KR20210103962A - B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B세포 성숙화 항원(BCMA)를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포는 B세포 관련 질환 특히 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

B세포 성숙화 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도{Chimeric Antigen Receptor Targeting B Cell Maturation Antigen and Uses Thereof}
본 발명은 B세포 성숙화 항원(BCMA)를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
다발성 골수종(multiple myeloma) 또는 형질세포골수종(plasma cell myeloma)은 일반적으로 항체를 생성하는 역할을 담당하는 백혈구의 일종인 형질 세포의 암이다. 다발성 골수종 환자에서는 정상적인 형질세포가 비정상적인 암세포인 골수종 세포로 변형되어 빠르게 증식한다. 손상된 골수종세포가 골수에 점차 많은 양의 악성 골수종세포를 만들어내며, 이러한 과정은 몸의 정상적인 면역체계를 파괴한다.
다발성 골수종에 대한 치료는 멜팔란(Melphalan), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 부신피질호르몬제(Steroid), 볼테죠밉/벨케이드(Bortezomib/velcade), 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리도마이드(Lenalidomide)와 같은 항암제 치료, 방사선 치료, 조혈모세포이식 및 수술적 치료 등이 있다.
키메라 항원 수용체 T 세포(Chimeric antigen receptor T cell, CAR T 세포)는 면역요법에 사용하기 위해 가공의 T 세포 수용체를 만들기 위해 유전학적으로 조작된 T 세포이다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포에 특정 단백질을 대상으로 하는 새로운 기능을 부여하도록 조작된 수용체 단백질이다. 키메라 항원 수용체는 외부도메인(ecto domain), 막통과도메인(transmembrane domain) 및 내부도메인(endo domain)으로 구성되어 있고, 세포에 활성화 신호를 전달하는 내부도메인의 구성에 따라, 1세대, 2세대, 3세대 및 4세대로 진화하고 있다.
TNFRSF17(tumor necrosis factor receptor superfamily 17)의 일원에 속하는 막통과 당단백질인 B세포 성숙화 항원(BCMA, B cell maturation antigen)은 환자의 다발성 골수종(Multiple Myeloma, MM) 세포에서 상당히 높은 수준으로 발현된다. 또한, BCMA는 악성 B 세포, 호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병과 같은 B 림프구를 수반하는 여러 암에서 발현된다.
BCMA는 임상시험에서 유의한 치료 효과를 보여준 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포가 표적으로 삼는 항원이다. 또한, 최근 최초의 항-BCMA 항체-약물 컨쥬게이트(anti-BCMA antibody-drug conjugate)도 항-CD38 항체, 프로테오좀(proteosome) 억제제 및 면역조절제와 같은 치료제로 치료 효과가 미약하였던 환자에게서 의미있는 임상 결과를 얻었다. 그러나, 현재까지 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 NK 세포의 개발 및 연구는 많은 진전이 이루어지지 않고 있다.
PCT/US2015/041722 PCT/US2015/064269 PCT/IB2016/051808 PCT/CN2017/096938
본 발명은 BCMA를 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR) 항-BCMA CAR를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 인코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하여 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 포함하는 B세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포의 B세포 관련 질환의 치료 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 항-BCMA CAR를 발현하는 세포를 이용한 B세포 관련 질환의 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다:
(i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
(ii) 막 관통 도메인;
(iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
(iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 세포의 약학적 유효량을 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포는 B세포 관련 질환 특히 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a은 본 발명의 일 구현예에 따른 BCMA-키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 보여준다. SP는 신호 펩티드, TM은 막 관통 도메인(transmembrane domain), CS1-ICD은 세포내 보조 자극 신호전달 도메인-1(costimulatory 1-intracellular signaling domain); CS2-ICD은 세포내 보조 자극 신호전달 도메인-2(costimulatory 2-intracellular signaling domain)이다.
도 1b은 본 발명의 일 실시예에 따른 BCMA-CAR의 구조를 보다 구체적으로 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 항-phospho-CD3ζ 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 방법으로 NK세포에 도입된 BCMA-CAR의 발현을 확인한 결과이다. CGT301, CGT302, CGT303, 및 CGT304는 각각 본 발명의 BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4를 형질 도입한 NK 세포이다.
도 3은 인간 IgG(ab')2 항체 및 Hig tag conjugated-BCMA 재조합 단백질과 PE-conjugated His 항체를 사용한 유세포 분석 방법(flow cytometry)으로 NK 세포 표면에서의 BCMA-CAR 발현을 확인한 결과이다.
도 4a는 BCMA-CAR NK 세포들의 암세포 살해능을 측정한 결과이고, 도 4b는 BCMA-CAR NK 세포들의 IFNγ 분비양을 측정한 결과이며, 도 4c는 BCMA-CAR NK 세포들의 Granzyme B의 분비양을 측정한 결과이다.
도 5는 BCMA가 발현되지 않는 K562 암세포에 인간(h), 원숭이(Rh) 또는 쥐(Ms), 랫드(Rat)유래 BCMA 유전자를 각각 도입하고 그 발현을 확인한 결과이다.
