TW202146443A - 一種抗新型冠狀病毒的單克隆抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及免疫學領域和分子病毒學領域，特別是新型冠狀病毒的診斷、預防和治療領域。具體而言，本發明涉及抗新型冠狀病毒的單克隆抗體，以及包含所述抗體的組合物(例如，診斷劑和治療劑)。此外，本發明還涉及所述抗體的用途。本發明的抗體可用於診斷、預防和/或治療新型冠狀病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，新型冠狀病毒肺炎)。

Description

一種抗新型冠狀病毒的單克隆抗體及其應用
本發明涉及免疫學領域和分子病毒學領域，特別是新型冠狀病毒的診斷、預防和治療領域。具體而言，本發明涉及抗新型冠狀病毒的單克隆抗體，以及包含所述抗體的組合物(例如，診斷劑和治療劑)。此外，本發明還涉及所述抗體的用途。本發明的抗體可用於診斷、預防和/或治療新型冠狀病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，新型冠狀病毒肺炎)。
新型冠狀病毒SARS-CoV-2是導致新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的病原體，是一種單鏈RNA病毒，它與2002-2003年引發疫情的重症急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）以及2012年引發疫情的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）同屬冠狀病毒科。冠狀病毒顆粒呈圓形或橢圓形，亦為多形性，直徑50-200 nm，屬於尺寸較大的病毒。冠狀病毒是包膜病毒，病毒衣殼外面包裹著脂質包膜，其上排列較寬的刺突蛋白（Spike, S蛋白），形狀如太陽光環。已有研究證實，S蛋白位元於新型冠狀病毒SARS-CoV-2的病毒表面，其能夠在病毒感染宿主的過程中通過其包含的受體結合結構域（RBD）結合宿主細胞受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）分子，從而啟動病毒膜與宿主細胞膜發生融合，導致宿主細胞感染病毒。
迄今為止，中和抗體已被證明是治療病毒性疾病的有效方法。一般來說，患者體內的B淋巴細胞受到抗原的刺激後，會被活化，進而轉變和分化成多種不同的細胞，並產生抗體。據現有的研究報導，新型冠狀病毒肺炎康復者的外周血內抗新型冠狀病毒的抗體，它們由經活化的B細胞產生和分泌。然而，康復者血漿記憶體在著多種B細胞，並且不同的B細胞所產生的抗體的結合活性和中和效價也有所不同。到目前為止，尚無研究報導，具有高結合活性和/或高中和活性的抗新型冠狀病毒的抗體。
因此，需要開發能夠抗新型冠狀病毒SARS-CoV-2的具有高結合活性和/或高中和活性的抗體，以提供有效的診斷、預防和/或治療新型冠狀病毒感染的手段。
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
如本文中所使用的，術語“抗體”是指，通常由兩對多肽鏈(每對具有一條“輕”(L)鏈和一條“重”(H)鏈)組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，並且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區通過大約12或更多個氨基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恒定區(CH)組成。重鏈恒定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恒定區(CL)組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域(稱為互補決定區(CDR))，其間散佈有較保守的稱為構架區(FR)的區域。各VH和VL由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗體結合部位。氨基酸至各區域或結構域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))，或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人 (1989) Nature 342:878-883的定義。術語“抗體”不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG (例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指包含全長抗體的片段的多肽，其保持特異性結合全長抗體所結合的相同抗原的能力，和/或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為“抗原結合部分”。通常參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合併入本文，用於所有目的。可通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。
在一些情況下，抗體的抗原結合片段是單鏈抗體(例如，scFv)，其中VL和VH結構域通過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子(參見，例如, Bird等人, Science 242:423 426 (1988)和Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883 (1988))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4 的接頭，但也可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。可用于本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng. 8:725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31: 94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情況下，抗體的抗原結合片段是雙抗體，即，雙價抗體，其中VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位(參見，例如, Holliger P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)，和Poljak R. J.等人, Structure 2:1121 1123 (1994))。
