KR20080090532A - 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 ｈ５ 헤마글루티닌에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 용도 - Google Patents

조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 ｈ５ 헤마글루티닌에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 용도 Download PDF

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셍시앙 게
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Abstract

본원은 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 및 상기 모노클로날 항체의 헤마글루티닌 결합 활성의 적어도 50%를 차단할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 상기 항체는 예를 들어 조류 인플루엔자 바이러스의 검출, 진단, 예방, 및 치료에 유용하다. 본원에 제공된 모노클로날 항체에 관련된 하이브리도마 세포주, 단리된 핵산 분자 및 짧은 펩티드, 및 본원에 제공된 모노클로날 항체를 함유하는 제약 조성물 및 키트를 또한 제공한다.
조류 인플루엔자 바이러스, 서브타입 H5, 헤마글루티닌, 모노클로날 항체, 진단, 예방, 치료

Description

조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 Ｈ５ 헤마글루티닌에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 용도 {MONOCLONAL ANTIBODIES BINDING TO AVIAN INFLUENZA VIRUS SUBTYPE H5 HAEMAGGLUTININ AND USES THEREOF}
관련 출원
본원은 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨 중국 특허 출원 200610002312.1 (2006년 1월 26일)을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본원은 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5 헤마글루티닌 (HA)에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 단편, 그들의 펩티드 서열, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 세포주, 및 진단 및 치료 목적으로 항체 및 그의 단편을 사용하는 방법에 관한 것이다.
H5 조류 인플루엔자가 1996년에 중국 광동 지방의 거위 농장에서 처음 발생한 이래로 (Xu, X. et al., 1999, Virology), 인플루엔자 발생은 홍콩의 조류 농장에서 (1997년 4월) 및 시장에서 (1997년 11월) 다른 파생된 H5 바이러스에 의해 유발되었다. 조류에서 인간으로의 조류 인플루엔자 바이러스의 직접 전염은 인간의 역사에서 첫 번째 기록된 전염이었다. 최종적으로 18명의 사람이 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 진단되었고, 그 중 6명은 사망하였다. 2003년 이래로, H5 조류 인플루엔자의 연속적인 발생이 동아시아와 동남아시아의 국가들 사이를 휩쓸었다. 세계보건기구 (WHO)와 독감 전문가들은 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스가 다음번 인간 독감 발생을 초래하는 가장 유망한 유행성 바이러스 균주일 것이라고 예측하였다. 2004년 초에, 고병원성 H5 조류 인플루엔자는 중국에서 10개가 넘는 지방에서 연속적으로 발생하였고, 홍콩, 태국, 네덜란드 및 다른 국가에서 닭, 오리, 왜가리, 호랑이 및 고양이를 포함하는 동물들이 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 것으로 보고되었다. 더 심하게는 태국 및 말레이시아에서 인간-대-인간 감염 사건이 의심되었다. 2005년에, H5 조류 인플루엔자 바이러스로 감염되어 죽은 새의 사례가 루마니아, 러시아 및 터키를 포함한 유럽 여러 국가에서 연속적으로 보고되었고, 전문가들은 고병원성 H5 조류 인플루엔자의 추가 확산 및 전염을 제어하는 것을 더 어렵게 만드는 것이 바이러스를 갖는 철새의 이동인 것으로 생각하였다. 전문가들은 철새에 의해 확산된 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5가 유라시아 및 아프로-아시아 지협을 통해 공중위생 상태가 불결한 아프리카 국가로 더욱 전파할 것이고, 이는 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5가 다른 인간 인플루엔자 바이러스와 완전히 재조합하는 기회와 시간을 제공할 수도 있는 것으로 예측하였다. 이때에는, 아주 새롭고 치명적인 인간 인플루엔자 바이러스가 나타날 수도 있고, 그에 의해 유발된 인명의 큰 손실을 가늠하기 어려울 것이다. 2006년 1월 19일의 WHO의 통계에 따라, H5N1 바이러스 감염에 의한 세계의 인간 사망자수는 80명에 가까워졌고, 이는 세계적인 공중 보건 안정에 대한 큰 도전을 초래하였다.
최근의 연구 (Li, K.S. et al., 2004, Nature)에서는 중국 남부에서 물새 (오리)가 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 주요 보균자 및 전파자이고, 그의 발생은 계절적이고 생물-다양성 (다중-유전형)의 진화를 동반하였음을 나타낸다. 그러나, 분자 역학에 대한 연구에서는 감염된 오리의 약 30%가 증상을 나타내지 않았고, 감염된 닭의 10% 이하가 우세한 무증상 보균자였음을 나타냈다. 이들 감염된 동물은 계속하여 인간을 감염시킬 수 있고, 이는 인간 보건을 엄청나게 위협할 것이다. 전문가들은 모두 동아시아, 동남아시아 및 유럽에서 고병원성 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 확산의 제어가 인간에 대한 초기 진단, 초기 격리, 초기 관리 및 초기 치료에 의해서만 보장될 수 있음에 동의하고 있다.
전통적인 바이러스 단리 및 혈청 진단 방법으로 조류 인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해서는 4-5일이 소요되고, 대부분의 인간 및 동물 질병 제어 실험실 체계에서는 등급-3 생물안전 실험실이 결여되어 있다. 따라서, 동남아시아의 여러 국가와 지역에서 H5 조류 인플루엔자 발생의 진단은 분명히 지연된다. 종종, 많은 수의 닭이 죽거나 도살된 후 최종 진단이 보고되지 않았다. 이러한 상황은 바이러스 발생을 제어하는 것을 어렵게 하였다. 또한, 일부 새들 (특히 물새, 예를 들어 오리) 사이의 무증상 보균자는 큰 문제를 내포하고, 현재의 검역 시스템에는 효과적인 시험 설비가 없다. 이로 인해 많은 국가 및 지역에서 바이러스가 반복적으로 발생하고 있다.
H5 조류 인플루엔자 바이러스 (그 중 거위/광동/1/96이 대표적인 균주였다)는 고병원성 바이러스 집단에 속하고, 모든 일반적인 가금류에 치명적이다. 그러 나, HA의 항원성은 유전 공학 방법을 통해 완전히 얻어질 수 없다. 세계의 많은 유명한 실험실에서 바이러스를 표적으로 하는 모노클로날 항체를 제조하려고 시도하였으나 실패하였다. 현재, 바이러스 항원성 분석에서는 진단 시약에 대한 특이성 및 반응성의 요건을 충족하지 않는 A/닭/펜실바니아/1370/83 (H5N2) 및 A/닭/펜실바니아/8125/83 (H5N2)에 의해 제조된 모노클로날 항체를 채택하여야 한다.
따라서, 편리한 실시간 진단을 위한 방법이 절박하게 요구된다. 상기 방법은 처음 종간 (cross-species) 감염된 세대로부터의 환자를 격리하고 치료하여, 개인 대 개인 감염을 예방하고 바이러스가 인간에게 적응하기 전에 전염 사슬을 중단시킬 것이다. 마지막으로, 널리 확산하는 인간 인플루엔자를 유발시키는 바이러스의 위협이 근원적으로 제거될 수 있다.
중국에서, 조류 인플루엔자 바이러스의 항-서브타입 H5을 검출하는 것에 관한 연구가 보고되었다. 중국 양주 대학교 축산 수의 대학의 킨 (Qin) 등 [Qin, Aijian et al., Journal of Chinese Prevention Veterinary Medicine, 2003, No. 3)]은 서브타입 H5 및 서브타입 H9의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 특이적 모노클로날 항체를 제조하였고, 상기 모노클로날 항체를 사용하여, 상응하는 조류 인플루엔자 바이러스가 간접 면역형광 분석에 의해 24시간 이내에 신속하게 검출될 수 있음을 확인하였다. 2005년 12월 10일에, 조류 인플루엔자 바이러스의 고병원성 서브타입 H5에 대한 검출 시간이 4시간으로 단축될 수도 있음을 추가로 임상적으로 확인하였으며, 상기 시험은 중국 출입 경검험 검역국의 베이징 사무소 (Beijing Office for Entry-Exit Inspection and Quarantine)에서 신속 형광 RT- PCR을 사용하여 수행하였다. 구오 유안지 (Guo Yuanji)가 높은 특이성을 갖는 ELISA 또는 미세-중화 실험이 서브타입 H5의 바이러스 균주에 대한 항체를 검출하기 위해 필요함을 언급하였지만 (Guo Yuanji, "Human Avian Influenza Research Present Situation," Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology, 2004, No.3), ELISA에 의한 서브타입 H5의 검출에 대해 보고된 연구는 없었다.
ELISA에 의한 H5N1 항체의 검출은 중국 외부에서 보고되었다. 로웨 (Rowe) 등은 간접 ELISA에 의해 H5N1 항체를 검출하기 위해 항원 커버링으로서 재조합 HA 단백질의 사용을 보고하였고, ELISA의 감도는 80%이고 특이성은 62%이었다 (Rowe, T. et al., J. Clin. Microbiol., April 1999, 37(4): 937-43). 그러나, 상기 연구는 직접적으로 서브타입 H5N1의 HA 유전자의 특이적 모노클로날 항체를 목적으로 하지 않았다. 조우 (Zhou) 등 (Zhou, E.M. et al., Avian Dis., 1998, 42(4): 757-61) 및 샤퍼 (Shafer) 등 (Shafer, A.L., et al., Avian Dis., 1998, 42(1): 28-34)은 경쟁적 ELISA에 의해 항-코어 단백질에 대한 항체를 검출하였다. 그러나, 대상은 타입 A 조류 인플루엔자의 모든 서브타입 H1-H16의 NP 단백질에 대한 모든 항체였고, 서브타입은 확인되지 않았다. 루 (Lu)는 모노클로날 항체에 기초하여 Dot-ELISA에 의해 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV)를 검출하기 위한 방법을 보고하였다. 상기 방법은 다른 조류 바이러스에 대한 교차-반응을 이용하지 않고 AIV 항원을 직접적으로 검출하였다 (Lu, H., Avian Dis., 2003, 47(2): 361-9). 사라 (Sala) 등이 서브타입 H7의 특이적 표면 당단백질의 모노클로날 항체에 기초한 ELISA를 확립하였지만, 서브타입은 H5와 상이하고, 모노클로날 항체는 HA 유전자에 특이적이기보다는 표면 당단백질에 특이적이었다 (Sala G, Cordioli P, Moreno-Martin et al., Avian Dis. 2003, 47(3 Suppl): 1057-9).
불행히도, 조류 인플루엔자 바이러스의 면역학적 진단에 사용되는 대부분의 모노클로날 항체는 직접적으로 코어 단백질 (NP 단백질)을 목표로 하고, 따라서 타입 A 서브타입들 사이를 구분할 수 없다. 타입 A 인플루엔자 바이러스는 실제로 서브타입 H1-H16으로 총 16개의 서브타입을 포함하고, 이들 중 대부분의 서브타입은 병원성이 없거나 병원성이 단지 낮고, 서브타입 H5만이 병원성을 갖는 가장 유해한 조류 인플루엔자 바이러스이다. 따라서, 이용가능한 기술은 임상 검출의 수요를 만족시키지 못한다.
본 발명의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 이용가능한 면역검출 기술의 단점을 극복하는 것이다. 본 발명에 채택된 모노클로날 항체는 직접적으로 서브타입 H5의 HA 단백질을 목표로 하여, 조류 인플루엔자 바이러스의 고병원성 서브타입 H5의 특이적 검출을 허용한다.
발명의 개요
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 및 상기 항체의 헤마글루티닌 결합 활성의 적어도 50%를 차단할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 그에 관련된 하이브리도마 세포주, 단리된 핵산 분자 및 짧은 펩티드뿐만 아니라, 모노클로날 항체를 함유하는 제약 조성물, 검출 장치 및 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 모노클로날 항체를 사용하여 조류 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인 플루엔자 바이러스의 서브타입 H5를 검출하고 진단하고 예방하고 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 금 마크 (gold mark) 방법에 의한 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 대한 HA 항원 검출 키트의 검출 결과를 도시한 것이고, 여기서 "a"는 2개의 적색선이 나타날 때 양성을 나타내고; "b"는 단지 하나의 품질관리선이 나타날 때 음성을 나타내고; "c"는 적색선이 나타나지 않을 때 무효 시험 결과를 나타낸다.
도 2는 금 마크 방법에 의한 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 대한 항-HA 항체 검출 키트의 검출 결과를 도시한 것이고, 여기서 "a"는 단지 하나의 품질관리선이 나타날 때 양성을 나타내고; "b"는 2개의 적색선이 나타날 때 음성을 나타내고; "c"는 적색선이 나타나지 않을 때 무효 시험 결과를 나타낸다.
도 3은 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 대한 HA 항원 Dot-ELISA 검출 키트의 검출 결과를 도시한 것이고, 여기서 "+"는 타원 영역에 색상이 나타날 때 양성을 나타내고; "-"는 타원 영역에 색상이 나타나지 않을 때 음성을 나타낸다.
도 4는 키메라 (chimeric) 항체에 대한 6개의 발현 플라스미드, 즉 pcDNA3.1-Ak8H5, pcDNA3.1-AH8H5, pcDNA3.1-Ak10F7, pcDNA3.1-AH10F7, pcDNA3.1-Ak4D1, 및 pcDNA3.1-AH4D1의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 바이러스 균주 Ck/HK/Yu22/02를 사용하는 3개의 종류의 키메라 항체 의 HA 응고 억제 시험의 결과를 도시한 것이다. 열 1, 2 및 3: PBS 대조군; 열 4 및 5: 10F7 cAb; 열 6: 10F7 mAb; 열 7 및 8: 4D1 cAb; 열 9: 4D1 mAb; 열 10 및 11: 8H5 cAb; 열 12: 8H5 mAb.
도 6은 H5 헤마글루티닌을 발현하는 세포를 사용하는 키메라 항체의 면역-형광 분석의 결과를 도시한 것이다. A. cAb 4D1 (DAPI); B. cAb 4D1 (FITC); C. cAb 10F7 (DAPI); D. cAb 10F7 (FITC); E. 항-HBV cAb (DAPI); F. 항-HBV cAb (FITC).
도 7은 박테리오파지 펩티드 파고토프 (phagotope)에 대한 ELISA 시험의 OD(450/620) 값의 막대그래프이다.
도 8은 pTO-T7 및 pTO-T7-239-123의 플라스미드 맵 (map)의 개략도를 도시한 것이다.
도 9는 pTO-T7 및 pTO-T7-239-125의 플라스미드 맵의 개략도를 도시한 것이다.
도 10은 정제된 융합 단백질 (또는 재조합 단백질) 239-123의 SDS-PAGE 사진을 도시한 것이다. 레인 (Lane) 1: 단백질 분자량 마커 (marker); 레인 2: 239-123을 발현하는 이. 콜라이 (E. coli)의 전세균 용해물; 레인 3: 전세균 용해물의 원심분리에 의해 얻은 상등액; 레인 4: 버퍼 1 내의 239-123; 레인 5: 2M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-123; 레인 6: 4M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-123; 레인 7: 8M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-123.
도 11은 정제된 융합 단백질 239-125의 SDS-PAGE 사진을 도시한 것이다. 레인 1: 단백질 분자량 마커; 레인 2: 239-125를 발현하는 이. 콜라이의 전세균 용해 물; 레인 3: 전세균 용해물의 원심분리에 의해 얻은 상등액; 레인 4: 버퍼 1 내의 239-125; 레인 5: 2M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-125; 레인 6: 4M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-125; 레인 7: 8M 우레아 내의 정제된 융합 단백질 239-125.
도 12는 융합 단백질 239-123의 특이적 친화도를 나타내고, 이는 수평축 상에 표지된 바와 같이 다양한 항체 균주에 결합하는 융합 단백질 239-123의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620)값으로 나타냄)의 막대그래프이다.
도 13은 융합 단백질 239-125의 특이적 친화도를 나타내고: 이는 수평축 상에 표지된 바와 같이 다양한 항체 균주에 결합하는 융합 단백질 239-125의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620)값으로 나타냄)의 막대그래프이다.
도 14는 mAb의 계열 희석에서 8H5 mAb (삼각형 점선) 또는 8C11 mAb (사각형 점선)에 결합하는 융합 단백질 239-123의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620)값으로 나타냄)를 도시한 것이다.
도 15는 플라스미드 pC149-mut 및 pC149-mut-123의 개략도를 도시한 것이다.
도 16은 플라스미드 pC149-mut 및 pC149-mut-125의 개략도를 도시한 것이다.
도 17은 소규모 발현된 "재조합" 단백질의 전세포 용해물의 SDS-PAGE 사진을 도시한 것이다. 레인 1: D123; 레인 2: T123; 레인 3: F123; 레인 4: Q123; 레인 5: D125; 레인 6: T125; 레인 7: F125; 레인 8: Q125.
도 18은 정제된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 사진을 도시한 것이다. 레인 1: D123; 레인 2: T123; 레인 3: F123; 레인 4: Q123; 레인 5: D125; 레인 6: T125; 레인 7: F125; 레인 8: Q125.
도 19는 HBV cAg 단편 및 항체-결합 펩티드의 재조합 단백질로부터 조립된 바이러스-유사 입자를 보여주는 전자현미경 사진이다.
도 20은 융합 단백질 HBc-123/125과 8H5 mAb 사이의 결합 친화도 및 반응성의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620) 값으로 나타냄)의 막대그래프이다.
도 21은 융합 단백질 HBc-Q123 또는 HBc-D125와 다양한 mAb 사이의 결합 친화도 및 반응의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620) 값으로 나타냄)의 막대그래프이다. 결과는 융합 단백질 HBc-Q123 및 HBc-D125가 8H5 mAb에 특이적으로 결합된 것을 보여주었다.
도 22는 0 내지 4주에 융합 단백질 HBc-123으로 면역화시킨 마우스의 면역 (immune) 마우스 혈청 항체 역가 (titer)의 증가 (상승 곡선)를 보여준다. 항체 역가는 ELISA에 의해 검출하였다.
도 23은 0 내지 4주에 융합 단백질 HBc-125로 면역화시킨 마우스의 면역 마우스 혈청 항체 역가의 증가 (상승 곡선)를 보여준다. 항체 역가는 ELISA에 의해 검출하였다.
도 24는 면역 마우스 혈청과 SF21 세포에서 발현된 HA 단백질 사이의 반응의 면역형광 사진을 도시한 것이다.
도 25는 재조합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128, 및 HBc-129에 의해 조립된 바이러스-유사 입자를 보여주는 전자현미경 사진을 포함한다.
도 26은 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129의 다양한 mAb에 대한 결합 친화도의 ELISA 시험의 색상 강도 (OD(450/620) 값으로 나타냄)의 막대그래프이다. 결과는 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129가 8H5 mAb에 특이적으로 결합된 것을 보여준다.
도 27은 12aa 12 VLP 펩티드의 융합 단백질로부터 조립된 바이러스 유사 입자 및 H5N1 바이러스의 효소-표지된 8H5 mAb에 대한 경쟁 결합의 결과를 도시한 것이다. 수직축은 색상 강도이다 (OD(450/620) 값으로 나타냄). 수평축은 시험에 사용된 다양한 바이러스 유사 입자 및 PBS 대조군이다.
정의
본원에서 사용될 때 용어 "헤마글루티닌"은 조류 인플루엔자 바이러스의 외피 (envelope) 당단백질을 나타낸다. 헤마글루티닌은 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포 내로 흡착 및 관통하는 것을 매개한다. 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질은 각각 16개의 바이러스 서브타입 H1-H16과 연관된 16개의 상이한 혈청학적 서브타입, 즉 HA 1 내지 HA 16을 나타낸다.
본원에서 사용될 때 용어 "항체"는 특이적 항원에 결합하는 임의의 면역글로불린, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 나타낸다. 완전 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 구역 및 제1, 제2 및 제3 불변 구역으로 이루어지는 반면, 각각의 경쇄는 하나의 가변 구역과 하나의 불변 구역으로 이루어진다. 항체는 "Y"자 형태를 갖고, 상기 Y자의 줄기는 디술피드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 구역으로 이루어진다. Y자의 각각의 아암 (arm)은 단일 경쇄의 가변 및 불변 구역에 결합된 단일 중쇄의 가변 구역 및 제1 불변 구역으로 이루어진다. 경쇄 및 중쇄의 가변 구역들은 항원 결합을 담당한다. 경쇄 및 중쇄 모두에서 가변 구역은 일반적으로 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 3개의 고도 가변 루프 (loop)를 포함한다 (경쇄 (L) CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄 (H) CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다) (문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), vols. 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.]에 정의됨). 3개의 CDR은 CDR보다 더 고도로 보존되고 초가변 루프를 지지하는 골격을 형성하는 프레임워크 구역 (FR)으로 공지된 인접 스트레치 (flanking stretch) 사이에 개재된다. 중쇄 및 경쇄의 불변 구역은 항원 결합에 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 구역의 아미노산 서열에 기초하여 클래스에 배정된다. 항체의 주요 클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이고, 이들 클래스 중 몇몇은 서브클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2로 나누어진다.
무손상 면역글로불린에 추가로, 본원에서 사용될 때 용어 "항체"는 추가로 그의 면역글로불린 단편 (즉, 면역글로불린 분자의 적어도 하나의 면역학상 활성 부분), 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 단일쇄 항체 분자, 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 나타낸다. 또한, 본원에서 사용될 때 항체는 하나 이상의 상이한 인간 면역글로불린으로부터의 프레임워크 구역에 그라프팅(grafting)된 특정 인간 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
항체에 관련하여 "Fab"는 디술피드 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 구역 및 제1 불변 구역에 결합된 단일 경쇄 (가변 및 불변 구역 모두)로 이루어지는 항체의 부분을 나타낸다.
"Fab'"는 힌지 구역의 부분을 포함하는 Fab 단편을 나타낸다.
"F(ab')2"는 Fab'의 이량체를 나타낸다.
항체에 관련하여 "Fc"는 디술피드 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 구역에 결합된 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 구역으로 이루어지는 항체의 부분을 나타낸다. 항체의 Fc 부분은 다양한 효과기 기능을 담당하지만, 항원 결합에서 기능을 하지 않는다.
항체에 관련하여 "Fv"는 완전 항원 결합 부위를 갖는 항체의 최소 단편을 나타낸다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 구역에 결합된 단일 경쇄의 가변 구역으로 이루어진다.
"단일쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 직접적으로 또는 펩티드 링커 (linker) 서열을 통해 (Houston 1988) 서로 연결된 경쇄 가변 구역 및 중쇄 가변 구역으로 이루어지는 공학처리된 항체를 나타낸다.
"단일쇄 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 구역에 연결된 scFv로 이루어지는 공학처리된 항체를 나타낸다.
본원에서 사용될 때 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자 상의 원자 및/또는 아미노산의 군을 나타낸다.
본원에서 사용될 때 용어 "모노클로날 항체" 또는 "MAb" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 얻은 항체 또는 그의 단편을 나타내며, 즉, 집단을 이루는 개별 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도 특이적이어서, 항원 상의 단일 에피토프에 대해서 지향된다. 모노클로날 항체는 대개 항원 상의 상이한 에피토프에 대해 지향되는 상이한 항체들을 포함하는 폴리클로날 항체에 대조적이다. 모노클로날 항체는 전통적으로 하이브리도마로부터 유도되지만, 본 발명의 모노클로날 항체는 그들의 생산 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에서 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 상기 항체의 단편을 나타낸다 (미국 특허 4,816,567 (Cabilly 등); 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)]).
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 수여체의 CDR의 일부 또는 전부로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 교체되는 인간 면역글로불린 (수여 항체)인 항체 또는 그의 단편을 나타낸다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능을 더욱 개량하고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 대개 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 구역은 비-인간 면역글로불린에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 구역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 적합하게는 적어도 일부의 면역글로불린 Fc 구역, 대개 인간 면역글로불린의 Fc 구역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]; 및 [Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000)])을 참조한다.
본원에서 사용될 때 용어 "단리된"은 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된 것을 의미한다. "단리된" 조성물 또는 물질은 자연에서 발생하는 것이면 그의 원래의 환경으로부터 변화 또는 제거되거나, 변화 및 제거된다. 예를 들어, 살아있는 동물 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 상태로 존재하도록 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 충분리 분리되면 "단리된" 것이다. 본원에서 사용될 때 "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 활성을 저해하지 않는 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본원에서 사용될 때 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단백질의 발현을 일으키도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 나타낸다. 벡터는 그가 숙주 세포 내에 전달하는 유전 성분의 발현을 일으키도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체 (YAC), 세균 인공 염색체 (BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체 (PAC), 박테리오파지, 예를 들어 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리는 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 및 파포바바이러스 (예를 들어, SV40)를 포함한다. 벡터는 발현을 제어하기 위한 다양한 성분, 예를 들어 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능 성분, 및 리포터 (reporter) 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포좀, 또는 단백질 코팅을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 세포 내로 그의 도입을 돕는 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "숙주 세포"는 벡터가 도입되는 세포를 나타낸다. 숙주 세포는 다양한 세포 종류, 예를 들어 세균 세포, 예를 들어 이. 콜라이 또는 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 세포, 진균 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 아스퍼길루스 (Aspergillus) 세포, 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) S2 또는 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9 세포, 또는 동물 세포, 예를 들어 섬유모세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포, 또는 인간 세포로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "중화 항체"는 그가 결합하는 표적 바이러스 항원의 병원성 (virulency)을 제거하거나 유의하게 감소시킬 수 있는 항체 또는 그의 단편을 나타낸다.
본원에 나타낸 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관련하여 용어 "% 서열 동일성"은 서열을 정렬시키고 최대 % 서열 동일성을 달성하도록 필요한 경우 갭 (gap)을 도입시킨 후, 서열 내에서 각각 핵산 또는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않는다. % 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공용 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "특이적으로 결합하는"은 2개의 분자들, 예를 들어 항체와 그에 대해 항체가 생성되는 항원 사이의 비-무작위 결합 반응을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 항원과 검출가능한 결합 친화도를 나타내지 않거나 낮은 수준의 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 특정 실시태양에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 결합 친화도 (KD) ≤10-5 M (예를 들어, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M 등)로 항원에 결합한다. 본원에서 사용될 때 해리율 대 회합율의 비 (koff/kon)를 나타내는 KD는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
항체
본 발명은 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 한 측면은 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 및 상기 모노클로날 항체의 각종 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 마우스 하이브리도마 세포 균주 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2에 의해 생산되는 항-H5 모노클로날 항체를 제공한다. 상기 모노클로날 항체는 그들을 생산하는 하이브리도마 세포 균주의 이름을 따서 명명한다. 따라서, 각각 마우스 하이브리도마 세포 균주 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2에 의해 생산되는 항-H5 모노클로날 항체는 각각 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2로 명명한다. 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2는 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합한다. 마우스 하이브리도마 세포 균주 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2는 2006년 1월 17일에 차이나 센터 포 티피컬 컬쳐 컬렉션 (China Center for Typical Culture Collection (CCTCC), 중국 우한 우한 대학교)에 기탁 번호 CCTCC - C200607 (하이브리도마 세포 균주 8H5), CCTCC - C200605 (하이브리도마 세포 균주 3C8), CCTCC - C200608 (하이브리도마 세포 균주 10F7), CCTCC - C200606 (하이브리도마 세포 균주 4D1), CCTCC - C200604 (하이브리도마 세포 균주 3G4) 및 CCTCC - C200424 (하이브리도마 세포 균주 2F2)로 기탁되었다.
본 발명은 또한 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2의 결합을 차단하는 모노클로날 항체를 제공한다. 상기 차단 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2에 의해 인지되는 헤마글루티닌 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 상기 차단 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2에 의해 인지되는 에피토프와 입체적으로 겹치는 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 차단 모노클로날 항체는 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2의 결합을 적어도 약 50% 감소시킬 수 있다. 별법으로, 이들은 결합을 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 감소시킬 수 있다.
공지의 모노클로날 항체의 H5 헤마글루티닌에 대한 결합을 감소시키는 시험 모노클로날 항체의 능력은 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 일상적인 경쟁 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 분석은 미량역가 (microtiter)판을 항원으로 예비-코팅하고, 예비-코팅된 플레이트를 선택된 농도의 표지된 공지의 항체와 혼합된 비표지 시험 항체의 계열 희석액과 함께 인큐베이팅하고, 인큐베이션 혼합물을 세척하고, 시험 항체의 다양한 희석액에서 플레이트에 결합된 공지의 항체의 양을 검출 및 측정함으로써 수행할 수 있다. 시험 항체가 항원에 대한 결합에 대해 공지의 항체와 더 강하게 경쟁하면, 항원에 대한 공지의 항체의 결합이 더 많이 감소될 것이다. 보통, 항원은 96-웰 플레이트 상에 예비코팅되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다.
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에서 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 임의의 적절한 숙주 동물을 면역제 및 필요한 경우 항원보강제 (adjuvant)의 1회 이상의 주입에 의해 면역화시킨다. 전형적으로, 면역제 및/또는 항원보강제는 다수의 피하 또는 복강내 주사에 의해 숙주 동물에 주입될 것이다. 면역제를 면역화시킬 숙주 동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 또는 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이팅하는 것이 유용할 수 있다. 사용할 수 있는 항원보강제의 예는 프로인트 (Freund) 완전 항원보강제 및 MPL-TDM를 포함한다. 면역화 후, 숙주 동물은 면역화를 위해 사용된 항원에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 생산한다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 목적하는 림프구를 수집하고 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 배양하고 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 대개 HGPRT-결여 세포의 성장을 방지하는 물질인 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 감수성인 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 (murine) 골수종주, 예를 들어 MOP-21 및 MC-11 마우스 종양 (소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능함), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌)로부터 입수가능함)으로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 설명되었다 ([Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지향된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침강에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사선 면역 분석 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)에 의해 결정한다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 세포를 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996]에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어, DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양과 같이 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 적합하게는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리된다.
본 발명의 모노클로날 항체는 또한 통상적인 유전 공학 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 분자는 예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 PCR을 통해 하이브리도마 세포로부터 단리될 수 있다. 이어서, DNA 분자를 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터를 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시킨다. 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양한다.