도 6a 및 도 6b은 인간(hu1, hu2), 원숭이(Rh), 마우스(Ms) 및 랫드(Rat) 유래 BCMA에 대한, 본 발명의 BCMA-CAR의 항원특이성을 확인한 결과이다.
도 7은 BCMA-CAR NK 세포의 활성이 BCMA 특이적인 반응인지를 rhBCMA 단백질과의 경쟁분석(competition assay)을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 BCMA-CAR NK 세포의 활성이 BCMA 특이적인 반응인지를 BCMA mAb를 이용한 경쟁분석(competition assay)을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 BCMA-CAR NK 세포의 인 비보(in vivo) 항암 효능을 측정한 결과이다.
도 10a 내지 도 10d는 BCMA-CAR NK세포의 안정성를 확인한 결과로서, 도 10a는 세포 생존능을 측정한 결과이고, 도 10b는 Population doubling time을 측정한 결과이며, 도 10c는 BCMA-CAR 발현을 측정한 결과이며, 도 10d는 세포독성을 측정한 결과이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다:
(i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
(ii) 막 관통 도메인;
(iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
(iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 (i) L-CDR(complementarity determining region)1, L-CDR2, 및 L-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL);
(ii) H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH); 또는
(iii) 하나 이상의 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나 이상의 상기 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 구성물이 생리적 조건 하에서 항원과 비교적 안정한 복합체를 형성한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 은 항체를 항원에 결합시키는 것에 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)).
중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에는 각각 3개의 CDR (중쇄: H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3; 경쇄: L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 하나 이상 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 하나 이상의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, (VL), (VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)을 포함할 수 있고, 또한, (VH), (VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 하나의 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있고, (VL)-(VH)와 같이 연결된 형태이거나, 그 반대 방향인 (VH)-(VL)와 같이 연결된 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 하나 또는 두개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태; 또는 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 두 개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있다.
예를 들어, (VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합도메인은 두개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)에 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)이 연결된 형태; 또는 하나 또는 두개 이상의 경쇄 가변 영역(VL)에 두 개 이상의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 번갈아 가며 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VL)-(VH), (VH)-(VL)-(VH)-(VL), (VH)-(VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL), (VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL)-(VH)-(VL)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서,
상기 L-CDR1은 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 13, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 L-CDR2은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 14, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 L-CDR3은 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR1은 서열번호 4, 서열번호 10, 서열번호 16, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR2은 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 17, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
상기 H-CDR3은 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열의 폴리펩티드이다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 4의 H-CDR1, 서열번호 5의 H-CDR2, 및 서열번호 6의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 1의 L-CDR1, 서열번호 2의 L-CDR2, 및 서열번호 3의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 10의 H-CDR1, 서열번호 11의 H-CDR2, 및 서열번호 12의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 7의 L-CDR1, 서열번호 8의 L-CDR2, 및 서열번호 9의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 16의 H-CDR1, 서열번호 17의 H-CDR2, 및 서열번호 18의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 13의 L-CDR1, 서열번호 14의 L-CDR2, 및 서열번호 15의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 22의 H-CDR1, 서열번호 23의 H-CDR2, 및 서열번호 24의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 19의 L-CDR1, 서열번호 20의 L-CDR2, 및 서열번호 21의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
(i) 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 및 서열번호 31의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 및
(ii) 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 중 하나 또는 둘 이상을 포함한다.
본 발명에서 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 조합은 상술한 조합과 같다.
구체적으로, 하나 이상 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 하나 이상의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, (VL), (VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), 또는 (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL)을 포함할 수 있고, 또한, (VH), (VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
또한, 하나의 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나의 중쇄 가변 영역(VH)이 연결된 형태를 포함할 수 있고, (VL)-(VH)와 같이 연결된 형태이거나, 그 반대 방향인 (VH)-(VL)와 같이 연결된 형태일 수 있다.
또한, (VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VH)-(VH)-(VH), 또는 (VL)-(VH)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있으며,
또한, (VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VL)-(VL)-(VL)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL), (VH)-(VH)-(VH)-(VL)-(VL), (VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH), (VL)-(VL)-(VL)-(VL)-(VH)-(VH)-(VH)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 번갈아 가며 연결된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, (VH)-(VL)-(VH), (VH)-(VL)-(VH)-(VL), (VH)-(VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL), (VL)-(VH)-(VL)-(VH), (VL)-(VH)-(VL)-(VH)-(VL)의 형태를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 26의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 25의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 28의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 27의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 30의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 29의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 32의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 31의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 둘 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 사이에 위치하는 링커를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포외 항원 결합 도메인은 막 관통 도메인과 연결되는 힌지 영역(hinge region)을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG4, 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 IgG1 힌지 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 IgG4 힌지 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 CD8α 힌지 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 막 관통 도메인은 CD8 알파 또는 CD28의 막 관통 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD8 알파 막 관통 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CD28 막 관통 영역은 서열번호 43의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 CD28, DAP10, 또는 CD137(4-1BB)의 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD28 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
상기 DAP10 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
상기 CD137(4-1BB) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 세포내 주요 신호 전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD3 제타(ζ) 세포내 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및/또는 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및/또는 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인을 연결하는 상기 링커는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드이다.