可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體(例如本發明提供的單克隆抗體BD23)獲得抗體的抗原結合片段(例如，上述抗體片段)，並且以與用於完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。
在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語“抗體”時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。
如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片段，也即，除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對于單克隆抗體而言的，其通常包含至少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常可採用Kohler等首次報導的雜交瘤技術獲得(Nature, 256:495 ,1975)，但也可採用重組DNA技術獲得(如參見Journal of virological methods, 2009, 158(1-2): 171-179)。
如本文中所使用的，“中和抗體”是指，能清除或顯著降低目標病毒的毒力(例如，感染細胞的能力)的抗體或抗體片段。
如本文中所使用的，術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限於：質粒；噬菌粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限於，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可以含有多種控制表達的元件，包括但不限於，啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。
如本文中所使用的，術語“宿主細胞”是指，可用於導入載體的細胞，其包括但不限於，如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等的原核細胞，如酵母細胞或曲黴菌等的真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，CHO細胞，COS細胞，NSO細胞，HeLa細胞，BHK細胞，HEK293細胞或人細胞等的動物細胞。
如本文中使用的，術語“特異性結合”是指，兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。在某些實施方式中，特異性結合某抗原的抗體(或對某抗原具有特異性的抗體)是指，抗體以小於大約10-5 M，例如小於大約10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M或10-10 M或更小的親和力(KD)結合該抗原。
如本文中所使用的，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體以小於大約10-5 M的解離平衡常數(KD)結合抗原。例如，本發明的單克隆抗體BD23能夠以大約10-9 M（nM水準）的解離平衡常數(KD)結合抗原(例如，新型冠狀病毒的S蛋白)。
在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，術語“中和活性”是指抗體或抗體片段具有與病毒上的抗原蛋白相結合，從而阻止病毒感染細胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的釋放的功能活性，具有中和活性的抗體或抗體片段可以阻止病毒的擴增，從而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，術語“新型冠狀病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因新型冠狀病毒感染而導致的肺炎，二者具有相同的含義，可互換使用。
本申請發明人經過大量的實驗研究後發現了一種抗體，其能夠特異性識別和靶向新型冠狀病毒的S蛋白，特別是S蛋白的受體結合結構域（RBD），並且顯示出了高效的中和病毒的能力。因此，本發明的抗體特別適合用於診斷、預防和治療新型冠狀病毒感染或與新型冠狀病毒感染相關的疾病(例如新型冠狀病毒肺炎)。
在本申請的第一個方面，提供了一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含，氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的重鏈可變區(VH)互補決定區1-3 (CDR1-3)；和/或，氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的輕鏈可變區(VL)互補決定區1-3 (CDR1-3)。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體包括如SEQ ID NO:7所示的重鏈可變區(VH)。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體包括如SEQ ID NO:8所示的輕鏈可變區(VL)。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體包含：氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的VH CDR1-3，和氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的VL CDR1-3。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和如SEQ ID NO:8所示的VL。