본 발명의 항체는 H5 헤마글루티닌에 높은 특이성 및 친화도로 결합할 수 있다. 항체는 다른 서브타입의 헤마글루티닌과 낮은 교차반응성을 가질 것이고, 바람직하게는 다른 서브타입의 헤마글루티닌과 교차반응성이 없다. 한 측면에서, 본 발명은 1 x 10-5 M 미만의 KD 값으로 H5 헤마글루티닌에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, KD 값은 1 x 10-6 M 미만이다. 보다 바람직하게는, KD 값은 1 x 10-7 M 미만이다. 가장 바람직하게는, KD 값은 1 x 10-8 M 미만이다.
본 발명의 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 통상적인 "Y"자형 구조를 가질 수 있다. 또한, 항체는 또한 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 또는 Fv 단편, 또는 헤마글루티닌에 대한 결합 친화도를 유지하는 통상적인 "Y"자형 구조의 다른 부분적 조각일 수 있다. 단편의 헤마글루티닌에 대한 결합 친화도는 통상적인 "Y"자형 항체보다 더 크거나 더 낮을 수 있다.
항체 단편은 무손상 항체의 단백분해성 소화를 통해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]) 참조). 추가로, 상기 단편은 또한 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다 (문헌 ([Hudson, Curr. Opin. Immunol., 11: 548-557 (1999)]; [Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)])에서 검토됨). 예를 들어, Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 실시태양에서, F(ab')2는 F(ab')2 분자의 조립을 촉진하기 위해 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 다른 방안에 따라, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
항체 핵산 서열
본 발명은 H5 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 항체를 코딩하는 핵산 분자는 하이브리도마 세포로부터 단리될 수 있다. 분자의 핵산 서열은 당업자에게 공지된 일상적인 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 통상적인 유전공학 기술 및 화학적 합성을 이용하여 제조할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 항-H5 (HA) 항체의 중쇄의 가변 구역을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 일부를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 항-H5 (HA) 항체의 경쇄의 가변 구역을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 일부를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 구역의 CDR을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 가변 구역 (VH, Vh)을 코딩하는 핵산 서열은 각각 서열 1, 서열 5, 서열 9, 서열 16, 서열 20 및 서열 24에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1 및 2F2의 경쇄 가변 구역 (VK, Vk)을 코딩하는 핵산 서열은 각각 서열 3, 서열 7, 서열 11, 서열 18, 서열 26에 제시되어 있다. 본 발명은 또한 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열의 다의성 유사체 (degenerative analog)를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 24 또는 서열 26의 핵산 서열과 서열 동일성을 공유하는 단리된 핵산 변이체를 제공한다. 한 실시태양에서, 핵산 변이체는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 24 또는 서열 26의 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유한다.
본 발명은 또한 여전히 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 추가로 서열 28-30, 서열 34-36, 서열 40-42, 서열 46-48, 서열 52-54, 또는 서열 58-60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 구역을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 서열 31-33, 서열 37-39, 서열 43-45, 서열 49-51, 또는 서열 61-63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 구역을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 핵산 분자로 형질감염된 숙주세포를 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포를 핵산 분자가 발현되는 조건 하에 배양하여 항체를 생산하고, 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
항체 폴리펩티드 서열
모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역의 아미노산 서열은 그들의 각각의 핵산 서열로부터 추론된다. 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 가변 구역의 아미노산 서열은 각각 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 및 서열 25에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1 및 2F2의 경쇄 가변 구역의 아미노산 서열은 각각 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 및 서열 27에 제시되어 있다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 또는 서열 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역을 포함하는 항-H5 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 또는 서열 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함하는 항-H5 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 또는 서열 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 가변 구역을 포함하는 항체 중쇄를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 또는 서열 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 가변 구역을 포함하는 항체 경쇄를 제공한다.
또한, 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 및 2F2의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역의 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같이 결정되었다:
모노클로날 항체 8H5의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 28-30에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 8H5의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 31-33에 제시되어 있다.
모노클로날 항체 3C8의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 34-36에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 3C8의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 37-39에 제시되어 있다.
모노클로날 항체 10F7의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 40-42에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 10F7의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 43-45에 제시되어 있다.
모노클로날 항체 4D1의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 46-48에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 4D1의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 49-51에 제시되어 있다.
모노클로날 항체 3G4의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 52-54에 제시되어 있다.
모노클로날 항체 2F2의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 58-60에 제시되어 있다. 모노클로날 항체 2F2의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 61-63에 제시되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 28-30으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (ii) 서열 34-36으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (iii) 서열 40-42로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (iv) 서열 46-48로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (v) 서열 52-54로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; 또는 (vi) 서열 58-60으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편을 제공한다. 한 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 28-30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 34-36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 40-42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 46-48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 52-54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 58-62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 항-H5 모노클로날 항체 중쇄 또는 그의 단편에 포함된 CDR은 서열 28-30, 34-36, 40-42, 46-48, 52-54 또는 58-60에 제시된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 3개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다. 보다 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 2개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다. 가장 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 1개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 31-33으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (ii) 서열 37-39로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (iii) 서열 43-45로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; (iv) 서열 49-51로부터 선택되는 하나 이상의 CDR; 또는 (v) 서열 61-63으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편을 제공한다. 한 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 31-33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편은 각각 서열 37-39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편은 서열 43-45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편은 서열 49-51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편은 서열 61-63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 항-H5 모노클로날 항체 경쇄 또는 그의 단편에 포함된 CDR은 서열 31-33, 37-39, 43-45, 49-51 또는 61-63에 제시된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 3개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다. 보다 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 2개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다. 가장 바람직하게는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 1개 이하의 아미노산 위치에서 일어난다.
상기 설명된 항체 또는 상기 설명된 CDR의 가변 구역에서 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 생성된 변이체는 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다. 본 발명은 또한 상기 변이체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 모노클로날 항체 변이체는 통상적인 유전 공학 방법에 의해 제조할 수 있다. 핵산 돌연변이가 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 DNA 분자 내로 도입될 수 있다. 별법으로, 중쇄 및 경쇄 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 화학 합성에 의해 제조될 수 있다.
키메라 항체, 인간화 항체 및 융합 단백질
다른 측면에서, 본 발명은 또한 인간 모노클로날 항체의 불변 구역과 조합된, 뮤린 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2 또는 그의 변이체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 구역을 전부 또는 일부 포함하는 키메라 항체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 인간 항체 프레임워크 내로 그라프팅된, 뮤린 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 3G4 또는 2F2 또는 그의 변이체의 하나 이상의 CDR을 포함하는 인간화 항체를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 다른 분자(들)과 컨쥬게이팅된 본 발명의 모노클로날 항체를 전부 또는 일부 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본원에 개시된 키메라 항체, 인간화 항체 및 융합 단백질은 통상적인 유전 공학 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 상동성 뮤린 서열 대신에 치환함으로써 (Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부에 공유 결합시켜 키메라 또는 인간화 항체 및 융합 단백질을 생산함으로써 변형될 수 있다.
중화 항체
다른 측면에서, 본 발명은 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 바이러스 활성을 중화할 수 있는 항-H5 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 중화 항체는 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 바이러스 활성의 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%를 중화할 수 있다.
서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 바이러스 활성을 중화시키는 항체의 능력은 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 이용하여 분석된다. 실시예 1은 본 발명의 특정 항-H5 모노클로날 항체의 중화 활성을 결정하기 위해 본 발명자들이 사용하는 중화 분석의 과정을 설명한다.
짧은 펩티드
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 mAb의 항원 결합 부위를 자극하는 짧은 펩티드를 제공한다.
8H5 mAb 또는 3C8 mAb에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 7개의 아미노산을 갖는 9개의 짧은 펩티드가 확인되었다. 서열 64-68에 제시된 서열을 갖는 5개의 상기 펩티드는 8H5 mAb에 대한 결합을 보이고, 서열 70-73에 제시된 서열을 갖는 4개의 펩티드는 3C8 mAb에 대한 결합을 보인다 (표 14).
7-aa 펩티드 8H5A (서열 64) 및 8H5E (서열 68)은 특이적 반응을 증명한다. 펩티드 8H5A와 모노클로날 항체 8H5 사이의 반응이 특히 우수하지만, 8H5A와 다른 3개의 모노클로날 항체 사이의 특이적 반응은 약하였다. 8H5E와 모노클로날 항체 8H5 사이의 특이적 반응은 비교적 불량하였다.
또한, 각각 12개의 아미노산을 갖는 12개의 짧은 펩티드 (표 16, 아미노산 서열 및 베이스 서열에 대해 서열 74-97)가 8H5 mAb에 대한 그들의 결합 특이성에 기초하여 확인되었다.
펩티드 123 또는 125를 갖는 12aa 펩티드가 각각 8C11 및 8H5에 대한 특이성을 나타내는 융합 단백질 239-123 및 239-125를 제조하기 위해 사용되었다. 12aa 펩티드 123 및 125와 HBVcAg와의 융합 단백질은 또한 8H5에 대해 결합 특이성을 나타냈지만, 다른 mAb에 대해서는 결합 특이성을 나타내지 않았다. 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129는 8H5와만 반응하였고, 임의의 다른 mAb와는 반응하지 않았다. 융합 단백질 HBc-123, HBc-124, HBc-125, HBc-128 또는 HBc-129로부터 조립된 바이러스-유사 입자는 각각 8H5 mAb에 대한 항원 결합 부위의 일부 부분을 자극하는 것으로 입증되었다.
검출 방법
본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 항원 및/또는 항체의 존재를 검출하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 샘플을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 단편과 접촉시켜 상기 항체 또는 단편과 상기 바이러스와의 복합체를 형성하고, (ii) 상기 복합체를 검출하여 상기 샘플 내에 상기 바이러스의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 제1 항체를 고체 기재에 부착시키고; (ii) 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 상기 기재에 첨가하고; (iii) 표지제에 연결된 제2 항체를 상기 기재에 첨가하고; (iv) 표지제의 존재를 검출하여 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) 항체를 고체 기재에 부착시키고; (ii) 표지된 H5 헤마글루티닌과 예비 혼합된 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 상기 기재에 첨가하고; (iii) 표지된 H5 헤마글루티닌의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
검출 방법은 효소결합 면역흡수 분석 (ELISA), 효소 면역 분석, 화학발광 면역 분석, 방사선 면역 분석, 형광 면역 분석, 면역크로마토그래피, 경쟁 분석 및 기타 기술을 사용할 수 있다. 검출 방법은 경쟁 또는 샌드위치 (sandwich) 방법을 통해 표적 항원 또는 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
경쟁 방법은 본 발명의 모노클로날 항체에 대한 샘플 내의 항원 및 공지량의 표지된 항원의 정량적 경쟁 결합에 기초한다. 경쟁 방법에 기초하는 면역학적 분석을 수행하기 위해, 미지량의 표적 항원을 함유하는 샘플을 본 발명의 모노클로날 항체가 공지의 수단으로 물리적으로 또는 화학적으로 결합된 고체 기재에 첨가하고, 반응을 진행시킨다. 이와 동시에, 표지제로 예비표지된 소정량의 표적 항원을 첨가하고, 반응을 진행시킨다. 인큐베이션 후, 고체 기재를 세척하고, 고체 기재에 결합된 표지제의 활성을 측정한다.
샌드위치 방법에서, 샘플 내의 표적 항원은 본 발명의 고정된 모노클로날 항체와 표지제로 표지된 본 발명의 모노클로날 항체 사이에 샌드위치된 후, 효소와 같은 표지제에 대한 기질을 첨가하고, 기질 변색을 검출하고, 그에 의해 항원의 존재를 검출한다. 샌드위치 방법에 기초하는 면역학적 분석을 수행하기 위해, 예를 들어, 미지량의 표적 항원을 함유하는 샘플을 본 발명의 모노클로날 항체가 공지의 수단으로 물리적으로 또는 화학적으로 결합된 고체 기재에 첨가하고, 반응을 진행시킨다. 이후에, 표지제로 표지된 본 발명의 모노클로날 항체를 첨가하고, 반응을 진행시킨다. 인큐베이션 후, 고체 기재를 세척하고, 고체 기재에 결합된 표지제의 활성을 측정한다. 표지제는 방사성 동위원소, 예를 들어 125I, 효소, 효소 기질, 발광 물질, 예를 들어 이소루미놀 및 아크리딘 에스테르, 형광 물질, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 비오틴, 및 착색 물질, 예를 들어 착색 라텍스 입자 및 콜로이드성 금일 수 있다. 표지 효소는 퍼옥시다제 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제일 수 있다. 반응에 적합한 기질은 ABTS, 루미놀-H2O2, o-페닐렌디아민-H2O2 (퍼옥시다제에 대해), p-니트로페닐 포스페이트, 메틸움벨리페릴 포스페이트, 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3"-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 (알칼리성 포스파타제에 대해), p-니트로페닐-β-D-갈락토스 및 메틸움벨리페릴-β-D-갈락토스 (β-갈락토시다제에 대해)로부터 선택할 수 있다. 추가의 표지는 양자점 (quantum dot)-표지, 발색단-표지, 효소-표지, 친화도 리간드-표지, 전자기 스핀 표지, 중원자 표지, 나노입자 광산란 표지 또는 다른 나노입자로 표지된 프로브, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), TRITC, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, 텍사스 레드 (Texas Red), 파르-레드 (Phar-Red), 알로피코시아닌 (APC), 에피토프 태그, 예를 들어 FLAG 또는 HA 에피토프, 및 효소 태그, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, I2-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제 및 합텐 컨쥬게이트, 예를 들어 디곡시게닌 또는 디니트로페닐, 또는 복합체, 예를 들어 스트렙타비딘/비오틴, 아비딘/비오틴 또는 예를 들어 토끼 IgG와 항-토끼 IgG를 포함하는 항원/항체 복합체를 형성할 수 있는 결합쌍의 멤버; 형광단, 예를 들어 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸 로다민, 에오신, 녹색 형광 단백질, 에리트로신, 쿠마린, 메틸 쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 케스케이드 블루, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린, 형광 란탄족 복합체, 예를 들어 유로퓸 및 테르븀을 포함하는 복합체, Cy3, Cy5, 분자 비콘 (beacon) 및 그의 형광 유도체, 발광 물질, 예를 들어 루미놀; 광산란 또는 플라즈몬 공명 물질, 예를 들어 금 또는 은 입자 또는 양자점; 또는 14C, 123I, 124I, 131I, Tc99m, 35S 또는 3H를 포함하는 방사성 물질; 또는 구형 쉘 (shell), 및 당업자에게 공지된 다른 신호 생성 표지로 표지된 프로브를 포함한다. 예를 들어, 검출가능한 분자는 형광단 및 예를 들어 문헌 [Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2nd edition (July 1999) and the 6<th> Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Hoagland]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 다른 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 표지는 반도체 나노결정, 예를 들어 미국 특허 6,207,392에 기재된 양자점 (즉, Qdot)을 포함한다. Qdot는 퀀텀 도트 코퍼레이션 (Quantum Dot Corporation)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 반도체 나노결정은 II-VI족 반도체, 예를 들어 MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe 및 HgTe와 그의 혼합 조성물의 나노결정; 및 III-V족 반도체, 예를 들어 GaAs, InGaAs, InP 및 InAs와 그의 혼합 조성물의 나노결정을 포함한다. 또한, IV족 반도체, 예를 들어 게르마늄 또는 규소, 또는 유기 반도체도 특정 조건 하에서 사용할 수 있다. 또한, 반도체 나노결정은 상기 III-V족 화합물, II-VI족 화합물, IV족 원소 및 이들의 조합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 2개 이상의 반도체를 포함하는 합금을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 형광 에너지 수용체 (acceptor)는 검출 프로브에 표지로서 연결된다. 한 실시태양에서, 형광 에너지 수용체는 일중항 (singlet) 산소와 반응하여 형광 화합물 또는 보조 화합물과 반응하여 형광 화합물로 전환할 수 있는 화합물을 형성하는 화합물의 결과로서 형성될 수 있다. 상기 보조 화합물은 본 발명의 장치 내에 담긴 버퍼 내에 포함될 수 있다. 다른 실시태양에서, 형광 에너지 수용체는 화학발광물질 (chemiluminescer)을 또한 포함하는 화합물의 일부로서 포함될 수 있다. 예를 들어, 형광 에너지 수용체는 희토류 금속, 예를 들어, 유로퓸, 사마륨, 텔루르 등의 금속 킬레이트를 포함할 수 있다. 상기 물질은 그들의 선명한 발광 밴드 때문에 특히 유리하다. 또한, 란탄족 표지, 예를 들어 유로퓸 (III)은 효과적이고 장기 신호 방출을 제공하고, 광 표백에 저항하여, 필요한 경우 가공/반응된 샘플을 함유하는 시험 장치를 장기간 동안 비축할 수 있다. 긴 수명의 형광 유로퓸(III) 킬레이트 나노입자가 다양한 불균질 및 균질 면역 분석에서 표지로서 적용가능한 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌 [Huhtinen et al, Clin. Chem., October 2004, 50(10): 1935-6] 참조). 분석 성능은 상기 내재적으로 표지된 나노입자를 시간차 형광 검출과 조합하여 사용할 때 개선될 수 있다. 불균질 분석에서, 낮은 농도에서 분석의 동적 범위가 확장될 수 있다. 또한, 분석의 운동학적 특징은 통상적으로 표지된 검출 항체 대신에 검출 항체-코팅된 고특이적-활성 나노입자 표지를 사용하여 개선될 수 있다. 균질 분석에서, 유로퓸(III) 나노입자는 형광 공명 에너지 전달에서 효율적인 공여체이고, 간단하고 신속한 초고속 (highthroughput) 스크리닝을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 표지 (예를 들어, 형광 표지)는 생체분자에 컨쥬게이팅된 나노입자 표지로서 구성된다. 즉, 검출 또는 포획 프로브를 갖는 나노입자가 이용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 내에서 특정 분석물을 검출하기 위해 모노클로날 항체 또는 스트렙타비딘 (SA)에 연결된 유로퓸(III)-표지된 나노입자가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 나노입자-기반 면역 분석). 나노입자는 분석물 및 검출 (즉, 표지) 또는 포획 모이어티 (moiety)에 대해 특이적 결합제가 부착되는 기재로서 역할을 한다. 또한, 표지의 예는 미국 특허 4,695,554, 4,863,875, 4,373,932 및 4,366,241에서 찾을 수 있다. 콜로이드성 금속 및 염료 입자는 미국 특허 4,313,734 및 4,373,932에 개시되어 있다. 비-금속성 콜로이드의 제조 및 사용은 미국 특허 4,954,452에 개시되어 있다. 표지로서 사용하기 위한 유기 중합체 라텍스 입자는 미국 특허 4,252,459에 개시되어 있다.
표지제는 말레이미드 방법 (J. Biochem. (1976), 79, 233), 활성화 비오틴 방법 (J. Am. Chem. Soc. (1978), 100, 3585), 소수성 결합 방법, 활성화 에스테르 방법 또는 이소시아네이트 방법 ("Enzyme immunoassay techniques", 1987년 Igaku Shoin에 의해 공개)에 의해 항원 또는 항체에 결합될 수 있다.
상기 표지제가 방사성 동위원소일 때, 측정은 웰 계수기 또는 액체 섬광 계수기를 사용하여 수행한다. 표지제가 효소인 경우에, 기질을 첨가하고, 효소 활성을 비색법 또는 형광분석법에 의해 측정한다. 표지제가 형광 물질, 발광 물질 또는 착색 기질인 경우에, 측정은 각각 당업계에 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 검출에 사용되는 샘플은 동물 또는 환자로부터의 폐기물, 구강 및 비강 분비물, 무손상 바이러스 또는 닭 배아 배양액 중의 용해성 바이러스 액체 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
검출 장치 및 키트
본 발명은 추가로 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5에 의한 감염의 진단을 위한 키트, 특히 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 항원 또는 항체를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 적어도 하나의 모노클로날 항체 종을 포함한다. 본 발명의 진단 키트에 사용될 본 발명의 모노클로날 항체는 특별히 제한되지 않으며, H5 헤마글루티닌 항원을 인식하는 임의의 항체일 수 있고, 본 발명의 모노클로날 항체의 임의의 항원-결합 단편, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab 등일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 모노클로날 항체 또는 그들의 활성 단편 또는 변이체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5를 검출하기 위한 2 종류의 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 항원-항체 반응의 검출에 적합한 검출 시약을 함유한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 모노클로날 항체 또는 그들의 활성 단편 또는 변이체를 포함하는, 항-H5 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 언급된 키트는 항원-항체 반응의 검출에 적합한 검출 시약을 함유한다.
본 발명에 따른 검출 방법에 사용되는 고체 기재, 또는 고체상 기재는 마이크로플레이트, 자성 입자, 면역크로마토그래피용 여과지, 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 유리 비드, 유리 필터 및 다른 불용성 다른 불용성 담체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 고체상 기재는 적어도 하나의 컴파트먼트 (compartment)가 본 발명의 항체로 코팅되는 복수의 컴파트먼트 또는 영역을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 적어도 하나의 컴파트먼트 (또는 제1 컴파트먼트)가 본 발명의 항체로 코팅되고, 적어도 하나의 나머지 컴파트먼트 (또는 제2 컴파트먼트)는 H5 이외의 다른 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 (예를 들어, H1, H2, H3, H4, H6, H7, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16), 바람직하게는 서브타입 H1, H3, H7 또는 H9에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅된다.
본 발명의 진단 키트는 다른 구성분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구성분은 표지를 위한 효소, 그에 대한 기질, 방사성 동위원소, 발광 물질, 형광 물질, 착색 물질, 버퍼 용액 및 플레이트를 포함하고 이로 제한되지 않고, 상기 언급된 것은 그와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 진단 키트에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 고체 기재에 미리 고정될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 모노클로날 항체는 항원에 대한 항체의 결합 효율을 향상시키는 배향으로 고체 기재에 고정된다. 태운 차 (TaeWoon Cha) 등 (Proteomics 5, 416-419 (2005))은 고정된 단백질 분자의 배향을 제어하고 고체 기재 표면 상의 이상적인 국소 화학 환경을 설계하는 것이 고정된 단백질의 반응 활성 및 효율을 보존하고 향상시키기 위해 중요함을 입증하였다. 항체를 목적하는 배향으로 고체 기재에 부착시키기 위한 각종 방법이 보고되었다. 숀 웽 (Shawn Weng) 등 (Proteomics 2, 48-57 (2002))은 단백질에 연결된 핵산을 통해 표면 상에 균일한 방식으로 단백질을 배향시키는 방법을 보고하였다. 쉘너 (Soellner, M.) 등 (J. AM. CHEM. SOC, 125, 11790-11791 (2003))은 그에 따라 항체 및 항원을 포함하는 단백질이 아지드 및 포스피노티오에스테르가 반응하여 아미드를 형성하는 스타우딩어 (Staudinger) 라이게이션을 통해 표면에 균일한 방식으로 고정되는 방법을 개시하였다. 헤이롱 장 (Hairong Zhang) 등 (Anal. Chem., 78, 609-616 (2006))은 입자의 표면에 대한 항체의 Fab' 단편의 유리 티올의 반응을 통해 항체를 금-코팅된 자성 입자 상에 배향시키는 방법을 개시하였고, 그에 따라 항체의 모든 항원 결합 부위가 유리한 방향으로 배향된다. 헤이 쑤 (Hai Xu) 등 (J. Phys. Chem. B, 110, 1907-1914 (2006))은 항체를 친수성 규소 산화물/물 표면에 흡착시키는 방법을 보고하였다. 성 승용 (Seung-yong Seong) 등 (Proteomics, 3, 2176-2189 (2003))은 표면에 대한 단백질의 배향된 고정화를 위한 방법 및 상기 방법에 사용되는 단백질 분자의 개요를 제공하였다. 상기 모든 참고문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 진단 키트에서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항원은 상기 언급된 표지제로 미리 표지될 수 있다.
본 발명은 추가로 자동화 과정을 통해 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 자동화 장치를 제공한다.
면역화학을 이용하여 생물학적 유체의 샘플 내에서 분석물의 존재를 검출하기 위한 다양한 장치는 당업계에서 설명되었다. 장치는 소위 "샌드위치" 분석을 이용할 수 있고, 예를 들어, 항원과 같은 표적 분석물은 표지된 항체와 고체 지지체 상에 고정된 항체 사이에 "샌드위치된다". 분석은 결합된 항원-표지된 항체 복합체의 존재 및/또는 양을 관찰하여 판독된다. 장치는 또한 경쟁 면역 분석을 포함할 수 있고, 여기서 고체 표면에 결합된 항체는 미지량의 항원 분석물을 함유하는 샘플과 및 동일한 종류의 표지된 항원과 접촉된다. 이어서, 고체 표면에 결합된 표지된 항원의 양을 결정하여 샘플 내의 항원 분석물의 양의 간접 측정치를 제공한다. 다양한 분석에서는 예를 들어, 상이한 항체 또는 항원을 시험 기재 (예를 들어, 흡수성 또는 비-흡수성 막)의 지정된 또는 접근가능한 구역 내에 포함시킴으로써, 복수의 상이한 분석물을 분석하도록 채택된 장치를 이용한다. 상기 방법과 아래 논의된 다른 방법은 항체 및 항원을 모두 검출할 수 있기 때문에, 일반적으로 면역화학 리간드-수용체 분석 또는 간단히 면역 분석으로 칭해진다.
고체상 면역 분석 장치는 샌드위치형이든 경쟁형이든 생물학적 유체 샘플, 예를 들어 혈액 또는 소변 내에서 분석물의 민감한 검출을 제공한다. 고체상 면역 분석 장치는 리간드-수용체 쌍의 하나의 멤버, 보통 항체, 항원 또는 합텐이 결합되는 고체 지지체를 포함한다. 일반적인 초기 형태의 고체 지지체는 방사선 면역 분석 및 효소 면역 분석의 분야에서 잘 공지된 폴리스티렌의 플레이트, 튜브 또는 비드였다. 보다 최근에, 많은 다공성 물질, 예를 들어 나일론, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 및 다른 다공성 중합체가 고체 지지체로서 사용되고 있다. 면역화학 성분, 예를 들어 항원, 합텐 또는 항체의 고체상 운반체로서 다공성 물질을 사용하는 많은 단독형 (self-contained) 면역 분석 키트가 설명되었다. 상기 키트는 보통 딥스틱 (dipstick), 플로-쓰루 (flow-through), 또는 이동식 디자인이다. 면역 분석 또는 특이적 결합 분석을 수행하기 위한 임의의 통상적인 잘 공지된 장치가 본 발명에서 인플루엔자를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 다양한 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입에 의해 유발된 감염의 진단을 위한 장치가 포함된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유할 수 있는 샘플이 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로 감염된 대상의 것인지를 결정하기 위해 샘플을 장치에 적용한다. 고체 지지체를 포함하는 장치는 그에 배치된 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 인플루엔자 바이러스 항원을 포함할 수 있어서, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 시험하기 위한 수단을 제공한다. 다양한 실시태양에서, 본 발명의 장치에서 사용되는 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (MAb), 또는 그의 보존적 또는 기능적 변이체, 키메라 항체, 재형성 (reshaped) 항체, 인간화 항체, 그의 생활성 단편, 또는 하나 이상의 상기 항체의 임의의 조합물을 포함하고, 이로 제한되지 않고; 임의의 상기 기능적 항체 또는 그의 단편은 본원에서 종합적으로 항체 또는 복수형 항체들로서 칭할 수 있다. 본 발명의 항체는 인플루엔자 바이러스의 검출을 허용하기 위해 임의의 장치에 채택될 수 있다. 예를 들어, H5 조류 인플루엔자 바이러스는 샘플 내에서 H5 단백질 또는 항-서브타입 H5 항체의 표적화에 의해 검출할 수 있다. 한 실시태양에서, H5는 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV)의 것이다.
본원에 개시된 항체 또는 항원을 포함시키기 위해 쉽게 채택될 수 있는 많은 장치가 상업적으로 입수가능하다. 장치는 비제한적으로 마이크로플레이트, 자성 입자, 면역크로마토그래피용 여과지, 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 유리 비드, 유리 필터 및 다른 불용성 운반체를 포함하는, 검출 방법에서 사용될 고체 기재를 포함할 수 있다. 기재는 일반적으로 스트립, 시트, 칩, 구체, 비드 또는 웰, 예를 들어 미량역가판 내의 웰, 또는 적합한 임의의 다른 형태를 포함하고 이로 제한되지 않는 형상일 것이다. 또한, 결합 파트너 (즉, 항원 또는 항체)가 결합되는 기재는 임의의 다양한 형태, 예를 들어, 미량역가 디쉬 (dish), 시험관, 딥스틱, 미세원심분리관, 비드, 회전형 디스크 등으로 존재할 수 있다. 적합한 물질은 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리에틸렌, PVC, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등), 단백질, 종이, 탄수화물 및 다른 고체 지지체를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 물질은 세라믹, 금속, 반금속 (metalloid), 반도체 물질, 시멘트 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 면역 분석 (예를 들어, ELISA)에서 사용되는 미량역가판은 96웰, 384웰 플레이트 또는 1536웰 포맷, 또는 다른 시판 플레이트에서와 같이 더 많은 수의 웰을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 장치는 미국 특허 6,448,001, 4,943,522, 6,485,982, 6,656,744, 6,811.971, 5,073,484, 5,716,778, 5,798,273, 6,565,808, 5,078,968, 5,415,994, 6,235,539, 6,267,722, 6,297,060, 7,098,040, 6,375,896, 7,083,912, 5,225,322, 6,780,582, 5,763,262, 6,306,642, 7,109,042, 5,952,173 및 5,914,241에 개시된 것과 같은 딥스틱, 측면 유동, 카트리지, 복합 (multiplexed), 미량역가판, 미세유체 (microfluidic), 플레이트 또는 어레이 또는 초고속 플랫폼 (platform)을 포함한다. 예시적인 미세유체 장치는 미국 특허 5,707,799와 WO2004/029221에 개시된 것을 포함한다.