일 구현예에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 신호 펩티드(signal peptide)를 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 CD16, GM-CSF, 인간 IgG, 또는 CD8의 신호 펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 CD16의 신호 펩티드는 서열번호 33의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 GM-CSF의 신호 펩티드는 서열번호 34의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 인간 IgG의 신호 펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하고; 상기 CD8의 신호 펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 상술한 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL); CD8α 힌지 영역; CD28 막 관통 영역; CD137(4-1BB) 보조 자극 신호전달도메인; 및 CD3 제타(ζ) 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예를 참조하여 본 발명의 보다 구체적인 키메라 항원 수용체를 구성하는 폴리펩티드의 구성은 도 1b로 표현될 수 있으나, 본 발명의 키메라 항원 수용체가 도 1b의 구성으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 폴리뉴클레오타이드로서, DNA 및 RNA를 포함하는 의미이고, 상기 DNA는 gDNA(genomic DNA) 및 cDNA(complementary DNA)를 포함하고, 상기 RNA는 mRNA (messenger RNA)을 포함한다. 상기 mRNA는 본 발명의 키메라 항원 수용체의 번역(translation)을 지시할 수 있는 핵산 분자로서 프라이머리 전사 mRNA(primary transcript mRNA) 분자 또는 성숙 mRNA (mature mRNA) 분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자의 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 얻을 수 있으며, 핵산 분자의 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으므로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 제공되는 서열 및 상업적 핵산 분자 합성기를 이용하여 목적하는 서열의 핵산 분자를 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 클로닝 벡터 또는 상기 키메라 항원 수용체를 안정적으로 발현하는 발현 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 복제원점(origin of replication)을 포함할 수 있으며, 예컨대 진핵세포에서 작동하는 f1 복제원점, SV 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터에서 상술한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자는 이의 발현을 개시하는 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, EF-1 alpha 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있고, 전사 종결서열로서 폴리아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 벡터 또는 재조합 벡터는 트랜스포존 벡터, 에피솜 벡터, 또는 바이러스 벡터이다.
다른 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스2(HIV-2), 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍바이러스(SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 세포, 또는 상기 설명된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명에서 벡터는 세포내로 도입될 수 있다. 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
세포내로 도입된 벡터는 세포내에서 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA의 일부분으로 통합될 수 있다.
본 발명의 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(폴리뉴클레오티드)를 포함하는 벡터를 포함하는 세포는, 상기 키메라 항원 수용체를 세포내에서 안정적으로 발현하고, 발현된 키메라 항원 수용체는 세포막 부위에 안정적으로 위치한다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, cDNA 또는 mRNA 분자)를 포함하는 세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 전사 및 번역(translation)을 지시할 수 있는 cDNA가 포함된 세포는 키메라 항원 수용체를 세포 내에서 안정적으로 발현할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 번역을 지시할 수 있는 프라이머리 전사 mRNA(primary transcript mRNA), 또는 성숙 mRNA (mature mRNA)를 직접 세포 내로 도입하여 키메라 항원 수용체의 세포 내 발현을 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 벡터가 도입되는 세포는 면역세포이고, 바람직하게는 NK (Natural Killer) 세포, T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포 또는 조절 (regulatory) T 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 “T 세포”는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(CD4+ 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3를 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다.
본 발명에서 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)로서, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT 및 NK101를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 설명된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 세포의 약학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "약학적 조성물"은 세포 또는 동물에게 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방식과 함께 투여하기 위한 약학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액 중에 제형화된 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서, "약학적 유효량" 이라는 용어는 임상 결과를 비롯하여 이롭거나 목적하는 예방학적 또는 치료학적 결과를 성취하기 위한 유전자 변형된 치료학적 세포, 예를 들어 NK 세포의 "유효한 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품 의약품 안전청에서 인간 또는 가축에 사용하기에 허용 가능한 것으로서 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 윤활제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 약학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화 아연; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무-발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약제학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "약학적으로 허용되는"은 사람 또는 동물에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).
일 구현예에서, 본 발명 조성물의 치료 대상인 B 세포 관련 질환은 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)이다.
일 구현예에서, 상기 B 세포 관련 질환은 B 세포 악성 종양이다.
일 구현예에서, 상기 B 세포 악성 종양은 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종이다.
본 명세서에서 설명된 하기의 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실시예 1. BCMA-CAR의 제작
BCMA-CAR의 디자인
BCMA에 특이적으로 결합하는 단일클론항체로부터 유래한 scFv 부위를 포함하는 3세대 키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 디자인하였다(도 1).
