B.
  • the invention provides a nucleic acid molecule encoding the above-described chimeric antigen receptor.
  • nucleic acid molecule is a polynucleotide, and is meant to include DNA and RNA, the DNA includes gDNA (genomic DNA) and cDNA (complementary DNA), and the RNA includes mRNA (messenger RNA) do.
  • the mRNA is a nucleic acid molecule capable of directing translation of the chimeric antigen receptor of the present invention, and may include a primary transcript mRNA (mRNA) molecule or a mature mRNA (mature mRNA) molecule.
  • the nucleotide which is the basic structural unit of the nucleic acid molecule, includes not only natural nucleotides but also analogs in which sugar or base sites are modified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews). , 90:543-584 (1990)).
  • Nucleic acid molecules or polynucleotides of the present invention can be obtained using chemical synthesis, recombinant methods or PCR, and methods for chemical synthesis of nucleic acid molecules are well known in the art, so those of ordinary skill in the art will be familiar with the present specification. Nucleic acid molecules of a desired sequence can be easily synthesized using the provided sequences and commercial nucleic acid molecule synthesizers.
  • the present invention provides a vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the vector may be a cloning vector or an expression vector stably expressing the chimeric antigen receptor.
  • the vector may include an origin of replication, such as f1 origin of replication, SV origin of replication, pMB1 origin of replication, Adeno origin of replication, AAV origin of replication and BBV origin of replication operating in eukaryotic cells.
  • an origin of replication such as f1 origin of replication, SV origin of replication, pMB1 origin of replication, Adeno origin of replication, AAV origin of replication and BBV origin of replication operating in eukaryotic cells.
  • the vector includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, puromycin and It may contain a resistance gene for tetracycline.
  • the nucleic acid molecule encoding the above-described chimeric antigen receptor may be operably linked with a promoter sequence that initiates its expression.
  • the promoter may be a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, metallotionine promoter, EF-1 alpha promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, and HSV tk promoter) may be used, and a polyadenylation sequence may be included as a transcription termination sequence, for example, an SV40 polA sequence and a BGH polA sequence may be included. .
  • the vector or recombinant vector is a transposon vector, an episomal vector, or a viral vector.
  • the viral vector is a retroviral vector or a lentiviral vector.
  • the lentiviral vector comprises human immunodeficiency virus 1 (HIV-1); human immunodeficiency virus 2 (HIV-2), visna-maedi virus (VMV) virus; goat arthritis-encephalitis virus (CAEV); Equine Infectious Anemia Virus (EIAV); Feline Immunodeficiency Virus (FIV); bovine immunodeficiency virus (BIV); and simian immunodeficiency virus (SIV).
  • HV-1 human immunodeficiency virus 1
  • HMV-2 human immunodeficiency virus 2
  • VMV visna-maedi virus
  • CAEV goat arthritis-encephalitis virus
  • EIAV Equine Infectious Anemia Virus
  • FV Feline Immunodeficiency Virus
  • BIV bovine immunodeficiency virus
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • the invention provides a cell comprising the nucleic acid molecule, or a cell comprising the vector described above.
  • the vector may be introduced into a cell.
  • a method for introducing a vector into a cell may use a known transfection method, for example, a microinjection method (Capecchi, MR, Cell 22, 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al.) al., Virology 52, 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene) , 10, 87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), and gene bambadment (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci) USA 87, 9568-9572 (1990)), but is not limited thereto.
  • a vector introduced into a cell may be maintained in the cell as a non-integrating vector (eg, a plasmid), or it may be integrated as part of the chromosomal DNA of the host cell.
  • a non-integrating vector eg, a plasmid
  • a cell comprising a vector comprising a nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding the above-described chimeric antigen receptor of the present invention stably expresses the chimeric antigen receptor in a cell, and the expressed chimeric antigen receptor is located in the cell membrane region. stably positioned.
  • cells can be provided comprising a nucleic acid molecule (eg, cDNA or mRNA molecule) encoding a chimeric antigen receptor of the invention.
  • a nucleic acid molecule eg, cDNA or mRNA molecule
  • Cells containing cDNA capable of instructing transcription and translation of the chimeric antigen receptor of the present invention can stably express the chimeric antigen receptor in the cell.
  • Intracellular expression of the chimeric antigen receptor can be induced by directly introducing a primary transcript mRNA or a mature mRNA capable of directing translation of the chimeric antigen receptor of the present invention into a cell.
  • the cells into which the vector is introduced are immune cells, preferably NK (Natural Killer) cells, T cells, cytotoxic T cells or regulatory T cells.
  • the cells are human-derived immune cells, more preferably human-derived NK cells.
  • T cell refers to a type of lymphocyte that matures in the thymus. T cells play an important role in cell-mediated immunity and are distinguished from other lymphocytes such as B lymphocytes by the presence of T cell receptors on the cell surface. T cells can also be isolated or obtained from commercially available sources. T cells are of any type expressing CD3, including helper T cells (CD4+ cells), cytotoxic T cells (CD8+ cells), natural killer T cells, regulatory T cells (Tregs) and gamma-delta T cells. contains immune cells. “Cytotoxic cells” include CD8+ T cells, natural-killer (NK) cells, and neutrophils that are capable of mediating a cytotoxic response.
  • NK cells refers to a type of lymphocytes derived from the bone marrow, which are natural killer cells (NK cells), which play an important role in the innate immune system. Even in the absence of major histocompatibility complexes or antibodies on the cell surface, NK cells provide a rapid immune response against virus-infected cells, tumor cells or other stressed cells.
  • NK-92 ATCC® CRL-2407TM
  • NK-92MI ATCC® CRL-2408TM
  • Additional examples include, but are not limited to, the NK cell lines HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT and NK101.
  • Non-limiting exemplary sources of such commercially available cell lines are the American Type Culture Collection, or ATCC, (http://www.atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz). .de/).
  • the invention provides a pharmaceutical composition comprising (i) a pharmaceutically effective amount of a cell comprising a nucleic acid molecule encoding a chimeric antigen receptor as described above, or a cell comprising a vector comprising said nucleic acid molecule; And (ii) provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a B cell-related disease comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition refers to a composition formulated in a pharmaceutically acceptable or physiologically acceptable solution for administration to a cell or animal, alone or in combination with one or more other therapeutic modalities.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an “effective amount” or “effective amount” of genetically modified therapeutic cells, e.g., NK cells, to achieve beneficial or desired prophylactic or therapeutic results, including clinical results. " refers to
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient” means any adjuvant, carrier, excipient, lubricant, sweetening agent, diluent, preservative, dyes/colorants, flavor enhancers, surfactants, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, stabilizers, isotonic agents, solvents, surfactants or emulsifiers.