딥스틱
가정용 임신 및 배란 검출 키트로 대표되는 보다 일반적인 형태의 딥스틱 분석에서, 면역화학 성분, 예를 들어 항체는 고체상에 결합된다. 미지의 항원 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내로 인큐베이션을 위해 분석 장치를 "담근다". 별법으로, 소량의 샘플을 샘플 수용 대역 상에 놓을 수 있다. 이어서, 표지된 항체를 첨가하고, 관심있는 분석물의 존재에 대한 표시로서 표지를 검출한다. 일부 경우에, 표지는 효소이고, 따라서 효소-표지된 항체가 인큐베이션 기간과 동시에 또는 그 후 첨가된다. 이어서, 장치를 세척한 후, 효소에 대한 기질을 함유하는 제2 용액 내로 삽입한다. 존재하는 경우에 효소-표지는 기질과 상호작용하여, 고체상으로 침전물로서 퇴적하거나 기질 용액 내에 가시적인 변색을 일으키는 착색 생성물의 형성을 일으킨다. EP-A 0 125 118 (Baxter 등)에서는 상기 샌드위치형 딥스틱 면역 분석을 개시한다. EP-A 0 282 192 (Kali 등)에서는 경쟁형 분석에서 사용하기 위한 딥스틱 장치를 개시한다. 딥스틱, 포맷 및 표지용 물질은 잘 알려져 있고, 인플루엔자 분석에 채택될 수 있다. 예시적인 딥스틱 장치는 미국 특허 4,235,601, 5,559,041, 5,712,172, 및 6,790,611에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 딥스틱 장치 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, 항-서브타입 H5 AIV 항체가 하나 이상의 매트릭스 스퀘어 (matrix square)에서 그 위에 부착되는 고체상 지지체 딥스틱의 사용을 통해 샘플 내에서 검출된다. 하나의 매트릭스 스퀘어는 부착된 비-특이적 대조 항체 및 항체 또는 그의 기능적 단편이 부착된 것을 갖는다. 상기 매트릭스 스퀘어는 단백질-결합 및/또는 항원-결합의 부위이고, 보통 니트로셀룰로스로 제조되지만; 당업계에 공지된 임의의 적합한 매체, 예를 들어 특정 나일론 및 폴리비닐리덴이 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 다수의 매트릭스가 고체 지지체에 부착되고, 각각의 매트릭스는 복수의 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 항원 또는 항체를 함유한다.
플로 - 쓰루
플로-쓰루형 면역 분석 장치는 딥스틱 분석과 연관된 광범한 인큐베이션 및 성가신 세척 단계에 대한 필요를 제거하기 위해 설계되었다. 미국 특허 4,632,901 (Valkirs 등)에서는 액체 샘플이 첨가되는 다공성 막 또는 필터에 결합된 항체 (표적 항원 분석물에 특이적임)를 포함하는 장치를 개시한다. 액체가 막을 통해 흐를 때, 표적 분석물이 항체에 결합한다. 샘플의 첨가 후, 표지된 항체를 첨가할 수 있다. 표지된 항체의 시각적 검출은 샘플 내에 표적 항원 분석물의 존재의 표시를 제공한다. EP-A 0 299 359 (Korom 등)에서는 표지된 항체가 시약 전달계로서 작용하는 막 내로 포함되는 플로-쓰루 장치의 변형을 개시한다. 상기 장치는 샘플 내의 성분에 대한 필터로서 작용하는 층을 포함할 수 있고, 분석에 사용되는 시약을 포함한다. 샘플이 한 층에서 다른 층으로 흐를 때 특이적 결합 시약 및 일부 경우에 표지 시스템의 성분과 접촉하고 반응하여, 분석물의 존재의 표시를 제공한다.
면역여과 장치
면역여과 장치는 상업적으로 입수할 수 있고 (예를 들어, 피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드)), 본 발명의 항체를 포함하도록 쉽게 채택될 수 있다. 효소-결합 면역유동 분석 (ELIFA) 방법은 96-웰 샘플 도포 플레이트와 진공 챔버 사이에 샌드위치된 니트로셀룰로스 막을 사용한다. 반응물을 샘플 도포 플레이트에 첨가하고, 진공은 반응물을 막을 통해 당긴다. 캐눌라는 비결합된 생성물을 수거 챔버로 이송한다. 검출을 위해, 마이크로플레이트가 수거 챔버 내에 놓인 후, 효소 기질을 첨가한다. 진공은 자동화 마이크로플레이트 판독기에서 분석을 위해 착색 생성물의 마이크로플레이트 웰 내로 이송을 허용한다. ELIFA 시스템은 웰에서 웰로 일정한 유속을 제공하는 기밀 가스켓 (gasket)을 갖는 정밀 절단된 플렉시글래스로 이루어진다. 캐눌라는 착색 생성물을 분석을 위해 마이크로플레이트 웰에 정확하게 이송한다. 기본적으로, 본 발명의 포획 항체는 기재 (예를 들어, 마이크로리터 플레이트, 막 또는 칩) 상에 점으로 찍힌다. 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 도포하고 인큐베이팅시켜 포획 항체가 결합하도록 한다. 후속적으로, 검출 항체를 첨가한다. 초고속 면역여과 장치의 예는 미국 특허 출원 2003/0108949에 개시되어 있다. 상기 장치는 필터로서 작용하는 층을 포함할 수 있고/있거나 분석에 사용되는 시약을 포함한다. 샘플은 특이적 결합 시약 및 일부 경우에 표지 시스템의 성분과 반응하여, 분석물의 존재의 표시를 제공한다.
측면 유동 장치
측면 유동형 분석에서, 막은 분석을 수행하기 위해 필요한 일부 또는 모든 시약으로 함침된다. 표지된 분석물이 검출되는 분석물 검출 대역이 제공된다 (예를 들어, 미국 특허 4,366,241 (Tom 등), 및 EP-A 0 143 574 (Zuk) 참조). 측면 유동 분석 장치에 대한 많은 변형이 알려져 있다. 장치는 특이적 결합 분석을 위한 시약의 일부를 함유할 수 있거나 (샘플은 일부 시약과 반응한 후 측면 유동 스트립에 적용될 수 있거나, 추가의 시약이 스트립에 순차적으로 적용될 수 있다) 또는 스트립은 특이적 결합 분석을 위한 모든 필요한 시약을 함유할 수 있다. 측면 유동 장치는 가장 종종 내부에 착색 표지에 부착된 시약을 포함하여, 추가로 물질을 첨가하지 않으면서 분석 결과의 가시적인 검출을 허용한다 (예를 들어, 미국 특허 4,770,853 (Bernstein), WO 88/08534 (May 등), 및 EP-A 0 299 428 (Ching 등) 참조). 장치는 일반적으로 샘플의 적용을 위한 위치, 시약 대역 및 검출 대역을 포함하도록 구성된다. 장치는 대개 샘플이 샘플 적용 대역으로부터의 막으로부터 시약 또는 반응 대역을 통해 검출 대역(들)로 유동하도록 허용하는 흡수성 물질로 제조된다. 일부 반응은 샘플을 스트립에 적용하기 전에 일어날 수 있지만, 일부 실시태양에서 반응 대역(들)은 면역 분석을 위한 시약을 포함한다. 하나의 특이적 결합 시약, 예를 들어 항체는 샘플 적용 대역 또는 반응 대역에서 스트립에 확산적으로 결합될 수 있어서, 샘플 내의 항원과 결합하고 샘플과 함께 스트립을 따라 유동할 수 있다. 항원-항체 복합체는 항원 또는 항체에 대한 다른 특이적 결합 파트너를 사용하여 검출 대역에서 직접 포획될 수 있거나, 추가의 특이적 결합 파트너, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘과 비오틴을 사용하여 간접적으로 포획될 수 있다. 이와 유사하게, 표지는 항원 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 예시적인 측면 유동 장치는 미국 특허 4,818,677, 4,943,522, 5,096,837 (RE 35,306), 5,096,837, 5,118,428, 5,118,630, 5,221,616, 5,223,220, 5,225,328, 5,415,994, 5,434,057, 5,521,102, 5,536,646, 5,541,069, 5,686,315, 5,763,262, 5,766,961, 5,770,460, 5,773,234, 5,786,220, 5,804,452, 5,814,455, 5,939,331, 6,306,642에 기재된 것을 포함한다. 유체 샘플 내에서 다수 분석물의 구분가능한 검출에 사용하기 위해 변형될 수 있는 다른 측면 유동 장치는 미국 특허 4,703,017, 6,187,598, 6,352,862, 6,485,982, 6,534,320 및 6,767,714에 기재된 것을 포함한다.
각각의 분석물에 대한 별개의 검출 대역을 확립함으로써, 단일 시험 스트립을 사용하여 샘플로부터 다수 분석물을 분석하는 것도 통상적으로 실시된다. 상이한 분석물 사이를 구분하는 것은 상이한 표지를 사용함으로써 또는 상이한 검출 대역에서 동일한 표지를 측정함으로써 달성할 수 있다. 다수 분석물에 대한 분석은 임의의 통상적인 장치를 사용하여 달성할 수 있다.
면역 분석에서는 유기체에 병원성 또는 외래의 것인 항원의 존재에 반응하여 항체가 생산되는 면역계의 메카니즘을 이용한다. 상기 항체 및 항원, 즉, 면역반응물은 서로 결합할 수 있어서, 시험 샘플 내에 특정 항원의 존재 또는 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있는 고도로 특이적인 반응 메카니즘을 유발한다.
상기 측면 유동 장치는 보통 임의로 경질 물질로 지지되는 다공성 막을 포함한다. 일반적으로, 다공성 막은 유체가 통과할 수 있는 임의의 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 다공성 막을 형성하기 위해 사용되는 물질은 천연, 합성, 또는 합성적으로 변형되는 자연 발생 물질, 예를 들어 다당류 (예를 들어, 셀룰로스 물질, 예를 들어 종이 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어 셀룰로스 아세테이트 및 니트로셀룰로스); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 중합체, 예를 들어 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체, 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스 내에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 실활 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생 (예를 들어, 면) 및 합성 (예를 들어, 나일론 또는 레이온)의 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란, 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드 등을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 하나의 특정 실시태양에서, 다공성 막은 니트로셀룰로스 및/또는 폴리에테르 술폰 물질로부터 제조된다. 용어 "니트로셀룰로스"는 니트로셀룰로스 자체, 또는 질산 및 다른 산, 예를 들어 1 내지 7개 탄소 원자를 갖는 지방족 카르복실산의 혼합 에스테르일 수 있는 셀룰로스의 질산 에스테르를 나타내는 것임을 이해해야 한다.
상기 장치는 또한 시험/검출 또는 대조 대역의 상류 또는 하류에 배치된 흡수 패드를 갖는 스트립을 포함할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 흡수 패드는 모세관 작용 및 막을 통한 유체 유동을 촉진하는 것을 도울 수 있다. 일부 실시태양에서, 흡수 패드는 이동가능 면역 분석 시약 (예를 들어, 항체)를 포함할 수 있다. 물론, 이동가능 또는 고정된 면역 분석 시약은 또한 검출/시험 또는 대조 대역의 상류 어느 곳이나 또한 검출 시스템의 별개의 성분 내에 배치될 수 있음이 이해된다.
다양한 실시태양에서, 샘플 패드를 형성하기 위해 사용될 수 있는 일부 적합한 물질은 니트로셀룰로스, 셀룰로스, 다공성 폴리에틸렌 패드 및 유리 섬유 여과지를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 필요한 경우, 샘플 패드는 또한 그에 공유 또는 비공유 부착된 하나 이상의 분석 예비처리 시약을 함유할 수 있다. 시험 샘플은 샘플 패드로부터 샘플링 패드의 한 단부와 소통하도록 배치된 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 컨쥬게이트 패드는 유체가 통과할 수 있는 물질로부터 형성된다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 컨쥬게이트 패드는 유리 섬유로부터 형성된다. 다른 컨쥬게이트 패드가 또한 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 별법으로, 일부 실시태양에서, 컨쥬게이트 또는 다른 면역시약은 시험 스트립에 적용하기 전에 샘플과 혼합되는 성분 내에 포함될 수 있다.
실험 샘플 내에서 분석물의 존재 또는 부재의 검출을 용이하게 하기 위해, 다양한 검출 프로브는 컨쥬게이트 패드에 적용될 수 있다. 컨쥬게이트 패드 상에 함유되어 있는 동안, 상기 검출 프로브는 샘플링 패드로부터 컨쥬게이트 패드를 통해 (또는 임의로 유체 내에서) 통과할 때 분석물과의 결합에 이용가능하게 남아있다. 분석물과 결합시에, 검출 프로브는 나중에 분석물의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 역할을 할 수 있다. 검출 프로브는 분석의 검출 및 보정 (calibration) 모두에 사용될 수 있다. 그러나, 다른 실시태양에서, 별개의 보정 프로브가 동시 보정 및 검출을 용이하게 하여, 통상적인 분석 보정 시스템에 의해 종종 발생하는 부정확성을 제거하기 위해 검출 프로브와 함께 사용하도록 컨쥬게이트 패드에 적용될 수 있다. 그러나, 검출 프로브 및/또는 보정 프로브는 임의의 분석 위치에서 함께 또는 따로 적용될 수 있고, 컨쥬게이트 패드에 적용될 필요가 없음을 이해해야 한다. 또한, 검출 프로브 및/또는 보정 프로브는 동일하거나 상이한 컨쥬게이트 패드에 적용될 수 있음을 또한 이해해야 한다. 별법으로, 검출 프로브 및/또는 보정 프로브는 진단 시험 유닛, 예를 들어 단독형 시험 장치의 별개의 영역에, 예를 들어 유체, 유동 채널, 또는 면봉 채취물 (swab) 내에 위치할 수 있다.
일부 경우에, 검출 프로브를 분석물에 대해 보다 쉽게 결합할 수 있도록 일부 방식으로 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 경우에, 검출 프로브는 그에 부착하여 컨쥬게이팅된 프로브를 형성하는 특정 특이적 결합 멤버를 사용하여 변형될 수 있다. 특이적 결합 멤버는 일반적으로 특이적 결합쌍의 멤버, 즉, 하나의 분자가 제2 분자에 화학적으로 및/또는 물리적으로 결합하는 경우에 2개의 상이한 분자를 나타낸다. 예를 들어, 면역반응성 특이적 결합 멤버는 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것을 포함하여 항원, 합텐, 앱타머, 항체 (1차 또는 2차), 및 그의 복합체를 포함할 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 재조합 단백질 또는 그의 혼합물(들) 또는 단편(들), 및 항체와 다른 특이적 결합 멤버의 혼합물일 수 있다. 상기 항체의 제조 및 특이적 결합 멤버로서 사용하기 위한 적합성에 관한 상세한 설명은 본원에 개시되어 있다. 다른 일반적인 특이적 결합쌍은 비오틴과 아비딘 (또는 그의 유도체), 비오틴과 스트렙타비딘, 탄수화물과 렉틴, 상보성 뉴클레오티드 서열 (표적 핵산 서열을 검출하기 위해 DNA 혼성화 분석에서 사용되는 프로브 및 포획 핵산 서열 포함), 재조합 방법에 의해 형성되는 것을 포함하는 상보성 펩티드 서열, 효과기와 수용체 분자, 호르몬 및 호르몬 결합 단백질, 효소 보조인자 및 효소, 효소 억제제와 효소 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 특이적 결합쌍은 본래의 특이적 결합 멤버의 유사체인 멤버를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석물의 유도체 또는 단편, 즉 분석물-유사체가 분석물과 공통되는 적어도 하나의 에피토프를 갖는 한 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 예를 들어, 시험 샘플을 함유하는 유체는 컨쥬게이트 패드로 이동하고, 여기서 분석물은 분석물 복합체를 형성하도록 특이적 결합 멤버로 변형된 검출 프로브와 혼합된다. 컨쥬게이트 패드는 다공성 막과 유체 소통 관계이기 때문에, 복합체는 컨쥬게이트 패드로부터 다공성 막 상에 존재하는 검출 대역으로 이동할 수 있다. 별법으로, 상이한 항원 (예를 들어, 상이한 인플루엔자 바이러스 또는 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 바이러스 항원)에 특이적인 항체를 포함함으로써 다수 검출 대역이 사용될 수 있다. 검출 대역(들)은 일반적으로 분석물 및/또는 그의 복합체 (예를 들어, 분석물의 검출 프로브와의 복합체)와 화학적 또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 고정된 시약을 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 시약은 생물학적 시약, 예를 들어 본원에 개시된 항체일 수 있다. 다른 생물학적 시약은 당업계에 잘 알려져 있고, 항원, 합텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙타비딘 및 그의 복합체를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 다른 경우에, 상기 생물학적 시약은 분석물 및/또는 분석물의 검출 프로브와의 복합체에 결합할 수 있는 것이 요망된다.
상기 시약은 검출 프로브/분석물 복합체에 대한 고정 결합 부위로서 역할을 한다. 일부 경우에, 분석물, 예를 들어 항체, 항체 등은 2개의 결합 부위를 갖는다. 검출 대역(들)에 도달시에, 상기 결합 부위들 중 하나는 복합체 형성된 프로브의 특이적 결합 멤버에 의해 점령된다. 그러나, 분석물의 자유 결합 부위는 고정된 시약에 결합할 수 있다. 고정된 시약에 결합 시에, 복합체 형성된 프로브는 새로운 3원 샌드위치 복합체를 형성한다.
검출 또는 시험 대역(들)은 일반적으로 사용자가 시험 샘플 내에서 특정 분석물의 존재를 보다 잘 결정할 수 있도록 임의의 수의 별개의 검출 구역을 제공할 수 있다. 각각의 구역은 동일한 시약을 함유할 수 있거나, 다수 분석물을 포획하기 위한 상이한 시약을 함유할 수 있다. 예를 들어, 검출 대역(들)은 2개 이상의 별개의 검출 구역 (예를 들어, 선, 점 등)을 포함할 수 있다. 검출 구역은 분석을 통한 시험 샘플의 유동에 실질적으로 수직인 방향의 선 형태로 배치될 수 있다. 이와 마찬가지로, 일부 실시태양에서, 검출 구역은 분석 장치를 통한 시험 샘플의 유동에 실질적으로 평행한 방향의 선 형태로 배치될 수 있다.
일부 경우에, 막이 또한 사용자에게 분석이 적절하게 수행되고 있다는 신호를 제공하는 대조 대역 (나타내지 않음)을 규정할 수 있다. 예를 들어, 대조 대역 (나타내지 않음)은 일반적으로 프로브와 또는 프로브 상에 고정된 시약과 화학적 및/또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 고정된 시약을 함유할 수 있다. 상기 시약의 몇몇 예는 항원, 합텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙타비딘, 2차 항체 및 그의 복합체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 대조 대역 시약에 대해 다양한 비-생물학적 물질을 사용하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 대조 대역 시약은 또한 포획되지 않은 프로브에 결합할 수 있는 상기 설명된 것과 같은 중합전해질을 포함할 수 있다. 대조 대역에서 시약은 프로브에 대해서만 특이적이기 때문에, 신호는 분석물이 존재하는지 여부에 무관하게 형성한다. 대조 대역은 막을 따라 임의의 위치에 위치할 수 있지만, 바람직하게는 검출 대역의 상류에 위치한다.
분석을 이용하여 분석물의 존재 또는 부재에 대해 시험하기 위해 다양한 포맷을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 설명된 실시태양에서, "샌드위치" 포맷을 이용한다. 상기 샌드위치형 분석의 다른 예는 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,168,146 (Grubb 등) 및 4,366,241 (Tom 등)에 설명되어 있다. 또한, 다른 포맷, 예를 들어 "경쟁" 포맷을 또한 사용할 수 있다. 경쟁 분석에서, 표지된 프로브는 일반적으로 분석물에 유사하거나 분석물의 유사체인 분자와 컨쥬게이팅된다. 따라서, 표지된 프로브는 이용가능한 시약에 대해 관심있는 분석물과 경쟁한다. 경쟁 분석은 대개 합텐과 같은 분석물의 검출을 위해 사용되고, 여기서, 각각의 합텐이 1가이고 하나의 항체 분자와만 결합할 수 있다. 경쟁 면역 분석 장치의 예는 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,235,601 (Deutsch 등), 4,442,204 (Liotta) 및 5,208,535 (Buechler 등)에 기재되어 있다. 다양한 다른 장치 형상 및/또는 분석 포맷이 또한 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,395,754 (Lambofte 등); 미국 특허 5,670,381 (Jou 등); 및 6,194,220 (Malick 등)에 설명되어 있다.
미세유체 장치
본 발명의 일부 측면에서, 본원에 개시된 항체는 미세유체 장치 내로 포함될 수 있다. 장치는 하나 이상의 분석물에 결합할 수 있는 미세유체 유동 시스템이다. 결합된 분석물은 장치 상에서 직접 분석되거나, 예를 들어, 추가의 분석 또는 처리를 위해 장치로부터 제거될 수 있다. 별법으로, 장치에 결합되지 않은 분석물은 예를 들어, 추가의 처리 또는 분석을 위해 수거될 수 있다.
예시적인 장치는 그를 통해 샘플이 유동하는 평판 (flat-plate) 채널을 갖는 유동 장치이고; 상기 장치는 미국 특허 5,837,115에 기재되어 있다. 샘플은 중력, 모세관에 의해 또는 샘플, 예를 들어 혈액을 미세유체 장치를 통해 관류시키기 위한 주입 펌프에 의한 것과 같은 능동력에 의해 상기 장치를 통해 이동할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 펌핑 방법이 사용될 수 있다. 미세유체 장치는 임의로 분석물 포획을 위한 장치 내의 구조체의 어레이에 의존할 수 있다. 구조체는 레이저 처리, 엠보싱 (embossing), Lithographie Galvanoformung Abformung (LIGA), 전기도금, 전기주조 (electroforming), 사진평판, 반응성 이온 에칭 (etching), 이온 빔 밀링 (milling), 압축 성형, 캐스팅, 반동 사출 성형, 사출 성형, 및 물질의 미세기계 가공을 포함하고, 이로 제한되지 않는 다양한 과정에 의해 제조할 수 있다. 이해되는 바와 같이, 본 발명의 장치를 제조하기 위해 이용되는 방법은 방법이 대량의 균일한 구조체 및 장치를 생성시키는 한 중대하지 않다. 또한, 방법은 구조체의 큰 표면적을 생성시키고, 좁은 채널을 생성하도록 서로 밀접하게 배열되도록 해야 한다. 좁은 채널은 포획 부위에서 분석물 및/또는 표지된 시약을 포획하는 효율을 향상시키도록 유체 내에서 분석물 확산이 일어나도록 한다.
대량 생산된 구조체는 바람직하게는 임의의 많은 중합성 물질로 제조된다. 이들 중에는 폴리올레핀, 예를 들어 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 예를 들어 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 스티렌 함유 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 스티렌아크릴로니트릴 및 아크릴로니트릴부타디엔스티렌, 폴리카르보네이트, 아크릴릭 중합체, 예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트 및 폴리 아크릴로니트릴, 염소 함유 중합체, 예를 들어 폴리비닐클로라이드 및 폴리비닐리덴클로라이드, 아세탈 단일중합체 및 공중합체, 셀룰로직 및 그들의 에스테르, 셀룰로스 니트레이트, 불소 함유 중합체, 예를 들어 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에테르에테르케톤, 황 함유 중합체, 예를 들어 폴리페닐렌술피드 및 폴리에테르술폰, 폴리우레탄, 규소 함유 중합체, 예를 들어 폴리디메틸실록산이 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다. 또한, 구조체는 상기 물질, 금속 호일, 예를 들어 알루미늄 호일, 금속화 필름 및 상기 물질 상에 증착된 금속, 및 유리 및 세라믹 물질의 공중합체, 블렌드 및/또는 라미네이트로부터 제조될 수 있다. 하나의 상기 방법에서, 엑시머 레이저와 같은 레이저를 사용하여 포토마스크 (photomask)를 방사시켜, 포토마스크를 통해 통과한 빛이 물질 기재에 채널을 형성하는 아래에 놓인 물질을 제거할 수 있다 [Sercel, J., et al., SPIE Proceedings, Vol. 998, (September, 1988)].
일반적으로, 미세유체 장치는 그를 통해 시험 샘플이 초기에 제공되는 도입 포트 (inlet port)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 채널은 모세관이고, 도입 포트로부터 장치, 포획 부위를 제공하는 구조체의 어레이, 및 장치에서 기체를 배출시키는 배출구, 예를 들어 배출 포트 (exit port)를 통한 시험 샘플의 수송을 제공한다. 또한, 장치를 주문제작하기 위해 챔버 및 추가의 모세관을 추가할 수 있다. 일반적으로, 장치를 통한 시험 샘플 이동은 모세관력에 의존한다. 또한, 시험 샘플을 도입 포트로부터 채널로 옮기기 위해 하나 이상의 모세관을 사용할 수 있다. 추가로, 장치의 구조체 영역을 빠져나가도록 하나 이상의 모세관을 사용할 수 있다. 그러나, 모세관력 대신 또는 그에 추가로 장치 내에 유체 유동을 구동시키기 위해 차별적인 압력이 사용될 수 있다.
채널은 인접한 구조체 사이에 생성되고, 그를 통해 유체가 유동할 수 있다. 채널 및 구조체 디자인은 모두 구조체 표면과 유체 분자 사이의 접촉을 최적화하기 위해 중요하다. 전형적으로, 채널의 깊이는 약 1 마이크로미터 (㎛) 내지 약 1 밀리미터 (mm)이다. 채널의 평균 폭은 대개 약 0.02 ㎛ 내지 20 ㎛이다. 채널은 높이가 대개 약 1 ㎛ 내지 1 mm이고, 평균 폭이 대개 1 ㎛ 내지 1 mm인 다이아몬드형, 육각형, 원형 또는 사각형을 포함하는 다양한 형태의 구조체를 포함할 수 있다.
고정된 시약은 구조체의 표면 상에 및 모세관 및/또는 챔버 내에 공유 또는 비공유 부착될 수 있다. 시약은 시간 방출형 시약, 공간상 분리된 시약으로서 적용되거나, 표면 상에 코팅되고 건조될 수 있다. 고정된 시약을 표면 상에 배치하는 상기 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 한 실시태양에서, 고정된 시약은 인플루엔자 바이러스 항원 (예를 들어, H5 AIV)을 표적화하는 본원에 개시된 항체이다.
본 발명의 장치를 사용하기 위한 방법은 특이적 결합 멤버를 포함한다. 검출 방법은 착색 표지, 예를 들어 형광 염료 또는 착색 입자의 결합을 포함할 수 있다. 별법으로, 검출은 착색 생성물을 생성할 수 있는 효소의 결합을 포함할 수 있다.
하나 이상의 대체 유동 경로가 본 발명의 장치에서 사용될 수 있다. 시험 샘플을 도입 포트로부터 수송하는 모세관은 상이한 경로로, 구조체로의 주요 경로 및 대체 경로 분기한다. 대체 경로는 다수 포획 부위를 허용하고, 단일 시험 부위에서 다수 분석물의 존재 또는 양의 동시 결정을 허용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 다수 분석물 (상이한 인플루엔자 서브타입)이 시험 장치에서 결정된다.
대체 경로는 시약을 시험 샘플과 혼합하기 위한 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 챔버가 시약 첨가의 영역으로서 사용될 수 있다. 또한, 트래핑 (trapping) 장치가 특정 크기를 넘는 유체 구성분을 제거하기 위해 장치 경로 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치는 예를 들어, 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 분리하기 위해 분리기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 친수성 소결 다공성 물질의 매트릭스는 그의 표면에 도포된 적혈구 응집제를 가질 수 있다. 매트릭스는 장치 내에 구조체 앞에 배치될 수 있다. 전혈 샘플 내의 적혈구는 매트릭스의 틈 내에 잡히는 한편, 실질적으로 무혈구 혈청 또는 혈장은 매트릭스를 통해 통과하여 모세관 작용에 의해 장치의 구조체 부분으로 수송된다. 미국 특허 4,933,092를 본원에 참고로 포함시킨다.
자동화
본 발명의 항체는 쉽게 자동화 면역화학 분석기에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법의 자동화를 용이하게 하고, 총처리 시간을 감소시키기 위해, 본 발명의 면역 분석에서 포획 항체는 자성 입자에 커플링될 수 있다.
항체는 M-280 양 항-토끼 IgG 코팅된 다이나비드 (Dynabead) (다이날, 인크. (Dynal, Inc., 미국 뉴욕주 레이크 석세스)) 및 표적 단백질에 대한 토끼 항체와 같은 상업적으로 입수가능한 기술을 사용함으로써, 또는 M-450 토실활성화된 다이나비드 (다이날, 인크.)를 사용하고 그에 대한 관련 항체를 공유결합함으로써 상기 자성 비드에 커플링될 수 있다. 별법으로, 대상 항체를 고체 지지체, 바람직하게는 자성 비드에 공유결합시키기 위해 글루타르알데히드와 같은 물질을 사용할 수 있다. 대표적인 커플링제는 티오에스테르, 카르보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다.