在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv、dAb、互補決定區片段、單鏈抗體(例如，scFv)、人抗體、嵌合抗體或雙特異或多特異抗體。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體還包括重鏈恒定區。在某些優選的實施方案中，所述重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
在某些優選的實施方案中，所述的單克隆抗體還包括輕鏈恒定區。在某些優選的實施方案中，輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合新型冠狀病毒的刺突蛋白（S蛋白）。在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段能夠靶向新型冠狀病毒的刺突蛋白（S蛋白）的受體結合域（RBD）。在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段能夠抑制S蛋白的受體結合域（RBD）介導的受體結合和/或膜融合過程，抑制病毒對細胞的感染。
在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段具有中和能力（例如，能夠中和新型冠狀病毒）。在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結合片段能夠抑制新型冠狀病毒感染或進入宿主細胞。由此，所述單克隆抗體或其抗原結合片段能夠中和新型冠狀病毒，並由此預防和治療新型冠狀病毒的感染。
本申請還提供了分離的核酸分子，其編碼本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。此類核酸分子不受限於其產生的方法，並且可以利用基因工程重組技術或化學合成方法獲得。
因此，在另一個方面，本發明提供了分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核苷酸序列，其中所述抗體重鏈可變區包含：氨基酸序列分別為SEQ ID NO:1-3的VH CDR1-3。
在某些優選的實施方案中，所述VH CDR1-3分別由SEQ ID NO:11-13所示的核苷酸序列編碼。因此，在某些優選的實施方案中，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO:11-13所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述抗體重鏈可變區具有如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核苷酸序列，其中所述抗體輕鏈可變區包含：氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 4-6的VL CDR1-3。
在某些優選的實施方案中，所述述VL CDR1-3分別由SEQ ID NO: 14-16所示的核苷酸序列編碼。因此，在某些優選的實施方案中，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO: 14-16所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述抗體輕鏈可變區具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了分離的核酸分子，其包含如上文所定義的能夠編碼抗體重鏈可變區的核苷酸序列，以及如上文所定義的能夠編碼抗體輕鏈可變區的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述抗體重鏈可變區具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在某些優選的實施方案中，所述能夠編碼抗體重鏈可變區的核苷酸序列具有如SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述抗體輕鏈可變區包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在某些優選的實施方案中，所述能夠編碼抗體輕鏈可變區的核苷酸序列具有如SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述分離的核酸分子包含如SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述分離的核酸分子還包含，能夠編碼抗體重鏈恒定區的核苷酸序列。在某些優選的實施方案中，所述重鏈恒定區具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在某些優選的實施方案中，所述能夠編碼抗體重鏈恒定區的核苷酸序列具有如SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列。
在某些優選的實施方案中，所述分離的核酸分子還包含，能夠編碼抗體輕鏈恒定區的核苷酸序列。在某些優選的實施方案中，所述輕鏈恒定區具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在某些優選的實施方案中，所述能夠編碼抗體輕鏈恒定區的核苷酸序列具有如SEQ ID NO: 20所示的核苷酸序列。
在另一個方面，本發明提供了分離的核酸分子，其編碼如上文所定義的本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。
在另一個方面，本發明提供了一種載體，其包含如上文所定義的分離的核酸分子。本發明的載體可以是克隆載體，也可以是表達載體。在某些優選的實施方案中，本發明的載體是例如質粒，粘粒，噬菌體等等。
在另一個方面，還提供了包含本發明的分離的核酸分子或載體的宿主細胞。此類宿主細胞包括但不限於，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等)。本發明的細胞還可以是細胞系，例如HEK293細胞。
在另一個方面，還提供了製備本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在合適的條件下培養本發明的宿主細胞，和從細胞培養物中回收本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。
在另一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含如上文所描述的單克隆抗體或其抗原結合片段、分離的核酸分子、載體或宿主細胞。