  • pharmaceutically acceptable carriers include sugars such as lactose, glucose and sucrose; starches such as corn starch and potato starch; cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; tragacanth; malt; gelatin; talc; cocoa butter, wax, animal and vegetable fats, paraffin, silicone, bentonite, silicic acid, zinc oxide; oils such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol; polyols such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; Baby; buffers such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; number of pyrogen-free; isotonic saline; Ringer's solution; ethyl alcohol
  • pharmaceutically acceptable means that it does not cause allergic reactions or similar adverse reactions when administered to humans or animals.
  • Such carriers include specific solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is known in the art.
  • composition of the present invention may preferably be administered by parenteral, intraperitoneal, intradermal, intramuscular, or intravenous routes.
  • compositions of the present invention are administered in a therapeutically effective amount in a manner compatible with the formulation.
  • dosage may be adjusted according to the condition or condition of the subject to be treated.
  • parenteral administration as an aqueous injectable solution, the solution must be suitably buffered as required, first rendered isotonic with the liquid diluent with sufficient saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal and intraperitoneal administration.
  • Carriers, agents, and media that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention are known in the art (see “Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15th edition).
  • the B cell related disease to be treated by the composition of the present invention is multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, B cell proliferation of uncertain malignant potential, lymphomatous granulomatosis, post-transplant lymphoproliferative.
  • the B cell related disease is a B cell malignancy.
  • the B cell malignancy is multiple myeloma or non-Hodgkin's lymphoma.
  • a third-generation chimeric antigen receptor (CAR) structure comprising an scFv region derived from a monoclonal antibody that specifically binds BCMA was designed ( FIG. 1 ).
  • the CAR of the present invention comprises (i) a signal peptide; (ii) a BCMA recognition and binding domain; (iii) a hinge region; (iv) a transmembrane domain; and a third generation chimeric antigen receptor (CAR), consisting of (v) a CD3 zeta ( ⁇ ) signaling domain as an intracellular signaling domain, and (vi) two costimulatory domains.
  • CAR third generation chimeric antigen receptor
  • amino acid sequence of each domain or polypeptide constituting the CAR is shown in Table 1 below.
  • each domain of BCMA-CAR used in the experiment was designed as follows: (i) CD16 signal peptide; (ii) a polypeptide comprising a heavy chain variable region (VH), a light chain variable region (VL) of a single chain variant fragment (scFv) targeting BCMA, and a linker connecting the VH and VL; (iii) a CD8 ⁇ hinge region polypeptide; (iv) a transmembrane domain polypeptide of CD28; (v) intracellular domain of CD28 (costimulatory domain), linker (GGGGS), intracellular domain of CD137 (costimulatory domain), linker (GGGS), intracellular domain of CD3 zeta ( ⁇ ) (costimulatory domain) polypeptides was composed of 1b schematically shows the structure of the BCMA-CAR of the present invention.
  • BCMA-CAR1 was prepared by sequentially linking the following polypeptides (i) to (v).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • amino acid sequences of VL and VH of scFV of BCMA-CAR1 are as follows.
  • V L Light chain variable region
  • L-CDR1 SGSSSNIGSNSVS (SEQ ID NO: 1)
  • L-CDR2 ADSKRPS (SEQ ID NO: 2)
  • L-CDR3 GSWDYSLSGYV (SEQ ID NO: 3)
  • V H Heavy chain variable region
  • H-CDR1 NYDMS (SEQ ID NO: 4)
  • H-CDR2 WIYPSDSSIYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)
  • H-CDR3 RGPFANKYRQFDY (SEQ ID NO: 6)
  • BCMA-CAR1 The entire amino acid sequence of BCMA-CAR1 is shown in SEQ ID NO: 48.
  • BCMA-CAR2 was prepared by sequentially linking the following polypeptides (i) to (v).
  • VH heavy chain variable region
  • SEQ ID NO: 28 of scFv targeting BCMA - linker peptide (GSTSGSGKPSGEGSTKG, SEQ ID NO: 37) - light chain variable region (VL) of scFv targeting BCMA (SEQ ID NO: 27) ;
  • amino acid sequences of VL and VH of scFV of BCMA-CAR2 are as follows.
  • V L Light chain variable region
  • L-CDR1 QGDSLRSYYVN (SEQ ID NO: 7)
  • L-CDR2 DHSKRPT (SEQ ID NO: 8)
  • L-CDR3 QSYDSSTV (SEQ ID NO: 9)
  • V H Heavy chain variable region
  • H-CDR1 NYGVH (SEQ ID NO: 10)
  • H-CDR2 YISYSGGTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 11)
  • H-CDR3 RDSDDFGFDY (SEQ ID NO: 12)
  • BCMA-CAR3 was prepared by sequentially linking the following polypeptides (i) to (v).
  • VH heavy chain variable region (SEQ ID NO: 30) of scFv targeting BCMA - linker peptide (GSTSGSGKPSGEGSTKG, SEQ ID NO: 37) - light chain variable region (VL) of scFv targeting BCMA (SEQ ID NO: 29) ;
  • amino acid sequences of VL and VH of BCMA-CAR3 scFV are as follows.
  • V L Light chain variable region
  • L-CDR1 KASQDIDDDIN (SEQ ID NO: 13)
  • L-CDR2 DASLRAT (SEQ ID NO: 14)
  • V H Heavy chain variable region
  • H-CDR1 DYGLS (SEQ ID NO: 16)
  • H-CDR2 LIDSSGSSTFYADSVKG (SEQ ID NO: 17)
  • H-CDR3 KEHGLFDS (SEQ ID NO: 18)
  • BCMA-CAR3 The entire amino acid sequence of BCMA-CAR3 is shown in SEQ ID NO: 50.
  • BCMA-CAR4 was prepared by sequentially linking the following polypeptides (i) to (v).
  • VH heavy chain variable region
  • SEQ ID NO: 32 of scFv targeting BCMA - linker peptide (GSTSGSGKPSGEGSTKG, SEQ ID NO: 37) - light chain variable region (VL) of scFv targeting BCMA (SEQ ID NO: 31) ;
  • amino acid sequences of VL and VH of scFV of BCMA-CAR4 are as follows.