바람직한 자동화/면역 분석 시스템은 ACS:180.RTM. 자동화 화학발광 시스템 (바이엘 코퍼레이션 (Bayer Corporation, 미국 뉴욕주 태리타운) 및 메드필드 (Medfield, 미국 매사추세츠주)); 예를 들어 ACS:180 PLUS 시스템; ACS:180 SE 시스템; 및 ACS: CENTAUR.RTM. 시스템)이다. ACS:180.RTM. 자동화 면역 분석 시스템은 문헌 [Dudley, B. S., J. Clin. Immunoassay, 14 2): 77 (Summer 1991)]에 기재되어 있다. 상기 시스템은 트레이서 (tracer)로서 화학발광 표지를 사용하고 고체상 시약으로서 상자성 입자 (PMP)를 사용한다. ACS:180 시스템은 경쟁 결합 및 샌드위치형 분석을 모두 수용하고, 여기서 각각의 단계는 자동화된다. ACS:180에서는 이용가능한 표면적을 최대화하는 마이크로미터 크기의 상자성 입자를 사용하고, 원심분리 없이 비결합된 트레이서로부터 결합된 트레이서의 신속한 자성 분리의 수단을 제공한다. 시약은 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있다. 화학발광 표지, 예를 들어 아크리디늄 에스테르 대신에 다른 태그, 예를 들어 효소 태그가 사용될 수 있다. 발광 신호는 바람직하게는 발광분석기로 검출될 것이다. 바이엘 (Bayer) Immuno 1.TM. 면역 분석 시스템이 또한 바람직하다. 본 발명의 항체를 사용하는 면역 분석을 수행하기 위해 쉽게 채택될 수 있는 다른 예시적인 자동화 장치는 미국 특허 5,807,522 및 6,907,722에 제시되어 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항-인플루엔자 항체는 면역 분석 방법을 이용하기 위해 자동화 멀티-웰 플랫폼에 포함될 수 있다. 멀티-웰 분석 모듈 (예를 들어, 플레이트)가 멀티-웰 분석 모듈의 하나 이상의 웰 또는 챔버 (예를 들어, 멀티-웰 분석 플레이트의 웰) 내부에서 유도된 발광-기반 분석을 위해 채택된다. 멀티-웰 분석 플레이트는 예를 들어 플레이트 상부, 플레이트 기저부, 웰, 작용 전극, 반대 전극, 기준 전극, 유전 물질, 전기 접속을 위한 접촉 표면, 전극과 접촉 표면을 전기 접속시키는 전도성 쓰루-홀 (through-hole), 접착제, 분석 시약, 및 확인 마킹 또는 표지를 포함하여 여러 성분을 포함할 수 있다. 플레이트의 웰은 플레이트 상부 내의 구멍에 의해 규정될 수 있고; 플레이트 상부 내의 구멍의 내벽은 웰의 벽을 규정할 수 있다. 플레이트 기저부는 플레이트 상부에 고정될 수 있고 (직접 또는 다른 성분과 조합으로), 웰의 기저부로서 기능할 수 있다.
멀티-웰 분석 모듈 (예를 들어, 플레이트)은 임의의 패턴 또는 형상으로 배열된 임의의 크기 또는 형태의 많은 웰 및/또는 챔버를 갖고, 다양한 상이한 물질로 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 플레이트 및 웰의 수, 크기, 형태 및 형상에 대한 산업 표준 멀티-웰 플레이트 포맷을 사용하는 멀티-웰 분석 플레이트이다. 표준 포맷의 예는 96-웰, 384-웰, 1536-웰 및 9600-웰 플레이트를 포함하고, 각각의 웰은 2차원 어레이 형상이다. 다른 포맷은 단일 웰, 2웰, 6웰 및 24웰과 6144웰 플레이트를 포함한다. 바람직하게는, 웰 및/또는 챔버는 내부에 포함된 적어도 하나의 제1 전극을 갖고, 보다 바람직하게는 또한 적어도 하나의 제2 전극을 포함한다. 바람직한 실시태양에 따라, 웰 및/또는 챔버는 내부에 포함된 적어도 하나의 작용 전극을 갖고, 보다 바람직하게는 또한 적어도 하나의 반대 전극을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에 따라, 작용 전극, 반대 전극 및 임의로 기준 전극이 웰 및/또는 챔버 내로 포함될 수 있다. 분석 플레이트는 바람직하게는 평평하지만, 또한 만곡될 (평평하지 않은) 수 있다.
또한, 하나 이상의 분석 시약이 분석 모듈의 웰, 챔버 및/또는 분석 도메인 내에 (예를 들어, 멀티-웰 분석 플레이트의 웰 내에) 포함될 수 있다. 예를 들어, 상이한 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대한 항체를 포함하는 분석 시약이 미량역가판(들)의 상이한 구역에서 사용될 수 있다. 상기 분석 시약은 웰 및/또는 챔버의 하나 이상의 표면 상에 (바람직하게는 전극, 가장 바람직하게는 작용 전극의 표면 상에) 고정되거나 배치될 수 있고, 하나 이상의 별개의 분석 도메인에 (예를 들어, 웰 및/또는 챔버의 하나 이상의 표면 상에, 바람직하게는 작용 전극 및/또는 반대 전극 상에, 가장 바람직하게는 작용 전극 상에 고정된 시약의 패턴형성된 어레이 내에) 고정되거나 배치될 수 있다. 분석 시약은 또한 웰 및/또는 챔버 내에 특징부에 의해 한정되거나 국소화될 수 있다. 예를 들어, 패턴형성된 유전 물질이 유체를 한정하거나 국소화시킬 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 기구는 분석 모듈, 바람직하게는 멀티-웰 분석 플레이트에서 수행된 분석에서 발광을 유도하고 측정하기 위해 사용될 수 있다. 기구는 예를 들어 하나 이상의 광검출기; 완전 차광 엔클로져 (enclosure); 분석 모듈을 접촉시키는 전기 커넥터 (connector); 멀티-웰 분석 모듈을 장치 안팎으로 (특히 완전 차광 엔클로져 안팎으로) 수송하는 메카니즘; 멀티-웰 분석 모듈을 광검출기(들)과 및 전기 접촉과 정렬 및 배향시키는 메카니즘; 모듈을 트랙킹하고 확인하기 위한 메카니즘 (예를 들어, 하나 이상의 바코드 (bar code) 판독기 (예를 들어, 플레이트 또는 모듈의 한 측면을 판독하기 위한 하나의 바코드 판독기 및 플레이트 또는 모듈의 다른 면을 판독하기 위한 다른 바코드 판독기)); 배향 센서(들); 모듈에 전기 접속을 만들기 위한 메카니즘, 모듈 내에 발광을 유도하기 위한 하나 이상의 전기 에너지원; 및 적절한 전자장치 및 소프트웨어를 포함할 수 있다.
장치는 또한 하나 이상의 분석 모듈을 저장하고/하거나, 스택킹하고/하거나, 이동시키고/시키거나 분포하기 위한 메카니즘 (예를 들어, 멀티-웰 플레이트 스태커 (stacker))을 포함할 수 있다. 장치는 유리하게는 빛을 측정하기 위해 광검출기의 어레이 (예를 들어, 포토다이오드의 어레이) 또는 영상화 광검출기 (예를 들어, CCD 카메라)를 사용할 수 있다. 상기 검출기를 사용하여 장치는 다수 웰 (및/또는 챔버)로부터 동시에 빛을 측정하고/하거나 개별 웰 (및/또는 챔버)로부터 방출된 빛의 강도 및 공간 분포를 영상화할 수 있다.
장치는 바람직하게는 분석 모듈, 바람직하게는 멀티-웰 분석 플레이트의 하나 이상의 섹터 (sector)로부터 빛을 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 섹터는 하나 내지 분석 모듈 (예를 들어, 멀티-웰 플레이트 내의 웰의 열, 행 또는 2차원 서브-어레이) 내의 웰 (및/또는 챔버)의 총 수보다 더 적은 일군의 웰 (및/또는 챔버)를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 섹터는 멀티-웰 플레이트의 웰의 4% 내지 50%를 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 멀티-웰 분석 플레이트는 원통형 섹터 (각각의 섹터는 웰의 하나의 열 또는 행을 갖는다) 또는 사각형 섹터 (예를 들어, 표준 크기의 멀티-웰 플레이트는 동일 크기의 6개 사각형 섹터로 나누어질 수 있다)로 나누어진다. 일부 실시태양에서, 섹터는 웰 내에 하나 이상의 유체 한정 구역을 갖는 하나 이상의 웰을 포함할 수 있다. 장치는 바람직하게는 주어진 모듈, 바람직하게는 플레이트 내의 섹터에서 ECL을 순차적으로 유도하고/하거나 섹터로부터의 ECL을 순차적으로 측정하기 위해 채택된다.
장치는 또한 기기 내부의 특정 기능을 제어하고 데이타의 저장, 분석 및 제시를 돕기 위해 마이크로프로세서 및 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 마이크로프로세서 및 컴퓨터는 장치 내에 존재할 수 있거나, 장치와 상호작용하는 (예를 들어, 네트워크 접속을 통해) 먼 위치에 존재할 수 있다.
막/표면
본 발명의 다양한 측면에서, 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 포함하는 장치는 표면 또는 막을 포함한다. 다양한 표면 또는 막이 그 위에 항체 또는 항원이 고정되거나 다양한 통상적인 면역 분석 장치에서 사용하기 위해 배치되는 표면을 제공할 수 있다. 따라서, 막은 시험 구역뿐만 아니라, 시험 결과 (예를 들어, 샘플이 하나 이상의 바이러스를 함유하는지 여부)의 시각화를 허용하는 면역시약을 이용하는 대조 구역을 포함하는 구역을 제공할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 그 위에 배치된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 갖는 막은 다시 고체 기재 (예를 들어, 측면 유동 또는 딥스틱 장치) 상에 배치된다.
항원/항체가 부착될 수 있는 막 또는 표면은 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 나일론, 4급 아미노 전하를 갖는 양이온화 나일론 (Zeta 프로브), DPT로 전환되는 아미노페닐티오에테르 (APT) 페이퍼, 디아조 유도체 (이는 효소 검출가능한 표지와 함께 사용하기 위해 염색될 수 없다) 또는 친수성 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) (밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주 빌레리카)로부터 입수가능)을 포함하지만 이로 제한되는 않는 물질로 이루어질 수 있다. 용어 "니트로셀룰로스"는 셀룰로스의 임의의 질산 에스테르를 의미한다. 따라서, 적합한 물질은 니트로셀룰로스를 셀롤로스의 카르복실산 에스테르와 조합으로 포함할 수 있다. 니트로셀룰로스 막의 공극 크기는 크게 변할 수 있지만, 종종 약 5 내지 20 마이크로미터, 바람직하게는 약 8 내지 15 마이크로미터이다. 그러나, 당업자에게 공지된 다른 물질이 고려된다. 일부 실시태양에서, 시험 구역은 투명한 Mylar 배킹 (backing)에 라미네이팅된 밀리포어 니트로셀룰로스 롤로 제조된 니트로셀룰로스 웹 조립체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 항원/항체를 포함하는 구역 (또는 "시험 구역")은 나일론으로 제조된다. 다른 실시태양에서, 시험 구역은 라텍스, 또는 분석물에 특이적으로 결합할 수 있어서 시험 대역을 규정하는 제2 시약을 갖는 다른 입자를 고정시킬 수 있는 물질, 예를 들어, 압축 나일론 분말, 또는 유리섬유로 이루어진다. 예비적 실시태양에서, 시험 구역은 건조 상태일 때 불투명하고 습윤 상태일 때 투명한 물질로 이루어진다.
시험 및 대조 대역
장치는 시험 구역에 대해 상기 나열한 임의의 물질로 제작된 시험 및 대조 대역을 포함하는 막/표면을 포함할 수 있다. 종종, 시험 및 대조 대역은 시험 구역의 규정된 성분을 형성한다. 한 실시태양에서, 시험 및 대조 대역은 시험 구역과 동일한 물질로 이루어진다. 종종, 용어 "시험 구역"은 본원에서 적어도 시험 및 대조 대역을 포함하는 장치 내의/상의 구역을 나타내도록 사용된다. 일부 실시태양에서, 장치는 흡수성 물질을 사용하지만, 비-흡수성 유동을 제공하는 일부 실시태양에서, 상기 물질은 흡수성 막의 흡수성을 책임지는 힘을 차단할 수 있는 차단제로 처리될 수 있다. 적합한 차단제는 소 혈청 알부민, 메틸화 소 혈청 알부민, 전 동물 혈청, 카제인 및 탈지 분유, 및 많은 세제와 중합체, 예를 들어, PEG, PVA 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 처리되지 않은 흡수성 막 상의 간섭 부위는 차단제로 완전히 차단되어, 그를 통해 비-흡수성 유동을 허용한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 본원에서는 다수 시험 및 대조 대역을 갖는 시험 장치를 생각하고 있다.
시험 구역은 일반적으로 샘플 유동이 예상되는 대로인 것을 증명하기 위해 유용한 하나 이상의 대조 대역을 포함한다. 각각의 대조 대역은 종종 표지된 대조 시약과 반응하는 특이적 결합쌍의 고정된 멤버를 포함하는 공간상 분리된 구역을 포함한다. 예비적 실시태양에서, 절차상 대조 대역은 관심있는 분석물 또는 그의 단편의 인증된 샘플을 함유한다. 본 실시태양에서, 하나의 종류의 표지된 시약이 사용될 수 있고, 여기서 유체 샘플은 표지된 시약을 시험 및 대조 대역으로 수송하고; 이어서, 관심있는 분석물에 결합되지 않은 표지된 시약은 대조 대역 내에 위치하는 관심있는 분석물의 인증된 샘플에 결합할 것이다. 다른 실시태양에서, 대조 라인은 표지된 시약에 특이적인 또는 달리 표지된 시약의 고정화를 제공하는 항체를 함유한다. 작동 시에, 임의의 또는 모든 관심있는 분석물이 시험 샘플에 존재하지 않을 경우에도, 표지된 시약은 각각의 하나 이상의 대조 대역 내에 구속된다.
일부 실시태양에서, 고체 지지체는 항원/항체-결합 매트릭스 영역을 포함하는 패턴형성된 구역을 포함할 수 있고, 이는 임의의 목적하는 형상 (예를 들어, 정사각형, 타원형, 원형, 수직 또는 수평 선)으로 고안될 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 매트릭스 영역은 플라스틱 또는 Mylar와 같은 물질로 제조될 수 있는 고체 지지체 딥스틱 상으로 배치된다. 본 발명을 사용함으로써, 각각 상이한 특이적 항원을 단일 시험 스트립 상에, 또는 단일 고체상 지지체 딥스틱 상에 다양한 위치에서 함유하는 다중 매트릭스 스퀘어를 포함키는 것을 통해 다수 항-서브타입 H5 AIV 항체를 단일 시험으로 검출하는 것이 가능하다.
다양한 실시태양에서, 면역 분석에서 사용될 본 발명의 항체를 포함하는 장치는 키트 내에 포함될 수 있다. 키트는 이용되는 면역 분석의 특정 포맷에 필요한 시약을 함유하도록 조성된다. 키트는 딥스틱 및 그들 사이에 사용되는 별개의 시약, 다수 서브타입의 인플루엔자의 분석에 필요한 고정된 항체가 그 위에 고정된 측면 유동 장치, 또는 필요한 시약을 갖는 임의의 통상적인 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 딥스틱을 키트 내에 제공된 일련의 시약을 통해 순차적으로 담그는 과정을 통해, 샘플 내에 특정 항-서브타입 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, H5 AIV 항체) 또는 인플루엔자 바이러스 항원 (예를 들어, H5 항원)의 존재 또는 부재를 간단하고 신속하게 확인할 수 있다. 상기 키트는 전문가 및 유사한 일반인이 사용하기에 적합할 것이다. 본 발명의 키트의 사용은 체액, 예를 들어 혈액, 소변, 가래, 정액, 분변, 타액, 담즙, 뇌척수액, 코 면봉 채취물 (nasal swab), 비뇨생식기 면봉 채취물 (urogenital swab), 코 흡인물, 척수액 등으로부터 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, AIV)의 신속한 혈청학적 진단을 허용할 것이다.
다른 실시태양에서, 고체상 지지체 딥스틱 또는 측면 유동 장치는 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, AIV)로 감염된 것으로 의심되는 환자 또는 동물로부터의 표본 샘플이 첨가되는 시험관 또는 유사한 저장기 (receptacle) 내에 놓인다. 표본 샘플은 딥스틱 상의 결합된 항원/항체와 반응하도록 허용된다. 이어서, 딥스틱을 제거하고 부드럽게 세척한다. 고체상 지지체 딥스틱을 세척 용액으로부터 제거하여, 알칼리성 포스파타제 또는 다른 적합한 효소에 컨쥬게이팅된, 샘플을 얻은 종에 특이적인 고도로 희석된 친화도 정제된 면역글로불린을 함유하는 다른 튜브에 넣는다. 이어서, 딥스틱을 제2 항체 용액으로부터 제거하여, 세척 용액의 용기 내에 넣는다. 세척 용액으로부터 제거 시에, 딥스틱을 예비혼합된 색원체 용액 또는 다른 적합한 기질 용액의 최종 튜브 내에 넣는다. 양성 반응은 대조물 (상부 스폿)을 양성 (하부 스폿)에 단순히 시각적으로 비교하여 평가할 수 있다. 양성 스폿이 대조물보다 더 어두우면, 시험은 양성으로 간주된다. 친화도 정제된 면역글로불린에 공유결합된 효소는 효소-기질 반응의 끝에 색상 반응 산물을 생성하는 기질과 반응한다. 상기 방식으로, 결합된 친화도 정제된 면역글로불린의 존재는 쉽게 검출되어, 표본 샘플 내에 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, H5 항원)에 특이적인 항체의 존재를 나타낼 수 있다. 상기 기술은 본원에도 개시한 바와 같이 잘 공지된 ELISA 기술을 포함한다.
적절한 효소와 기질 및 적절한 반응 조건을 선택하는 것은 당업자에게 공지되어 있을 것으로 이해된다. 상기 효소는 면역글로불린 분자에 컨쥬게이팅된 후에 활성으로 남아있는다. 각각의 효소-기질 쌍은 화학적으로 반응하여 착색 반응 산물을 생성한다. 또한, 효소 및 기질이 친화도 정제된 면역글로불린 용액 내로 모두 컨쥬게이팅되지만, 효소 및 기질은 단지 반응하여 착색 반응 산물을 형성하고, 상기 착색 반응 산물에 친화도 정제된 면역글로불린이 결합된 후 표본 항체에 결합되는 대체적인 컨쥬게이트가 존재한다.
물론, 상이한 항체/항원을 사용함으로써, 샘플은 상이한 바이러스 타입 또는 서브타입의 패널에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 면역 분석을 통해 다양한 패널이 분석될 수 있음을 이해할 것이다 (예를 들어, 문헌 [CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, John E., et. al., eds. 1999)] 참조).
어레이
본 발명의 항체는 또한 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질 (예를 들어, H5) 또는 샘플 내에서 하나 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체의 검출을 포함하는, 분석물을 검출하는 초고속 방법에 채택되는 장치에서 사용하기 위해 쉽게 채택될 수 있다. 상기 방법은 항체가 다수의 상이한 바이러스, 예를 들어 다른 인플루엔자 서브타입 (예를 들어, AIV)을 표적화하는 다른 항체를 함유하는 어레이 포맷으로 디스플레이되는 실시태양을 포함한다. 다른 실시태양에서, 항체는 동일한 항원 또는 표적을 표적화할 수 있지만, 주어진 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 또 다른 추가의 실시태양에서, 항체의 어레이는 기재, 및 기재 표면의 일부 상의 별개의 공지의 구역 내에 배열된 복수의 패치를 포함하고, 여기서 (i) 각각의 패치는 기재 상에 고정된 항체를 포함하고, 주어진 패치의 상기 항체는 특정 바이러스 발현 산물, 그의 단편, 또는 숙주 단백질, 예를 들어 항-방이러스 항체에 결합할 수 있고, (ii) 어레이는 각각이 상이한 바이러스 발현 산물, 그의 단편, 또는 숙주 단백질, 예를 들어 항-바이러스 항체에 결합할 수 있는 복수의 상이한 항체를 포함한다.
항체는 바람직하게는 어레이의 패치 상에 직접 또는 간접적으로 공유결합에 의해 고정된다. 대부분의 경우에, 어레이는 적어도 약 10개의 패치를 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 어레이는 적어도 약 50개의 패치를 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 어레이는 적어도 약 100개의 패치를 포함한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 항체의 어레이는 103, 104 또는 105 이상의 패치를 포함할 수 있다.
각각의 패치로 덮인 기재의 표면의 면적은 바람직하게는 약 0.25 mm2 이하이다. 바람직하게는, 각각의 패치로 덮인 기재 표면의 면적은 약 1 ㎛2 내지 약 10,000 ㎛2이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 각각의 패치는 약 100 ㎛2 내지 약 2,500 ㎛2의 기재 표면의 면적을 덮는다. 대안적인 실시태양에서, 어레이 상의 패치는 기재 표면의 면적을 약 2,500 ㎛2만큼 적게 덮을 수 있지만, 상기 작은 크기의 패치는 일반적으로 어레이의 사용에 필수적이지 않다.
어레이의 패치는 임의의 기하학적 형태일 수 있다. 예를 들어, 패치는 직사각형 또는 원형일 수 있다. 어레이의 패치는 또한 불규칙한 형태일 수 있다. 패치는 임의로 아래에 놓인 기재의 중앙 평면으로부터 상승된다.
어레이의 패치를 분리하는 거리를 변할 수 있다. 바람직하게는, 어레이의 패치는 이웃 패치로부터 약 1 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 분리된다. 대개, 패치가 약 10 ㎛보다 큰 치수를 가지면 패치를 분리하는 거리는 어레이 상의 패치의 직경 또는 측면 길이에 대략 비례한다. 패치 크기가 더 작으면, 패치를 분리하는 거리는 대개 패치의 치수보다 더 클 것이다.
어레이의 특정 실시태양에서, 어레이의 패치는 모두 기재의 표면 상에 약 1 cm2 이하의 면적 내에 포함된다. 따라서, 어레이의 한 바람직한 실시태양에서, 어레이는 기재의 표면 상에 약 1 cm2 이하의 총 면적 내에 100개 이상의 패치를 포함한다. 별법으로, 특히 바람직한 어레이는 약 1 cm2 이하의 총 면적 내에 103개 이상의 패치를 포함한다. 바람직한 어레이는 심지어 임의로 기재의 표면 상에 약 1 cm2 이하의 면적 내에 104 또는 105개 이상의 패치를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 어레이의 모든 패치는 기재의 표면 상에 약 1 mm2 이하의 면적 내에 포함된다.
전형적으로, 단지 하나의 항체만이 어레이의 단일 패치 상에 존재한다. 하나 초과의 항체가 단일 패치 상에 존재하면, 상기 패치 상의 모든 항체는 공통 결합 파트너를 공유해야 한다. 예를 들어, 패치는 인플루엔자 바이러스 단백질에 대한 다양한 항체를 포함할 수 있다 (그러나, 잠재적으로 항체는 주어진 인플루엔자 바이러스 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 바람직한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 단백질/항원은 H5이고, 인플루엔자 바이러스는 AIV이다.
본 발명의 어레이는 임의의 수의 복수의 상이한 항체를 가질 수 있다. 전형적으로, 어레이는 적어도 약 10개의 상이한 항체를 포함한다. 바람직하게는, 어레이는 적어도 약 50개의 상이한 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 어레이는 적어도 약 100개의 상이한 항체를 포함한다. 대안적인 바람직한 어레이는 약 103개 초과의 상이한 항체 또는 약 104개 초과의 상이한 항체를 포함할 수 있다. 어레이는 임의로 심지어 약 105개 초과의 상이한 항체를 포함할 수 있다.
어레이의 한 실시태양에서, 어레이의 각각의 패치는 상이한 항체를 포함한다. 예를 들어, 약 100개의 패치를 포함하는 어레이는 약 100개의 상이한 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 약 10,000개의 패치의 어레이는 약 10,000개의 상이한 항체를 포함할 수 있다. 그러나, 대안적인 실시태양에서, 각각의 상이한 항체는 어레이 상의 하나 초과의 별개의 패치 상에 고정된다. 예를 들어, 각각의 상이한 항체는 임의로 2 내지 6개의 상이한 패치 상에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 어레이는 약 3천 개의 항체 패치를 포함할 수 있지만, 약 천 개의 상이한 항체만을 포함하고, 이는 각각의 상이한 항체가 3개의 상이한 패치 상에 존재하기 때문이다.
전형적으로, 어레이 상의 복수의 상이한 항체가 결합할 수 있는 상이한 단백질의 수는 적어도 약 10개일 것이다. 그러나, 어레이 상의 복수의 상이한 항체가 보다 많은 수의 상이한 단백질, 예를 들어 적어도 약 50개 또는 적어도 약 100개에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 어레이 상의 복수의 상이한 항체는 적어도 약 103개의 단백질에 결합할 수 있다.
상기 실시태양의 항체 어레이의 사용에는 임의로 2차원 어레이를 25 mm2의 총 표면적 당 약 1-10 ㎕의 유체 부피를 갖는 유동 챔버 내에 놓는 것을 포함할 수 있다. 유동 챔버 내의 어레이 상의 커버 (cover)는 바람직하게는 투명 또는 반투명이다. 한 실시태양에서, 커버는 파이렉스 (Pyrex) 또는 석영 유리를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 커버는 어레이 상에 고정된 항체와 세포성 추출물과 같은 용액 내의 단백질 사이의 상호작용을 모니터링하는 검출 시스템의 일부일 수 있다. 유동 챔버는 항체를 보존하기 위해 적절한 수용액으로 채워져 있어야 한다. 염, 온도, 및 다른 조건은 바람직하게는 정상 생리학적 조건에 유사하게 유지된다. 유체 용액 내의 샘플은 원하는 경우 유동 챔버 내로 플러싱될 수 있고, 고정된 항체와의 그들의 사용작용이 결정될 수 있다. 항체와 그들의 결합 파트너 사이에 결합이 일어나도록 하기 위해 충분한 시간이 주어져야 한다. 이를 위해 요구되는 시간의 양은 항체와 그들의 결합 파트너 사이의 친화도에 따라 변할 것이다. 어레이에 유체 전달을 위해 특수한 미세유체 펌프, 밸브, 또는 혼합 기술이 요구되지 않는다.
검출 수단
본 발명의 항체를 사용하는 임의의 장치에 적용가능하면, 결합 파트너의 존재를 검출하기 위해 매우 다양한 검출 성분이 이용가능하다. 검출은 정량적 또는 정성적일 수 있다. 본 발명의 어레이는 가시광 또는 적외선 범위의 흡광, 화학발광, 및 형광 (수명, 편광, 형광 상관 분광법 (FCS), 및 형광-공명 에너지 전달 (FRET) 포함)과 같은 광학 검출 방법과 인터페이싱될 수 있다. 또한, 광도파로 (optical waveguide) (PCT 공개 WO 96/26432 및 미국 특허 5,677,196), 표면 플라즈몬 공명, 표면 전하 센서, 및 표면 힘 센서에 기반하는 것과 같은 다른 검출 방식도 본 발명의 많은 실시태양에 적합하다. 별법으로, 브루스터 각 (Brewster Angle) 현미경 (BAM) (Schaaf et al., Langmuir, 3:1131-1135 (1987)) 및 타원편광분석 (ellipsometry) (미국 특허 5,141,311 및 5,116,121; [Kim, Macromolecules, 22:2682-2685 (1984)])에 기반한 것과 같은 기술이 적용될 수 있다. 수정 진동자 미량저울 및 탈착 공정 (예를 들어, 미국 특허 5,719,060 참조)은 본 발명의 어레이의 적어도 일부 실시태양에 적합한 또 다른 대안적인 검출 수단을 제공한다. 본 발명의 일부 어레이 및 다양한 비-표지 검출 원리, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 전반사 형광 (TIRF), 브루스터 각 현미경, 광도파로 광모드 분광법 (OWLS), 표면 전하 측정 및 타원편광분석 모두에 적합한 광학 바이오센서 시스템의 예는 미국 특허 5,313,264에서 찾을 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 포함하는 장치는 판독기, 특히 컴퓨터가 내장된 판독기, 예를 들어 반사율 및/또는 형광 기반 판독기, 및 데이타 감소 및 곡선 피팅 알고리즘을 사용하는 데이타 처리 소프트웨어를 임의로 생물학적 샘플 내에 분석물의 존재 또는 농도를 정확하게 결정하기 위한 학습된 신경망과 조합하여 포함하는 시스템 내로 포함될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 판독기는 데이타를 검출하고/하거나 정량하기 위한 기기, 예를 들어 본 발명의 항체를 사용하는 시험 장치 내에 포함된 시험 스트립을 나타낸다. 데이타는 육안에 보일 수 있지만, 가시적일 필요는 없다. 방법은 환자 샘플에 대해 면역 분석을 수행하고, 반사율 및/또는 형광 기반 판독기를 사용하여 데이타를 판독하고, 데이타 감소를 사용하는 데이타 처리 소프트웨어를 사용하여 생성 데이타를 처리하는 단계를 포함한다. 바람직한 소프트웨어는 주어진 샘플 내에 분석물의 존재 및 양을 결정하기 위해 곡선 피팅 알고리즘을 임의로 학습된 신경망과 조합하여 포함한다. 이어서, 판독기로부터 얻은 데이타는 결과물로서 의학적 상태의 위험 평가 또는 진단을 제공하기 위해 의학 진단 시스템에 의해 추가로 처리할 수 있다. 대안적인 실시태양에서, 결과물은 후속적인 의사결정 지원 시스템, 예를 들어 상기 데이타를 평가하도록 학습된 신경망 내로 입력으로서 사용될 수 있다.
다양한 실시태양에서, 판독기는 장치로부터 검출해야할 신호에 따라 반사, 투과, 형광, 화학-생물발광, 자기 또는 전류측정 판독기 (또는 2 이상의 조합)일 수 있다. 또한, 표지의 사용을 필요로 하는 전통적인 면역 분석에 일반적으로 사용되는 일부 종류의 검출 방법이 본 발명의 어레이에 적용될 수 있다. 상기 기술은 비경쟁 면역 분석, 경쟁 면역 분석, 및 이중 표지, 비율적 (ratiometric) 면역 분석을 포함한다. 상기 특정 기술은 상이한 특이성을 갖는 상이한 항체의 수가 적을 때 (약 100개 미만) 항체의 어레이와 함께 사용하기에 주로 적합하다. 경쟁적 방법에서, 결합-부위 점유는 간접적으로 결정된다. 본 방법에서, 어레이의 항체는 대개 분석물 또는 분석물 유사체의 표지된 버전인 표지된 현상제 (developing agent)에 노출된다. 현상제는 항체 상의 경쟁 부위에 대해 분석물과 경쟁한다. 상이한-패치 상의 항체의 단편적 점유는 개별 패치의 항체에 대한 현상제의 결합에 의해 결정될 수 있다.