在另一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。在某些優選的實施方案中，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段還包括可檢測的標記。在某些優選的實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。優選地，所述第二抗體還包括可檢測的標記。此類可檢測的標記是本領域技術人員熟知的，包括但不限於，放射性同位素，螢光物質，發光物質，有色物質和酶(例如辣根過氧化物酶)等。
在另一個方面，本發明提供了檢測新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在樣品中的存在或其水準的方法，其包括，使用本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。在某些優選的實施方案中，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段還包括可檢測的標記。在另一個優選的實施方案中，所述方法還包括，使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。所述方法可以用於診斷目的(例如，所述樣品是來自患者的樣品)，或者非診斷目的(例如，所述樣品是細胞樣品，而非來自患者的樣品)。
在另一個方面，本發明提供了診斷受試者是否感染了新型冠狀病毒的方法，其包括：使用本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段檢測新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在來自所述受試者的樣品中的存在。在某些優選的實施方案中，本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段還包括可檢測的標記。在另一個優選的實施方案中，所述方法還包括，使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段。
在另一個方面，提供了本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在樣品中的存在或其水準，或用於診斷受試者是否感染了新型冠狀病毒。
在某些優選的實施方案中，所述樣品包括但不限於來自受試者(例如哺乳動物，優選人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、肺泡灌洗液等。
在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體是這樣的抗體，其包括：氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的VL CDR1-3；優選地，其包括：如SEQ ID NO: 7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
使用抗體或其抗原結合片段來檢測目標病毒或抗原(例如，新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD)在樣品中的存在或其水準的一般方法是本領域技術人員所熟知的。在某些優選的實施方案中，所述檢測方法可以使用酶聯免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測、化學發光免疫檢測、放射免疫檢測、螢光免疫檢測、免疫色譜法、競爭法及類似檢測方法。
在另一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體包括：氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的VL CDR1-3；優選地，所述單克隆抗體包括：如SEQ ID NO: 7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
在另一個方面，本發明提供了用於中和樣品中新型冠狀病毒的毒力的方法，其包括，將包含新型冠狀病毒的樣品與本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段接觸。此類方法可以用於治療目的，或非治療目的(例如所述樣品是細胞樣品，而不是患者或來自患者的樣品)。
在另一個方面，提供了本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段用於製備藥物的用途，所述藥物用於中和樣品中新型冠狀病毒的毒力。在另一個方面，本發明提供了如上文所描述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其用於中和樣品中新型冠狀病毒的毒力。
在另一個方面，提供了本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段在製備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用於預防或治療受試者的新型冠狀病毒感染或與新型冠狀病毒感染相關的疾病(例如新型冠狀病毒肺炎)。在另一個方面，本發明提供了如上文所描述的單克隆抗體或其抗原結合片段，其用於預防或治療受試者的新型冠狀病毒感染或與新型冠狀病毒感染相關的疾病(例如新型冠狀病毒肺炎)。
在另一個方面，本發明提供了用於預防或治療受試者的新型冠狀病毒感染或新型冠狀病毒感染相關的疾病(例如新型冠狀病毒肺炎)的方法，其包括，給有此需要的受試者施用預防或治療有效量的本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段，或者本發明的藥物組合物。
在某些優選的實施方案中，所述受試者是哺乳動物，例如人。
可通過任何適當的施用途徑來將本發明的單克隆抗體或其抗原結合片段或者本發明的藥物組合物施用給受試者。此類施用途徑包括但不限於，口服、口腔、舌下、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內、或鼻腔途徑。