  • V L Light chain variable region
  • EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQGIDSYVA WYQQKPGQAPRLLIY DASLRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYNSWPI TFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 31)
  • L-CDR1 RASQGIDSYVA (SEQ ID NO: 19)
  • L-CDR2 DASLRAT (SEQ ID NO: 20)
  • V H Heavy chain variable region
  • H-CDR1 GHYWS (SEQ ID NO: 22)
  • H-CDR2 TVSGSGGDTFYADSVKG (SEQ ID NO: 23)
  • H-CDR3 RGHSVMDV (SEQ ID NO: 24)
  • the polypeptide sequence of BCMA-CAR composed of the above is converted into a nucleic acid sequence by codon optimization to be suitable for protein expression in animal cells, and pSBbi-Neo (Addgene, Catalog No. 60525) was cloned and used.
  • the pSBbi-Noe vector into which the four types of anti-BCMA chimeric antigen receptor (CAR) coding nucleic acid sequences (genes) BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4 were cloned in Example 1 was NK-92 Electroporation using Lonza's Nucleofector and Cell line Nucleofector Kit together with pCMV(CAT)T7-SB100 (Addgene, Catalog No. 34879), a sleeping beauty transposase expression vector, was performed on cells 4 BCMA-CAR NK cells of the species CGT301, CGT302, CGT303, and CGT304 were prepared, respectively.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CAR of the same structure including the scFv based on the J6MO antibody sequence of BMCA-ADC was used as a reference to prepare comparative NK cells (Ref).
  • NK-92 cells expressing the BCMA-CAR gene were selected by treatment with kanamycin at a concentration of 200 ⁇ g/ml for 2 weeks or more.
  • the BCMA-CAR NK cells thus prepared were first confirmed for expression of BCMA-CAR in the NK cells by Western blotting using an anti-phospho-CD3 ⁇ antibody ( FIG. 2 ).
  • BCMA-CAR expression on the surface of NK cells was confirmed by flow cytometry using human IgG(ab')2 antibody or Hig tag conjugated-BCMA recombinant protein and PE-conjugated His antibody (FIG. 3) .
  • Example 3 In vitro efficacy evaluation of BCMA-CAR expressing NK cells
  • BCMA-CAR NK cells were treated with multiple myeloma cells including H929, MM1.R, OPM-2 and K562. , After reacting with other cancer cells of Jurkat, cytotoxicity assay and secretion of Granzyme B and IFN ⁇ were confirmed.
  • BCMA-CAR designed in Example 1
  • target cell lines expressing BCMA antigens derived from different species were prepared.
  • the BCMA gene expressing myc at the BCMA terminus derived from human (h), monkey (Rh), mouse (Ms), and rat (Rat) was introduced into K562 cancer cells in which BCMA is not expressed, respectively, and analyzed by flow cytometry and Western blot analysis. Its expression was confirmed by the Ting method (FIG. 5).
  • K562 K562 expressing BCMA derived from human (hu1, hu2), monkey (Rh), mouse (Ms) and rat (Rat) BCMA) cell line or K562 parent cells and BCMA-CAR1 NK, BCMA-CAR2 NK, BCMA-CAR3 NK, BCMA-CAR4 NK cells were reacted with each other, and then a cytotoxicity assay was performed and the secretion of Granzyme B and IFN ⁇ was measured. analyzed.
  • BCMA-CAR1 NK cells expressing BCMA-CAR1 showed specific activity only to human-derived BCMA, and NK cells expressing BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, and BCMA-CAR4, respectively, were reactive to non-human BCMA antigens. was shown (FIGS. 6a and 6b). Meanwhile, BCMA-CAR (Ref) derived from GSK's BCMA antibody (J6MO) used as a reference showed similar reactivity to BCMA-CAR-2, BCMA-CAR-3, and BCMA-CAR-4.
  • BCMA-CAR1 NK cells In order to confirm whether the activity exhibited by BCMA-CAR1 NK cells is a BCMA-specific response, a competition assay using rhBCMA was performed. First, 1 ⁇ g of rhBCMA protein was added to BCMA-CAR NK cells (4 x 10 4 cells) and pre-incubated for 1 hour. After adding BCMA cells (aK562, 4 x 10 4 cells) and reacting for 4 hours, cytotoxicity was confirmed. As a result, it was confirmed that when the rhBCMA protein was present, the cancer cell killing ability of BCMA-CAR NK cells was reduced by about 40% ( FIG. 7 ).
  • Example 5 Evaluation of in vivo anticancer efficacy of BCMA-CAR NK cells
  • BCMA-CAR NK cells expressing BCMA-CAR1 was evaluated in a xenograft animal model using NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice (Jackson Laboratory, Jax #00557 strain).
  • the test group (BCMA-CAR1 NK) administered with BCMA-CAR NK cells increased 20-fold compared to the size of the tumor before treatment, whereas the untreated group (Vehicle) increased it by 26-fold, In the group treated with NK cells (NKctrl) that do not express the therapeutic gene, the increase was 25-fold.
  • BCMA-CAR NK cells For characterization of BCMA-CAR NK cells, cell viability, proliferation, CAR expression, cytotoxicity, etc. were evaluated while continuously cultured for 60 days. As a result, CAR expression in BCMA-CAR NK cells was maintained at over 95% even after 60 days, proliferated three-fold every 2 days, and the cytotoxicity of killing cancer cells expressing BCMA antigen was also over 60%. was kept constant as The BCMA-CAR NK cells of the present invention confirmed the characteristics of stably maintaining CAR expression and cell activity for more than 60 days as well as cell proliferation ( FIGS. 10a to 10d ).

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Abstract

본 발명은 B세포 성숙화 항원(BCMA)를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포는 B세포 관련 질환 특히 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
본 발명은 B세포 성숙화 항원(BCMA)를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
다발성 골수종(multiple myeloma) 또는 형질세포골수종(plasma cell myeloma)은 일반적으로 항체를 생성하는 역할을 담당하는 백혈구의 일종인 형질 세포의 암이다. 다발성 골수종 환자에서는 정상적인 형질세포가 비정상적인 암세포인 골수종 세포로 변형되어 빠르게 증식한다. 손상된 골수종세포가 골수에 점차 많은 양의 악성 골수종세포를 만들어내며, 이러한 과정은 몸의 정상적인 면역체계를 파괴한다.
다발성 골수종에 대한 치료는 멜팔란(Melphalan), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부신피질호르몬제(Steroid), 볼테죠밉/벨케이드(Bortezomib/velcade), 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리도마이드(Lenalidomide)와 같은 항암제 치료, 방사선 치료, 조혈모세포이식 및 수술적 치료 등이 있다.