본 발명의 CAR는 다음과 같이 (i) 신호 펩타이드; (ii) BCMA 인식 및 결합 도메인; (iii) 힌지 영역; (iv) 막 관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인으로서 (v) CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인, 및 (vi) 두 개의 보조 자극 도메인으로 구성된, 제3 세대 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
상기 CAR를 구성할 수 있는 각각의 도메인 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
서열정보 설명 서열번호
MWQLLLPTALLLLVSA CD16 신호 펩타이드 33
MWLQSLLLLGTVACSIS GM-CSF 신호 펩타이드 34
MDWTWRILFLVAAATGAHS 인간 IgG 신호 펩타이드 35
MALPVTALLLPLALLLHAARP CD8 신호 펩타이드 36
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL scFv의 VL
(경쇄가변영역 1) 		25
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCQGDSLRSYYVNWYQQLPGTAPKLLIYDHSKRPTGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVLG scFv의 VL
(경쇄가변영역 2) 		27
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDIDDDINWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSLRTPITFGQGTKLEIKR scFv의 VL (경쇄가변영역 3) 29
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGIDSYVAWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNSWPITFGQGTKLEIKR scFv의 VL (경쇄가변영역 4) 31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPSDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPFANKYRQFDYWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 1) 26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGVHWVRQAPGKGLEWVSYISYSGGTYYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDDFGFDYWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 2) 28
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGLSWVRQAPGKGLEWVSLIDSSGSSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEHGLFDSWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 3) 30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGHYWSWVRQAPGKGLEWVSTVSGSGGDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHSVMDVWGQGTLVTVSS scFv의 VH (중쇄가변영역 4) 32
GSTSGSGKPSGEGSTKG 링커 펩타이드 1
Whitlow Linker		 37
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
EPKSCDKTHTCPPCP IgG1 알파 힌지 영역 39
ESKYGPPCPSCP IgG4 알파 힌지 영역 40
ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLD CD8 알파 힌지 영역 41
AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEE CD8 알파 막 관통 도메인 42
KPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 막 관통 도메인 43
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 보조 자극 도메인 44
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG DAP10 보조 자극 도메인 45
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD137 보조 자극 도메인 46
GGGGS 링커 펩타이드 2 38
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3제타 신호전달 도메인 47
4종류의 BCMA-CAR의 설계
구체적으로, 제작하여 실험에 사용한 BCMA-CAR의 각각의 도메인은 다음과 같이 설계하였다: (i) CD16 신호 펩타이드(signal peptide); (ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv (single chain variant fragment)의 중쇄가변영역(VH), 경쇄가변영역(VL) 및 상기 VH 와 VL를 연결하는 링커를 포함하는 폴리펩티드; (iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드; (iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드; (v) CD28의 세포내 도메인(보조 자극 도메인), 링커(GGGGS), CD137의 세포내 도메인(보조 자극 도메인), 링커(GGGS), CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인(보조 자극 도메인) 폴리펩티드로 구성하였다. 도 1b에 본 발명의 BCMA-CAR의 구조를 도식화하여 나타내었다.
BCMA-CAR1의 제조
BCMA-CAR1은 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 26) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 25);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR1의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (110 aa):
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL (서열번호 25)
L-CDR1 : SGSSSNIGSNSVS (서열번호 1)
L-CDR2 : ADSKRPS (서열번호 2)
L-CDR3 : GSWDYSLSGYV (서열번호 3)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (121 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSWIYPSDSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPFANKYRQFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 26)
H-CDR1 : NYDMS (서열번호 4)
H-CDR2 : WIYPSDSSIYYADSVKG (서열번호 5)
H-CDR3 : RGPFANKYRQFDY (서열번호 6)
BCMA-CAR1의 전체 아미노산 서열은 서열번호 48에 나타내었다.
BCMA-CAR2의 제조
BCMA-CAR2는 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 28) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 27);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR2의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (107 aa):
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCQGDSLRSYYVNWYQQLPGTAPKLLIYDHSKRPTGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSTVVFGGGTKLTVLG (서열번호 27)
L-CDR1 : QGDSLRSYYVN (서열번호 7)
L-CDR2 : DHSKRPT (서열번호 8)
L-CDR3 : QSYDSSTV (서열번호 9)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (117 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGVHWVRQAPGKGLEWVSYISYSGGTYYNPSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDDFGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 28)
H-CDR1 : NYGVH (서열번호 10)
H-CDR2 : YISYSGGTYYNPSLKS (서열번호 11)
H-CDR3 : RDSDDFGFDY (서열번호 12)
BCMA-CAR2의 전체 아미노산 서열은 서열번호 49에 나타내었다.
BCMA-CAR3의 제조
BCMA-CAR3은 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 30) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 29);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR3의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (108 aa):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDIDDDINWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSLRTPITFGQGTKLEIKR (서열번호 29)
L-CDR1 : KASQDIDDDIN (서열번호 13)
L-CDR2 : DASLRAT (서열번호 14)
L-CDR3 : QQSLRTPI (서열번호 15)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (121 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGLSWVRQAPGKGLEWVSLIDSSGSSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEHGLFDSWGQGTLVTVSS (서열번호 30)
H-CDR1 : DYGLS (서열번호 16)
H-CDR2 : LIDSSGSSTFYADSVKG (서열번호 17)
H-CDR3 : KEHGLFDS (서열번호 18)
BCMA-CAR3의 전체 아미노산 서열은 서열번호 50에 나타내었다.