在某些優選的實施方案中，所述單克隆抗體是這樣的抗體，其包括：氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的VH CDR1-3，和/或氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的VL CDR1-3；優選地，其包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和/或如SEQ ID NO:8所示的VL。
本發明所提供的藥物和藥物組合物可以單獨使用或聯合使用，也可以與其他藥學活性劑(例如抗病毒藥物，如法匹拉韋、瑞德西韋和干擾素等)聯合使用。在某些優選的實施方案中，所述藥物組合物還含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[序列資訊] 本申請所涉及的部分序列的資訊如下面的表1所示。 表1. 部分序列的資訊
SEQ ID NO: 序列描述 序列資訊
1 VH CDR1 GYTFTSYA
2 VH CDR2 INTNTGNP
3 VH CDR3 ARPQGGSSWYRDYYYGMDV
4 VL CDR1 QSISSW
5 VL CDR2 KAS
6 VL CDR3 QQYNSYPYT
7 VH QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARPQGGSSWYRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
8 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK
9 CH ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10 CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11 VH CDR1基因 GGCTACACCTTCACCTCCTATGCT
12 VH CDR2基因 ATAAACACCAACACAGGCAACCCA
13 VH CDR3基因 GCCAGACCACAGGGAGGCTCCTCCTGGTACAGGGACTACTACTATGGGATGGATGTG
14 VL CDR1基因 CAGAGCATCTCCTCCTGG
15 VL CDR2基因 AAGGCATCC
16 VL CDR3基因 CAACAATACAACTCCTACCCATACACC
17 VH基因 CAGGTCCAACTTGTCCAGTCTGGCTCTGAACTGAAAAAGCCTGGAGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACCTTCACCTCCTATGCTATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAAGGATTGGAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAACACAGGCAACCCAACCTATGCCCAGGGCTTCACAGGCAGGTTTGTGTTCTCCCTGGACACCTCTGTGAGCACAGCCTACCTCCAAATCTCCTCCCTGAAAGCAGAGGACACAGCAGTCTACTACTGTGCCAGACCACAGGGAGGCTCCTCCTGGTACAGGGACTACTACTATGGGATGGATGTGTGGGGACAAGGCACCACAGTGACAGTGTCCTCT
18 VL基因 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCACCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGGGTGACCATCACTTGTAGGGCAAGCCAGAGCATCTCCTCCTGGCTGGCTTGGTATCAACAGAAGCCTGGCAAGGCTCCAAAACTGCTGATTTACAAGGCATCCTCCTTGGAGTCTGGAGTGCCAAGCAGGTTCTCTGGCTCTGGCTCTGGCACAGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAACCTGATGACTTTGCCACCTACTACTGTCAACAATACAACTCCTACCCATACACCTTTGGACAAGGCACCAAATTGGAGATTAAG
19 CH基因 GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
20 CL基因 CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
21 S蛋白RBD RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
22 S蛋白 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
有益效果 本申請的單克隆抗體（例如BD23抗體）能夠以高親和力與新型冠狀病毒S蛋白結合，並且對新型冠狀病毒具有很強的中和活性。因此，本申請的單克隆抗體（例如BD23抗體）具有診斷、預防和治療新型冠狀病毒感染的臨床應用價值。
現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。
除非特別指明，本發明中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J. Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc.，1995中所述的方法進行；限制性內切酶的使用依照產品製造商推薦的條件。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的範圍。實例 1 ：記憶 B 細胞的分離
採集感染SARS-CoV-2病毒且痊癒出院的人員的血液（由北京佑安醫院提供），並在P2+生物安全實驗室中，利用STEMCELL SepMate™-15 （Stemcell Technologies，產品目錄號：86415）進行PBMCs的提取。隨後，根據製造商的說明書，使用STEMCELL EasySep Human Memory B Cell Isolation Kit（Stemcell Technologies，產品目錄號：17864）對提取的PBMCs進行記憶B細胞的富集。實例 2 ：抗體序列的獲得與鑒定