키메라 항원 수용체 T 세포(Chimeric antigen receptor T cell, CAR T 세포)는 면역요법에 사용하기 위해 가공의 T 세포 수용체를 만들기 위해 유전학적으로 조작된 T 세포이다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포에 특정 단백질을 대상으로 하는 새로운 기능을 부여하도록 조작된 수용체 단백질이다. 키메라 항원 수용체는 외부도메인(ecto domain), 막통과도메인(transmembrane domain) 및 내부도메인(endo domain)으로 구성되어 있고, 세포에 활성화 신호를 전달하는 내부도메인의 구성에 따라, 1세대, 2세대, 3세대 및 4세대로 진화하고 있다.
TNFRSF17(tumor necrosis factor receptor superfamily 17)의 일원에 속하는 막통과 당단백질인 B세포 성숙화 항원(BCMA, B cell maturation antigen)은 환자의 다발성 골수종(Multiple Myeloma, MM) 세포에서 상당히 높은 수준으로 발현된다. 또한, BCMA는 악성 B 세포, 호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병과 같은 B 림프구를 수반하는 여러 암에서 발현된다.
BCMA는 임상시험에서 유의한 치료 효과를 보여준 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포가 표적으로 삼는 항원이다. 또한, 최근 최초의 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트(anti-BCMA antibody-drug conjugate)도 항-CD38 항체, 프로테오좀(proteosome) 억제제 및 면역조절제와 같은 치료제로 치료 효과가 미약하였던 환자에게서 의미있는 임상 결과를 얻었다. 그러나, 현재까지 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 NK 세포의 개발 및 연구는 많은 진전이 이루어지지 않고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
PCT/US2015/041722
PCT/US2015/064269
PCT/IB2016/051808
PCT/CN2017/096938
본 발명은 BCMA를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR) 항-BCMA CAR를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 인코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하여 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 포함하는 B세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포의 B세포 관련 질환의 치료 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 이용한 B세포 관련 질환의 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다:
(i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
(ii) 막 관통 도메인;
(iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
(iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 세포의 약학적 유효량을 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포는 B세포 관련 질환 특히 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a은 본 발명의 일 구현예에 따른 BCMA-키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 보여준다. SP는 신호 펩티드, TM은 막 관통 도메인(transmembrane domain), CS1-ICD은 세포내 보조 자극 신호전달 도메인-1(costimulatory 1-intracellular signaling domain); CS2-ICD은 세포내 보조 자극 신호전달 도메인-2(costimulatory 2-intracellular signaling domain)이다.
도 1b은 본 발명의 일 실시예에 따른 BCMA-CAR의 구조를 보다 구체적으로 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 항-phospho-CD3ζ 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 방법으로 NK세포에 도입된 BCMA-CAR의 발현을 확인한 결과이다. CGT301, CGT302, CGT303, 및 CGT304는 각각 본 발명의 BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4를 형질 도입한 NK 세포이다.
도 3은 인간 IgG(ab')2 항체 및 Hig tag conjugated-BCMA 재조합 단백질과 PE-conjugated His 항체를 사용한 유세포 분석 방법(flow cytometry)으로 NK 세포 표면에서의 BCMA-CAR 발현을 확인한 결과이다.
도 4a는 BCMA-CAR NK 세포들의 암세포 살해능을 측정한 결과이고, 도 4b는 BCMA-CAR NK 세포들의 IFNγ 분비양을 측정한 결과이며, 도 4c는 BCMA-CAR NK 세포들의 Granzyme B의 분비양을 측정한 결과이다.
도 5는 BCMA가 발현되지 않는 K562 암세포에 인간(h), 원숭이(Rh) 또는 쥐(Ms), 랫드(Rat)유래 BCMA 유전자를 각각 도입하고 그 발현을 확인한 결과이다.
도 6a 및 도 6b은 인간(hu1, hu2), 원숭이(Rh), 마우스(Ms) 및 랫드(Rat) 유래 BCMA에 대한, 본 발명의 BCMA-CAR의 항원특이성을 확인한 결과이다.
도 7은 BCMA-CAR NK 세포의 활성이 BCMA 특이적인 반응인지를 rhBCMA 단백질과의 경쟁분석(competition assay)을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 BCMA-CAR NK 세포의 활성이 BCMA 특이적인 반응인지를 BCMA mAb를 이용한 경쟁분석(competition assay)을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 BCMA-CAR NK 세포의 인 비보(in vivo) 항암 효능을 측정한 결과이다.
도 10a 내지 도 10d는 BCMA-CAR NK세포의 안정성를 확인한 결과로서, 도 10a는 세포 생존능을 측정한 결과이고, 도 10b는 Population doubling time을 측정한 결과이며, 도 10c는 BCMA-CAR 발현을 측정한 결과이며, 도 10d는 세포독성을 측정한 결과이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다:
(i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
(ii) 막 관통 도메인;
(iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
(iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 (i) L-CDR(complementarity determining region)1, L-CDR2, 및 L-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL);
(ii) H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH); 또는
(iii) 하나 이상의 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나 이상의 상기 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 구성물이 생리적 조건 하에서 항원과 비교적 안정한 복합체를 형성한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 은 항체를 항원에 결합시키는 것에 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)).
중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에는 각각 3개의 CDR (중쇄: H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3; 경쇄: L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 하나 이상 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 하나 이상의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, (VL), (VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)을 포함할 수 있고, 또한, (VH), (VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 하나의 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있고, (VL)-(VH)와 같이 연결된 형태이거나, 그 반대 방향인 (VH)-(VL)와 같이 연결된 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 하나 또는 두개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태; 또는 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 두 개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있다.
예를 들어, (VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 두개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)에 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)이 연결된 형태; 또는 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 두 개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 번갈아 가며 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VL)-(VH), (VH)-(VL)-(VH)-(VL), (VH)-(VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL), (VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL)-(VH)-(VL)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서,
상기 L-CDR1은 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 13, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 L-CDR2은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 14, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 L-CDR3은 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR1은 서열번호 4, 서열번호 10, 서열번호 16, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR2은 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 17, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR3은 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열의 폴리펩티드이다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 4의 H-CDR1, 서열번호 5의 H-CDR2, 및 서열번호 6의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 1의 L-CDR1, 서열번호 2의 L-CDR2, 및 서열번호 3의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 10의 H-CDR1, 서열번호 11의 H-CDR2, 및 서열번호 12의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 7의 L-CDR1, 서열번호 8의 L-CDR2, 및 서열번호 9의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 16의 H-CDR1, 서열번호 17의 H-CDR2, 및 서열번호 18의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 13의 L-CDR1, 서열번호 14의 L-CDR2, 및 서열번호 15의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 22의 H-CDR1, 서열번호 23의 H-CDR2, 및 서열번호 24의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 19의 L-CDR1, 서열번호 20의 L-CDR2, 및 서열번호 21의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
(i) 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 및 서열번호 31의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 중 하나 또는 둘 이상을 포함한다.