비경쟁적 방법에서, 결합 부위 점유는 직접 결정된다. 본 방법에서, 어레이의 패치는 결합된 분석물 또는 단백질-포획제 상의 점유된 결합 부위에 결합할 수 있는 표지된 현상제에 노출된다. 예를 들어, 현상제는 점유된 부위에 대해 지향된 표지된 항체일 수 있다 (즉, "샌드위치 분석"). 별법으로, 이중 표지, 비율적 방안이 취해질 수 있고, 여기서 항체는 하나의 표지로 표지되고 제2 현상제는 제2 표지로 표지된다 (Ekins, et al., Clinica Chimica Acta., 194:91-114, 1990). 상기 언급된 기술에서 방사성동위원소, 효소, 화학발광, 및 형광 방법을 포함한 많은 상이한 표지 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 형광 검출 방법이 바람직하다. 검출 방법은 색상의 변화, 광 흡수 또는 광 투과, pH, 전도도, 형광, 물리적 상의 변화 등을 포함하지만 이로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
시험 샘플은 검출 시스템의 검출가능한 성분을 제공할 수 있거나, 또는 상기 성분이 추가될 수 있다. 상기 성분은 검출 시스템의 성질에 따라 매우 다양할 것이다. 하나의 상기 검출 방법은 입자의 사용을 포함할 것이고, 여기서 입자는 광 산란 또는 유동 속도의 변화를 제공한다. 입자는 세포, 액체 시스템과 혼화가능한 중합체 입자, 라텍스 입자, 목탄 입자, 금속 입자, 다당류 또는 단백질 입자, 세라믹 입자, 핵산 입자, 응집된 입자 등일 수 있지만 이로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 입자의 선택은 검출 방법, 분산액의 분산성 또는 안정성, 불활성, 유동의 변화에의 참여 등에 좌우될 것이다. 포획 부위에서 특이적 결합 멤버에 대한 분석물의 결합은 장치 내에 시험 샘플의 압력을 모니터링함으로써 임의로 검출될 수 있다. 예를 들어, 채널에 출입하는 시험 샘플에 연결된 압력 검출기는 채널 유동 제한을 일으키는 분석물 결합에 의해 유발된 압력 감소의 검출을 허용할 것이다.
예를 들어, 존재하는 검출가능한 표지 (예를 들어, 항체-컨쥬게이트)의 양, 및 따라서 존재하는 항원의 양을 정량하기 위해, 문헌 [Hazelgrove et al., Anal. Biochem., 150:449-456, 1985]의 과정 및 장치를 사용할 수 있다. 상기 과정은 컴퓨터에 연결된 TV 카메라에 기반한다. 점이 TV 카메라에 의해 형상화된 광 박스 상에 디스플레이되고, 디지탈화 보드 (테크마, 인크. (Techmar, Inc.))를 사용하여 디지탈화된다. 디지탈화 후, 컴퓨터는 각각의 점의 위치, 폭, 높이 및 상대 면적으로 판독할 것이다. 광학 밀도 (OD) 측정치를 절대 단백질 농도에 대해 플로팅한다.
다른 실시태양에서, Dot-ELISA 시험을 포함하는 장치를 사용하여 임의의 샘플로부터 표적 단백질을 직접 검출한다. 따라서, 본 발명의 항체는
(a) 모노클로날 항체-기반 분석을 수행하기 위한 고체 지지체를 제공하고;
(b) 고체 지지체에 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 적용하고;
(c) 고체 지지체에 유기산, 예를 들어 시트르산 또는 락트산을 함유하는 용액을 적용하고;
(d) 고체 지지체에 점액용해제 및 세제를 함유하는 용액을 적용하고;
(e) 고체 지지체를 1차 MAb, 키메라 MAb, 변이체 또는 단편과, MAb, 키메라 MAb, 변이체 또는 단편 및 H5 AIV 단백질이 함께 결합하여 항원-결합된 1차 MAb를 형성하기에 충분한 시간 동안 접촉시키고;
(f) 항원-결합된 1차 MAb를 효소 표지된 항-MAb 컨쥬게이트와, 컨쥬게이트에 대한 항원-결합된 MAb의 결합을 촉진하기에 충분한 시간 동안 접촉시키고;
(g) 착색 시약을 고체 지지체에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 착색 시약은 효소에 의해 촉매화되어 샘플 내의 H5 AIV 단백질의 존재의 시각적 검출을 허용하는 착색 마킹을 발생시키는 공정에서 사용될 수 있다.
예시적인 Dot-ELISA 방법은 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨 미국 특허 출원 2006/0246429에 개시되어 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 장치 또는 키트는 색소 검출 시스템, 예를 들어 알칼리성 포스파타제를 사용하는 시스템이 사용될 수 있는 요양 환경 (care setting) 분야 또는 시점에 사용될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 색상을 달성하기 위해 순서대로 사용되도록 고안된 버퍼 중 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트, 니트로블루 테트라졸륨 (NBT), 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (BCIP)를 함유하는 별개의 바이알이 키트의 성분으로서 공급될 수 있다. 색소 검출 시스템을 사용함으로써, 결과를 임의의 장비의 도움 없이 눈으로 볼 수 있다. 한 실시태양에서, 장치는 AIV의 존재량을 정량하기 위해 알칼리성 포스파타제를 사용할 수 있다. 알칼리성 포스파타제를 포함하는 상기 장치는 농도계와 함께 사용될 때 정확한 정량 결과를 제공할 것이다.
한 실시태양에서, H5 AIV 단백질 또는 항-서브타입 H5 AIV 항체의 검출을 위한 키트는 검출가능한 표지, 예를 들어 그에 대해 결합된 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트; 니트로블루 테트라졸륨 (NBT) 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (BCIP)를 포함하는 시약; 및 참조 표준품을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시태양에서, 시험 샘플은 비제한적으로 생리학적 물질과 같은 원료로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 장치에 적용될 수 있는 시험 샘플의 예는 비-인간 동물 또는 인간 대상으로부터 유래되는 항원 또는 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 포함하고, 생리학상 유체, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 수정체액, 뇌척수액, 고름, 삼출물, 유즙, 땀, 눈물, 귀 유동물, 가래, 림프액, 소변, 배설물, 구강 및 비강 분비물, 조직, 예를 들어 폐, 비장 및 신장, 닭 배아 배양액으로부터의 완전 바이러스 또는 용해성 바이러스의 액체, 및 가용성이거나 적합한 유체에 현탁될 수 있는 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 다른 샘플을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 시험 샘플은 추출, 첨가, 분리, 희석, 농축, 여과, 증류, 투석 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로 사전 처리될 수 있다. 생리학상 유체 외에, 다른 액체 시험 샘플이 사용될 수 있고, 관심있는 성분은 액체 또는 고체일 수 있어서, 고체는 액체 배지에 용해되거나 현탁된다. 한 실시태양에서, 면봉 채취 또는 다른 수거 장치로 취한 비강으로부터의 샘플이 면역 분석 장치 내에 또는 장치와 함께 사용된다. 장치는 종종 하나 이상의 항원 또는 항체가 부착될 수 있는 표면을 포함할 것이다.
치료 방법 및 제약 조성물
본 발명은 대상에게 제약상 유효량의 본 발명의 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 조류 인플루엔자 바이러스 감염과 연관된 질병을 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 모노클로날 항체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 제약 조성물은 대상에게 비제한적으로 경구, 구강, 설하, 눈, 외용, 비경구, 직장, 수조내 (intracisternal), 질내, 복강내, 방광내, 국소 (예를 들어, 분말, 연고, 또는 드롭 (drop)), 또는 코 경로를 포함하는 통상적인 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
비경구 주사에 적합한 제약 조성물은 제약상 허용되는 멸균 수용액 또는 비수성 용액; 분산액, 현탁액, 또는 에멀젼, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 즉석에서 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 비히클 및 희석제의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 그의 적합한 혼합물, 식물유 (예를 들어 올리브유), 및 주사가능 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 미생물 오염 방지는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 사용하여 달성할 수 있다. 등장제, 예를 들어, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 주사가능 제약 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시킬 수 있는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다.
경구 투여용 고체 투여형은 캡슐, 정제, 분말 및 과립을 포함한다. 상기 고체 투여형에서, 활성 화합물은 적어도 하나의 통상적인 불활성 제약 부형제 (또는 담체), 예를 들어 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 규산; (b) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸-셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아; (c) 보습제, 예를 들어 글리세롤; (d) 붕해제, 예를 들어, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 아르기닌산 특정 복합체 실리케이트, 및 탄산나트륨; (e) 용액 지연제, 예를 들어, 파라핀; (f) 흡수 촉진제, 예를 들어, 4급 암모늄 화합물; (g) 습윤제, 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (h) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트; 및/또는 (i) 윤활제, 예를 들어, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트 또는 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐 및 정제의 경우에, 투여형은 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
고체 투여형은 장치 상에 코팅되고/되거나 장치의 몸체 내에 포함되는 방출 속도 변경제로서 작용하는 추가의 부형제와 함께, 즉시 방출 투여형에 대해 상기 상세히 설명된 것과 같은 부형제를 함유하는 변형된 방출 및 박동 방출 투여형으로서 제형화될 수 있다. 방출 속도 변경제는 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥시드, 잔탄 검, 암모니오 메타크릴레이트 공중합체, 수소화 피마자유, 카르나우바 왁스, 파라핀 왁스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체 및 그의 혼합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 변형된 방출 및 박동 방출 투여형은 하나 또는 방출 속도 변형 부형제의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 성분으로서 아스파르탐, 아세술팜 칼륨, 시트르산, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 디아스코르브산, 에틸 아크릴레이트, 에틸 셀룰로스, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 메틸 메타크릴레이트, 민트 향미제, 폴리에틸렌 글리콜, 건식 (fumed) 실리카, 이산화규소, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 소르비톨, 자일리톨을 함유하는 신속 분산 또는 용해 투여 제형 (FDDF)를 추가로 포함할 수 있다. FDDF를 설명하기 위해 본원에서 사용될 때 용어 분산 또는 용해는 사용되는 약물 물질의 용해도에 좌우된다. 즉, 약물 물질이 불용성인 경우, 신속 분산 투여형이 제조될 수 있고, 약물 물질이 가용성인 경우, 신속 용해 투여형이 제조될 수 있다.
유사한 종류의 고체 조성물이 또한 락토스 또는 유당과 같은 부형제뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하는 연질 또는 경질 충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
코팅 및 외피 (shell), 예를 들어 장용 코팅 및 당업자에게 잘 공지된 다른 것을 갖는 고체 투여형, 예를 들어 정제, 당제 (dragee), 캡슐 및 과립이 제조될 수 있다. 이들은 또한 불투명화제를 포함하고, 또한 활성 화합물(들)을 지연, 지속 또는 제어 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합성 물질 및 왁스이다. 활성 화합물(들)은 또한 적절한 경우 하나 이상의 상기 언급된 부형제와 함께 미세-캡슐화 형태로 존재할 수 있다.
경구 투여용 액체 투여형은 제약상 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물에 추가로, 액체 투여형은 당업계에 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일, 특히, 면실유, 낙화생유, 옥배유, 올리브유, 피마자유 및 참기름, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 상기 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
상기 불활성 희석제 외에, 제약 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 현탁제, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 또는 상기 물질의 혼합물 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 수의과 용도에서 치료를 위해 형성될 수 있고, 여기서 본 발명의 화합물, 또는 그의 수의학상 허용되는 염, 또는 그의 수의학상 허용되는 용매화물 또는 전구-약물은 정상 수의학 실무에 따라 적합하게 허용되는 제형으로서 투여되고, 수의사는 특정 동물에 가장 적절할 투여 요법 및 투여 경로를 결정할 것이다.
본 발명의 하나 이상의 모노클로날 항체는 H5 조류 인플루엔자 바이러스 감염과 연관된 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 다른 항-바이러스제와 조합으로 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 다른 항바이러스제와 동시에, 따로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 항바이러스제의 예는 리바비린, 아만타딘, 히드록시우레아, 리바비린, IL-2, IL-12 및 펜타푸시드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
펩티드 스크리닝 방법, 및 항체 및 백신에 의해 인식되는 펩티드
본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 모방하는 짧은 펩티드를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 모방하는 짧은 펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 64-68, 70-73, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 및 96에 제시된 아미노산 서열을 갖는 짧은 펩티드를 제공한다. 상기 짧은 펩티드는 본 발명의 모노클로날 항체에 결합할 수 있다. 따라서, 상기 짧은 펩티드는 H5 헤마글루티닌과 동일한 항원 특이성을 갖는다. 짧은 펩티드는 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5로서 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 짧은 펩티드는 또한 항-H5 항체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 (i) 펩티드 디스플레이 라이브러리를 펩티드 발현에 적합한 조건 하에 배양하고; (ii) 배양 용액을 본 발명의 모노클로날 항체와 접촉시키고; (iii) 상기 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 선택하는 단계를 포함한다. 스크리닝에 사용되는 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 8H5, 3C8, 10F7, 4D1, 2F2 및/또는 3G4를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 본원에 포함된 실시예 11-13은 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 본 발명의 모노클로날 항체에 결합하는 짧은 펩티드를 성공적으로 스크리닝한 분석을 상세하게 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 생각하지 않아야 한다.
실시예 1. 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조
항원의 제조
수정된 9-일령 닭 배아에게 바이러스 균주 Ck/HK/Yu22/02 (H5N1) ("Yu22"로 언급됨)를 2일 동안 30℃에서 접종하였다. 닭 배아 상등액을 수거하여 증폭된 Yu22 바이러스를 얻었다. 살아있는 Yu22 바이러스를 수거하고, 0.03% 포르말린으로 4℃에서 불활성화시켰다. 불활성화된 바이러스의 HA 항원을 검출하고, 불활성화된 바이러스의 역가를 측정하였다 (HA 역가 결정 및 적혈구 응집 억제 (HI) 검출을 위한 구체적인 방법에 대한 WHO의 지침을 참고한다. 본 발명자들은 바이러스 균주 HA=I 024를 선택하였고 홍콩 대학교의 미생물학부 (Microbiology Department of Hong Kong University)에서 제공받았다).
마우스.
6주령의 암컷 Balb/c 마우스를 시아멘 대학교의 항암 센터 (Anti-Cancer Center of Xiamen University)로부터 상업적으로 입수하였다. 마우스를 센터에 둔 상태로 시험하였다.
하이브리도마의 제조.
본 발명자들은 표준 생체 내 면역화 및 PEG 융합 방법을 사용하여 하이브리도마를 제조하였다. 방법에 대한 상세한 내용은 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)]을 참고한다. 방법을 아래에 간단하게 설명한다.
마우스의 면역화. 상기 언급된 바이러스 상등액을 혼합하고 동일 부피의 완전 프로인트 항원보강제 (CFA)로 에멀젼화시켰다. 혼합물을 주사당 마우스마다 300 ㎕의 투여량으로 마우스의 4 다리 상의 근육의 여러 지점에 주사하였다. 제1 면역화 후 제15일 및 제29일에, 혼합물을 부스터 (booster)로서 동일한 투여량으로 다시 마우스에게 주사하였다. 제2 부스터 후에, 혈액 샘플을 마우스로부터 채취하여 억제 효능을 적혈구 응집 억제 분석에 의해 결정하였다. 효능이 1:640에 도달할 때, 마우스 비장을 채취하여 융합 실험을 수행하였다. 또다른 부스터를 융합 실험 72hr 전에 마우스당 50 ㎕의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 10개의 융합 플레이트가 생산되었다.
융합. 최고 HI 역가를 갖는 마우스 비장을 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 먼저, 비장을 연마하여 비장 세포 현탁액을 얻은 후, 10개의 비장 세포 대 1개의 골수종 세포의 비율로 대수 증식기 성장 상태의 SP2/0 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 세포를 PEG1500의 존재 하에 1분 동안 함께 융합시켰다. 이어서, 100 ml의 융합된 세포 용액을 10개의 96-웰 플레이트에 배양하였다. 융합 배지는 HAT 및 20% FBS를 포함하는 RPMI1640 완전 배지이었다. 목적하는 항원 특이성을 갖는 클론을 HI 시험에 의해 스크리닝하고, 3회의 클로닝 후에 안정한 모노클로날 항체 생산 세포주를 얻었다.
하이브리도마의 스크리닝. 융합된 세포를 96-웰 세포 플레이트 상에서 10일 동안 배양하였다. HI 시험을 수행하기 위해 세포 현탁액을 추출하였다. 세포주에 의해 분비된 항체가 Yu22 바이러스 균주와 닭 혈액 사이의 응집을 안정적으로 억제할 수 있을 때까지 양성 클론을 함유하는 웰을 추가로 배양하였다.
스크리닝 결과. 6개의 모노클로날 항체 세포주, 즉 2F2, 3G4, 3C8, 4D01, 8H5 및 10F7이 얻어졌다.
하이브리도마의 배양. 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 안정한 세포주를 먼저 96-웰 플레이트를 사용하여 CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 24-웰 플레이트로 이송하고, 다시 추가의 증폭을 위해 50 ml 세포 배양 플라스크에 이송하였다. 세포를 세포 플라스크로부터 수거하고, 마우스 복강 내에 주사하였다. 복수액을 7-10일 후에 마우스 복강으로부터 추출하였다.
모노클로날 항체의 정제.
복수액을 50% 황산암모늄으로 침전시킨 후, PBS (pH 7.2)로 투석하고, HPLC에 의해 DEAE 칼럼으로 정제하여 정제된 모노클로날 항체를 얻었다. 정제된 모노클로날 항체의 순도는 SDS-PAGE로 결정하였다.
모노클로날 항체의 바이러스 HI 분석
상이한 바이러스 서브타입에 속하는 베트남, 인도네시아, 말레이시아, 태국, 홍콩, 중국 유럽 등으로부터의 H5N1 바이러스의 34개 균주 (Chen et al. PNAS, 103: 2845 (2006)) 및 비-H5 바이러스의 14개 균주 (H1~H13, 닭 NDV)를 선택하여 HI 분석을 사용하여 선택된 모노클로날 항체와 바이러스의 반응성을 시험하였다. 그 결과를 표 1 및 2에 나타낸다. 결과는 H5 모노클로날 항체의 5개의 모든 균주가 H5 바이러스에 대한 우수한 특이성을 갖고, 비-H5 바이러스와 반응하지 않음을 보여주었다. H5 바이러스 균주와의 반응 활성에 있어서, 반응 특이성은 상이한 모노클로날 항체 사이에서 상이하였다. 3G4의 가장 좁은 반응 스펙트럼을 제외하고, 다른 4개의 모노클로날 항체의 바이러스와의 반응 스펙트럼은 모두 100%이거나 이에 근접하였다.
HI 분석을 사용할 때 모노클로날 항체와 H5 또는 비-H5 바이러스 균주 사이의 양성 반응율
모노클로날 항체 항체 서브타입 H5 바이러스 균주 (양성 수/총 바이러스 수) 비-H5 바이러스 균주 (양성 수/총 바이러스 수)
2F2 IgG1 28/34 0/14
3G4 IgG1 10/34 0/14
3C8 IgG1 32/34 0/14
4D1 IgG1 34/34 0/14
8H5 IgG2a 34/34 0/14
10F7 IgM 34/34 0/14
Figure 112008060377410-PCT00001
주: <, 100 미만의 역가.
모노클로날 항체와 바이러스 사이의 중화 시험
상기 언급된 모노클로날 항체의 H5N1 바이러스와의 중화 활성을 마이크로-웰 중화 시험으로 검출하였다 (Hulse-Post et al., PNAS, 102:10682-7(2005)). 표 3의 결과는 모노클로날 항체 8H5가 모든 H5N1 바이러스 균주에 대해 우수한 중화 활성을 가졌음을 증명한다.
Figure 112008060377410-PCT00002
주: /, 데이타 없음; <, 100 미만의 역가.
실시예 2. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 항원 검출 키트의 조립 (효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA)를 이용)
키트는 샘플에서 서브타입 H5 인플루엔자 바이러스의 HA 항원을 검출하기 위해 이중-항체 샌드위치 방법을 사용하였다. 먼저, 서브타입 H5 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체를 키트 박스 내의 폴리텐 마이크로-웰 플레이트의 표면에 미리 부착시켰다. HA 항원을 포함하는 서브타입 H5 인플루엔자 바이러스를 미리 용해시킨 후, 마이크로-웰에 첨가하였다. 미리 부착된 모노클로날 항체는 HA 항원을 포획할 것이다. 이어서, 효소-표지된 모노클로날 항체를 웰에 첨가하자, 항체가 항원에 결합하였다. 최종적으로, 결합 결과를 효소에 의해 촉매화된 기질 변색에 의해 가시화시켰다. 샘플이 임의의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하지 않거나 바이러스가 서브타입 H5 인플루엔자 바이러스가 아닐 경우, 기질은 변색하지 않을 것이다. 샘플은 동물 폐기물, 구강 및 비강 분비물, 무손상 바이러스, 또는 닭 배아에서 배양된 용해된 바이러스일 수 있다.
ELISA 플레이트의 제조
서브타입 H5 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체를 키트 내의 폴리텐 마이크로-웰 플레이트의 표면에 미리 부착시켰다. 모노클로날 항체는 1O nM 포스페이트 버퍼 (PB, pH=7.4) 내에서 밤새 37℃에서 인큐베이팅함으로써 플레이트에 미리 부착시키고, 이어서 PBST (1O mM PBS + 0.05 % Tween 20)로 세척하고, 건조시키고, 밀봉 용액 (1O mM PBS + 2% 젤라틴)으로 2시간 동안 37℃에서 밀봉하였다. 이어서, 플레이트를 다시 건조시키고, 진공 포장하여 검출 키트의 ELISA 플레이트 (8x12 웰)를 제조하였다.
검출 키트의 다른 성분의 제조
바이러스 용해 용액의 조성:
용해 버퍼 A (LB-A): 6% CHAPS + 2% Tween-20 + 1% Tween-80;
용해 버퍼 B (LB-B): 이소프로필로 용해된 10O mM PMSF, 최종 작업 농도는 2 nM이었다.
용해 버퍼 C (LB-C): 1O mM PBS, pH=7.4.
효소-표지된 시약: 항-HA 모노클로날 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지하고, 사용을 위해 적절한 농도로 희석하였다.
양성 대조군: 불활성화된 H5N1-Yu22 바이러스 균주를 양성 대조군으로서 적절한 역가로 사용하였다.
음성 대조군: 용해 버퍼 A를 음성 대조군으로서 사용하였다.
전개 버퍼 A: 전개 버퍼 A: 13.4 g/L Na2HPO4.12H2O + 4.2 g/L 시트르산 수용액 + 0.3 g/L 우레아 퍼옥시드.
전개 버퍼 B: 0.2 mM/L 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) + 20 mM/L 디메틸 포름아미드 (DMF).
정지 버퍼: 2M 진한 황산
농축된 세척 버퍼: 2OxPBST
마이크로플레이트 밀봉 필름: 2개의 시트
집록 백 (Ziplock Bag): 1개
사용설명서: 1개
검출 과정
용액 제조: 50 ml의 농축된 세척 버퍼 (2Ox)를 사용을 위해 증류수 또는 탈이온수를 사용하여 1000 ml로 희석하였다.
번호 매김: 샘플을 마이크로플레이트 순서에 따라 번호를 매겼다. 3개의 음성 대조군 웰, 2개의 양성 대조군 웰 및 1개의 블랭크 대조군 웰을 모든 플레이트에 할당하였다 (샘플 및 효소-표지된 시약은 블랭크 대조 웰에 첨가하지 않고, 블랭크 대조 웰에 대한 나머지 단계는 다른 웰과 동일하였다).
샘플 처리 및 적용
샘플이 액체일 경우 (본래의 샘플, 닭 배아 배양 샘플, 세포 배양 샘플 포함): 100 ㎕ LB-A + 4 ㎕ LB-B의 비율의 적절한 양의 LB-A와 LB-B의 혼합물을 제조하였다. 100 ㎕ 샘플을 먼저 플레이트 상의 각각의 웰에 첨가한 후, 100 ㎕의 제조된 LB-A와 LB-B의 혼합물을 첨가하였다.
샘플이 건조 면봉 채취물 샘플일 경우: 1 ml LB-A, 40 ㎕ LB-B 및 1 ml PBS를 함께 혼합하고, 샘플 튜브에 첨가하였다. 샘플을 교반하고, 용액에 용해시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 현탁을 위해 다시 교반하고, 5분 동안 6OOO rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 추출하고, 100 ㎕의 상등액을 시험을 위해 샘플로서 웰에 첨가하였다.
샘플이 건조 동물 폐기물일 경우: 1 ml LB-A, 40 ㎕ LB-B 및 1 ml PBS를 함께 혼합하고 샘플 튜브에 첨가하였다. 건조 동물 폐기물을 용액에 현탁시켜 10% (w/v) 샘플 현탁액을 제조하였다. 샘플을 교반 후에 용해시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 현탁을 위해 다시 교반하고, 5분 동안 6OOO rpm에서 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 추출하고, 100 ㎕의 상등액을 시험을 위해 샘플로서 웰에 첨가하였다.
음성 및 양성 대조군 웰은 매 검출 실험에 포함되어야 한다. 1OO ㎕의 대조 용액을 각각의 대조 웰에 첨가하여야 한다.
인큐베이션: 플레이트를 마이크로플레이트 밀봉 필름으로 밀봉하고, 플레이트 진탕기를 고속 또는 중속으로 설정하여 플레이트를 60분 동안 실온에서 (25~28℃) 진탕하였다.
세척: 밀봉 필름을 조심스럽게 제거하고, 플레이트를 플레이트 세척기로 5회 세척한 후 건조하였다.
효소 첨가: 100 ㎕의 효소 표지된 시약을 각각의 관련 웰에 첨가하였다.
인큐베이션: 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다.
단계 6을 반복하였다.
색상 반응: 각각 50 ㎕의 전개 버퍼 A 및 전개 버퍼 B를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 진탕하여 잘 혼합하고, 색상 반응을 위해 혼합물을 30분 동안 37℃에서 광으로부터 차단하였다.
검출: 1 방울의 정지 버퍼 (50 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하고 부드럽게 진탕하여 잘 혼합하였다. 각각의 웰의 OD값을 450 nm의 단일 파장 (블랭크 (blank) 대조군이 필요함) 또는 450 nm/630 nm의 이중 파장에서 플레이트 분석기로 결정하였다.
결과 평가
a) 정상 범위의 음성 대조군: 정상 조건 하에서, 음성 웰의 OD 값은 0.1 이하이었다 (모든 음성 대조군 웰의 OD 값이 0.1 초과일 경우, 이 값은 버려야 하고; 모든 음성 대조군 웰의 OD 값이 0.1 초과일 경우, 실험을 반복하여야 한다. 음성 대조군 웰의 OD 값이 0.03 미만일 경우, OD 값은 0.03으로 간주하여야 한다).
b) 정상 범위의 양성 대조군: 정상 조건 하에서, 양성 대조군의 OD 값은 0.5 이상이어야 한다.
c) 컷오프 (CUTOFF) 값의 결정 (최저 상황): 0.15를 음성 대조군 웰의 평균 OD 값에 더하였다.
d) 양성 반응의 결정: OD 값≥컷오프이면, 이것은 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대해 양성 반응이었다.
e) 음성 반응의 결정: OD 값<컷오프이면, 이것은 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대해 음성 반응이었다.
임상 샘플의 검출 시험
키트는 모든 종류의 H5 및 비-H5 바이러스 샘플을 검출하기 위해 사용하였고, 그 결과를 표 4에 나타낸다. 이는 키트가 매우 우수한 검출 감도 및 특이성을 가졌음을 입증한다.
H5 항원 ELISA 방법을 사용한 H5 및 비-H5 바이러스 샘플의 검출
샘플 종류 H5 비-H5
인간 면봉 채취물 - 1a/200b
닭 면봉 채취물 144a/300b 1a/87b
닭 배아 배양액 38a/38b(≤1 HA 역가) 0a/46b(≥256 HA 역가)
-, 측정되지 않음; a, 양성 샘플의 수; b, 시험된 샘플의 총수; HA 역가는 인플루엔자 바이러스의 역가를 평가하기 위한 표준 단위이다.
실시예 3. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 항-HA 항체에 대한 검출 키트 (ELISA)의 조립
키트는 혈액 혈청 샘플에서 특이적 항-HA 항체를 검출하기 위해 경쟁 방법을 사용하였다. 먼저, 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체를 키트 내의 마이크로웰 플레이트의 표면에 미리 부착시켰다. 이어서, 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 재조합 발현된 HA 항원을 미리 부착된 항체에 부착시켰다. 혈청 샘플 및 효소-표지된 모노클로날 항체를 플레이트에 첨가할 때, 샘플 내의 특이적 항체 및 효소 표지된 모노클로날 항체는 플레이트 상의 항원에 결합하기 위해 경쟁할 것이다. 혈청 샘플이 효소-표지된 모노클로날 항체의 HA 항원에 대한 결합을 현저하게 억제할 수 있다면, 이것은 샘플이 특이적 항-HA 항체를 함유하였음을 입증할 것이다. 샘플이 항-HA 항체를 함유하지 않거나 또는 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항체가 아니라면, 효소-표지된 모노클로날 항체와 항원 사이의 반응은 억제되지 않을 것이다.
ELISA 플레이트의 제조
서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체를 키트 내의 폴리텐 마이크로웰 플레이트의 표면에 미리 부착시켰다. 모노클로날 항체는 1O nM 포스페이트 버퍼 (PB, pH-7.4) 내에서 밤새 37℃에서 인큐베이팅함으로써 부착시키고, PBST (1O mM PBS + 0.05 % Tween 20)로 1회 세척하고, 건조시킨 후, 밀봉 용액 (1O mM PBS + 2% 젤라틴)으로 2시간 동안 37℃에서 밀봉하였다. 이를 재조합 HA 항원의 부착을 위해 다시 건조시켰다. 재조합 HA 항원을 1O mM PBS (pH=7.4) 중에 희석시킨 후, 100 ㎕의 희석된 용액을 항체가 미리 부착된 플레이트의 각각의 웰 내에 첨가하고, 2hr 동안 37℃에서 인큐베이팅하고, 1회 세척하고, 2h 동안 밀봉시킨 후, 진공 하에서 포장하여 키트의 최종 ELISA 플레이트 (8x12 웰)을 제조하였다.