根據製造商的說明書，使用Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits（購自10X genomics，產品目錄號：100006）對上述富集後的記憶B細胞進行單細胞轉錄組的VDJ測序。對測序結果進行分析，獲得一株抗體，命名為BD23。BD23抗體的序列資訊如下：
重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示（其編碼基因如SEQ ID NO: 17所示），其中，重鏈可變區的CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-3所示（其編碼基因分別如SEQ ID NO: 11-13所示）；
輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示（其編碼基因如SEQ ID NO: 18所示），其中，輕鏈可變區的CDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4-6所示（其編碼基因分別如SEQ ID NO: 14-16所示）；
重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示（其編碼基因如SEQ ID NO: 19所示）；
輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示（其編碼基因如SEQ ID NO: 20所示）。實例 3 ：抗體 BD23 的製備和純化
根據實施例2中鑒定的BD23抗體的序列資訊，委託北京義翹神州有限公司表達和純化BD23抗體，並檢測BD23抗體的抗原反應性。
簡言之，在體外合成編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸分子，然後分別克隆至表達載體中，從而得到分別編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體。將上述得到的分別編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體共轉染HEK293細胞。轉染4-6小時後，將細胞培養液更換成無血清的培養基，並且繼續在37℃下培養6天。培養結束後，通過親和純化柱從培養物中純化細胞所表達的抗體蛋白。隨後，通過還原性和非還原性SDS-PAGE檢測所純化的目的蛋白。結果如圖1所示。圖1的結果顯示，獲得了經純化的BD23抗體，其純度為97.7%。
隨後，使用重組表達的S蛋白RBD作為包被抗原，使用辣根過氧化物酶（HRP）標記的Goat anti-human IgG Fc作為二抗，通過ELISA實驗，檢測經純化的BD23抗體的抗原反應性。簡言之，用重組表達的S蛋白RBD（其氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示，濃度為0.01μg/ml或1μg/ml）包被96孔板，隨後用封閉液對96孔板進行封閉。然後，分別加入待測單抗（無關對照抗體或BD23抗體；濃度為0.1μg/ml），並孵育。用ELISA洗滌液進行洗滌後，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的Goat anti-human IgG Fc作為二抗（以1:500稀釋），並繼續孵育。然後，用PBST洗滌酶標板，並加入顯色劑顯色。隨後在酶標儀上讀取OD450 nm的吸收值。結果如表2所示。表2的結果顯示，BD23抗體能夠特異性識別並結合S蛋白RBD。 表2：通過ELISA檢測的BD23抗體與S蛋白RBD的反應性（OD450讀數）
待測樣品 RBD蛋白濃度
0.01μg/ml 1μg/ml
無關抗體 0.006 0.025
BD23抗體 0.017 3.026
實例 4 ：抗體 BD23 與 S 蛋白的結合能力的評估
本實施例採用高靈敏型微量熱泳動分子互作分析系統，檢測抗體BD23與S蛋白的結合能力，所述分析系統能夠直接在溶液中簡單、快速、精確地定量分析生物分子相互作用的親和力。
（1）用Cy5螢光染料標記帶有組氨酸標籤（his-tag）的S蛋白 根據製造商的說明書，使用Monolith His-tag標記試劑盒(Cat# MO-L018)，將重組表達的帶有His-tag的S蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示）標記上Cy5螢光染料。簡言之，使用1x PBS-T buffer，將Cy5螢光染料稀釋至100 nM。然後，取90μL帶有His-tag的S蛋白(濃度為200 nM)，與90μL經稀釋的染料(100 nM)混勻，並在室溫孵育30分鐘。隨後，將經孵育的樣品於4℃，以15000g離心10分鐘。收集上清至新的管中，備用。
（2）檢測抗體BD23與S蛋白結合的親和力 根據製造商的說明書，使用微量熱泳動儀（MO NT.115PICO），檢測BD23抗體與S蛋白的親和力。具體步驟如下： a. 將抗體BD23連續倍比稀釋（共計16個濃度），稀釋的起始濃度為1μM。稀釋方式如下：準備16個PCR管，取10μl PBST buffer（PBS + 0.005% Tween 20）加入2-16號PCR管；取20μl BD23抗體（濃度為1μM）至1號管；然後，從1號管移液10μl到2號管，混勻；然後，從2號管移液10μl到3號管，混勻；順次操作，最後從16號管取10μl混勻液體，丟棄。 b. 向每個PCR管（1-16號管）中加入10μl螢光分子（步驟（1）中製備的標記有Cy5螢光染料的S蛋白），混勻。 c. 室溫放置5分鐘，然後使用毛細管(cat#MO-K025)將樣品載入至微量熱泳動儀。 d. 使用Binding affinity模式，在微量熱泳動儀中測量抗體BD23與S蛋白相互作用的Kd值。
測量結果如圖2所示。結果顯示，BD23抗體與S蛋白相互作用的Kd為4.344nM。這表明，BD23抗體與新型冠狀病毒S蛋白具有極強的親和力。實例 5 ： BD23 抗體中和 SARS-CoV-2 假病毒的能力的評估
在本實施例中，參照Temperton N J等人, Emerg Infect Dis, 2005, 11(3), 411-416的描述，利用微孔細胞中和實驗法，檢測單抗BD23對SARS-CoV-2假病毒的中和活性。本實施例所應用的SARS-CoV-2假病毒由中國食品藥品檢定研究院提供，其具有與真病毒相似的細胞感染特點，能夠類比真病毒感染細胞的早期過程，並且攜帶報告基因luciferase,可以快速方便地進行檢測分析。操作假病毒的安全性高，在P2級實驗室內就可完成中和實驗，檢測抗體的中和活性(Neutralization titer)。實驗方法的具體步驟如下。