본 발명에서 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 조합은 상술한 조합과 같다.
구체적으로, 하나 이상 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 하나 이상의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, (VL), (VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)을 포함할 수 있고, 또한, (VH), (VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
또한, 하나의 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있고, (VL)-(VH)와 같이 연결된 형태이거나, 그 반대 방향인 (VH)-(VL)와 같이 연결된 형태일 수 있다.
또한, (VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있으며,
또한, (VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 번갈아 가며 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VL)-(VH), (VH)-(VL)-(VH)-(VL), (VH)-(VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL), (VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL)-(VH)-(VL)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 26의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 25의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 28의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 27의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 30의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 29의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 32의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 31의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 둘 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 사이에 위치하는 링커를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포외 항원 결합 도메인은 막 관통 도메인과 연결되는 힌지 영역(hinge region)을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG4, 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 IgG1 힌지 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 IgG4 힌지 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 CD8α 힌지 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 막 관통 도메인은 CD8 알파 또는 CD28의 막 관통 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD8 알파 막 관통 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CD28 막 관통 영역은 서열번호 43의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 CD28, DAP10, 또는 CD137(4-1BB)의 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD28 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
상기 DAP10 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
상기 CD137(4-1BB) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 세포내 주요 신호 전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD3 제타(ζ) 세포내 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및/또는 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및/또는 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인을 연결하는 상기 링커는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드이다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 신호 펩티드(signal peptide)를 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 CD16, GM-CSF, 인간 IgG, 또는 CD8의 신호 펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD16의 신호 펩티드는 서열번호 33의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 GM-CSF의 신호 펩티드는 서열번호 34의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 인간 IgG의 신호 펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 CD8의 신호 펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 상술한 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL); CD8α 힌지 영역; CD28 막 관통 영역; CD137(4-1BB) 보조 자극 신호전달도메인; 및 CD3 제타(ζ) 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예를 참조하여 본 발명의 보다 구체적인 키메라 항원 수용체를 구성하는 폴리펩티드의 구성은 도 1b로 표현될 수 있으나, 본 발명의 키메라 항원 수용체가 도 1b의 구성으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 폴리뉴클레오타이드로서, DNA 및 RNA를 포함하는 의미이고, 상기 DNA는 gDNA(genomic DNA) 및 cDNA(complementary DNA)를 포함하고, 상기 RNA는 mRNA (messenger RNA)을 포함한다. 상기 mRNA는 본 발명의 키메라 항원 수용체의 번역(translation)을 지시할 수 있는 핵산 분자로서 프라이머리 전사 mRNA(primary transcript mRNA) 분자 또는 성숙 mRNA (mature mRNA) 분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자의 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 얻을 수 있으며, 핵산 분자의 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 제공되는 서열 및 상업적 핵산 분자 합성기를 이용하여 목적하는 서열의 핵산 분자를 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 클로닝 벡터 또는 상기 키메라 항원 수용체를 안정적으로 발현하는 발현 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 복제원점(origin of replication)을 포함할 수 있으며, 예컨대 진핵세포에서 작동하는 f1 복제원점, SV 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터에서 상술한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자는 이의 발현을 개시하는 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, EF-1 alpha 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있고, 전사 종결서열로서 폴리아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 벡터 또는 재조합 벡터는 트랜스포존 벡터, 에피솜 벡터, 또는 바이러스 벡터이다.
다른 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스2(HIV-2), 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍바이러스(SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 세포, 또는 상기 설명된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명에서 벡터는 세포내로 도입될 수 있다. 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
세포내로 도입된 벡터는 세포내에서 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA의 일부분으로 통합될 수 있다.
본 발명의 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(폴리뉴클레오티드)를 포함하는 벡터를 포함하는 세포는, 상기 키메라 항원 수용체를 세포내에서 안정적으로 발현하고, 발현된 키메라 항원 수용체는 세포막 부위에 안정적으로 위치한다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, cDNA 또는 mRNA 분자)를 포함하는 세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 전사 및 번역(translation)을 지시할 수 있는 cDNA가 포함된 세포는 키메라 항원 수용체를 세포 내에서 안정적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 번역을 지시할 수 있는 프라이머리 전사 mRNA(primary transcript mRNA), 또는 성숙 mRNA (mature mRNA)를 직접 세포 내로 도입하여 키메라 항원 수용체의 세포 내 발현을 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 벡터가 도입되는 세포는 면역세포이고, 바람직하게는 NK (Natural Killer) 세포, T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포 또는 조절 (regulatory) T 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 “T 세포”는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(CD4+ 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3를 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다.
본 발명에서 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)로서, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT 및 NK101를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 세포의 약학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "약학적 조성물"은 세포 또는 동물에게 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방식과 함께 투여하기 위한 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액 중에 제형화된 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서, "약학적 유효량" 이라는 용어는 임상 결과를 비롯하여 이롭거나 목적하는 예방학적 또는 치료학적 결과를 성취하기 위한 유전자 변형된 치료학적 세포, 예를 들어 NK 세포의 "유효한 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품 의약품 안전청에서 인간 또는 가축에 사용하기에 허용 가능한 것으로서 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 윤활제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 약학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화 아연; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무-발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약제학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "약학적으로 허용되는"은 사람 또는 동물에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).
일 구현예에서, 본 발명 조성물의 치료 대상인 B 세포 관련 질환은 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)이다.
일 구현예에서, 상기 B 세포 관련 질환은 B 세포 악성 종양이다.
일 구현예에서, 상기 B 세포 악성 종양은 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종이다.
본 명세서에서 설명된 하기의 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실시예 1. BCMA-CAR의 제작
BCMA-CAR의 디자인
BCMA에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로부터 유래한 scFv 부위를 포함하는 3세대 키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 디자인하였다(도 1).