BCMA-CAR4의 제조
BCMA-CAR4는 다음의 폴리펩티드 (i) 내지 (v)를 순차적으로 연결한 구성으로 제조하였다.
(i) CD16 신호 펩타이드(서열번호 33);
(ii) BCMA를 표적으로 하는 scFv의 중쇄가변영역(VH)(서열번호 32) - 링커 펩티드(GSTSGSGKPSGEGSTKG, 서열번호 37) - BCMA를 표적으로 하는 scFv의 경쇄가변영역(VL)(서열번호 31);
(iii) CD8α 힌지 영역(hinge region) 폴리펩티드(서열번호 41);
(iv) CD28의 막 관통 도메인(transmembrane domain) 폴리펩티드 (서열번호 43);
(v) CD28의 세포내 도메인(서열번호 44)- 링커(GGGGS) - CD137의 세포내 도메인(서열번호 46) - 링커(GGGGS) - CD3 제타(ζ) 세포내 도메인(서열번호 47)
BCMA-CAR4의 scFV의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 다음과 같다.
- Light chain variable region (VL) aa sequence (108 aa):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGIDSYVAWYQQKPGQAPRLLIYDASLRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNSWPITFGQGTKLEIKR (서열번호 31)
L-CDR1 : RASQGIDSYVA (서열번호 19)
L-CDR2 : DASLRAT (서열번호 20)
L-CDR3 : QQYNSWPI (서열번호 21)
- Heavy chain variable region (VH) aa sequence (116 aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGHYWSWVRQAPGKGLEWVSTVSGSGGDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHSVMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 32)
H-CDR1 : GHYWS (서열번호 22)
H-CDR2 : TVSGSGGDTFYADSVKG (서열번호 23)
H-CDR3 : RGHSVMDV (서열번호 24)
BCMA-CAR4의 전체 아미노산 서열은 서열번호 51에 나타내었다.
상기 구성으로 이루어진 BCMA-CAR의 폴리펩타이드 서열을 동물 세포에서의 단백질 발현에 적합하도록 코돈 최적화(Codon optimization)하여 핵산 서열로 변환하고 EF1a 프로모터를 포함하는 트랜스포존 벡터인 pSBbi-Neo(Addgene, Catalog No. 60525)에 클로닝하여 사용하였다.
실시예 2: BCMA-CAR NK 세포의 제조
4종의 BCMA-CAR 발현 NK 세포의 제조
실시예 1에서 제작한 4종류의 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR) 코딩 핵산 서열(유전자) BCMA-CAR1, BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4가 클로닝된 pSBbi-Noe 벡터를 NK-92 세포에 슬리핑 뷰티(Sleeping beauty) 전이효소(transposase) 발현 벡터인 pCMV(CAT)T7-SB100(Addgene, Catalog No. 34879)와 함께 Lonza사의 Nucleofector와 Cell line Nucleofector Kit를 이용한 전기천공법을 수행하여 4종의 BCMA-CAR NK 세포 CGT301, CGT302, CGT303, CGT304를 각각 제조하였다.
한편, BMCA-ADC(GSK2857916, BLENREP)의 J6MO 항체 서열 기반의 scFv를 포함하는 동일 구조의 CAR를 참조(Reference)로 사용하여 비교군 NK 세포(Ref)를 제조하였다.
형질전환 후 세포는 12.5 % FBS, 12.5 % Horse serum, 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 1 % penicillin/streptomycin, IL-2 100 IU/ml이 포함된 α-MEM 배지에서 48시간 안정화시킨 다음 200μg/ml 농도의 카나마이신 (Kanamycin)을 2주 이상 처리함으로써 BCMA-CAR 유전자를 발현하는 NK-92 세포만을 선별(selection) 하였다.
이와 같이 제작한 BCMA-CAR NK 세포들을 먼저, 항-phospho-CD3ζ 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 방법으로 NK 세포에서 BCMA-CAR의 발현을 확인하였다(도 2). 또한, 인간 IgG(ab')2 항체 또는 Hig tag conjugated-BCMA 재조합 단백질과 PE-conjugated His 항체를 사용한 유세포 분석 방법(flow cytometry)으로 NK 세포 표면에서의 BCMA-CAR 발현을 확인하였다(도 3).
실시예 3: BCMA-CAR 발현 NK세포의 인 비트로(in vitro) 유효성 평가
BCMA-CAR NK의 다발골수종 암세포에 대한 세포 사멸 효과
상기 실시예 2에서 제작한 4종의 BCMA-CAR NK 세포의 다발골수종에 대한 선택성 및 반응성을 평가하기 위해, BCMA-CAR NK 세포를 H929, MM1.R, OPM-2를 비롯한 다발골수종 세포 및 K562, Jurkat의 다른 암세포와 반응시킨 후, 세포독성 시험 (cytotoxicity assay)과 Granzyme B, 및 IFNγ의 분비량을 확인하였다. 그 결과, BCMA를 발현하지 않는 K562, Jurkat 등의 암세포주에 대해서는 BCMA-CAR NK 세포의 반응성이 대조군(Ctrl)인 NK 세포(NKvec)와 차이가 없는 반면, H929, MM1.R, OPM-2와 같이 BCMA 발현양이 높은 다발골수종 세포주에 대해서는 BCMA-CAR NK 세포의 세포 사멸능이 비교군인 NK 세포(NKvec)에 비해 3-4배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4a). 이러한 BCMA-CAR NK의 특이적인 다발골수종 암세포 사멸 효과는 IFNγ 및 Granzyme B의 분비량 증가에 의한 것임을 확인할 수 있었다(도 4b, 도 4c).