1・平衡試劑 將保存於2-8℃的試劑（0.25%胰酶-EDTA，DMEM完全培養基）取出，室溫平衡30分鐘以上。
2・試驗操作 (1) 取96孔板，按照表3所示，設置樣品的排布方式；其中，A2-H2的孔設置為細胞對照孔（CC），其僅含有實驗細胞；A3-H3的孔設置為病毒對照孔（VV），其含有實驗細胞和假病毒；A4-A11、B4-B11、C4-C11、D4-D11、E4-E11、F4-F11、G4-G11、H4-H11的孔設置為實驗孔，其含有實驗細胞、假病毒以及不同濃度的待測抗體；其餘的孔設置為空白。本實施例中所使用的實驗細胞和假病毒分別為Huh-7細胞和SARS-CoV-2病毒（均由中國食品藥品檢定研究院提供）。 表3. 96孔板中樣品的排布方式
   1 2 3 4 5-10 11 12
A - CC VV 稀釋度1 稀釋度1 稀釋度1 -
B - CC VV 稀釋度2 稀釋度2 稀釋度2 -
C - CC VV 稀釋度3 稀釋度3 稀釋度3 -
D - CC VV 稀釋度4 稀釋度4 稀釋度4 -
E - CC VV 稀釋度5 稀釋度5 稀釋度5 -
F - CC VV 稀釋度6 稀釋度6 稀釋度6 -
G - CC VV 稀釋度7 稀釋度7 稀釋度7 -
H - CC VV 稀釋度8 稀釋度8 稀釋度8 -
(2) 在細胞對照孔中加入100μl/孔的DMEM完全培養基（含有1%的抗生素，25mM HEPES，10%FBS）；在病毒對照孔中加入100μl/孔的DMEM完全培養基；並且，在實驗孔中加入50μl/孔的指定濃度的、稀釋于DMEM完全培養基中的待測抗體。表3中所使用的稀釋度1-8的抗體濃度分別為1/30 μg/μl,1/90 μg/μl,1/270 μg/μl, 1/810 μg/μl, 1/2430 μg/μl, 1/7290 μg/μl,1/21870 μg/μl, 1/65610 μg/μl。 (3) 用DMEM完全培養基將SARS-CoV-2假病毒稀釋至約1.3×104 /ml (TCID50)；然後向病毒對照孔和實驗孔中添加50μl/孔的SARS-CoV-2假病毒。 (4) 將96孔板置於細胞培養箱中（37℃，5% CO2 ）孵育1小時。 (5) 用DMEM完全培養基將預先培養好的Huh-7細胞稀釋至2×105 個/ml。在前一步驟的孵育結束後，向細胞對照孔、病毒對照孔和實驗孔中添加100μl/孔的細胞。 (6) 將96孔板置於細胞培養箱中（37℃，5% CO2 ）培養20-28小時。 (7) 從細胞培養箱中取出96孔板，從每個孔中吸棄150μl上清，然後加入100μl螢光素酶檢測試劑，室溫避光反應2min。 (8) 反應結束後，用移液器將各個孔中的液體反復吹吸6～8次，使細胞充分裂解。然後，從每孔中吸出150μl液體，轉移至對應的96孔化學發光檢測板中，用化學發光檢測儀（Perkinelmer EnSight多功能酶標儀）讀取發光值。 (9) 計算中和抑制率： 抑制率＝[1－（實驗孔的發光強度均值－CC孔的發光強度均值）/（VV孔的發光強度均值－CC孔的發光強度均值）]×100％。 (10) 根據中和抑制率的結果，利用Reed-Muench法計算待測抗體的IC50。
實驗結果如圖3所示。結果顯示，單抗BD23對SARS-CoV-2假病毒具有良好的中和活性，其IC50為8.78nM（即1.317 μg/ml）。實例 6 ： BD23 抗體中和 SARS-CoV-2 真病毒的能力的評估
在本實施例中，所使用的SARS-CoV-2病毒由軍事醫學研究院提供，其滴度（TCID50）為105 /ml，並且，所有實驗操作均在BSL-3實驗室內完成。中和實驗方法的具體步驟如下。 (1) 以5×104 /ml的濃度，向96孔培養板的每孔中加入100µl Vero E6細胞，並在37℃，5% CO2 的條件下培養24小時。 (2) 將待測抗體稀釋成3個濃度：為50µg/ml；10µg/ml;2µg/ml。取100µl指定濃度的待測抗體，加入等體積的SARS-CoV-2真病毒（100 TCID50），並在37℃，5% CO2 的條件下孵育1h。 (3) 在步驟(1)的培養結束後，棄去96孔培養板中的細胞培養液，加入步驟(2)製備的含有待測抗體和真病毒的混合液（200µl），作為實驗組。孵育1h後，從孔中吸出上清，每孔加入200 µl DMEM培養基（含有2%抗生素和16μg/ml胰蛋白酶）。 在實驗過程中，平行設置細胞對照組和病毒對照組。在細胞對照組（4個複孔）中，棄去孔中的細胞培養液後，每孔添加200µl DMEM培養基（含有2%抗生素和16μg/ml胰蛋白酶）。在病毒對照組（4個複孔）中，棄去孔中的細胞培養液後，每孔添加100 TCID50的真病毒（100µl），並在37℃孵育1h；孵育結束後，從孔中吸出上清，每孔加入200 µl DMEM培養基（含有2%抗生素和16μg/ml胰蛋白酶）。 (4) 在37℃，5% CO2 的條件下培養細胞4-5天。 (5) 在光學顯微鏡下觀察細胞病變（CPE），並根據細胞病變情況，評估不同濃度的單抗BD23對CPE的抑制活性。
實驗結果如圖4所示。結果顯示，單抗BD23對SARS-CoV-2真病毒具有良好的中和活性，能夠有效抑制病毒感染和侵入細胞（IC50為20.4 μg/ml）。在50μg/ml的濃度下，單抗BD23對SARS-CoV-2真病毒的抑制率為大約70%。
圖1顯示了重組表達的BD23抗體的SDS-PAGE檢測結果，其中，“NR”表示非還原性SDS-PAGE；“R”表示還原性SDS-PAGE。圖1的結果顯示，在非還原性SDS-PAGE條件下，形成了約190.88 KDa的單一條帶；在還原性SDS-PAGE條件下，形成了約47.75 KDa和25.70 KDa的兩個條帶（分別對應於抗體的重鏈和輕鏈）；並且，所純化的BD23抗體的純度為97.7%。 圖2顯示了使用微量熱泳動儀檢測BD23抗體與S蛋白的親和力的測定結果。 圖3顯示了BD23抗體對SARS-CoV-2假病毒的中和抑制活性的測定結果。 圖4顯示了BD23抗體對SARS-CoV-2真病毒的中和抑制活性的測定結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (14)