키트의 다른 성분의 제조
a) 효소-표지된 시약: H5 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 모노클로날 항체를 HRP로 표지하였다. 표지된 항체를 적절한 희석액에 보관하여 시약을 제조하였다.
b) 양성 대조군: H5 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대한 적절한 농도의 모노클로날 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다.
c) 음성 대조군: 100% 송아지 혈청 (NBS)을 음성 대조군으로서 사용하였다.
d) 전개 버퍼 A: 13.4 g/L Na2HPO4.12H2O + 4.2 g/L 시트르산 수용액 + 0.3 g/L 우레아 퍼옥시드
e) 전개 버퍼 B: 0.2 mM/L 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) + 20 mM/L 디메틸 포름아미드 (DMF)
f) 정지 버퍼: 2M 진한 황산.
g) 농축된 세척 버퍼: 2Ox PBST.
h) 마이크로플레이트 밀봉 필름: 2개의 조각
i) 집록 백: 1개
j) 사용설명서: 1개
검출 과정
a) 액체 제조: 50 ml의 농축된 세척 버퍼 (2Ox)를 추가 사용을 위해 증류수 또는 탈이온수로 1000 ml로 희석하였다.
b) 번호 매김: 샘플을 마이크로플레이트 순서에 따라 번호를 매겼다. 3개의 음성 대조군 웰, 2개의 양성 대조군 웰 및 1개의 블랭크 대조군 웰을 모든 플레이트에 할당하였다 (샘플 및 효소-표지된 시약은 블랭크 대조 웰에 첨가하지 않고, 대조군에 대한 나머지 단계는 샘플과 동일하였다).
c) 샘플 적용: 50 ㎕의 샘플, 음성 대조군 및 양성 대조군을 관련 웰에 첨가하였다.
d) 효소 첨가: 50 ㎕의 효소 표지된 시약을 관련 웰에 첨가하였다.
e) 인큐베이션: 웰 내의 용액을 혼합한 후 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉한 후, 60분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다.
f) 세척: 밀봉 필름을 조심스럽게 제거하고, 플레이트를 플레이트 세척기로 5회 세척한 후 건조하였다.
g) 색상 반응: 각각 50 ㎕의 전개 버퍼 A 및 전개 버퍼 B를 각각의 웰에 첨가하고, 부드럽게 진탕하여 웰을 잘 혼합하였다. 색상 반응을 위해 혼합물을 15분 동안 37℃에서 광으로부터 차단하였다.
h) 검출: 1 방울의 정지 버퍼 (50 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하고 부드럽게 진탕하여 웰을 혼합하였다. 각각의 웰의 OD값을 450 nm의 단일 파장 (블랭크 대조군이 필요함) 또는 450 nm/630 nm의 이중 파장에서 플레이트 분석기로 결정하였다.
결과 평가
a) 정상 범위의 음성 대조군: 정상 조건 하에서, 음성 대조군의 OD 값은 0.1 이상이었다.
b) 정상 범위의 양성 대조군: 정상 조건 하에서, 양성 대조군의 OD 값은 0.1 이하이어야 한다.
c) 컷오프 값의 결정: 컷오프 값 = 음성 웰의 평균 OD 값의 1/2
d) 양성 반응의 결정: 샘플의 OD값<컷오프이면, 샘플은 항-HA 항체에 대해 양성이었다.
e) 음성 반응의 결정: 샘플의 OD값≥컷오프이면, 샘플은 항-HA 항체에 대해 음성이었다.
임상 샘플의 검출 시험
H5 항체 키트는 인간 및 닭 혈청 샘플을 시험하기 위해 사용하였다. 표 5는 키트가 매우 우수한 검출 감도 및 특이성을 가졌음을 보여준다.
항-H5 항원 ELISA 방법을 사용한 혈청 샘플의 검출
샘플 종류 H5 비-H5
인간 혈청 - 0a/1200b
닭 혈청 49a/50b 0a/24b
-, 측정되지 않음; a, 양성 샘플의 수; b, 시험된 샘플의 총수
실시예 4. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 항원 검출 키트의 조립 (콜로이드성 금 표지 방법)
시험지는 콜로이드성 금 면역크로마토그래피 기술을 사용하는 새로운 세대의 진단 시약이었다. 시험될 수 있는 샘플은 동물 폐기물, 구강 및 비강 분비물, 무손상 바이러스 또는 닭 배아에서 배양된 용해된 바이러스 등을 포함하였다. 제품은 1회용으로만 디자인되었고, 간편하고, 안전하며, 신뢰할 수 있고, 공해를 유발하지 않는다. 제품은 그 자체에 품질 관리 기능이 존재하고, 추가의 시약을 필요로 하지 않았다. 제시된 결과는 분명하였다. 반응은 신속하였고, 작동 완료를 위해 단지 30분이 필요하였다.
시험지는 니트로셀룰로스 필터 상의 시험 영역에 항-HA 모노클로날 항체를, 대조 영역에 염소 항-마우스 IgG를 포함하였다. 시험시에, 샘플 내의 H5 인플루엔자 바이러스 및 콜로이드성 금 표지된 항-HA 모노클로날 항체 (Ab-Au)는 복합체 (Ag-Ab-Au)를 형성하였고, 복합체는 층 분리 효과에 의해 막을 따라 이동하였고, 시험 영역에서 항-HA 모노클로날 항체와 이중 항체 샌드위치 면역복합체를 형성할 수 있었다. 복합체가 양성 샘플인 경우, 이는 각각 시험 영역 및 대조 영역에서 적색선을 형성할 수 있고, 음성 샘플인 경우에는, 대조 영역에서만 적색선을 형성할 수 있었다.
키트 내의 시험지의 제조: 시험지는 표준 방법을 사용하여 제조하였다.
키트는 시험지, 용해 버퍼 및 사용설명서를 포함하였다.
작동 과정
a) 샘플 처리 및 적용
i) 샘플이 액체일 경우 (본래의 샘플, 닭 배아 배양 샘플, 세포 배양 샘플 포함): 100 ㎕ LB-A + 4 ㎕ LB-B의 비율의 적절한 양의 LB-A와 LB-B의 용해 혼합물을 제조하였다. 100 ㎕ 샘플을 플레이트의 각각의 웰에 첨가한 후, 70 ㎕의 용해 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다.
ii) 샘플이 건조 면봉 채취물 샘플인 경우:
1 ml LB-A, 40 ㎕ LB-B 및 1 ml PBS를 함께 혼합하고, 샘플 튜브에 첨가하였다. 샘플을 교반하고, 용해시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 재현탁을 위해 다시 교반하고, 5분 동안 6OOO rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 추출하고, 70 ㎕의 상등액을 검출을 위해 각각의 웰에 첨가하였다.
iii) 샘플이 건조 동물 폐기물인 경우:
1 ml LB-A, 40 ㎕ LB-B 및 1 ml PBS를 함께 혼합하고 샘플 튜브에 첨가하였다. 건조 동물 폐기물을 혼합물에 현탁시켜 10% (w/v) 샘플 현탁액을 제조하였다. 샘플을 교반 후에 용해시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 재현탁을 위해 교반한 후, 5분 동안 6OOO rpm에서 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 추출하고, 70 ㎕의 상등액을 시험을 위해 각각의 웰에 첨가하였다.
b) 70 ㎕ 샘플을 샘플 로딩 부위에 점진적으로 첨가한 후, 실온에 배치하였다.
결과 평가: 결과를 30분 내에 관찰하였다.
샘플은 2개의 적색선이 나타날 때 양성이고, 품질관리선만 나타나면 음성이고, 적색선이 나타나지 않으면 무효였다. 도 1은 시험지를 사용한 검출 결과를 보여준다.
실시예 5. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항-HA 항체 검출 키트의 조립 (콜로이드성 금 표지 방법)
시험지는 니트로셀룰로스 필터 상의 시험 영역에 항-HA 모노클로날 항체를, 대조 영역에 염소 항-마우스 IgG를 포함하였다. 콜로이드성 금으로 표지된 동결 건조 항-HA 모노클로날 항체 및 서브타입 H5 인플루엔자의 재조합적으로 발현된 HA 항원이 유리 섬유 상에 존재하였다. 샘플 내의 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스 항-HA 항체를 검출하기 위해 경쟁 방법을 적용하였다. 항-HA 항체가 샘플에 존재할 경우, 이 항체는 콜로이드성 금 표지된 항-HA 모노클로날 항체와 경쟁하고, 따라서 콜로이드성 금 표지된 항체와 HA 항원의 복합체 형성을 차단할 것이고, 색상이 나타날 수 없고, 샘플이 음성인 경우에는, 복합체가 형성되고 색상이 나타날 수 있을 것이다.
키트의 시험지의 제조: 시험지는 표준 방법을 사용하여 제조하였다.
키트의 조성: 키트는 시험지 및 사용설명서를 포함하였다.
검출 과정
시험지를 준비하고, 70 ㎕ 샘플을 샘플 로딩 부위에 점진적으로 첨가한 후, 실온에 배치하였다. 결과를 30분 내에 관찰하였다. 30분이 경과한 경우에 결과는 무효로 처리되었다.
결과 평가
샘플은 품질관리선만이 나타날 때 양성이고, 2개의 적색선이 나타나면 음성이고, 적색선이 나타나지 않으면 무효였다. 도 2는 상기 시험의 결과를 보여준다.
실시예 6. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 항원 Dot-ELISA 검출 키트의 조립.
시험지를 니트로셀룰로스 필터 상의 시험 영역의 항-H5 (HA) 모노클로날 항체 및 대조 영역의 염소 항-마우스 IgG로 예비 코팅하였다. 서브타입 H5 인플루엔자 바이러스를 포함하는 용해된 샘플을 첨가하였고, 예비 코팅된 모노클로날 항체가 이들을 포획하여 항원-항체 복합체 (Ab-Ag)가 형성된 후, 효소-표지된 모노클로날 항체 (Ab-HRP)를 첨가하여 Ab-Ag 복합체에 결합시키고, 항체-항원-효소 표지된 항체 복합체 (Ab-Ag-Ab-HRP)가 형성된 후, 효소 촉매화된 기질 착색을 통해 결과를 관찰하였다. 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스가 존재할 때, 기질 착색이 시험 영역과 대조 영역 모두에서 나타날 것이다. 조류 인플루엔자 바이러스의 서브타입 H5가 존재하지 않을 때, 시험 구역은 색상을 나타내지 않을 것이고, 대조 영역에서만 착색 반점이 형성될 것이다.
침윤 검출 장치의 제조
니트로셀룰로스 막 및 물 흡수 여과지를 평평한 바닥의 지지체 상에 두었다. 중간에 개구부를 갖는 들어맞는 커버를 바닥의 지지체의 상부에 놓았다. 커버 상의 개구부에 들어맞는 형태를 갖는 유동 제어 유닛은 개구부 내에 잘 일치하였다. 유동 제어 유닛은 로딩 샘플 및 대조군에 대해 각각 2개의 구멍을 갖는다. 유동 제어 유닛의 기저부를 바닥의 지지체에 대해 긴밀하게 압축하여 니트로셀룰로스 막 및 여과지 상에서의 샘플 유동을 제한하였다. 유동 제어 유닛 내에서 항-H5 (HA) 모노클로날 항체를 시험 영역 상에 코팅하고, 염소 항-마우스 IgG를 대조 영역 상에 코팅하였다. 시험지를 1시간 동안 공기 건조시키고, 진공 포장하여 침윤 검출 장치를 제조하였다.
키트의 조성
키트는 다음 물품을 포함하였다:
a) 침윤 검출 장치
b) 샘플 처리 장치: 그 위에서 나사형태로 조이는 필터 캡 (cap)이 존재하는 병; 필터 캡은 용액이 그를 통해 여과되도록 중앙에 필터를 함유하였다.
c) 효소-표지된 시약: HRP로 항-H5 (HA) 모노클로날 항체를 표지하고 적절한 농도로 희석하여 효소-표지된 시약을 제조하였다.
d) 용해 버퍼: 3% NP40 + 1% Triton X-100 + 40 mM PBS, pH=7.4.
e) 세척 버퍼: 2% Triton X-100 + 2O mM EDTA + 0.25% Tween 20 + 0.1% Proclin 300 + 15O mM NaCl + 5 mM PBS, pH=7.4.
f) 전개 버퍼: 막에 대한 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 액체 기재 시스템.
g) 정지 버퍼: H2O 중의 50 mM 시트르산.
h) 사용설명서
검출 과정
a) 샘플 처리 및 적용:
200 ㎕ 샘플을 각각의 샘플 처리 유닛에 첨가하였다. 8방울의 용해 버퍼를 투입하고 완전히 혼합하였다. 이어서, 모든 용해된 샘플을 샘플 처리 유닛으로부터 필터 캡을 통해 압착한 후 검출 웰 내로 로딩하였다. 샘플이 완전히 흡수된 후 (약 25분), 유동 제어 유닛을 제거하였다.
b) 세척: 5방울의 세척 버퍼를 첨가한 후, 완전히 흡수되도록 방치하였다.
c) 효소 첨가: 4방울의 효소-표지된 시약을 첨가하고, 모든 효소가 흡수된 후에, 샘플을 방치하여 2분 동안 반응시켰다.
d) 세척: 2회 세척하였다. 8방울의 세척 버퍼를 제1 세척시에 첨가하고, 제1 세척시의 세척 버퍼가 흡수된 후 다시 5방울을 첨가하고, 완전히 흡수되도록 방치하였다.
e) 착색: 2방울의 전개 버퍼를 첨가하였다. 액체가 완전히 흡수되고 2분 후에 결과를 관찰하였다. 그 결과는 5분 후에 임상적 유의성을 갖지 않았다. 도 3은 결과 평가에 대한 개략도를 보여준다.
임상 샘플 검출. H5 신속 검출 키트를 사용하여 임상 샘플을 검출하고, 그 결과를 표 6에 나타낸다. 결과는 키트가 매우 우수한 감도 및 특이성을 가졌음을 입증하였다.
H5 항원 면역여과 방법에 의한 임상 바이러스 샘플의 검출
샘플 종류 H5 비-H5
인간 면봉 채취물 - 1a/36b
닭 면봉 채취물 55a/70b 2a/137b
닭 배아 배양액 38a/38b 0a/50b
-, 측정되지 않음; a, 양성 샘플의 수; b, 시험된 샘플의 총수
실시예 7. 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자의 단리
107개의 하이브리도마 세포를 반부착성 배양 플라스크 내에서 배양하였다. 플라스크 벽에 부착된 세포를 벽으로부터 불어내어 현탁시켰다. 세포를 다른 4 ml 원심분리관에 이송하고, 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 침전된 세포를 모으고, 100 ㎕ PBS (pH=7.45)에 다시 현탁시킨 후, 다른 1.5 ml 원심분리관에 이송하였다. 800 ㎕ Trizol (로슈 (Roche), 독일)을 원심분리관에 첨가하고, 부드럽게 혼합하여 10분 동안 인큐베이팅하였다. 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하여 15초 동안 교반한 후, 1O분 동안 인큐베이팅하고, 12000 rpm에서 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 액체의 상부층을 다른 1.5 ml 원심분리관에 이송하였다. 동일한 부피의 이소프로판올을 원심분리관에 첨가하고, 혼합하여 10분 동안 인큐베이팅하였다. 혼합물을 12000 rpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 잔여물을 세척하기 위해 600 ㎕의 75% 에탄올로 세척하였다. 혼합물을 12000 rpm에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 나머지 혼합물을 진공 하에서 60℃에서 5분 동안 침전시켰다. 투명 침전물을 70 ㎕의 DEPC H2O에 용해시켰다. 용액을 2개의 튜브에 나누고, 역전사를 위한 1 ㎕ 프라이머를 각 튜브에 첨가하였다. 한 튜브 내의 프라이머는 MVJkR (5'-CCg TTT(T/g) AT (T/C) TC CAg CTT ggT (g/C) CC-3')이었다. 이를 사용하여 경쇄의 가변 구역 내의 유전자를 증폭하였다. 다른 튜브 내의 프라이머는 MVDJhR (5'-C ggT gAC Cg (T/A)ggT (C/g/T) CC TTg (g/A) CC CCA-3')이었고, 이를 사용하여 중쇄의 가변 구역 내의 유전자를 증폭하였다. 1 ㎕ dNTP (상하이 상곤 (Shanghai Sangon))를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 72℃에서 10분 동안 수조에 위치시켰다. 이어서, 튜브를 즉시 5분 동안 빙조에 위치시켰다. 10 ㎕의 5x 역전사 버퍼, 1 ㎕ AMV (lO u/㎕, 프로메가 (Promega)) 및 1 ㎕ Rnasin (4O u/㎕, 프로메가)을 튜브에 첨가하고 혼합하였다. RNA의 cDNA로의 역전사는 42℃에서 수행하였다.
중합효소 연쇄 반응을 (PCR)을 이용하여 항체 유전자의 경쇄 및 중쇄 가변 구역을 증폭하였다. 프라이머 세트는 상하이 바이오아시아 (Shanghai Bioasia)에서 합성하였다. 다른 2개의 프라이머, 즉 MVJkR 및 MVDJhR은 상하이 바이오아시아에서 설계하고 합성하. 상기 설명된 역전사에 의해 합성된 2개의 cDNA 분자를 주형으로서 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 94℃ 5분, 94℃ 40초, 53℃ 1분, 72℃ 50초, 35 사이클 반복, 72℃ 15분. PCR 산물을 수거하고 pMD 18-T 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 산물은 상하이 바이오아시아에 의해 서열결정되고, 가변 구역의 서열은 BLAST 서열 비교를 통해 확인되었다. 대응하는 아미노산 서열은 유전자 서열로부터 추론되었다.
상기 방법을 사용하여, 항체의 가변 구역 유전자를 조류 인플루엔자 모노클로날 항체의 6개의 균주의 하이브리도마 세포주로부터 클로닝하고, 대응하는 아미노산 서열이 추론되었다. 프라이머 서열을 표 7에 나타낸다. 모노클로날 항체의 6개의 균주의 가변 구역 핵산 및 상응하는 아미노산의 일련 번호를 표 8에 제시한다. 상보성 결정 구역 (CDR)을 표 9에 나타낸다.
Figure 112008060377410-PCT00003
모노클로날 항체의 6개의 균주의 가변 구역 핵산 및 상응하는 아미노산의 일련 번호
모노클로날 항체 명칭 Vh 핵산 서열 Vh 아미노산 서열 Vk 핵산 서열 Vk 아미노산 서열
8H5 서열 1 서열 2 서열 3 서열 4
3C8 서열 5 서열 6 서열 7 서열 8
10F7 서열 9 서열 10 서열 11 서열 12
4D1 서열 16 서열 17 서열 18 서열 19
3G4 서열 20 서열 21 서열 22 서열 23
2F2 서열 24 서열 25 서열 26 서열 27
Figure 112008060377410-PCT00004
실시예 8. 8H5 단일쇄 항체의 발현 및 그의 활성 검출.
8H5 항체 유전자의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역 유전자를 짧은 펩티드 (GGGGS)를 코딩하는 핵산에 연결하여 단일쇄 항체를 코딩하는 DNA 단편을 형성하였다. 8H5 HF1/8H5 HR1을 8H5 중쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 사용하였다. 8H5 KF1/8H5 KR1을 8H5 경쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 사용하였다. 상기 프라이머의 서열을 표 10에 나타낸다. 증폭된 DNA 단편을 회수하고, 추가 라운드의 PCR 증폭을 통한 중복 연장을 수행하기 위해 서로에 대한 프라이머 및 주형으로서 사용하였다. 소수의 전장 단일쇄 항체 DNA 단편을 얻었다. 이어서, 전장 DNA 단편을 주형으로서 사용하고, 8H5 HF1/8H5 KRl을 다수의 전장 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머로서 사용하였다. 증폭된 DNA 단편을 회수하고, BamH I 및 Sal I으로 소화시키고, 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내에 클로닝하였다. ER2566 이. 콜라이를 숙주 세포로서 사용하여, 단일쇄 항체 단백질을 표준 방법에 의해 발현시켰다. 발현된 단백질은 불용성 봉입체 (inclusion body) 형태로 존재하였다. 봉입체를 초음파 처리로 파쇄하고, 생성되는 침전물을 표준 방법으로 정제하였다. 정제된 침전물을 8M 우레아에 용해시켰다. 우레아 용액을 1xPBS 중에서 서서히 투석하여 단백질을 재생시켰다. 투석된 용액을 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 나머지 침전물을 제거하였다. 마지막으로, 정제된 단일쇄 항체 용액을 활성에 대해 시험하였다.
Figure 112008060377410-PCT00005
Figure 112008060377410-PCT00006
Figure 112008060377410-PCT00007
경쟁적 ELISA 방법을 적용하여 정제된 8H5 단일쇄 항체의 활성을 결정하였다. 조류 인플루엔자 폴리클로날 항체를 폴리스티렌 플레이트에 예비 코팅하고, BSA로 차단하고, 50 ㎕의 상기 모노클로날 항체 용액 및 50 ㎕ 조류 인플루엔자 H5 바이러스를 시험 웰에 투입하였다. 50 ㎕ 1xPBS 및 50 ㎕ 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스를 음성 대조군 웰에 투입하고, 50 ㎕ 폴리클로날 항체 용액 및 50 ㎕ 서브타입 H5 조류 인플루엔자 바이러스를 양성 대조군 웰에 투입하였다. 웰 내의 용액을 부드럽게 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, HRP 표지된 조류 인플루엔자 폴리클로날 항체를 2차 항체로서 첨가하였다. 용액을 추가로 0.5시간 동안 인큐베이팅하고, 전개 버퍼 A 및 B의 첨가 후에 15분 동안 37℃에서 색상을 나타나게 하였다. 결과를 발색 반응이 정지되니 후에 마이크로플레이트 분석기로 판독하였다. 음성 대조군의 평균 값은 1.871이고, 양성 대조군의 평균값은 0.089이고, 시험 웰의 평균 값은 0.597이었다. 결과는 초기에 정제된 8H5 단일쇄 항체 단백질이 높은 반응 활성을 가졌음을 보여주었다.
바이러스와 8H5 단일쇄 항체 사이의 반응 활성을 확인하기 위한 HI 분석을 위해 H5N1 바이러스의 26개의 균주를 선택하였다. 25 ㎕ PBS를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 25 ㎕ 8H5 단일쇄 항체 용액 (0.08 mg/ml)을 제1 웰에 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 항체를 희석하기 위해 제1 웰로부터의 25 ㎕의 혼합물을 제2 웰에 첨가하였다. 25 ㎕의 각각의 바이러스를 웰에 따로 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 50 ㎕의 0.5% 닭 적혈구를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하여 혈액을 응집시켰다. 결과는 8H5 단일쇄 항체가 시험된 26개의 바이러스 균주 중에서 16개의 균주에 대한 HA 억제 활성을 가졌음을 보여주었다 (표 11).
실시예 9. 10F7 및 4D1의 단일쇄 항체의 발현 및 그들의 활성의 시험.
실시예 8에 설명된 바와 같이, 각각의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역 유전자는 짧은 펩티드 (GGGGS)를 코딩하는 핵산과 연결되어 단일쇄 항체를 코딩하는 DNA 단편을 형성하였다. 10F7 VHF/10F7 VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 10F7 중쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭시킨다. 10F7 VKF/10F7 VKR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 10F7 경쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭시킨다. 4D1 VHF/4D1 VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 4D1 중쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭시킨다. 4D1 VKF/4D1 VKR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 4D1 경쇄의 가변 구역 DNA 단편을 증폭시킨다.
10F7 VHF/10F7 VKR을 프라이머로서 사용하여 겹치는 10F7 단일쇄 DNA 단편을 증폭시킨다. 4D1 VHF/4D1 VKR을 프라이머로서 사용하여 겹치는 4D1 중쇄 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편을 회수하고, BamH I 및 Sal I으로 소화시키고, 동일한 제한 효소로 소화된 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내에 클로닝하였다. ER2566 이. 콜라이를 숙주 세포로서 사용하여, 단일쇄 항체 단백질을 표준 방법에 의해 발현시켰다. 발현된 단백질은 불용성 봉입체 형태로 존재하였다. 봉입체를 초음파 처리로 파쇄하고, 생성되는 침전물을 표준 방법으로 정제하였다. 정제된 침전물을 8M 우레아에 용해시켰다. 우레아 용액을 1xPBS 용액 중에서 서서히 투석하고, 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 나머지 침전물을 제거하였다. 최종 정제된 단일쇄 항체 용액을 활성에 대해 시험하였다.
상기 설명된 바와 같이 HI 분석을 사용하여 상기 정제된 10F7 및 4D1 단일쇄 항체의 활성을 시험하기 위해 H5N1 바이러스의 26개의 균주를 선택한다. 10F7 단일쇄 항체의 농도는 1.06 mg/ml에서 사용된다. 4D1 단일쇄 항체의 농도는 0.34 mg/ml에서 사용된다. 4D1 단일쇄 항체는 23개의 바이러스 균주에 대해 HA 억제 활성을 나타낸다. 10F7 단일쇄 항체는 14개의 바이러스 균주에 대해 HA 억제 활성을 나타낸다 (표 11).
Figure 112008060377410-PCT00008
HI 역가는 2의 "n" 제곱만큼 희석된다. "n"은 표에 나타낸 수이다.
상기 정제된 10F7 단일쇄 항체의 활성을 중화 방법을 사용하여 시험하였다. 2002년부터 2006년까지의 기간 동안 홍콩, 인도네시아, 킹하이 및 다른 지역에서 닭, 오리 및 다양한 야생 조류로부터 단리한 7개의 바이러스 균주를, HI 분석을 이용하여 10F7의 활성을 시험하기 위해 사용하였다. 항체는 5개의 바이러스 균주에 대해 우수한 중화 활성을 보였다 (표 12). 64배 희석에서, 항체는 여전히 숙주 세포의 바이러스 감염을 억제할 수 있었다.
10F7 단일쇄 항체 중화 시험 결과.
바이러스 균주 10F7 scFv의 희석
CK/HK/Yu22/02 64
DK/IDN/MS/04 16
CK/IDN/2A/04 32
BhGs/QH/15/05 16
CK/HK/213/03 <1
CP Heron/HK/18/05 8
동양 까치 (Oriental Magpie Robin)/HK /366/2006 <1
실시예 10. 키메라 항체의 발현 및 항체 활성의 시험.
단일 펩티드를 항체 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 유전자에 첨가한 후, 인간 감마1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 도메인을 포함하는 진핵생물 발현 플라스미드 내에 클로닝하였다. 플라스미드 pcDNA3.1-AH는 인간 감마1 중쇄 불변 구역 DNA 서열을 포함하였다. 플라스미드 pcDNA3.1-Ak는 카파 경쇄 불변 구역을 포함하였다.
8H58CHF1/8H5VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 부분 신호 펩티드를 갖는 8H5 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 단편을 PCR 주형으로서 사용하고, 8H58CHF2/8H5VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 완전 신호 펩티드를 갖는 8H5 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 Bam HI/Xho I으로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-AH 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 중쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-AH8H5이었다. 8H58CKF1/8H5VKR1을 프라이머 쌍으로서 사용하여 부분 신호 펩티드를 갖는 8H5 경쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 단편을 PCR 주형으로서 사용하고, 8H58CKF2/8H5VKR1을 프라이머 쌍으로서 사용하여 완전 신호 펩티드를 갖는 8H5 경쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 EcoR I/Xho I로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-Ak 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 경쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-Ak8H5이었다.
10F78CHF1/10F7VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 부분 신호 펩티드를 갖는 10F7 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 단편을 PCR 주형으로서 사용하고, 10F78CHF2/10F7VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 완전 신호 펩티드를 갖는 10F7 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 Bam HI/Xho I로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-AH 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 중쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-AH10F7이었다. 10F78CKF1/10F7VKR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 부분 신호 펩티드를 갖는 10F7 경쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 단편을 PCR 주형으로서 사용하고, 10F78CKF2/10F7VKR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 완전 신호 펩티드를 갖는 10F7 경쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 EcoR I/Xho I로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-Ak 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 경쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-Ak1OF7이었다.
4D1VHF1/4D1VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 부분 신호 펩티드를 갖는 4D1 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 단편을 PCR 주형으로서 사용하고, 4D1VHF2/4D1VHR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 완전 신호 펩티드를 갖는 4D1 중쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 Bam HI/Xho I로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-AH 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 중쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-AH4D1이었다. 4D1VKF/4D1VKR을 프라이머 쌍으로서 사용하여 신호 펩티드를 갖는 4D1 경쇄 가변 구역 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 EcoR I/Xho I로 소화된 플라스미드 pcDNA3.1-Ak 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 인간-마우스 키메라 경쇄를 위한 발현 플라스미드 pcDNA3.1-Ak4D1이었다.
도 4는 3개의 키메라 항체를 위한 발현 벡터의 구조의 개략도를 보여준다.
키메라 중쇄 및 키메라 경쇄를 포함하는 플라스미드들을 함께 인산칼슘 형질전환 방법을 통해 293 FT 세포 내로 형질전환시켰다. 세포 배양액의 현탁액을 수거하고, 포화 황산암모늄으로 침강시켜 초기의 정제된 키메라 항체 (cAb)를 수득하였다. cAb 및 마우스 mAb 용액의 농도를 0.7 ㎍/ml로 조정하였다. 바이러스 균주 Ck/HK/Yu22/02를 항체 활성을 시험하기 위해 HI 분석에 사용하였다. 결과는 3개의 cAb의 활성이 각각의 마우스 mAb와 동일함을 보여주었다 (도 5).
상기 설명된 HI 분석을 통해 초기의 정제된 10F7 및 4D1 cAb의 활성을 시험하기 위해 23개의 H5N1 바이러스 균주를 선택하였다. 결과는 두 cAb 모두가 23개의 모든 바이러스 균주에 대한 HA 억제 활성을 가졌음을 보여주었다 (표 13).