K562-BCMA 타겟 세포주의 제작
상기 실시예 1에서 설계한 BCMA-CAR의 BCMA 항원 특이적 효능을 평가하기 위하여 먼저 각기 다른 종(species) 유래 BCMA 항원을 발현하는 타겟 세포주를 제작하였다. BCMA가 발현되지 않는 K562 암세포에 인간(h), 원숭이(Rh) 또는 쥐(Ms), 랫드(Rat) 유래 BCMA 말단에 myc을 발현하는 BCMA 유전자를 각각 도입하고 유세포 분석(Flow cytometry)과 웨스턴 블로팅 방법으로 그 발현을 확인하였다(도 5).
4종류 BCMA-CAR의 BCMA 항원특이성 분석
상기 실시예 1에서 제작한 4 종류의 BCMA-CAR의 항원특이성을 분석하기 위해 인간(hu1, hu2), 원숭이(Rh), 마우스(Ms) 및 랫드(Rat) 유래 BCMA를 발현하는 K562(K562-BCMA) 세포주 또는 K562 모세포와 BCMA-CAR1 NK, BCMA-CAR2 NK, BCMA-CAR3 NK, BCMA-CAR4 NK 세포들을 서로 반응시킨 후, 세포독성 시험(Cytotoxicity assay)을 수행하고 Granzyme B, IFNγ의 분비량을 분석하였다.
BCMA-CAR1을 발현하는 BCMA-CAR1 NK 세포는 인간 유래 BCMA에만 특이적으로 활성을 나타냈으며, 각각 BCMA-CAR2, BCMA-CAR3, BCMA-CAR4을 발현하는 NK 세포들은 인간 이외의 BCMA 항원에 대해서 반응성을 나타냈다(도 6a 및 도 6b). 한편, 참조(Reference)로 사용한 GSK사의 BCMA 항체(J6MO) 유래 BCMA-CAR(Ref)는 BCMA-CAR-2, BCMA-CAR-3, BCMA-CAR-4와 유사한 반응성을 보여주었다.
실시예 4: BCMA-CAR NK 세포의 BCMA 특이적 세포 사멸 효과 검증
BCMA 재조합 단백질을 이용한 BCMA-CAR NK의 BCMA 특이적 활성 확인
BCMA-CAR1 NK 세포가 나타내는 활성이 BCMA 특이적인 반응인지 확인하기 위하여, rhBCMA를 이용한 경쟁 분석(competition assay)을 수행하였다. 먼저, BCMA-CAR NK 세포(4 x 104 cells)에 1 μg의 rhBCMA 단백질을 넣어주고 1시간 동안 사전-인큐베이션(pre-incubation)을 행한 후에 타겟 세포로 인간 BCMA를 과발현하는 K562 세포인 K562-BCMA 세포(aK562, 4 x 104 cells)를 추가하여 4시간 반응시킨 후, 세포 독성(cytotoxicity)을 확인하였다. 그 결과, rhBCMA 단백질이 존재할 경우 BCMA-CAR NK 세포의 암세포 살해능이 약 40% 감소함을 확인하였다(도 7).
BCMA 항체를 이용한 BCMA-CAR NK의 BCMA 특이적 활성 확인
또한, BCMA의 발현이 높은 것으로 확인된 다발골수종 세포인 OPM-2를 타겟 암세포로 이용하여 OPM-2 세포(4 x 104 cells)에 30 μg의 anti-BCMA mAb(J6M0)을 넣어주고 1시간 동안 사전-인큐베이션(pre-incubation)을 행한 후 BCMA-CAR1 NK 세포(4 x 104 cells)를 추가하여 4시간 반응 후 세포 독성(cytotoxicity)을 확인하였다. 그 결과, BCMA 항체(anti-BCMA mAb)가 존재하에서는 BCMA-CAR NK 세포의 OPM-2 다발골수종 세포 살해능이 약 50% 정도 억제되었고, 이와 유사하게 Granzyme B의 분비량도 50% 정도 감소하였으며, 특히 IFNγ의 분비량은 1/20로 감소하였다(도 8). 이러한 실험결과는 다발골수종 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 항원인 BCMA와 NK 세포 표면에 발현하는 BCMA-CAR1 수용체와의 결합에 의한 BCMA-CAR NK 세포의 BCMA 특이적 항암 활성에 의한 것이다.