  1. 一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含，氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的重鏈可變區(VH)互補決定區1-3 (CDR1-3)；和/或，氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的輕鏈可變區(VL)互補決定區1-3 (CDR1-3)； 優選地，所述的單克隆抗體包括，如SEQ ID NO:7所示的重鏈可變區(VH)，和/或，如SEQ ID NO:8所示的輕鏈可變區(VL)； 優選地，所述的單克隆抗體包含：氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示的VH CDR1-3，和氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 4-6所示的VL CDR1-3； 優選地，所述的單克隆抗體包括：如SEQ ID NO:7所示的VH和如SEQ ID NO:8所示的VL； 優選地，所述單克隆抗體或其抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv、dAb、互補決定區片段、單鏈抗體(例如，scFv)、人抗體、嵌合抗體或雙特異或多特異抗體； 優選地，所述的單克隆抗體還包括重鏈恒定區；優選地，所述重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示； 優選地，所述的單克隆抗體還包括輕鏈恒定區；優選地，所述輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
  2. 分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸序列，其中，所述抗體重鏈可變區包含：氨基酸序列分別為SEQ ID NO:1-3的VH CDR1-3； 例如，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO:11-13所示的核苷酸序列； 例如，所述抗體重鏈可變區具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列； 例如，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。
  3. 分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列，其中所述抗體輕鏈可變區包含：氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 4-6的VL CDR1-3； 例如，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO: 14-16所示的核苷酸序列； 例如，所述抗體輕鏈可變區具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列； 例如，所述核酸分子具有如SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。
  4. 分離的核酸分子，其編碼請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段。
  5. 種載體，其包含請求項2-4任一項的分離的核酸分子。
  6. 一種宿主細胞，其包含請求項2-4任一項的分離的核酸分子或請求項5的載體。
  7. 製備請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在合適的條件下培養權利要求6的宿主細胞，和從細胞培養物中回收所述單克隆抗體或其抗原結合片段。
  8. 一種組合物，其包含請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段，請求項2-4任一項的分離的核酸分子，請求項5的載體，請求項6的宿主細胞。
  9. 試劑盒，其包括請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段； 例如，所述單克隆抗體或其抗原結合片段還包括可檢測的標記，例如放射性同位素，螢光物質，發光物質，有色物質和酶； 例如，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別所述單克隆抗體或其抗原結合片段；任選地，所述第二抗體還包括可檢測的標記，例如放射性同位素，螢光物質，發光物質，有色物質和酶。
  10. 用於檢測新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在樣品中的存在或其水準的方法，其包括使用請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段； 例如，所述單克隆抗體或其抗原結合片段還包括可檢測的標記，例如放射性同位素，螢光物質，化學發光物質，有色物質和酶； 例如，所述方法還包括，使用攜帶可檢測的標記(例如放射性同位素，螢光物質，發光物質，有色物質和酶)的第二抗體來檢測所述單克隆抗體或其抗原結合片段。
  11. 請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測新型冠狀病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD在樣品中的存在或其水準，或用於診斷受試者是否感染了新型冠狀病毒； 優選地，所述樣品為來自受試者(例如哺乳動物，優選人)的排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
  12. 一種藥物組合物，其包含請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑； 優選地，所述藥物組合物還包含其他藥學活性劑，例如法匹拉韋，瑞德西韋，幹擾素等。
  13. 用於中和樣品中的新型冠狀病毒的毒力的方法，其包括，將包含新型冠狀病毒的樣品與請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段接觸。
  14. 請求項1的單克隆抗體或其抗原結合片段用於製備藥物的用途，所述藥物用於中和樣品中新型冠狀病毒的毒力，或用於預防或治療受試者的新型冠狀病毒感染或與新型冠狀病毒感染相關的疾病(例如新型冠狀病毒肺炎)； 優選地，所述受試者是哺乳動物，例如人； 優選地，所述藥物單獨使用，或與其他藥學活性劑(例如法匹拉韋，瑞德西韋，幹擾素等)聯合使用。
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