23개의 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 2개의 키메라 항체의 HI 시험 결과
바이러스 번호 4D1cAb 10F7cAb
A1 5 6.5
A2 5.5 7
A3 5.5 6.5
A4 6 7
A6 4.5 5
A7 4 5.5
A8 5.5 5.5
B1 >8 >8
B4 5.5 6
B6 6.5 6
B7 7 7
B8 4 4.5
C1 7.5 >8
C2 6 6
C3 4 2.5
D1 5 2.5
E1 5.5 6
E2 7.5 >8
F2 1 2.5
F3 1 >8
G1 1 6.5
H1 1 5.5
H2 1 8
cAb의 활성을 면역-형광 분석을 이용하여 추가로 시험하였다. 유리 슬라이드를 24-웰 세포 배양 플레이트에 투입하였다. 곤충 SF21 세포를 유리 슬라이드 상에 플레이팅하였다. 조류 인플루엔자 HA 단백질을 곤충 세포 - 바큘로바이러스 발현계를 통해 SF21 세포에서 발현시켰다. HA 단백질을 발현하는 세포를 PBS 중에서 세척하고, 4% 폴리포름알데히드로 고정시키고, 염소 항혈청으로 차단하였다. 4D1 또는 10F7 cAb를 세포에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 특이적 항-HBV cAb를 음성 대조군으로 사용하였다. 형광 표지된 염소-항-인간 항체 (시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스))를 2차 항체로서 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포 핵을 DAPI (시그마)로 10분 동안 염색하였다. 염색된 샘플을 형광 현미경 (니콘 (Nikon)) 하에서 관찰하였다. 도 6의 결과는 4D1 및 10F7 cAb가 SF21 세포에서 발현된 조류 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주었다.
실시예 11. 박테리오파지 디스플레이 7aa 펩티드 라이브러리로부터 mAb에 결합하는 항원 부위를 모방하는 짧은 펩티드의 스크리닝
뉴잉글랜드 바이오랩스 컴퍼니 (New England Biolabs company)의 파지 디스플레이 7aa 펩티드 라이브러리를 사용하여, 8H5 mAb 또는 3C8 mAb에 결합할 수 있는 7aa 펩티드를 스크리닝하였다. 스크리닝을 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 스크리닝 과정은 아래에 간단히 설명하였다.
50 ㎕ 단백질 A - 아가로스 배지 (50% 물 현탁액)을 미세원심분리관에 분취하였다. 1 ml TBS + 0.1% Tween (TBST) 용액을 미세원심분리관 내에 첨가하였다. 미세원심분리관을 부드럽게 두드리거나 또는 진동시켜 아가로스 배지를 재현탁시켰다. 미세원심분리관을 저속으로 30초 동안 원심분리하여 아가로스 배지를 침전시켰다. 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 침전된 아가로스 배지를 1 ml 차단 버퍼에 재현탁시키고, 때때로 혼합하면서 4℃에서 60분 동안 인큐베이팅하였다. 한편, 2x1011개의 파지 입자 (본래의 파지 라이브러리의 10 ㎕에 해당하는 양) 및 300 ng의 mAb를 TBS 버퍼를 사용하여 최종 부피 200 ㎕로 희석하였다. mAb의 최종 농도는 10 nm이었다. 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 차단 반응 후, 배지를 저속 원심분리에 의해 침전시키고, 1 ml TBS로 총 4회 세척하였고, 세척 후마다 원심분리를 반복하였다. 파지-mAb 혼합물을 세척된 배지에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 자주 혼합하면서 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 배지를 저속 원심분리로 침전시켰다. 상등액을 버렸다. 배지를 1 ml TBTS로 10회 세척하였다. 이어서, 배지를 1 ml의 0.2M 글라이신-HCl (pH 2.2) 및 1 mg/ml BSA에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이팅하여 결합된 파지 입자를 방출시켰다. 혼합물을 1분 동안 원심분리하고, 상등액을 다른 미세원심분리관에 조심스럽게 따라내었다. 상등액을 즉시 150 ㎕의 1M Tris-HCl (pH 9.1)로 중화시켰다. 약 1 ㎕의 상기 용액을 사용하여 파지의 역가를 조사하였다. 나머지 용액은 초기 대수 증식기 성장 상태의 20 ml ER2738 숙주 세포 내에 첨가하였다. 숙주 세포를 37℃에서 4.5시간 동안 진동시키면서 배양하였다. 세포 배양액을 50 ml 원심분리관에 옮기고, 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액의 상부의 80%를 수거하고, 1/6 부피의 PEG/NaCl 용액 (20% PEG-8000, 2.5M NaCl)을 첨가하였다. 용액을 4℃에서 1시간 동안 정치시킨 후, 10,000 rpm에서 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 침전된 파지를 200 ㎕ PBS에 현탁시키고, 4℃에서 보관하였다. 상기 언급된 과정은 추가의 스크리닝을 위해 반복하였다.
밤새 배양된 ER2738 숙주 세포를 1:10의 비율로 LB 배지 내로 희석하고 배양 튜브 (1 ml/튜브) 내로 분취하였다. 각각의 mAb 스크리닝을 위해, 3 라운드의 스크리닝을 실시한 LB/IPTG/Xgal 배양 플레이트 상의 10개의 청색 단일 콜로니 파지 플라크를 선택하고, 상기 배양 튜브 내에 접종하였다. 세포 배양액을 진동시키면서 37℃에서 4.5시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 배양액을 1.5 ml 원심분리관에 옮기고, 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 200 ㎕의 상등액을 모았다. 파지 ssDNA를 제조사의 지시에 따라 소량 M13 단리 및 정제 시약 키트 (상하이 후아시운 바이오엔지니어링 컴퍼니 (Shanghai Huashun Bioengineering Co., Ltd.))를 사용하여 상등액으로부터 단리하였다. 삽입된 7aa 펩티드의 서열은 상하이 보야 바이오테크놀로지 컴퍼니 (Shanghai Boya Biotechnology Co., Ltd.)에 의해 얻었고, 표 14에 나타냈다.
8H5 mAb 또는 3C8 mAb에 결합하는 7aa 펩티드의 아미노산 서열 (서열 13, 14 및 15 내의 핵산 서열은 각각 서열 64, 68 및 70의 펩티드를 코딩한다)
모노클로날 항체 7-aa 펩티드 서열 서열 번호
8H5 HGMLPVY 서열 64
PPSNYGR 서열 65
PPSNFGK 서열 66
GDPWFTS 서열 67
NSGPWLT 서열 68
3C8 WPPLSKK 서열 70
NTFRTPI 서열 71
NTFRDPN 서열 72
NPIWTKL 서열 73
실시예 12. 7aa 펩티드 활성의 검출
8H5A, 8H5E 및 3C8A의 7aa 펩티드를 포함하는 3개의 박테리오파지를 많은 수로 증폭시켰다. 이들을 PEG로 침전된 후 PBS에 용해시켰다. 파지 역가는 1011 내지 1012이었다. 마이크로플레이트를 5 ㎍/ml의 모노클로날 항체 8H5, 4Al, 9N7 및 4D11로 예비 코팅하였다. 플레이트를 5% 우유를 함유하는 PBS로 차단하였다. 3개의 박테리오파지를 계열 희석하고; 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 수행하였다. 이어서, 플레이트를 5회 세척하였다. 1:5,000 희석된 마우스 항-M13/HRP 항체 (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Phamarcia Biotech, 영국))를 2차 항체로서 첨가하고, 0.5시간 동안 인큐베이팅하였다. 반응이 완료된 후, 결과를 판독하였다. 결과를 표 15에 나타내었고, 여기서 펩티드 8H5A와 모노클로날 항체 8H5 사이의 특이적 반응이 우수하고, 8H5A와 다른 3개의 모노클로날 항체 사이의 특이적 반응이 약하였음을 입증되었다. 8H5E와 모노클로날 항체 8H5 사이의 특이적 반응은 비교적 불량하였다.
7aa 펩티드의 모노클로날 항체에 대한 특이적 결합 활성의 검출 결과
모노클로날 항체 박테리오파지 내의 7aa 펩티드
8H5A (1:1000) 8H5E (1:1000)
8H5 0.559 0.25
4A1 0.158 0.142
9N7 0.062 0.065
4D11 0.118 0.078
실시예 13. 파지 디스플레이 12aa 펩티드 라이브러리로부터 8H5 mAb에 결합하는 항원 부위를 모방하는 짧은 펩티드의 스크리닝.
뉴잉글랜드 바이오랩스 컴퍼니의 파지 디스플레이 12aa 펩티드 라이브러리를 사용하여, 8H5 mAb에 결합할 수 있는 12aa 펩티드를 스크리닝하였다. 스크리닝을 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상세한 실험 과정은 실시예 11에서와 동일하였다.
제3 라운드의 스크리닝 후에, 약 1 ㎕의 파지 용액을 사용하여 파지의 역가를 결정하였다. 단일 콜로니 파지 플라크를 선택하여 대수 증식기 성장 상태의 ER2738 세균 내에 접종하였다. 접종된 세균 배양액을 37℃에서 4.5~5시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 이들을 원심분리하고, ELISA 시험을 위해 상등액을 수집하였다. 마우스 8H5 mAb를 10 ㎍/ml의 농도로 ELISA 마이크로플레이트 상에 매립 (embedding)시켰다. 파지 용액을 1차 항체로서 사용하였다. 1:5,000으로 희석된 항-M13/HRP 항체 (아머샴 파마시아 바이오테크)를 2차 항체로서 사용하였다. 조류 인플루엔자 항체 4D1 mAb, 10F7 mAb 및 항-HEV E2 8C11 mAb를 마우스 mAb에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 7은 보다 우수한 결합 활성을 보인 12개의 파지 펩티드의 시험 결과를 보여준다. 시험은 대부분의 파지 펩티드의 표적 8H5 mAb에 대한 OD 값이 대조군보다 3배 더 큼을 보여주었고, 이것은 펩티드가 우수한 특이성을 갖는다는 것을 나타낸다.
제조사의 지시에 따라 파지 ssDNA 단리 시약 키트 (오메가 (Omega, 미국))를 사용하여 파지 DNA를 단리하였다. 단리된 DNA의 서열을 결정하였다. 12개의 12aa 펩티드의 핵산 및 아미노산 서열을 얻었다 (표 16).
Figure 112008060377410-PCT00009
실시예 14. 12aa 펩티드 123 또는 125 및 펩티드 239를 포함하는 융합 단백질의 발현 및 그들의 활성 검출
융합 단백질 239-123 및 239-125를 위한 발현 벡터의 제조
원핵생물 발현 벡터 pTO-T7-239-123 (도 8) 및 pTO-T7-239-125 (도 9)를 PCR을 통해 제조하기 위해서 12aa 펩티드 123 또는 125를 펩티드 239 (HEV ORF2의 잔기 368-606으로부터의 239개 아미노산 단편)의 c-말단에 연결하였다. 먼저, 239 유전자 및 12aa 펩티드 유전자에 대한 프라이머를 제조하였다. 이어서, 239 유전자를 주형으로서 사용하였고, 프라이머 239-123F/239-123R1 및 239-125F/239-125R1을 각각 제1 라운드의 PCR 증폭을 위해 사용하였다. PCR 산물을 수거하고, 정제한 후, 제2 라운드의 PCR 증폭을 위해 주형으로서 사용하였다. 제2 라운드의 PCR 증폭에서, 프라이머 239-123F/239-123R2 및 239-125F/239-125R2를 각각 단편 239-123 및 239-125의 제조를 위해 사용하였다. 생성된 단편 239-123 및 239-125를 수거하고, 제한 효소 NdeI 및 EcoRI으로 소화시키고, 벡터 pTO-T7 내로 클로닝하였다. 벡터를 이. 콜라이 ER2566 내로 형질전환시키고, 복제시키고, 제한 효소 소화로 조사하였다. 양성 숙주 세포 클론은 재조합 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7-239-123 및 pTO-T7-239-125를 포함하였다.
Figure 112008060377410-PCT00010
융합 단백질 239-123 및 239-125의 발현 및 정제.
벡터 pTO-T7-239-123 및 pTO-T7-239-125를 포함하는 ER2566 단일 콜로니를 각각 2 ml Kn-내성 LB 배지 내로 접종하였다. 세균 배양액을 진동시키면서 OD600 값이 약 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 배양액을 1:1000의 비율로 500 ml LB 배지에 이송하고, OD600 값이 약 1.0에 도달할 때까지 인큐베이팅하였다. 이어서, 500 ㎕ IPTG를 세균 배양액 내로 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 세균을 8,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 상등액을 버렸다. 세균 잔여물을 20 ml 용해 버퍼에 재현탁시키고, 얼음 상에서 인큐베이팅하고, 초음파로 처리하여 세균을 파쇄시켰다. 초음파 처리 조건은 다음과 같았다: 처리 시간: 10분; 처리 펄스: 2초 동안 펄스로 처리하고, 5초 동안 정지함; 전력 출력: 70%. 초음파 처리 후, 세균 용액을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 보관하였고 (SDS-PAGE에 로딩될 예정임, 도 10 및 11의 레인 3), 잔여물을 20 ml 2% Triton에 재현탁시키고, 30분 동안 진동시킨 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. Triton 세척을 1회 반복하였다. 이어서 상등액을 보관하였고 (SDS-PAGE에 로딩될 예정임, 도 10 및 11의 레인 4), 잔여물을 20 ml 2M 우레아 버퍼에 재현탁시키고, 30분 동안 진동시킨 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 다시, 상등액을 보관하였고 (SDS-PAGE에 로딩될 예정임, 도 10 및 11의 레인 5), 잔여물을 20 ml 4M 우레아에 재현탁시키고, 30분 동안 진동시킨 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 또한, 상등액을 보관하였고 (SDS-PAGE에 로딩될 예정임, 도 10 및 11의 레인 6), 잔여물을 20 ml 8M 우레아에 재현탁시키고, 30분 동안 진동시킨 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 보관하였다 (SDS-PAGE에 로딩될 예정임, 도 10 및 11의 레인 7). SDS-PAGE 로딩 샘플은 SDS-PAGE 분석을 위해 모든 상기 상등액으로부터 제조하였다 (도 10 및 도 11). SDS-PAGE 결과는 단백질이 90%의 순도로 8M 우레아 중에 대부분 용해되었음을 보여주었다. 8M 우레아 단백질 용액을 구배 투석 (8M 우레아-4M 우레아-2M 우레아-PBS)을 사용하여 PBS 내로 투석하였다.
융합 단백질 239-123 및 239-125의 활성 검출
직접적 ELISA 시험
초기 정제된 융합 단백질 239-123 및 239-125를 별개로 10 ㎍/ml의 농도에서 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트 상에 매립시켰다. 그 후에, 플레이트를 1회 세척하고, ED 차단 버퍼로 37℃에서 2시간 동안, 이어서 4℃에서 밤새 처리하여 비-특이적 결합 부위를 차단하였다. 이어서, 차단 버퍼를 버렸다. 이후에, 상이한 마우스 mAb를 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 8C11, 7H8, 3C8, 8H5, 1A6, 13E1, 1D8, 1G2, 3G41, 13A2, 11H8, 4D1, 10HD4, 14H12, 6CF3, 7D1, 7E8, 10DE2, 16A12, 3FC1, 8E2, 3D2, 10D122, 13E7을 포함하는 24개의 mAb가 존재하였다. 8C11 mAb는 특이적 항-239 단백질 항체였다. 8H5 mAb는 12aa 펩티드를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 다른 22개의 mAb는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질에 대한 항체였다. mAb를 플레이트 내에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 100 ㎕ GAM-HRP (1:10,000 희석액)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 착색 용액을 발색을 위해 플레이트에 10분 동안 첨가한 후, 정지 버퍼를 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 색상 강도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 도 12 및 13은 융합 단백질 239-123 및 239-125가 각각 8C11 및 8H5와만 반응하고, 임의의 다른 mAb와는 반응하지 않았음을 보여주었다. 이 결과는 융합 단백질 239-123 및 239-125가 매우 우수한 항체 특이성을 갖는다는 것을 나타내었다.
실시예 15. 12aa 펩티드 번호 123 및 번호 125와 HBV cAg의 융합 단백질의 발현
융합 단백질 발현 벡터의 제조
이. 콜라이에서 발현된 HBV cAg의 aa1-149 단편을 바이러스 유사 입자 내로 조립할 수 있다. aa1-149 단편을 위한 유전자를 이. 콜라이 발현 벡터 pTO-T7 내로 삽입하였다. 이어서, 단편의 위치 79 및 80에서의 2개의 아미노산을, 그의 핵산 서열이 돌연변이체 HBV cAg 발현 플라스미드 pC149-mut를 제조하기 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하는 대체 아미노산으로 치환하였다. HBV cAg는 실질적으로 면역원성이다. HBV cAg의 내부 MIR (주요 면역 우세 구역, aa 78-83)에 융합된 외래 펩티드는 입자 내로 조립되는 HBV cAg의 능력을 변경시키지 않을 것이지만, 펩티드 에피토프는 입자 표면으로부터 노출될 것이다.
1 내지 5 카피의 펩티드 123 및 125를 각각 HBcAg의 아미노산 위치 79 및 80 내로 삽입하여 각각 HBc-123 및 HBc-125로 불리는 일련의 융합 단백질을 얻었다. 12aa 펩티드 및 벡터 pC149-mut의 서열을 기초로 하여, 12aa 펩티드의 서열을 포함하는 5'-말단 프라이머 및 3'-말단 프라이머 149MRP를 설계하였다 (표 18, 밑줄친 부분은 삽입된 펩티드 서열임). 플라스미드 pC149-mut를 주형으로서 사용하고, 프라이머 HBc123F2/HBcR 및 HBc123F2/HBcR을 제1 라운드의 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 산물을 회수하고, 정제하여 주형으로서 사용하고, 프라이머 HBc123F1/HBcR 및 HBc123F1/HBcR을 제2 라운드의 PCR 증폭에 사용하였다. 그 결과로, 12aa 펩티드 서열에 연결된 C149aa81-149가 생성되었다. 단편을 Bgl II 및 EcoR I으로 소화시키고, 정제하였다. 플라스미드 pC149-mut를 BamH I 및 EcoR I로 소화시키고, 정제하고, 12aa 펩티드 서열을 포함하는 C149 단편과 연결하였다. 연결된 산물을 발현 및 제한 효소 소화 분석을 위해 이. 콜라이 ER2566 내로 형질전환시켰다. 분석은 각각 pC149-mut-123 및 pC149-mut-125로 불리는, 단일 카피의 12aa 펩티드 유전자가 삽입된 플라스미드를 선택하였다. 플라스미드를 BamH I 및 EcoR I으로 소화시켰다. 12aa 펩티드를 포함하는 단편을 Bgl II 및 EcoR I으로 소화시킨 후, 소화된 플라스미드와 연결시켰다. 2 카피의 12aa 펩티드를 포함하는 재조합 원핵생물 발현 플라스미드를 선택하고, 각각 pC149-mut-D123 및 pC149-mut-D125로 칭하였다. 이와 유사하게, 플라스미드 pC149-mut-T123, pC149-mut-F123, pC149-mut-Q123 및 pC149-mut-T125, pC149-mut-F125, pC149-mut-Q125를 비롯하여, 3, 4 및 5 카피의 12aa 펩티드를 포함하는 재조합 원핵생물 발현 벡터를 제조하였다. 재조합 플라스미드의 구조를 도 15 및 16에 제시한다 (플라스미드 pC149-mut-123 및 pC149-mut-125만을 예로서 도시하였다).
Figure 112008060377410-PCT00011
주: 밑줄친 것은 12 펩티드의 서열이다.
융합 단백질의 발현 및 정제
플라스미드 pC149-mut-D123, pC149-mut-T123, pC149-mut-F123, pC149-mut-Q123, pC149-mut-D125, pC149-mut-T125, pC149-mut-F125, pC149-mut-Q125에 의해 발현된 융합 단백질을 각각 D123, T123, F123, Q123, D125, T125, F125, Q125로 칭하였다. 상기 8개의 플라스미드를 각각 포함하는 ER2566 세균을 2 ml Kn-내성 LB 배지 내로 각각 접종하고, OD600 값이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 진탕하였다. 이어서, 배양액을 1:1000의 비로 500 ml LB 배지 내로 옮기고, OD600 값이 0.8에 도달할 때까지 인큐베이팅하였다. 그 후에, 500 ㎕ IPTG를 세균 배양액 내로 첨가하여 18℃에서 20시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 세균을 8,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 상등액을 버렸다. 세균 잔여물을 20 ml 용해 버퍼에 재현탁시키고, 얼음 상에서 인큐베이팅하고, 초음파로 처리하여 세균을 파쇄시켰다. 초음파 처리 조건은 다음과 같았다: 처리 시간: 10분; 처리 펄스: 2초 동안 펄스로 처리하고, 5초 동안 정지함; 전력 출력: 70%. 초음파 처리 후, 세균 용액을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 보관하고, SDS-PAGE로 이동시켰다. 그 결과는 모든 융합 단백질이 상등액에 존재함을 보여주었다 (도 17).
상기 상등액은 여전히 많은 오염물질을 포함하였고, 추가의 정제를 필요로 하였다. 상기 단백질은 적합한 조건 하에 입자로 자가-조립될 수 있다. 상기 단백질의 자가-조립 상태는 또한 상기 단백질의 추가의 정제 동안에도 고려되었다. 다음 과정을 사용하여 단백질을 추가로 정제하고 입자로 자가-조립되도록 단백질을 자극하였다. 포화 황산암모늄을 총 부피의 20%의 최종 농도로 첨가한 후, 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이팅하고; 혼합물을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고; 상등액을 버리고; 잔여물을 5% β-머캅토에탄올을 포함하는 CB 버퍼에 재현탁시키고; 37℃에서 30분 동안 진탕하고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수거하고, PB5.8 버퍼 (30O mM NaCl 및 5O mM EDTA 포함)에서 투석하였다. 버퍼를 8시간마다 교환하였다. 버퍼를 6회 교환한 후, 투석된 용액을 수거하고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수거하고, 단리된 단백질의 순도를 SDS-PAGE에서 검토하였다. 본 방법을 사용하여, 단백질을 먼저 20% 포화 황산암모늄 침강에 의해 정제하고, 이어서 5% β-머캅토에탄올을 포함하는 CB 버퍼를 사용하여 이량체로 조립되도록 단백질을 자극한 후, 낮은 pH 및 높은 염의 조건 하에서 단백질 입자가 형성되었다. 또한, 단백질은 상기 조건 하에 추가로 정제될 수 있다 (도 18).
상기 방법에 의해 정제된 8개의 융합 단백질을 2% 인텅스텐산으로 음성 염색하고, 전자 현미경 하에서 직접 관찰하였다 (도 19). 조립된 입자는 균일한 중공 구체로서 도시되었다 (일부 입자는 내부가 충전됨). 입자는 2가지 크기로 존재하였다. 즉, 하나는 직경이 35 nm이고 다른 것은 20 nm이었다.
실시예 16. HBc-123 및 HBc-125 융합 단백질의 활성을 ELISA에 의해 시험하였다.
8개의 융합 단백질을 10 ㎍/ml의 농도에서 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트 상에 별개로 매립시켰다. 그 후에, 플레이트를 1회 세척하고, ED 차단 버퍼로 37℃에서 2시간 동안 처리한 후, 4℃에서 밤새 처리하여 비-특이적 결합 부위를 차단하였다. 이후에, 100 ㎕의 8H5 mAb를 각각의 웰에 첨가하였다. mAb를 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 100 ㎕ GAM-HRP (1: 10,000 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 착색 용액을 발색을 위해 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이어서, 정지 버퍼를 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 색상 강도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 도 20은 8개의 모든 융합 단백질이 8H5 mAb에 특이적으로 결합됨을 보여주었다.
Q123 및 D125 단백질을 항체 결합 특이성에 대해 시험하였다. 2개의 단백질을 10 ㎍/ml의 농도에서 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트 상에 별개로 매립시켰다. 플레이트를 1회 세척하고, ED 차단 버퍼로 37℃에서 2시간 동안 처리한 후, 4℃에서 밤새 처리하여 비-특이적 결합 부위를 차단하였다. 이어서, 총 14개의 mAb, 즉 8H5, 8G9, 3C8, 4D1, 10F7, 1G2, 3D2, 3CF1, 7D1, 6CF3, 7H8, 10DE2, 13E7, 16A12를 포함하는 상이한 mAb를 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 8H5 mAb를 사용하여 12aa 펩티드를 스크리닝하였다. 다른 13개의 mAb는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질에 대한 항체이었다. mAb를 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 100 ㎕ GAM-HRP (1:10,000 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 착색 용액을 발색을 위해 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이어서, 정지 버퍼을 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 색상 강도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. ELISA 결과 (도 21)는 융합 단백질 Q123 및 D125가 8H5와만 반응하였고, 임의의 다른 mAb와는 반응하지 않았음을 보여주었다. 이 결과는 융합 단백질 Q123 및 D125가 매우 우수한 항체 특이성을 가짐을 나타내었다.
실시예 17. 융합 단백질 HBc-123 및 HBc-125의 면역원성 분석.
상기 8개의 HBc-123 및 HBc-125 융합 단백질을 등부피의 프로인트 항원보강제와 별개로 혼합하였다 (완전 프로인트 항원보강제는 초기 면역화를 위해 사용하였고, 불완전 프로인트 항원보강제는 부스터 면역화를 위해 사용하였다). 면역화 단백질 및 항원보강제를 마우스 당 100 ㎍ 단백질의 투여량으로 다수회의 피하 주사에 의해 BALB/c 마우스에 주사하였다. 3 내지 4 마리의 마우스를 한 군에 포함시켰다. 초기 면역화 후, 부스터 면역화를 격주로 수행하고, 혈액을 마우스 눈으로부터 수거하였다. 생성된 항-혈청을 다음과 같이 분리하였다: 혈액을 37℃에서 2시간 동안 유지한 후, 4℃에서 밤새 저장하여 혈액 세포를 응집시켰다. 이어서, 혈액을 4,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 항-혈청을 함유하는 상등액을 추후 사용을 위해 -4℃에서 보관하였다.
융합 단백질 239-123 및 239-125를 1 ㎍/웰로 마이크로플레이트 상에 매립시켰다. HRP-표지된 염소-항-마우스 IgG가 2가 항체로서 사용되었다. 따라서, 간접적 ELISA가 12aa 펩티드 123 및 125에 대한 특이적 항체를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 간접적 ELISA는 12aa 펩티드 123 및 125에 결합할 수 있는 항-혈청, 결합 특이성, 항체 역가 및 다른 관련 기능을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 간접적 ELISA 시험은 다양한 HBc-123 융합 단백질에 대한, 1:1,000 희석된 항-혈청을 사용하여 수행하였고, 그 결과를 도 22에 제시한다. 간접적 ELISA 시험은 다양한 HBc-125 융합 단백질에 대한, 1:2,000 희석된 항-혈청을 사용하여 수행하였고, 그 결과를 도 23에 제시한다.
실시예 18. 마우스 항-혈청의 면역-형광 검출
유리 슬라이드를 24-웰 세포 배양 플레이트에 투입하였다. 곤충 SF21 세포를 유리 슬라이드에 플레이팅하였다. 조류 인플루엔자 HA 단백질이 곤충 세포 - 바큘로바이러스 발현계를 통해 SF21 세포에서 발현되었다. HA 단백질을 발현하는 세포를 PBS 내에 세척하고, 4% 폴리포름알데히드로 고정시키고, 염소 항혈청으로 차단하였다. T123 및 F125에 대한 1:20 희석된 마우스 항-혈청을 세포에 따로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 항-HBc 마우스 항-혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 형광 표지된 염소-항-마우스 항체 (시그마)를 2차 항체로서 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포 핵을 DAPI (시그마)로 10분 동안 염색하였다. 염색된 샘플을 형광 현미경 (니콘) 하에서 관찰하였다. 도 24의 결과는 T123 및 F125에 대한 마우스 항-혈청이 SF21 세포에서 발현된 조류 인플루엔자 바이러스 HA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주었고, 이것은 12aa 펩티드 123 및 125가 HA 항원 부위를 적절하게 모방하였음을 추가로 확인한 것이다.
실시예 19. 12aa 펩티드 122, 124, 128 및 129와 HBV cAg의 융합 단백질의 발현 및 그들의 활성 검출.
4개의 12aa 펩티드, 즉 122, 124, 128 및 129의 2 카피를 HBV cAg 단백질 내에 삽입하고, 각각 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129를 얻었다.
융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129를 위한 발현 벡터의 제조 방법은 융합 단백질 HBc-123 및 HBc-125의 제조 방법과 동일하였다. 제조 방법에 사용되는 프라이머를 표 19에 나타낸다. 제1 PCR 증폭을 위한 상류 프라이머는 F3이었고, 제2 PCR 증폭을 위한 프라이머는 F2이었고, 제3 PCR 증폭을 위한 프라이머는 F1이었다. 하류 프라이머는 HBcR이었다. 3 라운드의 PCR 증폭을 통해, 표적 12aa 펩티드를 C149-mut 단편과 연결하였다. 연결된 단편을 Bgl II 및 EcoR I으로 소화시키고, BamH I 및 EcoR I으로 소화된 벡터 pC149-mut 내로 삽입하여 발현 플라스미드를 형성시켰다 (상세한 내용은 실시예 15 참조).
Figure 112008060377410-PCT00012
Figure 112008060377410-PCT00013
융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129의 발현 및 정제 방법은 융합 단백질 HBc-123 및 HBc-125에 대한 것과 동일하였다 (상세한 내용은 실시예 15 참조). 12aa 펩티드 및 HBc의 융합 단백질의 발현 및 입자 조립의 결과를 하기 표 20에 나타낸다. 조립된 입자의 전자현미경 사진을 도 25에 도시한다.
12aa 펩티드 및 HBc의 융합 단백질의 발현 및 바이러스 유사 입자의 형성.