본 발명의 CAR는 다음과 같이 (i) 신호 펩타이드; (ii) BCMA 인식 및 결합 도메인; (iii) 힌지 영역; (iv) 막 관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인으로서 (v) CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인, 및 (vi) 두 개의 보조 자극 도메인으로 구성된, 제3 세대 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
상기 CAR를 구성할 수 있는 각각의 도메인 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
서 열 정 보 설명 서열번호
MWQLLLPTALLLLVSA CD16 신호 펩타이드 33
MWLQSLLLLGTVACSIS GM-CSF 신호 펩타이드 34
MDWTWRILFLVAAATGAHS 인간 IgG 신호 펩타이드 35
MALPVTALLLPLALLLHAARP CD8 신호 펩타이드 36
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL scFv의 VL
(경쇄가변영역 1) 		25
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCQGDSLRSYYVNWYQQLPGTAPKLLIYDHSKRPTGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVLG scFv의 VL
(경쇄가변영역 2) 		27
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDIDDDINWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSLRTPITFGQGTKLEIKR scFv의 VL (경쇄가변영역 3) 29
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGIDSYVAWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNSWPITFGQGTKLEIKR scFv의 VL (경쇄가변영역 4) 31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPSDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPFANKYRQFDYWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 1) 26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGVHWVRQAPGKGLEWVSYISYSGGTYYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDDFGFDYWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 2) 28
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGLSWVRQAPGKGLEWVSLIDSSGSSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEHGLFDSWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 3) 30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGHYWSWVRQAPGKGLEWVSTVSGSGGDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHSVMDVWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 4) 32
GSTSGSGKPSGEGSTKG 링커 펩타이드 1
Whitlow Linker		 37
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
EPKSCDKTHTCPPCP IgG1 알파 힌지 영역 39
ESKYGPPCPSCP IgG4 알파 힌지 영역 40
ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLD CD8 알파 힌지 영역 41
AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEE CD8 알파 막 관통 도메인 42
KPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 막 관통 도메인 43
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 보조 자극 도메인 44
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG DAP10 보조 자극 도메인 45
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD137 보조 자극 도메인 46
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3제타 신호전달 도메인 47
4종류의 BCMA-CAR의 설계
구체적으로, 제작하여 실험에 사용한 BCMA-CAR의 각각의 도메인은 다음과 같이 설계하였다: (i) CD16 신호 펩타이드(signal peptide); (ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv (single chain variant fragment)의 중쇄가변영역(VH), 경쇄가변영역(VL) 및 상기 VH 와 VL를 연결하는 링커를 포함하는 폴리펩티드; (iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드; (iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드; (v) CD28의 세포내 도메인(보조 자극 도메인), 링커(GGGGS), CD137의 세포내 도메인(보조 자극 도메인), 링커(GGGS), CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인(보조 자극 도메인) 폴리펩티드로 구성하였다. 도 1b에 본 발명의 BCMA-CAR의 구조를 도식화하여 나타내었다.
BCMA-CAR1의 제조
BCMA-CAR1은 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 26) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 25);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR1의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (110 aa):
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL (서열번호 25)
L-CDR1 : SGSSSNIGSNSVS (서열번호 1)
L-CDR2 : ADSKRPS (서열번호 2)
L-CDR3 : GSWDYSLSGYV (서열번호 3)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (121 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPSDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPFANKYRQFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 26)
H-CDR1 : NYDMS (서열번호 4)
H-CDR2 : WIYPSDSSIYYADSVKG (서열번호 5)
H-CDR3 : RGPFANKYRQFDY (서열번호 6)
BCMA-CAR1의 전체 아미노산 서열은 서열번호 48에 나타내었다.
BCMA-CAR2의 제조
BCMA-CAR2는 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 28) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 27);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR2의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (107 aa):
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCQGDSLRSYYVNWYQQLPGTAPKLLIYDHSKRPTGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVLG (서열번호 27)
L-CDR1 : QGDSLRSYYVN (서열번호 7)
L-CDR2 : DHSKRPT (서열번호 8)
L-CDR3 : QSYDSSTV (서열번호 9)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (117 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGVHWVRQAPGKGLEWVSYISYSGGTYYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDDFGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 28)
H-CDR1 : NYGVH (서열번호 10)
H-CDR2 : YISYSGGTYYNPSLKS (서열번호 11)
H-CDR3 : RDSDDFGFDY (서열번호 12)
BCMA-CAR2의 전체 아미노산 서열은 서열번호 49에 나타내었다.
BCMA-CAR3의 제조
BCMA-CAR3은 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 30) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 29);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR3의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (108 aa):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDIDDDINWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSLRTPITFGQGTKLEIKR (서열번호 29)
L-CDR1 : KASQDIDDDIN (서열번호 13)
L-CDR2 : DASLRAT (서열번호 14)
L-CDR3 : QQSLRTPI (서열번호 15)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (121 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGLSWVRQAPGKGLEWVSLIDSSGSSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEHGLFDSWGQGTLVTVSS (서열번호 30)
H-CDR1 : DYGLS (서열번호 16)
H-CDR2 : LIDSSGSSTFYADSVKG (서열번호 17)
H-CDR3 : KEHGLFDS (서열번호 18)
BCMA-CAR3의 전체 아미노산 서열은 서열번호 50에 나타내었다.
BCMA-CAR4의 제조
BCMA-CAR4는 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 32) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 31);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR4의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (108 aa):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGIDSYVAWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNSWPITFGQGTKLEIKR (서열번호 31)
L-CDR1 : RASQGIDSYVA (서열번호 19)
L-CDR2 : DASLRAT (서열번호 20)
L-CDR3 : QQYNSWPI (서열번호 21)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (116 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGHYWSWVRQAPGKGLEWVSTVSGSGGDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHSVMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 32)
H-CDR1 : GHYWS (서열번호 22)
H-CDR2 : TVSGSGGDTFYADSVKG (서열번호 23)
H-CDR3 : RGHSVMDV (서열번호 24)
BCMA-CAR4의 전체 아미노산 서열은 서열번호 51에 나타내었다.
상기 구성으로 이루어진 BCMA-CAR의 폴리펩타이드 서열을 동물 세포에서의 단백질 발현에 적합하도록 코돈 최적화(Codon optimization)하여 핵산 서열로 변환하고 EF1a 프로모터를 포함하는 트랜스포존 벡터인 pSBbi-Neo(Addgene, Catalog No. 60525)에 클로닝하여 사용하였다.
실시예 2: BCMA-CAR NK 세포의 제조
4종의 BCMA-CAR 발현 NK 세포의 제조
실시예 1에서 제작한 4종류의 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR) 코딩 핵산 서열(유전자) BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4가 클로닝된 pSBbi-Noe 벡터를 NK-92 세포에 슬리핑 뷰티(Sleeping beauty) 전이효소(transposase) 발현 벡터인 pCMV(CAT)T7-SB100(Addgene, Catalog No. 34879)와 함께 Lonza사의 Nucleofector와 Cell line Nucleofector Kit를 이용한 전기천공법을 수행하여 4종의 BCMA-CAR NK 세포 CGT301, CGT302, CGT303, CGT304를 각각 제조하였다.