실시예 5: BCMA-CAR NK 세포의 인 비보(in vivo) 항암 효능 평가
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스(Jackson Laboratory, Jax #00557 strain)를 사용한 이종이식(xenograft) 동물 모델에서 BCMA-CAR1을 발현하는 BCMA-CAR NK 세포의 항암 효능을 평가하였다.
BCMA 발현이 높은 다발골수종 세포주 H929를 피하 이식한 후 종양 크기가 150 mm3에 도달했을 때(10 days post implantation), 무작위로 그룹당 5 마리씩 분류하였고 5 일에 한 번씩, 총 3회 BCMA-CAR NK 세포 또는 대조군(control) NK 세포(NKvec)를 1 x 107 cells씩 미정맥 투여(i.v.) 하였다. 이때 다발골수종 환자의 치료제로 사용되고 있는 프로테아솜 억제제인 벨케이드(Velcade®, 성분명 Bortezomib)와 항체 치료제인 다잘렉스(Darzalex®, 성분명 Daratumumab)를 대조 약물로 이용하였으며, 벨케이드®(Vel)과 다잘렉스®(Dara)는 각각 0.5 mg/kg의 농도로 3~4 일에 한 번씩, 총 5회 복강투여(i.p.) 하였다.
시험 17일째의 종양 크기를 비교해 본 결과, BCMA-CAR NK 세포를 투여한 시험군(BCMA-CAR1 NK)에서는 치료 전의 종양 크기 대비 20배가 증가한 반면, 비처리군(Vehicle) 에서는 26배 증가하였고, 치료용 유전자를 발현하지 않는 NK 세포(NKctrl)를 처리한 군에서는 25배 증가하였다. 시험 종료일(17일)에 비처리군(Vehicle) 대비 각 치료군의 종양 성장 억제능(growth inhibition rate; GIR(%))을 비교한 결과, BCMA-CAR NK 세포를 투여한 시험군(BCMA-CAR1 NK)에서는 25%의 종양 성장 억제 효능을 보여준 반면, 대조군(Control) NK 세포를 투여한 군(NKctrl)에서는 6%, 벨케이드®를 투여한 군(Vel)에서는 39%, 다잘렉스®를 투여한 군(Dara)에서는 23%의 종양 성장 억제 효과를 보여주었다(도 9). MM의 1차 치료제로 사용되고 있는 벨케이드는 항암 효능이 39%로 뛰어난 반면 체중감소 등의 독성을 나타냈으며, BCMA-CAR NK 세포는 독성 없이 항체 치료제인 다잘렉스와 유사한 수준의 항암 효능을 보여주었다.
실시예 6: BCMA-CAR NK 세포의 특성 분석
BCMA-CAR NK 세포의 특성 분석을 위해 60일간 지속적으로 배양하면서 세포 생존능(cell viability), 증식(proliferation), CAR 발현, 세포활성(cytotoxicity) 등을 평가하였다. 그 결과, BCMA-CAR NK 세포에서의 CAR 발현은 60일이 지나도 95% 이상이 유지되었으며, 2일에 3배씩 증식하였으며, BCMA 항원을 발현하는 암세포를 살해하는 세포 독성(cytotoxicity)도 60% 이상으로 일정하게 유지되었다. 본 발명의 BCMA-CAR NK 세포는 세포의 증식뿐만 아니라 CAR 발현 및 세포활성도 60일 이상 안정적으로 유지되는 특성을 확인하였다(도 10a 내지 도 10d).
<110> Chungbuk National University Industry University Cooperation Foundation CELLGENTEK CO.,LTD. <120> Chimeric Antigen Receptor Targeting B Cell Maturation Antigen and Uses Thereof <130> 2020-OPA-4811 <150> KR 10-2020-0018317 <151> 2020-02-14 <160> 51 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 1 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 <400> 2 Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 <400> 3 Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 <400> 4 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 <400> 5 Trp Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 6 Arg 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Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 35 40 45 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 Ser Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 65 70 75 80 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 85 90 95 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Arg Asp Ser Asp Asp Phe Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Ser Gly 130 135 140 Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala 145 150 155 160 Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Gln Gly Asp Ser 165 170 175 Leu Arg Ser Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala 180 185 190 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp His Ser Lys Arg Pro Thr Gly Val Pro 195 200 205 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile 210 215 220 Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr 225 230 235 240 Asp Ser Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250 255 Gly Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val 260 265 270 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 275 280 285 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 290 295 300 Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys 305 310 315 320 Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 325 330 335 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 340 345 350 Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 355 360 365 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 370 375 380 Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys 385 390 395 400 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 405 410 415 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 420 425 430 Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 435 440 445 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 465 470 475 480 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 485 490 495 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 500 505 510 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 515 520 525 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 530 535 540 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 545 550 <210> 50 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-CAR 3 <400> 50 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 20 25 30 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 35 40 45 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 Ser Leu Ile Asp Ser Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 65 70 75 80 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 85 90 95 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Ala Lys Glu His Gly Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu 145 150 155 160 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln 165 170 175 Asp Ile Asp Asp Asp Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 180 185 190 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Leu Arg Ala Thr Gly Ile Pro 195 200 205 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 210 215 220 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 225 230 235 240 Leu Arg Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 250 255 Arg Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val 260 265 270 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 275 280 285 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 290 295 300 Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys 305 310 315 320 Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 325 330 335 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 340 345 350 Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 355 360 365 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 370 375 380 Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys 385 390 395 400 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 405 410 415 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 420 425 430 Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 435 440 445 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 465 470 475 480 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 485 490 495 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 500 505 510 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 515 520 525 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 530 535 540 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 545 550 <210> 51 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-CAR 4 <400> 51 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 20 25 30 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His 35 40 45 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 50 55 60 Ser Thr Val Ser Gly Ser Gly Gly Asp Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 65 70 75 80 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 