번호 펩티드 섹션 명칭 생산 형태 발현 수율 입자 조립 상태
HBc-122 122 가용성 +++ 우수
HBc-D123 123 가용성 +++ 우수
HBc-T123 123 가용성 +++ 양호
HBc-F123 123 가용성 +++ 우수
HBc-Q123 123 가용성 ++ 우수
HBc-124 124 가용성/봉입체 +++ 우수
HBc-D125 125 가용성 +++ 우수
HBc-T125 125 가용성/봉입체 ++ 양호
HBc-F125 125 가용성/봉입체 ++ 양호
HBc-Q125 125 가용성/봉입체 ++ 양호
HBc-128 128 가용성 +++ 우수
HBc-129 129 가용성/봉입체 ++ 우수
융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129의 활성을 검출하기 위해 간접적 ELISA를 이용하였다.
융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129를 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트에 10 ㎍/ml의 농도로 별개로 매립시켰다. 플레이트를 1회 세척하고, ED 차단 버퍼로 37℃에서 2시간 동안, 이어서 4℃에서 밤새 처리하여 비-특이적 결합 부위를 차단하였다. 이어서, 총 12개의 mAb, 즉 8H5, 8G9, 3C8, 1G2, 3D2, 3CF1, 7D1, 6CF3, 7H8, 10DE2, 13E7, 16A12를 포함하는 상이한 mAb를 100 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하였다. 8H5 mAb를 사용하여 12aa 펩티드를 스크리닝하였다. 다른 11개의 mAb는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질에 대한 항체이었다. mAb를 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 100 ㎕의 GAM-HRP (1:10,000 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 착색 용액을 발색을 위해 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이어서, 정지 버퍼를 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 색상 강도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 도 26의 결과는 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129가 8H5와만 반응하였고, 임의의 다른 mAb와는 반응하지 않았음을 보여주었다. 이 결과는 융합 단백질 HBc-122, HBc-124, HBc-128 및 HBc-129가 8H5 mAb에 대한 매우 우수한 결합 특이성을 가짐을 나타내었다.
실시예 20. 12aa 펩티드 및 조류 인플루엔자 바이러스를 제시하는 바이러스 유사 입자의 경쟁적 ELISA.
H5N1 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 마우스 2F2 mAb를 10 ㎍/ml의 농도로 마이크로플레이트 상에 매립시켰다. 1:40으로 희석된 바이러스 균주 Ck/HK/Yu22/02를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이후에, 웰 내의 용액을 버렸다. 10 ㎍의 정제된 바이러스 유사 입자 및 1:1,000으로 희석된 8H5/HRP를 웰에 함께 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 12aa 펩티드 126 및 127은 8H5 mAb에 결합할 수 없지만, 음성 대조군으로서 바이러스 유사 입자 상에 제시되었다. 추가로, 바이러스 유사 입자가 존재하지 않는 PBS도 음성 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 착색 용액을 발색을 위해 10분 동안 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 정지 버퍼를 첨가하여 색상 반응을 정지시켰다. 색상 강도를 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 도 27의 결과는 융합 단백질 HBc-123, HBc-124, HBc-125, HBc-128 또는 HBc-129로부터 조립된 바이러스 유사 입자가 8H5 mAb에 결합하는 항원 부위의 몇몇 부분을 각각 모방할 수 있음을 보여주었다.
SEQUENCE LISTING <110> HX Diagnostics, Inc. Xia, Ningshao Chen, Yixin Ge, Shengxiang Luo, Wenxin Zhang, Jun <120> MONOCLONAL ANTIBODIES BINDING TO AVIAN INFLUENZA VIRUS SUBTYPE H5 HAEMAGGLUTININ AND USES THEREOF <130> 62682.8001.WO00 <140> PCT/US2007/002491 <141> 2007-01-26 <150> Chinese Patent Application No. 200610002312.1 <151> 2006-01-26 <160> 157 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cactttcagt aactactgga tagagtggat aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagcgatag aacaaactac 180 aatgggaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcccac 240 atgcaactca gtagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aaatagatac 300 gacgggtatt attttggttt ggattactgg ggtcaaggaa cctcagtcgc cgtctcctca 360 gcc 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Arg Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gaaatcgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc 60 atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat ttcgtttact ggtaccagca gaggtcagat 120 gcctccccca aactattgat ttactattca tccaacctgg ctcctggagt cccacctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcggctt ggagggtgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcacttt actagttccc cgtacacgtt cggagggggg 300 accaacctgg aaataaaacg g 321 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Phe Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Tyr Ser Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cctctgggta cagcttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtctaaagtg gatgggctgg ataaacacct acaccggaga gccagcctat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctctggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatggaat 300 agagatgcta tggactactg gggtcaagga acctcggtca ccgtatctag c 351 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 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caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagttt tactacctac 180 aatcaaaact tcaaagacag ggccacattg actgtagaca aatcatccag cacagcctac 240 atgcagctca gaagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc cagggggggt 300 ccaggagact ttcgctatgc tatggattac tggggccaag gcacctcggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60 atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120 gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatcc 240 gaagactttg cagactatta ctgtgtacag tatgttcagt ttccctacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgggct 327 <210> 19 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Val Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 <210> 20 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 caggtccaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttctggcta cacattcact gattatgcta tgcattgggt gaagcagagt 120 catgcaaaga gtctagagtg gattggactt attaatactg actatggtga tactacttac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccaa cacagcctat 240 atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagatcggac 300 tatgattact atttctgtgg tatggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgaatct 360 cta 363 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Thr Asp Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Cys Gly Met Asp Tyr 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Glu Thr Pro Leu Thr Glu Thr Ala Leu Lys Trp His 1 5 10 <210> 79 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 79 gagacgcctc ttacggagac ggctttgaag tggcat 36 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 80 Gln Thr Pro Leu Thr Met Ala Ala Leu Glu Leu Phe 1 5 10 <210> 81 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 81 cagacgccgc tgactatggc tgctcttgag cttttt 36 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 82 Asp Thr Pro Leu Thr Thr Ala Ala Leu Arg Leu Val 1 5 10 <210> 83 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 83 gatactccgc tgacgacggc ggctcttcgg ctggtt 36 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 84 Thr Pro Leu Thr Leu Trp Ala Leu Ser Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 85 acgccgctta cgctttgggc tctttctggg ctgagg 36 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 86 Gln Thr Pro Leu Thr Glu Thr Ala Leu Lys Trp His 1 5 10 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 87 cagacgcctc ttacggagac ggctttgaag tggcat 36 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 88 Gln Thr Pro Leu Thr Met Ala Ala Leu Glu Leu Leu 1 5 10 <210> 89 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 89 cagacgcctc tgactatggc ggctcttgag cttctt 36 <210> 90 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 90 His Leu Gln Asp Gly Ser Pro Pro Ser Ser Pro His 1 5 10 <210> 91 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 91 cagacgcctc tgactatggc ggctcttgag cttctt 36 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 92 Gly His Val Thr Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 93 gggcatgtga cgactctttc tcttctgtcg ctgcgg 36 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 94 Phe Pro Asn Phe Asp Trp Pro Leu Ser Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 36 <212> DNA <213> Recombinant <400> 95 tttccgaatt ttgattggcc tctgtctccg tggacg 36 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 96 Glu Thr Pro Leu Thr Glu Pro Ala Phe Lys Arg His 1 5 10 <210> 97 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant <400> 97 gagacgcctc ttacggagcc ggcttttaag cggcat 36 <210> 98 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or c <400> 98 atggnatgga ncnnnntctt tntct 25 <210> 99 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or t <400> 99 atggatttnc angtgcagat tntcagctt 29 <210> 100 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c or g <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a or c <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is c or t <400> 100 atggnttggn tgtgganctt gcnattcct 29 <210> 101 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c or g <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a or g <400> 101 atggtnctna tnttnctgct gctatgg 27 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is c or t <400> 102 atgnaatgna nctgggtnnt nctctt 26 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is c or g <400> 103 atggtntccn canctcagtt ccttg 25 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is c or t <400> 104 atgnaatgna nctgggtnnt nctctt 26 <210> 105 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is a or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a or t <400> 105 actagtcgac atgaggnccc ctgctcagnt tnttggnntc tt 42 <210> 106 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is c or g <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is g or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a or c <400> 106 atggnatgga ncnnnntctt tntct 25 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a or g <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is c or t <400> 107 cgacatggct gtcntngngc tgntcntctg 30 <210> 108 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is c or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c or g <400> 108 cgacatggtn ctnatntcct tgctgttctg g 31 <210> 109 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 109 ttggatccca ggttcagctg cagca 25 <210> 110 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 110 gctaccaccc cctccagatc cgccacctcc tgaggagacg gtgactgagg ttccttgac 59 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 111 atctggaggg ggtggtagcg gtggaggcgg gagtgaaatc gtgctcaccc a 51 <210> 112 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 112 tttgtcgacc cgttttattt ccagcttggt cccccctccg aa 42 <210> 113 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 113 tcctgctact gattgtccct gcatatgtcc tgtcccaggt tcagctgcag cag 53 <210> 114 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 114 tttctcgagt gaggagacgg tgactgaggt tcc 33 <210> 115 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 115 tttggatcca tgggaaggct tacttcttca ttcctgctac tgattgtccc 50 <210> 116 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 116 gctgctgctg tggcttacag atgcaagatg tgaaatcgtg ctcacccag 49 <210> 117 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 117 tttctcgagc cgttttattt ccagcttggt cccccctcc 39 <210> 118 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 118 tttgaattca tgtctgtgcc aactcaggtc ctggggttgc tgctgctgtg gcttac 56 <210> 119 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 119 tttgaattcc aggtccaact gcagcag 27 <210> 120 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 120 gctaccaccc cctccagatc cgccacctcc cgatgatacg gtgaccg 47 <210> 121 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 121 atctggaggg ggtggtagcg gtggaggcgg gagtgacatc ctgatgaccc aa 52 <210> 122 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 122 tttctcgagc cgtttgattt ccagcttg 28 <210> 123 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 123 tcctgctact gattgtccct gcatatgtcc tgtcccaggt ccaactgcag cag 53 <210> 124 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 124 tttctcgagc gatgatacgg tgaccgaggt gccttgaccc cag 43 <210> 125 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 125 tttggatcca tgggaaggct tacttcttca ttcctgctac tgattgtccc 50 <210> 126 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 126 gctgctgctg tggcttacag atgcaagatg tgacatcctg atgacccaat c 51 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 127 tttctcgaga gcccgtttta tttccag 27 <210> 128 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemially synthesized <400> 128 tttgaattca tgtctgtgcc aactcaggtc ctggggttgc tgctgctgtg gcttac 56 <210> 129 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 129 ctctttttgg tatcaacagc aacaggtgtc cattcccagg tccaactgc 49 <210> 130 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 130 tttctcgagt gaggagacgg tgaccg 26 <210> 131 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 131 tttggatcca tgggatggtc ctgtatcatt ctctttttgg tatcaacagc 50 <210> 132 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 132 tttgaattca tgatggtcct tgctcagttt cttgggttc 39 <210> 133 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 133 tttctcgaga gcccgtttta tttccag 27 <210> 134 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 134 tttttacata tgatagcgct taccctg 27 <210> 135 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 135 gctaccacca ccaccagaac caccaccacc gcgcggaggg ggggctaaac 50 <210> 136 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 136 tagaattcat gccacttcaa agccgtctcc gtaagaggcg tctcgctacc tccaccacc 59 <210> 137 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 137 tttttacata tgatagcgct taccctg 27 <210> 138 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 138 gctaccacca ccaccagaac caccaccacc gcgcggaggg ggggctaaaa c 51 <210> 139 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 139 tagaattcaa ccagccgaag agccgccgtc gtcagcggag tatcgctacc tccaccacc 59 <210> 140 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 140 tttagatctg gaggaggtgg ttctgagacg cctcttacgg agacggcttt gaagtggc 58 <210> 141 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 141 cggctttgaa gtggcatgga tccggtggcg gatctctgca gggtggtgga ggttcagg 58 <210> 142 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 142 tttagatctg gaggaggtgg ttctgatact cccctgacga cggcggctct tcggctgg 58 <210> 143 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 143 cggctcttcg gctggttgga tccggtggcg gatctctgca gggtggtgga ggttcagg 58 <210> 144 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 144 ttgaattctt aaacaacagt agttt 25 <210> 145 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 145 tttagatctg gaggaggtgg ttctgagact cagctgacta cggcgggcct gcgacttctc 60 <210> 146 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 146 ggcctgcgac ttctcggagg aggtggttct gagactcagc tgactacggc gggtcttcgg 60 <210> 147 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 147 acggcgggtc ttcggctgct tggatccgtc gacggtggtg gaggttcagg 50 <210> 148 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 148 tttagatctg gaggaggtgg ttctcagacg ccgctgacta tggctgcgct ggaactgttc 60 <210> 149 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 149 gcgctggaac tgttcggagg aggtggttct cagacgccgc tgactatggc tgctcttgag 60 <210> 150 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 150 atggctgctc ttgagctttt tggatccgtc gacggtggtg gaggttcagg 50 <210> 151 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 151 tttagatctg gaggaggtgg ttctcagacg cctcttacgg agacggcgct aaaatggcac 60 <210> 152 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 152 gcgctaaaat ggcacggagg aggtggttct cagacgcctc ttacggagac ggctttgaag 60 <210> 153 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 153 gagacggctt tgaagtggca tggatccgtc gacggtggtg gaggttcagg 50 <210> 154 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 154 tttagatctg gaggaggtgg ttctcagacg cctctgacta tggcggcgct ggaattgctg 60 <210> 155 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 155 gcgctggaat tgctgggagg aggtggttct cagacgcctc tgactatggc ggctcttgag 60 <210> 156 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 156 atggcggctc ttgagcttct tggatccgtc gacggtggtg gaggttcagg 50 <210> 157 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 157 ttgaattctt aaacaacagt agttt 25

Claims (64)

  1. (i) 서열 28-30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄;
    (ii) 서열 34-36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄;
    (iii) 서열 40-42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄;
    (iv) 서열 46-48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄;
    (v) 서열 52-54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄; 및
    (vi) 서열 58-60에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 중쇄로 이루어지는 군 중에서 선택된 가변 중쇄를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가변 중쇄가 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 및 서열 25로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    (i) 서열 31-33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (ii) 서열 37-39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (iii) 서열 43-45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (iv) 서열 49-51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄; 및
    (v) 서열 61-63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지는 군 중에서 선택된 가변 경쇄를 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가변 경쇄가 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 및 서열 27로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  5. 제2항에 있어서,
    (i) 서열 31-33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (ii) 서열 37-39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (iii) 서열 43-45에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄;
    (iv) 서열 49-51에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄; 및
    (v) 서열 61-63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 경쇄로 이루어지는 군 중에서 선택된 가변 경쇄를 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 가변 경쇄가 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 및 서열 27로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인 모노클로날 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 Fab, Fab', F(ab)2 또는 Fv인 모노 클로날 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 대해 1 x 10-5 M 미만의 KD로 결합하는 것인 모노클로날 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 헤마글루티닌에 대해 1 x 10-6 M 미만의 KD로 결합하는 것인 모노클로날 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 뮤린 (murine)과 상이한 종으로부터 유래하는 비-CDR 구역을 포함하는 것인 모노클로날 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 비-CDR 구역이 인간 항체로부터 유래하는 것인 모노클로날 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인간 비-CDR 구역이 뮤린 항체로부터 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 것인 모노클로날 항체.
  14. (i) 하이브리도마 세포주 8H5 (기탁 번호 CCTCC-C200607)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (ii) 하이브리도마 세포주 3C8 (기탁 번호 CCTCC-C200605)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iii) 하이브리도마 세포주 10F7 (기탁 번호 CCTCC-C200608)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iv) 하이브리도마 세포주 4D1 (기탁 번호 CCTCC-C200606)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (v) 하이브리도마 세포주 3G4 (기탁 번호 CCTCC-C200604)에 의해 생산된 모노클로날 항체; 및
    (vi) 하이브리도마 세포주 2F2 (기탁 번호 CCTCC-C200424)에 의해 생산된 모노클로날 항체로 이루어지는 군 중에서 선택된, 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  15. (i) 하이브리도마 세포주 8H5 (기탁 번호 CCTCC-C200607);
    (ii) 하이브리도마 세포주 3C8 (기탁 번호 CCTCC-C200605);
    (iii) 하이브리도마 세포주 10F7 (기탁 번호 CCTCC-C200608);
    (iv) 하이브리도마 세포주 4D1 (기탁 번호 CCTCC-C200606);
    (v) 하이브리도마 세포주 3G4 (기탁 번호 CCTCC-C200604); 및
    (vi) 하이브리도마 세포주 2F2 (기탁 번호 CCTCC-C200424)로 이루어지는 군 중에서 선택된 하이브리도마 세포주.
  16. (i) 하이브리도마 세포주 8H5 (기탁 번호 CCTCC-C200607)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (ii) 하이브리도마 세포주 3C8 (기탁 번호 CCTCC-C200605)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iii) 하이브리도마 세포주 10F7 (기탁 번호 CCTCC-C200608)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iv) 하이브리도마 세포주 4D1 (기탁 번호 CCTCC-C200606)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (v) 하이브리도마 세포주 3G4 (기탁 번호 CCTCC-C200604)에 의해 생산된 모노클로날 항체; 및
    (vi) 하이브리도마 세포주 2F2 (기탁 번호 CCTCC-C200424)에 의해 생산된 모노클로날 항체로 이루어지는 군 중에서 선택된 모노클로날 항체의 헤마글루티닌 결합 활성의 적어도 50%를 차단할 수 있는, 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 헤마글루티닌 결합 활성을 적어도 70% 차단할 수 있는 것인 모노클로날 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 헤마글루티닌 결합 활성을 적어도 90% 차단할 수 있는 것인 모노클로날 항체.
  19. (i) 서열 28-30;
    (ii) 서열 34-36;
    (iii) 서열 40-42;
    (iv) 서열 46-48;
    (v) 서열 52-54; 및
    (vi) 서열 58-60으로 이루어지는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 중쇄 가변 구역이 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 및 서열 25로 이루어지는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  21. 제20항에 있어서, 서열 1, 서열 5, 서열 9, 서열 16, 서열 20 및 서열 24로 이루어지는 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  22. 제19항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  23. 제22항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. (i) 서열 31-33;
    (ii) 서열 37-39;
    (iii) 서열 43-45;
    (iv) 서열 49-51; 및
    (v) 서열 61-63으로 이루어지는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 중쇄 가변 구역이 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 및 서열 27로 이루어지는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 서열 3, 서열 7, 서열 11, 서열 18 및 서열 26으로 이루어지는 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  27. 제26항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  28. 제27항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. a) 샘플을 제1항의 모노클로날 항체와 접촉시키고;
    b) 상기 모노클로날 항체와 바이러스의 반응을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5를 검출하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 고체상에 부착되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 고체상이 미량역가판, 자성 입자, 라텍스 입자, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 샘플과 모노클로날 항체의 결합 효율을 증가시키는 배향 (orientation)으로 상기 고체상에 부착되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 그의 불변 구역을 통해 상기 고체상에 부착되는 것인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 반응이 효소적 색상 분석에 의해 검출되는 것인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 반응이 형광 분석에 의해 검출되는 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 반응이 화학발광 분석에 의해 검출되는 것인 방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 Fab, Fab', F(ab)2 또는 Fv인 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 샘플이 조류 또는 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플인 방법.
  39. 제1항의 모노클로날 항체의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
  40. (i) 하이브리도마 세포주 8H5 (기탁 번호 CCTCC-C200607)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (ii) 하이브리도마 세포주 3C8 (기탁 번호 CCTCC-C200605)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iii) 하이브리도마 세포주 10F7 (기탁 번호 CCTCC-C200608)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (iv) 하이브리도마 세포주 4D1 (기탁 번호 CCTCC-C200606)에 의해 생산된 모노클로날 항체;
    (v) 하이브리도마 세포주 3G4 (기탁 번호 CCTCC-C200604)에 의해 생산된 모노클로날 항체; 및
    (vi) 하이브리도마 세포주 2F2 (기탁 번호 CCTCC-C200424)에 의해 생산된 모노클로날 항체로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 모노클로날 항체의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 다른 항바이러스제의 제약상 허용되는 염을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 Fab, Fab', F(ab)2 또는 Fv인 제약 조성물.
  43. 대상에게 제약상 유효량의 제39항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 조류 인플루엔자 바이러스 감염과 연관된 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  44. 고체상 기재에 부착된 제1항의 모노클로날 항체를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위해 유용한 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv인 조성물.
  46. 제44항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열 2, 서열 6, 서열 10, 서열 17, 서열 21 및 서열 25로 이루어지는 군 중에서 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 서열 4, 서열 8, 서열 12, 서열 19 및 서열 27로 이루어지는 군 중에서 선택되는 펩티드 서열을 포함하는 가변 경쇄를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  48. 제44항에 있어서, 상기 고체상 기재가 미량역가판, 자성 입자, 라텍스 입자, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  49. 제44항에 있어서, 상기 고체상 기재가 시험 스트립인 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 시험 스트립이 적어도 하나의 시험 영역 및 하나의 대조 영역을 갖는 것인 조성물.
  51. 제44항에 있어서, 상기 항체가 샘플과 모노클로날 항체의 결합 효율을 증가시키는 배향으로 상기 고체상 기재에 부착되는 것인 조성물.
  52. 복수의 컴파트먼트 (compartment)를 포함하는 고체상 기재를 포함하고, 하나 이상의 상기 컴파트먼트가 제1항의 모노클로날 항체로 코팅되는 것인, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위해 유용한 장치.
  53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 상기 컴파트먼트가 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 상기 모노클로날 항체와 상이한 결합제로 코팅되는 것인 장치.
  54. 제53항에 있어서, 상기 결합제가 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H7 또는 H9에 특이적으로 결합하는 항체인 장치.
  55. 제52항에 있어서, 상기 모노클로날 항체의 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5의 헤마글루티닌에 대한 결합을 검출할 수 있는 자동화 검출 장치를 추가로 포함하는 장치.
  56. 고체상 기재에 부착된 제1항의 모노클로날 항체, 및 검출가능하게 표지된 2차 모노클로날 항체를 포함하는, 샘플 내에서 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하 기 위한 키트.
  57. 제56항에 있어서, 상기 2차 모노클로날 항체가 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 키트.
  58. 제56항에 있어서, 상기 2차 모노클로날 항체가 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 키트.
  59. 제56항에 있어서, 대조 표준품을 추가로 포함하는 키트.
  60. 서열 64-68, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 및 96으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  61. 서열 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95 및 97로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  62. 제60 또는 61항에 있어서, 펩티드가 8H5 mAb에 특이적으로 결합하는 것인 펩티드.
  63. 서열 70-73으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티 드.
  64. 제63항에 있어서, 펩티드가 3C8 mAb에 특이적으로 결합하는 것인 펩티드.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102063341B1 (ko) * 2018-12-31 2020-01-07 다이노나(주) Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
KR20200142127A (ko) * 2012-05-10 2020-12-21 비스테라, 인크. 신규 ha 결합 물질
KR20230025133A (ko) 2021-08-13 2023-02-21 충남대학교산학협력단 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 h5 헤마글루티닌에 결합하는 항체를 포함하는 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1664322B1 (en) 2003-05-22 2013-07-10 Fraunhofer USA, Inc. Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides
US8962278B2 (en) 2005-08-03 2015-02-24 Ibio Inc. Compositions and methods for production of immunoglobulins
US20080014205A1 (en) * 2006-05-15 2008-01-17 Lawrence Horowitz Neutralizing Antibodies to Influenza Viruses
US8148085B2 (en) 2006-05-15 2012-04-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Donor specific antibody libraries
CN102046654A (zh) 2007-03-13 2011-05-04 胡马斯有限公司 针对甲型流感病毒h5n1株系的抗体
WO2008124086A2 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
EP2363415B1 (en) * 2007-05-11 2013-07-31 Temasek Life Sciences Laboratory Limited H5 subtype-specific binding proteins useful for H5 avian influenza diagnosis and surveillance
EP2716656B1 (en) 2007-06-15 2016-10-12 Xiamen University Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof
US8404252B2 (en) 2007-07-11 2013-03-26 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
WO2009026117A2 (en) * 2007-08-16 2009-02-26 Glaxo Group Limited Novel compounds
EP2207804B1 (en) * 2007-09-13 2015-07-22 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin from influenza virus h5-subtype and uses thereof
EP2201039B1 (en) * 2007-09-13 2015-07-15 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin and neuraminidase from influenza virus h5-subtype or n1-subtype and uses thereof
KR20090042652A (ko) * 2007-10-26 2009-04-30 주식회사 바이오노트 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 감염증을 위한 항체치료방법
WO2009073163A1 (en) * 2007-12-03 2009-06-11 American Type Culture Collection (Atcc) Avian influenza antibodies, compositions, and methods thereof
KR20100115346A (ko) * 2007-12-06 2010-10-27 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 및 그의 이용 방법
EP2250197B1 (en) * 2008-02-05 2016-05-11 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Binding protein and epitope-blocking elisa for the universal detection of h5-subtype influenza viruses
ES2569907T3 (es) 2008-06-27 2016-05-13 Zoetis Services Llc Composiciones adyuvantes novedosas
US20120128684A1 (en) * 2008-08-25 2012-05-24 Burnham Institute For Medical Research Conserved Hemagglutinin Epitope, Antibodies to the Epitope and Methods of Use
WO2010037046A1 (en) 2008-09-28 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
CN102171334B (zh) * 2008-09-30 2015-05-27 电化生研株式会社 纯化流感病毒抗原的制备方法
GB0818356D0 (en) * 2008-10-07 2008-11-12 Istituto Superiore Di Sanito Antibodies
US8540995B2 (en) 2008-12-24 2013-09-24 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Monoclonal antibodies specific to the fusion peptide from hemagglutinin from influenza A viruses and uses thereof
JP2010261912A (ja) * 2009-05-11 2010-11-18 Bl:Kk ヒトインフルエンザウイルスｈ３亜型の免疫学的検出法
US8784819B2 (en) * 2009-09-29 2014-07-22 Ibio Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions and related methods
CN102791734B (zh) * 2010-03-08 2014-10-15 赛特瑞恩股份有限公司 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
US20120015344A1 (en) * 2010-05-14 2012-01-19 1. Board of Trustees of MICHIGAN STATE UNIVERSITY Methods, compositions, and apparatus for the detection of viral strains
AU2011261396B2 (en) 2010-06-02 2015-11-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized monoclonal antibodies and methods of use
CN103180341B (zh) * 2010-08-23 2015-04-22 淡马锡生命科学研究院有限公司 特异于流感h5血凝素主要中和表位的单克隆抗体
KR101381604B1 (ko) * 2010-08-31 2014-04-11 한국전자통신연구원 고분자 박막 및 자기비드를 이용한 바이오 물질 측정방법
GB201014805D0 (en) 2010-09-07 2010-10-20 Multi Sense Technologies Ltd Microfluidics based assay device
CA2824389A1 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 Emory University Antibodies directed against influenza
CN102426230B (zh) * 2011-09-20 2013-10-30 王利兵 一种不对称金纳米粒子二聚体免疫传感器检测黄曲霉毒素的方法
CA2900712A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Celltrion Inc. Binding molecule having influenza a virus-neutralizing activity produced from human b cell
JP2013087069A (ja) * 2011-10-17 2013-05-13 Toyobo Co Ltd Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体
US10175199B2 (en) 2012-11-15 2019-01-08 Micro-Tracers, Inc. Tracer particles, and methods for making same
US20160025736A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-28 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Heterogeneous luminescent oxygen channeling immunoassays and methods of production and use thereof
ES2822663T3 (es) 2013-03-15 2021-05-04 Siemens Healthcare Diagnostics Inc Inmunoensayos de canalización de oxígeno luminiscentes heterogéneos
WO2014152165A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Luminescent oxygen channeling immunoassays utilizing electrochemical discharge of singlet oxygen and methods of production and use thereof
US9579374B2 (en) 2013-12-04 2017-02-28 The Johns Hopkins University Method for rapidly designing pharmaceutical preparations for preventing viral infection
US10308697B2 (en) 2014-04-30 2019-06-04 President And Fellows Of Harvard College Fusion proteins for treating cancer and related methods
WO2015186721A1 (ja) * 2014-06-03 2015-12-10 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 抗体またはその可変領域を含む抗体断片、抗原ポリペプチド、およびその利用
CN104407135A (zh) * 2014-11-03 2015-03-11 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒
EP3374390A1 (en) 2015-11-13 2018-09-19 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
GB201611442D0 (en) 2016-06-30 2016-08-17 Lumiradx Tech Ltd Fluid control
CN109959795A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 北京勤邦生物技术有限公司 一种矩阵型试纸条的开发和应用
WO2020191293A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 Javelin Oncology, Inc. Anti-adam12 antibodies and chimeric antigen receptors, and compositions and methods comprising
CN113924147A (zh) 2019-03-25 2022-01-11 威特拉公司 用于治疗和预防流感的组合物和方法
WO2021254476A1 (zh) * 2020-06-19 2021-12-23 南京金斯瑞生物科技有限公司 检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的磁微粒化学发光试剂盒及其应用
WO2022081888A1 (en) * 2020-10-15 2022-04-21 The Regents Of The University Of California Anti-cancer inhibitory antibodies
CN115353562A (zh) * 2022-06-28 2022-11-18 北京热燕生物科技有限公司 一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL121041A0 (en) * 1997-06-09 1997-11-20 Yeda Res & Dev Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity
US7122185B2 (en) * 2002-02-22 2006-10-17 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibody
CN100473665C (zh) * 2005-02-06 2009-04-01 厦门大学 一种h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其制备方法及其用途

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200142127A (ko) * 2012-05-10 2020-12-21 비스테라, 인크. 신규 ha 결합 물질
KR102063341B1 (ko) * 2018-12-31 2020-01-07 다이노나(주) Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2020141869A1 (ko) * 2018-12-31 2020-07-09 다이노나(주) Icam-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CN113272328A (zh) * 2018-12-31 2021-08-17 泰华有限公司 与icam-1特异结合的抗体及其用途
CN113272328B (zh) * 2018-12-31 2024-05-14 锦湖Ht株式会社 与icam-1特异结合的抗体及其用途
KR20230025133A (ko) 2021-08-13 2023-02-21 충남대학교산학협력단 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 h5 헤마글루티닌에 결합하는 항체를 포함하는 조류 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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