한편, BMCA-ADC(GSK2857916, BLENREP)의 J6MO 항체 서열 기반의 scFv를 포함하는 동일 구조의 CAR를 참조(Reference)로 사용하여 비교군 NK 세포(Ref)를 제조하였다.
형질전환 후 세포는 12.5 % FBS, 12.5 % Horse serum, 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 1 % penicillin/streptomycin, IL-2 100 IU/ml이 포함된 α-MEM 배지에서 48시간 안정화시킨 다음 200μg/ml 농도의 카나마이신 (Kanamycin)을 2주 이상 처리함으로써 BCMA-CAR 유전자를 발현하는 NK-92 세포만을 선별(selection) 하였다.
이와 같이 제작한 BCMA-CAR NK 세포들을 먼저, 항-phospho-CD3ζ 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 방법으로 NK 세포에서 BCMA-CAR의 발현을 확인하였다(도 2). 또한, 인간 IgG(ab')2 항체 또는 Hig tag conjugated-BCMA 재조합 단백질과 PE-conjugated His 항체를 사용한 유세포 분석 방법(flow cytometry)으로 NK 세포 표면에서의 BCMA-CAR 발현을 확인하였다(도 3).
실시예 3: BCMA-CAR 발현 NK세포의 인 비트로(in vitro) 유효성 평가
BCMA-CAR NK의 다발골수종 암세포에 대한 세포 사멸 효과
상기 실시예 2에서 제작한 4종의 BCMA-CAR NK 세포의 다발골수종에 대한 선택성 및 반응성을 평가하기 위해, BCMA-CAR NK 세포를 H929, MM1.R, OPM-2를 비롯한 다발골수종 세포 및 K562, Jurkat의 다른 암세포와 반응시킨 후, 세포독성 시험 (cytotoxicity assay)과 Granzyme B, 및 IFNγ의 분비량을 확인하였다. 그 결과, BCMA를 발현하지 않는 K562, Jurkat 등의 암세포주에 대해서는 BCMA-CAR NK 세포의 반응성이 대조군(Ctrl)인 NK 세포(NKvec)와 차이가 없는 반면, H929, MM1.R, OPM-2와 같이 BCMA 발현양이 높은 다발골수종 세포주에 대해서는 BCMA-CAR NK 세포의 세포 사멸능이 비교군인 NK 세포(NKvec)에 비해 3-4배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4a). 이러한 BCMA-CAR NK의 특이적인 다발골수종 암세포 사멸 효과는 IFNγ 및 Granzyme B의 분비량 증가에 의한 것임을 확인할 수 있었다(도 4b, 도 4c).
K562-BCMA 타겟 세포주의 제작
상기 실시예 1에서 설계한 BCMA-CAR의 BCMA 항원 특이적 효능을 평가하기 위하여 먼저 각기 다른 종(species) 유래 BCMA 항원을 발현하는 타겟 세포주를 제작하였다. BCMA가 발현되지 않는 K562 암세포에 인간(h), 원숭이(Rh) 또는 쥐(Ms), 랫드(Rat) 유래 BCMA 말단에 myc을 발현하는 BCMA 유전자를 각각 도입하고 유세포 분석(Flow cytometry)과 웨스턴 블로팅 방법으로 그 발현을 확인하였다(도 5).
4종류 BCMA-CAR의 BCMA 항원특이성 분석
상기 실시예 1에서 제작한 4 종류의 BCMA-CAR의 항원특이성을 분석하기 위해 인간(hu1, hu2), 원숭이(Rh), 마우스(Ms) 및 랫드(Rat) 유래 BCMA를 발현하는 K562(K562-BCMA) 세포주 또는 K562 모세포와 BCMA-CAR1 NK, BCMA-CAR2 NK, BCMA-CAR3 NK, BCMA-CAR4 NK 세포들을 서로 반응시킨 후, 세포독성 시험(Cytotoxicity assay)을 수행하고 Granzyme B, IFNγ의 분비량을 분석하였다.
BCMA-CAR1을 발현하는 BCMA-CAR1 NK 세포는 인간 유래 BCMA에만 특이적으로 활성을 나타냈으며, 각각 BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4을 발현하는 NK 세포들은 인간 이외의 BCMA 항원에 대해서 반응성을 나타냈다(도 6a 및 도 6b). 한편, 참조(Reference)로 사용한 GSK사의 BCMA 항체(J6MO) 유래 BCMA-CAR(Ref)는 BCMA-CAR-2, BCMA-CAR-3, BCMA-CAR-4와 유사한 반응성을 보여주었다.
실시예 4: BCMA-CAR NK 세포의 BCMA 특이적 세포 사멸 효과 검증
BCMA 재조합 단백질을 이용한 BCMA-CAR NK의 BCMA 특이적 활성 확인
BCMA-CAR1 NK 세포가 나타내는 활성이 BCMA 특이적인 반응인지 확인하기 위하여, rhBCMA를 이용한 경쟁 분석(competition assay)을 수행하였다. 먼저, BCMA-CAR NK 세포(4 x 104 cells)에 1 μg의 rhBCMA 단백질을 넣어주고 1시간 동안 사전-인큐베이션(pre-incubation)을 행한 후에 타겟 세포로 인간 BCMA를 과발현하는 K562 세포인 K562-BCMA 세포(aK562, 4 x 104 cells)를 추가하여 4시간 반응시킨 후, 세포 독성(cytotoxicity)을 확인하였다. 그 결과, rhBCMA 단백질이 존재할 경우 BCMA-CAR NK 세포의 암세포 살해능이 약 40% 감소함을 확인하였다(도 7).
BCMA 항체를 이용한 BCMA-CAR NK의 BCMA 특이적 활성 확인
또한, BCMA의 발현이 높은 것으로 확인된 다발골수종 세포인 OPM-2를 타겟 암세포로 이용하여 OPM-2 세포(4 x 104 cells)에 30 μg의 anti-BCMA mAb(J6M0)을 넣어주고 1시간 동안 사전-인큐베이션(pre-incubation)을 행한 후 BCMA-CAR1 NK 세포(4 x 104 cells)를 추가하여 4시간 반응 후 세포 독성(cytotoxicity)을 확인하였다. 그 결과, BCMA 항체(anti-BCMA mAb)가 존재하에서는 BCMA-CAR NK 세포의 OPM-2 다발골수종 세포 살해능이 약 50% 정도 억제되었고, 이와 유사하게 Granzyme B의 분비량도 50% 정도 감소하였으며, 특히 IFNγ의 분비량은 1/20로 감소하였다(도 8). 이러한 실험결과는 다발골수종 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 항원인 BCMA와 NK 세포 표면에 발현하는 BCMA-CAR1 수용체와의 결합에 의한 BCMA-CAR NK 세포의 BCMA 특이적 항암 활성에 의한 것이다.