85 90 95 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Ala Arg Gly His Ser Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu 145 150 155 160 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 165 170 175 Gly Ile Asp Ser Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 180 185 190 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Leu Arg Ala Thr Gly Ile Pro 195 200 205 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 210 215 220 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 225 230 235 240 Asn Ser Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 250 255 Arg Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val 260 265 270 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 275 280 285 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 290 295 300 Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Lys 305 310 315 320 Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 325 330 335 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 340 345 350 Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 355 360 365 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 370 375 380 Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys 385 390 395 400 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 405 410 415 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 420 425 430 Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 435 440 445 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 465 470 475 480 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 485 490 495 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 500 505 510 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 515 520 525 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 530 535 540 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 545 550

Claims (31)

  1. 다음의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR):
    (i) BCMA (B cell maturation antigen)에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인;
    (ii) 막 관통 도메인;
    (iii) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인(co-stimulatory signaling domain); 및
    (iv) 세포내 주요 신호 전달 도메인(primary signaling domain).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은,
    (i) L-CDR(complementarity determining region)1, L-CDR2, 및 L-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(light chain variable region, VL);
    (ii) H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH); 또는
    (iii) 하나 이상의 상기 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나 이상의 상기 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 L-CDR1은 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 13, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 L-CDR2은 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 14, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 L-CDR3은 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR1은 서열번호 4, 서열번호 10, 서열번호 16, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR2은 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 17, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 H-CDR3은 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 18, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열의 폴리펩티드인 것인, 키메라 항원 수용체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
    서열번호 4의 H-CDR1, 서열번호 5의 H-CDR2, 및 서열번호 6의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 1의 L-CDR1, 서열번호 2의 L-CDR2, 및 서열번호 3의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL);
    서열번호 10의 H-CDR1, 서열번호 11의 H-CDR2, 및 서열번호 12의 H-CDR3을 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 L-CDR1, 서열번호 8의 L-CDR2, 및 서열번호 9의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL);
    서열번호 16의 H-CDR1, 서열번호 17의 H-CDR2, 및 서열번호 18의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 13의 L-CDR1, 서열번호 14의 L-CDR2, 및 서열번호 15의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    서열번호 22의 H-CDR1, 서열번호 23의 H-CDR2, 및 서열번호 24의 H-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 19의 L-CDR1, 서열번호 20의 L-CDR2, 및 서열번호 21의 L-CDR3를 포함하는 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은
    (i) 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 및 서열번호 31의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 경쇄 가변 영역(VL); 및
    (ii) 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 및 서열번호 32의 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항-BCMA 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 중 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 사이에 위치하는 링커를 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 막 관통 도메인에 연결되는 힌지 영역(hinge region)을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG4, 또는 CD8α의 힌지 영역을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 IgG1 힌지 영역은 서열번호 39의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 IgG4 힌지 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD8α 힌지 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열의 폴리펩티드인 것인, 키메라 항원 수용체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 CD8 알파 또는 CD28의 막 관통 영역을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 CD8 알파 막 관통 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고, 상기 CD28 막 관통 영역은 서열번호 43의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 CD28, DAP10, 또는 CD137(4-1BB)의 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 CD28 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 DAP10 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD137(4-1BB) 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 세포내 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 CD3 제타(ζ) 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 보조 자극 신호 전달 도메인 및 상기 세포내 주요 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인, 키메라 항원 수용체.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 38의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 신호 펩티드(signal peptide)를 더 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 신호 펩티드는 CD16, GM-CSF, 인간 IgG, 또는 CD8의 신호 펩티드를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 CD16의 신호 펩티드는 서열번호 33의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 GM-CSF의 신호 펩티드는 서열번호 34의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 인간 IgG의 신호 펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열의 폴리펩티드이고;
    상기 CD8의 신호 펩티드는 서열번호 36의 아미노산 서열의 폴리펩티드인, 키메라 항원 수용체.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자.
  24. 제 23 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  25. 제 23 항의 핵산 분자 또는 제 24 항의 벡터를 포함하는 세포.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인 것인, 세포.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 면역세포는 NK (Natural Killer) 세포 또는 T 세포인, 세포.
  28. (i) 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 세포의 약학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 B 세포 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환은 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)인, 약학적 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환은 B 세포 악성 종양인 것인, 약학적 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 B 세포 악성 종양은 다발성 골수종 또는 비-호지킨 림프종인, 약학적 조성물.
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