실시예 5: BCMA-CAR NK 세포의 인 비보(in vivo) 항암 효능 평가
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(Jackson Laboratory, Jax #00557 strain)를 사용한 이종이식(xenograft) 동물 모델에서 BCMA-CAR1을 발현하는 BCMA-CAR NK 세포의 항암 효능을 평가하였다.
BCMA 발현이 높은 다발골수종 세포주 H929를 피하 이식한 후 종양 크기가 150 mm3에 도달했을 때(10 days post implantation), 무작위로 그룹당 5 마리씩 분류하였고 5 일에 한 번씩, 총 3회 BCMA-CAR NK 세포 또는 대조군(control) NK 세포(NKvec)를 1 x 107 cells씩 미정맥 투여(i.v.) 하였다. 이때 다발골수종 환자의 치료제로 사용되고 있는 프로테아솜 억제제인 벨케이드(Velcade®, 성분명 Bortezomib)와 항체 치료제인 다잘렉스(Darzalex®, 성분명 Daratumumab)를 대조 약물로 이용하였으며, 벨케이드®(Vel)과 다잘렉스®(Dara)는 각각 0.5 mg/kg의 농도로 3~4 일에 한 번씩, 총 5회 복강투여(i.p.) 하였다.
시험 17일째의 종양 크기를 비교해 본 결과, BCMA-CAR NK 세포를 투여한 시험군(BCMA-CAR1 NK)에서는 치료 전의 종양 크기 대비 20배가 증가한 반면, 비처리군(Vehicle) 에서는 26배 증가하였고, 치료용 유전자를 발현하지 않는 NK 세포(NKctrl)를 처리한 군에서는 25배 증가하였다. 시험 종료일(17일)에 비처리군(Vehicle) 대비 각 치료군의 종양 성장 억제능(growth inhibition rate; GIR(%))을 비교한 결과, BCMA-CAR NK 세포를 투여한 시험군(BCMA-CAR1 NK)에서는 25%의 종양 성장 억제 효능을 보여준 반면, 대조군(Control) NK 세포를 투여한 군(NKctrl)에서는 6%, 벨케이드®를 투여한 군(Vel)에서는 39%, 다잘렉스®를 투여한 군(Dara)에서는 23%의 종양 성장 억제 효과를 보여주었다(도 9). MM의 1차 치료제로 사용되고 있는 벨케이드는 항암 효능이 39%로 뛰어난 반면 체중감소 등의 독성을 나타냈으며, BCMA-CAR NK 세포는 독성 없이 항체 치료제인 다잘렉스와 유사한 수준의 항암 효능을 보여주었다.
실시예 6: BCMA-CAR NK 세포의 특성 분석
BCMA-CAR NK 세포의 특성 분석을 위해 60일간 지속적으로 배양하면서 세포 생존능(cell viability), 증식(proliferation), CAR 발현, 세포활성(cytotoxicity) 등을 평가하였다. 그 결과, BCMA-CAR NK 세포에서의 CAR 발현은 60일이 지나도 95% 이상이 유지되었으며, 2일에 3배씩 증식하였으며, BCMA 항원을 발현하는 암세포를 살해하는 세포 독성(cytotoxicity)도 60% 이상으로 일정하게 유지되었다. 본 발명의 BCMA-CAR NK 세포는 세포의 증식뿐만 아니라 CAR 발현 및 세포활성도 60일 이상 안정적으로 유지되는 특성을 확인하였다(도 10a 내지 도 10d).

Claims (31)

  1. 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR):
    (i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
    (ii) 막 관통 도메인;
    (iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
    (iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은,
    (i) L-CDR(complementarity determining region)1, L-CDR2, 및 L-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL);
    (ii) H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH); 또는
    (iii) 하나 이상의 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나 이상의 상기 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 L-CDR1은 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 13, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 L-CDR2은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 14, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 L-CDR3은 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR1은 서열번호 4, 서열번호 10, 서열번호 16, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR2은 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 17, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR3은 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열의 폴리펩티드인 것인, 키메라 항원 수용체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
    서열번호 4의 H-CDR1, 서열번호 5의 H-CDR2, 및 서열번호 6의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 1의 L-CDR1, 서열번호 2의 L-CDR2, 및 서열번호 3의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL);
    서열번호 10의 H-CDR1, 서열번호 11의 H-CDR2, 및 서열번호 12의 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 L-CDR1, 서열번호 8의 L-CDR2, 및 서열번호 9의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL);
    서열번호 16의 H-CDR1, 서열번호 17의 H-CDR2, 및 서열번호 18의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 13의 L-CDR1, 서열번호 14의 L-CDR2, 및 서열번호 15의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    서열번호 22의 H-CDR1, 서열번호 23의 H-CDR2, 및 서열번호 24의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 19의 L-CDR1, 서열번호 20의 L-CDR2, 및 서열번호 21의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
    (i) 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 및 서열번호 31의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (ii) 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 중 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 사이에 위치하는 링커를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 막 관통 도메인에 연결되는 힌지 영역(hinge region)을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG4, 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 IgG1 힌지 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 IgG4 힌지 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD8α 힌지 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열의 폴리펩티드인 것인, 키메라 항원 수용체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 CD8 알파 또는 CD28의 막 관통 영역을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 CD8 알파 막 관통 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고, 상기 CD28 막 관통 영역은 서열번호 43의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 CD28, DAP10, 또는 CD137(4-1BB)의 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 CD28 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 DAP10 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD137(4-1BB) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 CD3 제타(ζ) 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인, 키메라 항원 수용체.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 신호 펩티드(signal peptide)를 더 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 신호 펩티드는 CD16, GM-CSF, 인간 IgG, 또는 CD8의 신호 펩티드를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 CD16의 신호 펩티드는 서열번호 33의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 GM-CSF의 신호 펩티드는 서열번호 34의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 인간 IgG의 신호 펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD8의 신호 펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자.
  24. 제 23 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  25. 제 23 항의 핵산 분자 또는 제 24 항의 벡터를 포함하는 세포.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인 것인, 세포.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 면역세포는 NK (Natural Killer) 세포 또는 T 세포인, 세포.
  28. (i) 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 세포의 약학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환은 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)인, 약학적 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환은 B 세포 악성 종양인 것인, 약학적 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 B 세포 악성 종양은 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종인, 약학적 조성물.
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